JPH06502385A - 血管拡張及び免疫抑制ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血　拡張　び　ペプチド 合衆国政府）１ＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所）助成金第Ａｌ２４５１１号、 第Ａ１１８６９４号、第Ａｌ２２７９４号に拠って、本発明に対する権利を主張 することができる。

並びに組換えＤＮＡ技術を月いたタンパク質生成法と、前記タンパク質の合成形 態に関する。また１本発明は、免疫系を一時的に不活性にする機能のある所定の ペプチドを投与することにより、免疫原の刺激に対する哺乳動物の反応性を減じ る方法に関する。

血管拡張剤＃戴血管狭窄を伴う様々な疾患・異常、例えば、レイノー症候群・ク モ膜下出血に伴う脳外科手術後の合併症、心不全、狭・四り高血圧等の治療に有 効な薬剤である。近年、最も医薬効果が高く、且つ持続性の高い血管拡張剤とし て、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＰＲ）と称されるニューロペプチド が注目されている。カルシウムストレス下での骨吸収を防ぐ作用のあるニューロ ペプチド、カルシトニンと、前記ＣＧＲＰ）戴同じ遺伝子に由来する。カルシト ニンとＣ０ＲＰＩＬ　同族構造体としては、その類似性が低いものの、立体配座 は似通っており、それぞわ、相手側の受容体に反応する。このため、ＣＧＲＰに も、カルシトニンはど強力ではないが、同様の骨吸収阻害作用がある（Ｚａ　ｉ ｄ　ｉら：Ｑｕａｒｔ、　Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７２：３７１ 　（１９１ｔ７））。

細網内皮系の大型食細胞であるマクロファージが、細胞免疫の誘発・表出の中心 的な役割を果たす。抗原プロセシングや、それに伴い、クラスＩＩの組織適合性 を有する抗原の存在下でマクロファージが抗原の表出を行うことにより、ヘルパ ーエリ２３球の応答が促される（Ｂｕｓ　ａら：　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、 　９８：１１５　（１９８７））　、更に、マクロファージは、ＩＬ−１等のサ イドキン生成を通して、Ｔ細胞の応答を制御する役割を果たすＣＵｎａｎｕｅら ：　Ａｎｎ、　Ｌ’１ｎａｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　１３８：４８９　（ １９８７））　＊マクロファージの活性化により、様々な細胞内、分泌、及び細 胞表面タンパク質のレベルが有意に変化すると共に、細胞の殺微生物及び腫瘍破 壌作用が促進される（Ａｄａｍｓら二＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｒｍｕｎｏｌ、 　２＋２８３　（１９８４））　、１例えば、５゛ヌクレオチダーゼのレベルが 下がる一方（Ｊｏｈｎｓｏｎら：　Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．１３Ｃ１０３８（ １９８３））、■Ｌ−１の分泌レベル及びクラスＩＩの細胞適合性抗原の表出レ ベルが上がる（Ａｄａｎｔｓら二上に同じ）、更に、活性化マクロファージによ り過酸化水素の生成が制御不能なレベルまで増加する（Ａｄａｍｓら：上に同じ ）。マクロファージは、ＩＦＮ−γ等多くのリンホカインにより（Ｍｅｒｒｙら ：　Ｊ、　ｆｎｎｕｎｏｌ、　＋３４：１６１９　（１９８５））　、あるいハ リボ多糖類等の微生物細胞壁生成物により（Ｐａｂｓｔら：　Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、　１５１＋＋０１　（１９８０））活性化される。また、最近では活性 化マクロファージが炎症部位を滅菌する際、マクロファージが細胞毒性生成物を 放出し続けて、宿主組織に損傷を与えないように、前記マクロファージが不活性 化されるるのではないか、と考えられている（Ｔｓｕｎａｗａｋｉら：　Ｎａｔ ｕｒｅ　３３４：２６０　（１９８ｇ））　。

本！！四の第一の主目的は、哺乳動物の血管拡張並びに一時的な免疫抑制作用を 有する、砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　Ｊｏｎ（ｉｐａｌｐｉｓの唾液溶解物由来 のタンパク質を提供することにある。また１本発明は、前記タンパク質の特性を 明らかにし、前記タンパク質の天然及び組換え型、更に、前記タンパク質を暗号 化する遺伝子を提供し、同時に、組換えＤＮＡ及びペプチド合成技術を用いて、 前記タンパク質を生成する方法を提供すること、を目的とする。本発明の第二の 主目的は、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ、ＣＧＲＰ、カルシトニン、活性類似体、あるい は、それらの合成型由来のタンパク質を投与することにより、免疫原の刺激に対 する哺乳動物の反応性を減じる方法を提供することにある。

及灰Ω型！ 砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物由来の、所 定のタンパク質には哺乳動物の血管拡張及び／あるいは一時的な免疫抑制を促す 作用がある。前記タンパク質の一形態として、約６，８００ダルトンの分子量を 持ち、アセトニトリル−水−トリフルオロ酢酸を含む逆相高速液体クロマトグラ フィーのカラムで、Ｃ０ＲＰよりも先に滓出されるタンパク質が挙げられる。こ のタンパク質の血管拡張作用は少なくとも、Ｃ０ＲＰの８０ないし１００倍であ り、且つ、Ｃ０ＲＰと同様、かなり長い期間、例えば、数日間に渡って、その効 果を持続する。

前記タンパク質１戴　γＩＦＮによる過酸化水素の生成増加を阻害し、同時に、 Ｔ細胞に抗原を渡すマクロファージの作用を抑制するという方法で、マクロファ ージの機能を阻害し、それによって、免疫作用を一時的に抑制する。所定の活性 タンパク質に）上血管拡張と免疫抑制の両方の作用がある、と考えられる。

前記タンパク質（以下、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａタンパク質あるいはＬＰ））−４１ １，本発明に開示されるようなりロマトグラフイーＮ製法により、砂バエの唾液 腺溶解物から抽出される。本発明において、ＬＰを暗号化する遺伝子のヌクレオ チド配列を決定し、アミノ酸配列を推測した。更に、ＬＰを暗号化する第二ＤＮ Ａ配列を同定したが、この第二配列＃ふヌクレオチド配列及び推測されるアミノ 酸配列の何れにおいても、前記第一配列と少し異なっている。即ち、２種類以上 のＬＰ変異体が存在すると考えられる。前記タンパク質並びにその様々な活性類 似体及び断片は宿主細胞内での組換えＤＮＡの表出あるいはペプチド合成を利用 して、生成される。

ＬＰあるいはその活性類似体及び断片中に豊富に存在する組成物を、免疫抑制作 用 及び断片は多くの場合、ＬＰタンパク質の活性部位配列を複製可能なアミノ酸配 列を含む、タンパク質あるいはペプチドであり、前記タンパク質あるいはペプチ ドには、哺乳動物の血管拡張あるいは一時的な免疫抑制を促す作用がある。

更に本発明の血流増進方法は、適当な量のＬＰあるいはその活性類似体・断片を 哺乳動物に投与して、その血管を拡張することにより、前記哺乳動物の循環系に おける血流を増進させる、ことを特徴とする。前記物質を非経口投与することに より、全身の血管拡張が促される。また、外科手術中に血管床に適用する等、局 所に適用することにより、前記物質の有する血管拡張効果を、適用部位に集中さ せることもできる。

前記ＬＰに加えて、これと構造的に類似するＣ０ＲＰ及びカルシトニンペプチド にも、一時的に免疫系を抑制する作用がある。それ故、本発明の、免疫原の刺激 に対する哺乳動物の反応性を減じる方法は、免疫系を一時的に不活性化するため に充分な量の、ＬＰ、カルシトニン、ＣＧＲＰ、それらの活性類似体・断片、あ るいは、前記物質の混合物を、非経口投与する、ことを特徴とする。前記一時的 な免疫抑制物質を投与する際には、対象となる哺乳動物に固有に存在する以外の タンパク質（例えば、ヒトに対しては、ストレプトキナーゼあるいはネズミのモ ノクロナール）を同時に投与し、前記免疫抑制薬剤に対抗する抗体の生成あるい は細胞免疫作用を阻害・妨害するようにしてもよい。更に、これらの免疫抑制物 質を、移植組織に対する拒絶反応を押えるためにあるいは、自己免疫疾患の治療 に用いることも可能である。

図面の簡単な説明 本発明の構成並びに、前述及びその他の目的、特徴を更に明らかにするために以 下、図面に基いて１本発明の詳細な説明する。

図１＃上唾液腺抽出物の逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のクロマ トグラムである。

図２は、逆相ＨＰＬＣで精製したＬＰの毛管電気泳動の結果を示すグラフである 。

図３は、ＬＰ及びＣＧＲＰにより誘発された紅斑の効力並びに持続性を示すグラ フである。

図４は、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ　１ｏｎ（ｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物による、 ウサギ大動扉環狭窄の緩和レベルを示す、経時圧力変化グラフである。図中、Ａ は、血管収縮性アドレナリンの投与、Ｓは、唾液腺溶解物の投与、Ｗは、試料の 水洗い、二つ目のＡは、アドレナリンの二度目の投与をそれぞれ示す。

図５は、インターフェロンγで前処理したヒトマクロファージの過酸化水素生成 に及ぼす、ＣＧＲＰの影響を示す棒グラフである。棒線は、それぞＡ培養細胞３ 株当りの平均過酸化水素生成量子標準偏差（ＳＤ）を示す。

図６は、２種類の二二一口ベブチド、カルシトニン（△）並びにＣ０ＲＰ　（△ ）がマクロファージ機能に及ぼす影響を比較したグラフである。　（縦の棒は、 標準偏差を示す、） 及呵の膠担久靭男 砂バ：！−Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓの唾液溶解物中の活性 タンパク質（Ｌ　Ｐ）にｌ’Ｌ強力な血管拡張作用がある。また、カルシトニン 、Ｃ０ＲＰ並びにＬＰには、哺乳動物の免疫系を一時的に抑制する作用がある。

ＬＰは、下記に詳述するように、外科的に摘出されたり、　Ｉｏｎ（ｉｐａｌｐ ｉｓの唾液腺から、通常のクロマトグラフィー精製法を月いて精製することがで きる。唾液腺一対から、１０ないし１５ナノグラムのＬＰが得られる。

ＬＰを暗号化するヌクレオチド配列並びにＬＰのアミノ酸配列を２６ページ（英 文）の配列リストに示す。ＬＰ配列が明らかになれば、治療目的で眉いられるＬ Ｐタンパク質を多量に製造することができる。また、周知の化学固相あるいは液 相ペプチド合成技術を用いて、ＬＰあるいはその活性類似体を合成することがで きる。更に、ＬＰ配列がわかっていれば、Ｒ植生物、真核生物等、様々な型の宿 主細胞において、ＬＰあるいはその活性類似体・断片を暗号化するＤＮＡ配列を 表出させ、前記タンパク質、その活性類似体・断片等、哺乳動物の血管拡張ある いは一時的な免疫抑制を促す作用のある構造物を多量に生成することが、可能と なる。

本発明の化合物は、治療目的で用いられる薬剤として調製でき、特＋こＬＰは血 管拡張剤として、また、血圧調節剤として用いられる。更に、ＬＰ、あるいｉｌ （市販されている）ＣＯＲＰ、カルシトニンを、一時的な免疫抑制剤として用い ることもできる。

これら化合物は哺乳動物に適用されるが、獣医師の手で、家畜に投与することも できるし、また、他の薬剤と同様の方法で、ヒトに臨床投与することもできる。

−回の投与量は、投与対象者（動物）の体重１ｋｇ当り２ｐｇないし０．２５μ ｇである。この投与量は、上記範囲内で、症状・異常の程度に応じて、治療効果 が現れるように、調節される。レイノー症候群等の治療にＬＰタンパク質を用い る際には、全身の血管拡張効果がもたらされるように、前記タンパク質を血管内 に注射する。また、血管狭窄及びそれに起因する脳の損傷を軽減する目的で用い る場合には、脳外科手術中に局所的な血管拡張を促すように非経口投与あるいは 注入投与する。状況、目的に応じて、経口、類例、非経口、あるい＃上直腸投与 、鼻からの投与、あるいは吸入法または通気法での投与に適するように前記化合 物をＴ！４製すればよい。

また、これら化合物を投与する際には、そのまま単独でもよいし、薬学的に活性 あるいは不活性な材料、または、生理学的に適した担体、例えば、水、食塩水、 あるいは、生理学的状態に適応するその他緩衝液に混ぜて投与してもよい・また ・注射で投与する場合には、皮下注射、静尿注射、あるいは、筋肉注射の何れで もよい、更に　これら化合物を、酸性塩幕薬学的に通常用いられる塩の形で投与 してもよい、更に、前記タンパク質を凍結乾燥させた形で保存しておき、使用す る直前に元の状態に戻してもよい。

本発明の化合物について、更に詳しく説明する。

ｌ旦Ω巣鮮 ウォルター・リード陸軍研究所から入手した砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｔｏｎ ｇｉｐａｌｐｉｓの研究種を、Ｍｏｄｉら０．　Ｍｅｄ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　 ２０：５６ｇ−５７０（１９８３））の方法に従い、増やした・但し・野生種が 必要な場合には、南アメリカの熱帯地域で捕まえることができる。発酵させたウ サギの餌（Ｐｕｒｉｎａ）、ウサギのフン及び肝臓の粉を混合したものをハエの 幼虫に与えた。ハエの成虫には、１００％の相対湿度下で、飽和ショ糖溶液を自 由にとらせた。成虫になって５−７日後の雌から唾液腺を含む部分を切取り、１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中 に保存した。＃５ビンセット並びに外科手術用針を用いて、頭の後の部分から突 出している唾液腺を摘出して、２０μｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（５ｍＭ：　ｐ Ｈ７，４）に移した。すぐに使用しない場合には、これを、−７０’Ｃで凍結保 存する。

ＬＰの確認 １０５対の唾液腺抽出物を対象とした逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ− ＨＰ　Ｌ　Ｃ）の結果を図１に示す。１０５対の唾液腺を、ＰＢＳ中で細かく切 断し、凍結解除して溶解させる。得られた抽出物を３０秒間ミクロ遠心分離にか け、カラムに注入する。注入前に、Ｃ−１８超薄膜ＨＰＬＣカラム（Ｇｌｙｃｏ ｔｅａｈ）を、０．６ｍｌ／分の流速、５ｏ６Ｃで、２０％アセトニトリル１０ ．１％トリフルオロ酢酸溶液を用いて、平衡状態にしておいＬ注入３分後から、 直線勾配溶出部が流れだし、これが、２０分間、ア七トニトシル濃度が４４％に 達するまで続いた。各留分を３０秒毎に採取し、血管拡張作用を調べ旭血管拡張 効果の検定は、以下のように行った。勾配溶出した各留分を１０倍に希釈し、希 釈浮液５０μｌをウサギの背中の毛を剃った部分に皮肉注射した。各留分を注射 した部位における紅斑の顕色状況はクロマトグラムのピークと一致し九対照用ペ プチドとして注入されたヒトＣＧＲＰＩμｇは、前記勾配滓出の５分後に、これ とほぼ等しい面積を持つピークとして、溶出した（図示せず）、この結果から、 唾液腺一対にｉｔはぼ１０ナノグラムのＬＰが含まれていることがわかる。

ＨＰＬＣのピーク一つを、複数の成分が構成している可能性があるので、純粋な ＬＰを独立して測定する必要がある。このため、電荷に基づいて分子を分離する ことができる毛管電気泳動を行った。この毛管電気泳動を行うためにｔ戴約１ｍ ｇ／ｍｌの濃度のＬＰ試料が最低数マイクロリットル必要となる。唾液腺２５ｏ 対をｎ出して、ＲＰ−ＨＰＬＣを複数回行って、ＬＰ２．５μｇを単離した４採 取されたＬＰを含む留分約２ｍｌを１毛管電気泳動に用いるため＋Ｌ　５ｐｅｅ ｄ−ＶａＣで１０μｌまで濃縮した４得られた試料を、１／２ｐｓｉで３秒間か けて注入し、Ｂｅｃｋｍａａ　Ｐ／ＡＣＥ　２０００を眉いて、２５ｋｖで電気 泳動にかけた４ここでｔＬＨＰＬＣで精製したＥＩＰの等電中心は、ｐｒ　（等 イオン点）７．８付近でああたため、ｐＨ８，３，１００ｍＭのホウ酸緩衝液を 用いた４注入約６分後にでてくる緩やかなピークは、ＨＰＬＣにかけた時に用い たトリフルオロ酢酸の残存分である。

電気泳動開始後約３分で、大きなピークが現れた（図２参照）。

ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したＬＰｏ、５マイクログラムをＦＡＢ　（高速原子衝撃 質量分析法）で分析し、ＬＰの質量を測定したところ、６，８３９質量単位を持 つ単体が検出された。即ち、ＬＰの質量は、ＣＧＲＰの質量３，９００と＃上か なり異なってい旭 ＲＰ−ＨＰＬＣを眉いて精製したＬＰ並びに合成したヒトα−ＣＧＲＰをウサギ の皮膚に投与して、両者の血管拡張効果を比較した。この比較結果を図３に示す 。ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムから得られた吸収ピークの面積に基づいて、 皮膚に注射するＬＰの量を決めた。ＰＳＥ５０μｌに溶かした所定量のＲＰ−精 製ＬＰあるいは合成ＣＧＲＰを、ウサギの背中の毛を剃った部分に注射し旭　２ 時間後（三角形）、更に、４時間後（円形）に、紅斑の面積を図っ九各棒線は、 ３回注射を行った平均値並びにＳＥを示す。２時間後に測定したところ、０．　 １ナノグラムのＬＰにより生じた紅斑面積と、５０ナノグラムのＣＧＲＰによる ものと等しかつ九更に、４時間後に測定した際には、ＣＧＲＰ注入部の紅斑はほ とんど消えており、これに対して、ＬＰの紅斑はまだ残っていた。

ＬＰの血　五　作　の Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ　Ｉｏｎ（ｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物を投与した場合に 　ウサギ大動脈環の狭窄がどのくらい緩和されるかを測定することにより、ＬＰ の血管拡張作用を調べた０図４において、Ａは、総計２００ｍｇのアドレナリン 投与、Ｓは　３匹の砂バエから抽出した唾液腺溶解物（約３０ないし４０ｎｇの ＬＰ）の投与、Ｗは、試料の水洗いを、それぞれ示す。成長したニューシーラン トウサギから胸郭大動脈を取り出した。摘出された４ｍｍ幅の大動脈環を、９５ ％０２と５％Ｃｏｔを吹き込んだタイロード液を含む３ｍｌの浴に懸架し、１ｇ の初期張力下、３７°Ｃで保存した（Ｗｅｂｓｔｅｒら：　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　２９３＋５３１−５４１　（１９７０））　。

バーバード等優性変換器に連結した壇負荷収縮性振子水準器（Ｐａｔｏｎ　：　 Ｊ、　Ｐｈｙａｉｏｌ、　Ｌｏｎｄ、　１３７：３５ｐ−３６ｐ　（１９５７） ）を用いて、収縮を測定した。４回実験を行った結果、３対の唾液腺から作製し たホモジエネート懸濁液を２．５ｍｌの環室に投与した場合、血管収縮が５０％ 以上緩和されることがわかった（平均±Ｓ、Ｅ。

：５８±８％）。実験全てに共通して、唾液腺ホモジエネート投与と緩和開始と の間に、１５ないし３０秒のタイムラグが見られた。試料を一度洗浄した後、ア ドレナリンをもう一度加えたが、処理前の収縮レベルには戻らなかった（図４参 照）、この結果から、処理効果が持続していることがわかる。ＬＰを哺乳動物の 皮膚に注入した場合に得られる紅斑の持続時間からみて、少なくとも２４時間は 、血管拡張作用が持続する、と考えられる。

二且Ｚ醸胆烈Ω因工 ＨＰＬＣで精製した。生物学的に活性なＬＰに関して、アミノ酸配列の微量決定 を行った。完全なタンパク質量のアミノ酸残基３−１３は決定できたものの、残 基１．２は決定できなかった４そこで、変性オリゴヌクレオチドを、オリゴｄＴ プライマーと共にポリメラーゼ鎖反応に用いて、約６０細胞、即ち、唾液腺一対 の１１５を含むごく小量のＬＰｃＤＮＡを、直接増幅した。この増幅されたＤＮ Ａ配列からはアミノ酸残基１．２並びに信号鎖、プロモーター等の上流配列を暗 号化する５°末端の大部分が失われていたが、このＤＮＡ配列から、アミノ酸残 基１４を暗号化するヌクレオチドが、ヌクレオチド配列３′であることがねかり た。この配列情報に基づいて、砂バエのゲノム・ライブラリーから、ゲノムクロ ーンを選択した。信号ペプチドに基づく配列を有するゲノムＤＮＡから、新しい オリゴヌクレオチドを、ＬＰ−ｃＤＮＡの翻訳されていない３”部分に由来する オリゴヌクレオチドと共に調製した４これらのオリゴヌクレオチドをプライマー として用いて、残基１及び２を含む完全な配列を暗号化するｃＤＮＡを増幅した ・その後、このｃＤＮＡの配列を、周知の技法を用いて決定した。ｃＤＮＡのヌ クレオチド配列、並びに完全なＬＰの推定アミノ酸配列を、２６ページ（英文） の配列リストの配列Ｎ０１１に示す。また、２６ページ（英文）の配列リストの 配列Ｎ００２に、１７のアミノ酸から成るペプチドのＤＮＡ配列並びに推定アミ ノ酸配列を含む、ゲノムＬＰ−ＤＮＡ配列を示す、このＬＰ−ＤＮＡ配列＃Ｌ　 ＬＰ−ｃＤＮＡ配列と一部異なっており、ＬＰ遺伝子の変種であると考えられる 。更Ｅ、ＬＰの信号配列を配列Ｎ００２に示す（ヌクレオチド１−５１）。

思想づｉｆ上金成 ＬＰペプチドは、一般的な固相ペプチド合成法により、生成される（Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ、ＦＥＤ、ＰＲＣ，Ｆｅｄ、　二　Ｐｒｏｃ、Ｆｅｄ、Ａｍｅｒ、Ｓ ａｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、２４：４４２（１９６２））　ｍ　この合成法におい てｔｉ固相担体が、成長するオリゴマー鎖のＣ末端保護基として作用する。この ため、Ｎ末端を保護されたアミノ酸あるいはペプチドが、適当な官能基を持つ可 溶性ポリマーど反応し、その結果として、Ｃ末端残基が不溶性の担体と結合する 。次に　アミノ酸あるいはペプチドに含まれるカルボキシル基の反応を誘発する ような試薬を用いて、Ｎ末端保護基を選択的にアミノアシルポリマーから外し、 Ｎ末端を保護された次のアミノ酸あるいはペプチドを前記ポリマ−に結合させる 。適当なアミノ酸あるいはペプチド誘導体を用いて、この保護基取り外しと結合 のサイクルを必要に応じて繰り返し、所望のアミノ酸配列を持つペプチドを、ポ リマー担体上に組み上げていく。配列が完成した後、より強力な試薬をペプチド ／ポリマーに加え、ペプチドをポリマーにつないでいる結合に亀裂を生じさせて 、遊離したペプチドを周知の技術で回収する。生成されたペプチドが、酸あるい はアミド基のＣ末端を持ち、更にＮ末端保護基を含むようにあるいは、含まない ように合成条件を設定することができる。

アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基等、他の反応基が存在する場 合には合成の間これを適当な方法で保護し、更にポリマーからペプチドを分離し た後も保護された状態のままに保持することが望ましい、このように所望の化合 物を得るためには、ペプチドを更に処理することが必要となる。

保護基の導入及び取り外しを含むペプチド合成は、当業者に周知の技術である（ 例えば、　「ペプチド」第３巻ニゲロス＆マイエンホツコア−著：アカデミック 出版：１９８１年参照）、固相合成に用いられる、アミノ酸あるいはペプチド合 成の出発物質あるいはその反応誘導体ｔｉ　周知の何れの化合物でもよく、ある いは、周知の化合物の調製法に頭領の方法で作製された化合物を用いてもよい。

ジシクロへキシルカルボジイミド等のイミド類を、アミノ酸あるいはペプチドの カルボキシル基に活性を与えるために、用いてもよい。

不溶性ポリマー担体としては、例えば、架橋したポリジメチルアクリルアミド樹 脂等のポリアミド樹脂、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンあるいはメチ ルベンズヒドリルアミン樹脂等の不活性マクロレテイキュラー樹脂を用いること ができる。

本発明の化合物は、次の２種類のいずれかの方法に従い、調製される。第一の方 法は、ｔ−ブトキシカルボニル基を保護基として合成サイクルに用いる、ＢＯＣ 法である。ＢＯＣ保護基は、トリフルオロ酢酸及びジクロロメタンを用いて、選 択的に取り外される。合成サイクルが終了した後、フッ化水素並びにアニソール で処理することにより、ペプチドを樹脂から外す。第二の方法は、フルオレニル メトキシカルボニル基を用いるＦＭＯＣ法である。このＦＭＯＣ基＃上　２０％ ピペリジンを含むジメチルホルムアミド溶液を用いて取り外される。第二の方法 では合成終了後、トリフルオロ酢酸及びアニソールを用いて、ペプチドを樹脂か ら外す。

カルシトニン並びにＣＧＲＰは、そのＣ末端に活性に必要なアミド基を備えてい る。ＬＰをアミド化する必要がある場合に＃上上述の固相合成で用いられた分離 条件の内適当な条件を選択して、アミド化すればよい。例えば、メタノールとア ンモニアを用いることにより、一段階の処理で、化合物を担体から取り外し、且 つアミド化することができる。あるいは　Ｃ末端にカルボン酸を備えたペプチド が作製されるように分離条件を選択した場合に更にアミド基が必要であれば、周 知の手段でアミド化すればよい。例えば、Ｃ末端の前末端残基がロイシンの場合 にｌ九　カルボキシペプチダーゼＹで酵素処理すればよい、また、前末端残基が グリシンの場合には、アミド化酵素を用いる（Ｂｒａｄｂｕｒｙら：　Ｎａｔｕ ｒｅ　２９８：２４０−２４４（１９ｇ２））か、あるいは、ペプチドをアンモ ニア等で化学処理してもよい。固相合成の代わりに液相ペプチド合成技術を用い て、ＬＰペプチドを調製してもよい。

旦シ正■はユ處 ＬＰのアミノ酸配列がわかれば、周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＬＰタンパ ク質を生成することができる。例えば、オリゴヌクレオチド合成を行い、更に必 要があれば、それに続いて、完全に暗号化された部分を形成するように結紮を行 うことにより、前記アミノ酸配列を暗号化する遺伝子あるいはその類似体を調製 することができる。暗号化部分は、必要に応じて、ポリＡ部位、プロモーター、 リボゾーム結合部位、終結及び開始コドン等を含む３°及び５′の非翻訳ＤＮＡ 部分に結紮される。宿主ポリペプチド及びＬＰポリペプチドを暗号化するＤＮＡ を含む融合ＤＮＡを用いて、ＬＰポリペプチドを含む融合タンパク質を生成させ ることができる。所定の細胞型内部でＬＰ生成物を生成させる場合には当業者に 周知の方法で、表出ベクターの最適な構成を決めればよい。形質変換された細胞 を培養することにより、必要に応じて、精製さね改組さね後翻訳されるように修 飾されたタンパク質が、細胞内に蓄積され６あるいは、分泌される。

ヨ吏似び鰻酒用 ゛のマーカーとして、マクロファージによる゛・　イ　を、定する健康体の白血 球を泳動させることで得られた単核細胞をフィコール−ヘパリン及びパーコール （Ｐｈａｒｍａｃｉｉ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）勾配を利用して精製 し、５％の正常なヒト血清プール及び１％のゲンタマイシン（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｗａｌｋｉｎｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を加えた、ＲＰＭ　Ｉ− １６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　Ｉａｌａｎｄ、　ＮＹ）を含むミクロタイ ター（微量滴定）容器（５Ｘ１０’／容器）内に注入した。エステラーゼ染色に より、得られた細胞が９５％マクロファージよりも大きいことがわかった（マク ロファージ法のマニュアル：　Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚら：　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅ ｋｋｅｒｉｉ集：　ＮＹ、　９．１９９（１９８１）参照）、−日培養した後、 非付着細胞を洗い落とし、マクロファージをヒトＣＧＲＰ、カルシトニン、ある いはＬＰを用いて、後述のように処理した。

処理後、マクロファージを１００ないし４００ユニット濃度のインターフェロン ガンマ（Ａｍｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　Ｏａｋｇ 、　ＣＡ）を用いて、１５％の正常なヒト血清プールを含む媒体中で、３日間イ ンキュベートし、細胞体の過酸化水素濃度を測定した。

マクロファージによる過酸化水素の生成を、発蛍光団スコボレチンを用いて。

蛍光光度検定法で測定した（ｄｅ　ｌａ　Ｈａｒｐｅら：　Ｊ、　Ｉｎｒｍｕｎ ｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７８：３２３　（１９８５）参照）、マクロファージ を含む容器を洗浄し、スコボレチン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏａｉｓ、ＭＯ ）、ＰＭＡ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）、ホースラデイツ シｚ’ベロキシダーゼ（ＨＲＰＯ）　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　 ＭＯ）緩衝液を用いて、９０分間インキュベートした。ＰＭＡに誘起されて、活 性化マクロファージが過酸化水素を放出する。放出された過酸化水素は、ＨＲＰ ○触媒下で、スコボレチンを酸化し、非蛍光物質を生成する。培養細胞１株通り の放出過酸化水素量を、ナノモル単位で測定する。培養細胞株毎の細胞数の変動 を調整するためにデータを培養細胞１株当りのＤＮＡ　（μｇ）量に標準化した ４即ち、全てのデータは、放出された過酸化水素量（ナノモル）／ＤＮＡ　（μ ｇ）／時間で表される。ＤＮＡｆ＋！蛍光検定法で測定された。

ＣＧＲＰによるマクロフ　−ジ　能の阻ヒトマクロファージ単分子層を、様々な 濃度のヒトＣ０ＲＰで、３時間、前処理した後、ＩＦＮ−γ（１０ｏないし４０ ０ユニツト／ｍｌ）を７２時間作用させて、活性化した。細胞が生成する過酸化 水素の量を上述の方法で測定した４図５の棒線＃Ｌ培養細胞３株当りの平均過酸 化水素生成量±ＳＤ（標準偏初を示す。Ｃ０ＲＰ処理群の各々で測定された平均 過酸化水素応答を、ＩＦＮ−γで刺激はしたがＣ０ＲＰで処理しなかった正対照 培養細胞における過酸化水素応答と比較することにより、ｐ値をめた。４回繰り 返して測定を行ったが、同様の結果が得られ九以上の結果から、ＣＧＲＰには、 ＩＦＮ−γ刺激に応答してマクロファージが過酸化水素を生成する機能を、著し く阻害する作用があることがわかった（図５参照）。ＣＧＲＰは、２．５ｘｌＯ −９Ｍという低い濃度でも、マクロファージの過酸化水素生成を著しく阻害し、 高濃度で＃丸完全に過酸化水素の生成を抑制した（図５参照）。図５は、マクロ ファージを刺激する最適濃度である、２００ユニツト／ｍｌのＩＦＮ−γを用い た場合の結果である。が、投与量を変えても同様の結果が得られた。ＩＦＮ−γ 濃度が１００ユニツト／ｍｌ以下である場合にも、マクロファージによる過酸化 水素生成レベルはバンクグラウンド値とは有意に異なっていた。

カルシトニンによるマクロファージ１能の阻ヒトマクロファージを、図６に示さ れる量のＣＧＲＰ　（△）あるし１はカルシトニン（Δ）で、３時間ブレインキ ュベート処理し、上述のＣ０ＲＰと同様の方法で処理した。細胞を洗浄した後、 ＩＦＮ−γ（２００ユニツト／ｍｌ）を加えた。

３日間のインキュベートの後、過酸化水素生成量を測定した４棒線は、培養細胞 ３株当りの平均過酸化水素生成量±ＳＤ（標準僑船を示す。ＣＧＲＰとカルシト ニンの分子量はほぼ等しいため、１．ＯＯＯｎｇ／ｍｌ　（２，５ｘｌＯ−’Ｍ 濃度）のＣＧＲＰ並びにカルシトニンを用いた。この結果、カルシトニンは、Ｃ ＧＲＰとほぼ同じ程度に、マクロファージによる過酸化水素生成を阻害すること がわかった（図６参照）。

ＬＰによるマクロフ　−ジ　の阻害 ヒトマクロファージを、ＬＰあるいは媒体を含む様々な量の砂バエの唾液腺溶解 物で、３時間前処理した４唾液腺溶解物を洗い落とした後、ＩＦＮ−γ（２００ ユニット／ｍ　ｌ　）を加え、細胞を活性化した４　３日後、ＩＦＮ−γに応答 してマクロファージ細胞が生成した過酸化水素量を、培養細胞１株当りのｐＭＨ ２０□土ＳＤ（標準偏差）として、測定した。培養細胞株毎の細胞数の変動を調 整するためにデータを培養細胞１株当りのＤＮＡ　（μｇ）量に標準化し旭　Ｉ ＦＮ−γに誘導されたマクロファージの過酸化水素生成応答に対する阻害結果を 、下記の表に示す。

表４ １処　刺激　店　ＭＨＯＤＮＡ なし　なし　２ｏ±６ 唾液（ｌμｇ／ｍｌ）　なし　２０＋０なＬ　ＩＦＮ−ｙ　７２０＋１９０ なし　唾液（ｌμｇ／ｍｌｌ　１１７０土８ｏ＊＋ＩＦＮ−γ 唾液（ｌμｇ／ｍｌｌ　ＩＦＮ−ｙ　８０±６０なし　唾液（５００ｎｇ／ｍｌ ）　９６０±１２０本＋４ＦＮ−γ 唾液（５００ｎｇ／ｍｉｌ　ＩＦＮ−ｙ　１９０±１１０＊：溶解物による前処 理を行っていないため、ＩＦＮ−γにより誘導される過酸化水素応答が阻害され ない。

ＣＧＲＰによるマクロファージの　７産　能の阻害○ＶＡ特異性Ｔ細胞系をＢＡ ＬＢ／ｃネズミで生成した（Ｔｉｔｕｓら：　Ｓ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、１３３＋１５９４　（１９８４））。生成された細胞系はＬ３Ｔ４・であり 、断続的に刺激を与えられて、生体外で保存された。　（Ｋｉｍｏｎｏら’　Ｊ 、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ＋１．１５２ニア５９　（１９８０））。

抗原産生細胞源として、ＢＡＬＢ／ｃ腹膜細胞（Ｔｉｔｕｉら：　Ｃ１１ｎ、　 Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

５５：１５７．１９８４）を、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、　Ｌａｕａ ｎ、　ＵＴ）を加えた、デュルベツコ修飾イーグル媒体（ＤＭＥＭ）　（Ｍａｒ ｙａｎａｋｉら：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｂｌｌｍｕｎｏｌ、　１２：４０１（１９ ８２））を含むミクロタイター容器（１０’／容器）に注入し、−晩培養した、 非付薯細胞を容器から洗い落とし、ラットのＣＧＲＰ　（１，２５Ｘ１０−７Ｍ ）を含む、あるいは、含まない媒体を加え、３時間ブレインキュベートした。３ 時間後、容器を洗浄し、Ｃ０ＲＰを除き、所定数のＯＤＡ特異性Ｔ細胞（Ｓｉｇ ｍａ、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉａ、　ＭＯ）を加え札所定時間経過後、１μＣｉ’Ｈメチルチミジン（ ”ＨＴｄＲ）　（＾ｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｇ、 　ＩＬ）を容器に注入し、チミジン取り込みを測定した（Ｔｉｔｕｓら：　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３３：１５９４　（１９８４））　。

ＢＡＬＢ／Ｃ腹膜マクロファージ（１０４／容器）を抗原産生細胞として用いた 。

前記マクロファージを１．２５ｘｌＯ−７ＭのラットＣ０ＲＰで３時間ブレイン キュベートした後、ＣＧＲＰを洗い落とした４次に、Ｃ０ＲＰ処理されたマクロ ファージの抗原産生能力（Ｔ細胞の増殖率として示される）を測定する目的で、 ＯＶＡ特異性Ｔ細胞並びにＯＶＡを培養細胞に加え旭　４８時間後、３ＨＴｄＲ を培養細胞に加え、Ｔ細胞の増殖率を測定した。下記の表の数値ｉ九培養細胞４ 株当りの平均チミジン取り込み量±ＳＤ（標準偏幻を示す、パックグラウンド（ マクロファージ十Ｔ細胞：○ＶＡを含まないもの、あるいは、Ｔ１ｇ胞＋ＯＶＡ ：マクロファージを含まないもの）値は、３００ないし５００ＣＰＭの範帥であ った４様々な数（１０３ないし２Ｘ１０’／容器）の腹膜細胞マクロファージを 用いて測定を行ったが、同じ様な結果が得られ九表に示す結果から、ＣＧＲＰが 、○ＶＡ特異性Ｔ細胞系に対する、ネズミマクロファージのＯＶＡ産生を阻害す ることがわかる。Ｔ細胞の数及び培養細胞を刺激するＯＶＡの投与量を変化させ た場合にも、同様の結果が得られた。ＣＧＲＰはマクロファージの抗原産生を阻 害するが、この場合、単にＯＶＡ特異性Ｔ細胞の応答速度を遅くするだけではな い。

これは、２日間培養した場合にも、Ｔ細胞の増殖が同じように阻害されたことか らも、明かである。

（プレインキュ２００ｍｒ／ｍ１ＯＶＡ　４００＋＋＋ｒ／ｍ１ＯＶＡベートし た） 媒体　１５，０００　５，７］０＋１．３００　８．４５０＋１，１４０ＣＯＲ Ｐ　１５．０００　１，６２０＋　９１０　２．６２０＋　７００媒体　３０， ０００　５，２３Ｏｆ！、１５０　１０．９７０＋　８００ＣＯＲＰ　３０，０ ００　８３０＋　５００　３．３８０＋］、８７０ＬＰによるマクロフ　−ジの 　産　能の阻害ＣＧＲＰと同様の操作を行う。ＢＡＬＢ／ｃ腹嘆マクロファージ （２Ｘ１０’／容器）を媒体のみ（正対照）、あるいは、ＬＰを含む所定濃度の り、　１ｏｎＨｉｐａ崩３唾液腺溶解物で、３時間、ブレインキュベートした後 、洗浄した。２Ｘ１０’のリーシュマニア・メジャー特異性Ｔ細胞及び２Ｘ１０ ４のリーシュマニア・メジャーを培養細胞に加えた４　２４時間後、培養細胞に ３Ｈを加えて、Ｔ細胞の増殖率を測定した。下記の表の数値は、培養細胞３株当 りの平均チミジン取り込み量±ＳＤ（標準偏差）を示す。

マクロファージ　応答　パーセント （プレインキュ　（３ＨＴｄＲ阻害 ベートした）　平均取り込み量） 媒体　２０６５±６２１　Ｎ／Ａ １腺／ｍ１　７２６±４６０　６５ ０、　２腺／ｍ］　１００２±９０１　５１０．０５腺／ｍ１　１８８２±３９ ５　９配因盈？上 配列ＩＤＮｏ、：　１ 配列型：　対応するアミノ酸連鎖を伴うヌクレオチド連鎖配列長さ＝　３１５ 分子型：　ｃＤＮＡ τＧτ　Ｇλτ　ＧＣ入　λＣ入丁ＧＣＣ入五人Ｔτ　ＣＧＣλλＧＧＣ丁）Ｃ ＣＡτλ　Ｇ入τ　ＧλＣ丁ＧＣＣＡＧＡＡ０　４８Ｃｙｓ　入ｇｐ　入ユａτ ｈｒ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｐｈｓ　入ｒｇ　ＬＦＩＩ　入ユａ　Ｚｌｍ　入ｓｐ　 入ｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌ！ｌ　ｒｌAｙｓ ＣＡＧ　ＧＣＧ　Ｃｕｄ　Ｃλ丁ＡＧＣＪＪｄ　σＴτ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　入Ｃ 丁　ＴＣτ　Ｃ丁入　Ｃλ入五人λ　入Ｃτ　ＧＣ入　９６Ｇｌｎ　λユａ　ｌ １ｕｓ　Ｈｌｓ　Ｓａｒ　入ａｎＶａ１　Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　マ ａｌ　Ｇｌ！１　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入ユ■ 入Ｃ入丁τＣλＣ入　丁Ｃ五人τＧＧ入τ　入ｃｃ　Ｔｃｃ　ｃ入入　Ｃ！λ　 ｃｃτ　ＧＧλλ入〒　λＣτ　ＣＩＣ丁τＣ１４４Ｔｈｒ　Ｐｂ＠　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｍａｔ　Ａｊｐ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌ！Ｉ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ 　ｋｌＢ　５６１：　ＶａＩＰｂ■ λ入入　Ｇ入入五人σｒ　入？Ｇ　入λＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　λ五人　五人ＧＧ 入λ　ｆｆτ　五人ＧＧＣ人　００人　λλＧ　τＡ相　１X２ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌ！ｌ　Ｌｙｓ　１．１ｙｙｒ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　！’ｈｅ　Ｌｙｓ　入１ａＧユｙ　Ｌｙｓ黒　３１５ 配列ＩＤＮｏ、：　２ 配列型：　ヌクレオチド連鎖 配列長さ＝　２４３ 分子型：　ゲノムＤＮＡ 入τＧ　五人入　τ入τ　ＧＣＴ　τ丁入　五人τ　λ入ｒ　ＣＴＣＣ入τ　ｍ ｃττ　Ｇτ入　ＧλＣσｒ丁　ＧＣＴ　ＧＡＡ　４８Ｎｅｔ　Ｌ７１　Ｔｙｒ 　ｋｒ　Ｌ＠ｕ　入ｊＸｌ　入ａｎ　Ｌ書ｕ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｋａｕ　ｖａｌ 　入ｓｐ　Ｖａｌ　入ユａ　ＧｌｕＧＧＣＴＧＴ　Ｇｕ　ＧＣＡ　ＪｉＣＡ　Ｔ ＧＴ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＧＣλ入Ｇ　ＧＣＣＪｄＡ　ＧＡＡ　Ｇ入ＣＴＧＣＡ ＧＧ　９６Ｇｌｙ　Ｃｙｇ　ｌａｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｍ　Ｇｌ！Ｉ　Ｐｈ ｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｍ　ｕａ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　）、ｓｐ　Ｃｙｓ　）ｓ■ 入五人　五人Ｇ　ＧＣＧ　Ｃ入τ　Ｃλτ　入ＧＣＧ入τ　Ｃττ　ττＧＣ入 Ｇ　入Ｃ！丁Ｃτ　στ入　Ｃλ入　λＣ入　入Ｃτ　１４S Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　入ユａ　Ｈｉｓ　！！１ｓ　Ｓ＠ｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ！ｌ　Ｔｈｒ　τ■■ ＧＣＡ　ＡＣＡ　’ｌ”ｌ”ｒ　ＡＣＡ　Ｔｅｌ　Ａ！Ｇ　に入τ　Ａｃｅ　Ｔ ＣＣＣＪｕ　ＣＴＡ　ＣＣｒ　ＧＡＡ　入Ｇｒ　ＧσＴＧＴ秩@！９２ 人１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ｍｅｔ　入ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｎ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＶａｌＴｒＣ五人入　ＧＡ Ａ　ＴＣＣ入τＧ　λ入ＣＧλＧ　五人入　ＯＣＴ　入λＧＧ人入τ丁τ　λＡ ＧＧＣ人　ＧＡＡ　五人Ｇ　２４０Ｐｈｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｍａｔ　 Ｌｙｓ　Ｇｌ＋ｚ　Ｌｙｓ　入ユａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｍ　Ｐｂ＠　Ｌｙｓ　入ユａ 　Ｇｌｙ　［、凾■ τ入Ｇ　２４３ 本発明は、その要旨あるいは基本的な特徴から逸脱することなく、他の様々な態 様で実施できる。即ち、上述の莫施例は、本発明を何ら限定するものではなく、 本発明の詳細な説明するものに過ぎない。本発明の要旨は、以下の特許請求の範 囲に記載されるが、前記請求の範囲に明確に記載されていなくても、前記範囲内 であると考えられる変化変更は、本発明の要旨に含まれる。

（ＬＬＩ６１７り募γ殆 （ｔｕＪｏ）尉朋頂］ ＦＩＧＵＲＥ　４ 二二−ロベブチド濃度 ＦＩＧＵＲＥ　６ 国際調査報告 ＋−＋−１ｈ−−＋　ａ、、（、−−−、−ｔｅａ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０ ３７４６フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７１０２　 ＡＢＲ８３１４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５１０８　８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　１５／ １２ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／　Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｎ　 ９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　９９：００　８３１８−４Ｈ（７２）発明者　リモー ルド　ハインツ　ジー。

アメリカ合衆国　０２１４６　マサチューセッツ州　プルツクリン、クリントン ロードＩ （７２）発明者　リベイロ　ホセ　エム。

アメリカ合衆国　０１８９０　マサチューセッツ州　ウィンチェスタ−、シルベ スタ−コート　５ （７２）発明者　タイタス　リチャード　ジー。

アメリカ合衆国　０２１９２　マサチューセッツ州　ニードハム、コルビー　ス トリート

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　Ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物から得 られ、哺乳動物の血管拡張を促す作用を有することを特徴とする、純粋タンパク 質あるいはその活性断片。
2. ２．質量分析により測定された分子量が６，８３９ダルトンである、ことを特徴 とする請求項１のタンパク質。
3. ３．逆相高速液体クロマトグラフィーでカラムにアセトニトリル−水−トリフル オロ酢酸溶出液を用いて分離した場合、ＣＧＲＰよりも先に溶出される、ことを 特徴とする請求項１のタンパク質。
4. ４．動物皮膚の紅斑誘発により測定した血管拡張作用が、少なくともＣＧＲＰの ８０なレ、し１００倍である、ことを特徴とする請求項１のタンパク質。
5. ５．前記砂バエの唾液腺内の総タンパク質の約１％である、ことを特徴とする請 求項１のタンパク質。
6. ６．砂パエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｉｎｇｉｐａｌｔｉｓの唾液線溶解物あるい は薬学的に同等なキャリアから得られる血管拡張性タンパク質あるいはその活性 部位を含む、ことを特徴とする組成物＞
7. ７．砂パエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｏｎｇｉｐａｌｔｉｓの唾液腺溶解物から得 られマクロファージの機能を阻害する、ことを特徴とするタンパク質。
8. ８．質量分析により測定された分子量が６，８３９ダルトンである、ことを特徴 とする請求項７のタンパク質。
9. ９．逆相高速液体クロマトグラフィーでカラムにアセトニトリル−水−トリフル オロ酢酸溶出液を用いて分離した場合、ＣＧＲＰよりも先に溶出される、ことを 特徴とする請求項７のタンパク質。
10. １０．前記砂バエの唾液腺内の総タンパク質の約１％である、ことを特徴とする 請求項７のタンパク質。
11. １１．請求項１のタンパク質の活性部位配列を複製することが可能なアミノ酸配 列を含む、合成タンパク質あるいはペプチドで、哺乳動物の血管拡張を促す作用 を持つことを特徴とする、合成タンパク質あるいはペプチド。
12. １２．請求項７のタンパク質の活性部位配列を複製することが可能なアミノ酸配 列を含む、合成タンパク質あるいはペプチドで、哺乳動物の免疫系を一時的に抑 制する作用を持つことを特徴とする、合成タンパク質あるいはペプチド。
13. １３．宿主細胞内での組換えＤＮＡの表出により得られる、ことを特徴とする請 求項１１あるいは１２のタンパク質。
14. １４．化学ペプチド合成により得られる、ことを特徴とする請求項１１あるいは １２のタンパク質。
15. １５．配列リストに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、血管拡張 性タンパク質。
16. １６．砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物から 得られる血管拡張性タンパク質あるいはその活性断片を暗号化する、ことを特徴 とする核酸。
17. １７．配列リストに示されるヌクレオチド配列を有する、ことを特徴とする、血 管拡張性タンパク質暗号化ＤＮＡ。
18. １８．請求項１７のＤＮＡを含む、ことを特徴とする表出ベクター。
19. １９．請求項１８の表出ベクターで変換される、ことを特徴とする細胞。
20. ２０．請求項１のタンパク質の信号配列を暗号化するＤＮＡ。
21. ２１．配列リストの配列番号２番のヌクレオチド１−５１に対応するヌクレオチ ド配列を有する、ことを特徴とする請求項２０のＤＮＡ。
22. ２２．哺乳動物の循環系の血流を増進させる方法で、請求項１あるいは１１のタ ンパク質を適量哺乳動物に非経口投与して、血管拡張を促す、ことを特徴とする 血流増進方法。
23. ２３．局所的に血管床の血流を増進させる方法で、請求項１あるいは１１のタン パク質を適量血管床に局部的に適用して、血管拡張を促す、ことを特徴とする局 所的血流増進方法。
24. ２４．免疫原の刺激に対する哺乳動物の反応性を減じる方法で、ＣＧＲＰを含む タンパク質、カルシトニン、請求項７のタンパク質、請求項１２のタンパク質、 あるいはその混合物を適量非経口投与して、免疫原に曝されている間、哺乳動物 の免疫系を一時抑制する、ことを特徴とする方法。
25. ２５．前記タンパク質を繰り返し投与することにより、免疫抑制時間を延長する 、ことを特徴とする請求項２４の方法。
26. ２６．前記タンパク質を、対象となる哺乳動物とは異質の源から得た免疫原と共 に投与する、ことを特徴とする請求項２４の方法。
27. ２７．前記タンパク質を、ストレプトキナーゼと共に投与する、ことを特徴とす る請求項２４の方法。
28. ２８．前記タンパク質を、ネズミのモノクロナール抗体と共に投与する、ことを 特徴とする請求項２４の方法。
29. ２９．哺乳動物の免疫抑制を促す作用のある、砂バエＬｕｔｚｏｍｙｉａ　ｌｏ ｎｇｉｐａｌｐｉｓの唾液腺溶解物から得られるタンパク質を適量哺乳動物に投 与する、ことを特徴とする免疫抑制方法。