JPH0689029B2

JPH0689029B2 - 効力のあるサイモペンチン類似体

Info

Publication number: JPH0689029B2
Application number: JP60141464A
Authority: JP
Inventors: ギデオン・ゴールドスタイン; ジヨージ・ヒーブナー; ダニエル・クルーン; タパン・オードヤ
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1994-11-09
Anticipated expiration: 2009-11-09
Also published as: NZ212461A; FI92325B; DK171238B1; DK289285D0; IL75637A; CA1269499A; ZA854832B; JPS6118799A; US4629723A; EP0166612A3; DK289285A; AU4421585A; DE3586697T2; IL75637A0; NO167924B; KR860000314A; KR920006563B1; FI852522L; AU592309B2; FI852522A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に新規な免疫変調（immunomodulatory）
に関し、とくに大きく増大した効力を有するペプチドの
サイモペンチン（thymopentin）の類似体に関する。

米国特許第4,190,646号および同第4,261,886号は、米国
特許第4,002,740号および同第4,077,949号に記載されて
いるサイモポイエチンとして知られている長鎖ポリペプ
チドに類似する活性を有する種々のペンタペプチドを開
示している。サイモポイエチンはＴ細胞の分化を選択的
に刺激する。米国特許第4,190,646号中に開示されてい
るペンタペプチドは、配列H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OHを
有し、サイモポイエチンのペンタペプチドまたは「サイ
モペンチン（thymopentin）」として知られている。こ
れらのペプチドのあるものの生物学的活性は、文献MEウ
エクスラー（Weksler）ら、ジヤーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）148:996−100
6（1978）に記載されている。上記の米国特許および文
献をここに引用によつて加える。米国特許第4,361,673
号および同第4,420,424号は、また、サイモポイエチン
に類似する活性を有すると主張されている種々のペプチ
ドを開示している。ウシ脾から単離されかつ「スプレニ
ン（splenin）」と呼ばれる同様な構造は、アウドヒア
（Audhya）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、
20、6195-6200（1981）およびプロシーデイング・オブ
・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro
c.Nat.Acad.Sci.）（USA）、81、2847-2849（May1984）
に記載されている。この物質はＴ細胞およびＢ細胞の両
者の誘導（induction）を刺激する。

ある種の酵素抵抗性免疫変調ペプチドは、1983年11月18
日に提出したわれわれの同時係属米国特許出願第553,28
1号（ここに引用によつて加える）に記載されている。

サイモペンチンは動物および人間の免疫系へ変調効果を
及ぼすことが示され、そしてこうして免疫機能の欠乏ま
たは過剰として現われる免疫機能の欠陥を包含する病気
の処置に有用である。例えば、次の文献を参照：アウド
ヒア（Audhya）、T.およびゴルドステイン（Goldstei
n）、G.,インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・ペプ
チド・アンド・プロテイン・リサーチ（Int.J.Pept.Pro
tein Res.,22、568-572（1983）；アイウチ（Aiuti）
ら、ランセント（Lancet）1;551-555（1983）；および
レビンスキー（Levinsky）ら、１次免疫欠損病（Primar
y Immunodeficiency Diseases）、ウエツジウツド（Wed
gewood）、ローゼン（Rosen）およびパウル（Paul）
編、19、273-276（1983）。本発明に含まれる他の背景
の物質および生物学的方法について、これらの文献およ
び前述の特許を参照されたい。

本発明は、サイモペンチンまたはスプレニンよりも驚く
ほどに効力があり、こうして免疫欠損（immuno defect
s）の処置において有意な利点を提供する。

本発明は、次の式を有する新規なペプチドおよびその製
薬学的に許容されうる酸または塩基の付加塩に関する：Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−R¹ （Ｉ）式中、ＲはＨ、低級アルキル、ホルミル、または低級アルカノ
イルであり、ＶはARGまたはD-ARGであり、ＷはLYS、D-LYS、PRO、デヒドロ、PRO、またはAIBであ
り、ＸはASP、D-ASP、GLUまたはD-GLUであり、ＹはVAL、LYS、LEU、ILE、GLU、ALA、GLN、D-VAL、D-LY
S、D-LEU、D-ILE、D-GLU、D-ALAおよびD-GLNであり、ＺはPHE、HIS、TRP、D-PHE、D-HISまたはD-TRPであり、 R¹はOHまたはNR²R³であり、そして R²およびR³は各々独立にＨまたは低級アルキルから選択
され、ただしＷがLYSであり、ＸがD-ASP、GLUまたはD-GLUであ
りかつＹがVALであるとき、ＺはPHE以外である。

本発明のペプチドはサイモペンチンまたはスプレニン自
体のそれらのほぼ10倍の効能でサイモペンチン様または
スプレニン様活性を有することが驚くべきことには発見
された。

ＷがPRO、デヒドロPROまたはAIBである本発明のペプチ
ドは、また上の特許出願に開示されているように、酵素
による分解に対して驚くほどの抵抗性を有する。

上に示したように、本発明はサイモポイエチン様活性を
有する新規なペプチド、これらのペプチドを含有する治
療学的組成物、およびそれらの使用法に関する。

広い範囲において、本発明は次式Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−R¹ （Ｉ）式中、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、ＺおよびR¹は上に定義した
とおりである、を有するペプチドまたはその製薬学的に許容されうる酸
または塩基の付加塩を提供する。本発明の好ましいペプ
チドは、ＺがPHE、D-PHE、HISまたはD-HISであり、とく
にＷがまたPROである式（Ｉ）のものである。より好ま
しいペプチドは、Ｒが水素、または低級アルキルであ
り、ＶがARGであり、ＸがASPであり、そしてＺがPHEま
たはHISであり、とくにＷがまたPROである式Ｉのもので
ある。なおより好ましいペプチドは次のものである:H-A
RG-LYS-ASP-VAL-PHE-OH,H-ARG-LYS-ASP-VAL-HIS-OH,H-A
RG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH,H-ARG-PRO-ASP-VAL-HIS-OH,H-A
RG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH,α‐アセチル‐ARG-PRO-ASP-VA
L-PHE-NH₂，および低級アルカノイル‐ARG-PRO-ASP-VAL
-PHE-OH。

ここで使用するとき、「低級アルキル」という語は、１
〜６個の炭素原子を有する分枝鎖状および直鎖状の飽和
炭化水素、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ペンチル、ヘキシルなどであり、一方「低級ア
ルカノイル」という語はを意味する。

これらのペプチドと塩を形成できる酸として、次のもの
を述べることができる：無機酸、例えば、塩酸、臭化水
素酸、過塩素酸塩、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸
など、および有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン
酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シユウ酸、マロ
ン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル
酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルフアニル酸な
ど。

これらのペプチドと塩を形成できる塩基として、次のも
のを述べることができる：無機塩基、例えば、水酸化ナ
トリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど、
および有機塩基、例えば、モノ‐、ジ‐およびトリ‐ア
ルキルおよびアリールアミン（例えば、トリエチルアミ
ン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルア
ミンなど）および置換されていてもよいエタノールアミ
ン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンな
ど）。

この開示を通じて、それらの製造において使用されるペ
プチドのアミノ酸成分およびある種の物質を便宜上略号
により識別する。これらの略号は次の通りである：アミノ酸略号 L-アラニン ALA D-アラニン D-ALA L-アルギニン ARG D-アルギニン D-ARG L-アスパラギン酸 ASP D-アスパラギン酸 D-ASP L-グルタミン酸 GLU D-グルタミン酸 D-GLU L-グルタミン GLN D-グルタミン D-GLN L-ヒスチジン HIS D-ヒスチジン D-HIS L-イソロイシン ILE D-イソロイシン D-ILE L-ロイシン LEU D-ロイシン D-LEU L-リジン LYS D-リジン D-LYS α‐メチルアラニン AIB L-フエニルアラニン PHE D-フエニルアラニン D-PHE L-プロリン PRO L-トリプトフアン TRP D-トリプトフアン D-TRP L-バリン VAL D-バリン D-VAL L-チロシン TYR 本発明のペプチドは一般に既知に技術に従い製造でき
る。便利にはペプチドは最初にメリフイールド（Merrif
ield）、JACS、85、2145-2154（1963）に記載された固
相合成技術により製造できる。このような方法は、前述
の先行技術のあるものに開示されている。他の技術は、
例えば、M.ボダンスズキー（Bodanszky）ら、ペプチド
・シンセシス（Peptide Synthesis）ジヨン・ウイリー
・アンド・サンズ（John Wiley＆Sons）、第２版、1976
ならびにこの分野において知られている他の参考文献に
おいて見出すことができる。このような合成において有
用な保護基およびそれらの略号は、上のテキストならび
にJ.F.W.マクオミー（McQmie）、有機化学における保護
基（Protective Groups in Organic Chemistry）、プレ
ナム・プレス（Plenum Press）、ニユー・ヨーク（New
York）、1973中に見出されるである。これらの本の両者
を引用によつてここに加える。ここで使用する普通の保
護基はt-ブチルオキシカルボニル（BOC）、ベンジル（B
ZL）、t-アミルオキシカルボニル（AOC）、トシル（TO
C）、o-ブロモフエニルメトキシカルボニル（BrZ）、2,
6-ジクロロベンジル（BZLCl₂）およびフエニルメトキシ
カルボニル（ＺまたはCBZ）である。

ＸがASPまたはD-ASPである本発明のペプチドは、前述の
米国特許および文献中に開示されているように、サイモ
ポイエチンに類似する生物学的活性を示す。この生物学
的活性は、ヒトＴ細胞系統における環式GMPの生産の誘
導をサイモポイエチンと比較して検定測定することによ
り立証される。この検定における試験ペプチドによる環
式GMP生産の誘導は、試験ペプチドが細胞上のサイモポ
イエチン受容体部位に結合し、そしてサイモポイエチン
様生物学的活性を誘導する能力を示す。下に表わす結果
から理解できるように、本発明ペプチドはサイモペンチ
ンよりも約10倍まで効力があり、こうして有意な利点を
提供する。ペプチドを製造する費用および生きている系
においてしばしば観測されるペプチドの急速な分解のた
め、増大した効能を有するここにおけるもののようなペ
プチドは高く評価される。

ＸがASPまたはD-ASPである主題のペプチドの生物学的活
性は、また、これらのペプチドをサイモポイエチンの活
性部位のための細胞膜へ結合することにより示される。

ＸがGLUまたはD-GLUである本発明のペプチドは、シエイ
ド（Scheid）ら、ジヤーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メデイシン（J.ExpMed.）147:1727-1743（1978）の
検定において示されるように、スプレニンに類似する生
物学的活性を示し、そしてThy-1^-細胞のThy-1⁺T細胞へ
の分化およびLyb-2^-細胞のLyb-2⁺B細胞への分化を起こ
す。

本発明がなされる以前において、５位置のアミノ酸チロ
シンをフエニルアラニン、ヒスチジンまたはトリプトフ
アンで置換することにより、サイモペンチンに比較して
このような増大した効能を有するヘプチドを製造できる
であろうことは完全に予測されえなかつた。前述の参考
文献は、一般に、５位置におけるチロシンまたはチロシ
ン様アミノ酸残基の必要性を示す。本発明のペプチドの
使用によりこのような大きく増大した効能を達成できる
であろうことは、この分野において確かに示唆は存在し
なかつた。

本発明のペプチド類の免疫変調特性のために、それらは
人間および動物の処置において有用である。なぜなら、
それらは体の免疫応答において参加できる胸腺誘導（th
ymus-derived）細胞（Ｔ細胞）への造血組織中のリンパ
造成幹細胞の分化を誘導する（induce）能力を有するか
らである。その結果、本発明のペプチドは多数の治療学
的用途を有すると考えられる。

主として、前記化合物は胸腺の示した機能のあるものを
実施する能力を有するので、それらは種々の胸腺機能お
よび免疫の領域における用途を有する。１つのこのよう
な用途はジジヨージ症候群（Di George Syndrome）、す
なわち、胸腺の先天性不存在が存在する状態の処置であ
る。ジジヨージ症候群の患者への本発明のペプチドの１
種の適用は、この欠損を克服を促進するであろう。免疫
学の分野における専門家は、適当な投与の道筋（好まし
くは非経口的）を容易に決定でき、そしてジジヨージ症
候群の処置のための本発明のペプチドの１種の有効量を
容易に決定できるであろう。本発明のペプチドはサイモ
ペンチンよりも効力があるので、先行技術のペプチドよ
りも治療学的に有用である。

さらに、本発明のペプチド類は体の全体の免疫（collec
tive immunity）を促進する上で有用であると考えら
れ、それらは細胞の免疫の治療学的刺激を増加または助
進し、これにより慢性の感染、例えば、菌またはマイコ
プラズマの感染、結核、癩、急性および慢性およびウイ
ルスの感性などを包含する病気の処置において有用であ
る。

本発明の化合物は、細胞免疫が１つの結果（anissue）
である領域において、とくに前述のジシヨージ症候群に
おけるような免疫の欠損が存在する場合に有用である。
こうして、バランスされないＴ細胞およびＢ細胞のため
過剰に抗体が生産される場合、本発明のペプチド類はＴ
細胞の生産を刺激することによりこの状態を正すことが
できる。こうして、それらは傷害性抗体が生産されるあ
る種の自己免疫病、例えば、全身の紅斑性狼瘡、リウマ
チ様関節炎などにおける治療学的使用が期待される。

ＸがGLUまたはD-GLUである本発明のペプチド類は、抗体
を生産できる成熱Ｂ細胞への前駆体Ｂ細胞の分化を誘導
するためにまた有用である。こうして、それらはこのよ
うな分化機構の欠損が存在する、Ｘ結合乳児ハイポガン
ヤグロブリネミア（X-linked infantile hypo gammaglo
bulinemia）のような状態の処置において有用である。

最も広い用途において、本発明の化合物は、調節が必要
である患者である人間または動物の免疫系の調節におい
て有用である。ここで使用するとき、「調節」は本発明
の化合物が免疫系を異常な病気の状態から正常のバラン
スされた状態にもどさせることを意味する。この調節は
免疫学的欠損（例えば、ジジヨージ症候群）の補正にお
いて大きい用途を良好に見出すことができるが、またそ
れは過剰の免疫学的活性（例えば、自己免疫病）の状態
を補正するために使用できる。したがつて、本発明は、
調節を必要とする患者に免疫調節的に有効果の本発明の
化合物の１種を投与することからなる患者の免疫を調節
する方法、ならびにこれらの方法を実施するための製薬
学的組成物を包含する。

本発明は相対的または絶対的Ｔ細胞またはＢ細胞の欠損
から生ずる状態を有する患者（人間または動物）に治療
学的に有効量の式（Ｉ）のペプチドを投与することから
なる、前記患者における前記状態を処置する方法を提供
する。また、患者に治療学的に有効量の式（Ｉ）のペプ
チドを投与することからなる、患者の胸腺の相対的また
は絶対的欠損から生ずる状態を処置する方法を提供す
る。ここで使用するとき、「治療学的に有効量」は、そ
れぞれ、Ｔ細胞またはＢ細胞の欠損、あるいは胸腺の欠
損から生ずる状態を処置するために有効な量を意味す
る。また、本発明は、患者に有効誘導量の式（Ｉ）のペ
プチドを投与することからなる、患者のリンパ造成幹細
胞（lymphopoietic stem cell）を誘導して胸腺誘導リ
ンパ球の特性を発現する方法を提供する。また、本発明
は、患者に有効誘導量の式（Ｉ）のペプチドを投与する
ことからなる、患者の前駆体Ｂ細胞を誘導して成熱Ｂ細
胞の特性を発現させる方法を提供する。さらに、本発明
はそれらの方法を実施するための製薬学的組成物を提供
する。

本発明の製薬学的組成物を調製するため、式Ｉのペプチ
ドまたはその塩基もしくは酸の付加塩を活性成分として
慣用の製薬学的配合技術に従い製薬学的担体と組み合わ
せる。この担体は投与、例えば舌下、経直腸、鼻または
非経口の投与に望む調製の形態に依存して広範な種々の
形態を取ることができる。経口的投与形態の組成物を調
製するとき、通常の製薬学的媒質、例えば、経口的液体
の製剤（例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液）の場
合において、水、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着
色剤など、あるいは経口的固体の製剤（例えば、粉剤、
カプセル剤および錠剤）の場合において、でんぷん、
糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのよ
うな担体のいずれを使用することもできる。調節された
解放形態を用いることもできる。投与が容易であるた
め、錠剤およびカプセル剤は最も有利な経口的投与単位
形態を表わし、この場合固体の製薬学的担体が明らかに
用いられる。必要に応じて、標準技術により糖で被覆す
るかあるいは腸溶皮で被覆することができる。

非経口的製品のために、担体は通常無菌の水からなる
が、例えば、溶解を促進する成分または防腐剤を含むこ
とができる。また、注射用懸濁液を調製することがで
き、この場合において適当な液状担体、懸濁剤などを用
いることができる。

本発明の目的は、一般に、約１μg/kg体重以上の量で非
経口的に投与するとき活性である。ジジヨージ症候群
（Di George Syndrome）を処置するため、ペプチドは約
0.1〜約10mg/kg体重の量で非経口的に投与できる。一般
に、同一範囲の投与量を免疫欠損を処置すべき他の病気
または状態の処置において使用できる。これらより多い
量（例えば、約10〜1000mg/kg体重）は過剰の免疫の活
性のために有用である。

本発明のペプチド類はサイモペンチンの類似体であり、
他のサイモペンチン類似体より酵素的分解に長く抵抗す
るとはいえ、血流中には比較的短時間滞留した後分解さ
れ、その上相対的に低用量が投与されるので、本発明の
ペプチド類が体内に蓄積し毒性による著しい副作用を示
す可能性は殆どない。

次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実
施例および明細書を通じて、特記しないかぎり、部は重
量による。

実施例Ｉアルキニル‐リシル‐アスパルチル‐バリル‐フエニル
アラニン、溶媒和BOC-PHE-O-CH₂‐樹脂クロロメチル化樹脂（1.04ミリモルCl/g;5g）および無
水KF（0.44g;7.5ミリモル）を、オーバヘツドの攪拌機
をもつ丸底フラスコ内のDMF（40ml）中のBOC-PHE-OH
（1.33g;5ミリモル）の溶液に加えた。この反応混合物
を65℃において24時間攪拌した。次いで樹脂を過し、
DMF、DMF/H₂O（1:0;H₂O;EtOH/H₂O（1:1）、EtOHおよびC
H₂Cl₂でよく洗浄した。樹脂上のBOC-PHE-OHの置換は、
アミノ酸分析に基づいて、樹脂の1gにつき0.545ミリモ
ルであつた。

ARG-LYS-ASP-VAL-PHE Z-ARG（Z,Z）‐LYS（Ｚ）‐ASP（●BZL）‐VAL-PHE-OOH
₂‐樹脂を固相法により手動的に組み立てた。このアミ
ノ酸誘導体およびDCCを次の結合のため３倍過剰量で使
用した:Z-ARG（Z,Z）‐OH、BOC-LYS（Ｚ）‐OH、BOC-AS
P（●BZL）‐OHおよびBOC-VAL-OH。次いでこのペプチド
‐樹脂（3.1g）をHF/アニソール（Anisol）（9:1;30m
l）で０℃において１時間切り離した。HF/アニソールの
除去後、ペプチド‐樹脂混合物を過し、エーテル（３
×20ml）で洗浄した。このペプチドを５％のHOAc/H₂O
（３×50m）で抽出し、凍結乾燥して800mgの生成物を得
た。次いでこの粗成ペプチドをセフアデツクス（Sephad
ex）‐SPC-25カラム（80cm×2.5cm）（0.2モルのNH₄OA
c、pH5で平衡化した）で精製した。流速は85ml/時であ
り、そして10ml/管の分画を集めた。所望生成物は管145
-167間で溶離された。これらの分画をプールし、そして
凍結乾燥して750mgの物質を得た。このペプチドをさら
にセフアデツクスG-10カラム（80cm×2.5cm）のクロマ
トグラフイーにかけ、H₂Oで溶離した。流速は18ml/時で
あり、そして10ml/管の分画を集めた。表題ペプチドは
管21-26間で溶離された。

薄層クロマトグラフイー（シリカゲルF60;200ミクロ
ン） Rf0.23（n-BuOH/HOAc/H₂O＝4:1:1） Rf0.11（NH₄OH/2-プロパノール＝37:84）アミノ酸分析： Arg,1.04;Lys,1.00;Asp,1.04;Val,0.97およびPhe,1.00; ペプチド含量:88％ HPLC:ワツトマン・パートシル（Whatman Partisil）‐O
DS-1カラム 10％のCH₃OH/0.02M KH₂PO₄;pH3.5 流速:2ml/分保持時間:8.10分実施例II Ｎ^α‐アセチル‐アルギニル‐プロリル‐アスパルチル
‐バリル‐フエニルアラニン固相法により、BOC-PHEメリフイールド（Merrifield）
樹脂（12.03g,0,51meq/g）を用いて出発して、表題ペプ
チドを得た。この樹脂を順次に３当量のBOC-VAL、BOC-
β‐BZL-ASP、およびBOC-PROと結合した。結合剤は合成
を通じて4:1CH₂Cl₂:DMF中の1:1DCC:HOBTであつた。

このテトラペプチド樹脂のほぼ1/3を保存した。残りをN
g-TOS-N^α‐AOC-ARGと前述の結合条件下で結合した。

このペンタペプチド樹脂のほぼ1/2を保存した。残りをT
FAで処理し、DIEAで中和した。次いで、これをCH₂CCl₂
（40ml）中のAc₂O（3ml）およびDMAP（0.3g）で60分間
処理した。この樹脂を洗浄し、乾燥し、HF（40ml）：ア
ニソール（10ml）中で０℃において60分間切り離した。
残留固体を10％のHOAcで抽出し、凍結乾燥して1.36の粗
製ペプチドを得た。

この粗製ペプチドをセフアデツクスDEAE2.6×90cmで粗
製した:0.05モルのNH₄HCO₃、pH5（3.5l）、100ml/時の
流速、13mlのフラクシヨン、206nmの検出器。分画170-2
05を集め、凍結乾燥して表題化合物、830mg、を得た。

TLC:シリカゲル,250μ溶媒 Rf 5:5:3:1 EtOAc:pyr:H₂O:HOAc 0.38 4:1:5 nBuOH:HOAc:H₂O，上の相 0.41 1:1 トリフルオロエタノール：NH₄OH 0.75 アミノ酸分析： Arg,1.02;Pro,0.98;Asp,0.97; Val,1.02;Phe,1.01 ペプチド含量:65.3％実施例III Ｎ^α‐ホルミル‐アルギニル‐プロリル‐アスパルチル
‐バリル‐フエニルアラニン固相法により、実施例IIからの（Ng-TOS-N^α‐AOC）‐A
RG-PRO-（β‐BZL）‐ASP-VAL-PHE樹脂（約２ミリモ
ル）を用いて出発して、表題ペプチドを製造した。1:1
のTFA/CH₂Cl₂で脱保護しそしてDIEAで中和した後、この
樹脂をp-ニトロフエニルホルメート（1.0g）およびHOBT
（0.9g）で5:1のCH₂Cl₂:DMF（30ml）中で16時間処理し
た。この樹脂を洗浄し、p-ニトロフエニルホルメート
（1.0g）およびDMAP（0.2g）でCH₂Cl₂中において１時間
処理した。

このホルミルペプチド樹脂をHF（60ml）およびアニソー
ル（10ml）中において０℃で１時間切り離した。残留固
体を0.2％のNH₄OHで処理し、抽出液を凍結乾燥して1.00
gの無色固体を得た。

このペプチドをフエフアデツクスDEAE、2.6×90cmで精
製した:0.1モルのNH₄HCO₃、pH7.5、100ml/時の流速、13
mlの分画、206nmの検出器。分画105-130を集め、凍結乾
燥すると、表題化合物、675mg、が無色固体として得ら
れた。

TLC:シリカゲル,250μ溶媒 Rf 5:5:3:1 EtOAc:pyr:H₂O:HOAc 0.59 4:1:5 nBuOH:HOAc:H₂O 0.40 15:3:12:10 nBuOH:HOAc:H₂O:pyr 0.59 アミノ酸分析： Arg,1.01;Pro,1.00;Asp,1.00; Val,0.98;Phe,1.00 ペプチド含量;78.5％実施例IV アルギニル‐プロリル‐アスパルチル‐バリル‐フエニ
ルアラニン BOC-PHEメリフイールド樹脂（8.06g、0.5/meq/g）を用
いて出発して、固相法に従い、表題ペプチドを合成し
た。この樹脂を次のものと順次に結合した:3当量のBOC-
VAL（DCC/4-ピロリジノピリジンと１回、DCC/HOBTと再
結合した）BOC-β‐BZL-ASP（DCC/HOBT）、BOC-PRO（DC
C/HOBT）およびNg-TOS-Nα‐AOC-ARG（DCC/HOBT）。溶
媒は合成を通じて4:1のCH₂Cl₂:DMFであつた。

この樹脂のほぼ1/2を乾燥し、HF（40ml）：アニソール
（10ml）：メルカプトエタノール（1ml）中で０℃にお
いて60分間切り離した。残留固体を10％のHOAcで抽出
し、凍結乾燥して1.34の粗製ペプチドを得た。

この粗製ペプチドをセフアデツクスCM25、2.6×90cmで
精製した：勾配溶離、0.05モルのNH₄OAc、pH5（2.1）
〜0.3モルのNH₄OAc、pH5（2.1）、100ml/時の流速、1
3mlの分画、206nmの検出器。分画61-100を集め、凍結乾
燥した。固体をG-10セフアデツクスのクロマトグラフイ
ーにかけ（１％のHOAcで溶離）、集め、凍結乾燥して表
題化合物、780mg、が得られた。

TLC:シリカゲルG,250μ溶媒 Rf 5:5:3:1 EtOAc:pyr:H₂O:HOAc 0.38 4:1:5 n-BuOH:HOAc:H₂O，上の層 0.25 1:1 トリフルオロエタノール：NH₄OH 0.71 アミノ酸分析： Arg,1.00;Pro,1.00;Asp,1.00; Val,1.03;Phe,0.96 ペプチド含量:61％実施例Ｖアルギニル‐リシル‐アスパルチル‐バリル‐ヒスチジ
ン溶媒和物固相法により、0.21ミリモル/gの置換レベルでメリフイ
ールド樹脂へ結合したBOC-（im-TOS）ヒスチジンを用い
て出発して、表題化合物を合成した。洗浄順序は次のと
おりであつた：バリンを除外してすべての結合は対称の無水物技術によ
り実施した。CH₂Cl₂中において０℃で誘導化アミノ酸お
よびDCC（2:1のモル比）を用いることにより、対称無水
物を合成した。ジシクロヘキシル尿素を過により除去
し、液を固相反応器へ加えた。

樹脂ペプチドの収量は6.7gである。このペプチドを脱保
護し、そしてスキヤベンジヤーとしてアニソール（3m
l）を用いるHF（60ml）切り離しにより樹脂から除去し
た。

HFおよびアニソールを減圧により除去した後、残留物を
ジエチルエーテルで粉砕し、過により集め、ジエチル
エーテルで洗浄し、50％のTFA/CH₂Cl₂（４×25ml）で抽
出した。抽出液を合わせ、溶媒を減圧により除去し、そ
して残留物をジエチルエーテルで粉砕した。生ずる固体
を過により集め、ジエチルエーテルで洗浄し、室温で
一夜真空乾燥すると、1.84gの粗製ペプチドが得られ
た。

1.0gの粗製ペプチドをセフアデツクスC-25（2.6×95c
m）のクロマトグラフイーにかけ、0.2モルのNH₄CH₃CO₂
でpH6.0において溶離した。流速は90ml/時であり、そし
て分画を7.5分ごとに集めた。200の分画が集められた
後、緩衝液を0.25モルのNH₄CH₃CO₂、pH7.0、に変えた。
分画240〜280をプールし、凍結乾燥した。この物質を水
から２回凍結乾燥して0.8gを得た。これをセフアデツク
スG-10（２タンデム2.6×95cmのカラム）のクロマトグ
ラフイーにかけ、水で溶離した。流速は40ml/時であ
り、そして分画は150滴（6.5ml）であつた。分画78〜87
をプールし、凍結乾燥して286mgの表題化合物を得た。

TLCシリカゲルG250〔J.T.ベイカー（Baker）５×20cm〕スポツト40μｇ溶媒系 Rf n-ブタノール／酢酸／水（1:1:1） 0.23 n-ブタノール／酢酸／水／ピリジン（4:2:3:1） 0.29 クロロホルム／メタノール／濃NH₄OH（2:2:1） 0.23 HPLCは99.4％の純度を示す。アミノ酸分析計算値実測値 Arg 1.0 1.03 Lys 1.0 1.00 Asp 1.0 0.95 Val 1.0 1.02 His 1.0 0.99 76.1％のペプチド旋光度▲〔α〕²² _D▼＝−32.9°（Ｃ＝0.1124、１モル
のHOAc）例VI（参考）アルギニル‐リシル‐アスパルチル‐バリル‐トリプト
フアン溶媒和物このペプチドはDCC結合技術に従い次の出発物質を用い
て合成した：固相の手順は次の通りであつた：樹脂を固相の攪拌された反応器に入れ、４時間膨潤させ
た。溶媒を過により除去し、残留物を100mlの次の溶
媒および試薬で特定した時間およびサイクルの間処理し
た。各処理後、液体を過により除去した。

1.CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 2.50％TFA/CH₂Cl₂ １分‐脱ブロツク 3.50％TFA/CH₂Cl₂ 30分‐脱ブロツク 4.CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 5.5％N-メチルモルホリン／CH₂Cl₂ １分‐中和 6.CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 7.5％N-メチルモルホリン／CH₂Cl₂ １分‐中和 8.CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 9.5％ジイソプロピルエチルアミン／CH₂Cl₂0.5分‐中和 10.CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 11.20％DMF/CH₂Cl₂ ３×１分‐洗浄 12.結合 1.5〜4.0時間 13.DMF ３×１分‐洗浄 40mlのCH₂Cl₂のブロツクされたアミノ酸および20mlのDM
F中のHOBtを添加し、１分間攪拌し、次いで40mlのCH₂Cl
₂中のDCCを加え、次いで1.5〜4.0時間攪拌することによ
りペプチド結合を形成した。樹脂ペプチドをDMFおよびC
H₂Cl₂ですべての結合が完結した後洗浄し、そしてBoc基
を通常の方法で除去した。TFA塩をCH₂Cl₂でよく洗浄
し、反応器から取り出し、そして一定重量、8.69g、に
真空乾燥した。

ペプチドを樹脂から、液体HF（アニソールおよびトリプ
トフアンを加える）中で０℃において１時間攪拌するこ
とにより、切り離した。固体をエーテルで洗浄し、ペプ
チドを樹脂から25％のHOAc/H₂Oで抽出した。この物質を
凍結乾燥して3.45gの粗生成物が得られ、これはトリプ
トフアン上になおホルミル基を有した。この物質を1.0
モルのNH₄HCO₃、pH9.0（1.00ml）中で24時間攪拌するこ
とにより脱ホルミル化した。この粗製物質を凍結乾燥
し、セフアデツクスSP-C-25カラム（2.6×90cm）のクロ
マトグラフイーにかけた。0.2モルのNH₄OAc、pH600で溶
離すると、適当な分画を合わせかつ凍結乾燥した後、2.
09gの生成物（93％の純度）が得られた。この物質を調
製用HPLC、M-20カラム（ワツトマンODS-3）のクロマト
グラフイーにかけ、0.01モルのNH₄OAc、12％のCH₃CN、p
H5.00で溶離すると、適当な分画を合わせた後、0.75gの
純粋な生成物が得られた。

実施例VII アセチル‐アルギニル‐α‐アミノイソブチリル‐アス
パルチル‐バリル‐フエニルアラミナミド、溶媒和物 A.TFA Asp（OBzl）‐Val-Phe-NH-MBHA-樹脂 p-メチルベンズヒドリルアミン‐樹脂（70g;0.3ミリモ
ル/g樹脂）をCH₂Cl₂中で１時間膨潤させた。Boc-Phe、B
oc-ValおよびBoc-Asp（OBzl）‐OHを樹脂にDCC仲介結合
を介して組み込んだ。N-末端Boc基を除去した後、この
ペプチド‐樹脂を乾燥し、他のペプチドの合成のために
使用した。

B.Ac-Arg-Aib-Asp-Val-Phe-NH₂ TFA Asp（OBzl）‐Val-Phe-NH-MBHA-樹脂（6g）をBoc-A
ibおよびAoc-Arg（Tos）‐OHと、DCC/HOBt結合を用い
て、順次に結合した。ArgのAoc基の除去後、ペプチド‐
樹脂（5g）をHF/アニソール（9:1;50ml）で０℃におい
て１時間切り離した。ペプチドを５％のHOAC/H₂O（３×
50ml）で抽出し、凍結乾燥して570mgの固体物質を得
た。粗製ペプチドをセフアデツクスDEAE-カラム（80cm
×2.5cm）（0.05モルの緩衝しない（NH₄）HCO₃で平衡化
した）のクロマトグラフイーにかけた。流速は85ml/時
であり、そして10mlの分画を集めた。ペプチドは管35-4
8の間で溶離され、次いでこの分画を凍結乾燥して450mg
の生成物を得た。薄層クロマトグラフイー（シリカゲル
F₆₀;200ミクロン） R_fI 0.45（NH₄OH／イソプロパノール＝37:84） R_fII 0.25（n-BuOH/HOAc/H₂O＝3:1:1）アミノ酸分析： Arg,1.01;Aib,1.03;Asp,1.03; Val,0.99;Phe,1.00。

ペプチド含量:88.3％実施例VIII アセチル‐アルギニル‐プロリル‐アスパルチル‐バリ
ル‐フエニルアラニン‐アミド、溶媒和物 Ac-Arg（Tos）‐Pro-Asp（OBzl）‐Val-Phe-NH-MBHA-樹
脂を、SPPSにより10gのp-メチルベンズヒドリルアミン
‐樹脂（置換0.3ミリモルNH₂/g樹脂）を用いて出発して
合成した。アミノ酸誘導体およびDCCを次の結合のため
に３倍過剰量で使用した:Aoc-Arg（Tos）‐OH、Boc-Pr
o、Boc-Asp（OBzl）‐OH、Boc-ValおよびBoc-Phe。次い
でペプチド‐樹脂（4g）をHF/アニソール（9:1;40ml）
で０℃において１時間切り離した。HF/アニソールの除
去後、混合物を過し、エーテル（３×30ml）で洗浄し
た。ペプチドを５％のHOAc/H₂O（３×50ml）で抽出し、
凍結乾燥して315mgの生成物を得た。次いで粗製ペプチ
ドをセフアデツクスDEAEカラム（2.5cm×80cm）（0.05
モルの緩衝化されていないNH₄HCO₃で平衡化した）で精
製した。流速は85ml/時であり、そして12ml/管の分画を
集めた。所望のペプチドは管30-40の間で溶離された。
この分画を凍結乾燥すると、300mgの物質が得られた。

薄層クロマトグラフイー（シリカゲルF₆₀;200ミクロ
ン） R_fI 0.55（NH₄OH／イソプロパノール＝37:84） R_fII 0.3（n-BuOH/HOAc/H₂O＝3:1:1）アミノ酸分析： Arg,1.00;Pro,0.99;Asp,0.99; Val,1.00;Phe,1.00。

ペプチド含量:57.5％実施例IX アルギニル‐リシル‐グルタミル‐バリル‐ヒスチジン
溶媒和物 0.21ミリモル/gの置換レベルでメリフイールド樹脂へ取
り付けられた5.0gのBoc-（im-Tos）ヒスチジンを用いて
出発して、固相法により、この化合物を合成した。清浄
順序は次の通りであつた：等モル量の保護されたアミノ酸、ジシクロヘキシルカル
ボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾールを用い
ることにより、すべての結合を実施した。用いた溶媒は
ジメチルホルムアミド（12ml）と塩化メチレン（38ml）
との混合物であつた。

注：最終の結合後、樹脂‐ペプチドをジメチルホルムアミド
（２×50ml）、イソプロパノール（２×50ml）で洗浄
し、そして50℃において20時間真空乾燥した。

樹脂ペプチドの収量は6.9gであつた。6.7gの樹脂ペプチ
ドを脱保護し、そして樹脂からHF（50ml）の切り離しに
よりスキヤベンジヤーとしてアニソール（1ml）を用い
て除去した。

HFおよびアニソールを減圧により除去した後、残留物を
ジエチルエーテルで粉砕し、過により集め、ジエチル
エーテルで洗浄し、５％の酢酸／水（４×25ml）で抽出
し、次いで水（４×25ml）で抽出した。抽出液を合わ
せ、凍結乾燥して1.1gの粗製ペプチドを得た。1.0gの粗
製ペプチドをセフアデツクスC-25（2.6×95cm）のクロ
マトグラフイーにかけ、0.25モルのNH₄HCO₃、pH7.0で溶
離した、流速は100ml/時であり、そして分画を200滴ご
とに集めた。分画161〜210をプールし、凍結乾燥した。
この物質を水から３回凍結乾燥すると、568mgの表題化
合物が得られた。

分析データ： TLCシリカゲル G250〔J.T.ベイカー（Baker）５×20c
m〕溶媒系 Rf n-ブタノール／酢酸／水（1:1:1） 0.29 n-ブタノール／酢酸／水／ピリミジン（4:2:3:1） 0.32 クロロホルム／メタノール／濃NH₄OH（2:2:1） 0.30アミノ酸分析計算値実測値 Arg 1.0 1.05 Lys 1.0 1.01 Glu 1.0 1.02 Val 1.0 0.99 His 1.0 0.93 74.7％のペプチド旋光度▲〔α〕²² _D▼＝‐24.3°（Ｃ＝0.1154、0.1モル
のHOAc）例Ｘ（参考）アルギニル‐リシル‐アスパルチル‐バリル‐プロリン固相法により、Boc-Proベンジルエステル樹脂（5.08g、
0.64meq/g）を用いて出発して、表題化合物を調製し
た。次の標準ルーチンを用いた：脱保護:50ml50％TFA/CH₂Cl₂５分間次いで50ml50％TFA/C
H₂Cl₂20分間；洗浄:50mlCH₂Cl₂各回１分次いで50mliPrOH 1分間次いで
50mlCH₂Cl₂２回；中和:50ml5％DIEA/CH₂Cl₂各回2.5分２回；結合、方法1:15.0ミリモルの保護されたアミノ酸および
HOBT（2.3g）を10mlのDMF中に溶解し、次いで30mlのCH₂
Cl₂で希釈した。DCC（3.09g）を10mlのCH₂Cl₂中に溶解
し、反応成分と樹脂との混合物に加え、２〜2.5時間攪
拌した。

結合、方法2:15.0ミリモルの保護されたアミノ酸ヒドロ
キシ‐スクシンイミドエステルを50mlのCH₂Cl₂中に溶解
した。NMM（3.3ml）を加え、そしてこの混合物を18時間
樹脂とともに攪拌した。

順次に、樹脂を１回各々Boc-Val（方法１）およびBoc-B
zl^β‐Asp-Osu（方法２）と結合した。この樹脂（3952-
137B′）の半分を取り出し、そして残りを１回各々Boc
α‐Cbzε‐Lysおよび(Cbz)₃Argと結合した（両者とも
方法１）。樹脂を洗浄し、空気乾燥し、そしてHF/アニ
ソール（30ml/80ml）中で０℃で60分間切り離した。

樹脂残留物をEt₂Oで急冷し、過した。固体を10％のHO
Ac（100ml）で１時間過し、そして抽出液を凍結乾燥
すると、塩酸塩が無色のガム、1.0g、として得られた。

粗製ペプチドをCMセフアデツクス（2.6×87cm）のカラ
ム、0.15モルのNH₄OAc、緩衝せず;100ml/時の流速、12m
l/分画、225nmの検出器）で精製した。分画203-235をプ
ールし、凍結乾燥して880mlの表題化合物を得た。

II、分析：アミノ酸比 Arg 1.01 Pro 0.99 Asp 1.00 Val 0.96 Tyr 1.03 56.7％のペプチド含量薄層クロマトグラフイー 250ミクロン、シリカゲル
Ｇ実施例XI アルギニル‐リシル‐グルタミル‐バリル‐トリプトフ
アン溶媒和物ペプチドをDCC結合技術により次の出発物質を用いて合
成した：固相の手順は、次のとおりであつた：樹脂を固相の攪拌された反応器に入れ、４時間膨潤させ
た。溶媒を過により除去し、残留物を100mlの次の溶
媒および試薬で特定した時間およびサイクルの間処理し
た。各処理後、液体を過過により除去した。

40mlのCH₂Cl₂中のブロツクしたアミノ酸および20mlのDM
F中のHOBtを加え、１分間攪拌し、次いで40mlのCH₂Cl₂
中のDCCを加え、1.5〜4.0時間攪拌することによつて、
ペプチド結合を形成した。すべての結合が完結した後、
樹脂ペプチドをDMFで洗浄し、Boc基を通常の方法で除去
した。TFA塩をCH₂Cl₂でよく洗浄し、そして反応器から
取り出し、一定重量の8.75gに真空乾燥した。

ペプチドを樹脂から、液体HF（アニソールおよびトリプ
トフアンを加える）中で０℃において１時間攪拌するこ
とにより、切り離した。HFを減圧において除去した。固
体をエーテルで洗浄し、そしてペプチドを樹脂から25％
のHOAc/H₂Oで抽出した。これを凍結乾燥して、3.60gの
トリプトフアン上になおホルミル基をもつ粗製生成物を
得た。この物質を1.0モルのNH₄HCO₃、pH9.0（100ml）中
で24時間攪拌することにより脱ホルミル化した。この粗
製物質を凍結乾燥し、セフアデツクスSP-C-25カラム
（2.6×90cm）のクロマトグラフイーにかけた。0.1モル
のNH₄OAc、pH5.38で溶離すると、適当な分画を合わせか
つ凍結乾燥した後、2.10gの生成物（約96％の純度）が
得られた。

この物質をワツトマンODS-3NPLCカラムで精製し、そし
て0.01モルのNH₄OAc、12％のCH₃CN、pH5.00で溶離する
と、適当の分画を合わせた後、0.90gの純粋な生成物が
得られた。

TLC:Rf（溶媒系） Rf₁ 0.15（BuOH:HOAc:H₂O 3:1:1） Rf₂ 0.28（BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc 1:1:1:1） Rf₃ 0.09（CHCl₃:MeOH:NH₄OH 12:9:4）アミノ酸分析:Arg（0.99）Lys（0.98）Glu（0.97）Val
（1.05）Trp（0.96）組成＝88.4％のペプチド実施例XII アルギニル‐リシル‐グルタミル‐バリル‐トリプトフ
アンアミド溶媒和物固相法により樹脂‐ペプチドVal-Trp-NH-ベンズヒドリ
ルアミン樹脂を用いて出発して、この化合物を合成し
た。

1.N^α‐Boc-N^ε‐‐CBZ-Lysの結合後、樹脂ペプチドを
５％の無水酢酸でCH₂Cl₂（100ml）で100mgの4-ジメチル
アミノピリジンの存在下にアセチル化した。

樹脂ペプチドの収量は15.3gであつた。9.0gの樹脂ペプ
チドを脱保護し、樹脂からHF（80ml）の切り離しにより
スキヤベンジヤーとしてアニソール（90ml）を用いて切
り離した。溶媒を減圧により除去し、残留物をジエチル
エーテルで粉砕した。固体を過により集め、水中の５
％の酢酸（４×50ml）で抽出した。抽出液を合わせ、凍
結乾燥して1.4gの粗生成物を得た。

この粗製物質を250mlの1.0モルのNH₄HCO₃中に溶かし、p
Hを9.5に調節した。この溶液を24時間室温に静置し、次
いで凍結乾燥して1.2gの粗生成物を得た。

この粗ペプチドをセフアデツクスC-25（2.6×90cm）の
クロマトグラフイーにかけ、0.3モルのNH₄OAc、pH6.0で
溶離し、流速は150ml/時であり、そして分画は20mlであ
つた。管90〜110はHPLCにより純粋な生成物を含有する
ことが示され、これらをプールし、そして凍結乾燥して
450mgの表題化合物を得た。

分析データ： TLC シリカゲル GF 250ミクロン溶媒系 Rf n-ブタノール／酢酸／水（1:1:1） 0.13 n-ブタノール／酢酸／水／酢酸エチル（1:1:1） 0.10 HPLCは99.1％の純度を示す。アミノ酸分析計算値実測値 Arg 1.0 1.02 Lys 1.0 0.96 Glu 1.0 0.99 Val 1.0 1.04 Trp 1.0 0.94 82.1％のペプチド旋光度〔α〕_Ｄ＝−20.7°（Ｃ＝0.997、0.1モルのHOA
c）実施例XIII アルギニル‐リシル‐アスパルチル‐バリル‐トリプト
フアンアミド溶媒和物固相法により0.68meq/gの置換レベルのベンズヒドリル
アミン樹脂を用いて、この化合物を合成した。洗浄順序
は次のとおりであつた：すべての結合は等モル量の保護されたアミノ酸、ジシク
ロヘキシルカーボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリ
アゾールを用いて実施した。この結合したジメチルホル
ムアミド（20ml）および塩化メチレン（60ml）を溶媒と
して用いた。

1.樹脂ペプチドを脱保護およびバリニン残基の中和後に
半分に分割した。

2.N^α‐CBZ-N^γ，△‐diCBZ-Argの結合後、樹脂ペプチ
ドを５％の酢酸無水物でCH₂Cl₂（100ml）中において100
mgの4-ジメチルアミノピリジンの存在下にアセチル化し
た。

樹脂ペプチドの収量は15.7gであつた。7.0gの樹脂ペプ
チドを脱保護し、HF（60ml）の切り離しによりスキヤベ
ンジヤーとしてアニソール（5ml）を用いて樹脂から除
去した。溶媒を減圧により除去し、残留物をジエチルエ
ーテルで粉砕した。固体を過により集め、水中の５％
の酢酸（５×20ml）で抽出した。抽出を合わせ、凍結乾
燥して1.2gの粗生成物を得た。

この粗製物質を250mlの1.0モルのNH₄HCO₃中に溶かし、p
Hを9.5に調節した。この溶液を24時間室温に静置し、次
いで凍結乾燥して1.2gの粗生成物が得られた。

粗ペプチドをセフアデツクスC-25（2.6×90cm）のクロ
マトグラフイーにかけ、0.3モルのNH₄OAc、pH6.0で溶離
し、流速は150ml/時であり、そして分画は20mlであつ
た。管197〜221はHPLCにより純粋な生成物を含有するこ
とが示され、これらをプールし、凍結乾燥して450mgの
表題化合物が得られた。

分析データ： TLC シリカゲル GF 250ミクロン溶媒系 Rf n-ブタノール／酢酸／水（1:1:1） 0.13 n-ブタノール／酢酸／水／酢酸エチル（1:1:1:1） 0.10アミノ酸分析計算値実測値 Arg 1.0 1.00 Lys 1.0 0.97 Asp 1.0 0.98 Val 1.0 1.06 Trp 1.0 0.96 75.1％のペプチド旋光度〔α〕_Ｄ＝−35.6°（Ｃ＝1.002、0.1モルのHOA
c）例XIV（参考）Ｎ^α‐アセチル‐アルギニル‐3,4-デヒドロ‐プロリル
‐アスパルチル‐バリル‐チロシンアミド A.BOC-3,4-デヒドロ‐プロリン 3,4-デヒドロ‐Pro（200mg;1.76ミリモル）をジオキサ
ン／H₂O（8ml;2:1）中に溶解した。この溶液に、1NのNa
OHおよびジ‐t-ブチルカーボネート（436mg;2ミリモ
ル）を０℃においてかきまぜながら加えた。次いでこの
混合物を室温において一夜かきまぜた。ジオキサンを除
去し、残留する水相に、酢酸エチル（20ml）を加えた。
この混合物を氷浴中で冷却し、0.5NのHClでpH2.0に酸性
化し、分液漏斗の中に移した。有機層を分離し、水層を
EtOAc（２×20ml）で２回抽出した。合わせた有機相をN
a₂SO₄で乾燥し、過した。溶媒を除去し、残留物を乾
燥し、それ以上精製しないで使用した。

試料の¹HNMR（CDCl₃:Ar No5030-83）は1.45ppmにBOC基
の存在を示した。

B.N^α‐アセチル‐アルギニル‐3,4-デヒドロ‐プロリ
ル‐アスパルチル‐バリル‐チロシンアミドペプチドを（p-メチル）ベンズヒドリルアミン‐樹脂
（2gの樹脂：樹脂の1gにつき0.25ミリモル）のNH₂の置
換）上で固相法により合成した。BOC-Tyr（Bzl）‐OH、
Boc-Val、BOC-3,4-デヒドロ‐ProおよびAoc-Arg（Tos）
‐OHの組み込みをDCC結合を経て実施した。結合を定着
的ニンヒドリン試験により監視した。アルギニンのアセ
チル化を50％の無水酢酸／ピリミジン（15ml）およびDM
AP（15ml）を用いて実施した。ペプチジル樹脂を次いで
DMFおよびCH₂Cl₂でよく洗浄し、乾燥した。乾燥したペ
プチジル樹脂（2g）をHF/アニソール（20ml;9:1）で０
℃において１時間切り離した。ペプチド‐樹脂混合物を
エーテル（３×20ml）で洗浄し、そしてペプチドを５％
のHOAc/H₂O（200ml）で抽出した。凍結乾燥後、ペプチ
ドをセフアデツクスSPC-25カラム（50cm×0.9cm）中に
適用し、そして0.02モルのNH₄OAc、pH4.6で平衡化し
た。流速は80ml/時であり、そして12mlの分画を集め
た。生成物は管22〜39溶離され、これらをプールし、凍
結乾燥した。

凍結乾燥した物質を再びセフアデツクスSPC-25カラム
（60cm×2.5cm）（0.002モルのNH₄OAcで平衡化した;pH
4.5〜6.8）で前述と同じ条件下で精製した。ペプチドは
管55〜75の間で溶離され、これらをプールし、凍結乾乾
燥して80mgの生成物を得た。

Rf0.45（n-BuOH/HOAc/H₂O/Pyr＝15:3:12:10;シリカゲル
F60） Rf0.27（n-BuOH/HOAc/H₂O‐3:1:1;シリカゲル F60）アミノ酸分析： Asp、1.04;Val、1.00;Tyr、0.85;Arg、0.96;3,4-デヒド
ロ‐Pro、1.08 ペプチド含量:72％吸湿性物質 HPLC:ワツトマン・パートル（Whatmam Partisil）‐ODS
カラム 10％のCH₃CN/0.02M NH₄OAc;pH4.6 流速:2ml/分ペプチドは99.7％の純度であり、そして14.3分の保持時
間を有する。

実施例XV 環式‐GMPの検定この検定は、サイモポイエチン自体がなすような、試験
ペプチドが完全なCEM細胞の細胞膜受容体へ結合しかつ
環式‐GMPの生産を選択的に刺激するその能力を測定す
る。

CEM細胞系統はアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン（American Type Culture Collection）から入
手し、そして10％の熱不活性化胎児ウシ血清、10％の熱
不活性化ウマ血清、２ミリモルのL-グルタミンおよび50
g/mlのゲンタマイシンを補充したRPMI-1640培地中で、3
7℃において５％のCO₂を含有する湿つた雰囲気中で３〜
４×10⁶細胞/mlの最終密度に培養した。この濃度におい
て、細胞は生長曲線の早期の静止相にあり、そしてトリ
プトフアンブルーの排除により９％生存可能であること
がわかつた。細胞を４日間生長させ、そして収穫した。
収穫後、細胞をPBS中で３回洗浄し、RPMI-1640培地中に
3.12×10⁷細胞/mlの濃度で懸濁させた。細胞を37℃で30
分間平衡化させた後、25μｌの培地中の種々の濃度の試
験ペプチドを1mlの細胞に加え、添加する試験化合物の
初期濃度は培地中の試験ペプチドの所望の最終濃度を生
ずるように選択した。試験ペプチドを細胞懸濁液と瞬間
的に混合した。インキユベーシヨンを振盪水浴中で37℃
において４〜５分間進行させ、次いで氷冷トリクロロ酢
酸（10％;1ml）の添加により停止した。

次いでTCA中の細胞を均質化し、超音波処理して環式ヌ
クレオチドを解放した。生ずる懸濁液を3000gおよび４
℃において20分間遠心し、生ずる沈殿を0.1NのNaOH中に
溶解し、さらに30分間超音波処理し、その後タンパク質
含量をカドマン（Cadman）ら、アナリテイカル・バイオ
ケミストリー（Anal.Biochem.）,96,21-23（1979）の方
法により決定した。TCAを上澄み分画から5mlの水飽和ジ
エチルエーテルで４回抽出することにより除去した。最
終の抽出後、残る微量のエーテルを上澄み分画から50℃
の水浴中の10分間の加熱により除去した。抽出された上
澄み分画を凍結乾燥した後、検定キツトNEX-133、ニユ
ー・イングランド・ニユークリアー（New England Nucl
ear,Boston,MA02113）を用いる環式ヌクレオチドの放射
線免疫検定のため、それを50ミリモルの酢酸緩衝液中で
再構成した。

放射線標識環式GMPに対する慣用の対抗放射線免疫検定
（competition radio immunoassay）を実施して、各濃
度の試験ペプチドにより誘導される環式GMPの量を決定
した。結果を第１図および次表に示す。ここで代表的な
本発明のペプチドがサイモペンチン（“TP-5"と表示）
および「ナンセンス」ペプチドH-ASP-ARG-TYR-VAL-OHと
比較して検定されている。これらの結果は本発明のペプ
チドはサイモペンチンよりもすぐれた効力をもつことを
立証し、そしてまたサイモペンチン様活性を有するペプ
チドについての検定の特異性を示す。

この検定においてすぐれた結果を示す他の代表的化合物
は次の通りであつた:H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH;N-α‐
アセチル‐ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-NH₂;N-α‐アセチル‐
ARG-AIB-ASP-VAL-PHE-NH₂;H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-N
H₂；およびN-α‐アセチル‐ARG-3,4-デヒドロ‐PRO-AS
P-VAL-TYR-NH₂。

実施例XVI 受容体の検定この検定は、CEM細胞から単離されたサイモポイエチン
細胞表面の受容体タンパク質へ結合するために、標識サ
イモポイエチンと対抗する試験ペプチドの能力を測定す
る。

材料 CEM細胞系統はアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨンから得た。3-ニトロ‐2-ピリジンスルホニルク
ロライドおよび2-ピリジンチオール1-オキシドは、レイ
・マツエダ（Rei Matsueda）博士（サンヨウ研究所、東
京）により提供された。RPMI-1640、胎児ウシ血清およ
びL-グルタミンはギブコ（Gibco）から入手し、ゲンタ
マイシンはシエアリング（Schering）から入手し、そし
てレクチン結合アガロースビーズはベクター研究所（Ve
ctor Laboratories）から入手した。セフアデツクス（S
ephadex）はフアーマシア・フアイン・ケミカルズ（Pha
rmacia Fine Chemicals）から購入し、そしてヒトIgGは
マイルス研究所（Miles Laboratories）から購入した。
すべて他の化学物質は普通の商業的源から購入し、そし
て試薬級であつた。ウサギ抗サイモポイエチン抗体およ
びユビクイチン（ubiquitin）は次の既知に従つて生産
した。

次の略号を用いる:PBS、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム水
溶液;TCA、トリクロロ酢酸;SDS、ドデシル硫酸ナトリウ
ム;ConA、コンカナビリンA;TP、サイモポイエチン;PE
G、ポリエチレングリコール;BSA、ウシ血清アルブミン;
I.P.腹腔内;PMSF、フエニルメチルスルホニルフルオラ
イド;FTS、フクツール、サイミーク・セリクー（facteu
r thymique serique）;CRF、コルチコトロピン解放因
子;ACTH、アドレノコルチコトロピツクホルモン（adren
ocorticotropic hormone）;Hepes、N-2-ヒドロキシエチ
ルピペラジンN-2-エタン‐スルホン酸。

膜糖タンパク質の調製 CEMヒトリンパ様細胞系統は、10％の熱不活性化胎児ウ
シ血清、２ミリモルのL-グルタミンおよび50μg/mlのゲ
ンタマイシンを補充したRPM-1640中で37℃において５％
のCO₂を含有する湿つた雰囲気中で、３〜４×10⁶細胞/m
lの最終密度に培養した。この濃度において、細胞は生
長曲線の早期の静止相にあり、そしてトリパンブルー排
除により90％より大きい生存率であることがわかつた。

膜の糖タンパク質は、ヘド（Hedo）ら、バイオケミスト
リー（Biochem.），20,3385-3393（1981）の技術の変更
により調製した。細胞をPBSで１回洗浄し、そして40％
のスクロース、50％の50ミリモルのHepes、１％のEDT
A、0.1％のo-フエナントリンおよび１ミリモルのPMSF
（エタノール中）、pH7.8、中に懸濁し、そしてガラス
のホモジナイザーで室温において均質化した。次いで全
体の懸濁液を、カツプ・ホーン（cup horn）取付けを有
する細胞粉砕ソニケーター（cell disruptor sonicato
r）（W-225R）により35℃において10分間超音波処理し
た。この懸濁液を600xgおよび４℃において10分間ソー
バル（Sorval）GLC-3遠心機により遠心し、そして上澄
み液をソーバル（Sorval）5B遠心機により４℃において
３分間さらに遠心した。この沈殿物から得られる粗製膜
分画を50ミリモルのHepes、10ミリモルのMgSO₄および１
ミリモルのPMSF中に5mg/mlの最終タンパク質濃度に懸濁
した。この懸濁液を25℃において２時間１％のトリトン
X-100（最終濃度）および0.1％のbrij-96（ポリオキシ
エチレン10、オレイルエーテル）（最終濃度）の存在下
に攪拌することにより、タンパク質の可溶化を実施し
た。その懸濁液を200,000Xgおよび４℃において遠心
し、そして上澄み液を‐70℃において貯蔵した。可溶性
タンパク質濃度はカドマン（Cadman）らの技術により標
準としてBSAおよび対照として緩衝液を用いて測定し
た。

小麦の胚のアグルチニンまたはリシヌス・コムニス（ri
cinus communis）のアグリニチン‐Ｉを受容体タンパク
質の精製のために使用した。すべてのレクチンのビーズ
を４℃において対応する単糖阻害剤（300ミリモル）と
ともに貯蔵した。

各精製のため、2mlのレクチン‐アガロースを直径1cmの
カラム中に詰め、そして室温において25mlの0.15モルの
NaCl、50ミリモルのHepes、0.1％のトリトンX-1および
0.01％のSDS、pH7.8、で洗浄した。

このカラムを200mlの0.15モルのNaCl、50ミリモルのHep
esおよび0.1％のトリトンX-100、pH7.8で洗浄し、次い
で10ミリモルのMgSO₄を含有するこの緩衝液で最後に洗
浄した。PMSF（１ミリモル）をすべての緩衝液系に加え
た。可溶化された膜のタンパク質（約10mg）を個々のカ
ラムを通して５回再循環させた。次いでこのカラムを10
0mlの0.15モルのNaCl、50ミリモルのHepes、10ミリモル
のMgSO₄および0.1％のトリトンX-100、pH7.8で洗浄し
た。単糖の阻害剤を、30mlの洗浄緩衝液中の400ミリモ
ルの濃度で、個々のカラムの溶離に使用した；小麦の胚
のアグリチニンについてN-アセチルグルコサミンおよび
リシヌス・コムニスのアグリチニン‐Ｉについてβ‐メ
チルD-ガラクトシドを使用した。単糖をカラムに適用
し、これを30〜40分間停止して平衡化させ、次いでさら
に溶離した。タンパク質の溶離液を500mlの50ミリモル
のHepes、10ミリモルのMgSO₄および0.1％のトリトンX-1
00、pH7.8に対して４℃に対して透析した。

放射線標識サイモポイエチンの調製サイモポイエチンを0.2モルの炭酸塩‐重炭酸塩緩衝
液、pH9.8中に溶解して反応性アミノ基を得た。ジオキ
サン中の3-ニトロ‐2-ピリジスルホニルクロライド（1
0:1モル）を上のサイモポイエチン溶液に加え、20℃に
おいて５時間攪拌した。水の添加後、不溶性物質を遠心
した。保護されたペプチドをセフアテツクスG-25のクロ
マトグラフイーにより精製し、次いでポスト‐プロリン
切り離酵素（post-proline cleaving enzyme）で消化し
てNH₂末端ブロツクされたプロリンを除去した。メチル
3,5シ〔¹²⁵I〕ヨウドヒドロキシベンズイミデート（400
0ci/ミリモル）がメタノール中の5.5Ci/mlの濃度で得ら
れ、これを蒸発乾燥した。このヨウ素化イミドエステル
（1.4＋１モル）を保護されたサイモポイエチン（５μ
g;0.9＋１モル）と、ウツド（Wood）ら、アナリテイカ
ル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.），69,339-34
9（1975）の方法に従い、次の変更をもちい、反応させ
た。この反応を500μｌの0.16モルのホウ酸塩緩衝液、p
H9.1、中で４℃において24時間実施した。この反応を50
0μｌの２モルのクエン酸塩緩衝液、pH5.5の添加により
４℃において停止した。試料をバイオゲル（Biogel）P-
10カラムのクラマトグラフイーにかけ、４℃においてピ
ロリン酸ナトリウム、pH7.5（15滴／フラクシヨン）で
溶離して遊離のヨウ素を除去した。

ヨウ素化されたペプチドを水中に溶解し、そして2-ピリ
ジンチオール1-オキシド（10:1モル）で５時間室温にお
いて処理して保護基を除去した。脱保護された標識ペプ
チドをバイオゲルP-10カラムで精製した。３つの放射能
のピークが得られ、それらのうち最初のピークはウサギ
抗サイモホ・イエチン抗体と免疫反応性であつた。次い
で第１ピークをDEAE-セフアテツクスA-25（50ミリモル
のトリス緩衝液、pH7.0で平衡化した）の１×60cmのカ
ラムへ適用した。このヨウ素化混合物をこの緩衝液で、
平衡濃度から1.0モルまでの増大するイオン強度の直線
勾配を用いて溶離した。各分画の放射能をLKB1280ウル
トラ（Ultra）ガンマ分光計により決定した。

各精製のスキーム（scheme）からのピーク放射能をもつ
分画を、過剰のサイモポイエチン抗体との結合について
分析した。DEAEセフアデツクスA-25カラムのピークIIか
らの分画（クラクシヨン35〜45）は、最高の特異的結合
を示し、そして放射線受容体検定において引き続いて使
用した。

ヨウ素化サイモポイエチンは、神経筋の検定におけるそ
の作用〔ゴルドステイン（Goldstein），ネイチヤー（N
ature），247,11-14（1974）〕およびCEM細胞により環
式GMP合成へのその作用を評価することにより決定され
るように、生物学的活性を保持した。

結合の検定 12gのHepes、1.2gのMgSO₄および1.2gのBSAを1000mlのガ
ラス蒸留水に加えることにより、検定緩衝液を調製し
た。pH7.65を1NのNaOHにより得た。検定緩衝を使用して
原標準溶液をつくり、そして１週間使用した。12×75mm
のガラス製試験管中で100mlの標準溶液、25μｌの受容
体タンパク質（150〜200μg/ml）、25μｌの¹²⁵I‐TP
（80,000cpm）を20μｌの１％のトリトンX-100に加える
ことにより検定を実施し、そして体積を検定緩衝液で20
0μｌにした。４℃において18時間インキユベーシヨン
した後、PBS、pH7.56中の200μｌのヒトIgG（1.5mg/m
l）（担体として）および200μｌの35％のPEG-8000を加
え、混合し、そして氷上で30分間インキユベーシヨンし
た。試験管を遠心し、そして残留物をPBS、pH7.3中の10
％のPEGで洗浄し、そしてLKB-ガンマカウンターで計数
した。

1mg/mlの非放射性サイモポイエチンの存在下に沈殿物に
おける放射能を測定して非特異的結合を表わした。TCA
を上澄みに加え（最終濃度５％）そして沈殿しうる放射
能を測定した。すべての時間において、これは95％を越
え、トレーサーからの遊離の¹²⁵Iの最小の解放を示し
た。

対抗実験（Competition Experiment）上の結合手順に従い、2.3×10^-10モルの¹²⁵I‐TPを４μ
ｇの受容体及び試験ペプチドならびに同じ濃度のサイモ
ポイエンチン37〜45ノナペプチド（H-VAL-GLU-LEU-TYR-
LEU-GLN-SER-LEU-TNR-OH）と一緒にインキユベーシヨン
した。インキユベーシヨンを12時間続け、その後遊離お
よび結合した¹²⁵I‐TPを上のように決定した。ノナペプ
チドを用いて受容体タンパク質上の隣接受容体部位をブ
ロツクする。この隣接受容体部位がブロツクされない場
合、多少の標識TPは、サイモペンチン受容体部位が試験
ペプチドによりブロツクされている場合でさえ、この部
位を介して受容体タンパク質へ結合することができる。
このような結合は試験ペプチドの活性に対して関係づけ
られず、そして（TP37-45ノナペプチドによりブロツク
されない場合）不精確な結果を与えるであろう。

本発明の次の代表的化合物は、等しい濃度においてサイ
モポイエチンの自己置換により引き起こされるものの少
なくとも50％の置換を引き起こした： H-ARG-LYS-ASP-VAL-PHE-OH; N-α‐アセチル‐ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH; N-α‐ホルミル‐ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH; N-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH; H-ARG-LYS-ASP-VAL-HIS-OH; H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH;および H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-NH₂。

比較のため、他のペプチド、例えば、インシユリン、グ
ルカゴン、生長ホルモン、ソマトスタチン、β‐エドル
フイン、FTS、AGH、CRF、およびウビクイチンは検出可
能な置換を引き起こさなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例XVの結果を示すグラフである。なお、図
中、記号△はTP−５（比較）、×はα−アセチル−ARG
−PRO−ASP−VAL−PHE−OH（本発明）を、□はα−ホル
ミル−ARG−PRO−ASP−VAL−PHE−OH（本発明）を、そ
してはＨ−ARG−TYR−VAL−OH（比較）を、それぞれ培地へ
添加した場合の培養結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダニエル・クルーンアメリカ合衆国ニユージヤージイ州ブリツジウオーター・ホークロード 470 (72)発明者タパン・オードヤアメリカ合衆国ニユージヤージイ州ブリツジウオーター・フツトヒルロード 473 (56)参考文献特開昭55−149237（ＪＰ，Ａ) 特開昭54−76543（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−1700（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−R¹ 式中、ＲはＨ、低級アルキル、ホルミルまたは低級アルカノイ
ルであり、ＶはARGであり、ＷはPRO、デヒドロ−PROまたはAIBであり、ＸはASPまたはGLUであり、ＹはVALであり、ＺはPHE、HISまたはTRPであり、 R¹はOHまたはNR²R³であり、そして R²およびR³は各々独立にＨまたは低級アルキルから選択
される、を有するペプチドまたはその製薬学的に許容されうる酸
または塩基の付加塩。
【請求項２】Ｒが水素または低級アルキルであり、Ｖが
ARGであり、ＸがASPであり、そしてＺがPHEまたはHISで
ある特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項３】ＷがPROである特許請求の範囲第２項記載
のペプチド。
【請求項４】式α−アセチル−ARG−PRO−ASP−VAL−PH
E−OHを有する特許請求の範囲第１項記載のペプチドま
たはその製薬学的に許容されうる酸または塩基の付加
塩。
【請求項５】式α−ホルミル−ARG−PRO−ASP−VAL−PH
E−OHを有する特許請求の範囲第１項記載のペプチドま
たはその製薬学的に許容されうる酸または塩基の付加
塩。
【請求項６】式α−（低級アルカノイル）−ARG−PRO−
ASP−VAL−PHE−OHを有する特許請求の範囲第１項記載
のペプチドまたはその製薬学的に許容されうる酸または
塩基の付加塩。
【請求項７】式Ｈ−ARG−PRO−ASP−VAL−PHE−OHを有
する特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその製
薬学的に許容されうる酸または塩基の付加塩。
【請求項８】式Ｈ−ARG−PRO−ASP−VAL−HIS−OHを有
する特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその製
薬学的に許容されうる酸または塩基の付加塩。
【請求項９】式Ｈ−ARG−LYS−ASP−VAL−HIS−OHを有
する特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその製
薬学的に許容されうる酸または塩基の付加塩。
【請求項１０】式Ｈ−ARG−LYS−ASP−VAL−PHE−OHを
有する特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその
製薬学的に許容されうる酸または塩基の付加塩。
【請求項１１】有効成分として、式Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−R¹ 式中、ＲはＨ、低級アルキル、ホルミルまたは低級アルカノイ
ルであり、ＶはARGであり、ＷはPRO、デヒドロ−PROまたはAIBであり、ＸはASPまたはGLUであり、ＹはVALであり、ＺはPHE、HISまたはTRPであり、 R¹はOHまたはNR²R³であり、そして R²およびR³は各々独立にＨまたは低級アルキルから選択
される、を有するペプチドまたはその製薬学的に許容されうる酸
または塩基の付加塩を含むことを特徴とする免疫疾患処
置剤。