JPS63179892A - Ｖｉｐ塩酸塩及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医薬品として有用なペプチドであるＶＩＰ塩酸
塩及びその製造法に関するものである。

〔従来の技術及びその問題点〕

最近のペプチドホルモンに関する研究の進歩により、消
化管に存在するペプチドホルモンの多くは、脳にも存在
し、逆に脳で発見されたホルモンの多数が消化管にも認
められることが判り、これらのホルモンは脳−腸管ペプ
チド（Ｂｒａｉｎ−ｇｕｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ）と呼称さ
れ、これらホルモンに関する研究が神経内分泌学として
脚光を浴びている。

脳−腸管ペプチドの代表であるＶＩＰ　（バソアクティ
ブ・インテスティナル・ポリペプチド（Ｖａｓｏａｃｔ
ｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄ
ｅ）　）は１９７４年ブイ・ムソト等〔ブイ・ムット等
、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（ν１Ｍｕｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）＋　４２＋５８０１９７４）　）によ
り発見された２８個のアミノ酸残基からなる分子量３３
２５．８のペプチドで次に示すようなアミノ酸配列を有
する。

Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−ＡｓｐＭｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｓｅｒ−１１ｅ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ２本ＶＩＰは血流増加、血圧低下
作用を有する（特開昭５６−１２８７２１号公報参照）
。

これまでＶＩＰについてはＶＩＰトリフルオロ酢酸塩〔
エム・ボダンスキー等、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティー（Ｍ。

Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａ＋ｗｅ
ｒ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、）＋　９６＋４９７３　
（１９７４年））、ＶＩＰ酢酸塩〔エム、タテヤマ等、
ケミカル・ファーマス−ティカル・ブレチン（Ｍ、Ｔａ
ｔｅｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　ＣｈｅＩｌｌ、　Ｐｈ
ａｒ＋ｗ、　Ｂｕｌｌ、）。

２８、１８７３　（１９８０年）〕についてのみ報告さ
れており、ＶＩＰ塩酸塩の記載はない。

また、塩酸塩の製法に関しても、目的ペプチドの酢酸塩
もしくはトリフルオロ酢酸塩を希塩酸水溶液に溶解させ
、凍結乾燥により揮発性の酸を留去し塩酸塩に変える方
法が一般法であり、この方法では酸に不安定なペプチド
の塩酸塩を製造するのは困難である。

本発明はＶＩＰ塩酸塩と、酸に不安定なペプチドＶＩＰ
塩酸塩の製造を行う技術を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、次式： ％式％ で示されるＶＩＰのＶＩＰ塩酸塩、及びその製造法、即
ちＶＩＰ　Ｉ−リフルオロ酢酸塩又はＶＩＰ酢酸塩を、
それぞれの塩に対し５〜１０００倍当量塩化水素を含む
水溶液に溶解し、ゲル濾過によるカラムクロマト処理に
よりＶＩＰ塩酸塩を分離することを特徴とするＶＩＰ塩
酸塩の製造法を提供するものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチドに関して略号で
表示する場合はＩＵＰＡＣ，ＩＵＨの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次に挙げ
る。

またアミノ酸等に関して光学異性体があり得る場合は、
特に明記しなければＬ体を示すものとする。

Ａｌａ：アラニン　　　　　　Ａｒｇ：アルギニンＡｓ
ｎ：アスパラギン　　　　Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｇｌ
ｎ：グルタミン　　　　　Ｈｉｓ：ヒスチジン１１ｅ：
イソロイシン　　　　Ｌｅｕ　：ロイシンＬｙｓ　：リ
ジン　　　　　　　Ｍｅｔ：メチオニンＰｈｅ　：フェ
ニルアラニン　　Ｓｅｒ　：セリンＴｈｒ：スレオニン
　　　　　Ｔｙｒ：チロシンＶａｌ：バリン 本発明のペプチドは、入手容易な市販のアミノ酸を利用
して簡単な操作で容易に合成することができるが、本発
明に用いたＶＩＰは固相合成法〔アール・ビイ−・メリ
ーフィールド、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエティ（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　
、ｙ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）。

顧、　２１４９　（１９６３）　）に従い、以下の如く
して合成した。

即ち、アミノ基を保護したＣ末端アミノ酸をそのカルボ
キシル基によって、不溶性担体に結合させ、次いでアミ
ノ保護基を除去した後、アミノ酸配列に従い順次アミノ
基保護アミノ酸を、その反応性アミノ基及び反応性カル
ボキシル基との縮合反応により結合させ、一段階ずつ合
成し、全配列を合成した後、ペプチドを不溶性担体から
はずすことにより製造される。ここで用いられる不溶性
担体としてはベンズヒドリルアミン系樹脂を用いること
ができる。

上記方法において、側鎖官能基を有する各アミノ酸、例
えば旧ｓ、　Ｓｅｒ、　Ａｓｐ＋　Ｔｈｒ、　Ｔｙｒ、
＾ｒｇ及びＬｙｓは、その側鎖官能基を保護しておくの
が好ましく、これは通常の保護基により保護され、反応
終了後、該保護基は脱離される。また反応に関与する官
能基は通常活性化される。これらの各反応方法は公知で
あり、それらに用いられる試薬等も公知のものから適宜
選択される〔エイ・フォーニア−等、ペプタイズ（Ａ、
Ｆｏｒｎｉｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、
　　５．１６９（１９８４年）、ディー・エイチ・コイ
等、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペブタイ
ド・アンド・プロチェイン・リサーチ（Ｄ、Ｈ，Ｃｏｙ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　）、　１
５．７３　（１９８０年）参照〕 以下、上記方法により合成したＶＩＰ　トリフルオロ酢
酸塩からＶＩＰ塩酸塩を製造する方法を例にとり詳しく
述べる。

従来ペプチドの酢酸塩或いはトリフルオロ酢酸塩を塩酸
塩に交換するためには、それらペプチドの塩を希塩酸に
溶かし、凍結乾燥を行うことにより揮発性の酸を留去し
塩酸塩に変える方法が一般的である。しかしながら、こ
の方法をＶＩＰ塩酸塩製造に用いると凍結乾燥中にＶＩ
Ｐが一部分解し、純粋なＶＩＰ塩酸塩が得られない（比
較例１参照）。

本発明ではＶＩＰ　トリフルオロ酢酸塩を、５〜１００
０倍当量、好ましくは１０〜２００倍当量の塩化水素を
含む水溶液に溶解させ、本水溶液を最低排斥限界が蛋白
質分子量に換算し１５００以下の性能を有するゲル濾過
カラムクロマトグラフィーにかける。各フラクションに
分画後、各々を各種ペプチド検出法及びｐｏ測測定より
目的のｖ■Ｐ塩酸塩留分を集め、凍結乾燥することによ
り純粋なりｒｐ塩酸塩を得ることができる。

本発明により得られるＶＩＰ塩酸塩はＶＩＰ　１分子に
対し５〜１０分子の塩酸分子を含む。

〔発明の効果〕

公知のＶＩＰ酢酸塩及びＶＩＰ　トリフルオロ酢酸塩は
その構成塩が刺激性あるいは細胞毒性を示す欠点を有す
るが、本発明において得られたＶＩＰ塩酸塩はその様な
欠点を有さす、医薬として有効に利用できる。同時に本
発明で提示した方法を用いることにより酸に不安定なＶ
ＩＰの塩酸塩の効果的な製造法が容易になった。

〔実施例〕

以下具体的実施例によって本発明を更に説明する。

実施例１　　ｍＰ塩酸塩の製造） ＶｒＰトリフルオロ酢酸塩２０．（１ｗｇを氷冷した１
％塩酸水溶液２．０−に溶解したのち２分間放置した。

次にこの溶液を、純水で膨潤・洗浄したセファデックス
Ｇ−１５（ファルマシア社製）カラム（１，７Ｘ４０ｃ
ｍ）にのせ、次いで純水を用いて溶出した。カラム温度
：室温。

溶出液はフラクションコレクター５Ｆ−１６０＜東洋科
学産業■製）を用いて３ｇ毎に分取し４０画分を得た。

各々の両分は下記参考例１で述べるクロリン試験及びｐ
Ｈ万能試験紙（東洋濾紙■製）を用いたｐＨ測定試験に
よりそれぞれＶＩＰ塩酸塩を含む両分及び遊離の塩酸を
含む両分を確認した。この結果、両分１２〜２０にはＶ
ＩＰ塩酸塩が、存在し、両分１８〜２２には遊離の塩酸
が存在することがわかった。次に両分１２〜１７を合わ
せて凍結乾燥してｉ６．６ｍｇのＶＩＰ塩酸塩を得た。

本実施例で得たｖｒｐ塩酸塩の理化学的性状は以下に示
す通りである。

（ｉ）融　　点　１９５〜１９６℃（分解）（ｉｉ）比
旋光度　〔α）　　、”−一６１゜（ｃ　＝０．１０．
０．１Ｍ酢酸水Ｒ液）（ｉｉｉ　）紫外線吸収スペクト
ル λＩｎａＸ（０，１Ｍ酢酸水溶液）ｎｍ：２３７（ε−
６５７）、　２７５（ε−６１２）（ｉｖ　）元素分析
値　Ｃ＋ａＪｚｓｅＮａ４０ａ２Ｓ　・８ＨＣＩ　・２
７Ｈｚ０として ＣＨＮ　　　Ｃ１ 計算値（％’）　　４２．９８　７．３１　１５．０１
　６．９２測定値（％）　　４２．７０　６．９５　１
５．０？　　７．０３（ｖ）アミノ酸分析値 ６Ｎ塩酸−フェノール水溶液中で加水分解。

１１０℃、２４時間　　　（）内は計算値＾ｓｐ　５．
０３（５）　　Ｔｈｒ　２．０５（２）　　Ｓｅｒ　１
．８９（２）Ｇｌｕ　１．１０（１）　　Ａｌａ　２．
０２（２）　　Ｖａｌ　１．８Ｎ２）Ｍｅｔ　１．０Ｈ
１）　　Ｉｌｅ　Ｏ，９３（１）　　Ｌｅｕ　２．９４
（３）Ｔｙｒ　２．１４（２）　　Ｐｈｅ　Ｏ，９２（
１）　　Ｌｙｓ　２．９５（３）Ｈ４ｓ　０．９９（１
）　　Ａｒｇ　２．０２（２）（ｖｉ）ＴＬＣ Ｒｆ値：０．５０（ｎ−ブタノール：酢酸＝水：ピリジ
ン−ｔｓ：３　：１２：１０） （ｖｉ　）液体クロマトグラフィー分析ＴＳＫ　ＧＥＬ
　００５−１２０Ｔ　（０，４６Ｘ２５ｃｍ）（東洋曹
達■製）を用い、アセトニトリル（２８％）、０．１％
トリフルオロ酢酸水溶液（７２％）からなる混液を溶離
液とし、流速１ｍ７／分で分析した。

検出は２５４ｎｍにおけるυＶ吸収で行い、分析試料は
サンプル５０ｐ９を２０ＩＪＩの０．１％トリフルオロ
酢酸水溶液に溶かしたものを用いた。上記条件でＶＩＰ
塩酸塩は保持時間約１２分で溶出した。

分析結果を第１図に示した。

比較例１ １０ｎ＋ｇのＶＩＰ　トリフルオロ酢酸塩を１０−の水
冷した１％塩酸水溶液に溶解させた後、凍結乾燥して８
．６ｍｇのＶＩＰ塩酸塩を得た。

原料として用いたＶＩＰ　トリフルオロ酢酸塩と得られ
たＶＩＰ塩酸塩の液体クロマトグラフィーによる分析結
果を第２図及び第３図に示した。

その分析条件は、ＴＳＫ　ＧＥＬ　０ＤＳ−１２０Ｔ　
（０，４６Ｘ２５ｃｍ）　（東洋曹達■製）を用い、ア
セトニトリル（２８％）、０．１％トリフルオロ酢酸水
溶液（７２％）からなる混液を溶離液とし、流速１−７
分で分析した。

検出は２５４ｎｍにおけるυＶ吸収で行い、分析試料は
サンプル５０ｐｇを２０ｍの０．１％トリフルオロ酢酸
水溶液に溶かしたものを用いた。

図に示されるように比較例１の方法で製造したＶＩＰ塩
酸塩は製造の際に分解等の副反応が併発し、その副生成
物に由来する新たなピークが認められる。更に目的物で
あるＶＩＰ塩酸塩の収率も低下している。

参考例１　（クロリン試験） ｌＯ〜５０ｄの試料溶液を薄層プレート板（Ｋｉｅｓｅ
−Ｉｇｅｌ　６０Ｆ＊ｓ４１Ｍｅｒｃｋ社製）上に打ち
、乾燥た後５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液を噴霧し、
十分乾燥した後、６％の酢酸を含む０．０６４％オルト
トリジン水溶液と０．４％ヨウ化カリウム水溶液の１：
ｌ混合液を噴霧し濃い青色を呈したものについてはペプ
チド、例えばＶＩＰが含まれているとした。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたＶＩＰ塩酸塩の液体クロマ
トグラフィーである。第２図は比較例１で原料として用
いたＶＩＰ　トリフルオロ酢酸塩の液体クロマトグラフ
ィーであり、第３図は比較例１で得られたＶＩＰ塩酸塩
の液体クロマトグラフィーである。 出願人代理人　古　　谷　　　　　馨 第　　１　　図 保持時間（分） 第　　２　　図 保持時間（分） 第　　３　　図 保持時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ
   ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ
   ｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｌａ
   −Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
   Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ＿２で示されるＶＩＰ（
   バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド）の
   ＶＩＰ塩酸塩。 ２、ＶＩＰトリフルオロ酢酸塩又はＶＩＰ酢酸塩を、そ
   れぞれの塩に対し５〜１０００倍当量塩化水素を含む水
   溶液に溶解し、ゲル濾過によるカラムクロマト処理によ
   りＶＩＰ塩酸塩を分離することを特徴とするＶＩＰ塩酸
   塩の製造法。