DK171238B1 - Thymopentin- eller spleninanaloge peptider samt farmaceutisk præparat indeholdende disse - Google Patents

Description

DK 171238 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte immunomodulato-riske peptider, som er analoge af peptidet thymopentin med stærkt forøget styrke og farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte deraf. Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat indeholdende 5 disse peptider.

US patentskrifterne nr. 4.190.646 og nr. 4.261.886 omhandler forskellige pentapeptider med aktivitet, som ligner aktiviteten af det langkædede polypeptid kendt som thymopoietin, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.002.740 og nr. 4.077.949. Thymopoietin stimulerer 10 selektivt differentieringen af T-celler. Det i US patentskrift nr.

4.190.646 omhandlede pentapeptid, som har sekvensen H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH, kendes som thymopoietin-pentapeptidet eller "thymopentin". Den biologiske aktivitet af visse af disse peptider beskrives i en artikel af M.E. Weksler et al., J. Exp. Med. 148: 996-1006 (1978). Ovennævnte US 15 patentskrifter og artiklen inkorporeres herved som en del af den foreliggende beskrivelse. US patentskrifterne nr. 4.361.673 og nr. 4.420.424 omhandler ligeledes forskellige peptider, der påstås at have en aktivitet svarende til thymopoietin. Et peptid med lignende struktur isoleret fra hornkvægmilt og benævnt "splenin" omhandles i Audhya et al., Bio-20 chemistry, 20, 6195-6200 (1981) og Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.), 81, 2847-2849 (maj 1984). Dette materiale stimulerer induktionen af både T-celler og B-celler.

Visse enzymresistente immunomodulatoriske peptider omhandles i ansøgerens US patentansøgning nr. 553.281 svarende til dansk patentansøg-25 ning nr. 5455/84, hvortil henvises i det foreliggende.

Thymopentin har vist sig at udøve en modulatorisk virkning på dyrs og menneskers immunsystem og er således nyttigt til behandling af sygdomme, der involverer defekter i immunfunktionen, hvadenten sådanne defekter manifesterer sig som underskud eller overskud med hensyn til 30 immunfunktion, jfr. f.eks. Audhya, T. og Goldstein, G., Int. J. Pept.

Protein Res., 22, 568-572 (1983); Aiuti et al., Lancet 1:551-555 (1983); og Levinsky et al., i "Primary Immunodeficiency Diseases", Wedgewood,

Rosen og Paul, udg. 19, 273-276 (1983). Der henvises til de ovenfor nævnte patentskrifter og artikler med hensyn til en diskussion af andet 35 baggrundsmateriale og de biologiske processer, som er involveret i den foreliggende opfindelse.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer peptider og peptidpræparater, der er overraskende kraftigere end thymopentin eller splenin og DK 171238 B1 2 således tilbyder væs'entlige fordele ved behandlingen af immundefekter.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptider med følgende formel: R-V-W-X-Y-Z-R1 (I) 5 eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf, hvori R er H, lavere al kyl, formyl eller lavere alkanoyl, V er ARG eller D-ARG, 10 W er LYS, D-LYS, PRO, dehydro PRO eller AIB, X er ASP, D-ASP, GLU eller D-GLU, Y er VAL, LYS, LEU, ILE, GLU,-ALA, GLN, D-VAL, D-LYS, D-LEU, D-ILE, D-GLU, D-ALA og D-GLN, Z er PHE, HIS, TRP, D-PHE, D-HIS eller D-TRP, 15 R1 er OH eller NR2R3 og 2 3 R og R indbyrdes uafhængigt er H eller lavere al kyl, under forudsætning af, at Z er forskellig fra PHE, når W er LYS, X er D-ASP, GLU eller D-GLU, og Y er VAL.

Det har overraskende vist sig, at de omhandlede peptider besidder 20 thymopentin-1ignende eller splenin-1ignende aktivitet af en styrke, som er cirka ti gange styrken af thymopentin eller splenin selv.

De omhandlede peptider, hvor W er PRO, dehydro PRO eller AIB, besidder også overraskende modstandsdygtighed over for nedbrydning med enzymer, som omhandlet i ovennævnte patentansøgning.

25 Som angivet ovenfor angår den foreliggende opfindelse hidtil ukendte peptider med thymopoietin-1ignende aktivitet, og syre- eller base-additionssalte heraf samt terapeutiske præparater indeholdende disse peptider.

I dens bredeste aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse 30 peptider med følgende formel: R-V-W-X-Y-Z-R1 (I) eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf, 35 hvori R, V, W, X, Y, Z og R1 har den ovenfor angivne betydning. Foretrukne peptider ifølge opfindelsen er sådanne med formel (I), hvor Z er PHE, D-PHE, HIS eller D-HIS, og især hvor W også er PRO. Mere foretrukne peptider er sådanne med formel (I), hvor R er hydrogen eller lavere al- DK 171238 B1 3 kanoyl, V er ARG, X er ASP og Z er PHE eller HIS, og nærmere betegnet hvor W også er PRO. Stadigt mere foretrukne peptider er H-ARG-LYS-ASP-VAL-PRE-OH, H-ARG-LYS-ASP-VAL-HIS-OH, H-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH, H-ARG-PRO-ASP-VAL-HIS-OH, H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH, o-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-5 PHE-NH2 og lavere alkanoyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH.

I det foreliggende omfatter betegnelsen "lavere al kyl" forgrenede eller ligekædede mættede carbonhydrider med fra ét til seks carbon-atomer, såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, pentyl, hexyl og lignende, medens betegnelsen "lavere alkanoyl" betyder 10 o

II

lavere alkyl-OC-.

Som syrer, der kan danne salte med disse peptider, kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrintesyre, perchlorsyre, salpeter-15 syre, thiocyansyre, svovlsyre, phosphorsyre og lignende, og organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, anthranilsyre, kanelsyre, naphthalensulfonsyre, sulfanilsyre eller lignende.

20 Som baser, der er i stand til at danne salte med disse peptider, kan nævnes uorganiske baser såsom natriumhydroxid, ammoniumhydroxid, kaliumhydroxid og lignende og organiske baser såsom mono-, di- og trial-kyl- og -arylaminer (f.eks. triethylamin, di isopropylamin, methylamin, dimethylamin og lignende) og eventuelt substituerede ethanolaminer 25 (f.eks. ethanolamin, diethanolamin og lignende).

I beskrivelsen og kravene identificeres aminosyrekomponenterne i peptiderne og visse materialer, som anvendes til deres fremstilling, af bekvemmelighedsgrunde ved hjælp af forkortelser. Disse forkortelser er som følger: 30 Aminosyre Forkortelse

L-alanin ALA

D-alanin D-ALA

L-arginin ARG

D-arginin D-ARG

35 L-aspartinsyre ASP

D-aspartinsyre D-ASP

L-glutaminsyre GLU

D-glutaminsyre D-GLU

i DK 171238 B1 4

L-glutamin GLN

D-glutamin D-GLN

L-histidin HIS

D-histidin D-HIS

5 L-isoleucin ILE

D-isoleucin D-ILE

L-leucin LEU

D-leucin D-LEU

L-lysin LYS

10 D-lysin D-LYS

a-methylalanin AIB

L-phenylalanin PHE

D-phenylalanin D-PHE

L-prolin PRO

15 L-tryptophan TRP

D-tryptophan D-TRP

L-valin VAL

D-valin D-VAL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Peptiderne ifølge opfindelsen kan generelt fremstilles ved kendt 2 teknik. Peptiderne kan bekvemt fremstilles ved fast-fase syntese 3 teknikken, der først blev beskrevet af Merryfield i Journal of the 4

American Chemical Society, 85, 2149-2154 (1963). Sådanne fremgangsmåder 5 omtales også i visse af de ovennævnte tidligere patentskrifter. Andre 6 teknikker kan findes, f.eks. i M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, 7

John Wiley & Sons, 2. udg., 1976, såvel som i andre af fagmanden kendte 8 opslagsværker. Passende beskyttende grupper kan anvendes ved sådanne 9 synteser, og deres forkortelser vil kunne findes i ovennævnte tekst så 10 vel som i J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum 11

Press, New York, 1973. Indholdet af begge disse bøger inkorporeres heri 12 som en del af den foreliggende beskrivelse. De almindelige beskyttende 13 grupper, som anvendes heri, er t-butyloxycarbonyl (BOC), benzyl (BZL), 14 t-amyloxycarbonyl (AOC), tosyl (TOS), o-bromphenylmethoxycarbonyl (BrZ), 15 2,6-dichlorbenzyl (BZLC12) og phenylmethoxycarbonyl (Z eller CBZ).

16

Peptiderne ifølge opfindelsen, hvor X er ASP eller D-ASP, har vist sig at udvise biologisk aktivitet, der svarer til thymopoietins, som omhandlet i de ovenfor anførte USA patentskrifter og artikler. Denne biologiske aktivitet påvises, idet induktion af cyklisk GMP-produktion i DK 171238 B1 5 en human T-cellelinie ved forsøg måles under sammenligning med thymopoietin. Induktionen af c-GMP produktion med et testpeptid ved denne prøve indikerer testpeptidets evne til at binde til thymopoietin-receptorsted-et på cellen og inducerer thymopoietin-1ignende biologisk aktivitet. Som 5 det fremgår af de nedenstående resultater, er de omhandlede peptider op til ti gange kraftigere end thymopentin og tilbyder således en væsentlig fordel. På grund af omkostningerne ved fremstilling af peptider og den hurtige nedbrydning af peptider, der ofte iagttages i levende systemer, er peptider af de i det foreliggende omhandlede arter med forøget styrke 10 stærkt værdsatte.

Den biologiske aktivitet af de omhandlede peptider, hvori X er ASP eller D-ASP, antydes også ved at disse peptider bindes til cellemembranreceptoren for thymopoietins aktive sted.

Peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse, hvori X er GLU eller 15 D-GLU, udviser biologisk aktivitet svarende til splenin og forårsager differentieringen af både Thy-1“ celler til Thy-1+ T-celler og Lyb-2' celler til Lyb-2+ B-celler ifølge den af Scheid et al., J. Exp. Med.

147: 1727-1743 (1978) omhandlede prøve.

I forhold til den kendte teknik var det fuldstændigt uventet, at 20 det skulle være muligt at fremstille peptider med en sådan forøget styrke i sammenligning med thymopentin ved at erstatte aminosyren tyrosin i femstillingen med phenylalanin, histidin eller tryptophan. Nødvendigheden af en tyrosinrest eller tyrosin-1ignende aminosyrerest i femstillingen antydes generelt i de ovennævnte patentskrifter og artikler. Den 25 kendte teknik indebærer ingen antydning af, at sådan stærkt forøget styrke ville kunne opnås ved anvendelse af de omhandlede peptider.

På grund af de omhandlede peptiders immunomodulatoriske egenskaber er de terapeutisk nyttige ved behandlingen af mennesker og dyr, idet de er i stand til at inducere differentieringen af lymphopoietiske stam-30 celler i det hæmopoietiske væv til thymus-afledte celler (T-celler), som er i stand til at indgå i legemets immunreaktion. Som følge heraf antages de omhandlede peptider at have talrige terapeutiske anvendelser.

Da forbindelserne er i stand til at udføre visse af de indikerede thymus-funktioner, har de primært anvendelse inden for forskellige thy-35 miske funktions- og immunitetsområder. En sådan anvendelse er behandlingen af DiGeorge syndrom, en tilstand, hvor der er et medfødt fravær af thymus. Administrering af et af de omhandlede peptider til en patient, som lider af DiGeorge syndrom vil hjælpe denne med at overvinde manglen.

DK 171238 B1 6

Fagmanden inden for immunologi kan let bestemme en hensigtsmæssig administreringsvej (fortrinsvis parenteralt),og kan bestemme den effektive mængde af et af de omhandlede peptider til behandling af DiGeorge syndrom. Da de omhandlede peptider har højere styrke end thymopentin, er de 5 terapeutisk mere nyttige end peptider ifølge den kendte teknik.

Ydermere betragtes de omhandlede peptider som værdifulde til at assistere ved legemets kollektive immunitet, idet de vil forøge eller assistere med terapeutisk stimulering af cellulær immunitet, hvorved de bliver værdifulde til behandlingen af sygdomme, der involverer kronisk 10 infektion, såsom svampe- eller mycoplasmainfektioner, tuberkulose, spedalskhed, akutte og kroniske virusinfektioner og lignende.

De omhandlede forbindelser betragtes generelt som værende nyttige inden for ethvert område, hvor cellulær immunitet har betydning, og især i tilfælde af immunitetsmangler såsom ved det ovennævnte DiGeorge syn-15 drom. Når der således er et overskud af antistofproduktion som følge af ubalancerede T-celler og B-celler, kan de omhandlede peptider korrigere denne tilstand ved at stimulere T-celle-produktionen. De forventes således at være af terapeutisk nytte ved visse autoimmun-sygdomme, hvor skadelige antistoffer dannes, såsom systemisk lupus erythematosis, rheu-20 matoid arthritis eller lignende.

De omhandlede peptider, hvor X er GLU eller D-GLU, er også nyttige til at inducere differentieringen af prækursor B-celler til modne B-celler, som er i stand til at danne antistof. De er således nyttige ved behandling af sådanne tilstande som X-bundet infantil hypogammaglobuli-25 nemia, hvor der eksisterer en defekt i denne differentieringsmekanisme.

Generelt udtrykt er de omhandlede forbindelser nyttige til regulering af immunsystemet hos en patient, dvs. et menneske eller et dyr, som behøver en sådan regulering. Med udtrykket "regulere" menes i det foreliggende, at den omhandlede forbindelse får immunsystemet til at vende 30 fra en unormal sygdomstilstand tilbage til en normal, afbalanceret tilstand. Medens denne regulering meget vel kan finde store anvendelsesmuligheder ved afhjælpning af immunologiske mangler (f.eks. DiGeorge syndrom), er den også anvendelig til afhjælpning af tilstande med overskud af immunologisk aktivitet (f.eks. autoimmun-sygdomme). Den fore-35 liggende opfindelse omfatter derfor farmaceutiske præparater til udøvelse af disse fremgangsmåder.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i krav 13's kendetegnende del angivne.

DK 171238 B1 7

Til fremstilling af de farmaceutiske præparater ifølge den foreliggende opfindelse forenes et peptid med formel (I) eller et baseeller syreadditionssalt deraf som den aktive bestanddel i intim blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer i overensstemmelse med konventionelle 5 farmaceutiske sammenblandingsteknikker. Denne bærer kan antage et antal forskellige former i afhængighed af den til administrering ønskede præparatform, f.eks. sublingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Til fremstilling af præparaterne på oral dosisform kan ethvert af de sædvanlige farmaceutiske medier anvendes, som f.eks. vand, olier, alkoholer, 10 aromamidler, konserveringsmidler, farvemidler og lignende i tilfælde af orale flydende præparater (f.eks. suspensioner, eliksirer og opløsninger) eller bærere som stivelsesarter, sukkerarter, fortyndingsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, disintegreringsmidler og lignende i tilfælde af orale faste præparater (f.eks. pulvere, kapsler 15 og tabletter). Former med kontrolleret frigørelse kan også anvendes. På grund af administreringsletheden repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale enhedsdosisform, i hvilket tilfælde der naturligvis anvendes faste farmaceutiske bærere. Om ønsket kan tabletterne være sukkerovertrukket eller enterisk overtrukket ved hjælp af standard-20 teknikker.

Til parenterale produkter vil bæreren sædvanligvis omfatte sterilt vand, skønt andre bestanddele, f.eks. til fremme af opløselighed eller med konserveringsformål, kan være medindbefattet. Injicerbare suspensioner kan også fremstilles, i hvilket tilfælde der kan anvendes passen-25 de flydende bærere, suspensionsmidler og lignende.

De omhandlede peptider er i almindelighed aktive, når de administreres parenteralt i mængder, der overstiger ca. 1 øg/kg legemsvægt.

Til behandling af DiGeorge syndrom kan peptiderne administreres parenteral t i en mængde på ca. 0,1 til ca. 10 mg/kg legemsvægt. Dosismængder i 30 samme område kan i almindelighed anvendes til behandling af de andre nævnte sygdomme eller tilstande, hvor immunologiske mangler skal behand les. Større mængder (f.eks. ca. 10-1000 mg/kg legemsvægt) er nyttige til at undertrykke for høj immunaktivitet.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere. I eksemplerne og 35 i hele beskrivelsen er dele vægtdele, med mindre andet er angivet.

DK 171238 B1 8

Eksempel 1

Arqinyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Phenyl alanin, opløst BOC-PHE-O-CHn-harpiks

Chlormethyleret harpiks (1,04 mmol Cl/g, 5 g) og vandfri KF (0,44 5 g, 7,5 mmol) sattes til en opløsning af BOC-PHE-OH (1,33 g, 5 mmol) i DMF (40 ml) i en rundbundet kolbe forsynet med en foroven anbragt omrører. Reaktionsblandingen omrørtes ved 65°C i 24 timer. Harpiksen frafiltreredes så og vaskedes omfattende med DMF, DMF/H20 (1:0), H20, Et0H/H20 (1:1), EtOH og CHgCl2· Substitutionen med BOC-PHE-OH på 10 harpiksen var 0,545 mmol pr. g harpiks baseret på aminosyreanalyse.

ARG-LYS-ASP-VAL-PHE

Z-ARG(Z,Z)-LYS(Z)-ASP( BZL)-VAL-PHE-OCH2-harpiks sammensattes manuelt ved fastfase-metode. Aminosyrederivaterne og DCC anvendtes i tredob-15 belt overskud med følgende koblinger: Z-ARG(Z,Z)-OH, BOC-LYS(Z)-OH, BOC-ASP( BZL)-OH og BOC-VAL-OH. Harpikspeptidet (3,1 g) spaltedes så med HF/anisol (9:1, 30 ml) i 1 time ved 0°C. Efter fjernelse af HF/anisol frafiltreredes harpikspeptid-blandingen og vaskedes med ether (3 x 20 ml). Peptidet ekstraheredes med 5% H0Ac/H2O (3 x 50 ml) og lyofilisere-20 des, hvilket gav 800 mg af produktet. Det rå peptid rensedes så på en "Sephadex-SPC-25"-kolonne (80 cm x 2,5 cm), der var ækvilibreret med 0,2 M NH^OAc, pH 5. Strømningshastigheden var 85 ml/time, og fraktioner bestående af 10 ml/glas opsamledes. Det ønskede peptid elueredes mellem glas 145-167. Disse fraktioner forenedes og lyofiliseredes, hvilket gav 25 750 mg materiale. Dette peptid kromatograferedes yderligere på en "Sephadex G10"-kolonne (80 cm x 2,5 cm) under anvendelse af H20. Strømningshastigheden var 18 ml/time, og fraktioner bestående af 10 ml/glas opsamledes. Det ønskede peptid elueredes imellem glas 21-26. Tyndtlagskromatografi (silikagel F60, 200 mikrometer) 30 Rf 0,23 (n-Bu0H/H0Ac/H20 = 4:1:1)

Rf 0,11 (NH40H/2-propanol = 37:84)

Aminosyreanalyse:

Arg, 1,04; Lys, 1,00; Asp, 1,04; Val, 0,97 og Phe, 1,00 35 Peptidindhold: 88% HPLC: "Whatman Partisil-ODS-1"-kolonne 10% CH3OH/0,02 M KH2P04; pH 3,5 Strømningshastighed: 2 ml/min DK 171238 B1 9

Retentionstid: 8,10 min Eksempel 2

Ntt-Acety1-Arginyl-Prolyl-Aspartyl-Valyl-Phenyl alanin 5 Det ønskede peptid syntetiseredes ved hjælp af fastfase-metoden, idet der startedes med BOC-PHE Merrifield harpiks (12,03 g, 0,51 n»kv/g). Harpiksen kobledes sekventielt med tre ækvivalenter BOC-VAL, B0C-/3-BZL-ASP og BOC-PRO. Koblingsmidlet var 1:1 DCC:H0BT i 4:1 CH2C12: DMF under hele syntesen.

10 Cirka 1/3 af denne tetrapeptidharpiks gemtes. Den resterende harpiks kobledes med Ng-T0S-Ntt-A0C-ARG under anvendelse af de ovennævnte koblingsbetingelser.

Cirka halvdelen af pentapeptidharpiksen gemtes. Den resterende harpiks behandledes med TFA og neutraliseredes med DIEA. Den behandledes så 15 med Ac20 (3 ml) og DMAP (0,3 g) i CH2C12 (40 ml) i 60 min. Harpiksen vaskedes, tørredes og spaltedes i HF (40 ml): anisol (10 ml) ved 0°C i 60 min. Faststofremanensen ekstraheredes så med 10% HOAc og lyofili seredes, hvilket gav 1,36 g af det rå peptid.

Det rå peptid rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 90 cm): 0,05M 20 NH^HCO^, pH 5 (3,5 1), 100 ml/time strømningshastighed, 13 ml fraktioner, 206 nm detektor. Fraktionerne 170-205 opsamledes og lyofiliseredes, hvilket gav den ønskede forbindelse, 830 mg.

TLC: Silikagel, 250μ 25 Opløsningsmiddel R^.

5:5:3:1 Et0Ac:pyr:H20:H0Ac 0,38 4:1:5 nBu0H:H0Ac:H20, øvre fase 0,41 1:1 trifluorethanoliNH^OH 0,75 30 Aminosyreanalyse:

Arg, 1,02; Pro, 0,98; Asp, 0,97; Val, 1,02; Phe, 1,01

Peptidindhold: 65,3%

Eksempel 3 35 Na-Formyl-Arginyl-Propyl-Aspartyl-Valyl-Phenyl alanin

Det ønskede peptid fremstilledes ved fasefase-metoden, idet der startedes med (Ng-T0S-Na-A0C)-ARG-PR0-(0-BZL)-ASP-VAL-PHE harpiksester fra eksempel 2 (ca. 2 mmol). Efter af beskyttelse med 1:1 TFA/CH2C12 og DK 171238 B1 10 neutralisering med DIEA behandledes harpiksen med p-nitrophenylformiat (1,0 g) og HOBT (0,9 g) i 5:1 CH^C^rDMF (30 ml) i 16 timer. Harpiksen vaskedes og genbehandledes med p-nitrophenyl formiat (1,0 g) og DMAP (0,2 g) i CH2C12 i 1 time.

5 Formyl peptidharpiksen spaltedes i HF (60 ml) og anisol (10 ml) ved 0°C i 1 time. Faststofremanensen behandledes med 0,2% NH^OH, og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav 1,00 g farveløst fast stof.

Peptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 90 cm): 0,1M NH^HCOj, pH 7,5, 100 ml/time strømningshastighed, 13 ml fraktioner, 206 nm 10 detektor. Fraktionerne 105-130 opsamledes og lyofili seredes, hvilket gav den ønskede forbindelse, 675 mg, i form af et farveløst fast stof.

TLC: Sil i kagel, 250μ

Opløsningsmiddel 15 _ _ 5:5:3:1 Et0Ac:pyr:H20:H0Ac 0,59 4:1:5 nBu0H:H0Ac:H20 0,40 15:3:12:10 NBu0H:H0Ac:H20:pyr 0,59 20 Aminosyreanalyse:

Arg, 1,01; Pro, 1,00; Asp, 1,00; Val, 0,98; Phe, 1,00 Peptidindhold: 78,5%

Eksempel 4 25 Arginyl-Prolyl-Aspartyl-Valyl-Phenylalanin

Det ønskede peptid syntetiseredes ved fastfase-metoden, idet der startedes med B0C-PHE Merrifield harpiks (8,06 g, 0,5 mækv/g). Harpiksen kobledes sekventielt med tre ækvivalenter B0C-VAL (én gang med DCC/4-pyrrolidinopyridin, rekobiet med DCC/HOBT), BOC-/J-BZL-ASP (DCC/H0BT), 30 B0C-PRO(DCC/HOBT) og Ng-TOS-Na-AOC-ARG (DCC/HOBT). Opløsningsmidlet var 4:1 CH2C12:DMF under hele syntesen.

Cirka halvdelen af denne harpiks tørredes og spaltedes i HF (40 ml):anisol (10 ml):mercaptoethanol (1 ml) ved 0°C i 60 min. Faststofremanensen ekstraheredes med 10% HOAc og lyofili seredes, hvilket gav 35 1,34 g af det rå peptid.

Det rå peptid rensedes på "Sephadex CM 25" (2,6 x 90 cm): gradienteluering, 0,05M NH40Ac, pH 5 (2,1 1) til 0,3 M NH40Ac, pH 4 (2,1 1), 100 ml/time strømningshastighed, 13 ml fraktioner, 206 nm detektor.

DK 171238 B1 11

Fraktioner 61-100 opsamledes og lyofi liseredes. Det faste stof kromato-graferedes på en "G-10 Sephadex"-kolonne (eluering med 1% HOAc), opsam-ledes og lyofil i seredes, hvilket gav den ønskede forbindelse, 780 mg.

TLC: Silikagel G, 250/i 5

Opløsningsmiddel 5:5:3:1 Et0Ac:pyr:H20:H0Ac 0,38 4:1:5 n-Bu0H:H0Ac:H20, øvre fase 0,25 10 1:1 trifluorethanol:NH^0H 0,71

Aminosyreanalyse:

Arg, 1,00; Pro, 1,00; Asp, 1,00; Val, 1,03; Phe, 0,96 Peptidindhold: 61% 15

Eksempel 5

Arginyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Histidin, opløst

Den ønskede forbindelse syntetiseredes ved fastfase-metoden, idet der startedes med BOC-(im-TOS) histidin bundet til Merrifield harpiks 20 ved et substitutionsniveau på 0,21 mmol/g. Vaskningssekvensen var som følger: Mængde x Gentagelser Tid 1) 50% TFA/CH2C12 75 x 1 1 min . 2) 50% TFA/CH2C12 75 x 1 20 min 25 3) CH3C12 75 x 3 1 min 4) 25% (CH3)2CH0H/CH2C12 75 x 3 1 min 5) CHgCl2 75 x 3 1 min 6) 5% di isopropyl ethylamin/CH2Cl2 75/1 1 min 7) CH2C12 75 x 3 1 min 30 8) som i 6) 75 x 1 1 min 9) CH2C12 75 x 3 1 min 10) Koblingstrin

Alle koblingstrin, undtagen val in, udførtes ved hjælp af den 35 symmetriske anhydrid-teknik. Det symmetriske anhydrid syntetiseredes under anvendelse af den derivatiserede aminosyre og DCC (2 til 1 mol forhold) i CH2C12 ved 0°C. Di cyklohexyluri nstoffet fjernedes ved filtrering, og filtratet førtes til fastfase-reaktionsbeholderen.

DK 171238 B1 12

Aminosyre Mængde Mmol Kilde Parti Nr.

Boc val in 4,0 g 18,00 Bachem R4544

Boc val in 4,0 g 18,00 Bachem R4544

Boc val in 2,0 g 9,00 Bachem R4544 5 Boc-/J-benzyl-Asp 3,22 g 10,00 Bachem R5291

Ntt-Boc-Nf-CBZ-Lys 3,81 g 10,00 Bachem R4651

Na-CBZ-N'y,AdiCBZ-Arg 2,9 g 5,00 Bachem R5931

Noter: 10 1. Tredie kobling med Boc val in foretoges under anvendelse af dicyklo- hexylcarbodiimid (9,00 mmol) og 1-hydroxybenzotriazol.monohydrat (9,00 mmol) i dimethyl formamid (20 ml)/methylenchlorid (30 ml).

2. Efter tredie kobling med Boc val in acetyleredes harpikspeptidet med 5% eddikesyreanhydrid i CH2C12 (100 ml) indeholdende 100 mg 4- 15 dimethylaminopyridin.

3. Harpikspeptidet halveredes efter acetyleringen.

4. Harpikspeptidet halveredes efter afbeskyttelse og neutralisering af lysinresten.

Harpikspeptid-udbyttet var 6,7 g. Peptidet afbeskyttedes og 20 fjernedes fra harpiksen ved hjælp af spaltning med HF (60 ml) under anvendelse af anisol (3 ml) som bortfjernelsesmiddel.

Efter fjernelse af HF og anisol ved formindsket tryk tri tureredes remanensen med diethyl ether, opsamledes ved filtrering, vaskedes med diethyl ether og ekstraheredes med 50% TFA/CH2C12 (4 x 25 ml). Ekstrakterne 25 forenedes, opløsningsmidlerne fjernedes ved formindsket tryk, og remanensen tritureredes med diethylether. Det resulterende faste stof opsamledes ved filtrering, vaskedes med diethylether og tørredes i vakuum ved stuetemperatur natten over, hvilket gav 1,84 g af det rå peptid.

1,0 g af det rå peptid kromatograferedes på "Sephadex C-25" (2,6 x 30 95 cm) ved eluering med 0,2 M NH^CH3C02 ved pH 6,0. Strømningshastigheden var 90 ml/time, og fraktioner opsamledes hver 7,5 minut. Efter opsamling af 200 fraktioner ændredes pufferen til 0,25 M NH^CH3C02 ved pH

7,0. Fraktioner 240 til 280 forenedes og lyofiliseredes. Materialet lyo-filiseredes to gange fra vand, hvilket gav 0,8 g. Dette kromatografere-35 des på "Sephadex 6-10" (2 tandem 2,6 x 95 cm kolonner) ved eluering med vand. Strømningshastigheden var 40 ml/time, og hver fraktion bestod af 150 dråber (6,5 ml). Fraktioner 78 til 87 forenedes og lyofiliseredes, hvilket gav 286 mg af den ønskede forbindelse.

DK 171238 B1 13 TLC på silikagel G250 (J.T. Baker 5 x 20 cm) Påvist 40 øg

Opløsningsmiddel system 5 _ _ n-butanol/eddikesyre/vand (1:1:1) 0,23 n-butanol/eddikesyre/vand/pyridin (4:2:3:1) 0,29

Chloroform/methanol/konc. NH^OH (2:2:1) 0,23 10 HPLC påviser en renhed på 99,4%

Aminosyreanalyse Beregnet Fundet

Arg 1,0 1,03

Lys 1,0 1,00 15 Asp 1,0 0,95

Val 1,0 1,02

His 1,0 0,99 76,1% peptid 20

Optisk rotation [a]„22 . .32 9o (c . 0ill24 , 1H H0Ac)

Eksempel 6

Arginyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Tryptophan, opløst 25 Peptidet syntetiseredes under anvendelse af DCC-kobl ingsteknik med følgende udgangsmaterialer: Mængde Mol

Boc-tryptophan (CHO)-harpiksester 6,0 g 0,003

Boc-valin 1,96 g 0,009 30 Boc-aspartinsyre-/?-benzylester 2,94 g 0,009

Boc-Nf-lysin 3,42 g 0,009

Boc-N^-tosyl-arginin 3,86 g 0,009

Dicyklohexylcarboxiimid 1,86 g 0,009

Hydroxybenzotriazol 1,22 g 0,009 35 Fastfase-fremgangsmåden var som følger:

Harpiksen anbragtes i en med omrøring forsynet fastfase-reaktions-beholder og fik lov at kvælde i fire timer. Opløsningsmidlet fjernedes ved filtrering, og remanensen behandledes med 100 ml af følgende opløs- DK 171238 B1 14 ningsmidler og reagenser under anvendelse af de angivne tidsrum og cykler. Efter hver behandling fjernedes væsken ved filtrering.

1. CHgClg 3x1 minut - vask 5 2. 50% TFA/CH2C1g 1 minut - deblokering 3. 50% TFA/CHgClg 30 minutter - deblokering 4. CHgClg 3x1 minut - vask 5. 5% N-methylmorpholin/CHgClg 1 minut - neutralisering 6. CH2C12 3 x 1 minut - vask 10 7. 5% N-methylmorpholin/CHgClg 1 minut - neutralisering 8. CHgClg 3 x 1 minut - vask 9. 5% di isopropyl ethylamin/CHgClg 0,5 minut - neutralisering 10. CHgClg 3 x 1 minut - vask 11. 20% DMF/CH2C12 3 x 1 minut - vask 15 12. Kobling 1,5 til 4,0 timer 13. DMF 3x1 minut - vask

Peptidbindingen dannedes ved at tilsætte den blokerede aminosyre i 40 ml CH2C12 og HOBt i 20 ml DMF og omrøre i 1 minut og derpå tilsætte 20 DCC i 40 ml CH2C12 og omrøre imellem 1,5 og 4,0 timer. Harpikspeptidet vaskedes med DMF og CHgCl2 efter fuldførelse af alle koblinger, og Boc-gruppen fjernedes på sædvanligvis. TFA-saltet vaskedes grundigt med CH2C12» fjernedes fra reaktionsbeholderen og tørredes til en konstant vægt i vakuum, 8,69 g.

25 Peptidet spaltedes fra harpiksen ved omrøring i flydende HF (med

tilsat anisol og tryptophan) i 1 time ved 0°C. HF fjernedes ved formindsket tryk. Det faste stof vaskedes med ether, og peptidet ekstrahe-redes fra harpiksen med 25% H0Ac/H20. Dette materiale lyofil i seredes, hvilket gav 3,45 g af det rå produkt, hvor formylgruppen stadig sad på 30 tryptophan. Materialet deformyleredes ved omrøring i 1,0 M NH^HCO-j, pH

9,0 (100 ml) i 24 timer. Det rå materiale lyofiliseredes og kromatogra-feredes på en "Sephadex SP-C-25"-kolonne (2,6 x 90 cm). Eluering med 0,2M NH40Ac, pH 6,00, gav efter forening af de passende fraktioner og lyofili sering 2,09 g produkt (renhed 93%). Dette materiale behandledes 35 ved præparativ HPLC på en "M-20"-kolonne (Whatman "ODS-3") og elueredes med 0,01M NH^OAc, 12% CH-jCN, pH 5,00, hvilket efter forening af de passende fraktioner gav 0,75 g af det rene produkt.

DK 171238 B1 15

Eksempel 7

Acetyl-Arqi nyl-α-Ami noi sobutyryl-Aspartyl - Valyl- Phenyl alami nami d, opi øst A. TFA Asp(0Bzl)-Val-Phe-NH-MBHA-harpiks 5 p-methylbenzylhydrylamin-harpiks (70 g, 0,3 mmol/g harpiks) kvælde- des i CHgCl^ i 1 time. Boc-Phe, Boc-Val og Boc-Asp(OBzl)-OH inkorporeredes i harpiksen via DCC-formidlet kobling. Efter fjernelse af N-terminal Boc-gruppen tørredes harpikspeptidet og anvendtes til syntese af andre peptider.

10 B. Ac-Arq-Aib-Asp-Val -Phe-NHp TFA Asp(0Bzl)-Val-Phe-NH-MBHA-harpiks (6 g) kobledes med Boc-Aib og Aoc-Arg(Tos)-OH under anvendelse af på hinanden følgende DCC/HOBt-kob-linger. Efter fjernelse af Arg's Aoc-gruppe acetyleredes harpikspeptidet 15 med Ac20/pyridin (1:1). Harpikspeptidet (5 g) spaltedes så med HF/anisol (9:1, 50 ml) ved 0°C i 1 time. Peptidet ekstraheredes med 5% H0Ac/H20 (3 x 50 ml) og lyofili seredes, hvilket gav 570 mg fast materiale. Det rå peptid kromatograferedes på en "Sephadex DEAE"-kolonne (80 cm x 2,5 cm), der var ækvilibreret med ikke-pufferbehandlet 0,05 M (NH^JHCOg. Strøm-20 ningshastigheden var 85 ml/time, og 10 ml fraktioner opsamledes. Peptidet elueredes imellem glas 35-48, og denne fraktion lyofiliseredes så, hvilket gav 450 mg af produktet.

Tyndtlagskromatografi (sil i kagel FgQ, 200 β) 25 RfI 0,45 (NH40H/isopropanol = 37:84)

RfII 0,25 (n-Bu0H/H0Ac/H20 = 3:1:1)

Aminosyreanalyse:

Arg, 1,01; Aib, 1,03; Asp, 1,03; Val, 0,99; Phe, 1,00 30

Peptidindhold: 88,3%

Eksempel 8

Acetyl-Arqi nyl- Prolyl-Aspartyl-Valyl- Phenyl al an i n-ami d, opløst 35 Ac-Arg(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Val-Phe-NH-MBHA-harpiks syntetiseredes ved SPPS ud fra 10 g p-methylbenzhydrylamin-harpiks (substitutionsniveau 0,3 mmol NH2/g harpiks). Aminosyrederivaterne og DCC anvendtes i tredobbelt overskud til følgende koblinger: Aoc-Arg(Tos)-0H, Boc-Pro, Boc-Asp- DK 171238 B1 16 (OBzl)-OH, Boc-Val og Boc-Phe. Harpikspeptidet (4 g) spaltedes så med HF/anisol (9:1, 40 ml) i 1 time ved 0°C. Efter fjernelse af HF/anisol filtreredes blandingen og vaskedes med ether (3 x 30 ml). Peptidet eks-traheredes med 5% HOAc/l^O (3 x 50 ml) og lyofili seredes, hvilket gav 5 315 mg af produktet. Det rå peptid rensedes så på en "Sephadex DEAE"-ko lonne (2,5 cm x 80 cm), der var ækvilibreret med 0,05 M (NH^HCOg) (ikke-pufferbehandlet). Strømningshastigheden var 85 ml/time, og fraktioner bestående af 12 ml/glas opsamledes. Det ønskede peptid elueredes imellem glas 30-40. Denne fraktion lyofiliseredes, hvilket gav 300 mg materiale.

10

Tyndtlagskromatografi (silikagel Fg0, 200 β)

Rfj 0,55 (NH^OH/isopropanol = 37:84)

Rfn 0,3 (n-Bu0H/H0Ac/H20 = 3:1:1)

Aminosyreanalyse: 15 Arg, 1,00; Pro, 0,99; Asp, 0,99; Val, 1,00; Phe, 1,00

Peptidindhold: 57,5%

Eksempel 9 20 Arginyl-Lysyl-Glutamyl-Valyl-Histadin, opløst

Forbindelsen syntetiseredes ved fastfase-metoden ud fra 5,0 g Boc-(im-Tos) histidin, som var bundet til Merrifield harpiks ved et substitutionsniveau på 0,21 mmol/g. Vaskningssekvensen var som følger: 25 Mængde x Gentagelser Tid 1) 50% TFA/CH2C12 75 x 1 1 min 2) 50% TFA/CH2C12 75 x 1 20 min 3) CH^C^ 75 x 3 1 min 4) 25% (CH3)2CH0H/CH2C12 75 x 3 1 min 30 5) CH2C12 75 x 3 1 min 6) 5% di isopropyl ethylamin/CH2Cl2 75 x 1 1 min 7) CH2C12 75 x 3 1 min 8) som i 6) 75 x 1 1 min 9) CH2C12 75 x 3 1 min 35 10) Koblingstrin

Alle koblinger udførtes under anvendelse af ækvimolære mængder af den beskyttede aminosyre, dicyklohexylcarbodiimid og hydroxybenzoetria- DK 171238 B1 17 zol. Som opløsningsmiddel anvendtes en blanding af dimethyl formamid (12 ml) og methylenchlorid (38 ml).

Aminosyre Mængde Mmol Kilde Parti Nr.

5 Boc-valin 0,65 g 3,00 Peninsula 001678

Boc-benzyl-Glu 1,01 g 3,00 Bachem R4835

Ntt-Boc-NY-CBZ-Lys 1,14 g 3,00 Bachem R4651

Na-CBZ-N7’ÅdiCBZ-Arg 1,14 g 3,00 Bachem R5931 10 Noter:

Efter den sidste kobling vaskedes harpikspeptidet med dimethyl formamid (2 x 50 ml), isopropanol (2 x 50 ml) og tørredes i vakuum ved 50°C i 20 timer.

Udbyttet af harpikspeptid var 6,9 g. 6,7 g af harpikspeptidet 15 afbeskyttedes, og peptidet fjernedes fra harpiksen ved spaltning med HF (50 ml) under anvendelse af anisol (1 ml) som bortfjernelsesmiddel.

Efter fjernelse af HF og anisol ved formindsket tryk tritureredes remanensen med diethylether, opsamledes ved filtrering, vaskedes med diethyl ether og ekstraheredes med 5% eddikesyre/vand (4 x 25 ml) og derpå 20 vand (4 x 25 ml). Ekstrakterne forenedes og lyofili seredes, hvilket gav 1,1 g af det rå peptid.

1,0 g af det rå peptid kromatograferedes på "Sephadex C-25" (2,6 x 95 cm) ved eluering med 0,25 M NH^HCO^ ved pH 7,0. Strømningshastigheden var 100 ml/time, og fraktioner hver bestående af 200 dråber opsamledes.

25 Fraktionerne 161 til 210 forenedes og lyofiliseredes. Materialet lyofili seredes tre gange fra vand, hvilket gav 568 mg af den ønskede forbindelse.

Analytiske data: 30 TLC på silkagel G250 (J.T. Baker 5 x 20 cm)

Opløsningsmiddelsystem R^ n-butanol/eddikesyre/vand (1:1:1) 0,29 35 n-butanol/eddikesyre/vand/pyridin (4:2:3:1) 0,32

Chloroform/methanol/konc. NH^OH (2:2:1) 0,30 DK 171238 B1 18

Aminosyreanalyse Beregnet Fundet

Arg 1,0 1,05

Lys 1,0 1,01

Glu 1,0 1,02 5 Val 1,0 0,99

His 1,0 0,93 74,7% peptid

Optisk rotation [α1ρ22 . _24 3o (c „ 0|U54 , 0>1 N H0Ac) 10

Eksempel 10

Arqinyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Prolin

Den ønskede forbindelse fremstilledes ved fastfase-metoden ud fra Boc-Pro benzyl esterharpiks (5,08 g, 0,64 mækv/g). Følgende standard-15 rutiner anvendtes:

Afbeskyttelse: 50 ml 50% TFA/CH2C12 i 5 min, derpå 50 ml 50% TFA/CH2C12 i 20 min;

Vaskning: 50 ml CHgCl2 to gange hver i 1 min, fulgt 20 af 50 ml iPrOH i 1 min, derpå 50 ml CH2C12 to gange hver i 1 min;

Neutralisation: 50 ml 5% 01EA/CH2C12 to gange hver i 2,5 min;

Kobling, metode 1: 15,0 mmol af den beskyttede aminosyre og

HOBT (2,3 g) opløstes i 10 ml DMF og 25 fortyndedes så med 30 ml CH2C12. DCC

(3,09 g) opløstes i 10 ml CH2C12, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og omrystedes i 2 - 2,5 time;

Kobling, metode 2: 15,0 mmol af den beskyttede aminosyre 30 hydroxy-succinimidester opløstes i 50 ml CH2C12. NMM (3,3 ml) tilsattes, og blandingen omrystedes med harpiksen i 18 timer.

Harpiksen kobledes i rækkefølge én gang med Boc-Val (metode 1) og én gang med Boc-Bzl^-Asp-OSu (metode 2). Halvdelen af harpiksen (3942-35 137B') udtoges, og den resterende halvdel kobledes én gang med Boca-

Cbze-Lys og én gang med (Cbz)3Arg (begge koblinger ifølge metode 1). Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 60 min. ved 0°C.

DK 171238 B1 19

Harpiksremanensen bratkøledes i Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 10% HOAc (100 ml) i 1 time, filtreredes, og ekstrakten lyofil i seredes, hvilket gav hydrofluoridsaltet som et farvet gummiagtigt stof, 1,09 g.

5 Det rå peptid rensedes på "CM Sephadex"-kolonne (2,6 x 87 cm kolon ne, 0,15 M NH40Ac, ikke-pufferbehandlet, 100 ml/time strømningshastighed, 12 ml/fraktion, 225 nm detektor). Fraktionerne 203-235 forenedes og lyofiliseredes, hvilket gav 880 mg af den ønskede forbindelse.

10 Analyse:

Aminosyre Forhold

Arg 1,01

Pro 0,99

Asp 1,00 15 Val 0,96

Tyr 1,03 56,7% peptidindhold

Tyndtlaqskromatografi: 250 μ, si li kagel G

20

Eluent R^.

1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H2O:Et0Ac 0,19 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,34 25 5:1:3:5 Et0Ac:H0Ac:H20:pyridin 0,27

Eksempel 11

Arginyl-Lysyl-Glutamyl-Valyl-Tryptophan, opløst

Peptidet syntetiseredes under anvendelse af DCC koblingsteknik ud 30 fra følgende udgangsmaterialer:

Kilde Mængde Mol

Boc-tryptophan (CH0)-harpiksester -- 6,0 g 0,003

Boc-valin Bachem 1,96 g 0,009

Boc-glutaminsyre-6-benzylester Bachem 3,04 g 0,009 35 Boc-N€-Z-lysin Bachem 3,42 g 0,009

Boc-N^-tosyl-arginin Bachem 3,86 g 0,009

Oicyklohexylcarbodiimid Chemalog 1,86 g 0,009

Hydroxybenzoetriazol Aldrich 1,22 g 0,009 DK 171238 B1 20

Fastfasemetoden anvendtes:

Harpiksen anbragtes i en omrørt fasefase-reaktionsbeholder og fik lov at kvælde i fire timer. Opløsningsmidlet fjernedes ved filtrering, og remanensen behandledes med 100 ml af følgende opløsningsmidler og 5 reagenser under anvendelse af de angivne tidsrum og cykler. Efter hver behandling fjernedes væsken ved filtrering.

1. CH2CI2 3 x 1 minut - vask 2. 50% TFA/CH2CI2 1 minut - deblokering 10 3. 50% TFA/CH2CI2 30 minutter - deblokering 4. CHgCl^ 3x1 minut - vask 5. 5% N-methylmorpholin/CH2Cl2 1 minut * neutralisering 6. CH2CI2 3 x 1 minut - vask 7. 5% N-methylmorpholin/CHgClg 1 minut - neutralisering 15 8. CHgCl2 3 x 1 minut - vask 9. 5% di isopropyl ethylamin/CHgCl2 0,5 minut - neutralisering 10. CHgCl2 3 x 1 minut - vask 11. 20% DMF/CHgClg 3 x 1 minut - vask 12. Kobling 1,5 til 4,0 timer 20 13. DMF 3 x 1 minut - vask

Peptidbindingen dannedes ved at tilsætte den blokerede aminosyre i 40 ml CHgClg og HOBt i 20 ml DMF og omrøre i 1 minut og derpå tilsætte DCC i 40 ml CHgCl2 og omrøre imellem 1,5 og 4,0 timer. Harpikspeptidet 25 vaskedes med DMF og CHgCl g efter fuldførelse af alle koblinger, og Boc-gruppen fjernedes på sædvanligvis. TFA-saltet vaskedes grundigt med CHgClg» fjernedes fra reaktionsbeholderen og tørredes til en konstant vægt i vakuum, 8,75 g.

Peptidet spaltedes fra harpiksen ved omrøring i flydende HF (med 30 tilsat anisol og tryptophan) i 1 time ved 0°C. HF fjernedes ved formindsket tryk. Det faste stof vaskedes med ether, og pepidet ekstraheredes fra harpiksen med 25% HOAc/HgO. Dette materiale lyofili seredes, hvilket gav 3,60 g af det rå produkt, hvor formylgruppen stadig sad på tryptophan. Materialet deformyleredes ved omrøring i 1,0 M NH^HCO^, pH 9,0 35 (100 ml) i 24 timer. Det rå materiale lyofiliseredes og kromatografere- des på en "Sephadex SP-C-25"-kolonne (2,6 x 90 cm). Eluering med 0,1M NH^OAc, pH 5,38, gav efter forening af de passende fraktioner og lyofi-1 i sering 2,10 g produkt (ca. 96% rent).

DK 171238 B1 21

Dette materiale rensedes på en "Whatman ODS-3 NPLC"-kolonne og elueredes med 0,01M NH^OAc, 12% CH^CN, pH 5,00, hvilket efter forening af de passende fraktioner gav 0,90 g rent produkt.

5 TLC: Rf (opløsningsmiddelsystem)

Rfj 0,15 (Bu0H:H0Ac:H20 3:1:1)

Rf2 0,28 (BuOH:HOAc:H20:EtOAc 1:1:1:1)

Rf3 0,09 (CHCl3:MeOH:NH4OH 12:9:4) 10 Aminosyreanalyse:

Arg, 0,99; Lys, 0,98; Glu, 0,97; Val, 1,05; Trp, 0,96 Procent sammensætning = 88,4% peptid 15 Eksempel 12

Arginyl-Lysyl-Glutamyl-Valyl-Tryptophan-amid, opløst

Forbindelsen syntetiseredes ved hjælp af fastfase-metoden ud fra harpikspeptidet Val-Trp-NH-benzylhydryl-amin-harpiks.

20 Aminosyre Mængde Mmol Kilde Parti Nr.

Boc-y-benzyl-Glu 2,23 g 16,50 Bachem R5785

Na-Boc-Ne-CBZ-Lys 6,29 g 16,50 Bachem R5268

Na-CBZ-N'r,ÅdiCBZ-Arg 9,53 g 16,50 Bachem R5931 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Efter koblingen af Nft-Boc-Nc-CBZ-Lys acetyleredes harpikspeptidet 2 med 5% eddikesyreanhydrid i CH2C12 (100 ml) med 100 mg 4-dimethylamino- 3 pyridin.

4

Udbyttet af harpikspeptid var 15,3 g. 9,0 g af harpikspeptidet af- 5 beskyttedes og fjernedes fra harpiksen ved spaltning med HF (80 ml) 6 under anvendelse af anisol (9 ml) som bortfjernelsesmiddel. Opløsnings 7 midlerne fjernedes ved formindsket tryk, og remanensen tri tureredes med 8 diethylether. De faste stoffer opsamledes ved filtrering og ekstrahere- 9 des med 5% eddikesyre i vand (4 x 50 ml). Ekstrakterne forenedes og lyo- 10 filiseredes, hvilket gav 1,4 g af det rå produkt.

11

Det rå produkt opløstes i 250 ml 1,0 M NH4HC03, og pH-værdien ind stilledes til 9,5. Denne opløsning henstod i 24 timer ved stuetemperatur og lyofili seredes så, hvilket gav 1,2 g af det rå produkt.

Det rå peptid kromatograferedes på "Sephadex C-25" (2,6 x 90 cm) DK 171238 B1 22 ved eluering med 0,3 M NH^OAc, pH 6,0, ved en strømningshastighed på 150 ml/time og opsamling af 20 ml fraktioner. Fraktionsglas 90 til 110 viste sig ved HPLC at indeholde det rene produkt og forenedes og lyofilisere-des, hvilket gav 450 mg af den ønskede forbindelse.

5 Analytiske data: TLC på si li kagel 6F 250 μ

Opløsningsmiddel system R^.

10 n-butanol/eddikesyre/vand (1:1:1) 0,13 n-butanol/eddikesyre/vand/ethylacetat (1:1:1:1) 0,10

Renhed ifølge HPLC 99,1% 15 Aminosyreanalyse Beregnet Fundet

Arg 1,0 1,02

Lys 1,0 0,96

Glu 1,0 0,99

Val 1,0 1,04 20 Trp 1,0 0,94 82,1% peptid

Optisk rotation [ot]D = -20,7° (C = 0,997 i 0,1 M HOAc) 25

Eksempel 13

Arqinyl-Lysyl-Aspartyl-Valyl-Tryptophanamid, opløst

Forbindelsen syntetiseredes ved fastfase-metoden ud fra benz-hydrylamin-harpiks med et substitutionsniveau på 0,68 mækv/g.

30 Vaskningssekvensen var som følger: Mængde x Gentagelser Tid 1) CH2C12 100 x 3 2 min 2) 50% TFA/CH2C12 100 x 1 2 min 35 3) 50% TFA/CH2C12 100 x 1 20 min 4) CH2C12 100 x 3 2 min 5) 33% (CH3)2CH0H/CH2C12 100 x 3 2 min 6) CHgCl2 100 x 3 2 min DK 171238 B1 23 7) 6,5% di isopropyl ethyl ami n/^Cl 2 100 x 1 4 min 8) CH2C12 100 x 3 2 min 9) som i 7) 100 x 1 4 min 10) CH2C12 100 x 3 2 min 5 11) Koblingstrin 12) Dimethyl formamid 100 x 1 2 min 13) CH2C12 100 x 3 2 min

Alle koblinger foretoges med ækvimolære mængder af den beskyttede 10 aminosyre, dicyklohexylcarbodi imid og hydroxybenzoetriazol. Dimethyl-formamid (20 ml) og methylenchlorid (60 ml) anvendtes som opløsningsmidler ved koblingerne.

Aminosyre Mængde Mmol Kilde Parti Nr.

15 Boc-Trp(CHO) 10,97 g 33,00 Peninsula 000613

Boc-valin 7,17 g 33,00 Bachem R4544

Boc-Ø-benzyl-Asp 5,32 g 16,50 Bachem R5291

Na-Boc-Nc-CBZ-Lys 6,20 g 16,50 Bachem R5268

Na-CBZ-N^diCBZ-Arg 9,53 g 16,50 Bachem R5931 20 1. Harpikspeptidet deltes i to halvdele efter afbeskyttelse og neutralisation af valin-resten.

2. Efter koblingen af Na-CBZ-N^’^-diCBZ-Arg acetyleredes harpikspeptidet med 5% eddikesyreanhydrid i CH2C12 (100 ml) med 100 mg 4- 25 dimethylaminopyridin.

Harpikspeptidudbyttet var 15,7 g. 7,0 g af harpikspeptidet afbe-skyttedes og fjernedes fra harpiksen ved spaltning med HF (60 ml) under anvendelse af anisol (5 ml) som bortfjernelsesmiddel. Opløsningsmidlerne fjernedes ved formindsket tryk, og remanensen tritureredes med diethyl -30 ether. De faste stoffer opsamledes ved filtrering og ekstraheredes med 5% eddikesyre i vand (5 x 20 ml). Ekstrakterne forenedes og lyofilisere-des, hvilket gav 1,2 g af det rå produkt.

Det rå materiale opløstes i 250 ml 1,0 M NH^HCO^, og pH-værdien indstilledes til 9,5. Denne opløsning henstod i 24 timer ved stuetempe-35 ratur og lyofil i seredes så, hvilket gav 1,2 g af det rå produkt.

Det rå peptid kromatograferedes på "Sephadex C-25" (2,6 x 90 cm) ved eluering med 0,3 M NH^OAc, pH 6,0, under anvendelse af en strømningshastighed på 150 ml/time og opsamling af 20 ml fraktioner. Frak DK 171238 B1 24 tionsglas 197 til 221 indeholdt det rene produkt ifølge HPLC-analyse og forenedes og lyofili seredes, hvilket gav 450 mg af den ønskede forbindelse.

Analytiske data: 5 TLC på silikagel GF 250 μ

Opløsningsmiddel system R^.

n-butanol/eddikesyre/vand (1:1:1) 0,13 10 n-butanol/eddikesyre/vand/ethylacetat (1:1:1:1) 0,10

Aminosyreanalyse Beregnet Fundet

Arg 1,0 1,00

Lys 1,0 0,97 15 Asp 1,0 0,98

Val 1,0 1,06

Trp 1,0 0,96 75,1% peptid 20

Optisk rotation [a]D = -35,6° (C = 1,002 i 0,1 M HOAc)

Eksempel 14

Ntt-Acetyl-Arginyl-3,4-deihydro-Prolyl-Aspartyl-Valyl-Tyrosinamid 25 A. B0C-3,4-dehydro-Prolin 3,4-dehydro-Pro (200 mg, 1,76 mmol) opløstes i dioxan/l^O (8 ml, 2:1). Til denne opløsning sattes 1 N NaOH (1,8 ml) og di-tButyldicar-bonat (436 mg, 2 mmol) under omrøring ved 0°C. Blandingen omrørtes så ved stuetemperatur natten over. Dioxan fjernedes, og til den resterende 30 vandfase sattes ethylacetat (20 ml). Blandingen afkøledes i et isbad, forsyredes til pH 2,0 med 0,5 N HC1 og overførtes til skilletragt. Det organiske lag separeredes, og det vandige lag ekstraheredes to gange med EtOAc (2 x 20 ml). De forenede organiske faser tørredes over NagSO^ og filtreredes. Opløsningsmidlet fjernedes, og remanensen tørredes og an-35 vendtes uden yderligere rensning.

^HNMR af prøven (CDCl^, Ar nr. 5030-83) antydede et 1,45 ppm indhold af BOC-gruppen.

DK 171238 B1 25 B. Ntt-Acety1-Arginyl-3,4-dehydro-Prolyl-Aspartyl-Valyl -Tyrosinamid Peptidet syntetiseredes på en (p-methyl)benzhydryl-amin-harpiks (2 g harpiks, substitutionsniveau: 0,25 mmol NH2 pr. g harpiks) ved fastfase-metoden. Inkorporering af B0C-Tyr(Bzl)-0H, Boc-Val, BOC-3,4-5 dehydro-Pro og Aoc-Arg(Tos)-OH udførtes via DCC-kobling. Koblingen overvågedes ved hjælp af kvalitativ ninhydrin-test. Acetyleringen af arginin udførtes med 50% eddikesyreanhydrid/pyridin (15 ml) og DMAP (15 mg). Peptidyl-harpiksen vaskedes så grundigt med DMF og C^Clg og tørredes. Den tørrede peptidylharpiks (2 g) spaltedes med HF/anisol (20 10 ml, 9:1) ved 0°C i 1 time. Peptidharpiks-blandingen vaskedes med ether (3 x 20 ml), og peptidet ekstraheredes med 5% H0Ac/H20 (200 ml). Efter lyofilisering rensedes peptidet på en "Sephadex $PC-25"-kolonne (50 x 0,9 cm) ækvilibreret med 0,02 M NH^OAc, pH 4,6. Strømningshastigheden var 80 ml/time, og 12 ml fraktioner opsamledes. Produktet elueredes 15 imellem glas 22-39, og disse fraktioner forenedes og lyofiliseredes.

Det lyofili serede materiale rensedes atter på "Sephadex SPC-25"-kolonne (60 cm x 2,5 cm) ækvilibreret med 0,02 M NH^OAc, pH 4,5 - 6,8, under de ovenfor beskrevne betingelser. Peptidet elueredes imellem glas 55-75, hvilke fraktioner forenedes og lyofiliseredes, hvilket gav 80 mg 20 af produktet.

Rf 0,45 (n-Bu0H/H0Ac/H20/Pyr = 15:3:12:10, silikagel F60)

Rf 0,27 (n-Bu0H/H0Ac/H20 - 3:1:1, sil kagel F60)

Aminosyreanalyse: 25 Asp, 1,04; Val, 1,00; Tyr, 0,85; Arg, 0,96; 3,4-dehydro-Pro, 1,08 Peptidindhold: 72%; hygroskopisk materiale HPLC: "Whatman Partisil - 0DS"-kolonne 10% CH3CN/0,02 M NH40Ac; pH 4,6 30 Strømningshastighed: 2 ml/min

Peptidet var 99,7% rent og havde en retentionstid på 14,3 min.

Eksempel 15 Cyklisk GMP-prøve 35 Ved denne prøve måles testpeptidets evne til at bindes til den intakte CEM-celles cellemembranreceptor og selektivt at stimulere produktionen af cyklisk GMP i lighed med thymopoietin.

CEM-cellelinien opnåedes fra the American Type Culture Collection DK 171238 B1 26 og dyrkedes i RPMI-1640 medium, der var suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt hornkvægserum, 10% varmeinaktiveret hesteserum, 2mM L-glut-amin og 50 g/ml gentamycin, ved 37°C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% C02 til en slutkoncentration på 3-4 x 10® celler/ml. Ved denne kon-5 centration befandt cellerne sig i den tidlige stationære fase af vækstkurven og skønnedes at være mere end 90% levedygtige ved trypan blå-udelukkelse. Cellerne dyrkedes i fire dage og høstedes. Efter høst vaskedes cellerne tre gange i PBS og resuspenderedes i RPMI-1640 medium i en koncentration på 3,12 x 107 celler/ml. Efter at cellerne var bragt i lige-10 vægt ved 37°C i 30 min, tilsattes forskellige koncentrationer af testpeptiderne i et volumen på 25 μΐ medium til 1 ml celler, idet begyndelseskoncentrationen af den tilsatte testforbindelse udvalgtes til opnåelse af den ønskede slutkoncentration af testpeptid i mediet. Testpeptidet blandedes straks med cellesuspensionen. Inkubationen fandt sted i et ry-15 ste-vandbad ved 37°C i 4-5 min og afsluttedes så ved tilsætning af iskold trichloreddikesyre (10%, 1 ml).

Cellerne i TCA homogeniseredes og lydbehandledes så til frigørelse af cyklisk nukleotid. Den resulterende suspension centrifugeredes ved 3000 g i 20 min ved 4°C, og det resulterende bundfald opløstes i 0,1 N 20 NaOH og lydbehandledes i yderligere 30 min, hvorefter proteinindholdet bestemtes ved en fremgangsmåde ifølge Cadman, et al., Anal. Biochem., 96, 21-23 (1979). TCA fjernedes fra supernatant-fraktionen ved fire gange ekstraktion med 5 ml vandmættet diethylether. Efter sidste ekstraktion fjernedes de resterende spor af ether fra supernatant-fraktio-25 nen ved opvarmning deraf i 10 min i et 50°C varmt vandbad. Efter lyofi-1 i sering af den ekstraherede supernatant-fraktion rekonstitueredes den i 50 mM acetatpuffer, pH 6,2, til radioimmuntest for cykliske nukleotider under anvendelse af prøvesættet "NEX-133" fra New England Nuclear,

Boston, MA 02113.

30 Der udførtes en konventionel radioimmun-konkurrencetest imod radio aktivt mærket cyklisk GMP til bestemmelse af den mængde cyklisk GMP, der induceres ved hver koncentration af testpeptid. Resultaterne framgår af fig. 1 og af den følgende tabel, hvor repræsentative eksempler på de omhandlede peptider er testet i sammenligning med thymopentin (betegnet 35 "TP-5") samt et "meningsløst" peptid H-ASP-ARG-TYR-LYS-VAL-OH. Disse resultater påviser de omhandlede peptiders overlegne styrke i sammenligning med thymopentin og indikerer også specificiteten for prøven med hensyn til peptider med thymopentin-1ignende aktivitet.

DK 171238 B1 27

Tabel 1

Koncentration af fremstillet c-GMP (picomol/ntl)

Peptid Koncentration af peptid 5 tøg/ml) 10° 101 102 103 104 105 H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH (TP-5) 0 4,5 9 12 14 -- cr-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH 7 15 ........

10 a-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH 0 14 ........

H-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH 0 12 ........

H-ARG-LYS-ASP-VAL-HIS-OH 0 9.......- H-ARG-LYS-ASP-VAL-PHE-OH 6 9 -- -- -- -- H-ASP-ARG-TYR-LYS-VAL-OH .....-000 15

Andre repræsentative eksempler på forbindelser, der udviser overlegne resultater ved denne prøve, var: H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH, Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-NH2, N-a-acetyl -ARG-AIB-ASP-VAL-PHE-NH^, H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-Nl·^ og N-a-acetyl-20 ARG-3,4-dehydro-PR0-ASP-VAL-TYR-NH2.

Eksempel 16 Receptorprøve

Ved denne prøve måles testpeptidets evne til at konkurrere med 25 mærket thymopoietin med hensyn til binding til det isolerede thymopoietin-celleoverflade-receptorprotein fra CEM-celler.

Materialer - CEM-cellelinier opnåedes fra the American Type Culture Collection. 3-nitro-2-pyridin-sulfonylchlorid og 2-pyridinethiol 1-oxid tilvejebragtes af Dr. Rei Matsueda, Sanyo Laboratories, Tokyo. RPM1-30 1640, føtalt hornkvægserum og L-glutamin opnåedes fra Gibco, gentamycin fra Schering, og lectin-bundne agarosekorn fra Vector Laboratories.

Sephadex erhvervedes fra Pharmacia Fine Chemicals og humant IgG fra Miles Laboratories. Alle andre kemikalier erhvervedes fra almindelige kommercielle kilder og var af reagensrenhed. Kanin-antithymopoietin-an-35 tistof og ubiquitin fremstilledes ved kendte teknikker.

De anvendte forkortelser er: PBS, phosphat-pufferholdigt saltvand; TCA, trichloreddikesyre; SDS, natriumdodecyl sul fat; Con A, concanavilin A; TP, thymopoietin; PEG, polyethylenglycol; BSA, hornkvægserumalbumin; DK 171238 B1 28 I.P., intraperitoneal; PMSF, phenylmethyl sulfonylfluorid; FTS, faktor thymin serique; CRF, corticotropin-frigørende faktor; ACTH, adrenocorti-cotropisk hormon; Hepes, N-2-hydroxyethylpiperazin N-2-ethan-sulfonsyre.

Fremstilling af membran-glycoprotein - CEM-humane lymfoide 5 cellelinier dyrkedes i RPMI-1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt hornkvægserum, 2 mM L-glutamin og 50 Mg/ml gentamycin ved 37°C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO- til en slutkoncentration på 3-4 g t x 10 celler/ml. Ved denne koncentration befandt cellerne sig i den tidlige stationære fase på vækstkurven og skønnedes at være mere end 90% 10 levedygtige ved trypan blå-udelukkelse.

Membranglycoproteiner fremstilledes ved en modifikation af teknikken ifølge Hedo et al., Biochem, 20, 3385-3393 (1981). Cellerne vaskedes én gang med PBS og suspenderedes i 40% saccharose, 50 mM Hepes, 1% EDTA, 0,1% 0-phenanthrolin og 1 mM PMSF (i metha nol), pH 7,8, og homogenise-15 redes i et glas-homogeniseringsapparat ved stuetemperatur. Den samlede suspension underkastedes derpå lydbehandling ved hjælp af en celle-sprængnings-sonicator med en tragtanordning (model W-225R) ved 35°C i 10 min. Suspensionen centrifugeredes ved 600 x g i 10 min ved 4°C i en "Sorval GLC-3"-centrifuge, og supernatanten recentri fugeredes ved 20.000 20 x g i en "Sorval 5B"-centri fuge ved 4°C i 3 min. Den rå membranfraktion opnået fra denne pellet suspenderedes i 50 nM Hepes, 10 nM MgS04 og 1 mM PMSF, pH 7,8, med en slut-proteinkoncentration på 5 mg/ml. Opløsning af proteinet udførtes ved omrøring af suspensionen i 2 timer ved 25°C i nærværelse af 1% "Triton X-100" (slutkoncentration) og 0,1% "brij-96" 25 (polyoxyethylen 10, oleylether) (slutkoncentration). Suspensionen centrifugeredes ved 200.000 x g i 2 timer ved 4°C, og supernatanten opbevaredes ved -70°C. Koncentrationen af opløseligt protein måltes i overensstemmelse med teknikken ifølge Cadman et al. under anvendelse af BSA som standard med puffer som kontrol.

30 Hvedespire-agglutinin eller ricinus communis agglutinin-I anvendtes til rensning af receptor-proteinet. Alle lectinkorn opbevaredes ved 4°C med deres tilsvarende monosaccharid-inhibitorer (300 mM).

Til hver rensning pakkedes 2 ml lectin-agarose i en kolonne med en diameter på 1 cm og vaskedes ved stuetemperatur med 25 ml 0,15 M NaCl, 35 50 mM Hepes, 0,1% "Triton X-l" og 0,01% SDS, pH 7,8.

Kolonnerne vaskedes med 200 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Hepes og 0,1% "Triton X-100", pH 7,8, efterfulgt af en slutvask med denne puffer indeholdende 10 mM MgSO^. PMSF (1 mM) sattes til alle puffersystemer. Oplø- DK 171238 B1 29 ste membranproteiner (ca. 10 mg) recirkuleredes fem gange igennem de enkelte kolonner. Kolonnen vaskedes derpå med 100 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Hepes, 10 mM MgSO^ og 0,1% "Triton X-100", pH 7,8, ved 4°C. Monosaccha-rid-inhibitorer ved en koncentration på 400 mM i 3 ml vaskepuffer an-5 vendtes til de individuelle kolonneelueringer; N-acetylglucosamin til hvedespireagglutinin og /J-methyl-D-galactosid til ricinus communis ag-glutinin-I. Monosacchariderne indførtes på kolonnen, som stoppedes i 30-40 min for at tillade ligevægt, og dernæst elueredes yderligere. Pro-teineluatet dialyseredes imod 500 ml 50 mM Hepes, 10 mM MgSO^ og 0,1% 10 "Triton X-100", pH 7,8, ved 4°C.

Fremstilling af radioaktivt-mærket thymopoietin - Thymopoietin opløstes i 0,2 M natriumcarbonat-bicarbonat-puffer, pH 9,8, til opnåelse af reaktive aminogrupper. 3-nitro-2-pyridin-sulfonylchlorid i dioxan (10:1 mol) sattes til thymopoietin-opløsningen, og opløsningen omrørtes 15 i 5 timer ved 20°C. Efter tilsætning af vand fracentrifugeredes uopløseligt materiale. Det beskyttede peptid rensedes under anvendelse af "Sephadex G-25"-kromatografi efterfulgt af digestion med post-prolin spaltningsenzym til fjernelse af ΝΗ,-terminalblokeret prolin. Methyl-125 ^ 3,5-di[ I]iodhydroxybenzimidat (4000 Ci/mM) opnåedes i en koncentra-20 tion på 5,5 mCi/ml i methanol og inddampedes til tørhed. Den ioderede imidoester (1,4 nM) omsattes med beskyttet thymopoietin (5/xg, 0,9 nM) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Wood, et al., Anal. Biochem., 69, 339-349 (1975), med følgende modifikationer. Omsætningen udførtes i 500 μΐ 0,16 M boratpuffer, pH 9,1, i 24 timer ved 4°C. Omsætningen 25 standsedes ved tilsætning af 500 μΐ 2 M citratphosphat-puffer, pH 5,5, ved 4°C. Prøven kromatograferedes på en "Biogel P-10"-kolonne under anvendelse af natriumpyrophosphat, pH 7,5 (15 dråber/fraktion), ved 4°C til fraseparering af frit iod.

Det ioderede peptid opløstes i vand og behandledes med 2-pyridin-30 thiol 1-oxid (10:1 mol) i 5 timer ved stuetemperatur til fjernelse af beskyttende grupper. Det afbeskyttende mærkede peptid rensedes på en "Biogel P-10"-kolonne. Tre radioaktive toppe opnåedes, hvoraf de to første var immunoaktive over for kanin-antithymo poietin-antistof. Den første top indførtes så på en 1 x 60 cm kolonne af "DEAE-Sephadex A-25", 35 der var blevet ækvilibreret med 50 nM Tris buffer, pH 7,0. Ioderings-blandingen elueredes med denne puffer under anvendelse af en linær gradient af stigende ionstyrke fra ækvilibreringskoncentrationen op til 1,0 M. Radioaktiviteten af hver fraktion bestemtes under anvendelse af et DK 171238 B1 30 "LKB 1280 Ultra gamma"-spektrometer.

Fraktioner med radioaktivitetstoppe fra hvert rensningsskema analyseredes med hensyn til binding med overskud af antithymopoietin-antistof. Fraktioner fra top II (fraktionerne 35-45) fra "DEAE-Sephadex 5 A-25"-kolonnen udviste den højeste specifikke binding og anvendtes derefter i radioreceptor-prøven.

Ioderet thymopoietin bibeholdt biologisk aktivitet som bestemt ved testning af dets effekt ved en neuromuskular prøve (Goldstein, Nature, 247, 11-14 (1974)) og dets effekt på syntese af cyklisk GMP med CEM-10 celler.

Bindinqstest - Testpufferen fremstilledes ved at sætte 12 g Hepes, 1,2 g MgSO^ og 1,2 g BSA til 1000 ml glasdestilleret vand. Der opnåedes et pH på 7,65 ved anvendelse af 1 N NaOH. Forråds-standardopløsningen fremstilledes under anvendelse af testpuffer og benyttedes i én uge.

15 Testen udførtes i 12 x 75 mm reagensglas ved tilsætning af 100 μΐ l ?5

standard-opløsning, 25 μΐ receptorprotein (150-200 Mg/ml), 25 μΐ I-TP

(80.000 cpm), 20 μΐ 1% "Triton X-100", og voluminet indstilledes til 200 /il med testpuffer. Efter inkubering i 18 timer ved 4°C tilsattes 200 μΐ

humant IgG (1,5 mg/ml) (som bærer) og 200 μΐ 35% PEG-8000 i PBS, pH

20 7,56, efterfulgt af blanding og inkubering i 30 min på is. Glassene centrifugeredes, og remanensen vaskedes med 10% PEG i PBS, pH 7,3, og taltes i en "LKB-gamma"-tæller.

Radioaktiviteten i bundfaldet i nærværelse af 1 mg/ml ikke- radioaktivt thymopoietin valgtes som repræsentant for ikke-specifik 25 binding. TCA såttes til supernatanten (siutkoncentration 5%), og udfældet i radioaktivitet måltes. I alle tilfælde oversteg denne 5%, 125 hvilket indikerer minimal frigørelse af frit I fra sporstoffet.

Konkurrenceforsøg - Efter ovennævnte bindingstest-procedure inkuberedes 2,3 x ΙΟ"1^3 M 125I-TP med 4 μg receptorprotein og testpeptid sam-30 men med samme koncentration af thymopoietinet 37-45 nonapeptid (H-VAL- GLU-LEU-TYR-LEU-GLN-SER-LEU-TNR-OH). Inkuberingen fortsattes i 12 timer, 125 hvorefter frit og bundet I-TP bestemtes som ovenfor. Nonapeptidet anvendes til blokering af nabo-receptorsteder på receptorproteinet. Hvis disse nabo-receptorsteder ikke blokeres, kan noget mærket TP binde til 35 receptorproteinet via dette sted, selv om thymopentin-receptorstedet er blokeret af testpeptidet. En sådan binding er ubeslægtet med testpepti-dets aktivitet og ville (uden blokering med TP 37-45 nonapeptidet) give unøjagtige resultater.

Claims (13)

1. Thymopentin- eller spleninanalogt peptid med formlen R-V-W-X-Y-Z-R1 25 eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf, hvori R er H, lavere al kyl, formyl eller lavere alkanoyl, V er ARG eller D-ARG, W er LYS, D-LYS, PRO, dehydro PRO eller AIB, 30. er ASP, D-ASP, GLU eller D-GLU, Y er VAL, LYS, LEU, ILE, GLU, ALA, GLN, D-VAL, D-LYS, D-LEU, D-ILE, D-GLU, D-ALA og D-GLN, Z er PHE, HIS, TRP, D-PHE, D-HIS eller D-TRP, R* er OH eller NR^R^ og 2 3 35. og R indbyrdes uafhængigt er H eller lavere alkyl, under forudsætning af, at Z er forskellig fra PHE, når W er LYS, X er D-ASP, GLU eller D-GLU, og Y er VAL. DK 171238 B1

2. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT Z er PHE, HIS, D-PHE eller D-HIS.

3. Peptid ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT W er PRO.

4. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT R er hydrogen eller 5 lavere al kyl, V er ARG, X er ASP og Z er PHE eller HIS.

5. Peptid ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, AT W er PRO.

5 H-ARG-LYS-ASP-VAL-PHE-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH, N-tt-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH, N-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH, H-ARG-LYS-ASP-VAL-HIS-OH,

6. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er α-acetyl-ARG- PRO-ASP-VAL-PHE-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

7. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er a-formyl-ARG- PRO-ASP-VAL-PHE-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

8. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er e-(lavere alkanoyl)-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre-15 eller baseadditionssalt deraf.

9. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er H-ARG-PRO-ASP-VAL-PHE-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

10. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er H-ARG-PRO-ASP-20 -VAL-HIS-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

10 H-ARG-LYS-ASP-VAL-TRP-OH og h-arg-lys-asp-val-trp-nh2. Til sammenligning forårsagede andre peptider, såsom insulin, glucagon, væksthormon, somatostatin, ^-endorphin, FTS, ACTH, CRF og 15 ubiquitin, ingen påviselig fortrængning. 20

11. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er H-ARG-LYS-ASP--VAL-HIS-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

12. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT det er H-ARG-LYS-ASP- -VAL-PHE-OH eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt deraf.

13. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, AT det indeholder en effektiv T-celle- eller B-celle-inducerende mængde af et peptid ifølge 30 krav 1 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.