JP2000511417A

JP2000511417A - Ｄ異性体のアミノ酸を含む免疫調節化合物

Info

Publication number: JP2000511417A
Application number: JP09542375A
Authority: JP
Inventors: クレイバーガー，カロル; エム．クレンスキー，アラン
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブレランドスタンフォードジュニアユニバーシティ
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 2000-09-05
Also published as: AU3115497A; EP0939643A4; WO1997044052A1; US6436903B1; CA2258698A1; AU712040B2; EP0939643A1

Abstract

(57)【要約】免疫調節活性を有する化合物であって、ペプチドタイプ化合物、またはその改変体もしくはフラグメントであり、これは、30アミノ酸までの、そのＮ末端アシル化ならびにＣ末端アミド化またはエステル化形態を含み、ここで該ペプチドタイプ化合物が以下の式を含む：（ａ）R aa^76-77L aa^79-84または（ｂ） aa^84-79L aa^77-76Rここで、aa⁷⁶は、EまたはVであり；aa⁷⁷は、D、SまたはNであり；aa⁷⁹は、RまたはGであり；aa⁸⁰は、IまたはNであり；aa⁸¹は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；aa⁸²は、RまたはLであり；aa⁸³は、GまたはRであり；そしてaa⁸⁴は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；ここで、この化合物において、アミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ異性体である、化合物は、単独または免疫抑制薬と組み合わせて用いられ、ＣＴＬ活性化（特にトランスプラントに関連したＣＴＬ活性化）を減少させる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｄ異性体のアミノ酸を含む免疫調節化合物技術分野本発明は免疫調節に関する。背景免疫系は、病原性生物および異常常在細胞（例えば、新生物形成のような）に対する哺乳動物宿主の防御において重大な役割を果たす。細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）が防御機構に含まれ、これは、病原性生物による細胞の感染および新生物細胞の存在をモニターするように働く。これはまた、宿主とは異なる主要組織適合性複合体レパートリーを有する細胞を攻撃する。特定の条件下では、ＣＴＬは、常在細胞を攻撃し、自己免疫疾患と呼ばれる疾患群を生じる。トランスプランテーションおよび自己免疫疾患については、ＣＴＬが組織に攻撃することを阻害し得ることが望まれる。今日、たいていは、ＣＴＬを抑制するために免疫抑制剤が用いられ得るが、これは一般に免疫系を衰弱させる。結果として、患者は、偶発的な感染、ならびに薬物（例えば、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６）から生じる多数の副作用によりずっと罹りやすくなる。したがって、トランスプランテーションの場合および自己免疫疾患における免疫攻撃を阻害するための代替方法であって、この阻害がより特異的であり、副作用がより少なくなり、そしてより長く持続し得る方法を提供することに、かなりの関心が寄せられている。関連文献 Claybergerら、J.Exp.Med．（1985）11:1709-1714は、ＨＬＡ−Ａｗ６８およびＡｗ６９と比較したＨＬＡ−Ａ２抗原を記載している。Townsendら、Cell，（ 1986）44:959-968は、ＣＴＬが、ヘルパーＴ細胞と同様にして、変性または分解したタンパク質のセグメントエピトープを認識することを示唆している。Holmes およびParham、EMBO J．（1985）4:2849-2854は、ＨＬＡ−Ａ２、Ａｗ６８およびＡｗ６９の関係を記載している。特に、ＣＴＬ標的特異性がヒトクラスＩ分子の構造における変化に極度に感受性であることが教示されている（DurnaおよびPea se、Transplantation，（1986）41:279-285；Biddisonら、J.Immunol．（1980） 124：548-552；Spitsら、Immunogenetics．（1982）16:503-512；Gastonら、J.E xp.Med.（1983）158:280-293）。ＣＴＬによる認識に影響する変異体がマウス（Nathensonら、Ann.Rev.Immunol ．（1986）4:471-502；Schulzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:2007-201 1）およびヒト（Krangel、Biochemistry（1982）21:6313-6321；Krangelら、J.I mmunol．（1983）130:1856-1862；Cowanら、J.Immunol．（1985）135:2835-2841 ;Taketaniら、（同上）（1984）133:816-821；およひVegaら、Proc.Natl.Acad.S ci.USA（1985）82:7394-7398）において研究されている。これらの報告は、残基１４７から１５７の間の領域にかなりの関心を集めているが、他の領域もまた機能的差異を生じ得る（Ezquerraら、J.Immunol．（1985 ）134:2727-2733）。可変部のクラスターが、第１の細胞外ドメインのカルボキシ末端および第２の細胞外ドメインのアミノ末端で報告されている（Waysら、J. Biol.Chem．（1985）26：11924-11933）。全てのクラスＩ分子の残基１０５〜１０８の配列が、フィブロネクチン結合テトラペプチドの配列に関連し（Auffray およびNovotny、J.Human Immunologyz（1986）15:381-390）、いずれの向きのテトラペプチドも細胞結合特性を有することが見出されている（PierschbacherおよびRuoslahti、Nature（1984）309:30-33；YamadaおよびKennedy、J.Cell.Biol ．（1985）28:99-104）。ＨＬＡ−Ａ２の単一モノクローナル抗体規定エピトープに影響する１０７位での置換が、Salterら、J.Exp.Med．（1987）166:283-288 によって報告されている。同時係属中の米国特許出願第08/222,851号（1994年４月５日に出願）およびPC T出願US95/04349（1995年４月５日出願）はそれぞれ、クラスＩのＭＨＣペプチドを開示している。これは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を調節する。同時係属中の米国特許出願第07/844,716号（1992年３月２日出願）およびPCT出願US93/01758（1993年３月２日出願）はそれぞれ、ＨＬＡペプチドによるリンパ球活性調節を開示している。上記各特許出願の完全な開示は、本明細書中に参考として援用される。発明の開示宿主またはインビトロにおいて、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）が細胞に望ましくない攻撃をすることを阻害する、免疫調節のための方法および組成物が提供される。本発明の組成物は、アミノ酸の非天然の「Ｄ」型を含むが、驚くべきことに、これらの組成物は、免疫系を調節することにおいて生物学的活性を示す。非天然の「Ｄ」型を含むことは、このことによって組成物がインビボでの分解をより受けにくくなるため、好都合である。組成物は、ペプチドタイプ化合物、改変体またはフラグメント（３０アミノ酸までの、そのＮ末端アシル化およびＣ末端アミド化またはエステル化形態を含む）である、免疫調節活性を有する化合物を含む。ここでペプチドタイプ化合物は以下の式を含む：Ｒａａ^76-77Ｌａａ^79-84 またはａａ^84-79Ｌａａ^77-76Ｒここで、ａａ⁷⁶は、ＥまたはＶであり；ａａ⁷⁷は、Ｄ、ＳまたはＮであり；ａａ⁷⁹は、ＲまたはＧであり；ａａ⁸⁰は、ＩまたはＮであり；ａａ⁸¹は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；ａａ⁸²は、ＲまたはＬであり；ａａ⁸³は、ＧまたはＲであり；そしてａａ⁸⁴は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；ここでアミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ異性体である。この組成物は、インビトロおよびインビボでの免疫調節のために有用である。本発明を実施するための態様本発明によれば、クラスＩＨＬＡ−Ｂα₁ドメインに存在する配列を、少なくとも一部分共有するＣＴＬ免疫調節組成物が提供される。ここで、この配列は、少なくとも６アミノ酸からなる。この組成物は、天然に生じるＨＬＡ−Ｂα₁ドメインの配列とは、ペプチドの活性に有害に影響しないアミノ酸置換を有する点で異なり得、そして少なくとも１つのＤ異性体を含むにちがいない。化合物は、ほとんど、ＨＬＡ−Ｂ配列の７９位〜８４位に見出される６アミノ酸配列に基づくが、ＨＬＡ−Ｂの６０位〜８４位のアミノ酸と関連するアミノ酸を含み得、そして縦列反復および/または無関係な配列伸長部を含み得る。上記のアミノ酸配列は、１またはそれ以上の天然に存在するＨＬＡ−Ｂ組成物の示された位置に存在するアミノ酸を提供する。しかし、周知のように、活性を保持しながらの保存的アミノ酸置換は、許される。本発明の化合物は、免疫調節活性を有し、そして３０アミノ酸までを有する。これらは、以下の式に基づく：Ｒａａ^76-77Ｌａａ^79-84 またはａａ^84-79Ｌａａ^77-76Ｒ。ここで、ａａ⁷⁶、ａａ⁷⁷およびａａ^79-84は、上記の定義のとおりである；しかし、本発明の化合物はまた、免疫調節活性を保持する、改変体およびフラグメントを含む。本発明のすべての化合物において、少なくとも１つのアミノ酸は、Ｄ異性体である。好ましくは、すべてのアミノ酸がＤ型である。驚くべきことに、これらのペプチド様化合物は、その立体化学が標的生物に対して珍しくあっても、免疫調節活性を保持する。確かに、いくつかの化合物は、対応するジアステレオマーまたはエナンチオマーより効果的である。いくつかの化合物は、実質的に純粋な形態で調製され得る。本明細書で使用される場合、用語「実質的に純粋」とは、通常、ペプチドが天然に関連し得る物質の約７０％以上を含まない、好ましくは、これらの物質の約８０％以上を含まない化合物の調製物を意味する。しかし、「これらの物質」には、薬学組成物の調製においてペプチドと混合され得る物質は含まれない。「ペプチドタイプ」の化合物とは、アミノ酸配列から誘導された化合物を意味する。しかし、ここで、随意に、１つまたはそれ以上のペプチド結合が、本明細書において以下にさらに記載される等量式によって置換される。したがって、「ペプチドタイプ」化合物は、等量式が存在するペプチドおよび化合物を含む。「免疫調節活性」とは、化合物が、以下の実施例１に示される細胞傷害性アッセイにおいてＣＴＬ媒介性溶解を阻害すること、および/またはその実施例において記載されるアッセイに従って抗ＣＤ３に対して精製Ｔ細胞の増幅を阻害することを示され得ることを意味する。本発明の化合物はまた、「改変体」、すなわち、その化合物の免疫調節活性を破壊しない保存的置換によって、上記に具体的に示したものとは異なるペプチドタイプ化合物を含む。改変体に関しては、「保存的置換」とは、置換されるアミノ酸の一般群と同じ一般群のアミノ酸が、そのアミノ酸と置き換わることを意味する。置き換わるアミノ酸は、遺伝子にコードされてもよく、されないくてもよい。これらはまた、適切な場合、ＤまたはＬ異性体のいずれも含み得る。したがって、保存的置換は、以下に規定する群内での置換である：酸性：この残基は、生理学的ｐＨでのＨイオンの喪失に起因して負電荷を有し、そしてこの残基は、それが含まれるペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中にある場合、このペプチドのコンホメーション中の表面位置を探し求めるように、水性溶液により引き寄せられる。塩基性：この残基は、生理学的ｐＨでのＨイオンとの会合に起因して正電荷を有し、そしてこの残基は、それが含まれるペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中にある場合、このペプチドのコンホメーション中の表面位置を探し求めるように、水性溶液により引き寄せられる。疎水性：この残基は、生理学的ｐＨで荷電しておらず、そしてこの残基は、それが含まれるペプチドが水性媒体中にある場合、このペプチドのコンホメーション中の内部位置を探し求めるように、水性溶液により排斥される。中性/極性：この残基は、生理学的ｐＨで荷電していないが、この残基は、それが含まれるペプチドが水性媒体中にある場合、このペプチドのコンホメーション中の内部位置を探し求めるに十分には水性溶液により排斥されない。この記載はまた、特定のアミノ酸を、「小さい」として特徴付ける。なぜなら、これらの側鎖は、たとえ、極性基を欠いても、疎水性を与えるに十分大きくないからである。「小さな」アミノ酸とは、少なくとも１つの極性基が側鎖に存在する場合、カルボキシルを含めて４つ以下の炭素を有するアミノ酸であり、そしてそうでない場合３つ以下の炭素を有するアミノ酸である。もちろん、個々の残基分子の実質的な集団において、いくつかの分子が荷電し、いくつかの分子が荷電しておらず、そして、より大きなもしくはより小さな程度の、水性媒体への引力もしくは排斥力が存在することが理解される。「荷電した」の定義に適合させるため、かなりの割合（少なくとも約２５％）の個々の分子が、関連するｐＨで荷電している。極性もしくは非極性としての分類に必要とされる引力または排斥力の程度は、任意であり、したがって、本発明によって具体的に企図されるアミノ酸は、一方または他方として分類された。具体的に命名されないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動に基づいて分類され得る。アミノ酸残基は、環式もしくは非環式、および芳香族もしくは非芳香族といった、残基の側鎖置換基に関して自明の分類にさらに細かく分類され得る。天然に生じるタンパク質アミノ酸については、上記のスキームに従う細分類は、以下の通りである；酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン小さいグリシン、セリン、アラニン、スレオニン、システイン極性/大きいアスパラギン、グルタミン疎水性チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン遺伝子によりコードされる第二級アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンホメーションに対する公知の効果のために特別な場合であり、したがって群には含まれない。本願において、標準的な３文字表記または標準的な１文字表記のいずれも、遺伝子によりコードされるアミノ酸を示すために使用される。Ｄ異性体については、１文字表記記号の右に上付のダガー（^†）を用いる；したがって、Ｄ^†は、Ｄ −ａｓｐと同様に、Ｄアスパラギン酸を表し、Ｌ^†、Ｄ−ｌｅｕと同様にＤ−ロイシンを表す。遺伝子コードによってコードされない、特定の通常に遭遇するアミノ酸には、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、または他のω−アミノ酸（例えば、３アミノプロピオン酸、２，３ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、４アミノ酪酸など）、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔブチルアラニン（ｔＢｕＡ）、ｔブチルグリシン（ｔＢｕＧ）、Ｎメチルイソロイシン（ＮＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、２ナフチルアラニン（２Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３カルボン酸（Ｔｉｃ）；β２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；およびホモアルギニン（Ｈａｒ）が含まれる。これらもまた、上記のカテゴリーに簡便に分類される。上記の定義に基づいて、Ｓａｒ、β−Ａｌａ、２，３−ｄｉａＰおよびＡｉｂは、小さい；ｔＢｕＡ、ｔＢｕＧ、ＮＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ、Ｃｈａ、Ｐｈｇ、Ｎａｌ、ＴｈｉおよびＴｉｃは、疎水性；ＯｒｎおよびＨａｒは、塩基性；Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性/極性。適切な場合、非遺伝子コードアミノ酸のＤ異性体は、その非遺伝子コードアミノ酸が、３文字表記を一般に使用する配列中に現れる場合、Ｄ−を頭に付けることによって示す；しかし、その非遺伝子コードアミノ酸が、遺伝子コードアミノ酸が１文字表記によって示される配列中に現れる場合、上付のダガー（^†）が用いられる。種々のωアミノ酸は、サイズに従い、小さい（β−Ａｌａおよび３アミノプロピオン酸）または大きくてしかも疎水性（他のすべてのアミノ酸）と分類される。遺伝子にコードされるアミノ酸との他のアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内のペプチド化合物に含まれ、そしてその構造に従ってこの一般的なスキームにおいて分類され得る。一般に、本発明の範囲内となる改変体を提供する、上記に示す基本配列と比較した置換の数は、比較的少数の置換を含む。以前に示したように、たとえ特定のアミノ酸または限定された数のアミノ酸が各部位で示されていたとしても、個々のアミノ酸置換を作製してどのアミノ酸が必須であるかを決定し得る。通常、置換の数は、配列のアミノ酸の総数の２０％を越えず、通常は１５％を越えず、より普通には１０％を越えず、一般的には３つの置換を越えず、より通常には２つの置換を越えず；そしてさらにより普通には１つの置換を越えない。全ての場合、置換の結果は、本明細書中上記で定義したように免疫調節活性を保持しなければならない。化合物のアミノ末端は、遊離アミノ形態であり得るか、または式ＲＣＯ−の基によりアシル化され得、ここで、Ｒは１〜６Ｃのヒドロカルビル基を示す。ヒドロカルビル基は、飽和または不飽和であり、そして代表的には、例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、Ｎ−ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセン−２−イル、ヘキセン−３−イル、ヘキシン−４−イルなどである。本発明の化合物のＣ末端は、遊離酸または受容可能な塩（例えば、無機イオンまたは有機イオン（例えば、カフェイン）のカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、または他の塩）のいずれかとしての、非誘導体化カルボキシル基の形態であり得る。カルボキシル末端はまた、式ＲＯＨのアルコールとのエステルの形成により誘導体化され得るか、または式ＮＨ₃もしくはＲＮＨ₂もしくはＲ₂ＮＨのアミンによるアミド化され得、ここで、各Ｒは独立して、上記で定義したように１〜６Ｃのヒドロカルビルである。Ｃ末端が式ＣＯＮＨ₂を有するペプチドのアミド化形態が好ましい。本発明の化合物が塩基性アミノ酸を含む場合、本発明のペプチドは、酸付加塩の形態で供給され得る。代表的な酸付加塩は、無機イオン（例えば、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素など）、硫酸塩、硝酸塩、またはリン酸塩の酸付加塩を含むか、または有機性アニオンの塩（例えば、酢酸塩、蟻酸、安息香酸塩など）であり得る。このような塩の各々の許容性は、一般に理解されるように、意図される用途に依存する。本発明の全ての化合物では、１つ以上のペプチド結台（−ＣＯ−ＮＨ−）が、必要に応じて、−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂ＣＨ₂、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂−および−ＣＨ₂ＳＯ−のような同配体である別の結合で置換され得る。この置換は、当該分野で公知の方法により行われ得る。以下の参考文献は、これらの代替結合部分を含むペプチドアナログの調製を記載する：Spatola,A.F.、Vega Data（1983年３月）第１巻、第３刷、「Peptide Backbone Modifications」（総説）；Spatola,A.F．「Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins」、B.W einstein編、Marcel Dekker，New York，267頁（1983）（総説）；Morley,J.S. 、Trends Pharm Sci（1980）463-468頁（総説）；Hudson,D.ら、Int J Pept Pro t Res（1979）14:177-185（−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−）；Spatola,A.F.ら、Life Sci（1986）38:1243-1249（−ＣＨ₂−Ｓ）；Hann,M.M.、J Chem Soc Per kin Trans I（1982）307-314（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Almqui st,R.G.ら、J Med Chem（1980）23:1392-1398（−ＣＯ-ＣＨ₂−）；Jennings-Wh ite,C.ら、Tetrahedron Lett（1982）23:2533（−ＣＯＣＨ₂−）；Szelke,M.ら、欧州特許出願第EP 45665（1982）CA：97；39405（1982）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−）；Holladay,M.W.ら、Tetrahedron Lett（1983）24:4401-4404（−Ｃ(ＯＨ)ＣＨ２−）；およびHruby,V.J.、Life Sci（1982）31:189-199（−ＣＨ₂−Ｓ −）。上記式におけるαおよび/またはβの基礎として好ましいのは、ＨＬＡ−Ｂ０７０１（Ｂ７）またはＢ２７０２からのペプチドであり、ここで、１つ以上のアミノ酸が置換され得るがＣＴＬ調節活性を保持している。７５〜８４位でのＢ０７０１（Ｂ７）およびＢ２７０２の部分は、７５位、７６位、７８位、７９位、および８４位で相同性を有しながら、７７位、８０位、８１位、８２位、および８３位で異なる。７７位、８１位、および８４位でのアミノ酸は、免疫調節活性の喪失を伴わずに置換され得ることが見出される。したがって、コンセンサス配列はＲＥＸ¹ＬＲＸ²Ｘ³Ｘ⁴Ｘ⁵Ｘ⁶であり、ここで、Ｘ¹は、極性または非極性の、好ましくは極性の、荷電または非荷電のいずれかの任意のアミノ酸であり得；Ｘ²は、好ましくは少なくとも５炭素原子のアミノ酸であり、これは極性または非極性、特にアスパラギンおよびイソロイシンであり得；Ｘ³は、２〜６炭素原子の（すなわち、疎水性または小さい）、より詳細には３〜５炭素原子の非極性脂肪族、特にイソロイシンであり得；Ｘ⁴は、任意のアミノ酸、詳細には荷電または非荷電のいずれかの脂肪族、好ましくは少なくとも約５炭素原子、例えば、アルギニンおよびロイシンであり得；Ｘ⁵は、任意のアミノ酸、好ましくは荷電または非荷電、極性または非極性の脂肪族、詳細にはグリシンおよびアルギニンであり得、より詳細にはＸ⁴およびＸ⁵の１つはアルギニンである。Ｘ⁶は、任意のアミノ酸、好ましくは疎水性または小さい。好ましくは、Ｘ¹ ^〜6は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、またはＮ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｙ、またはＤ、Ｉ、Ｌ、Ｌ、Ｒ、Ｙであり、ここで１つの群におけるアミノ酸の１つは、他の群のアミノ酸を同じ部位で置換し得る。配列は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方で、規定されたペプチドの活性を妨害しない、ＨＬＡ配列におけるさらなるアミノ酸または他のアミノ酸により伸長され得る。本発明の化合物は、少なくとも６アミノ酸、より通常には少なくとも８アミノ酸、一般的には少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも約１２以上のアミノ酸、一般的には３０を越えないアミノ酸、より通常には約２５を越えないアミノ酸を有する。本発明に含まれるフラグメントは、少なくとも部分ａａ⁷⁹ ^〜84 またはａａ⁸⁴ ^〜79を含む。好ましい化合物は、Ｒ^†ＩＡＬＹＲ^†Ｉ^†Ａ^†Ｌ^†Ｓ^† ＲＩＬＬ^†ＲＹＲ^†Ｉ^†Ｌ^†Ｌ^†Ｒ^†Ｙ^† ＳＬＡＩ^†ＲＹ^†Ｌ^†Ａ^†Ｉ^†Ｒ^† ＳＲＬＬ^†ＩＲＹ^†Ｒ^†Ｌ^†Ｌ^†Ｉ^†Ｒ^† ならびに伸長された、それらのＮ末端アシル化およびＣ末端アミド化またはエステル化形態を含む。本化合物は、広範な種々の方法において改変され得る。ペプチドは、異なる目的のために、ペプチドに沿った任意の便利な部位での種々の他の化合物への共有結合により連結され得る。したがって、ペプチドは、抗体産生のための免疫のための宿主への投与のために免疫原に連結され得るか、あるいは特定のＭＨＣ抗原の非隣接ＭＨＣ配列へ、合成、合成遺伝子の発現などの手段により連結され得るか；脂質もしくはポリアルキレンオキシ基に連結され得るか；糖類に連結され得るか；または核酸に連結され得る。特に興味深いのは、本ペプチドを、合成または合成遺伝子の発現により別のペプチドへ連結することであり、ここで他のペプチドは、宿主へ投与した場合に本ペプチドに長期安定性を提供する。免疫グロブリン定常領域のような種々のペプチド（例えば、ＩｇＧＦｃ）が使用され得る。あるいは、本ペプチドは、トキシン（例えば、ジフテリアトキシン、リシン、アブリンなど）に連結され得、特に、結合鎖が除去または不活化されている場合、その結果、細胞への結合鎖の非特異的結合が防がれる。配列は、それらの最終的な目的に依存して種々の方法により改変され得る。固体基体または他の分子へのペプチドの連結を可能にする異なるＮ末端基またはＣ末端基が導入され得る。合成手順では、その後の反応を可能にする任意の分子が、ペプチドが調製される目的に依存して、Ｎ末端またはＣ末端で導入され得る。診断目的のためには、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供し得る広範な種々の標識が、末端に連結され得る。例えば、蛍光剤が、末端または標識（例えば、蛍光剤、酵素、粒子など）への連結を提供する他の分子へ導入され得る。例えば、連結は、末端で導入され得る（例えば、酵素または蛍光剤を有するアビジン結合体に結合する、ビオチン）。あるいは、種々の反応部位が、粒子、固体基体、高分子などへの連結のために末端で導入され得る。例えば、固体基体に結合し、中間側鎖基が保護されている成長鎖の内部アミノ部分は、メチルジチオ安息香酸（ＭＤＴＢ）で結合され得る。次いで、活性化されたオレフィンと結合させるために、遊離メカプタン基を用い得る。したがって、タンパク質（例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシβ-グロブリンなど）は、ペプチドに結合されて、免疫アッセイ、アフィニティークロマトグラフィーなどにおいて使用するためのこのペプチドに対する抗体を産生するための免疫原を提供し得る。あるいは、ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはタンパク質の内側にペプチドを有するＤＮＡ配列を調製することにより、別のポリペプチドへ結合され得、その結果、目的の結合ペプチドを含む融合タンパク質を提供し得る。このような様式で、酵素活性を有する融合タンパク質が産生され得、この酵素活性は、目的のペプチドへ結合している高分子（例えば、抗体）により調節され得る。したがって、本発明のペプチドは、広範な種々の方法において、種々の最終目的のために、依然として生物学的活性を保持したまま改変され得る。（「生物学的活性」とは、ネイティブなタンパク質の同じエピトープに対する抗体に対して特異的親和性（＞10⁶Ｍ^-1）で結合する能力を意図する。）本ペプチドはまた、目的の抗原性ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて使用されてＣＴＬを活性化し得る。したがって、本ペプチドは、タンパク質に対して直接的または間接的に結合され得、その結果、ＣＴＬに対して２つのエピトープ（これにＣＴＬが結合して活性化され得る）を提示し得る。特に興味深いのは、本ペプチドは、リポソームまたは脂質二重層膜に、他の決定部位を提供するペプチドまたはタンパク質とともに結合され得る場合である。リポソーム表面上でペプチドまたはタンパク質の存在を提供するために、ペプチドまたはタンパク質を脂質、特にリン脂質に連結するための種々の技術が利用可能である。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、または他の脂質が、二官能性連結剤（例えば、ＭＢＳＥ、グルタルアルデヒド、メチルジチオ安息香酸など）とともに用いられ得る。結合したタンパク質を有するリポソームの形成については、文献に豊富な支持が見出せる。例えば、米国特許第3, 887,698号；同第4,261,975号、および同第4,193,983号を参照。改変されたペプチドまたはタンパク質は、水性培地中で脂質と組み合わされ、そして超音波処理されて所望のリポソームを提供する。次いで、リポソームは、収集され、そして示された方法において使用され得る。トランスプランテーションおよび自己免疫抑制における処方および使用本発明の化合物の免疫調節活性は、トランスプラントの拒絶の防止および自己免疫疾患の処置においてそれらを有用にする。主として、同種間のインプラントに関するが、器官の異種の供給源、例えば、ブタ、ヒト以外の霊長類、例えば、ヒヒなどを使用することに実質的な利益がある。目的の器官は、心臓、肺、腎臓、血管、眼、腸、骨髄、肝臓などが挙げられる。トランスプランテーションのために、器官は、最初に、本発明の１種以上の化合物（これは、個別に、または他の薬物と組み合わせて使用され得る）に浸され得る。一般的に、本発明の化合物の濃度は、その特定の活性に依存し、一般的に、約０．１μｇ/ｍｌ〜１ｍｇ/ｍｌの範囲である。本発明の組成物は、トランスプラントの処置に拘わらず、レシピエント宿主に直接投与され得る。特定のペプチドが、広い範囲のクラスＩＭＨＣ抗原を有するＣＴＬに作用する。ペプチドが様々な回数および様々な期間で投与される場合、ボーラス、除放、デポ剤、連続注入または他の投薬形態のいずれが採用されるか；投与態様（経口、非経口、吸入などのいずれか）；投与について、選択される特定の回数；ドナーとレシピエントとのトランスプランテーション抗原間の相違の程度などに依存するレジメンを提供することにより、これらの化合物は、トランスプランテーション拒絶に対する保護に特定の用途を見いだす。ペプチドの投与は、トランスプランテーションの日の前、当日、および後、またはそれらの組合せであっても良い。様々なレジメンが有効に採用され得、その結果、特定のレジメンが具体的に規定され得ないことがわかる。ペプチドがトランスプランテーションの前に投与される場合、投与を、トランスプランテーションの少なくとも３日前、好ましくは少なくとも約５日前に、そしてより好ましくはトランスプランテーションの少なくとも約７〜２０日前に、始めるべきである。しかし、ペプチドがトランスプランテーションの始め、またはその後に投与される場合、好ましくは、投与は、トランスプランテーションの１日以内に開始され、好ましくはトランスプランテーションの当日であり、そして、グラフトプロセス中に投与され得る。通常、複数の投与が存在し、通常は、約１０以下であり、より普通には、約６以下であり、一般的には、少なくとも約２であり、しばしば、約２〜６の範囲の投与であり、ここで、投与は、毎日でもよく、１日おきでも良く、通常は、３日以内の間隔であり、好ましくは、２日以内の間隔である。１日に複数回の投薬が与えられ得るが、１日あたり１回の用量が十分であることがわかる。したがって、全体のレジメンは、グラフト手術前の２０日間およびグラフト手術後の約１０日間までの間の投与を含む。通常は、最初の用量が−２０日から＋１日の期間に始まる。ここで、（−）は、手術の日の前を意図し、そして（＋）は、手術の日の後を意図し、そして０は手術の日を意図する。投与が主に、手術前である場合、好ましくは、最初の用量は、手術の７日前よりも早くはない。最初の用量が手術の後である場合、手術後の１日以内である。所望であれば、投与は、インプラントの生存（life）の間、継続され得る。レジメンの一部として、免疫抑制薬物もまた、一般的には、トランスプラントの際にかまたは後に、それ単独でか、またはペプチドが特にトランスプランテーション後に投与される場合にはペプチドと組み合わせて、投与され得る。免疫抑制剤化合物の亜治療用量（subtherapeutic dose）が採用され、ここで、免疫抑制剤は、単独の薬剤であり得、または複数の薬剤の組合せであり得、ここで組合せは、亜治療投薬量未満である。亜治療投薬量とは、ペプチドの非存在下では、グラフトが、大多数の患者において１００日以内、通常３０日以内、そしてより普通には２０日以内に拒絶されるであろうことを意図する。様々な免疫抑制剤が知られ、例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、グラフト拒絶に関する原形質膜タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２８に対する抗体）などである。亜治療用量は、治療投薬量の約５％以上であり、通常、約１０％以上であり、より普通には約２５％以上であり、そして通常、約７５％以下であり、より普通には約６０％以下である。組合せが使用される場合、亜治療投薬量は、主に、免疫系に対する効果を最小化する実質的な利点を有するが、顕著な副作用を有する薬物に関する。亜治療投薬量について言及するときは、ボーラス量を意図する。なぜなら直接の比較が困難だからである。ここで本レジメンは、トランスプランテーションの短い期間内に終わる。本レジメンは、毎日または毎日より少なくてもよく、そして他のレジメンは、繰り返し毎日投与を含み得る。本レジメンは、患者の一生にわたる他の免疫抑制剤レジメンと対照してみると、トランスプランテーションの約２０日間以内、通常約１０日間以内、に終わり得ると言えば十分である。一般的に、投与されるペプチドの量は、約０．１〜５０、より普通には、約１〜２５ｍｇ/ｋｇ宿主である。この量は、ペプチド化合物の半減期が６時間よりも短い、より具体的には、４時間よりも短く、そして約１分間よりは長い場合に、ペプチド化合物に使用される。より低い部分の範囲の投薬量、およびさらに低い投薬量が採用され得る。この場合、ペプチドが増強された半減期を有するか、またはデポ剤（例えば、長期間にわたってペプチドを維持するマトリックス（例えば、コラーゲンマトリックス）に導入された粒子を含む除放性組成物）として提供されるか、実質的に連続的な速度で長期間にわたってペプチドを連続的に注入するポンプを使用するなどである。ペプチドがトランスプランテーションの前に投与される時期に依存して、免疫抑制剤レジメンは、変化し得る。例えば、ペプチドが−７および−１日に与えられる場合、１回の亜治療投薬量のシクロスポリンＡは、ほんのわずかの保護能を有し得る。一方、０〜４日、毎日のシクロスポリンＡの投与は、保護的であり得る。−１４、−１２、−１０、および−７日のペプチドの投与に続いて、トランスプラント０〜４日後のシクロスポリンＡの投与のレジメンはまた、実質的な保護効果を有し得る。あるいは、トランスプラント０〜４日後の亜治療投薬量のシクロスポリンＡおよびこれらのペプチドの組合せ投薬を使用することにより、グラフトの維持が、非常に増強され得る。本発明の組成物は、組成物が生理学的に受容可能な媒体中にあり得る場合、直接投与のための処方物として調製され得る。他の薬物が存在する場合、特別な処方が使用され得、他の薬物の安定な分散を確実にする。使用され得る媒体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、エタノール、植物油などが挙げ他の従来の媒体もまた用途を見いだし得る。さらに、例えば、安定剤、抗生物質、界面活性剤、分散剤、乳化剤、リポソームなどの他の成分もまた含まれ得る。一般的に、同様な処方物が使用され得、そして自己免疫疾患の処置のためのプロトコルでの使用について最適化され得る。このような処置は、ルーチン的に設計され得、そして標準的な医学的実践およびまず少なくとも動物モデルに基づいて最適化され得る。たくさんの自己免疫疾患について動物モデルがある。例えば、NODマウスは、自己免疫糖尿病の調査のためのマウスモデルとして広く使用されている。なぜなら、それらは、約８週齢で自然に糖尿病を発症させるからである。Ｂ２７０２．７５−８４由来の様々なペプチドが、最近、３週齢で始めて、毎週３回のip注入を含むプロトコルでテストされている。これらのモデルの結果は、糖尿病の適切な治療プロトコルの設計に役に立つ。同様のモデルが、他の自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび紅斑性狼蒼）のプロトコルの開発に有用である。合成本発明の組成物は、様々な様式で、生産され得る。本発明のペプチドタイプ化合物は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むので、標準的なペプチド合成方法（固相または液相のいずれか）が好ましい。自動合成機（例えば、Beckman、App lied Biosystems Inc.）などが使用され得る。遺伝子にコードされるアミノ酸のみを含み、そしてペプチド結合のみを含む化合物の部分は、標準的な組換え技術を用いて調製され得、そしてこれらの部分は、Ｄ−アミノ酸または遺伝子にコードされない他のアミノ酸に連結される。このような方法において、発現系は、従来の方法を用いて構築され、ここで、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞でその発現を達成し得る制御配列に作動可能に連結する。原核生物、酵母、哺乳動物細胞、鳥細胞、昆虫細胞および植物細胞を含む広範な種々の宿主細胞が使用され得る。適切な制御配列の選択は、もちろん、組換え宿主の選択に支配される。ペプチドを生産するためには、所望の発現系を含むDN A分子を含むように改変された組換え細胞は、所望のペプチドが生産される条件下で培養され、そしてペプチドが培養物から回収される。標準的な精製プロセスは、ペプチドまたは細胞上清を回収するために使用され得、あるいはライセートが特定の状況において次の連結のために粗製形態で使用され得る。１つの実施態様において、メチオニン（これは、Ｍｅｔ残基における切断を可能にする）のようなアミノ酸により分離されて、縦列に、化合物の所望の部分をコードするヌクレオチド配列の複数のコピーを含み、そのことにより主題の部分が単離され得るように、発現系は設計され得る。タンパク質分解性酵素の基質であるアミノ酸配列もまた、コードされた縦列タンパク質の部分を分離するのに使用され得る。抗体本発明のペプチドタイプ化合物と「特異的に免疫反応性」または「免疫特異的」である抗体もまた、調製され得る。「特異的に免疫反応性」とは、本発明の化合物と反応するが、ＨＬＡ対立遺伝子（Ｄ型異性体を含む化合物はこれに基づく）中の配列によって表されるネイティブなペプチドとは反応しない抗体を意味する。これらの抗体の調製のために、標準的な免疫化技術が使用され得、それによって適切な動物は抗体が所望される化合物を投与され、そして適切な力価の所望の抗体が血清または血漿において見出されるまで、投与は適切なプロトコル下で続けられる。当該分野で理解されるように、十分な力価を提供するために、免疫原を適切なキャリアと会合させることが必要であり得る。いくつかの目的については、抗血清が直接使用され得る；他の使用については、免疫グロブリン画分を精製すること、または適切な特異性を有するこれらの抗体のモノクローナル形態を調製することが所望され得る。モノクローナル抗体の調製のために、適切な抗体産生細胞（例えば、牌細胞または末梢血リンパ球）が採集され、代表的には腫瘍細胞とのポリエチレングリコール融合によって不死化され、そして得られた不死化細胞は個々に培養され、所望の抗体の産生についてスクリーニングされ得る。上記のように調製された抗体がインタクトで使用され得るか、またはそれらの免疫特異性を保持するフラグメントが使用され得る。代表的なそのようなフラグメントは、Ｆ_ab、Ｆ_ab,、またはＦ_(ab')2フラグメントである。さらに、抗体は、標準的な組換え技術を使用して、不死化細胞から関連遺伝子を回収することによって調製され得る。これらの状況下で、遺伝子はまた、上記のフラグメントを提供するように、または本発明のペプチドの１つに免疫特異的な重鎖/軽鎖の組合せと別のものに免疫特異的な同様の組合せとを連結することにより、多価形態で抗体を提供するように操作され得る。あるいは、抗体は、単鎖形態（例えば、Ｆ_V形態）で調製され得る。種々のさらなる改変（例えばマウスに由来する抗体のヒト化）もまた行われ得る。本発明のペプチドタイプ化合物に免疫特異的な抗体は、これらのペプチドを精製するにおいて、本発明のペプチドを定量する際の診断ツールとして、そしてインビボで本発明のペプチドタイプ化合物の活性を追跡する診断アッセイにおいて有用である。以下の実施例は、限定のためではなく例証のために提供される。実施例１免疫調節活性についてのアッセイ本発明の化合物は、簡便なインビトロアッセイによって、免疫系を調節する能力について評価され得る。以下の実施例は、これらのアッセイを例証し、そして本発明の化合物およびコントロールペプチドについての結果を提供する。この実施例において、種々のペプチドを、樹立されたＣＴＬによる溶解を阻害する能力について、抗ＣＤ３に応答する精製Ｔ細胞の増殖を阻害する能力について、および細胞内カルシウムレベルに影響する能力について試験した。以下の段落は、アッセイにおいて使用された種々の物質の調製、および実施されたアッセイの特定の特徴を記載する。材料および方法細胞および細胞培養物。PBLを、Ficoll-Hypaqueでの遠心分離によって正常なドナーから単離した。いくつかの場合には、Ｔ細胞を、Secristら［J.Exp.Med. （1993）178:2123］の方法を使用してこの調製物から精製した。簡潔には、Fico 11-Hypaqueで単離された細胞を、ペトリ皿中で１時間インキュベートした。非接着細胞を、ナイロンウールカラムを通過させ、そして得られた集団はＦＡＣＳ分析によって＞90％ＣＤ３＋であった。ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４８、またはＣｗ４に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬ株を作製し、そして以前に記載のように［ Buxtonら、J.Exp.Med．（1992）175:809;Wesleyら、Hum.Immunol．（1993）36:1 49］、長期培養において維持した。ＪｕｒｋａｔＥ６−１、およびＴ細胞レセプターネガティブＪｕｒｋａｔであるＪＲＴ３−Ｔ３．５を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC；Rockville，MD）から入手した。使用された他の細胞株には、以下が含まれた：ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株ＪＹ、ＭＳ、ＣｌＲ、および７２１.２２１；赤白血病細胞株Ｋ５６２およびＨＥＬ；Ｔ細胞腫瘍Ｐｅｅｒ、Ｈｕｔ−７８、およびＨＳＢ；Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ、およびＳＵＰＢ１７［Wrightら、J.Exp.Med.1989）169:1557］；ならびにＮＫ様細胞株ＹＴ２Ｃ２。全ての形質転換細胞を、培養培地［10％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Hyclone，Inc.，Logan，UT）、２ｍＭＬ−グルタミン、１０ＯＵ/ｍｌペニシリン、および１００μｇ/ｍｌストレプトマイシン］中で増殖させた。細胞傷害性アッセイ。ＣＴＬアッセイを、標的としての適切なＨＬＡ対立遺伝子を発現する⁵¹Ｃｒ標識されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を使用して、記載されるように実施した［Krenskyら、J.Immunol．（1982）129:2001］。増殖アッセイ。１０⁵の細胞を、抗ＣＤ３（Sigma，St．Louls，MO）でコートされたマイクロタイターウェルに５μｇ/ｍｌで添加した。プレートを、５％ＣＯ₂中37℃でインキュベートした。４８時間後、１μＣｉの［³Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。プレートをPHD Cell Harvesterで２４時間後に収集し、そして［³Ｈ］チミジン取り込みをシンチレーション計数によって決定した。ペプチド。ペプチドを、Stanfoad Medical CenterのProtein and Nucleic Aci d Facilityにおいて、Ｆｍｏｃ化学を使用して、Applied Biosystems Milligen/ Biosearch 9050自動ペプチド合成機によって合成した。ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、そして各々の均質性を分析逆相ＨＰＬＡによって確認した。アミノ酸含量を、アミノ酸分析によって確認した。ペプチドを、ＤＭＳＯ中に４０ｍｇ /ｍｌで溶解させ、次いで、アッセイのために培養培地中でさらに希釈した。結果以下のペプチドを試験のために調製した：表１合成ペプチドのアミノ酸分析。横線は、Ｂ２７０２.７５−８４またはＢ２７０２.８４−７５/７５−８４配列中に見出された残基との同一性を示す。アミノ酸配列の機能としての樹立されたＣＴＬによる溶解の阻害Ａ．集中置換ＨＬＡ−Ｂ２７０２.６０−８４が樹立されたＣＴＬによる溶解を阻害することは以前に示されているが（Claybergerら、Transplant Proc（1993）25:477）、一方でＨＬＡ−Ｂ２７０５.６０−８４は阻害しない。このプロトコルでは、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬ細胞株を、⁵¹Ｃｒ標識されたＪＹ標的の溶解について、種々のペプチドの存在下で試験した。ペプチドを、４時間のアッセイの開始時に、１００μｇ/ｍｌの最終濃度で添加した。各測定は、３連のウェルの平均であった。以下に記載のような同様の結果を、ＨＬＡ-Ｂ２７または−Ｂ４８に特異的なＣＴＬを使用して得た。ＨＬＡ−Ｂ２７０２.７５−８４は、このアッセイにおいて、樹立されたＣＴＬによる溶解を阻害した。しかし、Ｂ２７０２.６０−８４は、細胞傷害性の５０％阻害を達成するに必要な濃度に基づいて、Ｂ２７０２.７５−８４よりも約５倍強力であった。それゆえ、ペプチドを、ペプチド長の効果を評価するために調製した。１５マーのＨＬＡ-Ｂ２７０２.７０−８４は、細胞溶解を阻害するにおいてB2702.75-84と同等に効果的であった。しかし、逆方向反復ダイマーであるＢ２７０２.８４−７５/７５−８４（ＹＲＬＡＩＲＬＮＥＲＲＥＮＬＲＩＡＬＲＹ）は、細胞溶解の50％阻害を達成するに必要な濃度に関してＢ２７０２.６０−８４と同様に強力であり（約３μＭ）、そしてそれが完全に細胞溶解を阻害した点において、このペプチドよりも優れていた。Ｂ２７０２.７５−８４/７５ −８４は、同様の活性を示した。次いで、個々のアミノ酸を置換することの、免疫調節ペプチドにおける効果を試験した。ペプチド０２.７５−８４Ｌ⁸¹（ロイシンが８１位のアラニンを置換する）は、０２.７５−８４と同等に溶解を阻害した。しかし、ペプチド０２.７５−８４Ｄ⁷⁷（アスパラギン酸が７７位のアスパラギンを置換する）およびペプチド０２.７５−８４Ｔ⁸⁰（スレオニンが８０位のイソロイシンを置換する）は、溶解を阻害しなかった。Ｂ２７０２の８０位のイソロイシン残基は、それのスレオニンによる置換が阻害活性の完全な消失をもたらす点で、重要であるようである；７７位のアスパラギンを置換することの効果は、より劇的でないようであった。本発明のダイマーに関して、逆方向反復におけるＩｌｅ⁸⁰残基のいずれかのスレオニンによる置換は、完全に阻害を抑止した。Ｂ７.７５−８４またはＢ７.８４−７５/７５−８４に対応する合成ペプチドは、試験されたいかなる濃度においても、ＣＴＬ媒介溶解を阻害しなかった。Ｂ．セリンスキャンさらに、ダイマーＢ２７０２.８４−７５/７５−８４およびＢ２７０２.８４ −７９/７９−８４を、ダイマーの両方の側で各位置で順番に天然の残基をセリンで置換することにより、「スキャン」した。樹立されたＣＴＬによる溶解の阻害について本アッセイで試験した場合、８０位のイソロイシンならびに/または７８位および/もしくは８２位のロイシンをセリンで置換したダイマーのみが、もはや活性を有さなかった。この分子の他の位置でのセリンの置換は、有意な効果を有さなかった。ダイマーにおける対応するアミノ酸をセリン残基で体系的に置換し、次いで活性について試験する技術を、「セリンスキャン」という。Ｃ．Ｄ−アミノ酸での置換これらの決定では、上記のような細胞溶解の阻害は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的な長期ＣＤ８＋ＣＴＬ株であるＣＴＬ細胞株AJYを用い、そして標的細胞はＢリンパ芽球細胞株JY（ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７）であった。細胞傷害性アッセイを、Clay bergerら、J.Exp.Med．（1984）162:1709-1714；およびReissら、Proc Natl Ac ad Sci USA（1980）77:5432-5436により記載されたように実施した。ペプチドを、１〜３×１０³ＣＴＬとともに３０分間プレインキュベートし、その後１０³⁵¹ Ｃｒ標識Ｂリンパ芽球標的細胞を添加した。結果を、変化する比の２つの細胞株を用いて、変化する濃度のペプチドについて報告する。表２したがって、Ｂ２７０２.７５−８４を示すペプチド（ここで、全ての残基はＤ−異性体により置換された）は、天然のＬ−アミノ酸形態のＢ２７０２.６０ −８４よりもさらに活性であるようであった。Ｄ．必要とされる遊離ペプチド阻害における有効性は、細胞結合ＨＬＡ分子としてよりむしろ、ペプチドそれ自体を提供することに依存するようであった。本発明者らのグループによる以前の研究は、Ｂｗ４ａモチーフを表すＨＬＡ分子が、Ｂｗ４特異的ＣＴＬにより認識され得ることを実証した［Claybergerら、J.Immunol．（1990）144:4172］。それゆえ、２つの異なる型の実験を用いて、Ｂｗ４ａ決定基を表す細胞表面ＨＬＡ分子がＨＬＡ−Ａ２に特異的なＣＴＬによる溶解を阻害し得るか否かを決定した。第１に、ＨＬＡ−Ｂ２７０２を発現するトランスフェクタントを、ＨＬＡ− Ａ２特異的ＣＴＬの非放射性標的インヒビターとして用いた。あるいは、ＨＬＡ −Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ５８（Ｂｗ４ａ＋である対立遺伝子）の両方を発現するトランスフェクタントを、ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＴＬの標的として用いた。ＨＬＡ−Ａ２特異的溶解の阻害は、いずれの場合も観察されなかった。このことは、Ｂｗ４ａ配列が、可溶性形態でのみ阻害性であることを示す。Ｔ細胞増殖の阻害Ａ．集中置換ペプチドを、固定化抗ＣＤ３抗体により刺激された精製Ｔ細胞の増殖に対する効果について評価した。³Ｈ-チミジンの取込みの減少により測定する場合、B270 2.84-75/75-84はこの増殖を阻害するが、B2702.75-84およびB7.75-84は阻害しない。逆方向反復配列B2702.84-75/75-84が、Ile⁸⁰残基のいずれかまたは両方においてThrで置換される場合、増殖が阻害された。同様の結果が2702.84-79/79-84 で得られた。Ｂ．セリンスキャン実施例Ｉに記載される技術に従ったこれらのダイマー（B2702.84-75/75-84およびB2702.84-79/79-84）のセリンスキャンは、先述の増殖アッセイにおける活性が、80位の両方のIle残基ならびに/または78位および/もしくは82位の両方のL eu残基が置換された場合にのみ、有意に減少または消去されたことを示した。Ｃ．Ｄ−アミノ酸での置換増殖に対するＤ−置換の効果を測定するために、正常なドナー由来のPBLを、５×10⁵細胞/丸底マイクロタイターウェルで、10％ウシ胎児血清およびL-グルタミンを補充したRPMI-1640中で培養した。培養物に、コンアグルチニンＡ（Conag glutinin A）を補充した。細胞を37℃にて３日間インキュベートし、この時点で³ Ｈ-チミジン（１μＣｉ/ウェル）を添加した。24時間後、ウェルを収集し、そして³Ｈ-チミジンの取込みを、シンチレーションカウンターにより決定した。以下の表は結果を示す：表３表３の結果は、近似に過ぎない。なぜなら、種々のペプチドの純度が樹立されていないからである。Ｄ．機構の研究これらのペプチドの存在下で抗ＣＤ３抗体により剌激されたＴ細胞への組換え IL-2の添加は、阻害を逆転させない。このことは、不応答性の基礎をなす機構は、JenkinsおよびSchwartz［Schwartzら、Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol．（1989）2:605；Jenkinsら、Adv.Exp.Med.Biol．（1991）292:167］により最初に定義されたような、「古典的な」Ｔ細胞アネルギーではないことを示す。 B2702.84-75/75-84ペプチドの存在下で観察された、ＣＴＬ溶解およびＴ細胞増殖の欠如は、Ｔ細胞死にもアポトーシスにも起因しなかった。Ｔ細胞株および新たに単離された末梢血リンパ球を、１〜50μＭのペプチドとともに培養した。これらの培養物のアリコートを、ヨウ化プロピジウムを用いて染色し、そしてFA CSにより蛍光について評価した。培養物中の生存細胞の総数の減少も割合の減少も、１週間の期間にわたって検出されなかった。実施例２ラットモデルにおける同種異系グラフト防御の防止材料および方法動物成体雄性で特定病原体を有さない（SPFの）ACI（RTl^a）、PVG（RTl^c）、Brown Norway（BN）（RTlⁿ）、およびLewis（Lew）（RTl^l）ラット（体重200〜250ｇ）を、これらの研究に用いた。ラットを、Bantin and Kingman，Fremont，CA（P VG）またはCharles River，Boston，MA（ACI、BN、およびLew）から購入した。A CIラットを、BNまたはLewドナーからの心臓または皮膚の同種異系グラフトのレシピエントとした。動物を、Falk Cardiovascular Research Buildingにおいて標準的な条件下で協会ガイドラインに従って維持した。ペプチドペプチドを、Protein and Nucleic Acid Facility、Beckman Center、Stanfor d University School of Medicineで、またはMultiple Peptide Systems（San D iego，CA）により、自動化ペプチド合成機によりFmoc化学を用いて合成した。ペプチドを調製用逆相HPLCにより精製し、そして＞98％均質であることが分析的逆相HPLCにより示された。アミノ酸含量を、アミノ酸分析により確認した。ＣＴＬ前駆体についての限界希釈アッセイ脾臓細胞におけるＣＴＬ前駆体頻度に対するペプチドの効果を、以下の通りに試験した。限界希釈分析を、本質的に記載された（Moellerら、1993，前出；Ski nnerおよびMarbrook、J.Exp.Med．（1976）143:1562）ように実施した。手短には、脾臓を、未処理の動物または最低60日前に同種異系グラフトを受けた動物から取り出し、次いで細かく裂いて単細胞懸濁液にした。応答細胞を、１ウェルあたり1000〜40,000細胞（１濃度あたり24連）で丸底マイクロタイターウェルに、 10％ウシ胎児血清（Hyclone，Logan，UT）、２mM L-グルタミン、５×10^-5Mβ- メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、100μｇ/mlストレプトマイシン、コンカナバリンＡ活性化ラット牌臓細胞からの20％上清、および50μＭ α-メチルマンノシドを補充したRPMI 1640中でプレートした。次いで、５×10⁵の照射（2000 rad）刺激細胞を各ウェルに添加し、そしてプレートを、加湿CO₂インキュベータ一中でインキュベートした。５日後、アリコートを取り出し、そして⁵¹Cr標識コンカナバリンＡ活性化芽細胞の溶解について試験した。上清のアリコートを、ガンマカウンターにおいて計数し、そしてＣＴＬ前駆体頻度を直線回帰（Skinner およびMarbrook、1976，前出）により決定した。比放出が＞10％であった場合、ウェルを陽性と判断した。リンパ節増殖アッセイ ACIまたはPVGラット（200g）に、生理食塩水に溶解させたペプチドを０日目に静脈内注射した。その後の示した日に、ラットの左後肢掌に同系のドナー由来の５×10⁶個の脾細胞を注射し、そしてその右後肢掌に同種のLewドナー由来の５× 10⁶個の脾細胞を注入した（Moellerら Transplantation（1993）55:650）。Twi stおよびBarnes Transplantation（1973）15:182；FanslowらScience（1990）24 8:739も参照。肢掌注射後７日目に、動物を屠殺し、そして膝窩リンパ節を取り出した。単一の細胞調節液を調製し、そして細胞数を血球計算盤を使用して測定した。器官トランスプランテーション血管が新生した心臓同種異系グラフトを、OnoおよびLindsayの技術（OnoおよびLindsey J.Thorac.Cardiovasc.Surg．（1969）57:225）の改変を使用してレシピエントラットの腹部にヘテロタイプにトランスプラントした。腹部同種異系グHEAラフトを、グラフトの機能を評価するために毎日触診し、そして触知可能な心室の収縮が終止した場合、拒絶が完了したと判断した。全厚皮膚グラフトを、BillinghamおよびMedawar（J.Exp.Biol．（1951）28:38 5）によって記載される技術の改変を使用して行った。ドナーおよびレシピエントの両方を剃毛し、そしてドナー皮膚を標準的な２×２cmの小片に切断し、そして皮下脂肪を外科的に除去した。複数のグラフトを単一のドナーから得、冷却した生理食塩水中で保存し、そして同一日にトランスプラントした。ドナーグラフトと同じ大きさの１片の皮膚を、レシピエントの脇腹から除去し、そして弛んだ結合組織を筋膜から外科的に除去した。次いで、同種異系グラフトを4-O vicryl 縫合糸でレシピエントの筋膜に合わせた。粗いガーゼの１つの層およびきめの細かいガーゼスポンジの８つの層を、2-Ovicryl縫合糸を使用してグラフトの周りのレシピエントの皮膚および筋膜に縫った。これによって、ドナー皮膚をレシピエントの筋膜にしっかりと固定し、そしてグラフトに血管再新生させた。手術後６日目に、手当用具を取り除き、次いでグラフトを拒絶の形跡について毎日調べた。拒絶は、紅斑、持続的な漿液の滲出、潰瘍、またはグラフトの壊死によって証明した。免疫抑制オリーブ油に溶解させたシクロスポリンＡ（CsA、Sandoz Phrmaceuticals Cor poration，Base，Switzerland）を、示した用量で栄養管を介して経口的に与えた。ペプチドを水または生理食塩水に溶解し、そして示すように静脈内にまたは栄養管によって与えた。統計分析スチューデントのｔ検定を、異なる群内の同種異系グラフトの生存を比較するために、Graphpad InStat統計プログラムを使用して計算した。ｐ値が＜0.05の場合、差異を有意とみなした。結果Ａ．ＣＴＬ前駆体についてのＣＴＬ分化インビトロ限界希釈アッセイに対するインビボ投与の効果最初の研究は、B7.75-84およびB2702.75-84ペプチドの両方が、インビトロでラット脾細胞の同種特異的ＣＴＬへの分化をブロックしたことを示したが、A2.7 5-84ペプチドまたはラットＭＨＣクラスI分子由来の同一の残基に対応するペプチド、RTI^aのいずれもがインビトロでラット脾細胞の同種特異的ＣＴＬへの分化をブロックしなかったことを示した。したがって、本発明者らは、インビボでペプチドで処理したラットから得られた脾細胞がエキソビボでＣＴＬへ分化し得るか否か試験した。予備的な研究で、B7.75-84ペプチドの半減期をラットにおいて２〜３時間であると測定した。したがって、本発明者らは、１投与量当たり２〜 20mgペプチド（６〜60mg/kg）（ウンデカペプチドCsA（10〜20mg/kg）の投与量に匹敵する量）を投与することを選んだ。 PVG（RTI^c）またはACI（RTI^a）ラットを、生理食塩水または２mgのA2.75-84、 B7.75-84、B2702.75-84、またはRTI^a75-84ペプチドの一回の静脈注射で処理した。それらの脾臓を、ペプチド処理後の異なる日に取り除き、限界希釈条件下にて Le wisラットからの放射線照射（2000R）した脾細胞（すなわち、Lew（RTI^I)刺激細胞）と供に５日間培養し、そして⁵¹Cr標識Lew芽細胞の溶解についてアッセイした。ＣＴＬ前駆体頻度を直線回帰分析よって決定した。表４に示すように、生理食塩水、A2.75-84ペプチド、またはRTI^a.75-84ペプチドのいずれかで処理したPVGラット（２/群）から単離した牌細胞におけるLew特異的細胞の前駆体頻度は、脾臓を除去した日に依存せず、約55.000分の１であった。同一頻度を、脾臓切除の日または24時間前にB7.75-84、B2702.75-84ペプチドのいずかで処理した動物由来の脾細胞において見出した。しかし、脾臓切除の７または10日前にB7.7 5-84またはB2702.75-84ペプチドで処理したラットから得た脾細胞は、Lew特異的ＣＴＬの前駆体頻度において８〜10倍の減少を示した。表４生理食塩水または種々のペプチドの注射後にラットから単離した脾細胞におけるＣＴＬ前駆体頻度したがって、結論として、B7.75-84およびB2702.75-84の両方を、ラットに注射した場合、インビトロで同種チャレンジに応答しなかった脾細胞を生じた。A2 . 75-84またはコントロールペプチドのいずれもこの効果を有さなかった。Ｂ．同種反応性インビボ−リンパ節増殖アッセイに対する効果ペプチドがインビボで同種反応性に影響し得るかどうか否か評価するために、本発明者らは、上記のように、肢掌への非自己脾細胞の注射後の排出リンパ節における細胞の蓄積に対するそれらの効果を試験した。 PVGまたはACIラット（１群当たり３匹）に４つのペプチドの各々2mgまたは生理食塩水の単回静脈内注射を与えた。処理の日、処理後１日目、７日目、または 10日目に右の肢掌に５×10⁶個の同系脾細胞を注射し、一方、左肢掌には、５×1 0⁶個の同種Lew脾細胞を注射した。肢掌注射後７日目に排出リンパ節を取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、そして細胞数を測定した。（同種細胞を注射した側から回収した細胞の数）対（同系細胞を注射した側から回収した細胞の数）の比は生理食塩水、A2.75-84ペプチド、またはRTI^a.75-84 ペプチドで処理したラットにおいておよそ３：１であった。同様な比を、肢掌注射の24時間以内にB7.75-84またはB2702.75-84ペプチドで処理したラットから得たリンパ節において観察した。しかし、肢掌チャレンジの７日または10日前にB7 .75-84ペプチドで処理したラットにおける比は、１：１まで落ちていた。肢掌注射の７日または10日前にB2702.75-84ペプチドで処理したラットにおける比は、およそ２：１であった。したがって、B7.75-84およびB2702.75-84の両方を、予めラットに注射した場合、インビボでの同種チャレンジに対する応答を阻害するに有効であったが、A2 .75-84または別のコントロールペプチドのいずれもが有効ではなかった。B7.75- 84は、B2702.75-84よりいくらか有効であるようであった。Ｃ．心臓同種異系グラフト生存に対するペプチドの静脈内投与ならびにCsAの短期治療の効果 B7.75-84およびB2702.75-84ペプチドが、インビボで細胞性免疫をブロックしたので、本発明者らは、ラットにおいて同種異系グラフト生存に対するそれらの効果を調べた。ACI（RTI^a）レシピエントに、Lewドナーからの異所性心臓同種異系グラフトを腹部に与えた（Moellerら、1993、前出；OnoおよびLindsey、1969 、前出）。グラフトの機能を、毎日の腹部の触診によってモニターし、そして拒絶を、触知可能な心室の収縮が終わった場合、完了したと記録した。グラフトは、治療を受けていないコントロールラットにおいて９〜12日間生存した。トランスプラントの２週間前またはトランスプラント後４日目のいずれかに２〜５投与量のB7.75-84で処理したレシピエントにおける同種異系グラフト生存は、同様であった（７〜13日間）。したがって、本発明者らは、ペプチド治療をCsAの副治療レジメと組み合わせることを選んだ。CsAを単一用量（20mg/kg）でトランスプランテーション後２日目に投与した場合、17匹のラットの内の16匹が23日目までにそれらのグラフトを拒絶した。しかし、外科手術前の２週間に10mgのB7.75-84での４回の処理および手術後２日目に単一用量のCsAを受けた７匹のラットの内の４匹がそれらのグラフトを限りなく（＞200日）維持した（CsAのみと比較してp=.0023）。トランスプランテーション前の７日目および１日目に20mgのB7.75-84で処理し、次いで手術後２日目に単一投与量のCsAで処理した全てのラットがl6m日目までにそれらのグラフトを拒絶した。これらの結果は、与えたB7.75-84の総投与量は２つの群内で同一であるので、ペプチド投与の時期が重要であることを示す。ラットにCsA（10mg/kg）を手術後０日目〜４日目に毎日与える代替の処置プロトコルもまた評価された。これらのグラフトの大半（14/17）が、トランスプランテーション後30日までに拒絶された。トランスプランテーション前の−７日目および−１日目に20mgのB7.75-84で処置され、次いでCsAを０日目〜４日目に与えられた動物の50パーセント（4/8）が、それらのグラフトを＞200日間維持した（CsA単独に比較して、p=.0849）。これは、２日目に単回用量のCsAと組み合わせた同一のペプチドレジメンを与えられたラットが、それらのグラフトを16日目までに拒絶した知見とは対照的である。−14日目、−12日目、−10日目、および −７日目に10mgのB7.75-84で、およびその後、トランスプランテーション後０日目〜４日目にCsAでの動物の処置は、23/29動物（80％）における寛容性を生じた（CsA単独に比較して、p＜.0001）。最後に、トランスプランテーション後０〜４日目にB7.75-84ペプチドおよびCsAで同時に処置された7/11のラットは、それらのグラフトを＞200日間維持した（CsA単独に比較して、p=.0090）。まとめると、これらの結果は、B7.75-84ペプチドが、亜治療用量のCsAとの組合せで用いられた場合、グラフト寛容性を誘導し得ることを示す。ペプチド処置は、トランスプランテーションの前または後の期間に投与される場合に効果的である。 CsAおよびペプチドの同種異系グラフト生存に対する相乗効果は、ペプチド配列に依存する：トランスプランテーション前の２週間または手術後の４日間に、０〜４日目でのCsAと組み台わせてB2702.75-84ペプチドで処置されたラットにおけるグラフトは、CsA単独で処置された動物において同種異系グラフトに対して同様に拒絶された。これらの結果は、上記で試験されたプロトコルにおいて、B7.75-84（しかし、 B2702.75-84ではない）は、前述のラットのプロトコルにおいて同種異系グラフトの拒絶を防止することに有用であったことを示す。Ｄ．寛容性のドナー特異性の実証 B7.75-84＋CsAの組合せで処置された大半のラットが、これらのグラフトを拒絶しなかったが、動物が寛容性でない可能性はまだ残った。処置は、一般的な免疫抑制状態を産生したかもしれないし、またはグラフトが、抗原提示機能もしくはダウンレギュレートされたＭＨＣを失ったのかもしれない。寛容性とこれらの他の可能性とを識別するために、グラフトを最低100日間維持したラットに、最初のグラフトとは遠位の第二の腹部心臓同種異系グラフトを再びトランスプラントした。さらなるペプチドまたはCsA処置は与えなかった。Brown Norway(BN)(RT lⁿ)ドナー（n=4）由来の第二の心臓同種異系グラフトを受けたラットは、14日までにBN同種異系グラフトを拒絶したのに対し、元のドナーと同一の株由来の第二の心臓グラフトを受けたラット（n=3）は、第二の同種異系グラフトを無期限に受容した。この寛容性の組織特異性を評価するために、それらの心臓グラフトを＞100日間維持した動物に、２つの全厚腹部皮膚同種異系グラフトを与えた（n=4）：左側のグラフトは、BNドナーから、そして右側のグラフトは、Lewドナーからであった。再び、さらなるペプチドまたはCsAは投与しなかった。BN皮膚グラフトは、11日目までに拒絶されたのに対し、Lew皮膚グラフトは、拒絶の徴候を示さなかった（＞200日）。興味深いことに、第二の同種異系グラフト（心臓または皮膚）の拒絶は、元の心臓グラフトの機能に影響を与えなかった。したがって、B7.75-84ペプチド＋亜治療用量のCsAで処置したラットは、ドナー特異的寛容性を示した。Ｅ．経口投与の効果薬物が与えられる経路は、その強度にしばしば影響を与え得る。Carpenterおよびその共同研究者らは、ラットＭＨＣクラスII分子の非ラセン領域に対応する合成ペプチドの胸腺内注射が、血管が新生したグラフトの生存を延長したことを報告している（Sayeghら、Transplant Proc．（1993）25:357）。対照的に、Fab reおよびその共同研究者らは、RT1A^a分子の残基57〜80に対応する合成ペプチドが、完全フロイントアジュバント中で投与される場合、寛容原性というよりもむしろ免疫原性であることを見出した（Fangmannら、Transplant Proc．（1993）2 5:183）。B7.75-84ペプチドの経口投与が、同種異系グラフトに対する寛容性を誘導するか否かを決定した。ペプチド単独で経口的に処置されたラットは、正常なキネティクスでグラフトを拒絶した。しかし、ペプチドを経口的にトランスプランテーション前の−14、 −12、−10、−７日目に与えられた8/12の動物、および手術の０〜４日後に０〜４日目にCsAと組み合わせて処置された9/12の動物は、そのグラフトを＞200日間維持した（CsA単独に比較して、それぞれp=.005および.0007）。さらに、その心臓同種異系グラフトを維持したラットに引き続いてドナーおよび第三者からの皮膚同種異系グラフトを与えた場合、それらは第三者のグラフトを拒絶したが、ドナーの皮膚グラフトは拒絶しなかった。したがって、B7.75-84ペプチドの免疫調節性効果は、経口または静脈内投与のいずれかによって達成され得る。Ｆ．B7.75-84ペプチド誘導寛容性の機構 B7.75-84ペプチドが同種抗原に対する応答を改変する機構を調査するために、いくつかの免疫学的パラメータを試験した。蛍光励起セルソーター分析は、ペプチド処置ラット対ナイーブラットから単離された胸腺または脾臓における細胞の絶対数またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットのパーセントに差異がなかったことを示した。ペプチドで処置されたラットから得られた脾臓細胞の分裂促進因子または同種抗原によって誘導された増殖は、コントロールの増殖と同一であった。さらに、寛容性ラット由来の脾細胞は、ナイーブラットにおいて同種応答を直接抑制し得なかった。このことは、「サプレッサー」細胞が関与していなかったことを示している。しかし、ドナー応答性細胞は、寛容性ラットにおいて実証され得た。限界希釈分析を用いて、本発明者らは、ナイーブACI動物から得られた脾細胞におけるLew特異的ＣＴＬの前駆体頻度が、303,611中１であることを見出した。Lewis心臓同種異系グラフトを100日間を超えて維持したACIラットから得られた脾細胞におけるLew特異的ＣＴＬ前駆体の頻度は、98,646中１であった。これらの結果は、アネルギードナー応答性細胞が、インビボで存在し、そしてこれらの細胞は、インビトロで限界希釈培養物に添加された外因性のサイトカインによってアネルギーから放出されたことを示唆する（JenkinsおよびMiller Fa seb J．（1992）6:2428；Atteisら、J.Exp.Med．（1991）175:491）。ラットＭＨＣクラスＩ分子について入手可能な唯一の配列は、RT1A分子であり、これはB7 .75-84と10アミノ酸のうち７において同一であり、これは、RT1A配列に10残基のうちわずか５において同一であるB2702.75-84ペプチドとは対照的であることに留意されたい（RT1A.75-84RVDLRTLRGY）。Ｇ．抗体応答これらのペプチドのいずれも、ラットにおいて可溶性タンパク質抗原であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に対する抗体応答を調節し得なかった。KLHでの免疫の前の、それと同時の、またはその後の、ペプチドのラットへの投与は、７または14日後に得られた血清において検出された抗KLH抗体の力価を変更しなかった。実施例３マウスにおける同種異系グラフト拒絶に対するペプチドの効果実施例３Ｃにおけるプロトコルに従って、CsAと組み合わせてB2702.75-84ペプチドで処置したラットは、異種グラフト拒絶の防止を示さなかった。マウスにおいて行われた類似のプロトコルは、B2702.75-84ペプチドがこのような寛容性を与え得ることを示す。実施例３Ｃに示す手順に従って、B2702.75-84（80mg/kg/日；ip）の、（H-2^b ）マウス心臓同種異系グラフトでのC57B1/6の（H-2^k）レシピエントを伴うCBAマウスへの毎日の投与は、グラフト生存を、未処置コントロール動物における7.5 ±1.2日に比較して、11.4±2.6日に延長した（n=8；p＜0.01，Mann-Whitney U検定）。トランスプランテーション後５日目に開始する同一の化合物を用いた治療は、グラフト生存を9.2±0.4日に延長した（n=5；p＜0.02）。このことは、目的の組成物が、進行中の拒絶発症において有用であり得ることを示している。亜治療用量のシクロスポリンＡ（2.7mg/kg/日；ip；０〜４日）と組み合わせて、目的のペプチドは、シクロスポリンＡ単独治療を受けた動物における14日の中央値のグラフト生存に比較して、グラフト生存を少なくとも45日間延長した（４つのグラフトのうち３は依然鼓動している）。したがって、B2702.75-84は、マウスにおいて高度に効果的である。 B2702.75-84をＤ異性体として調製し（全てのアミノ酸がＤ型である）、そしてマウスグラフトレシピエントに10mg/kg/日で投与した場合（ip；０〜10日）、グラフト生存は、５匹の動物のうちの４匹において22日を超えて延長された（５つのうち４つが依然鼓動している）。これらのデータから、Ｄ異性体は、インビボでＬ異性体よりも強力であるようである。これらの結果から、実質的な優位性が、生理学的安定性を増強するために、非天然のＤアミノ酸で１つ以上のアミノ酸を置換することによって起こることは明白である。さらなる一連の実験において、B2702.84-75/75-84を、移植片対宿主病（GVHD ）のマウスモデルにおいて試験した。ドナー/レシピエントマウスは、その主要組織適合性複合体位置で整合するが、少数の位置で非整合である。これは、90％の骨髄グラフトレシピエントの状況に密接に近い状況である。レシピエントマウスを、致死的に照射し（900R）、そしてドナー動物由来の骨髄および脾臓細胞の組合せを与えた。B2702.84-75/75-84処置の非存在において、全ての動物は、30 日以内にGVHDの証拠を示した。しかし、このペプチドで100μg/マウス/ipで35日間毎日処置されたマウスは、GVHDをこのときに示さなかった。しかし、その後の 20日間に、これらのマウスのいくつかは、GVHDを発症させた。この結果は、ペプチドと亜治療用量のシクロスポリンＡの投与を組み合わせることによって改善されると予想される。本発明の化合物は、それら自身によってか、または他の薬物（特に免疫抑制剤薬物）との組合せによってのいずれかで、グラフトの受容を大きく増強させるために使用され得る。ＣＴＬの活性を調節する能力は、多くの機会をインビトロおよびインビボでの溶解の阻害のために提供する。本明細書中で引用される全ての出版物および特許出願は、各々の個々の出版物または特許出願が、特別に、および個々に参考として援用されることが示されているかのように、本明細書中で参考として援用される。上記の発明がいくらか詳細に例示および実施例によって、理解の明確化のために記載されたが、当業者には、特定の変更および改変が添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明の教示に照らして容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 5/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 7/00 16/00 16/00 17/00 17/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 15/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クレンスキー，アランエム. アメリカ合衆国カリフォルニア 94305, スタンフォード，メイフィールドアベニュー 812

Claims

【特許請求の範囲】１．３０アミノ酸までの、Ｎ末端アシル化ならびにＣ末端アミド化およびエステル化形態を含む、ペプチドタイプ化合物またはその改変体もしくはフラグメントである、免疫調節活性を有する化合物であって、ここで該ペプチドタイプ化合物が以下の式を含む：（ａ）Ｒａａ^76-77Ｌａａ^79-84 または（ｂ）ａａ^84-79Ｌａａ^77-76Ｒここで、ａａ⁷⁶は、ＥまたはＶであり；ａａ⁷⁷は、Ｄ、ＳまたはＮであり；ａａ⁷⁹は、ＲまたはＧであり；ａａ⁸⁰は、ＩまたはＮであり；ａａ⁸¹は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；ａａ⁸²は、ＲまたはＬであり；ａａ⁸³は、ＧまたはＲであり；そしてａａ⁸⁴は、小さいまたは疎水性のアミノ酸であり；ここで、該化合物において、アミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ異性体である。２．ａａ⁸⁰がＩである、請求項１に記載の化合物。３．前記アミノ酸の全てがＤ異性体である、請求項１に記載の化合物。４．式（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列、式ａａ^79-84、ａａ^84-79、Ｌ−ａａ^79-84 、ａａ^84-79−Ｌ、ａａ⁷⁷−Ｌ−ａａ^79-84、ａａ^84-79−Ｌ−ａａ⁷⁷、ａａ^76-77 −Ｌ−ａａ^79-84、またはａａ^84-79−Ｌ−ａａ^77-76のそのフラグメントからなるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の化合物。５．ａａ⁷⁹がＲである、請求項１に記載の化合物。６．ａａ⁸¹がＡまたはＬである、請求項１に記載の化合物。７．ａａ⁸²がＬである、請求項１に記載の化合物。８．ａａ⁸³がＲである、請求項１に記載の化合物。９．ａａ⁸⁴がＹである、請求項１に記載の化合物。１０．ＲＩＡＬＲＹ、ＲＩＬＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲ、ＹＲＬＬＩＲ、ＲＥＮＬＲＩＡＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲＬＮＥＲ、ＲＥＮＬＲＩＬＬＲＹ、ＹＲＬＬＩＲＬＮＥＲ、ＲＥＤＬＲＩＡＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲＬＤＥＲ、ＲＥＤＬＲＩＬＬＲＹ、またはＹＲＬＬＩＲＬＤＥＲである、請求項１に記載の化合物。１１．ＲＩＡＬＲＹ、ＲＩＬＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲ、ＹＲＬＬＩＲ、ＲＥＮＬＲＩＡＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲＬＮＥＲ、ＲＥＮＬＲＩＬＬＲＹ、ＹＲＬＬＩＲＬＮＥＲ、ＲＥＤＬＲＩＡＬＲＹ、ＹＲＬＡＩＲＬＤＥＲ、ＲＥＤＬＲＩＬＬＲＹ、またはＹＲＬＬＩＲＬＤＥＲである、請求項３に記載の化合物。１２．ＭＨＣ非適合ドナーからのトランスプラントのレシピエントによる受容期間を延長するための方法であって、所定のレジメに従って、該ドナーに、該トランスプラントの受容期間を延長するに有効な量で、請求項１に記載の化合物を投与する工程であって、これにより、該トランスプラントの受容期間が延長される、工程を包含する、方法。１３．前記化合物が、亜治療投与量の免疫抑制剤と組み合わせて投与され、そして前記受容期間が、該化合物の非存在下で該亜治療投与量としての該免疫抑制剤の投与から生じる期間に比べて長い、請求項１２に記載の方法。１４．請求項１に記載の化合物および亜治療投与量の免疫抑制剤を、生理学的に受容可能な媒体中に、哺乳動物におけるトランスプラント拒絶を阻害するに十分な量で共に含む組成物。１５．ペプチドであり、かつ該ペプチド中のすべてのアミノ酸残基が遺伝子でコードされている、請求項１に記載のペプチドタイプ化合物の部分。１６．請求項１５に記載の部分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。１７．前記ＤＮＡ分子が宿主細胞中に含まれるとき、請求項１５に記載の部分を産生するための発現系を含むＤＮＡ分子。１８．請求項１７に記載のＤＮＡ分子を含むように改変されている、組換え宿主細胞。１９．請求項１５に記載の部分を調製する方法であって、前記ペプチドの産生のための発現系を含むＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を、該ペプチドが産生される条件下で培養する工程；および該ペプチドを該培養から回収する工程を含む、方法。２０．請求項１に記載の化合物と特異的に免疫反応性である抗体。