HU205143B - Process for producing peptides having t cell suppressor activity and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Description

A leírás terjedelme: 13 oldal (ezen belül 1 lap ábra)

HU 205143 Β

A találmány tárgya eljárás olyan szintetikus peptidek előállítására, amelyek képesek stimulálni a T sejtek szuppresszor aktivitását Közelebbről a találmány tárgya eljárás olyan tetrapeptidek előállítására, amelyeknek molekulája a thymopoietinen alapszik, és amelyek 5 a karboxil-végen amid helyettesítőt tartalmaznak.

A védettségszabályozó proteinek a thymopoietin és a thysplenin, amelyet korábban spleninnek is neveztek, szarvasmarha és emberi csecsemőmirigyből, valamint lépből kerültek izolálásra. Ezen túlmenően ké- 10 miailag is szintetizáltak kis peptideket melyek utánozzák a thymopoietin biológiai aktivitását és tovább módosították ezeket egyéb tulajdonságok, például az enzimműködéssel szembeni ellenállás elérése érdekében. Lásd példád a 4 505 853 számú amerikai egye- 15 sült államokbeli szabadalmi leírást továbbá a 462 743 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést

Számos, eddig proteinekre és szintetizált peptidekre vonatkozó közlemény és szabadalom jelent meg. A 20 4190 646 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás pentapeptid thymopentint, amely a thymopoietin aktív helye és Arg-Lys-Asp-Val-Tyr szekvenciával rendelkezik, valamint peptid-származékokat ismertet amelyekben a pentapeptid amino- 25 és/vagy karboxi-végződéseit különböző csoportok helyettesítik. Mind a thymopoietin, mind a thymopentin biológiai változásokat indukál két emberi T sejt vonalban, a CEM-ben és a MOLT-4-ben, miáltal a T sejtek biológiai tevékenységét serkenti. Pentapeptideknél (5 30 aminosav, sorrendben) rövidebb egyelen thymopoietin analóg sem bizonydt aktívnak a CEM sejtekre nézve.

A 4 923 964 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy 48 aminosavat tartalmazó, 35 védettségszabályozó proteint, a splenint ismertetjük, amelyet a továbbiakban t hyspleninnek nevezünk, amelyet emberi lépből választottunk el. Szarvasmarha thysplenin in vivő serkentő hatást fejt ki a segítő T sejt tevékenységre egerekben. Az emberi thysplenin ily 40 módon, várakozás szerint analóg biológiai hatást fejt ki emberi szervezetben. A fent említett bejelentésben ismertettük, hogy az emberi thysplenin elősegíti a sejten belüli cGMP emelkedését MOLT-4 emberi T sejt vonalban. A szarvasmarha thysplenin aktív helye, 45 amelyet SP-5-nek neveznek, a 32-től a 36. aminosavmaradékig terjed és az Arg-Lys-Glu-Val-Tyr szekvenciával rendelkezik. A 4 923 964 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás az emberi ArgLys-Ala-Val-Tyr szekvenciája aktív helyet ismerteti. 50

A thysplenin, ellentétben a thymopoietiimel, nem okoz változást a CEM sejtek biológiai tevékenységében. A thysplenin tehát T sejt segítő és a T sejt elnyomó aktivitásban vesz részt. Lásd még például a következő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírá- 55 sokat 4 190 646; 4 261886; 4 361 673; 4 420 424 és 4629723.

A Kisfaludy és munkatársai számára 1984. január 31-én engedélyezett 4 428 938 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom bizonyos védettségszabá- 60 lyozást befolyásoló peptideket tárgyal. Ezek közül a peptidek közül az alábbiak tetrapeptidek;

Arg-Lys-Asp-Val

Arg-Lys-Asn-Val

Arg-Lys-Ala-Val

Arg-Lys-Asp-Ala

Arg-Lys-Asp-De

Arg-Lys-Glu-Val

Glp-Arg-Lys-Asp.

A szabadalom általában ismerteti ezen szekvenciák sóit, amidjait, rövidszénláncú alkil-észtereit és védett származékait, valamint ezen szekvenciák alkalmazását a csecsemőmirigy-elégtelenségek következtében fellépő immunológiai elváltozások kezelésére. A szabadalmi leírás ismerteti a peptidek aktivitásának in vitro körülmények között végzett E rozetta vizsgálatát

A párhuzamos 462 743 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésünkben egy sor thysplenin peptid analógot ismertetünk, amelyek képesek biológiai aktivitást indukálni a MOLT-4 T sejtvonalban. A korábban ismertetett thymopentin analógoktól eltérően a thyspleninnel rokon, 5 aminosavnál rövidebb peptidek, valamint a thysplenin pentapeptid analógjai T sejt segítőaktivitást indukáltak MOLT-4 sejtekben. Néhány ott ismertetett tetrapeptid például;

Arg-Pro-Asp-Val

Arg-Pro-Asp-Val-NH ₂Formil-Arg-Pro-Asp-VaI

Acetil-Arg-Pro-Asp-Val

Acetil-Arg-Pro-Asp-Val-NH ₂

Acetíl-Arg-Pro-Ala-Val-NH ₂

Acetil-Arg-Pro-D-beta-Asp-Val-NH ₂

Acetü-Arg-Pro-Glu-Val-NH ₂

Acetil-ARg-Pro-GIu-Val

Acetil-Arg-Aib-Ala-Val-NH ₂

Acetil-Arg-Aib-Glu-Val-NH ₂

Acetü-Arg-Pro-Asp-Gly-NH ₂.

A MOLT-4 vizsgálatban úgy találtuk, hogy ezek a peptidek a thysplenin hatását utánozzák, de a CEM sejtvonal vizsgálatban a thymopentin aktivitását nem tudják utánozni.

Szükség van tehát olyan további peptidekre, amelyek alkalmazhatók az emberi immunrendszer szupp- $ resszor és segítőaktivitásának stimulálására különböző T sejt hiányos állapotok esetén.

Meglepő módon úgy találtuk, hogy számos tetrapeptid, amelyek a karboxil-végen amid helyettesítőt tartalmaznak, T sejt szuppresszor aktivitással rendelkeznek, ami a thymopentinre jellemző, a CEM sejteken végzett ciklikus GMP vizsgálatokban. Ez a felismerés azért meglepő, mert ugyanezek a tetrapeptidek szabad karboxil-véggel vagy más C-terminális amidcsoportokkal amidálva nem mutatnak ilyen T sejt szuppressszor aktivitást. Korábban azonosítottak már néhán yolyan tetrapeptid szekvenciát (például a 4 428 938 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban), amelyek szabad karboxil-véggel nem mutatnak T sejt szuppresszor aktivitást. Ha azonban azonos amidhelyettesítőket kapcsolunk a C-terminálishoz a találmány értelmében, ezek az inaktív peptidek

HU 205143 Β

T sejt szuppresszor aktivitást nyernek. Ez az aktivitás a korábbi ismeretek alapján nem volt előre várható.

A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletű amidált peptidek előállítására R-Arg-X-Asp-Y-NR ^JR² (I) ahol

R jelentése hidrogénatom, acetil-, formil-, 36 szénatomos alkanoilcsoport,

X jelentése Pro-dehidro-Pro, hydroxil-Pro, D-Lys, vagyLys,

Y jelentése Val,

R¹ jelentése hidrogénatom és

R² jelentése 1-8 szénatomos alkilcsoport, 48 szénatomos gyűrűs alkilcsoport, fenil- vagy naftilcsoport vagy NHR₃, ahol R₃ jelentése fenilcsoport, vagy

R¹ és R² együtt egy 4-7 szénatomos metilénláncot alkot.

Ezek az amidált peptidek és az. ilyen peptideket tartalmazó készítmények meglepő módon a humán thymopentin CEM sejtekre kifejtett biológiai aktivitásával rendelkeznek. Ebből következően tehát ezek a peptidek hasonló in vivő biológiai aktivitást mutatnak emberben. Ezen peptidek legtöbbje fokozottan ellenáll az endo- és exopeptidázok, valamint a tripszinhez hasonló enzimek hatásának az emésztőrendszerben és a szérumban. Ezek a peptidek tehát előnyösen alkalmazhatók az immunhiányok kezelésére.

A találmány tárgya továbbá eljárás olyan készítmények előállítására, amelyek ezeket a peptideket tartalmazzák, és amelyek különböző olyan állapotok és betegségek kezelésére alkalmazhatók, amelyek az immunszabályozást kívánják meg.

Az 1. ábrán egy CEM cGMP vizsgálatban a peptidkoncentráció φ-g/ml) függvényében felvett cGMP szinteket (pikogram/ml) ábrázoltuk, ahol a thymopentin (TP-5) és a találmány szerinti eljárással előállított peptidek aktivitását a kontroliéval vetettük össze.

A találmány tárgya a fentiek alapján eljárás T sejtszuppresszor aktivitással rendelkező (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R, X, Y, R¹ és R² jelentése a fenti.

A leírásban a peptidek aminosavkomponenseit, valamint az ezekhez alkalmazott bizonyos anyagokat rövidítéssel jelöljük. Az aminosavak hárombetűs rövidítéseinek legtöbbje jól ismert. Kevésbé ismert rövidítések a Glp a piroglutamil (szintén p-Glu) és az Aib az amino-ízovajsav esetén. Hacsak másképpen nem jelöljük, az aminosavak L-izomer konfigurációban vannak. Ahol a D-izomer konfiguráció a kívánatos, azt jelöljük.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek közül előnyösek azok, ahol a második aminosav Pro vagy Aib. Azok a C-terminálisan amidhelyettesítőt tartalmazó tetrapeptidek, ahol a második aminosav Pro vagy Aib, fokozottan ellenállnak az emésztő- és szérumenzimek bontó hatásának.

Ilyen előnyös peptidek a következők:

Arg-Pro-Asp-Val-izopropilamid

Arg-Pro-Asp-Val-metilamid

Formil· Arg-Pro-Asp-Val-metilamid.

A találmány szerinti eljárással előállított további előnyös peptidek a következők:

Arg-Lys-Asp-Val-anilinamid

Arg-Lys-Asp-Val-metilamid

Arg-Lys-Asp-Val-2-fenilhidrazid

Arg-Lys-Asp-Val-piperidinamid

Arg-Lys-Asp-Val-ciidohexilamid

Arg-Lys-Asp-Val-izopropilamid.

A találmány szerinti eljárással előállított helyettesített tetrapeptidek meglepő és előre nem várt aktivitása új és előre nem várt tulajdonságokkal rendelkező vegyületeket eredményez, különösen, ha a technika állása szerint ismert vegyületekkel vetjük össze ezeket Tetrapeptid szekvenciák korábbról ismeretesek, például az Arg-Lys-Asp-Val a 4 428 938. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból, felismertük azonban, hogy ezen szekvenciák szelektív amidálása a karboxil-végen olyan vegyületeket eredményez, amelyek T sejt szuppresszor aktivitással rendel· keznek. Felismertük továbbá, hogy néhány fent leírt peptid meglepő és nem várt módon mind T sejt szuppresszor, mind segítőáktivitással rendelkezik a thymopentinhez hasonlóan. Ilyen peptidek például Arg-ProAsp-V al-izopropilamid, formil-Arg-Pro-Asp-V al· metilamid és Arg-Lys-Asp-Val-izopropilamid.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek újak és gyógyszerkészítmények hatóanyagaként alkalmazhatók. A fenti tetrapeptid szekvenciákkal jellemezhető aktív vegyületek előállításához szükséges famidcsoportok kiválasztását az irodalom sehol sem úja le, azt sem írja le, hogy bizonyos, biológiailag inaktív, szabad karboxi-végcsoportot tartalmazó tetrapeptidek a találmány szerinti módon végzett szelektív amidálással biológiailag aktív vegyületekké alakíthatók. Ezenkívül, ha a fenti tetrapeptid szekvenciákat karboxi-végükön amidáljuk, ezek nem mindegyike rendelkezik ilyen, a thymopentinnel analóg T sejt szuppresszor biológiai aktivitással. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a technika állasa szerint ismert tetrapeptidek közül sok, ha amidáljuk, nem képes ilyen T sejt szuppresszor aktivitást kifejteni. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek tehát nem voltak előre várhatók azon általános felismerés alapján, hogy ilyen szekvenciával rendelkező amidok képesek az immunrendszert befolyásolni, illetve a T sejt segítő aktivitást stimulálni. így például a következő peptidek nem mutatják a thymopentinhez hasonló T sejt szuppresszor stimuláló aktivitást:

Arg-Pro-Asp-Val-morfolin-amid

Arg-Lys-Asp-Val-dimetil-amid

Arg-Lys-Asp-Val-2-naftil-amid

Acetil-Arg-Pro-Glu-Val-etíl-amid

Ezek a 4 428 938 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, illetve a 462 743 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetetthez hasonló vagy azzal azonos peptid szekvenciával rendelkeznek.

Az (I) általános képletű peptideket általában ismert eljárásokkal elő lehet állítani. Előnyösen szilárd fázisú

HU 205143 Β szintetikus módszer szerint vagy standard, oldatban végzett szintézis módszerével dolgozunk, szilárd fázisú szintetikus módszert ismertet pl. Menifield a J.A.C.S.S5,2149-2154 (1963) irodalmi helyen. Ez az eljárás jól ismert és gyakori módszer peptidek előállítására. A szilárd fázisú szintézis módszer abban áll, hogy lépésenként védett aminosavakat adunk egy növekvő peptidlánchoz, amely kovalens kötéssel kapcsolódik szilárd gyantarészecskékhez. Ennél az eljárásnál a reagenseket és a melléktermékeket szűréssel távolítjuk el, ily módon kiküszöbölhető az intermedierek tisztítása. Ennek a módszernek az általános koncepciója attól a kövalens kötéstől függ, amellyel a lánc első aminosavját a szilárd polimerhez kapcsoljuk. A következő védett aminosavakat lépésenként blokkokban vagy egyenként adagoljuk mindaddig, míg a kívánt szekvencia össze nem állt. Végül, a védett pepiidet eltávolítjuk a szilárd gyantáról és a védőcsoportokat lehasítjuk.

Az aminosavak bármilyen alkalmas polimer gyantához csatlakoztathatók. A gyantának egy olyan funkciós csoportot kell tartalmaznia, amelyhez az első védett aminosav kövalens kötéssel jól kapcsolható. Különböző polimerek alkalmasak erre a célra, például cellulóz, polivinil-alkohol, polimetil-metakrilát, N-alkil-benzilamin és N-alkil-benzhidril-amin és polisztirol. Az ilyen szintézisben alkalmazható védőcsoportok például a tercier-butil-oxi-karbonil- (BOC), benzil(BZL), tercier-amil-oxi-karbonil- (AOC), tozil(DOS), orto-brőm-fenil-metoxi-kaibonil- (BiZ) és a fenil-metoxi-karbonil-csoportok (Z vagy CBZ). További védőcsoportokat ismertet a fenti irodalmi hely, továbbá a J. F. W. McÖmie „védőcsoportok a szerveskémiában” Plenum Press, New York, 1973.

A találmány értelmében a peptidek előállítását általában úgy végezzük, hogy először a védett C-terminális aminosavat kapcsoljuk a gyantához. A kapcsolás után a gyantát szűrjük, mossuk és a C-terminális aminosav α-aminocsoportján lévő védöcsoportot (célszerűen t-butil-oxi-karbonil-csoport) eltávolítjuk. Ennek a védőcsoportnak az eltávolítása úgy kell, hogy végbemenjen természetesen, hogy ne szakadjon fel a kötés az aminosav és a gyanta között. A kapott gyanta-peptidhez ezután az utolsó előtti C-terminális védett aminosavat kapcsoljuk. Ez a kapcsolat amidkötés kialakulásával jön létre, a második aminosav szabad karboxilcsoportja és a gyantához csatlakozó első aminosav aminocsoportja között. Ezen eljárási lépéseket ismételjük egymás után a következő aminosavakkal mindaddig, míg az összes aminosav nem csatlakozik a gyantához. Végezetül, a védett pepiidet lehasítjuk a gyantáról, és a védőcsoportokat eltávolítjuk a kívánt peptid előállítása érdekében. A peptid gyantától történő léhasítására és a védőcsoportok eltávolítására alkalmazott módszereket az alkalmazott gyantától és védőcsoportoktól függően választjuk meg. Ezek a módszerek a peptid-szintézisben járatos szakemberek számára jól ismertek.

A peptid-szintézis más módszereit úja le Bodanszky és munkatársai „A peptid-szintézis” című művének második kiadásában (John Wiley and Sons, 1976). Például az © általános képletű peptidek standard, oldatban végzett peptid-szintézis módszerekkel is szintetizálhatok, amelyeknek során aminosavakat vagy peptidfragmenseket lépésenkénti vagy blokkkapcsolással kapcsolunk az amidkötés kialakításának kémiai vagy enzimetikus módszerével. Ezek az oldatban végzett szintézises módszerek az irodalomból jól ismertek.

Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított peptidek a fenti amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett humán thymopentinhez hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Ezt a biológiai aktivitást elsősorban a CEM humán T sejtvonal ciklikus GMP termelése indukálásának mérésével igazoljuk.

Az a tény, hogy a találmány szerinti peptidek ciklikus GMP termelését indukálják, azt jelzi, hogy a peptid emberi thymopentin receptorhoz kötődik a sejten, és emberi thymopentinszerű biológiai aktivitást indukál.

A találmány szerinti eljárással előállított tetrapeptidek további jelentős előnyöket mutatnak. A peptidek legtöbbje ellenáll akár az emésztő, akár a szérum enzimekkel szemben. By módon ezek meghosszabbított felezési időt mutatnak élő szervezetben, ha biológiai lénybe, injekció formájában viszik be. A peptidek közül többnek egy további előnye az, hogy orálisan is adagolható.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek védettséget szabályozó tulajdonságai miatt ezek terápiásán hasznosak emberek kezelésénél és valószínűleg állatoknál is, miután képesek a T sejtek differenciálódását és érését indukálni, amelyek a test immunválaszában vehetnek részt. Ennek eredményeképpen a találmány szerinti eljárással előállított peptidek többféle terápiás felhasználásra alkalmasak.

A találmány szerinti eljárással előáUított peptidek hasznosak a test koUektív védettségének támogatásában azzal, hogy elősegítik vagy támogatják a sejtimmunitás terápiás serkentését.

A találmány szerinti eljárással előáUított peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények általában előnyösen alkalmazhatók bármely olyan területen, ahol a sejtes immunitás van érintve, és különösen ott, ahol az immunitás hiányos.

Ezáltal hasznosak krónikus fertőzésekkel együttjáró betegségek kezelésében, például aUergiás reakciók és autoimmun reakciók kezelésében.

A találmány szerinti eljárással előáUított peptidek vagy az olyan gyógyászati kompozíciók, amelyek peptideket vagy ezek savas vagy bázikus sóit tartalmazzák, általában hasznosak minden olyan területen, ahol a sejtimmunitás szerepet játszik és különösen ott, ahol a T sejtek egyensúlyhiánya miatt az antitestképződés túlzott, ezek a peptidek helyesbíteni tudják ezt az állapotot a T sejt szuppresszor funkció serkentésével. íly módon bizonyos autoimmun betegségekben, ahol az antitestek károsodnak, mint például a szisztémikus lupus erythematosus, a rheumás arthritis vagy hasonlók

HU 205 143 Β esetén, terápiásán használhatók.

A legszélesebb körű alkalmazást tekintve a találmány szerinti eljárással előállított peptidek vagy azt tartalmazó gyágyászati termékek hasznosak ember vagy állat immunrendszerének szabályozásához, amennyiben ilyen szabályozás szükséges. A „szabályozás szó azt jelenti, hogy az adott vegyületek azt eredményezik, hogy az immunrendszer egy abnormális fertőzött állapotból visszaáll egy normális kiegyensúlyozott állapotba. Míg ez a szabályozás igen széles körben történhet immunológiai hiányosságok kezelésénél, például a DiGeorge szindrómánál, alkalmazási lehetőség nyílik túlzott immunológiai tevékenység állapotának javítására, például az autoimmun fertőzéseknél is.

Emberi vagy állati immunrendszer szabályozható a találmány szerinti eljárással előállított peptidek, valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények segítségével úgy, hogy az immunrendszer szabályozásához terápiásán hatásos mennyiséget adagolunk ezekből.

A találmány szerinti eljárással elállított peptidek és gyógyszerkészítmények alkalmazhatók továbbá olyan állapotok kezelésére, amelyek az immunrendszer relatív vagy abszolút hiányából adódnak, különösen, ha a T sejt szuppresszor funkcióról van szó. Ilyenkor a kezelendő személynek legalább egy a találmány szerinti eljárással előállított peptid terápiásán hatásos menynyiségét adagoljuk.

A terápiásán hatásos mennyiség az olyan mennyiséget jelenti, amely a fent hivatkozott körülmények között hatékony. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek és gyógyszerkészítmények alkalmazhatók továbbá T sejtek differenciálódásának és érzésének megindításához.

A találmány szerinti eljárással gyógyszerkészítményeket úgy állítunk elő, hogy egy, a találmány szerinti eljárással előállított pepiidet mint aktív hatóanyagot a gyógyszergyártásban szokásos eljárásokkal hordozóval összekeverünk. Ez a hordozó az adagolás módjától, például szájon keresztül, nyelv alatti, végbélen keresztül, orron keresztül vagy parenterálisan történő adagolástól függően választható meg. ·

Az előnyös orális adagoláshoz bármely, az ilyen célra megszokott gyógyászati hordozó alkalmazható. Orális folyékony készítményekhez, például szuszpenziókhoz, elixírekhez és oldatokhoz használhatunk például vizet, olajokat alkoholokat tartalmazó hordozóközeget, a készítmény tartalmazhat továbbá ízesítőszereket, tartósítószereket, színezőanyagokat és hasonlókat. A hordozók lehetnek keményítőfélék, cukrok, hígítók, granulálószerek, csősztatóanyagok, kötőanyagok, dezintegrálószerek és hasonlók az orális sziláid gyógyszerekhez, például porokhoz, kapszulákhoz, tablettáihoz. Szabályozott hatóanyag-leadási formák szintén készíthetők. A könnyű adagolhatóság miatt a tabletták és kapszulák jelentik a legelőnyösebb orális adagolási formát, és ebben az esetben nyilvánvalóan szilárd gyógyászati hordozóanyagokat használunk. Kívánt esetben a tablettákat cukorbevonattal vagy más emészthető bevonattal lehet ellátni a megszokott eljárásokkal.

Parenterális termékekhez a hordozó általában tartalmaz steril vizet, jóllehet más komponensek, például oldást segítő anyagok vagy tartósítószerek is használatosak. Injekcióval bevihető szuszpenziók is készíthetők, amelyekbe megfelelő folyadékhordozókat, szuszpendálószereket és hasonlókat lehet alkalmazni.

A találmány szerinti peptidek általában akkor hatásosak, ha 1 gg/kg testtömeg, célszerűen 0,01-10 mg/kg testtömeg dózisban alkalmazzuk. Általában ilyen dóziban alkalmazzuk immunhiányos betegségek vagy állatok kezelésére. Nagyobb mennyiségek, például 10100 mg/kg testtömeg hasznos a fölös immunaktivitás elnyomására.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. A példákban a rész kifejezés tömegrészt jelent, hacsak másként nem jelöljük. A példákban a következő rövidítések szerepelnek:

TFA trifluor-ecetsav

HOAc ecetsav

CH₂C1₂ metilén-klorid

CH₃CN acetonitril

DMF dimetil-formamid

NH₄OAc ammónium-acetát n-BuOH normál butanol pyr piridin • DCC diciklohexil-karbodiimid

HOBt 1-hidroxi-benzotriazol

DMAP dimetilaminö-piridin

TCA triklór-ecetsav

MeOH metilalkohol

TLC vékonyrétegkromatográfia

THF tetrahidrofurán

EtOAc etilacetát

NaHCO₃ nátrium-hidrogén-karbonát

MgSO₄ magnézium-szulfát

NMM N-metil-formamid

EtDO dietil-éter

HPLC nagysebességű folyadékkromatográfia

Pd/C szénhordozós palládium

DBA diizopropil-etil-amin iBuOCOCl izobutil-kloroformát iPr₂O diizopropil-éter ON para-nitro-fenil-észter RPMI szövettenyésztő tápközeg PBS foszfáttal pufferolt sóoldat

1. példa

Arg-Pro-Asp-Val-izopropilamid szintézise ml CH₂Cl₂-ben feloldunk 2,25 g BOC-Pro(Bzl) Asp-Val-t. Az oldatot jeges vízfürdőben lehűtjük, és hozzáadunk 0,67 g MOBt-t és 0,90 g DCC-t 4 .ml DMF-ben feloldva. Az oldatot 10 percig keverjük, majd hozzáadunk 0,30 g izopropil-amint 5 ml CH₂Cl₂-ben. Az elegyet jeges fürdőn 15 percig keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Három óra múlva a csapadékot leszűrjük. A szűrletet 10 térf%-os citromsavval, vízzel és telített nátrium5

HU 205 143 Β karbonát-oldattal extraháljuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. így 2,32 g piszkosfehér színű szilárd terméket kapunk, amelyet EtOAc-iPr₂O-ból átkristályosítunk, így 1,64 g terméket kapunk, op.: 179,5-181,5 ’C.

0,84 g fenti termékhez hozzáadunk 50 ml 40% TFÁ-t tartalmazó CH₂Cl₂-t. Az oldatot 30 percig keveqük, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékhoz étert adunk, így szilárd Pro(Bzl) Asp-Val-izopropil-amid-triflnor-acetátot kapunk.

ml DMF-ben feloldunk 0,93 g BOC-arginint Az oldatot -20 ’C-ra hűtjük, és hozzáadunk 0,18 ml NMM-t, majd 0,22 g iBuOCOCl-t az elegyet -15 ’Con 20 percig keveq'ük, majd hozzáadunk 0,18 ml nMM-t és a fenti trifluor-acetát-ső 10 ml DMF-vel készült hűtött oldatát Az oldatot 30 percig hűtőfürdón tartjuk, majd további 2 óra hosszat hűtés nélkül keveqük. Az oldószer nagy részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékhoz etil-acetátot és vizet asdunk. A fázisokat elválasztjuk, és a szerves fázist citromsav-oldattal, majd kétszer telített nátrium-hidrogén-kaibonát-oldatíal extraháljuk. Az oldószer eltávolítása után 1,44 g színtelen üvegszerű terméket kapunk. A terméket gyors kromatográfiával szilikagél 60-on tisztítjuk, 98:2 térfogatarányű diklőr-metán/metanol eleggyel eluálva. Az először eluálódó komponens a kívánt termék, a tiszta frakció mennyisége 0,53 g, egy másik, csekély szennyezést tartalmazó frakció mennyisége 0,32 g.

0,53 g tisztított, védett tetrapeptid-amidot 1 ml hangyasav és 20 ml metanol elegyével szénhordozós palládiumon hidrogénezünk. Egy óra múlva az elegyet Celite alkalmazásával leszűrjük, és vízzel mossuk. A metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, A maradékot vízzel hígítjuk, és lifolizáljuk, így 280 mg terméket kapunk. A terméket SP-Sephadex tölteten kromatografáljuk, 0,30 mől/l-es ámmónium-acetáttal eluálva (pH= 5). A fő csúcs középső részét tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, így 190 mg amorf, szilárd, cím szerinti terméket kapunk.

Aminosavanalxzis: Asp 1,01; Pro, 1,03; Val 0,97, Arg 1,00,96% peptid.

Vékonyréteg kromatográfia (szilikagél 60)

Rf(I)=0,44(n-BuOH:HOAc:H₂O-Pyr/15:3:12:10)

R^II)=0,65 (EtOAc:PyrHOAc:H₂O/5:5:l:3)

R_fC0I)=0,16(n-BuOH:HOAc:H₂O/3:l:l)

2. példa

Arg-Lys-Asp-Val-ciklohexil-amid szintézise

1,09 g (2,00 mmól) BOC-(Bzl)Asp-Val-ONp és 0,27 ml (1,2 ekvivalens) ciklohexil-amin 10 THF-vel készült oldatához hozzáadunk 0,27 g HOBt-L A kapott sárga oldatot 24 óra hosszat keveq'ük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott olajat etil-acetáttal hígítjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel, 10%-os citromsavval és telített sóoldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton megszárítjuk, lesztűjük, és bepároljuk, így a védett dipeptíd-amidot kapjuk.

ml 4,2 mól/l-es sósavas dioxán-oldathoz keverés közben hozzáadunk 0,71 g (1,4 mmól) védett dipeptidet 60 perc múlva a reakcióelegyet csökkentett nyomáson bepároljuk, így színtelen sziláid tennék formájában a dipeptid hidrokloridsőját kapjuk.

1,34 g (1,4 mmól) (CBZ)₃Arg-(BCZ)-Lys-ONp dípeptid sósavas sója és 0,19 g (1,0 ekvivalens) HOB-t 10 ml DMF-vel készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,18 ml NMM-t. 16 óra alatt gélszerű csapadék képződik. A reakcióelegyet telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk, leszűqük, és vízzel 10%-os citromsavval, vízzel és dietil-éterrel mossuk. 4% ecetsavat tartalmazó etil-acetátból átkristályosítva 1,36 g (73%) (CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-AspVal-ciklohexil-amidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

1,33 g tetrapeptidről a védőcsoportokat 30 ml hidrogén-fluorid és 8 ml anizol elegyével 60 perc alatt 0 ’C-on eltávolítjuk. A maradékot dietil-éterrel hígítjuk, és leszűqük. A kapott szilárd terméket 10%-os ecetsavban feloldjuk, és lifoilizáljuk, így 460 mg cím szerinti terméket kapunk.

A pepiidet HPLC útján tisztítjuk.· Whatman M-20 10/50 ODS-3 oszlop, 10,0 ml/perc átfolyási sebességgel, 10% CH₃CN, 0,01 mól/1 pH=5, NH₄OAc. Háromszor injektálunk 150 mg anyagot 3 ml pufferben, és a 35,0 és 51,6 perc között eíuáló frakciókat összegyűjtjük. Az oldószert csökkentett nyomáson részben eltávolítjuk, a maradékot liofilizáljuk, így 410 mg cím szerinti terméket kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

Aminosav analízis: Arg, 1,00; Lys, 1,00; Asp, 1,00; Val, 0,85.

Vékonyrétegkromatográfia (250 μ szilikagél G)

R_f(I)=0_J39(n-BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc/l:l:l:l)

R_f©)=0,61(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10)

Rf(ni)= 0,90 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

3. példa

Arg-Lys-Asp-Val-piperidin-amid szintézis

2,72 g (5,00 mmól) BOC-(Bzl)-Asp-Val-ONp és 0,6 ml (1,2 ekvivalens) piperidin 10 ml THF-vel készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,68 g (1,0 ekvivalens) HOBt-t. 48 óra múlva a sárga oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott olajos maradékot etil-acetátban feloldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, hideg 2 mól/l-es nátriumhidroxiddal, kétszer vízzel, egyszer 10%-os citromsavval és telített sőoldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton megszárítjuk, így 2,36 g BOC-(Bzl)Asp-Val-piperidin-amidot kapunk színtelen olaj formájában.

Metanol és diklórmetán elegyével végzett gyors kromatográfiás tisztítással 1,65 g (67%) védett dipeptid-amidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

ml 4,2 mól/l-es sósavas dioxánhoz hozzáadunk 1,06 g (2,17 mmól) védett dipeptid-amidoL Egy óra múlva az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, a

HU 205 143 Β maradékot .diklór-metánban oldjuk, és újra bepároljuk, így a hidrokloridsót kapjuk színtelen olaj formájában. / :·· · ·· ·

2,08 g (2,17 mmól) (CBZ)₃Arg-(CBZ)-Lys-ONp, a fenti színtelen olaj és 0,29 g HOBtlO ml DMF-vel készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,29 ml MMM-t. Egy óra múlva elkezd csapadék képződni. 16 óra múlva a reakcióelegyet vízzel hígítjuk. A terméket etil-acetáttal extraháljuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel, 10%-os citromsav-oldattal, vízzel és dietil-éterrel mossuk, HOAc/ETOAe/Et₂O eleggyel végzett átkristályosítással 2,40 g (92%) (CBZ)₃Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-piperi din-amidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

1,87 g (1,55 mmól) védett tetrapeptidet szuszpendálunk 100 ml 10%-os ecetsavban, amelyet előzőleg nitrogénnel átöblítettünk, és amelyhez előzőleg 0,8 g 10%-os szénhordozós palládiumot adtunk. Az elegyet egy 500 ml-es edénnyel ellátott Parr-hidrogénezőben keverjük 0,3 kPa nyomás mellett. 48 óra múlva a reakcióelegyet egy 0,45-ös nylonszűrőn leszűrjük, részben bepároljuk, vízzel hígítjuk, és liofilizáljuk, így 890 mg nyers tetrapeptidet kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

A pepiidet HPLC útján tisztítjuk: Whatman M-20 10/50 ODS-3 oszlop, 10,0 ml/perc átfolyási sebesség, 10 CH₃CN, 0,01 mólÁ, pH= 5,0,NH₄OAc. Háromszor injektálunk 300 mg anyagot 3 ml pufferben oldva, és a 23,0 és 44,0 perc között eluálódó frakciókat összegyűjtjük. Csökkentett nyomáson végzett részleges bepárlással és liofilezés után 510 mg cím szerinti tetrapeptid-amidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

Aminosav analízis: Arg, 0,95, Lys, 1,00; Asp, 1,02; Val, 1,00; 54,2 peptid-tartalom.

Vékonyréteg kromatográfia (250 μ, szilikagél G)

R_f(I)=0,31(n-BuOH:HOAc:H₂O:EtOAc/l: 1:1:1)

R_f(II)=0,53(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10)

R_f(IÜ)= 0,61 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

4. példa

ÁRg-Pro-Ásp-Val-N-metil-amid szintézise

10,86 g (50,0 mmól) BOC-Val és 8,70 ml (1,0 ekvivalens) DIEA, 3,38 g (1,0 ekvivalens) metil-amin-hidroklorid és 7,66 g (1,0 ekvivalens) HOBt diklór-metán és DMF 12:5 térfogatarányú 85 ml elegyével készült * oldatához keverés közben hozzáadunk 10,32 g (50,0 mmól) DCC-t. Ekkor csapadék képződik. Két óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot etil-acetátban feloldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel, 10%-os citromsavval és telített sóoldattal háromszor mossuk. Ezután nátrium-szulfáton megszárítjuk,, leszűrjük, és bepároljuk, így színtelen szilárd terméket kapunk. Forró hexánnal végzett triturálás után 7,98 g (69%) BOC-Val-metil-amidot kapunk, op.: 120-122 ’C.

4,60 g (20,0 mmól) kapott amidhoz hozzáadunk 20 ml TFA/CH₂C1₂ elegyet. A kapott elegyet 30 percig keverjük, majd 30 ’C alatti hőmérsékleten bepároljuk, az olajos maradékot diklór-metánban oldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, és bepároljuk, így 1,90 g (73%) Val-metílamidot kapunk.

4,72 g (14,6 mmól) BOC-Bzl-Asp, 1,90 g (14,6 mmól) Val-metil-amid, 2,24 g (1,0 ekvivalens) HOBt 20 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 3,01 g (14,6 mmól) DCC-t. Öt perc múlva csapadék képződik. 16 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, a szűrletet félig telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk.

A kapott szilárd terméket összegyűjtjük, vízzel kb. 10%-os citromsavval, vízzel és dietil-éterrel mossuk, majd levegő nmegszárítjuk, így színtelen szilárd terméket kapunk. ETil-acetátból végzett átkristályosítással 5,85 g (92%) BOC-(Bzl)-Asp-Val-metíl-amidot kapunk.

3.94 g (9,05 mmól) fenti dipeptid-amidhoz hozzáadunk 20 ml 50%-os TFA/CH₂C1₂ elegyet. Az elegyet 30 percig keverjük, majd 30 ’C alatti hőmérsékleten bepároljuk, és dietil-éterrel trituráljuk, így 4,10 g (100%) TFA-sót kapunk színtelen üvegszerű termék formájában.

1.95 g (9,05 mmól) BOC-Pro, 4,10 g (9,05 mmól) dipeptid-TFA-só, 1,73 ml (1,1 ekvivalens) DIEA, 0,12 g (0,1 ekvivalens) DMAP 20 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 1,87 g (9,05 mmól) DCC-t. 5 perc múlva csapadék képződik. 16 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet félig telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk. A kapott szilárd terméket összegyűjtjük, vízzel, 10%os citromsavval, vízzel és dietíl-éterrel mossuk, levegőn megszárítjuk, így 4,15 g (86%) kívánt tripeptidamidot kapunk. Ezt tisztítás nélkül tovább feldolgozzuk.

4,15 g (7,78 mmól) fenti amidhoz hozzáadunk 15 ml 50%-os TFA/CH₂C1₂ elegyet. Az elegyet 30 percig keverjük, majd 30 ’C alatt bepároljuk, és dietíl-éterrel trituráljuk, így 4,25 g (100%) tripeptid-TFA-sőt kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

39,7 g (7,78 mmól) AOC-Tos-ARg, 4,25 g (7,78 mmól) tripeptid-amid, 0,86 ml (1,1 ekvivalens) HOBt 15 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 1,61 g (7,78 mmól) DCC-t 10 perc múlva csapadék képződik. 16 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet félig telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk.

A kapott szilárd terméket összegyűjtjük, vízzel 10%-os citromsavval, vízzel, majd éténél mossuk, és levegőn megszárítjuk, így 4,82 g (72%) védett tetrapeptíd-amidot kapunk.

A kapott szilárd termék felét védőcsoport eltávolításnak vetjük alá 10 ml 50%-os TFA/CH₂C1₂ eleggyel 30 percig, majd csökkentett nyomáson bepároljuk, és dietil-éterrel trituráljuk. A kapott szilárd terméket 30 ml hidrogén-fluorid és 8 ml anizol elegyével kezeljük 0 ’C-on 60 percig. A kapott terméket etil-acetatban szuszpendáljuk, és 50 ml 10%-os ecetsavval két7

HU 205143 Β szer extraháljuk. A vizes terméket liofílizáljuk, így a nyers cím szerinti terméket kapjuk.

A nyers peptidet SPC-25 Sephadexen. tisztítjuk (2,6x83 cm oszlop, 0,05-0,3 mól/l NH₄0 Ac, pH= 6,5; 100 ml/óta átfolyási sebesség, 9,5 ml/frakció, 206 nm detektor). A 113-128. frakciókat összegyűjtjük, és liofílizáljuk, így 925 mg cím szerinti tetrapeptid-amidot kapunk.

Aminosav-analízis: Arg, 1,06; Pro, 0,99, Asp, 0,95; Val, 1,00; 54 peptid-tartalom.

Vékonyréteg kromatográfia (250 μ, szilikagél G)

Rf(I)=0^0 (n-BuOH:HOAc:H₂O:felsŐfázis/4:1:5)

Rf(II)=0,26(n-BuOH:HOAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10)

Rf(in)= 0,26 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:l:3:5)

5. példa

N-formil-Arg-Pro-Asp-Val-metil-amid szintézise

1,0 g (0,17 mmól) AQC-(Tos)-Arg-Pro-(Bzl)-AspVal-metil-amidhoz hozzáadunk 10 ml 4,5 mól/I-es sósav dioxánt. 60 perc múlva a reakcióelegyet bepároljuk, a maradékot vízzel hígítjuk, és liofílizáljuk, így 0,92 g (100%) tetrapeptid-hirokloridsőt kapunk színtelen por formájában.

A kapott terméket feloldjuk 10 ml DMF-ben, és hozzáadunk 0,93 ml (4,0 ekvivalens) DIEA-ζ 0,08 g DMAP-t és 200 mg (1,02 ekvivalens) p-nitro-fenilformiátot Két óra múlva a reakcióelegyet 10%-os citromsavval kezeljük. A kapott szilárd terméket leszűrjük, vízzel mossuk, és levegőn megszárítjuk, így 0,41 formilezett peptíd-amidot kapunk.

Ezt a szilárd terméket 0 °C-on 60 percig 30 ml hidrogén-fluorid és 8 ml anizol elegyével kezeljük. A kapott maradékot etil-acetátban szuszpendáljuk, és 50 ml 1%-os ammőnium-hidroxiddal kétszer extraháljuk. A vizes extraktumot liofílizáljuk, így a cím szerinti peptid nyers formáját kapjuk.

A nyers peptidet DEAE Sephadexen tisztítjuk (2,6x90 cm oszlop, 0,1 mől/INH₄HCO₃, nempufferolt, 100 ml/óra átfolyási sebesség, 10 ml/frakció, 206 nm detektor). A 38-43. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, így 80 mg amidált peptidet kapunk.

Aminosav-analízis: Arg, 1,00; Pro, 1,00; Asp, 1,00; Val, 1,00; 50% peptid-tartalom.

Vékonyréteg kromatográfia: (250 μ szilikagél G)

RfQ=0,32(n-BuOH:HOAc:H₂O:felsőindex/4:l:5)

Rf(ü)=0,38 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

RfÖn)= 0,34 (trifluor-etanol:NH₄OH/l:l)

6. példa

Arg-Lys-Asp-Val-2-fenil-kidrazid szintézise

4,34 g (20,0 mmól) BOC-Val 40 ml THF-vel készült oldatához -15 °C-on keverés közben hozzáadunk

2,30 mlNMM-t, majd 2,64 ml iBuOCOCl-t. A kapott szuszpenzíót 15 percig keveq'ük, majd cseppenként hozzáadunk 1,98 ml fenil-hidrazint. A kapott elegyet -10 ’C és 0 °C közötti hőmérsékleten 1 óra hosszat keveq'ük, majd szobahőmérsékletre melegítjük. A reakcióelegyet leszűq'ük, a szűrletet csökkentett nomáson bepároljuk. A maradékot etil-acetátban feloldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és telített sóoldattal mossuk.

A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, bepároljuk, így narancssárga szilárd terméket kapunk. Diklór-metán és petroléter elegyével átkristályosítva 4,96 g (74%) BOC-Val-2-fenil-hidrazidot kapunk színtelen szilárd tennék formájában.

ml 4(2 mól/I-es sősavas dioxán-oldathozkeverés közben hozzáadunk 1,13 g (3,68 mmöl) BOC-Val-2fenil-hidrazidot Egy óra múlva a reakcióelegyet csökkentett nyomáson bepároljuk, dietil-éterrel trituráljuk, és leszűrjük, így 1,03 g Val-2-fenil-hidrazid-dihidroklorid-sót kapunk.

1,03 g (3,68 mmól) dihidrokloridsó, 0,88 g BOC(Bzl)-Asp és 0,37 g HOBt 10 ml THF-nal készült oldatához keverés közben hozáadunk 0,60 ml ΝΜΜ-ζ majd 0,56 g DCC-L Szinte azonnal csapadék képződik. 16 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot etilacetátban feloldjuk, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített sóoldattal mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszánjuk, leszűrjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Etil-acetát és hexán elegyéből átkristályosítva 1,07 g (64%) BOC(Bzl)-Asp-Val-2-fenil-hidrazidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

ml 4,2 mól/l-es sósavas dioxánoldathoz keverés közben hozzáadunk 1,07 g (1,75 mmól) BOC-dipeptid-fenil-hidrazidot. 60 perc múlva az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, így színtelen olaj formájában (Bzl)-Asp-Val-2-fenil-hidrazid-hidrokIoridot kapunk.

1,68 g(CBZ)₃ Arg-(CBZ)Lys-ONp, 0,24 gHOBtés a fenti olaj 6 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,6 ml NMM-t. 16 óra múlva gélszerű csapadék képződik. A reakcióelegyet telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk, és a szilárd anyagot összegyűjtjük, vízzel, 10%-os citromsavval, vízzel és dietil-éterrel mossuk. 2%-os ecetsavas etil-acetátból végzett átkristályosítással 2,15 g (92%) (CBZ)₃Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-2- fenil-hidrazidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

ml 4,2 mól/I-es sósavas dioxánoldathoz keverés közben hozzáadunk 1,07 g (1,75 mmól) BOC-dipeptíd-fenil-hidrazidot. 60 perc múlva az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, így színtelen olaj formájában (Bzl)-Asp-Val-2-fenil-hidrazid-hidrokloridot kapunk.

1,68 g(CBZ)₃Arg-(CBZ)Lys-ON, 0,24 gHOBt és a fenti olaj 6 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 0,6 ml NMM-t. 16 óra múlva gélszerű csapadék képződik. A reakcióelegyet telített nátrium-hidrogén-karbonát-Oldattal hígítjuk, és a szilárd anyagot összegyűjtjük, vízzel 10%-os citromsavval, vízzel és dietíl-éterrel mossuk. 2%-os ecetsavas etil-acetátból végzett átkristályosítással 2,15 g (92%) (CBZ)3Arg-(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-2- fenil-hidrazidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

1,88 g védett peptidet 0 °C-on 60 percig 30 ml hidrogén-fluorid és 8«ml anizol elegyével hasítunk. A ma8 radékot dietil-éterrel hígítjuk, és leszűrjük. A szilárd terméket 100 ml 10%-os ecetsavval 1 óra hosszat extraháljuk, leszűrjük, és az extraktumot liofilizáljuk, így 890 mg Arg-Lys-Asp-Val-2-fenil-hidrazidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

A nyers peptidet CM Sephadexen tisztítjuk (2,6x88 cm oszlop, 0,3 mól/1 NH₄OAc, nempufferolt, 100 ml/óra átfolyási sebesség, 12,5 ml/frakció, 225 nm detektor). A 270-310. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, így 390 mg cím szerinti terméket kapunk,

Aminosav-analízis: Arg, 0,98; Lys 1,03; Asp, 1,00; Val, 0,99; 83% peptid-tartalom.

Vékonyrétegkromatográfía: (250 μ szilikagél G)

R_f©=0,39(n-BuOH:HOAc:H2O:EtOAc/l:l:l:l)

R_f(©=0,51(n-BuOH:HOAc:Í^O:Pyr/15:3:12:10)

R_f(III)= 0,59 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

7. példa

Arg-Lys-Asp-Val-amlin-amid szintézise

4,35 g (20,0 mmól) BOC-Val, 3,0 ml (1,05 ekvivalens) anilin és 3,09 g (1,0 ekvivalens) HOBt 20 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben, szobahőmérsékleten hozzáadunk 4,12 g (20,0 mmól) DCC-t. 5 percen belül sűrű csapadék képződik. 4 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, a szűrletet 500 ml félig telített nátrium-hidrogén-lcarbonát-oldatba öntjük. A képződött csapadékot leszűrjük. A szilárd terméket vízzel mossuk (1:1), és levegőn megszárítjuk. Hexán és izopropanol elegyéből végzett átkristályosítással 3,76 g(64%) BOC-Val-anilin-amidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

2,50 g (8,55 mmól) BOC-Val-anilin-amidot feloldunk 10 mi 10%-os TFA/CH₂C1₂ elegyben, és 30 percig keverjük. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szobahőmérsékleten bepároljuk, és a maradékot diklór-metánban feloldjuk. Az oldatot telített nátriumhidrogén-kaibonát-oldattal kétszer mossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, és bepáröljuk, így 1,42 g (88%) Val-anilin-amidot kapunk halvány. sárga olaj formájában.

2,38 g (1,0 ekvivalens) BOC-(Bzl)-Asp, a Val-anilinamid és 1,13 g HOBt 7,5 ml DMF-dal készült oldatá<·; hoz hozzáadunk 1,52 g (1,0 ekvivalens) DCC-t. Ekkor csapadék képződik, a reakcióelegyet 3 óra hosszat keverjük. Az elegyet ezután leszűrjük, a szűrletet telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk. A képződött szilárd anyagokat összegyűjtjük, vízzel mossuk, és levegőn megszárítjuk. Etil-acetát és petroléter elegyéből átkristályosítva 1,74 g (46%) BOC-(Bzl)Asp-Val-anilin-amidot kapunk, op.: 121-122 °.

1,71 g (3,44 mmól) BOC-dipeptidet feloldunk 10 ml50%-os TFA/CH₂C1₂ elegyben, és 30 percig keverjük. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szobahőmérsékleten bepároljuk, a maradékot éterrel trituráljuk, leszűrjük, és levegő nmegszárítjuk.

1,33 g (3,50 mmól) BOC-(CBZ)-Lys 10 ml DMF-dal készült oldatához keverés közben, -20 ’C-on hozzáadunk 0,46 ml (1,2 ekvivalens) NMM-t, majd 0,46 ml (1,01 ekvivalens) iBuQCOQ-t. A kapott szuszpenziót 30 percig keverjük, majd hozzáadjuk a TFA-sót, majd

0,46 ml NMM-t. A reakcióelegyet keverjük, majd szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. Egy óra múlva a reakcióelegyet 200 ml félig telített nátrium-hidrogénkarbonát-oldatba öntjük. Színtelen szilárd termék képződik. Ezt összegyűjtjük, és levegőn megszárítjuk. Etil-acetát és diizopropil-éter elegyéből átkristályosítva 2,05 g (78%) BOC-tripeptid-amidot kapunk, op.: 164-167 ’C.

2,00 g (2,63 mmól) BOC-tripeptid-amidot feloldunk 6 ml 50%-os TFA/CH₂C1₂ elegyben, és 30 percig keverjük. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, csökkentett nyomáson bepároljuk, és a maradékot éténél trituráljuk, leszűrjük, és levegőn megszárítjuk, így a TFA-sót kapjuk.

1,52 g (2,63 mmól) (CBZ)₃ Arg DMF-dal készült, oldatához keverés közben, -20 ’C-on hozzáadunk 0,35 ml (1,2 ekvivalens) NMM-t, majd 0,35 ml (1,01 ekvivalens) iBuOCOCl-t. A kapott szuszpenziót 30 percig keverjük. Ezután hozzáadunk 0,35 ml NMM-t, majd a TFÁ-sót. A reakcióelegyet 1 óra alatt szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. Ezután a reakcióelegyet telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntjük, akivált szilárd terméket leszűrjük, vízzel mossuk, és levegőn megszárítjuk. Etanollal triturálva a BOC(CBZ)-Lys-(Bzl)-Asp-Val-anilin-amid védett tetrapeptidet kapjuk, 2,55 g (78%).

2,30 g (1,89 mmól) tetrapeptid 50 ml trifluor-etanollal és 5 ml 97%-os hangyasavval készült szuszpenziójához 0,95 g szénhordozós palládiumot adunk keverés közben. A reakcióelegyet élénken keverjük. Egy óra múlva az oldatot Celiten leszűrjük és vízzel mossuk. A szűrletet csökkentett nyomáson részben bepároljuk, a maradékot liofilizáljuk, így 0,89 g színtelen szilárd terméket kapunk.

A nyers peptidet SPC-25 Sephadexen tisztítjuk (2,6x89 cm oszlop, 0,1-0,3 mól/1 NM₄OAc; pH= 5 gradiens; 100 ml/óra átfolyási sebesség, 15 ml/frakció, 206 nm detektor). A 253-285. frakciókat összegyűjtjük, és liofilizáljuk, így 680 mg cím szerinti terméket kapunk.

Aminosav-analízis: Arg, 1,00; Lys, 0,98; Asp, 1,00; Val, 1,01; 100% peptid-tartalom.

Vékonyréteg kromatográfia: (250 μ szilikagél G)

R_f(I)= 0,42 (EtOAc:HOAc:H₂O:Pyr/5:1:3:5)

R_f(II)=0,32(n-BuOH:HÖAc:H₂O:EtOAc/l:l:l:l)

R_f(III)=0,54(n-BuÖH:HÖAc:H₂O:Pyr/15:3:12:10)

8. példa

Biológiai aktivitás: ciklikus GMP vizsgálat

Ezzel a vizsgálattal a találmány szerinti eljárással előállított pepiidnek azt a képességét mérjük, hogy az érintetlen CEM sejt sejtmembrán receptorához kötődik, és szelektíven stimulálja a gyűrűs GMP képződését, ahogy azt az emberi thymopentin teszi.

Az American Type Culture Collection of Rockville, Md. Intézettől származó CEM sejtvonalat használjuk. A CEM sejteket frissen oltottuk és tenyésztettük három napig, majd összegyűjtöttük T. Audhya és munkatársai által Arch. Biochem. Biophys., 234: 167-177 (1984) helyen ismertetett módon. A sejteket három9

HU 205143 Β szór mostuk PBS-hen, majd újra szuszpendaltuk RPMI 1640-ben Ι,ΟχΙΟ⁷ sejt/ml koncentrációval, és hagytuk kiegyenlítődni 37 ’C hőmérsékleten 30 percig, mielőtthozzáadtuk volna a vizsgálandó (25 μΐ) ésa kontroll peptideket 4-5 percig inkubáltuk rázó vízfürdőben, és ezután a folyamatot 1 ml jéghideg TCA (10%) hozzáadásával leállítottuk.

A sejteket TCA-ban homogenizáltuk, majd ultrahangkezeléssel felszabadítottuk a ciklikus nukleotidot. A szuszpenziót 3000 g-vel 20 percig 4 ’C hőmérsékleten centrifugáltuk. A keletkező csapadékot 0,1 n nátrium-hidroxidban feloldottuk, a proteintartalom meghatározására. A TCA-t felülűszó frakcióból négyszer 5 ml vízzel telített dietil-éteirel extraháltuk. Az utolsó extrakció után az étemyomokat úgy távolítottuk el, hogy 50 ’C hőmérsékletű vízfürdőn 10 percen át melegítettük. Liofilizálás után a mintát 50 mmól/l-es acetát-pufferben (pH=6,2) visszaoldottuk gyűrűs GMP radioimmuno-vizsgálatához.

Az 1. ábra a jellegzetes dózis-válasz görbéket mutatja, amelyeket 1 és 1000 gg/ml között Arg-Pro-AspVal-izopropil-amid, Arg-Lys-Asp-Val-anilin-amid, Arg-Lys-Asp-Val-ciklohexil-amid, Arg-Asp-Val-piperidin-amid és Arg-Lys-Asp-Val-fenil-hidrazid thymopentinnel és Arg-Lys-Asp-Val-dimetil-amid és Arg-Lys-Asp-Val-2-naftiI-amid inaktív peptidekkel történő összehasonlításával CEM sejtekben kaptunk.

Minden egyes vizsgált pepiidnél meghatároztuk az aktivitás küszöbértéket Ez a vizsgált peptid azon lega-* lacsonyább koncentrációját jelenti, amely a ciklikus GMP két standard deviáció értékkel magasabb intracellulátís szintjét inkubálja, mint a kontroll. A kontrollok intracelluláris ciklikus GMP-értéke 0,9 pikomől/ml-nél kevesebb (átlag ± standard deviáció). A vizsgálati eredmények pozitívnak tekinthetők, amennyiben a ciklikus GMP szintje a párhuzamos negatív kontroll esetén mért érték kétszeresénél (két standard deviáció érték) nagyobb. Az aktív peptidek küszöbértéke 1-10 ttg/l.

A gyűrűs GMP vizsgálatok eredményeit az 1. ábra mutatja, amely a találmány szerinti eljárással előállított peptidek jellemző képviselői thymopentinnel és kontroll peptidekkel történő összehasonlítására vonatkoznak. Ezek az eredmények igazolják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított peptidek biológiai aktivitást mutatnak T sejt szuppresszor hatás elősegítésére CEM sejtekben.

9. példa

Enzimatikus stabilitás

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek intestinális és szérumenzimek által okozott degradációval szembeni stabilitásának bemutatására példaként Arg-Pro-Asp-Val-izopropil-amidot inkubáltunk 37 ’C hőmérsékleten 120 percig patkány bélfolyadékában és emberi szérumban. Összehasonlításként hasonló kezelést végeztünk Arg-Lys-Asp-Val-dimetilamiddal és thymopentinnel. HPLC azt mutatta, hogy az Arg-Lys-Asp-Val-dimetil-amid teljesen lebomlott néhány másodperc alatt. A thymopentin 50%-os degradációt mutatott 20 másodperc elteltével. A jelen találmány szerinti eljárással előállított peptidek lényegében lebontatlanok maradtak mind a szérumban, mind a bélfolyadékban hosszabb ideig, mint a thymopentin vagy a kontroll peptid.

10. példa

Arg-Lys-Asp-Val-metil-amid szintézise

A. Na -t-butil-oxi-karbonil-(N-benzíI-oxi-karbonil)Lys-(p -benzil)-Asp-Val-metil-amid ml 85%-os ecetsavban feloldunk 3,21 g Να-t-bu til-oxi-karbonil-(N-benzil-oxi-karbonil)-Lys-( β -benzil)-Asp-Val-fenacil-észtert. Hozzáadunk 5,2 g cinkport, és az elegyet 1 óra hosszat élénken keveqűk. Ezután a reakcióelegyet leszúrjuk, a szűrletet vízzel hígítjuk, és etil-acetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vízzel és telített nátriumklorid-oldattal extraháljuk, majd vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószer eltávolítása után egy olajat kapunk. Éter, majd hexán adagolása hatására gumiszerű csapadékot kapunk. Ezt az anyagot hexánnal addig trituráljuk, míg száraz fehér szilárd anyagot nem kapunk, amelynek mennyisége 1,75 g. Ezt a terméket 14 ml etil-acetátban és 1 ml dimetil-formamidban feloldjuk.

Az oldatot -20 ’C-ra lehűtjük, és hozzáadunk 0,30 ml N-metil-morfolint, majd cseppenként 0,36 g izobutil-kloroformátoL A reakcióelegyet -15 ’C-on 20 percig keveqűk, majd hozzáadjuk 0,29 ml N-metilmorfolint és 0,18 g metil-amin-hidroklorid 10 ml 95%-os etanollal készült lehűtött oldatát. Ekkor sűrű csapadék képződik. A-keverés megkönnyítésére 5 ml DMF-t adunk hozzá, és az elegyet 90 percig 0 ’C-on, majd 30 percig szobahőmérsékleten keveqűk. Ezután a reakcióelegyet 75 ml vízhez adjuk.

Az elegy keverése hatására a szerves fázis viaszos szilárd részecskékké kezd válni. A szilárd anyagot leszűqük, és a szűrletet etil-acetáttal extraháljuk A szerves fázis bepárlása után kapott maradékot egyesítjük a szilárd termékkel, és etil-acetát és izopropiléter elegyéböl kristályosítjuk. így 1,53 g terméket kapunk, op.: 183,5-184,5 ’C.

Elemanalízis:

talált: C-.6I,57,H:7,21,N:9,81%, számított C: 61,96,H: 7,37,N: 10,04%.

B. Tri(benzil-oxi-karbonil)-arginil-(N-benzil-oxi-ka rbonil)-$-benzil)-Asp-Val-metil-amid

1,46 g A lépésben kapott termékhez hozzáadunk 50% trifluor-ecetsavat tartalmazó metilén-kloridot. Az elegyet 25 percig keveqűk, majd az oldószert lepároljuk, és a maradékhoz étert adunk. A kapott fehér szilárd terméket leszűrjük, és éterrel mossuk.

1,33 g tri(benzil-oxi-karhonil)-arginint feloldunk 10 ml DMF-ben. Az oldatot lehűtjük -20 ’C-ra, és hozzáadunk 0,25 ml N-metil-morfolint, majd 0,31 g izobutil-kloroformát 2 ml DMF-dal készült oldatát. Az elegyet -20 ’C-on 20 percig keveq’ük, majd hozzáadunk 0,26 ml N-metil-morfolint és a tripeptid-trifluor-acetát 10 ml DMF-dal készült lehűtött oldatát. A reakcióelegyet -20 és -10 ’C között 30 percig, majd

HU 205143 Β szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük. 16 óra múlva a'reakcióelegyet 125 ml vízhez adjuk. A kivált csapadékot leszúrjuk, és meleg metanollal, majd etilacetáttal mossuk. így 1,74 g terméket kapunk, op.: 118-120 ’C.

Aminosavanalízis: Asp-0,99, Val-1,03, Tyr-0,99, Lys-0,98, Arg-1,00; 67,7% peptid.

C. Arg-Lys-Asp-Val-metil-amid

I, 72 g B lépésben kapott termékről a védőcsoportokat 2 ml hangyasav és 1 g szénhordozós palládium segítségével 40 ml trifluor-etanolban távolítjuk el. A .reakcióelegyet egy ballonnal lezárt lombikban másfél óra hosszat élénken keverjük. Ezután a palládiumot Celiten keresztül leszűrjük, vízzel utánamossuk. A trífluor-etanol nagy részét forgóbepárlóban eltávolítjuk a szűrletből. A maradékot 5%-os ecetsavval hígítjuk és liofilizáljuk. így 670 mg terméket kapunk.

A kapott pepiidet kromatográfiás tisztítjuk 2,6x85 cm-es SP-Sephadex oszlopon, amelyet 310,20-0,50 n gradiensű ammónium-acetáttal (pH= 5,5) eluálunk.

ml-es frakciókat gyűjtünk, és 206 nm-nél dekantáljuk. A fő csúcs a 185-220. frakcióknál jelenik meg, ezt három részletre osztjuk: 185-190, 191-205 és 206220. Ezeket liofilizálva 21 mg, 497 mg és 235 mg terméket kapunk. Az első részlet szennyezést tartalmaz, a másik két részlet tisztasága 99,5% feletti.

HPLC, μ-Bondapak C₁₈: Rt= 8,5 perc, 0,01 mól/1

NH₄OAc pH= 5,2,0 ml/perc.

Aminosavanalízis: Asp-1,01, Val-0,95, Lys-1,01, Arg-1,02; 56% peptid.

Vékonyrétegkromatográfia (szilikagél 60)

R_f(I)= 0,19 (n-BuOH:HOAc:H₂O:piridín/15:3:12:10)

R_f (Π)= 0,15 (EtOAc.pir:H₂O:5Pyr/5:5:l:3)

R_f(HI)= 0,45 (TFA:NH₃OH/2:1)

II. példa

Arg-Lys-Asp-Val-2-propil-atnid szintézise

A. a-Boc-e-(Cbz)-Lys-(P-Bzl)Asp-Val-fenacil-észter

100 ml 85%-os ecetsavval készült oldatához élénk 40 keverés közben, szobahőmérsékleten hozzáadunk 12,4 g savval edzett cinkport. Egy óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A kapott olajos maradékot dietil-éterrel trituráljuk. A képződött szilárd terméket összegyűjtjük, dietil-éterrel és vízzel mossuk, majd vákuumban 40 ’C-on megszárítjuk, így 4,95 g (72%) terméket kapunk.

B. a-Boc-s-(Cbz)Lys-(p-Bzl)-Asp-Val-NHCH(CH₃)₂

1,00 g (1,46 mmól) Boc-tripeptid 5 ml THF-vel készült oldatához keverés közben, -15 ’C-on hozzáadunk 170 μΐ (1,03 ekvivalens) iBuOCOCl-ot. A kapott enyhén zavaros oldatot 15 percig keverjük, majd hozzáadunk 150 ml (1,1 ekvivalens) 2-propil-amint. A reakcióelegyet -5 ’C-ra melegítjük. Ekkor gélszerű termék képződik. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. 16 óra múlva a reakcióelegyet vákuumban 30 ’C-on bepároljuk, a kapott szilárd terméket 10%-os citromsavval, vízzel, telített nátriumhidrogén-karhonát-oldattal és vízzel mossuk. Ezután levegőn megszáritjuk, így 2,58 g (55%) színtelen Boc’ tripeptid-amidot kapunk.

C. (Cbz)₃Arg-8-(Cbz)Lys-(p -Bzl)Asp-ValNHCH(CH₃)₂

0,55 g (0,76 mmól) Boc-tripeptid-amidot feloldunk ml 4,4 mól/l-es sósavas dioxánban, és 45 percig keveqük. Ezután az oldatot vákuumban bepároljuk, a kapott szilárd terméket dietil-éterrel trituráljuk. Szűrés után 0,51 g (100%) színtelen tripeptid-amid-hid10 rokloridot kapunk.

A tripeptid-amid-hidroklorid, 0,53 g (1,01 ekvivalens) (Cbz)₃ Arg-p-nitrofenil-észter és 0,12 g (1,0 ekvivalens) HOBt 5 ml DMF-vei készült oldatához keverés közben, szobahőmérsékleten hozzáadunk 92 μΐ (1,1 15 ekvivalens) NMM-t. 16 óra alatt lassan csapadék képződik. A gélszerű reakcióelegyet telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal keverjük, és leszűrjük. A kapott szilárd terméket vízzel, 10%-os citrorftsavval, vízzel és dietil-éterrel mossuk. A kapott védett tetrapep20 tid-amidot ecetsav és etil-acetát elegyéből átkristályosítjuk, így 743 mg (83%) színtelen szilárd terméket kapunk.

D. Arg-Lys-Asp-Val-NHCH(CH₃)₂

0,70 g (0,59 mmól) védett tetrapeptidet 50 ml 90%25 os ecetsavban szuszpendálunk. Az elegyen nitrogént buborékoltatunk át és hozzáadunk 0,4 g 10%-os szénhordozós palládiumot. A hidrogénezést 64 óra hosszat egy Parr-rázókészülékben végezzük (250 ml-es edény, P_o= 0,36 kPa). A reakcióelegyet egy 0,45 μ-os nylon30 szűrőn leszűrjük, részben hepároljuk, és liofilizáljuk, így 385 mg nyers tetrapeptidet kapunk.

A nyes pepiidet CM Sephadexen tisztítjuk (2,6x93 cm oszlop, 1,71,0,2 mól, majd 0,3 mól NH₄OAc, nempufferolt; 100 ml/óra átfolyási sebesség, 10 ml/frak35 ció, 225 nm detektor). A 335-370. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, így 231 mg terméket kapunk.

Aminosav-analízis: Arg-1,00, Lys-1,02, Asp-0,98, Val-1,00; 80,3% peptid-tartalom.

Vékonyrétegkromatográfia: (250 μ, szilikagél G)

R_f(I)= 0,24 (n-BuOH:HOAc:H₂O;EtOAc/l :1:1:1)

RfOI)= 0,52 (n-BuOH:HOAc:H₂O:piridin/l5:3:12:10)

R_f(III)= 0,61 (EtOAc:HOAc:H₂O:piridin/5:l:3:5)

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás

   R-Arg-X-Asp-Y-NR¹R²(I) általános képletű peptid előállítására, ahol 50 R jelentése hidrogénatom, acetil-, formil-, 3-6 szénatomos alkanoilcsoport,

   X jelentése Pro, dehidro-Pro, hydroxil-Pro, D-Lys vagyLys,

   Y jelentése Val,

   55 R¹ jelentése hidrogénatom és

   R² jelentése 1-8 szénatomos alkilcsoport,4-8 szénatomos gyűrűs alkilcsoport, fenil- vagy naftilcsoport vagy NHR,, ahol R₃ jelentése fenilcsoport, vagy

   R¹ ésR² együtt egy 4-7 szénatomos metilénláncot 60 alkot, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, kívánt eset11 ben védett aminosavakbólkiindulva szilárd fázisú vagy oldatban végzett szintézises módszerrel megfelelő védett peptidet előállítjuk, majd kívánt esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (Γ) általános képletű peptidek előállítására, ahol X jelentése Pro vagy Lys, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás

   Arg-Pro-Asp-Val-izopropil-amid

   Arg-Lys-Asp-Val-anilin-amid formil-Arg-Pro-Asp-Val-metil-amid

   Arg-Pro-Asp-Val-metil-amid

   Arg-Lys-Asp-Val-metil-amid

   Arg-Lys-Asp-Val-2-fenil-hidrazid

   Arg-Lys-Asp-Val-piperidin-amid

   Arg-Lys-Asp-Val-ciklohexil-amid

   5 Arg-Lys-Asp-Val-izopropil-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
4. 4. Eljárás gyógyszerkészítmények előáUítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással 10 előállított peptidet a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.