PT91846B

PT91846B - Processo para a producao de peptidos que tem actividade como supressores de celulas t e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT91846B
Application number: PT91846A
Authority: PT
Inventors: Gideon Goldstein; Tapan Audhya; George Heavner
Original assignee: Immunobiology Res Inst Inc
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-28
Publication date: 1995-07-03
Also published as: AU627781B2; ZA897282B; BR8907105A; CZ278982B6; HU205143B; FI902534A0; EP0361977A3; ES2031803T1; KR900701298A; HU896052D0; CN1041366A; IE893110L; EP0361977A2; IL91775A0; DK132390D0; YU183789A; DK132390A; PT91846A; DD297416A5; GR900300088T1

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PfiPTIDOS QUE TÊM

ACTIVIDADE COMO SUPRESSORES DE CÉLULAS Τ E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM que apresenta

IMMUNOBIOLOGY RESEARCH INSTITUTE, INC., americana, industrial, com sede em Route 22 East, Annandale, New Jersey 08801-0999, Estados Unidos da América.

RESUMO

A invenção refere-se ao processo para a preparação de péptidos de fórmula

R-Arg-X-A sp-Y-NR¹R²1 P na qual os símbolos R, R , R , X e Y possuem as significações referidas nas reivindicações, os quais possuem a activi dade biológica da timopentina das moléculas, compreendendo eintetizar-se o péptido pretendido, por síntese em fase sóli da oW ^0m solução. Rsfere-se também às composições farmacêuti cas que contêm os referidos péptidos e aos processos de utilização dos citados péptidos.

A presente invenção refere-se geralmente à sintese de peptídeos capazes de estimularem a actividade supressora de células T.

liais particularmente, os peptídeos da presente invenção são tetrapeptídeos, que têm substituições amida no carboxi-terminal, os quais estão baseados na molécula de timopoietina.

HISTORIAL DA INVENÇÃO

As proteínas imunomodulatérias, tiriopentina e tisplenina (primeiramente esplenina”) tem sido isoladas a partir do timo e baços humanos e bovinos, respectivamente. Adicionalmente, tem sido sintetizados quimicamente pequenos peptídeos, os quais imitam a actividade biológica da timopoetina, e a tisplenina tem sido posteriormente modificada para desenvolver atributos adicionais, tais como resistência a acção enzimática. Ver, por exemplo, a Patente Americana 4.505.853 e o Pedido de Depósito da Patente Americana co-pendente de 112 196.138

Um vasto conjunto de artigos e patentes tern sido publicados re ferindo-se a tais proteínas e peptídeos sintetizados. A Patente Americana 1124.190646 desvenda o pentapeptídeo timopentina, o qual é a zona activa da timopoietina e tem a sequência ArgLys-Asp-Val-Tyr, bem como composições de neptideos, nas quais sao feitas várias substituições no grupo amino e/ou carboxi terminal deste pentapeptídeo. Tanto a timopoietina, como a timopentina, induzem alterações biológicas nas duas linhas de células T humanas, CEM e MOLT-4» indicando, consequentemente, um papel de estimulação tanto das actividades de supressor como de auxiliar das células -T. Nenhum análogo da timopentina mais pequeno do que os pentapeptídeos (sequência com 5 aminoácidos) se mostrou

activo em células CEL pedido de patente dos mesmos depositantes dos E.U.A. 1J9 de Série 53186 desvenda uma proteina imunomodulatória de 48 aminoácidos , esplenina, ( a partir daqui referida como tisplenina) isolada do bago humano. A zona activa da tisplenina do bovino, denominada SP-5, que se estende dos resíduos aminoácidos 32 a 36 e apresenta a sequência Arg-Lys-Glu-Val-Tyr, estimula a actividade auxiliar das células T in vivo em ratos. Espera-se pois que a tisplenina humana exiba actividade biológica análoga nos seres humanos. A tisplenina humana foi descrita no Pedido de Patente acima mencionado como indutora do aumente de cGKP intracelular na linha LíOLT-4 das células T humanas. No Pedido de Patente com ο N9 de Série 56186, a zona activa da sequência humana foi desvendada como sendo Arg-Lys-Ala-Val-Tyr.

A tisplenina, ao contrário da tiraopoietina, não produz alterações na actividade biológica das células CEM. Consequentemente a tisplenina está implicada na estimulação da actividade auxiliar das células T, e não na actividade supressora das células T. Ver também as Patentes Americanas N° 4.190.646; 4.261.886; 4.361.673; 4.420.424; θ 4.629.723· A referência às Patentes, Pedidos de Patente o artigos anteriormente mencionados é feita com o objectivo de discutir o material histórico e os processos biológicos envolvidos na presente invenção.

A Ratonte Americana N° 4.428.938 de Kisfaludy et al, publicada a 31 de Janeiro de 1984, desvenda certos peptideos que afectam a regulação imunitória. Entre tais peptideos encontram-se os seguintes tetrapeptídeos:

Arg-Lys-Asp-Val

Arg-Lys-Asn-Val

Arg-Lys-Ala-Val

Arg-Lys-Asp-Ala

Arg-Lys-Asp-Ile

Arg-Lys-Glu-Val

Glp-Arg-Lys-Asp

A Patente *93Q refer de utn modo geral que os sais,'amidas, ésteres de alquilos de baixo peso molecular e os derivados protegidos destas sequências são também capazes de afectarem a regulação imunitória. No entanto, nenhuma amida particular destas sequências é identificada com a especificidade aqui apresentada, são também discutidos processos para o uso destas sequências no tratamento de desordens imunológicas devido a deficiências timicas. Nesta Patente, os peptideos foram ensaiados em termos de actividade num ensaio de roseta in vitro.

Os depositantes de Patente Americana com o N° de Série 196.138 copendente e dos mesmos depositantes desvendaram uma série de peptídeos análogos à tisplenina, capazes de induzirem a actividade biológica na linha de células T LOLT-4· Ao contrário dos análogos da timopentina préviamente referidos, os peptideos com menos do que cinco aminoácidos em comprimento e em relação à tisplenina foram activos na indução da actividade auxiliar das células T nas células i.lOLT-4, bem como os pentapeptídeos análogos à tisplenina aqui descritos. Vários tetrapeptídeos aqui descritos incluem:

Arg-Pro-Asp-Val

Arg-Pro-Asp-Val-NHg

Pormilo-Arg-Pro-Asp-Val

Acetilo-Arg-Pro-Asp-Val

Acetilo-Arg-Pro-Asp-Val-NH^

Acetilo-Arg-Pro-Ala-Val-líHg

Acetilo-Arg-Pro-D-p-Asp-Val-NH^

Acetilo-Arg-Pro-Glu-Val-NH2

Acetilo-Arg-Pro-Glu-Val

Acetilo-Arg-Aib-Ala-Val-NH,,

Acetilo-Arg-Aib-Glu-Val-NH₂Acetilo- Arg-Pro-Asp-Gly-NH₂

Descobriu-se que estes peptídeos imitavam a acção da tisplenina no ensaio MOLT-4, mas não podiam imitar a actividade da timopentina no ensaio da linha de células CEM.

Resta à técnica a necessidade de peptídeos adicionais que sejam útei na estimulação das actividades supressora e auxiliar do sistema imunitório humano, para variadas condições de células T deficientes.

SUMÃKIO DA DÍVEÍÍÇÃO

Foi surpreendentemente descoberto que um determinado numero de tetrapeptídeos, que compreendem um grupo carboxi terminal substituido por amidas, possuem actividade supressora de células T, caracteristica da timopentina nos ensaios cíclicos GI.:P em células CEM. Esta descoberta é surpreendente porque os mesmos tetrapeptídeos com um carboxi-terminal livre ou amidado com diferentes grupos amida C terminais, não originam tal actividade supressora de células T. Várias sequências de tetrapeptídeos têm sido préviamente identificadas, por exemplo na Patente Americana 4.42Θ.93Β, as quais, embora possuindo um grupo carboxi terminal, não produzem qualquer actividade supressora de células T. Além disso , quando certas substituições amidas são colocadas no terminal C de acordo com esta invenção, estes peptídeos inactivos revelam uma actividade supressora de células T. Esta actividade não é previsível por qualquer uma das técnicas anteriores.

Consequentemente, num aspecto, a presente invenção desenvolve os seguintes peptídeos aminados de fórmula:

R-Arg-X-Asp-Y-NR¹ R² na qual

R é H, alquilo de baixo peso molecular, acetilo, formilo, alcanoilo de baixo peso molecular;

X é Pro, desidro-Pro, hidroxilo-Pro, D-Lys, Aib ou Lys;

Y é Gly ou a forma D ou L de um aminoácido seleccionado no grupo constituído por Vai, Ala, Ile, Leu, Asp, Glu, Gin, ou Lys;

2

R é H e R é um alquilo de baixo peso molecular ou um alcenilo de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo ciclico ou alcenilo de 4 a 10 átomos de carbono, arilo ou NHR , onde é um alquilo de baixo peso molecular, com 1 a 10 átomos de carbono, alquilo ciclico ou alcenilo com 4 a 8 átomos de carbono, ou arilo; ou

2

R e R compreendem, conjuntamente, uma cadeia metileno de 4 a 7 átomos de carbono.

Estes peptídeos amidados e composições, que os contém, retêm surpreendentemente a actividade biológica da timopentina humana em células CEiií.

Depreende-se,eportanto, que estes peptídeos são os responsáveis pela actividade biológica similar in vivo nos seres humanos. Um vasto numero destes peptídeos pode ser caracterizado pelo aumento de resistência ao ataque pelas endo- e exopeptidases e enzimas semelhantes à tripsina no tracto digestivo e no soro. Logo, estes peptídeos oferecem vantagens significativas no tratamento de deficiências imunitórias.

Ainda um outro aspecto desta invenção inclui a preparação de composiçoes terapêuticas que contêm estes peptídeos e métodos para / · Ã ί^Λ- ·^ζ'< '.

uso destes peptídeos no tratamento de variadas condições ou doenças que requerem regulação imunitória.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são desvendados na descrição detalhada que se segue.

BREVE DBSCRIgÃO DOS DESENHOS

A Pig. 1 é uma ilustração gráfica de um ensaio cGMP de células CEM que regista a concentração de peptideo (Aj/ml) versus teor de cGMP (picograma/ml) e compara a actividade aqui revelada pela timopentina (TP-5) e dos peptídeos desta invenção com a dos controlos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção desenvolve, surpreendentemente, compostos que possuem actividade supressora de células T e são representados pela fórmula R-Arg-X-Asp-Y-NR^R², na qual R, X, Y, R¹ e R² são os acima descritos.

Através desta descrição, os componentes de aminoáeido dos peptídeos e certos materiais usados na sua preparação são identificados por abrviaturas, por conveniência. A maior parte das abreviaturas de três letras são bem conhecidas na técnica. As abreviaturas menos conhecidas são Glp para piroglutamilo (também p-Glu) e Aib para o ácido aminoisobutírico. A não ser que de outra forma se especifique, todos os aminoácidos apresentam a configuração isomérica L. Quando se desejar a configuração isomérica D, será também indicado.

Certos peptídeos preferidos da presente invenção 3ao aqueles, em cuja fórmula o segundo aminoáeido é Pro ou Aib. Espera-se que os tetrapeptídeos com amidas C-terminal, nas quais o segundo aminoácido X é Pro ou Aib, possuam resistência aumentada à degradação por parte das enzimas digestivas e do soro. Tais peptídeos preferidos incluem:

Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida Arg-Pro-Asp-Val-Metilamida Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-Idet ilamida Pormil-Arg-Pro-Asp-Val-Metilamida

Outros peptídeos preferidos da presente invenção incluem:

Arg-Ly s-A s p-Va1-An i1ina-am ida Arg-Lys-Asp-Val-í.iet ilamida Arg-Lys-Asp-Val-2-Fenilhidrazida Arg-Lys-Asp-Val-Piperidino-amida Arg-Lys-Asp-Val-Ciclohexilamida Arg-Lys-Asp-Val-Isopropilamida

A actividade surpreendente e imprevisível dos tetrapeptídeos Substituídos desenvolve compostos novos e inesperados, particularmente quando comparados com as técnicas anteriores. Enquanto as sequências tetrapeptídicas desta invenção podem ser previamente desvendadas, por exemplo Arg-Lys-Asp-Val na Patente Americana N2 4.428.938, os presentes inventores descobriram, surpreendentemente, que a arnidação selectiva destas sequências nos seus terminais carboxi desenvolve compostos com actividade supressora de células T. Adicionalmente, os depositanjres descobriram que vários peptídeos acima descritos desencadeiam, surpreendentemente, e inexplicavelmente, não apenas actividades supressoras, mas também auxiliares de células T semelhantes à da timopentina. Estes peptídeos incluem Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida, Pormilo-Arg-Pro-Asp-Val-lletilamida, e Arg-Lys-Asp-Val-Isopropilamida, como acima descrito.

Consequentemente, os inventores presentes desenvolveram, a partir dos seus ensinamentos, novos compostos para uso farmacêuticos.

A selecção dos grupos amida particulares, necessários para a produção de compostos activos das sequências tetrapeptídicas acima desvendadas, não é em parte alguma ensinada na técnica, e nem o facto de que a amidação selectiva da presente invenção produz compostos biologicamente activos a partir de vários tetrapeptídeos, que são biologicamente inactivos com terminais livres de carboxi. Além disso, nem todas as sequências tetrapeptídicas acima descritas, quando amidadas no seu carboxi terminal, desencadeiam tal actividade biológica supressora análoga à da timopentina.

Um determinado número de tetrapptídeos do estado da técnica quando amidados, são incapazes de desencadearem tal actividade supressora de células T, quando são ensaiados. Nao se prevê nos compostos da presente invenção, por meio do ensinamento generalizado, que as amidas de tais sequências revelem a capacidade de realizarem o sistema imunitário ou estimularem a actividade auxiliar de células T.

Por exemplo, os peptídeos seguintes

Arg-Pro-Asp-Val-I-lorfo1inoamida Arg-Ly s-A sp-Va1-D im e t ilam ida Arg-Lys-Asp-Val-2-Naftilamida Acetil-Arg-Pro-Glu-Val-Etilamida não apresentam a actividade estimulatéria supressora de células T da timopentina. Todavia os peptídeos possuem as mesmas sequências peptídicas, ou similares, tal como descrito na Patente ’938 de Kisfaludy ou no pedido de Patente copendente com o número de série 196.138.

Os peptídeos da presente invenção podem ser geralmente preparados seguindo as técnicas conhecidas. Convenientemente, a produção sintética do polipeptídeo da invenção pode ser de acordo com o

método de síntese em fase sólida ou pelo método de síntese de soluções-padrão. Por exemplo, o método de síntese em fase sólida descrito por Merrifield em J.A.C.S.. 85: 2149-2154 (1963) é bem compreendido e é um método comum para a preparação dos peptideos.

método de síntese em fase sólida envolve a adição cuidadosa dos aminoácidos protegidos para aumentar a cadeia peptidica, a qual está ligada por ligações covalentes a uma partícula de resina sólida. Por meio desta técnica, os reagentes e os coprodutos são removidos por filtração, logo eliminando a necessidade de purificação dos intermediários. 0 conceito geral deste método reside na ligação do primeiro aminoácido da cadeia a um polímero sólido por meio de uma ligação covalente. São sucessivamente adicionados protegidos, todos de uma vez, ou em blocos, de uma maneira gradual, até que se obtenha a sequência desejada. Finalmente, o peptideo protegido é removido do suporte de resina sólida e o grupo de protecção são removidos quebrando as ligações.

Os aminoácidos podem ser ligados a qualquer polímero adequado, como uma resina. A resina deve conter um grupo funcional, ao qual o primeiro aminoácido protegido pode ser firmemente ligado por ligaçao covalente. Vários são os polímeros adequados para tais propostas, tais como: celulose, álcool polivinilico, polimetil-metacrilato, e IJ-alquilo benzilamina, M-alquilo benzihidrilamina e resinas poliestirenos. Os grupos protectores adequados, usados na referida síntese incluem: t-butil-oxicarbonilo (BOC), benzilo (Bzl), t-amilo-oxicarbonilo (AOC), tosilo (Tos), o-bromo-fenil-metoxicarbonilo (BrZ), e fenilmetoxicarbonilo (Z ou (CBZ). Adicionalmente, os grupos protectores, que foram anteriormente mencionados, encontrara-se também identificados J.F.W. I.TcOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenurn Press, Ilew York,

1973· Ambos os livros são aqui incorporados como referência.

A técnica geral de preparação dos peptideos desta invenção envolve a ligação do aminoácido C-terminal protegido à resina. Após a

ligação a resina é filtrada, lavada e o grupo protector (desejavelmente BOC) no grupo alfa amino do aminoácido C-terminal é removido. A remoção deste grupo protector deve realizar-se, eviden temente, sem quebrar a ligação entre o aminoácido e a resina. Ao peptídeo resina resultante é então acopulado o penúltimo aminoácido protegido C-terminal. Este acopulamento realiza-se a partir da formação de uma ligação amida entre o grupo carboxi livre do segundo aminoácido e o grupo amino do primeiro aminoácido ligado à resina. Esta sequência de fases é repetida com sucessivos aminoácidos, até que todos os aminoácidos estejam ligados à resina.

Finalmente, o peptídeo protegido é quebrado a partir da resina por por meio de uma técnica convencional conhecida pelos peritos na técnica, por exemplo, aininólise usando ciclohexilamida, e os grupos protectores removidos para revelar o peptídeo desejado.

As técnicas de clivagem usadas para separar o peptídeo da resina e para remover os grupos protectores depende da selecção da resina e dos grupos protectores e são conhecidas pelos peritos em técnicas de síntese peptidica.

Técnicas alternativas para a síntese peptidica são descritas em Peptide Synthesis” por Bodanszky et al, 2ã Edição, John Wiley e Sons, 1976. Por exemplo, os peptideos da invenção podem também ser sintetizados usando-se metodologias de síntese peptidica em soluções-padrão, envolvendo tanto o acopulamento por fases, ou em blocos de fragmentos de aminoácidos oupeptídeos, usando métodos enzimáticos ou químicos da formação da ligação amida. Estes métodos de síntese em solução são bem conhecidos na técnica.

Descobriu-se que os peptideos da invenção exibem actividade biológica similar à da timopentina humana, tal como é desvendado nas Patentes Americanas, Pedidos de patente e artigos acima referidos. Esta actividade biológica é primeiramente evidenciada por um ensaio de medição da indução da produção de GLIP cíclico na linha

CEM das células T, em comparação com a timopentina humana.

A indução da produção de cGMP por um peptídeo da presente invenção neste ensaio indica a capacidade desse peptídeo para ligar à zona receptora da timopentina humana na célula e induz actividade biológica semelhante à timopentina humana.

Vários dos peptídeos em questão oferecem vantagens muito significativas. Muitos peptídeos da presente invenção podem ser caracterizados por resistência à degradaçao enzimática,'tanto por enzimas digestivas, como por enzimas do soro. Consequentemente elas apresentam um tempo de vida médio prolongado in vivo , quando administrado por injecção num individuo. Uma outra vantagem de vários destes peptídeos é a possibilidade de serem administrados por via oral.

Devido às caractoristicas imunomodulatérias dos peptídeos em ques tão, eles são terapêuticamente úteis no tratamento de seres humanos e, possivelmente animais, desde que estes possuam capacidade de induzir a diferenciação e maturação das células T, as quais sao capazes de se envolverem na resposta imunitária corporal.

Como resultado, considera-se que os citados peptídeos possuem usos terapêuticos múltiplos.

Os peptídeos desta invenção são considerados útois no auxílio à imunidade colectiva do corpo, pelo que aumentarão ou ajudarão na estimulação terapêutica da imunidade celular. Os referidos peptídeos da presente invenção, ou composições terapêuticas que os contêm, são geralmente considerados como sendo úteis em qualquer área, em que a imunidade celular é uma solução e particularmente onde existam deficiências na imunidade. Estes peptídeos são, portanto, úteis no tratamento de doenças que envolvam reacções alérgicas e reacções de autoimunidade.

Logo, onde existir um excesso de produção de anticorpos ou de imunidade celular devido a um desíquilibrio de células T, os peptideos em questão podem corrigir esta condição estimulando a acção de células T supressoras. Espera-se ainda que estes peptídeos tenham uso terapêutico em certas doenças de autoimunidade, nas quais se produzem anticorpos danificadores, tal como eritematose lupus sistémica, artrite reumatóide ou condiçoes semelhantes

Na sua aplicação mais ampla, os referidos peptideos e os compostos farmacêuticos, que os contêm, são úteis na regulação do sistema imunitório de um indivíduo, humano ou animal, em estado de carência de tal regulação. Tal como aqui é usado, o termo regula significa que os compostos em questão causam um retorno do sistema imunitório do estado anormal, de doença, para um estado normal, de equlíbrio. Equanto esta regulação pode facilmente encontrar grande aplicação na correcção de deficiências imunológicas (Por exemplo Sindrome de DiGeorge), é também anlicavel para corrigir condições de actividade imunolégica excessiva (por exemplo, doenças da autoimunidade).

A presente invenção inclui, consequentemente, processos para a regulação do sistema imunitório de um ser humano ou animal, em estado de carênciade tal regulação, que compreende a administração, ao referido ser humano ou animal, de uma quantidade imuno-regulatoriamente efectiva de pelo menos um dos peptideos ou de uma das composições farmacêuticas para prática destes processos.

A invenção desenvolve também um processo para o tratamento de condições resultantes de deficiências relativas ou absolutas do sistema imunitório de um indivíduo, particularmente na função supressora de células T, o qual compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapêuticamonte efectiva de, pelo menos, um dos peptideos da presente invenção.

Tal como aqui é usado, o termo quantidade terapêuticamente efectiva significa uma quantidade que é eficaz no tratamento das condições acima referidas. A invenção desenvolve ainda um processo para indução da diferenciação e maturação de células T, o qual compreende a administração a um indivíduo de uma quantidede indutora efectiva de pelo menos um dos peptideos da invenção.

A invenção desenvolve ainda composições farmacêuticas para a prática destes métodos. Para preparação das composições farmacêuticas da presente invenção, um peptideo desta invenção é combinado como ingrediente activo numa mistura íntima com uma substância veicular farmacêutica de acordo corn as técnicas de formulação farmacêuticas convencionais. Esta substância veicular pode tomar uma variedade lata de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral,sublingual, roctal, nasal ou parentérica.

Na preparação das composições sob a forma de dosagem oral preferida, qualquer um dos neios farmacêuticos usuais pode ser usado. Para preparações orais líquidas (por exemplo, suspensões, elixires e soluções), podem ser usados meios compreendendo, por exemplo, água, óleos, álcoois, agentes arornatizantes, conservantes, corantes e semelhantes. Substâncias veiculares tais como: amidos, açucares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração, e substâncias semelhantes podem ser usadas para a preparação de sólidos para administraçao oral (por exemplo pés, cápsulas e comprimidos). Podem também ser usadas formas de libertação controlada. Os comprimidos e cápsulas representam a forma unitária de dosagem oral mais vantajosa devido à sua fácil administração, sendo em tal caso obviamente usadas substâncias veiculares farmacêuticas. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos de açúcar ou revestidos entéricamente por meio de técnicas-padrão.

Para produtos destinados a administração parentérica, a substancia veicular compreende, normaimente, água destilada, apesar de se poderem incluir outros ingredientes, por exámplo, para ajudar em termos de solubilidade ou com o objectivo de conservação. Podem também ser preparadas suspensões injectaveis, sendo em tal caso possível o uso de substâncias veiculares líquidas apropriadas, agentes de suspensão, e semelhantes.

Um peptideo da presente invenção é geralmentc activo quando administrado em quantidade de cerca de lyxj/Kgde peso corporal e, de preferência, no intervalo compreendido entre cerca de 0,001 a cerca de 10 mg/Kg de peso corporal, apesar de baixas dosagens poderem ser úteis. Geralmente, o mesmo intervalo de quantidade de dosagem pode ser usado no tratamento de doenças ou condiçoes mencionadas, em que se pretenda o tratamento de imunodefeciências.

As quantidades superiores (por exemplo, cerca de 10 a 100 mg/Kg de peso corporal) são úteis para supressão de excessiva actividade imunitória.

Os exemplos que se seguem são apresentados para ilustração da invenção, sem a intenção de a limitar especificamente. Mos exemplos e através da memória descritiva, as partes são em peso, a não ser que de outra forma se especifioue. Os exc. nlos aplicam ao seguintes abreviatura:

TFA para ácido trifluor acético;

HOAc para ácido acético;

CHgClg para cloreto de metileno;

CH^CN para acetonitrilo;

DMF para dimetil formamida;

NH^OAc para acetato de amónio; n-BuOH para n-Butanol; pyr para piridina;

DCC para diciclohexilcarbodi-imida;

HOBt para 1-hidroxi-bcnzotriazole;

DMAP para dimetilaminopiridina;

TCA para ácido tricloroacético;

MeOH para metanol;

TLC para cromatografia em camada fina;

THF para tetrahidrofurano;

EtOAc para etilacetato;

NalICO^ para bicarbonato de sódio;

MgSO^ para sulfato de magnésio;

NMM para N-metilmorfolina;

Et^O para éter dietílico;

HPLC para cromatogarfia líquida de elevada realização; Pd/C para paládio em Carbono;

DIEA para di-isopropil-etilamina; iBuOCOCl para iso-butilcloroformato; i-Pr₂O para éter di-isopropilíco;

OIíp para éster paranitrofenílico;

RPMI para meio de cultura de tecidos;

PBS solução tampão fosfato salina.

EXEMPLO í, SÍHTESE DO Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida

Em 40 ml de CI^Cl^ foram dissolvidos 2,25 g de BOC-Pro-(Bzl) Asp-Val. A solução foi arrefecida num banho de gelo e foram adicionados 0,67 g de HOBt e 0,90 g de DCC em 4 ml de DMF. Após agitação durante 10 minutos, foi adicionada uma solução de 0,30 g de isopropilamina em 5 ml de CHgClg. A mistura foi agitada num banho de gelo durante 15 minutos, permitindo-se então o aquecimento até à temperatura ambiente. Após 3 horas, o precipitado foi filtrado. 0 filtrado foi extraído com uma solução de ácido cítrico a 10%, água e uma solução saturada de NaHCO^. A camada orgânica foi seca sobre MgSO^ e o dissolvente foi removido a pressão reduzida. 0 produto removido era um sólido branco que pesava ori2,32 g. A cristalização realizada a partir de EtOAC-i-P^ ginou 1,64 g de produto, cujo ponto de fusão varia entre 179,5 -181,5°C.

A 0,84 g do produto anterior foram adicionados 50 ml de TFA a 40% em Cl^Clg. A solução foi agitada durante 30 minutos e então 0 dissolvente foi removido a pressão reduzida. A adição de éter ao resíduo produziu um sólido: 0 trifluoracetato de Pro-(Bzl)Asp-Val-Isopropilamida.

Em 10 ml de DMF foram dissolvidos 0,93 g de BOC-arginina. A solução foi arrefecida a -20°C e foram adicionados 0,18 ml de KMM seguindo-se 0,22 g de i-BuOCOCl, a mistura foi agitada a -15°C por 20 minutos, depois adicionaram-se 0,18 ml de NMM e uma solução gelada do sal de trifluoracetato acima referido em 10 ml de DMF. Após 30 minutos, o banho de arrefecimento foi removido e a agitação continuada durante 2 horas. A maior parte do dissolvente foi removido a pressão reduzida. Adicionou-se ao resíduo EtOAc e ãgua. As camadas foram separadas e a camada orgânica extraída com uma solução de ácido cítrico e duas veses com uma solução saturada de NaHCO^. A remoção do dissolvente originou um sólido vítreo incolor de 1,44 g de peso. 0 produto foi purificado por cromatografia luminosa em sílica gel 60 e eluída com CH^l^ ϊ MeOH 98:2. 0 primeiro componente da eluição era 0 produto desejado as fracções puras originaram 0,53 g; obtiveram-se outros 0,32 g que continham ligeiras impurezas.

Os 0,53 g do tetrapeptídeo-amida protegido purificado foi hidrogenado com 1 ml de ácido fórmico em 20 ml de MeOH sobre paládio negro. Após uma hora, a mistura foi filtrada através de Celite e lavada com água. 0 MeOH foi removido a pressão reduzida. 0 resíduo foi diluído com água e liofilizado, originando 280 mg.

produto foi purificado por cromatografia em SP-Sephadex eluido com IíH^OAc 0,30 M pH 5. As fracções que continham o centro do t

tr

pico principal, foram combinadas e liofilizadas para originarem 190 mg de um sólido amorfo: Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida.

Análises do aminoâcido : Asp - 1,01; Pro - 1,03; Vai - 0,97;

Arg - 1,00; 96% do peptídeo

Cromatografia em camada fina (Silica Gel 60)

Rf(l)

Rf (II) Rf(lII)

0,44 (n-BuOH:HOA c:H₂0:Pyr/15:3:12:10) 0,65 (EtOAc:Pyr:HOAc:H 0/5:5:1:3:) 0,16 (n-BuOH:HOAc:H₂O/3:l:l)

EXEMPLO 2, SÍNTESE DO Arg-Lys-Asp-Val-Ciclohexilamida

A uma solução de BOC-(Bzl)Asp-ValONp (1,09 g, 2,00 mmol) e ciclohexilamina (0,27 mml, 1,2 eq) em TIIE (10 mml) foram adicionados 0,2/ g de THP. A solução amarela resultante foi agitada durante 24 horas e evaporada a pressão reduzida. 0 óleo residual foi diluido com EtOAc e lavado com NalICOg saturado, 11^,0, ácido citrico a 10(0 e uma solução salina saturada. A fase orgânica foi seca sobre MgSO^, filtrada e evaporada para se obter o dipeptídeo amida protegido .

A solução agitada de IICl dioxano 4,2 1.1 (10 ml) foi adicionado o dipeptídeo protegido (0,71 g, 1,4 mmol). Após 60 minutos, a reacção foi evaporada a pressão reduzida, para originar um sólido incolor como um sal de HC1 do dipeptídeo.

A uma solução agitada do sal de IICl do dipeptídeo, (CBZ)^Arg-(CBZ)-Lys-OHp (1,34 g, 1,4 mmol) e HOBt (0,19 g, 1,0 eq) em DI.IP (10 ml),

( foram adicionados 0,18 ml de NI.ILI. Após 16 horas formou-se um precipitado gelatinoso. A mistura reccional foi temperada com uma solução saturada de NaHCOg, filtrada e lavada com ácido cítrico a

10%, H₂0 e Et^O, A recristalização a partir de HOAc/EtOAc 4% originou (CBZ)^Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-Ciclohexilamida, sob a forma de um sólido incolor, 1,36 g, 73%.

tetrapoptídeo (1,33 g) foi desprotegido em HP/anisole (30 ml/8 ml) durante 60 minutos a 0°C. 0 residuo foi temperado em Et^O e filtrado. Os sólidos recolhidos foram dissolvidos em HOAc a 10% e liofilizados, para originarem Arg-Asp-Val-Ciclohexilamida, 460 mg.

peptideo foi purificado por HPLC; Whatman 17-20 Coluna 10/50 ODS-3, taxa de fluxo 10,0 ml/mn, CI I CN a 10%, NH^OAc 0,01M pH5. Foram usadas três injecções de 150 mg em 3ml de tampão e a fracção eluída entre os 35,0 e os 51,6 minutos foi recolhida. A evaporação parcial a pressão reduzida e a liofilização originaram o tctrapeptídeo amida Arg-Lys-Asp-Val-Ciclohexilamida, sob a forma de um sólido incolor, 410 mg.

Análises do aminoácido ; Arg- 1,00; Lys - 1,00; Asp - 1,00;

Vai - 0,85.

Cromatografia em camada

Iíf(I) = 0,39 Rf(ll) = 0,61 Rf(lII) = 0,90 fina (250y> Silica Gel G) (n-BuOII ;HOA_C : HgO ;ETOAe/l; 1:1:1) (n-BuOII :iI0Ac :H₂0: Pyr/15:3:12:10) (Et0Ac:II0Ac:H0:Pyr/5:1:3:5)

EXEMPLO 3» SINTESE DO Arg-L.ys-Asp-Val-Piperidinoamida

A uma solução agitada de BOC-(Bzl)-Asp-Val-ONp (2,72 g, 5,00 mmol) e piperidina (0,6 ml, 1,2 eq) em THF (10 ml), adicionou-se HOBt (0,68 g, 1,0 eq). Após 48 horas evaporou-se urna solução amarela a pressão reduzida. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em EtOAc e lavado uma vez com uma solução saturada de NaHCO^, Oom NaOH 21.' frio, duas vezes com H^O, uma com ácido cítrico a 10% e uma solução salina saturada. A fase orgânica foi seca cobre I.lgSO^, para originar um óleo incolor, BOC-(Bzl)-Asp-Val-piperidina-amida,

2,36 g .

A purificação realizada por cromatografia luminosa em MeOH/CII^Clp originou o dipeptídeo amida protegido, sob a forma de um sólido incolor, 1,67 g, 67/5.

A HCl-dioxano 4,2 1.1 (10 ml) adicionou-se o dipeptídeo amida protegido (1,06 g, 2,17 mmol). Uma hora depois a solução foi evaporada a pressão reduzida, dissolvida em CII^Cl^ e re-evaporada para originar o sal da HCl, sob a forma de um óleo incolor.

A uma solução agitada de (CBZ) ^Arg-ÍCBZ)-Lys-OIIp (2,08 g, 2,17 mmol) e de óleo incolor acima descrito e HOBt (0,29 g) e DMF (10 ml) adicionou-se NMM (0,29 ml). Uma hora depois iniciou-se a formação de um precipitado. Dezasseis horas depois, a mistura reaccional foi temperada com água. 0 produto foi extraído com EtOAc e lavado com uma solução saturada de NaHCO^, H₂0, ácido cítrico a 10%,

H^O e Et^O. A recristalização a partir de HOAc/EtOAc/Et^O originou (CBZ)^Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-Piperidina-amida, sob a forma de um sólido incolor, 2, 40 g 91%.

tetrapeptídeo protegido (1,87 g, 1,55 mmol) foi transformado numa pasta fluida en Ng-purifiçado HOAc 10% (lOOml), à qual se adicionou Pd/C a 10% (0,8 g). A mistura foi agitada num hidro-

i genador Parr (balão de 500 ml, 43,5 psi) . Aj5ós 48 horas, a mistura reaccional foi filtrada através de um filtro de nylon , parcialmente evaporada, diluída com H₂0 e liofilizada, para originar o tetrapoptídeo bruto, sob a forma de um óleo incolor ,

890 mg.

peptídeo foi purificado por HPLC: Coluna Whatman II—20 10/50

ODS-3, Taxa de fluxo 10,0 ml/mn, CII^CN 10%, NH OAc 0,01 LI, pII5 Foram usadas três injecções de 300 mg em 3 ml de tampão e a fracção eluida entre 23,0 e 44,0 minutos foi recolhida. A evaporação parcial a pressão reduzida e a liofilizaç.ão originaram o tetrapeptídeo amida desejado, a Arg-Lys-Asp-Val-Piperidina-amida , sob a forma de um sólido incolor, 510 mg.

Análise do aminoácido: Arg - 0,95 : Lys - 1,00 ; Asp - 1,02 ;

Vai - 1,00 ; Teor em peptídeo 54,2.

Cromatografia em camada fina (250 /λ , Silica Gel G)

Rf(I) Rf (II) Rf(lII)

0,31 0,53 6,61 (n-BuOII :II0Ac :H₂0 :EtOAc/l: 1:1:1) (n-BuOH:HOAc:H 0:Pyr/l5:3:12:10) (EtOAc:HOAc:IIO:Pyr/5:1:3:5)

A uma solução agitada de BOC-Val (10,86 g, 50,0 mmol) e DIEÀ (8,70 ml, 1,0 eq) metilamina. IIC1 (3,38 g, 1,0 oq) e HOBT (7,66 g, 1,0 eq) em CHgClgSDLIF (85 ml), adicionaram-se DCC (10,32 g, 50,0 mmol). Formou-se um precipitado. Duas horas depois a mistura reaccional foi filtrada e o filtrado evaporado à secura. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em EtOAo e lavado três vezes com uma

e uma solução salina saturada. Após secagem sobre Na_oS0 , a fase orgânica foi filtrada e evaporada para originar um sólido incolor. A trituração em hexanos quentes originou o amida desejada, BOC-Val-Metilamida, 7,98 g, 69%, p.f. 120 a 122°C.

A esta amida (4,60 g, 20,0 mmol) foram adicionados 50 TFA/CII^Cl^ (20 ml). Após agitação durante 30 minutos, a solução foi evaporada a menos de 30°C, o resíduo oleoso foi dissolvido em CH^Cl^, lavado duas vezes com uma solução saturada de UalICO^. A fase orgânica foi seca sobre Na^SO^, filtrada e evaporada para originar Val-I.letilamida, 1,90 g, 73%.

A uma solução agitada de BOC-Bzl-Asp (4,72 g, 14,6 mmol), Val-Llet ilamida (1,90 g, 14,6 mmol), IIOBt (2,24 g, 1,0 eq) em DI'P (20 ml) adicionou-se DCC (3,01 g, 14,6 mmol). Formou-se um precipitado 5 minutos depois. Após 16 horas, a mistura renccional foi filtrada e o filtrado temperado com uma solução de KalICO^ meia saturada.

Os sólidos resultantes foram recolhidos, lavados com H^O, ácido cítrico a 10%, HgO e Et^O e secos ao ar, obtendo-se um sólido incolor. A recristalização a partir de EtOAc originou um dineptídeo amida desejado, 5,85 g, 92%, BOC-(Bzl)-Asp-Val-I.ictilanida.

Ao dipeptídeo amida (3,94 g, 9,05 mmol) foi adicionado TPA 50%/ /CH^Cl^ (20 ml). Após agitação durante 30 minutos, a solução foi evaporada a menos de 30°C e triturada com Et^O, para se obter o dipeptídeo TPA 4,10 g, 100% sob a forma de vidro incolor.

A uma solução agitada de BOC-Pro (1,95 g, 9,05 mmol), o dipeptídeo TPA (4,10 g, 9,05 mmol) , DIEA (1,73 ml, 1,1 eq), DI'AP (0,12 g, 0,1 eq) em D1.IP (20 ml) adicionou-se DCC (1,87 g, 9,05 mmol). Formou-se um precipitado 5 minutos depois. Após 16 horas, a mistura reaccional foi filtrada e o filtrado foi temperado oom uma solução de HaHCO^ meio saturada. 0 sólido resultante foi removido, lavado com 11^0, ácido cítrico a 10%, H^O, e Et?0, e soco

ao ar para originar o tripeptídeo amida desejado, 4,15 g, 86$.

Esta última foi usada sem purificação.

A esta amida (4,15 g, 7,78 mmol) adicionou-se TFA 5O$/CH₂C1₂ (15 ml). Após agitação durante 30 minutos, a solução foi evaporada a menos de 30°C e triturada com Et₂O, para originar o tripeptídeo TPA, 4,25 g, 100$, sob a forma de um sólido incolor.

A solução agitada de 86,9 AOC-Tos-Arg (39,7 g, 7,78 mmol), o tripeptídeo amida (4,25 g 7,78 mmol), KMM (0,86 ml, 1,1 eq), e HOBt (1,19 g, 1,0 eq) em DL1F (15 ml), adicionou-se BCC (l,6l g,

7,78 mmol). Obteve-se um precipitado que se formou 10 minutos depois. Após 16 horas, a mistura reaccional foi filtrada e o filtrado temperado com uma solução de NaHCO^. meio saturada.

sólido resultante foi removido, lavado com H₂0, ácido cítrico a 10$, IlgO, éter, e seco ao ar para originar o tetrapeptídeo amida protegido, 4,82 g, 72$.

Metade do sólido foi desprotegido com TPA 50$ / CII₂C1₂ (10 ml) durante 30 minutos, evaporado a pressão reduzida, e triturado com bt₂O. Osólido resultante foi quebrado oom HP/anisole (30 ml/ /8 ml) durante 60 minutos, a 0°C. 0 resíduo foi transformado numa pasta fluída em EtOAc e extraído duas vezes com HOAc a 10$ (50 ml). Os extractos aquosos são liofilizados, para originarem Arg-Pro-Asp-Val-Metilamida bruta.

peptideo bruto foi purificado em Sephadex SPC-25 (coluna de 2,6 x 83 cm NH^OAc 0,05 a 0,3 M, pH 6,5; gradiente: 100 ml/h taxa de fluxo, 9,5 ml/fraoção, detector 206 nm). As facções 113 -128 foram removidas e liofilizadas, para originarem 925 mg do tetrapeptídeo amida, Arg-Pro-Asp-Val-Metilamida.

Análise do aminoácido: Arg - 1,06 ; Pro - 0,99 ; Asp - 0,95 Vai - 1,00 ; teor em peptífeo 54

Cromatografia em camada fina (250 Silica Gel G)

Rf(I)	= 0,20	(n-BuOHzH^O:Pase superior/4:1:5)
Rf(ll)	= 0,26	(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10)
Rf(lll)	= 0,26	(EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)
EXEMPLO	5. SINTESE DO	II-Formil-Arg-Pro-Asp-Val-Met ilamida

A AOC-(TOS)-Arg-Pro-(Bzl)-Asp-Val-I.’etilamida (1,00 g, 1,17 mmol) adicionou-se HC1 dioxano 4,5 M (10 ml). Após 60 minutos, a massa reaccional foi evaporada, diluida com H^O e liofilizada, para originar o HC1 tetrapeptídeo, sob a forma de um sólido cm pó incolor, 0,92 g, 100%.

sólido foi dissolvido em DIJF (10 ml) e adicionou-se DIEA (0,93 ml, 4,0 eq), DMAP (0,08 g) e p-nitrofenil-formato (200 mg, 1,02 eq). Após duas horas, a mistura reaccional foi tratada com ácido cítrico a 10%, 0 sólido resultante foi filtrado, lavado com H^O e seco ao ar, para se obter o peptídeo amida formilado, 0,41 g.

Este sólido foi quebrado com HF/anisole (30ml/8ml) durante 60 minutos a 0°C. 0 resíduo foi transformado numa pasta fluída em EtOAc e extraído duas vezes com NH^OH 1% (50 ml). Os extractos aquosos foram liofilizados para originarem o peptídeo bruto,

II -Formil-Arg-Pro-Asp-Val-Me t ilamida.

peptídeo bruto foi purificado em DEAE sephadex (Coluna 2,6 x 90 cm, ItH^HCO^ 0,1 LI, não tamponada; Taxa de fluxo 100 rnl/h, ml/fracção detector 206 nm). Recolheram-se as fracções 38-43 e liofilizaram-se para originarem o peptídeo amidado 80 mg.

Análise do Aminoácido: Arg - 1,00 ; Pro - 1,00 ; Asp - 1,00;

Val - 1,00 ; Teor em peptídeo 50%

Cromatografia em Oamada Fina (250y6 Silica Gel G)

Rf(l) = 0,32 (n-BuOH:HOAc:H 0:Fase Superior/4:1:5)

Rf(II) = 0,38 (EtOac:HOAc:HO:Pyr/5:1:3:5)

Rf(lII) = 0,34 (Trifluoretanol:HH H0/l:l)

EXELIPLO 6. SINTESE DO Arn-Lys-Asn-Val-2-Fenilhidrazida

A uma solução agitada de BOC-Val (4,34 g, 20,0 mmol) em THF (40 ml) a 15°C, adicionou-se NUM (2,30 ml) e depois iBuOCOCl (2,64 ml). A pasta fluída resultante foi agitada durante 15 minutos e então adicionou-se fenilhidrazina (1,98 ml), cuidadosaraente. A pasta fluída foi agitada a um intervalo de temperatura de -10°C a 0°C durante uma hora e depois aquecida ató à temperatura ambiente. A mistua reaccional foi filtrada e o filtrado foi evaporado a pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em EtOAc e lavado com uma solução saturada de NaHCO^ ,

H^O e uma solução salina saturada .

A fase orgânica foi seca sobre Ua^SO^, filtrada e evaporada para originar um sólido amarelo laranja. A recristalização a partir de CH₂Cl₂/óter de petróleo originou B0C-Val-2-Fenilhidrazida, sob a forma de um 3Ólido incolor, p.f. 140 - 141°C , 4,96g, 74%.

A uma solução agitada de HC1 dioxano 4,2 I.I (10 ml) adicionou-se B0C-Val-2-Fenilhidrazida (1,13 g, 3,68 mmol). Uma hora depois, a mistura reaccional foi evaporada a pressão reduzida, triturada em Et₂O e filtrada, para dar Val-2-Fenilhidrazida, o sal

di-HCl, sob a forma de um sólido incolor, 1,03 g.

A uma solução agitada do sal di-HCl (1,03 g, 3,68 mmol), BOC-(Bzl)-Asp (0,88 g) e HOBt (0,37 g) em THF (10 ml) adicionou-se NLIM (0,60 ml) e posteríormente DCC (0,56 g) . Formou-se um precipitado quase momentaneamente. Após 16 horas, a mistura reaccional foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida.

resíduo foi dissolvido em EtOAc, lavado com uma solução saturada de NalICO^ e uma solução salina saturada. A fase orgânica foi seca sobre IJaSO^, filtrada e evaporada sob pressão reduzida.

A recristalização a partir de EtOAc/hexanos originou BOC-(Bzl)-Asp-Val-2-Fenilhidrazida, sob a forma de um sólido incolor ,

1,07 e, 64%.

A uma solução agitada de HCl dioxano 4,2 M (10 ml) foi adicionado o dipeptídeo fenilhidrazida (1,07 g, 1,75 mmol). Sessenta minutos depois a solução foi evaporada sob pressão reduzida, para originar um óleo incolor, hidrocloreto de (Bzl)-Asp-Val-2-Fenilhidrazida.

A uma solução agitada de (CBZ) ^Arg-( CBZ)-Lys-OIIp (1,68 g) , o óleo e HOBt (o, 24 g) em DMF (6 ml), adicionou-se LMM (0,6 ml). Após 16 horas, formou-3e um precipitado. A mistura reaccional foi temperada com uma solução saturada com IlaHCO^ e os sólidos foram removidos, lavados com H^O, ácido cítrico a lOÇó, H^O e Et 0.

A recristalização a partir de HOAc 2%/EtOAc originou (CBZ)^Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-2-Fenilhidrazida, sob a forma de um sólido incolor, 2,15 g, 92%.

O peptídeo protegido (1,88 g) foi quebrado em IIF/anisole (30 ml/ /8 ml) durante 60 minutos, a 0°C. 0 resíduo foi temperado em Et^O e filtrado. Os sólidos foram extraídos com HOAc 10% (100 ml) durante 1 hora, filtrados, e o extracto foi liofilizado para originar Arg-Lys-Asp-Val-2-Fenilhidrazida sob a forma de um sólido

incolor, 890 mg peptideo bruto foi purificado numa Coluna CII Sephadex de 2,6 x 88 cm, NH^OAc 0,3 M, não tamponado; Taxa de fluxo 100 ml/h

12,5 ml/fracção, detector 225 nm). Foram recolhidas as facções 270-310 e liofilizadas, para originarem 390 mg do produto final: -Arg-Lys-Asp-Val-2-Fenilhidrazida.

Análise do Aminoáeido: Arg - 0,98 ; Lys - 1,03 ; Asp - 1,00 ;

Val - 0,99 ; Teor em peptideo 93.

Cromatografia em camada fina (250/k Sílica Gel G)

Hf(I) = 0,39 (n-BuOH:HOAc:HO:EtOAc/l:1:1:1)

Rf(II) = 0,51 (n-Bu0H:H0Ac :11^0: Pyr/15 : 3:12 :10)

Rf(lII) = 0,59 (EtOAc:HOAc:IIO:Pyr/5:1:3:5)

EXEMPLO 7. SINTESE DE Arg-Lys-Asp-Val-Anilina-amida

A uma solução em agitação de BOC-Val (4,35 g 20,0 mmol), anilina (3,0 ml, 1,05 eq) e HOBt (3,09 g, 1,0 eq) em DI.TF (20 ml), à temperatura ambiente, adicionou-se DCC (4,12 g, 20,0 mmol) . Formou-se um precipitado fraco em 5 minutos. Quatro horas depois, a reacção foi filtrada e o filtrado foi vertido sobre uma solução meio-saturada de NaHCO^ (500ml).

Formou-se um precipitado e este foi removido. Os sólidos foram lavados com H^O (1:1) e secos ao ar. A recristalização a partir de hexanos/isopropanol originou uri sólido incolor, BOC-Val-anilina-amida anilada, 3,76 g, 64%.

tA-

(ί

300-Val-Anilina-amida (2,50 g, 8,55 mmol) foi dissolvido em TFA/CH^Cl^ 50$ (10 ml) e agitada durante 30 minutos. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida à temperatura ambiente e o resíduo foi dissolvido em CH^Cl^. Esta solução foi lavada duas vezes com uma solução saturada de NaHCO^, seca sobre LlgSO^, filtrada e evaporada para originar o Val-Ànilina-amida , sob a forma de um óleo amarelo claro, 1,42 g, 88$.

A uma solução de BOC-(Bzl)-Asp (2,3Q g, 1,0 eq), Val-Anilina-amida, e HOBt (1,13 g) em DMF (7,5 ml) adicionou-se DCC (1,52 g, 1,0 eq). Formou-se um precipitado e a mistura reaccional foi agitada durante 3 horas. A mistura foi filtrada e o filtrado temperado com uma solução saturada de NaHCO^. Os sólidos resultantes foram recolhidos, lavados com H^O e secos ao ar. A recristalização a partir de EtOAc/éter de petróleo originou uma amida BOC dipeptídeo incolor, p.f. 121 - 122°G, 1,74 g, 46$,

BOC-(Bzl)-Asp-Val-Anilina-amida.

dipeptídeo BOC (1,71 g, 3,44 mmol) foi dissolvido era TFA/CIÍ^Cl^ 50 (10 ml) e agitado durante 30 minutos. A mistura reaccional foi evaporada a pressão reduzida à temperatura ambiente e o residuo triturado em óter, filtrado e seco ao ar.

A solução saturada de BOC-(CBZ)-Lys (l,33 g, 3,50 mmol) em DMF (10 ml) a -20°C adicionou-se ΝΙ&Ι (0,46 ml, 1,2 eq) e então iliuOCOCl (0,46 ml, 1,01 eq). A pasta fluída resultante foi agitada durante 30 minutos e adicionou-se o sal dipeptídeo TFA, seguindo-se a adição de NMM (0,46 ml). A mistura reaccional foi agitada e permitiu-se o seu aquecimento até atingir a temperatura ambiente. Após uma hora, a mistura reaccional foi vertida sobre uma solução meio-saturada de NaHCO^ (200 ml). Formou-se um sólido incolor, este foi removido e seco ao ar. A recristalização a partir de EtOAc/i-Pr^O originou a amida BOC tetrapeptídeo , 2,05 g, 78$, p.f. 164-167°C.

A amida BOC tetrapeptídeo (2,00 g, 2,63 mmol) foi dissolvida em TFA/CH^Cl^ 50% (6 ml) e agitada durante 30 minutos. A mistura reaccional foi evaporada a pressão reduzida à temperatura ambiente e o resíduo triturado em éter, filtrado e seco ao ar, para se obter o sal TFA.

A uma solução agitada de (CBZ)^Arg (1,52 g, 2,63 mmol) em DBF a -20°C, adicionou-se HLIM (0,35 ml, 1,2 eq) e posteriormente iBuOCOCl (0,35 ml, 1,01 eq). A psta fluída resultante foi agitada durante 30 minutos. Adicionou-se então NldM (0,35 ml) seguindo-se a adição do sal TFA. Permitiu-se que a mistura reaccional aquecesse até à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura foi vertida sobre uma solução saturada de NaHCO^ e os sólidos resultantes foram filtrados, lavados com H?0 e secos ao ar. A trituração em EtOlI quente originou o tetrapeptídeo protegido , BOC-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-Anilina-amida, 2,55g, 78%.

A uma pasta fluída do tetrapeptídeo em agitação (2,30g, 1,89 mmol) em trifluoretanol (50 ml) e ácido fórmico (97%, 5 ml) adicionou-se paládio negro (0,95 g). A reacção foi agitada vigorosamente . Apés 1 hora, a solução foi filtrada através de Celite e lavada com H^O. 0 filtrado foi parcialmente evaporado a pressão reduzida e o resíduo foi liofilizado para originar um sólido incolor,' 0,89 g.

peptideo bruto foi purificado numa Coluna Sephadex SPC-25 (Coluna 2,6 x 89 cm, 1ΙΙ.Ί OAc 0,1 a 0,3 Π; gradiente óe pH 5} Taxa de fluxo 100 ml/h, 15 ml/fracção, detector 206 nm). Foram recolhidas as fracções 253-285 e liofilizadas, para originarem 680 mg, Arg-Lys-Asp-Val-Anilinamida.

Análise do Aminoácido : Arg - 1,00 ; lys - 0,98 ; Asp - 1,00 ;

Vai - 1,01 ; teror em peptideo 100%

Cromatografia em Camada Fina (250J*. Sílica Gel G)

Rf(I) = 0,42 (EtOAc:HOAc:II O:Pyr/5:l:3:5)

Rf(II) = 0,32 (n-BuOH:IIOAc:H O:EtOAc/l: 1:1:1)

Rf(lII) = 0,54 (nBuOH:H0Ac:H₂0:Pyr/l5:3:12:10)

EXEI.IPLO 8. ACTIVIDADE BIOLÓGICA; ENSAIO GI.ÍP CICLICO

Este ensaio mede a capacidade de um peptideo desta invenção para se ligar ao receptor da membrana celular da célula CEtl intacta e estimular selectivamente a produção do GI.IP cíclico, tal como o faz a timopentina humana,

A linha de células CEtl foi obtida a partir do American Type Culture Collection of Rockville, tld. As células CEtl foram semeadas de fresco e cresceram durante 3 dias sendo a colheita feita como descrito por T.Audhya et al, Arch. Biochem. Biophys., 234: 167-177 (1984). As células foram lavadas 3 vezes cm PBS e resuspensas em RPLII 1640 a uma concentração de 1,0 x 107 células/ ml e permitiu-se o estabelecimento de equilíbrio a 37°C, durante 30 minutos, antes da adição dos peptideos de ensaio (25 /Ul) e peptideos do controlo, a incubação foi permitida procedendo-se a um banho em água com agitação durante 4 a 5 minutos e terminou-se com a adição de 1 ml de TCA gelado (lOÇj).

As células em TCA foram homogeneizadas para libertarem o nucleotídeo cíclico. A suspensão foi centrifugada a 3000 x g durante 20 minutos a 4°C. 0 precipitado resultante foi dissolvido em

0,111 NaOH, para se determinar o teor en proteínas. 0 TCA foi removido a partir da facção sobrenadante, extraindo-se para tal 4 x com 5 ml de Et^O saturado de água. Após a extracção final , os vestígios restantes de éter foram removidos por aquecimento

ί t

durante 10 minutos num banho de água a 50°C. Após a liofilização, a amostra foi reconstituída em tampão acetato 50mI’ (pH 6,2) para ensaio radioimunológico do GLIP cíclico.

Por exemplo, as curvas dose-resposta de 1 a lOOO^Lg/ml do peptídeo foram avaliados para cada composto. A figura 1 mostra uma curva dose-resposta típica de 6 experiências) para peptideos activos, Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida, Arg-Lys-Asp-Val-Anilina-amida, Arg-Lys-Asp-Val-Ciclohexilamida, Arg-Lys-Asp-Val-Piperidina-amida e Arg-Lys-Asp-Val-Penilhidrazida em comparação com a timopentina e pipetídeos inactivos, Arg-Lys-Asp-Val-Dimetilamida e Arg-Lys-Asp-Val-2-naftilamida em células CELI. Poi determinada uma actividade limiar para cada peptídeo ensaiado, sendo defenida como a concentração mais baixa de peptídeo de ensaio a qual induziu um nivel intracelular do GI1P cíclico superior a dois desvios-padrão acima do controlo. Os controlos apresentaram valores de GLIP cíclico intracelular inferiores a 0,9 picomoles/ml (média + desvio padrão). Os resultados dos ensaios foram considerados positivos quando o nível do GLIP cíclico se apresentou 2 vezes superior ao determinado pelo controlo negativo paralelo. Os peptideos activos possuíam um limiar de actividade no intervalo compreendido entre 1 a 10 Ag/l.

Os resultados do ensaio GLIP cíclico são apresentados na Pigura 1, na qual os peptideos representativos da invenção foram ensaiados em termos de comparação com a timopentina e peptideos do controlo. Estes resultados demonstram a actividade biológica dos peotídeos da invenção na estimulação da actividade supressora de células T nas células CELI.

/ 4

EXEI.IPLO 9. ESTABILIDADE EKZK1ÁTICA

Para ilustrar a estabilidade de urn peptídeo da presente invenção contra a degradação por parte de enzimas intestinais e do soro, um peptídeo éxemplificativo Arg-Pro-Asp-Val-Isopropilamida pode ser incubado a 37°C no suco intestinal do rato e no soro humano até o máximo de 120 minutos. São tratados similarmente, para comparação, os peptideos como Arg-Lys-Asp-Val-Dimetilamida e timopentina. Espera-se que a HPLC revele que o Arg-Lys-Asp-Val-Dimetilarnida é totalinente digerido após apenas alguns segundos . A timopentina ó degradada a 50% sob estas condições em cerca de 20 segundos. Espera-se que os peptideos desta invenção se mantenham substancialmente não degradados, tanto no soro, como no suco intestinal, durante um período de tempo substancialmente mais longo do que o da timopentina ou de um peptídeo de controlo.

./ ρ

EXEMPLO 10. SINTESE DO Arg-Lys-Asp-Val-Eetilamida

A, H -t-butiloxicarbonil-(N-Benziloxicarbonil)-Liail-(β> -benzil)Aspartil-Valina metilamida

Em 50 ml de ácido acético a 85% foram dissolvidos 3,21 g de NO/-butiloxicarbonil-(N-benziloxicarbonil)Lisil-( β -benzil)Aspartil-Valina fenacil éster. Adicionou-se pé de zinco, 5,2 g e a mistura foi agitada vigorosamente durante 1 hora. A mistura reaccional foi filtrada, o filtrado diluído com água e extraído três vezes com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram extraídas com água e uma solução de cloreto de sódio saturada, e posteriormente seca sobre sulfato de sódio anidro. A remoção do dissolvente originpu um óleo. A adição de éter e depois de hexano produziu um precipitado viscoso. Este material foi triturado com hexano até se tornar um sólido branco seco, pesando 1,75 g. 0 produto foi dissolvido em 14 ml de acetato de etilo e 1 ml de dimetilformamida.

Após oongelamento da solução a-20°C, adicionaram-se 0,30 ml de lí-me tilmorf olina, seguindo-se a adição gota a gota, de 0,36 ml de isobutilcloroforrnato .A mistura reaccional foi agitada a -15°C durante 20 minutos, depois adicionaram-se 0,29 ml de L-metilmorfolina e uma solução gelada de 0,18 g de hidroclorelo de metilamina em 10 ml de etanol a 95%. Formou-se um precipitado pastoso. Para facilitar a agitação adicionaram-se 5 ml de DI.1P e a mistura reaccional foi agitada a 0°C, durante 90 minutos, e posteriormente à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura reaccional foi adicionada a 75 ml de água.

A fase orgânica tomou um aspecto de glóTbulos de um sólido ceroso a quando da agitação da mistura. 0 sólido foi filtrado e o filtrado extraído com acetato de etilo. 0 resíduo obtido a partir

da evaporação da fase orgânica foi combinado com o produto sólido e cristalizado a partir de acetato de etilo - éter isopropiA lico. 0 rendimento foi de 1,53 g, p.f. 103,5 —184,5 C. Análises Elementares: C - 61,57 (61,96) H - 7,21 (7,37), II - 9,81 (10,04).

B. Tri-benziloxicarbonil-A;rainil-(H-benziloxicarbonil)-Lisil( (3-benzil)Aspartil-Valina metil amida

A 1,46 g do produto da fase A, foram adicionados 50 ml de ácido trifluoracético 50/ó em cloreto de metileno. Após agitação durante 25 minutos, o dissolvente foi evaporado e adicionou-se éter ao resíduo, obtendo-se um sólido branco. Este material foi filtrado e lavado com éter.

Dissolveram-se 1,33 g de tribenziloxicarbonil-Arginina em 10 ml de D1IP. A solução foi arrefecida gelando a -20°C e adicionaramse 0,25 ml de II-metilrnorfolina, seguindo-qe a adição de 0,31 g de isobutilcloroformato em 2 ml de DI.IP. A mistura foi agitada a -20°C durante 20 minutos, adicionando-se então 0,26 ml de N-metilmorfolina e uma solução gelada de trifluoracetato de tripeptídoo em 10 ml de DLIP. A mistura reaccional foi agitada a -20°C para -10°C durante 30 minutos, e posteriormente à temperatura ambiente, durante a noite. 16 horas depois a mistura foi adicionada a 125 ml de água. 0 precipitado foi removido por filtração e lavado com metanol e acetato de etilo quentes. 0 rendimento foi de 1,74 g, com um ponto de fusão de 118-120°C.

Análise do Aminoácido: Asp - 0,99 ; Vai - 1,03 5 Tyr - 0,99; Lys -0,98; Arg - 1,00 ; 67,7/í do peptideo.

C. Arginil-Lisil-Aspartil-Valina Metil Amida

A desprotecção de 1,72 g do produto obtido na fase B anterior foi levada a cabo pela redução com 2ml de ácido fórmico sobre 1 g de paládio negro em 40 ml de trifluoretanol. A mistura foi agitada rapidamente durante 1,5 horas num frasco arrolhado com um balão.

paládio foi removido por filtração através de Celite, lavando-o com água. A maior parte do trifluoretanol foi removida do filtrado por evaporação rotativa. 0 resíduo foi diluído com ácido acético a 5% e liofilizado. 0 produto pesava 676 mg.

peptídeo foi purificado por cromatografia numa coluna de 2,6 x 85 cm de SP-Sephadex eluído, com um gradiente de NH^OAc 0,20 a 0,50 II, pH 5,5 sobre 3L. Foram recolhidas fracções de 10 ml , monitorizando a 206 nm.

pico maior apareceu nas fracções 185-220: forarn tomados 3 cortes: 185-190, 191-205, 206-220. A liofilização rendeu 21 mg, 497 mg e

235 mg, respectivamente. 0 primeiro corto continha impurezas, os outros dois apresentavam uma pureza superior a 99,5%.

HPLC, -Bondapak rt = 8,5 minutos com IIH^OAc 0,01 M

IJH^OAc pH 5 a 2,0 ml/min.

Análise do Aminoácido: Asp-1,01, Val-0,95, Lys-1,01, Arg-1,02,

56% de peptídeo.

Cromatografia em Camada Fina (Silica Gel 60)

Rf = 0,19 (n-BuOH:IIOAcjH 0:piridina/15:3:12:10)

Rf = 0,15 (EtOAc;pyr:H 0/5:5:1:3)

Rf = 0,45 (TFAtNH 0H/2:l)

EXEMPLO 11. SPiTESE DO Arg-Lys-Aop-Val-2-propilamida

A. cj -BOC-£-(Cbz)-L.ys-( β-Bzl)Asp-Val

A uma solução rapidamente agitada de of -Boc-£ -(Cbz)-Lys-(&-Bzl) Asp-Val fenacil ester (8,02 g, 10,0 mmol) em 85 IIOAc (100 ml), à temperatura ambiente, adicionou-se pode zinco acidificado (12,4 g). A]5ós uma hora a reacção foi filtrada, e o filtrado foi evaporado a vácuo. 0 resíduo oleoso resultante foi triturado em Et^O. Os sólidos, que se formaram, foram removidos, lavados com Et^O e H^O e secos a vácuo a 40°C, para se obter 4,95 g, 72%.

B. -Boc-Σ-(Cbz)-I»ys-( β-Bzl)-Asp-Val-IÍIICH( CH)_?

A uma solução agitada do tripepetídeo BOC (1,00 g, 1,/|6 mmol) em THF (5 ml) a -15°C, adicionou-se líIiLí (170 /xl, 1,0b eq) e o iBuOCOCl (195Al, 1,03 eq). A solução fracamento turva resultante foi agitada durante 15 minutos e posteriormente adicionou-se então 2-propilamida (150/xl, 1,1 eq). A reacçao foi aquecida a

-5°C. Formou-se um sólido gelatinoso e permitiu-se então que a mistura reaccional aquecesse até atingir a temperatura ambiente. 16 horas depois, a mistura reaccional foi evaporada a vácuo a 30°C e o resíduo sólido foi lavado com ácido cítrico a 10%,

I-IgO, solução saturada de HalICO^ e H^O. A secagem ao ar originou ura tetrapeptídeo amida Boc incolor, 2,58 g, 55%.

0, (Cbz^Arg-F -(Cbz)Lys-( β -Bzl)Anp-Val-IHIClI( C-₃)₂ tripeptídeo amida Boc (0,55 g, 0,76 mmol) foi dissolvido em

11C1 dioxano 4,4 H (5 ml) e agitado durante 45 minutos. A solução foi evaporada a vácuo e o sólido trituradh em Et 0. A filtmeãn - 2 ^J originou um tetrapeptídeo amida IIC1 incolor, 0,51 g, 100%.

A uma solução agitada de tripeptídeo amida IICl, (Cbz)^Arg p-nitrofenil-éster (O,53g, 1,0 eq) e IIOBT (0,12 g, l,0eq) em DI.IP (5 ml), à temperatura ambiente, adicionou-se líI.UVl (92/Vl, 1,1 eq). Pormou-se lentarnente um precipitado durante 16 horas. A mistura reaccional gelatinosa foi agitada com uma solução saturada de HalICO^ e filtrada. 0 resíduo sólido foi lavado com H₂0, ácido cítrico a 10%, H^O e h't₂O. 0 tetrapeptídeo protegido resultante foi recristalizado a partir de HOAc/EtOAc 1, para originar um sólido incolor, 743 mg, 83%.

D. Arg^ys-Asp-Val-IIHCIICCII )„ tetrapeptídeo protegido (0,70 g, 0,59 mmol) foi transformado numa pasta em IIOAc 90% (50 ml). A mistura foi purgada com N₂e carregada com Pd-C 10% (0,4 g). A hidrogonaçao num dispositivo misturador Parr (vaso de 250 ml, Po = 52,0 psi) durante 64 horas, filtração através de um filtro de nylon de o,45 , evaporaçao parcial e liofilização originaram o tetrapeptídeo bruto, 385 mg.

peptídeo bruto foi purificado numa coluna CL Scphadex (2,6 x 93 em, 1,71, 0,21.1, depois 0,3M NH^OAo, nao tamponado; taxa de fluxo 100 rnl/h, 10 ml/fracção, detector 225 nm). A fracções 335-370 foram retiradas e liofilizadas para se obter 231 mg.

Análise do Aminoâcido: Arg-1,00 ; Lys-1,02; .2.ου-0,98; Val-1,00;

Teor en peptídeo 80 , 3p,

Cromatografia em Camada Pina (25QA- Silica Gel G)

Rf

0,24 (n-BuOH:II0Ac:ÍI₂0 :IStOAc/l:1:1:1)

0,52 (n-Bu0II:H0Ac:II 0:piridina/l5:3:12:10) 0,61 (EtOAc :H0Ac :Ií₂0 :piridina/5 :1:3:5)

EXEMPLO 12. SINTESE DO N-Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-N-mctilamida

A Aoc + (Tos) Arg-Pro-(β -Bzl)Asp-Val-NH^ (1,50 g, 1.75 mmol) adicionou-se HCl dioxano 4,5 LI (10 ml). 45 minutos depois a massa reaccional foi evaporada, diluída com HgO e liofilizada, para originar o tetrapeptídeo HCl, sob a forma de um sólido poroso incolor, 1,38 g, 99% sólido foi dissolvido em DMF (10 ml) e adicionou-se DIEA (1,4 ml 4 eq), DMAP (0,11 g) e AC^O (1,0 ml). Após 1 hora,'a mistura reaccional foi tratada com ácido cítrico 10%. 0 sólido resultante foi filtrado, lavado com H^O e seco ao ar. A trituração em EtOAc quente originou o tetrapeptídeo acetilo protegido, 1,42 g 100%.

Este sólido foi clivado com HF/anisole (30 ml/8 ml), durante 60 minutos, a 0°C. 0 resíduo ó transformado numa pasta fluída em EtOAc e extraído 2 vezes com HOAc 10 (50 ml). Os extractos aquosos foram liofilizados para se obter o Ac-Arg-Pro-Asp-ValNHCII^.

peptídeo bruto foi purificado numa coluna DEAE Sephadex (coluna com 2,6 x 90 cm, O,1M NH^IICO^, não tamponado , taxa de fluxo 100 ml/hora, 10 ml/fracçao, detector 260 nm). As fracções 32-40 foram retiradas e liofilizadas, para originarem 345 mg, 32%.

Análise do Aminoácido: Arg-0,98; Pro-0,97; Asp-1,00; Val-1,05;

Teor em peptídeo 87%

Cromatografia em Camada Fina (25O/< Silica Gel G)

Rf =0,39 Rf =0,56 Rf = 0,76 (n-BuOH jIIOAc:II 0: EtOAc/l :1:1:1) (n-BuOII :HOAc:11^0 :piridina/l5 :3:12:10) (EtOAc:HOAc :11^0 : piridina/5 :1:3:5)

fí ³⁹

Os exemplos anteriores foram apresentados com objectivos ilustra tivos apenas, e não limitam o âmbito da presente invenção, o qual está estabelecido pelas reivindicações que se seguem.

*

Claims

REIVINDICAÇÕES :

- Processo para a produção de um péptido que tem actividade como supressor de células T e a capacidade de aumentar a actividade de cGMP em CEM da linha de células humanas T caracterizado pelo facto de o referido péptido ser escolhido do grupo formado pelos péptidos de fórmula

R-Arg-X-Asp-Y-NR¹R² na qual R significa H, alquilo inferior, acetilo, formilo, alcanoilo inferior; X é Pro, desidro-Pro, hidroxil-Pro, D-Lys, Aib ou Lys; Y é Gly ou uma forma D ou L de um aminoácido escolhido entre Vai, Ala, Ile, Leu, Asp, Glu, Gin, ou Lys;

1 2

R é H e R é alquilo inferior ou alcenilo com 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo ou cicloalcenilo com 4a8 átomos de carbono, arilo ou NHR^, em que R^ é um radical alquilo inferior com 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo ou cicloalcenilo oom 4 a 8 átomos de carbono ou arilo; ou 1 2

R e R conjuntamente compreendem uma cadeia de metileno com 4 a 7 átomos de carbono, e compreender realizar-se a sintese do mencionado péptido em fase sólida.
2ê - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado polo facto de, no citado péptido X ser Pro ou Lys e Y ser Vai.
3ê - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado péutido ser escolhido do grupo formado por

Arg-Pro-Asp-Val-isopropilamida,

Arg-Lys-Asp-Val-anilinoamida,

Pormil-Arg-Pro-Asp-Val-me t ilamida, Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-met ilamida, Arg-Pro-Asp-Val-metilamida,

Arg-Lys-Asp-Val-metilamida,

Arg-Lys-Asp-Val-2-fenil-hidrazida, Arg-Lys-Asp-Val-piperidinoamida, Arg-Lys-Asp-Val-ciclo-hexilamida e Arg-Lys-Asp-Val-isopropilamida.

45 - Processo para a preparação de um péptido que tem a capacidade de aumentar a actividade de cGMP em CEI.I da linha de células humanas T e é escolhido do grupo formado pelos péptidos de fórmula

R-Arg-X-Asp-Y-NR¹R² na qual

R significa H, alquilo inferior, acetilo, formilo, alcanoilo inferior;

X é Pro, desidro-Pro, hidroxil-Rro, D-Lys, Aib ou Lys;

Y é Gly ou uma forma D ou L de um aminoácido escolhido entre Vai,

Ala, Ile, Leu, Asp, Glu, Gin, ou Lys;

1 2

R é H e R é alquilo inferior ou alcenilo com 1 a 10 átomos de carbono, cicioalquilo ou cicloalcenilo com 4 a 8 átomos de carbono, arilo ou NHR^, em R^ é um radical alquilo inferior com

1 a 10 átomos de carbono, cicioalquilo ou cicloalcenilo com 4 a
8 átomos de carbono ou arilo; ou 1 2

R e R conjuntamente compreendem uma cadeia de metileno com 4 a 7 átomos de carbono, caracterizado pelo facto de compreender realizar-se a síntese do mencionado péptido em solução.

55 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de no mencionado péptido, X ser Pro ou Lys e Y ser Vai.

65 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido péptido ser escolhido no grupo formado por

Arg-Pro-Asp-Val-isopropilamida, Arg-Lys-Asp-Val-anilinoamida, formil-Arg-Pro-Asp-Val-metilamida, acet il-Arg-Pro-Asp-Val-metilamida,

Arg-Pro-Asp-Val-metilamida,

Arg-Lys-Asp-Val-met ilamida,

Arg-Lys-Asp-Val-2-fenil-hidrazida, Arg-Lys-Asp-Val-pepiridinoamida, Arg-Lys-Asp-Val-ciclo-hexilamida e Arg-Lys-Asp-Val-isopropilamida.

75 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg- Pro- AspVal- isopropilamida.

85 - Processo de acordo com as reivindicaçães 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Lys-AspVal-anilino-amida.

95 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracter:.

zado pelo facto de, como produto final, se obter formil Arg-ProAsp-Val-metilamida.

105 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter acetil-ArgPro-Asp-Val-metilamida.

115 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Pro-Asp-Val -metilamida.

125 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Lys-Asp-Val-metilamida.

135 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Lys-Asp

-Val-2-f enil-hidrazida

14^ - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-LysyAspVal-piperidino-alida.

155 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Lys-Asp-Val-ciclo-hexilamida.

165 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter Arg-Lys-Asp-Val-isopropilamida.

175 - Processo para a preparação de composições farmacêuticas que regulam num paciente humano o seu sistema imune, caracterizado pelo facto de compreender misturar-se urna quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos um péptido de acordo com as reivindicações 1 a 17, com uma substância ou mistura de substâncias veiculares e/ou auxiliares apropriadas para a obtenção duma formulação farmaceuticamente aceitável.

185 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a formulação farmacêuticaser adequada para administra ção por via oral.

195 - Processo para regular uma defeciencia ou um excesso de função das células T num paciente, caracterizado pelo facto de se administrar ao mencionado paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos um péptido de acordo com as reivindicações 1 a 17, de preferência, compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal no caso de se pretender tratar uma imuno defeciência e, entre cerca de 10 e cerca de 100 mg/kg de peso corporal, no caso de se pretender suprimir o excesso de actividade imune

Lisboa, 28 de Setembro de 1989

O Agente Oficial da Propriedade Industrial

Λ t _

América da ίίνε CauvaUio

Agente Oficial da Prrpriaada ladurtrial R.CmííIIíb, 501-3. fc.-10íi01-ISÕOA lelefs. 65 1 3 39 - 65 46 1 3

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FIG. /

Arg- Pro- Asp - Vai- Isopropi lamida

-*Arg-Lys-Asp-Val-2- Naftilatnicfa

-ΘArg- Lys-Asp- Vol- Anilinamida

-^θArg-Lys-Asp-Vol- Dimafi/amda

-ΔArg- Lys-Asp- Va/- Fenil - tíidt-Qz/do

-*Arg-Lys- Asp - Vai- Piporidioamida

-θ-Arg-Lys - Asp - Vai- Cyc/o - H&àlamida

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