JPS5959654A - ホルモン放出因子類似体及びその製造方法 - Google Patents

ホルモン放出因子類似体及びその製造方法

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JPS5959654A
JPS5959654A JP58141977A JP14197783A JPS5959654A JP S5959654 A JPS5959654 A JP S5959654A JP 58141977 A JP58141977 A JP 58141977A JP 14197783 A JP14197783 A JP 14197783A JP S5959654 A JPS5959654 A JP S5959654A
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acid
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tyr
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JP58141977A
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マルテイン・フレゲル
ヤン・ポスピシエク
ヨセフ・ピチヤ
ドラホミラ・ピチヨバ
ミラン・クロイドロ
イリ・コリンスキイ
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Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (発明の分野) この発明は、次の一般式(I)、 1  254567R9 pG 1 u −Hi s −Tr p−8s r−T
yr −D−T l e−Le u−Arg−Pr o
−NrI−FJt(I) (式中、Xは水素原子又は保護基、好ましくはp−トル
エンスルホニル(トシル)基であル、)で表わされる黄
体形成及び卵胞刺激ホルモン(r、■i十FSu)放出
因子類似体に関する。他の略号は通常の意味を有する。
すなわち、Etはエヂル基を意味し、次の記号(左)は
それぞれ次(右)に示す二価基を意味する。
pGlu     ピログルタミン酸 H1s     ヒスチジン Trp      トリプトファン Set     セリン Tyr     チロシン 1、rau     o−イシン Arg     アル“Yニン Pro      750−リン 上記の新規々生物学的に活性なノナペプチドは高い性腺
刺激活性を有し、そして性周期の制御のため、性周期異
状の治療のため、そして非ステロイド系避妊薬と(−て
、ヒト及び動物薬として使用することができると期待さ
れる。
(発明の背景) すでに知られている通シ、黄体形成及び卵胞刺激ホルモ
ン放出因子(LRF)は視床下部により生産され、そし
て脳下垂体前葉におけるLH十FSHの遊離を誘導する
。遊離したLH+FSHは、ヒト及び動物の両性におい
てステロイドホルモンのレベルを制御する。LRF受谷
器は生殖腺の周辺にも見出される。拮抗的に(放出に関
して)活性なLRF類似体は、例えば機能的不妊及び卵
巣のう胞の治療のためにヒト及び動物の医療において使
用される。
さらに、高いそして持続的な作用を有するある種のLR
F類似体は逆の作用、すなわち排卵及び精子形成を抑制
する作用を崩する。
次の構造、 12345   6  78910 pG l u−H3s −Tr p−8e r−Tyr
 −G 1 y−Lo u−Arg−Pr o−G l
 y−NH2を有する天然のLRFデカペプヂドは、そ
のpGlu−His結合、Tyr−Gly結合、及びP
ro−Gly結合の切断の結果として急速な酵素分解を
受ける。従って、これらの臨界的部位におけるアミノ酸
残基を他の残基に置換することによシ、変性さノ1.た
、より高い、そしてより長時間持続する活性を有するさ
らに耐性の高い類似体を得る試みがな込lじCきた。そ
して、6位のグリシンを種々の非イ1i白性D−アミノ
酸及びその誘導体により、’I”Jにある種の親脂性を
イ1する誘導体により置換することにより、作用的に(
agonislcally)高い活性をイjず2゜物質
が誘導された。10位のGuy−1UI2を通常のアル
キル基によジ置換することにより、さらに高いLRF活
性を有するいわゆる「超活性」類似体が得られた。低い
投与量で投与した場合、これらの物質は特に排卵異状の
治療のため、及び乳/1のステアードレプロダクチ・イ
ブレジーム(nteeredreproductive
 regime)における排卵誘発のために有用である
。これらの物質は、農梨動物における性周期の制御のた
め、非ステロイド牲避妊のため及び内分泌依存腫瘍の治
療のために多量に投与することができる。
(発明の構成及び効果) 新規な構造変化を含む構造と活性との関係についての研
究を組織的に継続した結果、高い生物学的活性と医薬と
して使用される可能性を有するT、RF類似体を開発し
た。すなわち、この発明に従えば、天然LRFの6位の
グリシン基が、この関連においては今まで記載されてい
ないD配置を有する新規なアミノ酸の二価基により11
′1−換された。この基は1−アミノ−3,3−ジメチ
ル−D−醋酸(tert−ロイシン)の基である。この
脂肪族性(1111鎖借造は相当に親脂性であシ、そし
て効果的に立体障害される。この2つの/rf徴のいず
れもが、1.1?、F類似体の生物学的活性、特にこの
活性の程度及び゛持続性に好都合な影響を与える。この
(i−I)−1’le類似体は、Q−t、ert−ブチ
ル−D−セリン基又は例えば3−(2−ノーフチル)−
〇−アラニンの芳香族性側鎖を有する類似体に比べて、
代?、Ql F’+川に対して実質上安定であυ、従っ
て持続性を、0j′□る。。
10− Guy−NH2をNfII丸により置換するの
が最適である。
部分的に保護されたLRF類似体前駆体は、対応する保
護されていない化合物の活性の実質的な部分を維持して
いる。従って、8位のArgが遊離の形で存在すること
は高い作用活性のために必須では々い。よυ入手しやす
く、−t L、で安価左これらの合成前駆体を使用する
ことに上り、!+M°に動物の治療において所望の生物
学的活性がイIJられるから前記の知見は特に重要であ
る3゜ 幾つかのLRF’類似体について、阻害活性を有する逆
の例がすでに報告されている。
LR,F類似体(Vl)及び(■)(例を参照のこと)
を、卵巣剥除した幼牝牛に、10μg及び200μμの
投与量:で静脈力投した。二重抗体の均−系によシRI
A測定を行った〔スラップニラ−Y (Stupnlc
kl )R・、ミラデジ(八(ladej)人、 : 
Endoct lnolngy 68.6(1976年
)〕。〕牛NIH−LER−1’716−2標品をヨウ
ド化標準として使用した。RIA感受性は100ノ堤よ
υ犬であった。5TH−プロラフアン交叉反応は1%で
あった。試験結果を次の第1表に示す。
200μgのLRF及び類似体を投与した後におけるL
H−H”sHのレベル ブラ、り   −              :(1
2j1.9LRF      40±11.5    
 10(1±26.7    108.41に1G、1
■    267±38   43±20.4   7
2.4f−10,9V11      40.0±r、
、o       230±32.1     110
.91117LRF    53.3±13.9  1
2.3f’!r、o     7.43±1.6■  
  466±15.4  86.7±10.7   3
.88±]3■     53.3±19.0 236
.7±10   11.24+1.592鍾類の投力し
ペルで投与した化合物(■)は、非常に高い作用効果を
有する。この化合物は化合物(Vl)すなわち対応する
トシル誘導体よりさらに活性であり、そして比較対照で
ある天然LRFよりさらに活性である、この発明に従っ
てGlyをD−Tieによ、り置換することにより、L
RF作用の程度及び持続が顕著に増加する。このことは
、動物画たシ10μgの投与量においても明らかに観察
された。部分的に保護された前駆(−1ト: (■’)
 (rJ:相当な活性を有する。この知見により、4ゾ
チド核の構造(主体構造)の6位における前61】の(
1■1ζ、変化の有意な効果が確認される。この置換の
好都合な効果は8位におけるArgのトシル化の不都合
な効果を大きく超越する。天然IRFの対応する8−ト
シル誘導体はほとんど活性を有しない。
式(1)のノナペプチドは、各アミノ酸又は低級ペプチ
ドを、ペプチド化学における製造方法を用いて結合反応
せしめることにより製造することができる。このための
好ましい方法は、次の一般式() %式%() 〔式中、Xは式(1)の場合と同じ意味を有し、そして
Yは水素原子又は水素化分解により除去し得る保護基、
好ましくはベンジルオキシカル7]ソニル基である、〕 で表わされる化合物を、次の式(]Hl、pGl u−
Hl n−Trp     (III)で表わされるト
リペプチドの反応性誘導体と結合せしめ、そして所望に
より保護基を除去する方法である。
結合反応は、ペプチド化学の古典的な製造方法である溶
液中で[g、シュレーダー(Sohro*der:)、
K、リュプケ(Lubke) 、The Peptid
es 、 Vol、 [IMびIT、 Ac1d Pr
e8g 、 = ニーヨーク、1965年〕又は固相中
で〔J、M、ステワード(StowRrt) 、J、I
)・ヤ7り(Young)、 So目d phase 
peptideRsynt、haqlq 。
W、Il、フリーマン社、サンフランシスコ、1969
年〕行うことができる。場合忙よっては末端保設基をベ
ンジルオキシカルボニルニル基の導入により保護するの
が打部aである。側鎖の官能基は、Argのり)合を除
き、保護する必要がない。アルギニンのグアニジノ基の
保護はトシル基により行った。この基の除去は常法に従
って行うことができるが、適当な保護剤、例えばチオグ
リコール酸(例を参照のこと)の存在下で、トリフルメ
ロ酢M中1−リフルオロメタンスルホン酸の溶液を用い
る新規力方法により行うことができる。この方法に上り
、感受性のペプチド分子の他の部分を同時に分解するこ
となくトシル基を急速に除去することができ、従って公
知の方法に比べて実質上高い収率で目的生成物が得られ
る。
保護基を除去した後、得られた生成物を直接に液体クロ
マトグラフィーにより精製することができる。これによ
シ、この発明のノナペプチドが高純度で得られる。いわ
ゆる逆相すなわぢCR”CjFl炭化水炭化全素層せし
めることにより表面変性したシリカゲル(粒径10〜3
0/1m)を、固定相として使用するのが好ましい。溶
出は、メタノール(含まれる啄プブド化合物に応じて2
0〜60容量係)及び0.1〜0.5%、好1しくは0
.2%のトリフルオロ酢酸の混合物を移動相として使用
して行う。移動相におけるイオン化抑制剤としてのトリ
フルオロ酢酸の存在は、効果的な分IWcを行うために
必須である。これにより、追加の脱塩操作を用いないで
1操作により物質を精製することが可能であった。
今まで、同様のペプチド化合物のイ′青製に液体クロマ
トグラフィーは使用されていなかった。前記の移動相は
、処理化合物のイオン化を制御するだめの種々のPI(
の緩衝液を用いるすでに記載されている移動系に代わる
ものとして開発された。緩衝化移動相を用いる場合、分
離した化合物をさらに脱塩処理しなければならず、この
ために分離が相当に血判になりそI−て多くの時間を必
要とするようになる。
この発明の生物学的に活性なノナペブ゛チド化合物のJ
lq造方法の前記以外の特徴を次の例によシ示す。この
例において、2はベンジルオキシカルボニルg、Toe
はトシル基、すガわちp−)ルエンスルホニル基、DC
HAハシシクロヘキシルアミンを示す。この例は、説明
のだめのものであって、これによシこの発明の範囲を限
定するものではない。
50gのZ−Pro(0,2モル)を170m1のジメ
チルホルムアミドに溶解し、これに21 m/!のピリ
ジンを注入し、そして溶液を一40℃に冷却する。ピパ
ロイルクロリド(29ml、 、(1,22モル)を加
え、そして混合物を一30℃にて10分間攪拌する。反
応混合物を40℃に冷却した後、50m1のジメチルホ
ルムアミド中1o、lO,2xモル)のエチルアミンの
溶液を加える。0℃にで一装置いた後、ジメチルホルム
アミドを蒸発せしめ、そして残渣を酢酸エチルに溶解し
、結晶化せしめる。50g(収率91チ)の標記化合物
をイυる。融点125〜130℃。
Z−Arg(Tos)−Pro−NH−Ft (n)4
.5.9のZ−Pro−NH−Et (16,2ミリモ
ル)を、酢酸中具化水素酸溶液で処理することにより保
護基を除去する。室温にて20分間装いた後、エーテル
によシ臭酸塩を沈澱せしめ、そしてすぐに30m1のジ
メチルホルムアミドに溶解した。
ioyのZ−Arg(Tos)DCllA (It、 
7.8ミリモル)を2 N HCtで分解し、遊離しだ
Z−Ar g (To II) ′5C酢酸エチル中に
抽出する。溶剤を蒸発せしめた後、この生成物を泡状物
として得る。これを6Qm/!のジメチルホルムアミド
に溶解し、ぞして溶液を一40℃に冷却し、そしてこの
温度において、1.4m1(20ミリモル)のピリジン
、2.2 mlのN−エチルヒ啄リジン及びz、tmg
(toミリモル)のビバリルクロリドで次々と処理する
。−30℃にて20分間攪拌した後、Pro−’HH−
EJIIBrの上記の溶液を江加し、そして反応混合物
のp+(をN−エチルピペリジンを用いて7.5に調整
し、そして冷蔵庫に一夜放置する。次に揮発性部分を蒸
発ぜしめ、残渣を酢酸エチルで抽出し、抽出物をIN塩
酸、5%炭酸水素す) IJウム溶液及び水で次々と洗
浄する。
次に溶剤を共沸条件下で留去し、6.02,9(63%
)の標記化合物を泡状物として得る。アミノ酸組成分析
: Pro O,91、Argl、09.。
6g(8,7ミリモル)のZ−Arg(Ton)−Pr
o−Nr(−1iitを、酢酸中具化水素酸溶液で処理
することにより保護基を除去する。エーテルを用いて臭
酸塩を溶液から沈澱せしめ、そしC″25m1のジメチ
ル;j゛ルムアミド1度に溶解する。、3.72g(8
,7ミリモル)のZ−Leu DCHA % 1.2 
Jnl’ (10ミリ七ル)のビバリルクロリド、0.
83ml (8,7ミリモル)のピリジン及び1.19
ml (8,7ミリモル)のN−エチルピペリジンを用
いる上記の混合無水物法により再度縮合を行う。この場
合溶剤とし−Cジメチルポルムアミドを使用する。前記
の例の化合物■と同様にして生成物を分離する。4.5
g(73q6)の標記化合物を泡状物として得る。アミ
ノ酸組成分析:Leu O,98、Arg 1.09、
Pro O,93゜2.69 (5,82ミリモル)の
Z−1)−Tle I)CIAを0、IN硫酸で処理す
ることにより頃を分解し、遊離したZ−D−Tieを酢
酸エチル中に抽出する。溶剤を蒸発せしめた後、2gの
油状生成物を得る。この物質を20m1の塩化メチレン
に溶解する。
4 、q (5,7ミリモル)の化合物(III)を酢
酸中具化水素酸で処理して脱カルボベンジル側キシル化
する。メタノール溶液中0)I−型の陰イ刊ン交換体カ
ラムを用いてA酸1話から生成物を1JIL離ぜしめる
2.92のLeu−Arg(Tns )−Pro−NH
−1i、’tを泡状物として得る。この生成物&:、J
:pH2,5及び57におけるTI’T、気泳動におい
て純粋でを)るにンヒドリンにより検出)。得られた遊
1顎l・リペプチドアミドを15m1の塩化メチレンに
一度に溶解L、−2,0℃に冷却し、前もッテ調製しま
たZ−1,)−TI、!溶液、及び1r)meの塩化メ
チレン中2g(:9.7ミリモル)のジシクロヘキシル
カルビジィミドの溶液を加える。反応混合物を4日間冷
蔵庫中に放置、する。次にジシクロヘキシル尿素の沈澱
を炉去し、炉液6:蒸発せしめ、ぞして7A渣を酢酸エ
チルに溶解する。l tJ堪酸、5チ炭酸水素ナトリウ
ノ・溶液及び水を用いてて酢酸エチル溶液を次々と洗浄
した後、標記化合物を中性物質として分離する。3.9
g(93%)のシフ0チドを泡状物として得る。りr」
ロホルムーメクノール(9:1)系を用いるシリカゲル
薄層り1:Iマドグラフィーにおいて生成物はクロマト
グラフ的に単一である。アミノ酸組成分析: D−’I
’+6 (1,92、Leu O,98、Argl、0
1、ProO,93゜3.6gの化合物(IV)a−1
・ぞラジウム触媒上水素化分解により処1+fi L、
て保護基を除去する。30g(44ミリモル)の遊離テ
トラペゾグ°ドを得る0無水のジメチルホルムアミド−
塩化メチレン混O物中−30Cにて、1.99のZ−8
er−Tyr−N、IT、 。
1.5m/!のジオキサン中8N塩酸溶液、及びO,g
 meの亜硝酸n−ブチルな用いて、Z −S e r
 −T y r −N 3とノ縮合ヲ行う。N−エチル
ビイリジンを用いて中和(rH8)を行う。次に反応混
合物を0℃にて3日間冷蔵庫に放置する。揮発性部分を
蒸発せしめ、そして残渣を酢酸エチルに溶解する。溶液
を、IN塩酸、5外炭酸水素すl・リウノ、溶液及び水
を用いて次々と反復して洗浄し、そして乾燥しそして蒸
発せしめる。4.14g(76%)の非結晶性のへキサ
4ゾチドを得る。生成物は、液体クロマトグラフィー(
0,4X25crnのカ2)・を使用、固定相:変性シ
リカゲル、移動相ニア0容月襲のメタノール及び30容
量−の燐酸緩衝液P+14.4 )による検定において
クロマトグラフ的に単一である。生成物は82f)の標
記へキサペプチドを含有する・アミノ酸組成分析: S
er 1.14 、 Tyr 1.05. D−Tie
O,98,Leu 1.03 、 Arg 1.04 
、 Pro 1.00゜前記のへキサペプチド(V) 
(3,8,9)  を、メクノール溶液中パラジウム触
媒により水素化分解することによυ保護基を除去する。
88チの遊離ベキザ−でプチドを含有する物質3.2g
を得る(液体クロマトグラフィー、カラムの大きさ及び
固定相は前記の通シ、移動相:50容μ1%のメタノー
ル及び50容量チのトリフルオロ酢酸−トリエグールア
ミン緩衝液PI(3,9,220nmにおけるUVによ
シ検出、によシ測定)。
無水のジメチルホルムアミドージメチルメルホキシド(
1:1)混合物中、1.6gのpGlu−Il、1s−
Trp−N2H3,32yの前記へキザベプチド、及び
0.5 mlの亜硝酸n−プグールを用い−Cアジド縮
合を行う、4−20℃にて反応を行い、この温度で30
分間アジ1゛形成を行う。次いニ、反応d?1自物(7
) 1ull i−s 〜9 k 調J悸t、、そして
、、11を途中’l’l’l+:祝L ’/J’。
がら4日間冷蔵Jri<におく。溶剤を蒸ヴ+j4j、
’ I〜めた後、残lffを少、f7(のエーテルに溶
解し、−そしで・(:1らilだ油状溶液を:30me
のメタノールで稀釈〕る。酢酸エチルを加えることによ
り生成物を沈澱せしめ、瀘紙−ヒに集め、酢酸エチル−
エーテル混合物で洗浄する。3.65.9’(87ヴ)
の相ノナベグヂドを得る。液体クロマトグラフィー(カ
ラムの大きさ及び固定相は前記の通り、整励相二60容
゛間係のメタノール及び40容t%の隣酸綬衝液rll
 7.0.210 nmにおりるUVに1℃す(“灸出
)において−1得られた生成物に70チの標記化合物を
含有し、このほかにクロマトグラフィーのピークにより
示される若干の出発物質(標)■物質を混合してフィー
ドすることにより同定する)を含有する。この相ノナペ
プチドのアミノ酸組成分析の結果は、Glul、43.
 His 1.41. Trp 1.1.0.  Se
r 1.0り、 Tyr L20゜1)−Tie O,
89,Leu 1(+(1,Arg(1,88,Pro
 O,%10である。
生物学的活性を標価するために次の条件下で調興用クロ
マトグラフィーにより物質をFN製する。
カラムの大きさ2.5 >C3Qα、固定相:変性シリ
カゲル(粒子−リ□(−” 1 (l ltm ) 、
%’i−動相:6()容−h):係のメタノール及び4
0容1口、チの0.2 % l・リフルオロ酢酸水溶液
、21(inmにて検出する。3007#yの粗ノナペ
ゾチド(3罰の移動相に溶解して注入)から96チ純度
の生成物148rnダを得Z)。アミノ酸組成分析: 
Glu 1.01.  His 1.01.  Trp
 O,90゜Ser O,95,Tyr 11.01.
  J’)−TieO195+ Lau 10 (1+
Arg O,99,Pro 1.04゜(■() 上記のようにして精製した化・0物(■)のRJ(料(
3omp)を0.6 m(!のl−リフルオロ酢酸にi
′δ解する。チオグリコールR(0,5m1)を加え、
そして混合物を0℃に冷却し、Q、 4 mlのトリフ
ルオロメタンスルホン酸で処理し、そして30力間冷蔵
庄中に放置する。次にエーテルにより生成物を沈澱ぜし
め、そして沖取する。イ:7られた、べ゛・く′吸湿性
の粉末をIMの酢酸に溶力了し ;、、、、、して溶1
1ダを凍結乾燥する62Fl:Zの粗生成物をイ:する
。この物りLを、固定相とじで変性シリカゲルを使J■
1シ、そシて移動相として55容訊襲のヌクノール45
係水溶液及び45容FT%のトリフルオロ酢酸02楚水
溶液の混合物を使用する2、5X30rrnカラムによ
る液体クロマトグラフィーによ’)M’i’fitI呈
する。1a製された物質の試料(25Q?)を0.5 
mlの移動相に溶解し、そして注入する。+280nm
にて記録する。純粋な標記化合物を含有する分画を隼め
、メタノールを30℃にて減圧蒸発亡しめる。1M酢酸
中溶液を凍結乾燥することにより98 % i’l1度
の精製された生成物10.5m9を得る。アミノ酸組成
分析:Glu 1.03.  ll1s O,94,T
rp O,80,Ser (1,95゜Tyr O,9
6,D−Tie O,90,Leu O,99,Arg
 1.06゜Pro  1.01  。
/l’イW「出+Art人 スボファ、スボエネ ポドニキイ プロ ズドラ?トニチコウ ビロブ 特許出願代理人 弁理士 宵 木    朗 弁理士 西 舘 オ11  之 弁理士  福  本     積 弁理士 山 口 昭 之 弁理士  西  山  雅  也 チェコスロバキア国プラハ8ナ ト・ストレルニチ3 0発 明 者 イリ・コリンスキイ チェコスロバキア国プラハ6ク ラロプス力・オボラ11

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、次の一般式(1) (式中、Xは水素原子又は保護基、好ましくはp−)ル
    エンスルホニル基テアル、) で表わされる高い生殖腺刺激活性を有する黄体形成及び
    卵胞刺激ホルモン放出因子類似体。 2、個々のアミノ酸又は低級4プチド基を、波プチド化
    学における製造方法を用いて結合せしめることを特徴と
    する次の一般式(1)、1    234   5  
       6   7(19pG l u−1(k s −
    Tr p −8e t−Tyr −D−T 1 e −
    Le 11−Ar g−Pr o−NII−E を交 (1) (式中、Xは水素原子又は保護基、好ましくはp−)ル
    エンスルホニル基でアル、) で表わされる化合物の製造方法。 3、次の一般式(H)、 Y−8et−Tyr−D−Tl e −Le u−Ar
    g−Pr o−NH−Et   ([[)〔式中、Xは
    式(1)の場合と同じ意味を有し、そしてYは水素原子
    又は水素化分解によシ除去し得る保護基、好ましくはベ
    ンジルオキシカルボニル基である、〕 で表わされるヘキザ啄プチド防導体を、次の式(Ill
    )、pGlu−His−Trp     (III)で
    表わされるトリペプチドの反応性誘導体と結合反応せし
    め、そして所望によシ保護基を除去することを特徴とす
    る特許請求の範囲第2項記載の方法。 4.8位の保mp−トルエンスルホニル基の除去を、保
    護剤、好ましくはチオグリコール酸の存在下で、トリフ
    ルメロ酢酸中トリフルオロメタンスルホン酸の溶液を用
    いて行い、次に生成物を分離し、そしてFfI製するこ
    とを特徴とする特許の範囲第3項記載の方法。 5 反応生成物の精製を、移動相とL7て水性メタノー
    ル中トリフルオロ酢酸の溶液を用いる逆相液体クロマト
    グラフィーにより行うことを特徴とする特許請求の範囲
    第4項記載のlj法。
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SE8304158D0 (sv) 1983-07-27
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