DD139125B1 - Verfahren zur herstellung von undekapeptiden - Google Patents

Description

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung von Undekapeptiden der allgemeinen Formel I, in der R¹ und R² für Phe, am aromatischen Ring substituiertes Phe und andere Aminosäurereste und R³ für Met und Nie stehen,

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH₂ (I)

wobei R\ R² und R³ vorzugsweise folgende Bedeutung haben:

R¹ = RJ = Phe, R³ = Met - Substanz P

R¹ = R²= Phe, R³ = Nie Nle"-SubstanzP

R¹ = Phe, R² = Tyr, R³ = Met Tyr⁸-Substanz P

R¹ = r2 = phe (Cl), R³ = Nie Phe (Cl)⁷⁸, Nle"-Substanz P

R¹ = Phe, R² = Tyr, R³ = Nie Tyr⁸, Nle¹¹-Substanz P

R¹ = Phe, R² = Tyr (J₂), R³ = Nie Tyr (J₂)⁸, Nle"-Substanz P

Bei den drei letztgenannten Analogen handelt es sich um neue Verbindungen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

SP ist aus dem Darm und dem Hypothalamus von Säugetieren isoliert und inzwischen auch in Bereichen des zentralen und peripheren Nervensystems nachgewiesen worden, SP wirkt auf die glatte Muskulatur tonisierend und kontrahierend, stimuliert die Speicheldrüsen, senkt den Blutdruck und spielt im ZNS eine Rolle als Transmitter bzw. Modulator bei der Übertragung sensorischer Reize. SP, SP-Analoga, verkürzte C-terminale SP-Sequenzen und deren pharmazeutisch anwendbare Addukte und Salze haben Aussicht, in der Gastroenterologie zur Verdauungsregulation und als ZNS-Pharmakon am Menschen sowie als Veterinärpharmakon in Anwendung zu kommen

Einige der aufgezählten Verbindungen I sind Vorstufen für radioaktiv markierte Produkte.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Synthese von Substanz P und analoger Verbindungen ist mehrfach beschrieben worden, z. B. nach der Merrifield-Methode von G.W. Tregearund Mitarb., Nature New Biology 232,87 (1971). J. L. M. Syrier und Mitarb, in „Peptides 1974". Proceedings of the 13. European Peptide Symposium, Israel 1974, ed. Y. Wolman, 1975, Wiley, New York u. Toronto and Israel Universities Press, Jerusalem, 1975 S. 105, J. ν. Rietschoten und Mitarb., ibid. S. 113; G. H. Fisher und Mitarb., J. Med. Chem. 17,843(1974); R.W. Bury und Mitarb., J. Med. Chem. 19, 854 (1976).

Die durch schrittweisen Aufbau am festen oder löslichen (E. Bayer und Mitarb., Chem. Ber. 107,1344(1974]) polymeren Träger ohne Isolierung von Zwischenprodukten erhaltenen Produkte genügen in Qualität, Quantität und Reproduzierbarkeit nicht den Ansprüchen, wie sie für eine pharmazeutische Anwendung zu stellen sind.

Die Herstellung von SP sowie einiger Analoga erfolgte auch durch Anwendung konventioneller Methoden. Hierbei gelangte sowohl die Synthese durch stufenweisen Aufbau (J.Bergmann u. Mitarb., Experentia 30,401 [1974]) als auch durch Fragmentkondensation (H.Yajima u. Mitarb., Chem. Pharm. Bull. 21, 2500 [1973], F. K. Mutulis u. Mitarb., 3.Allunions Symp. „Chemie der Peptide und Proteine" Kiew 1974—Abstracts S. 103; R. O. Studer und Mitarb., Substance P, ed. by U. S. ν. Euler und B.Pernow, Raven Press, New York 1977, S. 15; N.Yanaihara und Mitarb., ibid., S. 27; H.Yajima und Mitarb., Chem. Pharm. Bull, 24, 544 [1976D zur Anwendung.

Die stufenweise Synthese erschwert die Herstellung von Peptidmengen im Gramm-Maßstab und ist fur die Synthese von Analoga unrationell. Eine Synthese (Substanz P, Raven Press, New York 1977, S. 15), die zwei Fragmentkondensationen einsch ießt, beinhaltet die nachteilige Aktivierung von razemisierungsgefährdeten Aminosäuren. In der in Chem. Pharm. Bull. 21, 25C0 (1973) beschriebenen Synthese von Substanz P werden Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen verwendet, deren acidolytische Abspaltung von irreversiblen Nebenreaktionen am Methionin begleitet sein können. Von Nachteil ist auch die Umsetzung vor Z(OMe)-Lys(Z)-OPcp mit dem Triethylaminsalz des Prolins in wäßrig/organischem Milieu im Rahmen der Herstellung des Fragments Z(OMe)-Lys(Z)-Pro-OH, da unter diesen Bedingungen stets eine partielle Hydrolyse des Aktivesters erfolgt und das so erhaltene Dipeptid das kaum abtrennbare Z(OMe)-Lys(Z)-OH als Verunreinigung enthält. Die Kupplung der Dipeptide zum N-term. Tetrapeptid wird über den zusätzlich herzustellenden Aktivester Z-ArgfNC^l-Pro-OPcp realisiert und liefert nur mäßige Ausbeuten (41 %). Auch die Kondensation des N-term. Tetrapeptides mit dem C-term. Heptapeptid mittels DCC/HOBt liefert mit 67% nur mäßige Ausbeuten. Zudem muß bei den langen Kupplungszeiten (48 Std.) bei Peptiden mit N-term. Glutaminsaurerest mit erheblicher Pyroglutaminylpeptid-Bildung gerechnet werden. Diese Faktoren fuhren insgesamt zu einer nicht befriedigenden Gesamtausbeute des in Chem. Pharm. Bull. 21, 2500 (1973) beschriebenen Verfahrens (siehe Tab.1).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, Methoden der Peptidsynthese in der Weise zu kombinieren, daß Substanz P und darüber hinaus im C-terminalen Bereich modifizierte Substanz P-5equenzen der allgemeinen Formel I in hoher Ausbeute und hoher Reinheit im Gramm-Maßstab bei minimalem Reinigungsaufwand hergestellt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erindung ist dadurch gekennzeichnet, daß ein geschütztes N-terminales Tetrapeptid der Sequenz Boc-Arg(NO2)-Pro-Lys(Boc)-Pro, aufgebaut aus den Dipeptiden Boc-Arg(NO2>Pro-OH und H-Lys(Boc)-Pro-OH, mit Heptapeptiden der Sequenz GIn-G n-R'-R²-Gly-Leu-R³-NH₂, in dem R' bis R³ die o.g. Bedeutung haben, nach der Mischanhydrid-Methode umgesetzt werden und die Schutzgruppen anschließend entfernt werden. Zum Aufbau des Tetrapeptides Boc-Arg-(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-OH wird Boc-Nitroarginin als Mischanhydrid mit ProOMe gekuppelt und 2um Boc-ArgfNC^-Pro-OH verseift. Fur die Umsetzung von Z-Lys(Boc)-OTcp mit Pro wird Prolin als Tnton-B-salz in wasserfreiem Dimethylformamid eingesetzt. Z-Lys(Boc)-Pro-OH wird durch katalytische Hydrierung in H-Lys(Boc)-Pro-OH umgewandelt und dieses mittels Mischanhydrid-Synthese in das geschützte Tetrapeptid Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-OH überfuhrt. Die Herstellung des C-terminalen Heptapeptides H-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-L£(U-MetNH₂ erfolgt nach einem bekannten Verfahren (M.Bienert und Mitarb., DD-PS 108744 vom 3.12.1973). Die C-terminalen Heptapeptide, die Norleucin, Tyrosin oder p-Chlorphenylalanin enthalten, werden durch stufenweisen Aufbau über Mischanhydride oder Aktivester unter Verwendung der tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe hergestellt, können aber auch mit Hilfe anderer an sich bekannter peptidchemischer Methoden gewonnen werden.

Die Entfernung der Schutzgruppen von den Undecapeptiden im Falle R³ = Met erfolgt entweder durch Behandlung mit HF und nachfolgendes Erwärmen in wäßriger Losung oder durch separate Abspaltung der Boc-Schutzgruppen in an sich bekannter Weise und nachfolgendes Behandeln mit HF. Der Syntheseweg ist im Formelschema I zusammengestellt. DasVsrfahren weist einige Vorteile auf: So erfolgt die Umsetzung von Z-Lys(Boc)-OTcp mit Prolin über dessen Triton B-SaIz in wasserfreiem DMF, wodurch die nachteilige, bei Arbeiten in wäßrig/organischem Milieu zu beobachtende teilweise Hydrolyse des Activesters unter Bildung des auf rationellem Wege nicht abtrennbaren Z-Lys(Boc)-OH vermieden wird. Durch den Einsatz von Carboxyl-ungeschützten Prolin wird die bei Einsatz von Prolinmethylethyl oder -benzylestern nicht zu unterdruckende Diketopiperazin-Bildung verhindert. Das auf diese Weise hergestellte Dipeptid kann mit Ausbeuten >90% hergestellt werden. Von Vorteil sind auch die durch Anwendung oer Mischanhydrid-Methode erzielbaren hohen Ausbeuten der 2 + 2 sowie der 4 + 7· Fragmentkondensationen, die ebenfalls deutlich hoher liegen, als die in Chem. Pharm. Bull. 21, 2500 (1973) angegebenen (Tab. 1). Die so erhaltenen Tetra- bzw. Undecapeptide fallen auch in besserer Reinheit an, da sie nicht durch Dicyclohexylharnstoff und HOBt verunreinigt sind. Die Mischanhydrid-Synthese gestattet eine Kupplung von Tetra- mit Heptapeptid innerhalb wesentlich kürzerer Zeiten, als dies mit der DCC/HOBt-Methode möglich ist, so daß die bei Fragmentkondensationen mit N-term. Glutaminrest als Konkurrenzreaktion ablaufende Cyclisierung unter Bildung von Pyroglutamyl-Heptapeptid stark reduziert werden kann (<2%). Dies führt zu einer höheren Reinheit der Undecapeptide, so daß sich auch die Reinigungsausbeute erhöht (Tab.1).

Die erfindungsgemäß hergestellte Peptide (R³ = Met) enthalten neben < 5% der Ausgangsfragmente ca. 5% S-Oxid, die durch Verteilungschromatographie an Sephadex G25 abgetrennt werden. Eine Reinigung kann auch durch lonenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose erfolgen. Die erhaltenen Produkte I werden in hoher Ausbeute erhalten und sind chromatographisch und elektrophoretisch rein (Reinheit >98% an gewünschtem Peptid gemäß HPLC-Unteisuchung).

Tabelle 1 Bei der Herstellung der N-term. Tetrapeptidsequenz, der Fragmentkondensation sowie der Reinigung erhaltene Ausbeuten im Vergleich zu Chem. Pharm. Bull. 21, 2500 (1973)³'

Peptid31	Ausbeute (%)3>	Peptid	Ausbeute (%)
Z-Arg(NO2)-Pro-OH	80	Boc-Arg(N02)-Pro-OMe	70
Z-Arg(N02)-Pro-OPfp	82	Boc-Arg(N02)-Pro-OH	75
Z(OMe)-lys(Z)-Pro-OH	74	Z-Lys(Boc)-Pro-OH	95
Z-Arg(N02)-Pro-Lys(Z)-Pro-OH	41	Boc-Arg(N02)-Pro-Lys(Z)-Pro-OH	70
Substanz P (geschützt)	67	Substanz P (geschützt)	85
Substanz P (gereinigt)	37	Substanz P (gereinigt)	60
Gesamtausbeute, bezogen auf eingesetztes		Gesamtausbeute, bezogen auf eingesetztes
Arg-Derivat	5	Arg-Denvat	18+)
auf eingesetztes Lys-Derivat	7	auf eingesetztes Lys-Derivat	34

Die anderen Undecapeptide der ellg. Formel I werden in Gesarrtausbeuten von 11-23% erhalten

Schema I

Boc-Arg(NO₂)-OH + H-Prο-OMe Z-Lys(Boc)-OTci Π-Pro-OH

Triton B

1. Mischanhydrid-Synthese

2. Verseifung

Boc-Arg(N0₂)-Pro-OII

Mischanhydrid-Syntheoe

Boc-Arg(W0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-OH Mischanhydrid-Synthese

1. Aktivester-Methode

2. Hydrierung

H-Lys(Boc)-Pro-OH

+ H-Gln-Gln-R¹-R²-

1. HP/Anisol

2. Verteilungschromatographie

Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Gln-G!n-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH₂

B? = Met

HCl/AcOH λ ^I (R-* = Nie)

1

H-Arg(NO₂)-Pro-Lys-Pro-Gln-GIn-R'-R^c-Gly-Leu-Met-NH₂

1. HP/Anisol

2. Verteilungschromat ographie

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH, (D

ro ' οι

Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I

näher erläutern.

Systeme für die Dünnschichtchromatographie (Silufol-Fertigplatten):

A n-Butanol/Eisessig/Wasser 4/1/1

B Chloroform/Methanol/Wasser 40/15/5

C Essigester/PYridin/Eisessig/Wasser 120/20/6/11

D n-Butanol/Pyridin/Eisessig/Wasser 20/12/2/14

E Essigester/Pyridm/Eisessig/Wasser 60/20/6/11

Beispiel 1:

Boc-Arg(NO₂)-OH (2OmMoI) in 60ml THF werden bei -15°C mit 2,22ml (2OmMoI) N-Methylmorpholin und (2OmMoI) 2,62ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach 5min setzt man 4,00g H-Pro-OMe · HCI (24mMol) und 2,68ml N-Methylmorpholin (24mMol) in 30 ml DMF zu und rührt 1 h bei -10⁰C und 2 h bei Raumtemperatur. Es wird i. Vak. eingeengt und das verbleibende Öl in Essigester/halbgesättigter wäßriger NaCI-Losung aufgenommen. Die Essigesterphase wird mit 5%iger KHSCVLösung, NaCI-Lösung, 5%iger NaHCO₃-Losung und halbges. NaCI-Lösung extrahiert, mit MgSO₄ getrocknet und nach dem Filtrieren eingeengt. Man erhält 5,4g des Methylesters als weißen Schaum (70% d.Th.). Ia]I⁰ - -44° (c = 1, Aceton), Rf (C) = 0,80 sowie schwacher Nebenfleck bei Rf 0,50.

4,8g Boc-Arg(NO₂)-ProOMe werden in 20ml Ethanol gelöst und mit 15ml 1 N NaOH versetzt. Nach 60min wird i.Vak. eingeengt, der Rückstand in 20 ml 5%iger NaHCO₃ aufgenommen und mit Essigester 3x ausgeschüttelt. Man stellt mit KHSO₄-Losung pH3,0 ein, sättigt die Losung mit K₂SO₄ und extrahiert 5 χ mit je 30 ml Chloroform. Die Aufarbeitung der organischen Phase liefert 3,6g Boc-Arg(N0₂)-Pro-OH als weißen Schaum (75% d.Th.), Ia]I⁰ = -50° (c = 1; Methanol), Rf (A) = 0,75, Rf (C) = 0,3, C₆H₂₈N₆O₇ (416,4) Ber.: C 46,15 H 6.78 N 20,18 Gef.: C 46,92 H 7,08 N 19,37

Beispiel 2:

H-Lys(Boc)-Pro-OH

2,30g Prolin (2OmMoI) werden in 20ml Methanol gelöst und 10ml einer 40%igen methanolischen Triton B-Lösung versetzt. Das Methanol wird abdestilliert, der Rückstand 2x in 20ml DMF weitgehend gelost und das DMF im Ölpumpenvakuum jeweils wieder abdestilliert. Das Triton B-SaIz wird in 40 ml DMF suspendiert und mit 5,60g Z-Lys(Boc)-OTcp (1OmMoI) bei 0⁰C versetzt. Es entsteht sofort eine klare Lösung, die Reaktion ist nach 5min beendet. Das DMF wird im Ölpumpenvakuum entfernt. Der Rückstand wird in 50ml 5%iger NaHCO3-Lösung aufgenommen und 3x mit Essigester extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 5%iger KHSO₄-Lösung angesäuert (pH 3,0) und das ausfallende Öl durch Extraktion mit4x 50 ml Essigester aufgenommen. Der Extrakt wird mit wenig H₂O gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das nach Filtration und Einengen erhaltene Öl enthält noch beträchtliche Mengen Trichlorphenol, die durch dreimaliges Umfallen aus Ether/Petrolether (30-50⁰C) entfernt werden. Nach Entfernung letzter Lösungsmittelreste i.Vak. erhalt man einen Schaum. Ausbeute 4,5g (95% d.Th.) bezogen auf Z-Lys(Boc)-OTcp,

Ia]I⁰ = -33° (c = 1; Essigester), Rf (E) = 0,6 Das Produkt ist frei von 2-Lys(Boc)-OH. C₂₄H₃₆N₃O₇ (477,5) Ber.: C 60,34 H 7,39 N 8,80 Gef.: C 60,88 H 7,52 N 8,10

2g Z-Lys(Boc)-Pro-OH werden in 70%igem Methanol gelöst, mit PdO/BaSO₄ versetzt und 3 h bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und der Überstand zur Trockne eingeengt. Das deblockierte Dipeptid H-Lys(Boc)-Pro-OH wird in quantitativer Ausbeute als festes Harz erhalten

F. 107-111 ⁰C, Ia)g° = -47' (c = 1; Methanol) Rf (A) = 0,35, C₁₆H₂₉N₃O₆ (343,4).

Beispiel 3:

Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys-(Boc)-Pro-OH

1,7g (5 mMol) frisch hergestellte AminokomponenteH-Lys(Boc)-Pro-OH und 0,63 ml N-Äthylmorpholinin20ml DMF werden auf -20⁰C gekühlt und zu einer Lösung von 1,66g (4mMol) Boc-Arg(N0₂)-Pro-OH und 0,504ml (4mMol N-Ethylmorpholin) in 20ml DMF gegeben, die 20min bei -15°C bis -10"C mit 0,544ml (4mMol) Chlorameisensäureisobutylester reagiert hatte. Man rührt 1 h bei - 1O⁰C und 2 h bei O'C, entfernt das DMF im Ölpumpenvakuum, nimmt den Ruckstand in 50 ml Essigester und 50 ml 5%iger KHSOj-Lösungauf, extrahiert die wäßrige Phase 3x mit Essigester, wäscht die vereinigte, organische Phase 2 χ mit 5%iger KHS0₄-Lösung und 2x mit halbkonzentrierter NaCI-Lösung. Nach dem Trocknen wird eingeengt und mit Ether verrieben. Man erhält 2,44g (85%) weißes Pulver, das neben der Tetrapeptidsaure (Rf[C] 0,70) noch geringe Mengen Carboxylkomponente (RF(C] 0,60) sowie zwei unpolare Nebenprodukte enthält, die durch zweimaliges Umfallen aus Chloroform/Ether entfernt werden können. Ausbeute 2,07 g (70%, bezogen auf eingesetztes Boc-Arg[NO₂]-Pro-OH). F. Erweichen ab 164-168⁰C, [a]g° = -69,5° (c = 1; Methanol) C₃₂H₅₆N₉O_n (741,8) Ber.: C 51,81 H 7,47 N 16,99 Gef.: C 50,98 H 7,21 N 16,23

Beispiel 4:

Boc-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetN^

Die Herstellung von Boc-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNHz ausgehend von H-Gly-Leu-MetNH₂ (B. Mehlis und Mitarb., J. prakt. Chem. 314,390 [1972]) unter Verwendung von Boc-Phe-OTcp und Mischanhydrid-Kupplungen von Boc-Gln-OH erfolgte nach M. Bienen und Mitarb., DDR-Pat. 108744, 3.12.1973.

Die im folgenden aufgeführten Analoga dieses Heptapeptides werden ebenfalls nach diesem Verfahren hergestellt. BoC-GIn-GIn-PhC(CI)-PhC(CI)-GIy-LeU-NIeNH₂:

F. 260-70⁰C (Zers.) [a}l° = -26°(c = 1; DMF) Rf(A) = 0,76, Rf(B) = 0,55. Rf(C) = 0,23; C₄₇H₆₈N₁₀O_nCI₂.

Boc-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-NleNHj:

F. 260-5⁰C (Zers.), [a]l° = -36° (c = 1; DMF), Rf(A) = 0,73. Rf(B) = 0,52, Rf(C) - 0,19, C₄₇H₁₀N₁₀OtI.

Boc-Gln-Gln-Phe-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-NleNH₂:

F. 269-72'C (Zers.), |a]§° = -20°[c = 1; DMF), Rf(A) = 0,75, Rf(B) = 0,55, Rf(C) = 0,23; C₅₄H₇₆N₁₀C₂.

Boc-Gln-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-MetNHj:

F. 208-224⁰C (Zers.), [«]§° = -29°(c = 1; DMF) Rf(A) = 0,68, Rf(B) = 0,45, Rf(C) = 0,13; C₄₆H₆₇N₁₀O₁₂S(984,2) Ber.; C56.14 H 6,86 N 14,23 Gef.: C 55,69 H 6,82 N 13,87

Beispiel 5:

Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂

1,93 g (2,61 mMol) Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-OH in 40 ml DMF werden mit 0,33 ml (2,61 mMol) N-Ethylmorpholin und nach Kühlen auf-20"C mit0,356ml (2,61 mMol) Chlorameisensaureisobutylester versetzt. Man rührt 20 min bei -15°C und setzt 2,35g (2,61 mMol) frisch hergestelltes Heptapeptid H-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂ HCI — erhalten durch Behandlung von Boc-GI-i-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNHi mit HCI/Eisessig — und 0,365ml N-Ethylmorpholin (2,9OmMoI) in 40ml DMF (das Heptapeptid lost sich nicht vollständig) bei -2O⁰C zu. Es wird 1h bei -10⁰C bis -5°Cund 2h bei +5⁰C gerührt und die klare Losunci aufgearbeitet, wie bei Beispiel 3 angegeben. Man erhalt 3,5g weißes Pulver (85% d. Th.), F. 208-218⁰C (Zers.), [a]g° = -48,5° (c = 0,5; DMF), Rf(A) = 0,5, Rf(D) = 0,8; C₇₃H₁₁₃N₁₉O₁₉S (1592,9)

Die folgenden aufgeführten Analoga werden ebenfalls nach diesem Verfahren hergestellt. Boc-Arg(N0₂)-Pro-lys(Boc)-Pro-Gln-Gln-Phe(CI)-Phe(CI)-Gly-Leu-NleNH₂: Rf(A) = 0,43, Rf(D) = 0,76, Ausbeute 91 %

C₇₄H₁₁₃M₁₉O₁₉CI₂

Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-NleNH₂;

F. 260-262⁰C (Zers.), Ml⁰ = -42° (c = 0,25; Eisessig), Rf(A) = 0,40, Rf(B) = 0,51,Rf(C) = 0,12; Ausbeute 89%. C₇₄H₁₁SiN₁₉O₁₉

Boc-Arg(NO₂)-Pro-Lys(8oc)-Pro-Gln-Gln-Phe-Tyr( BzI)-GIy-LeU-NIeNH₂:

F. 230-232⁰C (Zers.), [α]§° = -52° (c = 0,5; Eisessig), Rf(A) = 0,43, Rf(B) = 0,53, Rf(C) = 0,15; Ausbeute 82%. Ce₁H₁₂₁N₁₉O₂₀

Boc-Arg(NO)₂-P'0-Lys(Boc)-Pro-Gln-Gln-Phe-TYr-Gly-Leu-MetNH₂:

F. Erweichen oberhalb 150⁰C [α]|° = -57° (c = 0,5; Eisessig), Rf(A) = 0,40, Rf(B) = 0,49, Rf(D) = 0,68, Ausbeute 90%. C₇₃H₁₁₃N₁₉O₂₀S Ber.: C 54,53 H 7,02 N 16,55 Gef.: C 53,95 H 7,32 N 16,05

Beispiele:

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂überH-Arg(NO₂)-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂ 3,11 g BocArg(N0₂)-Pro-Lys(Boc)Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂ werden 30min mit HCI/Eisessig gerührt und das Reaktionsprodukt durch Fallen mit Ether isoliert. Man erhält 3,0g H-Arg(N0₂)-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂ als

weißes Pulver.

F. 164-178⁵C, [a)l° = -43° (c = 0,5; DMF), Rf(D) = 0,45 sowie schwacher Fleck bei Rf(D) = 0,42 (identifiziert als Sulfoxid) 3,0 g [Arg(NO₂)l '-Substanz P werden mit 3 ml Anisol und 30 ml HF 45 min bei 2 ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Ruckstand mehrmals mit Ether verrieben. Zur Reinigung werden 500mg Rohprodukt in 5OmMM Essigsäure gelost, filtriert, 3x mit Essigester extrahiert, über eine Säule 10 χ 1cm, gefüllt mit Wofatit AK40, Acetat-Form, in das Acetat überführt und lyophylisiert. Man erhalt 450mg. 200 mg werden in 4 ml Oberphase des Systems n-Butanol:1 %HAc:Pyridin = 5:11:3 gelost, von aggregierter Substanz P durch Zentrifugation abgetrennt und auf eine zunächst mit Unterphase beladene, dann mit

Oberphase aquilibrierte Sephadex-G-25-Saule (2 χ 120cm, Gelbettvolumen 375ml) aufgetragen. Durch Elution

(Tropfgeschwindigkeit 3ml/30min.) mit 160 bis 210ml Oberphase erhält man nach Aufarbeitung und Lyophilisation 120mg

chromatographisch einheitliche Substanz P.

\a\l° = -82,5° (c = 0,5; 5%ige HAc),

Rf(B) = 0,05,Rf(D) = 0,40, Elektrophorese einheitlich; Aminosäureanalyse: Arg 0,99(1); Pro2,07(2); Lys 1,00(1), Glu2,02(2);

Phe 1,98(2); GIyLOO(D; Leu 1,03(1), MetO,87.

Der Peptidgehalt des Lyophilsates betragt 78% (ermittelt durch Aminosäure-Analyse, sowie durch Acetat- und Wasserbestimmung; die Reinheit ist >98% (HPLC)

Elution mit 250-330 ml Oberphase ergibt nach Aufarbeitung 15mg Substanz P-S-Oxid.

la\o° = -72° (c = 0,5; 5%ige HAc), Rf(A) = 0,37, identisch mit einer aus Substanz P durch H₂0₂-Oxydation gewonnenen Probe.

Beispiel 7:

Andere Peptide der allgemeinen Formel I, in denen für R³ Nie steht, werden direkt in an sich bekannter Weise aus den geschützten Vorstufen (z. B. den in Beispiel 5 angegebenen) durch Einwirkung von flüssigem Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol

erhalten.

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PhefCD-PhelCD-Gly-Leu-NleNHs^alo⁰ = -48° (c = 0,5; Eisessig), Rf(D) = 0,43, Rf(A) = 0,05; Aminosäureanalyse (6NHCI/20h:Arg 1,03(1); Pro2,07(2); LysO,97(1); GIu 1,92(2); Phe(CI) 1,92(2); GlyO,95(1); Leu 1,00(1); Nie

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-NleNH₂:

[a]l° = -53° (c = 0,25; Eisessig), Rf(D) = 0,40, Rf(A) = 0,05;

Aminosäureanalyse(6NHCI/6h):Arg0,98(1);Pro2,21(2);Lys 1,00(1); GIu 1,95(2); Phe 1,86(2); GIy 1,00(1); Leu 1,02(1);

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-NleNH₂: Ml" = -53° (c = 0,25; Eisessig), Rf(D) = 0,38, Rf(A) = 0,05;

Aminosäureanalyse(6NHCI/20h):Arg1,08(1);Pro2,22(2);Lys1,12(1);Glu1,98(2);Phe1,84(1);Tyr1,00(1);Gly1,03(1); Leu 1,00(1); NleO,98(1).

Beispiel 8:

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Tyr(J₂)-Gly-Leu-NleNH₂

10 mg H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-NleNH₂ (Beispiel 7), gelöst in 2 ml NH4Ac-Puffer (10~² M, pH 6,0), werden in an sich bekannter Weise (Hung LamThang u. Morgat, Franz. Patent 2.039.530 vom 2.4.1969) mit 35μΜοΙ Jodmonochlorid, gelost in 350μΙ Methanol, innerhalb von 3 min. zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wird durch Zugabe von 400μΙ 0,1 Na₂S₂0₃-Losung beendet. Dabei fällt das Jodierungsprodukt teilweise aus. Die Mischung wird mit 0,1 N Essigsäure verdünnt, lyophilisiert und der

erhaltene Feststoff durch Verteilungschromatographie — wie im Beispiel 6 beschrieben — gereinigt.

Rf(A) = 0,43, Nebenfleck bei Rf(D) 0,38; das UV-Spektrum (pH6,81) zeigt ein Maximum bei 312nm, wie fur Dijodtyrosin-

Verbindungen bekannt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von Undekapeptiden der Formel I

   Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH₂ (D,

   worin R¹ und R² Phe oder am aromatischen Ring substituiertes Phe, R² Tyr oder am aromatischen Ring substituiertes Tyr und R³ Met oder Nie bedeuten, durch Umsetzung der Dipeptide Arg(NO₂)-Pro-OH und H-Lys-Pro-OH, anschließende Umsetzung des erhaltenen Tetrapeptides

   Arg(NO₂)-Pro-Lys-Pro_:OH mit dem Heptapeptid H-Gln-Gin-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH₂, wobei R¹ bis R³ die o.g. Bedeutung haben, nach der Mischanhydrid-Synthese, Entfernung der Boc-Schutzgruppe mittels HCI in Eisessig und der NO₂-Schutzgruppe mittels HF in Anisol und anschließende Reinigung durch Verteilungschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man Boc-Arg(NO₂)-OH als Mischanhydrid mit H-Pro-OMe kuppelt und zum Dipeptid Boc-Arg(N0₂)-Pro-OH verseift, sowie Z-Lys(Boc)-OTcp mit dem Triton-B-Salz von Prolin nach der Aktivester-Methode umsetzt und das Umsetzungsprodukt zum Dipeptid H-Lys(Boc)-Pro-OH hydriert, anschließend die beiden Dipeptide nach der Mischanhydrid-Methode in das geschützte Tetrapeptid Boc-Arg(N0₂)-Pro-Lys-(Boc)-Pro-OH überführt und dieses in an sich bekannter Weise mit dem Heptapeptid H-Gln-Gln-R¹-R²-Gly-Leu-R³-NH₂ umsetzt, Schutzgruppen abspaltet und reinigt.