DE3328235A1 - Gonadotrop hochwirksame synthetische analoga der releasingfaktoren der hormone lh und fsh und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

SPOFA, spojene podniky pro zdravotnickou vyrobu Prag 3, CSSR

Gonadotrop hochwirksame synthetische Analoga der Releasingfaktoren der Hormone LH und FSH und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft synthetische Analoga der natürlichen Releasing-Hormone (Releasingfaktoren) für das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon LH bzw FSH, die üblicherweise als LH-RH bzw FSH-RH oder als entsprechende Releasingfaktoren bezeichnet werden. Die synthetischen Analoga der Releasingfaktoren LH-RH bzw FSH»-RH gemäß der Erfindung entsprechen der allgemeinen Formel I

1 2 3*4.5 6 7 89

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (I),

in der X ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, vorzugsweise p-Toluolsulfonyl (Tosyl), bedeutet. Die anderen Abkürzungen in Formel I haben die in der Fachliteratur übliche Bedeutung; so ist Et eine Ethylgruppe, und die nachstehenden Aminosäuresymbole bedeuten jeweils einen zweiwertigen Rest einer Aminosäure wie folgt:

pGlu Pyroglutaminsäure,

His Histidin,

Trp Tryptophan,

Ser Serin,

233-S10262-SF-Bk

Tyr Tyrosin,

D-TIe l-Amino-3.3-dimethyl-D-butansäure (t-Leucin),

Leu Leucin,

Arg Arginin

und

Pro Prolin.

Die erfindungsgemäßen neuen biologisch aktiven Nonapeptide besitzen hohe gonadotrope Wirksamkeit und eignen sich zur Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin, insbesondere zur Steuerung des Oestralcyclus, zur Behandlung entsprechender Cyclusstörungen und als nichtsteroide Empfängnisverhütungsmittel.

Der Releasingfaktor LH-RH bzw FSH-RH wird bekanntlich im Hypothalamus erzeugt und bewirkt die Sekretion von LH bzw FSH aus dem Hypophysenvorderlappen. Die freigesetzten Hormone steuern die Spiegel der Steroidhormone bei Menschen und Säugetieren beiderlei Geschlechts. Rezeptoren für diese Releasingfaktoren wurden auch unmittelbar im Gonadenbereich aufgefunden. Die agonistisch, dh hormonfreisetzend wirksamen LH-RH- und FSH-RH-Analoga eignen sich zur Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin, ua zur Behandlung funktioneller Sterilität und von Ovarialcysten. Mit einigen höher und langer wirksamen Analoga läßt sich ferner auch die umgekehrte Wirkung, dh eine Hemmung der Ovulation und der Spermatogenese, erzeugen.

Der natürliche LH-RH- und FSH-RH-Releasingfaktor (im folgenden kurz als LRF bezeichnet) ist ein Dekapeptid der Formel

1 23456789 10 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^

das im Organismus rasch enzymatisch abgebaut wird, wobei

die Bindungen pGlu-His, Tyr-Gly und Pro-Gly gespalten werden. Man versuchte daher, anhand verschiedener Abänderungen der Aminosäurereste in diesen entscheidenden Stellungen beständigere Analoga zu gewinnen, die eine entsprechend modifizierte bzw möglichst hohe und lang anhaltende Wirkung besitzen. So ergab zB der Ersatz von GIy in 6-Stellung durch verschiedene nicht-proteinogene D-Aminosäuren und deren Derivate, insbesondere lipophilere Derivate, agonistisch hochwirksame Verbindungen. Der gleichzeitige Ersatz von GIy-NH₉ in 10-Stellung durch geeignete Alkylgruppen lieferte Derivate, die aufgrund ihrer weiter gesteigerten Wirksamkeit als sog. "superaktive" Analoga bezeichnet werden. Diese Analoga eignen sich in niedrigen Dosen insbesondere zur Behandlung von ovarialen Störungen und zur Auslösung der Ovulation im gesteuerten Reproduktionscyclus bei Milchkühen. In hohen Dosen lassen sich diese Wirkstoffe dagegen zB zur kontrollierten Unterbrechung des Oestralcyclus bei Schlachtvieh, zur nichtsteroiden Empfängnisverhütung und zur Behandlung von gewissen endokrin bedingten Tumoren verwenden.

Eine systematische Untersuchung der Beziehungen zwischen Struktur und Wirksamkeit unter Heranziehung neuer Strukturänderungsmöglichkeiten führte im Rahmen der Erfindung zur Entwicklung von Analoga mit wesentlich höherer biologischer Wirksamkeit und dementsprechend guten Voraussetzungen für die therapeutische Anwendung. So wurde zB erfindungsgemäß der Glycinrest in 6-Stellung des natürlichen Releasingfaktors durch einen zweiwertigen Rest einer neuen, in diesem Zusammenhang bisher nicht beschriebenen Aminosäure mit D-Konfiguration, der l-Amino-3.3-dimethyl-D-butansäure (t-Leucin), ersetzt. Die aliphatische Seitenkette dieser Säure ist ziemlich lipophil und zugleich stark sterisch gehindert. Beide Umstände wirken sich günstig auf die biologischen Eigenschaften der Analoge aus, insbesondere

auf ihre Wirkungsstärke und Wirkungsdauer. Das resultierende 6-D-Tle-Analogon ist gegenüber metabolischen Einwirkungen wesentlich beständiger und wirkt infolgedessen prolongierter als solche Analoga, die einen Rest von O-t-Butyl-D-serin oder eine aromatische Seitenkette, zB die von 3-(2-Naphthyl)-D-alanin, enthalten. Der natürliche GIy-NH₉-Rest in 10-Stellung wird am günstigsten durch NHEt ersetzt.

Die teilweise geschützten Vorläufer solcher LH-RH- bzw FSH-RH-Analoga weisen noch einen wesentlichen Teil der Aktivität der entsprechenden ungeschützten Verbindungen auf; so ist zB die Anwesenheit von freiem Arg in 8-Stellung nicht entscheidend für die hohe agonistische Wirksamkeit. Dieser Befund ist von zusätzlicher Bedeutung, da er die vorteilhafte Möglichkeit bietet, die angestrebte biologische Wirkung, insbesondere in der Veterinärmedizin, unter Verwendung dieser besser zugänglichen und daher billigeren Vorläufer zu erreichen. Ähnliche Verhältnisse wurden früher ua im entgegengesetzten Falle einiger Analoga mit inhibitorischer Wirkungsweise beschrieben.

Die erfindungsgemäßen, in den nachfolgenden Beispielen erläuterten Analoga VI und VII wurden i.v. an ovariektomierte Färsen in Dosen von 10 und 200 pg verabreicht. Der RIA-Test wurde in einem homologen System doppelter Antikörper durchgeführt (Stupnicki R., Mladej A., Endocrinology 6§_ (1976) 6). Das Rinderpräparat NIH-LER-1716-2 diente als Jodierungsstandard; die RIA-Empfindlichkeit lag oberhalb 100 pg. Die STH-Prolactin-Kreuzreaktion betrug 1 %. Die Testergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Spiegel von LH + FSH nach Verabreichung von 200 pg LRF bzw

erfindungsgemäßer Analoga

Verbin dung	Eintritt der FS-Wirkung (min)	Wirkungsdauer (min)	mittlere FSH-Konzentration (pg/ml)
Kontrolle	_	—	31,2 i 1,9
LRF	40 - 11,5	100 - 26,7	108,4 - 16,1
VI	26,7 - 3,8	43 i 20,4	72,4 - 10,9
VII	40,0 - 6,0	230 - 32,1	110,9 - 11,7
Verbin dung	Eintritt der luteinisieren- den Wirkung (min)	Wirkungsdauer (min)	mittlere LH-Konzentration . (pg/ml)
Kontrolle	_	—	0,26 - 0,04
LRF	53,3 - 13,9	12,3 - 5,0	7,43 - 1,6
VI	46,6 i 15,4	86,7 i 10,7	3,88 - 1,3
VII	53,3 i 19,0	236,7 - 10	11,24 i 1,59.

Die Verbindung VII zeigte in beiden oben angegebenen Dosierungen eine stark ausgeprägte agonistische Wirksamkeit; sie war ferner wirksamer als Verbindung VI, dh das entsprechende Tosylderivat, und wesentlich stärker wirksam als der natürliche Releasingfaktor LRF, der als Vergleichssubstanz verwendet wurde. Der Ersatz von GIy durch D-TIe gemäß der Erfindung führt also zu einer bemerkenswerten Erhöhung von Stärke und Dauer der LRF-l-Jirkung; dies wurde schon bei der niederen Dosis von 10 μg pro Tier deutlich beobachtet. Auch der teilweise geschützte Vorläufer VI besitzt eine bedeutende Wirksamkeit. Dieser Befund

bestätigt den starken Einfluß der erwähnten Strukturänderung in 6-Stellung auf die Konformation, dh die sterische Anordnung des Peptidmoleküls. Der günstige Effekt dieser Änderung überwog stark die Wirksamkeitsabnahme infolge der Tosylierung von Arg in 8-Stellung des Dekapeptids; das entsprechende 8-Tosylderivat des natürlichen LRF war nämlich nahezu wirkungslos.

Die Nonapeptidverbindungen der Formel I sind synthetisch glatt zugänglich, indem man die entsprechenden Aminosäuren bzw. niederen Peptidreste nach präparativen Methoden der Peptidchemie miteinander verknüpft. Mit Vorteil wird dabei so vorgegangen, daß ein Hexapeptidderivat der allgemeinen Formel II

Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (II)

in der X dieselbe Bedeutung wie in Formel I besitzt und Y ein Wasserstoffatom oder eine hydrogenolytisch abspaltbare Schutzgruppe, vorzugsweise Benzyloxycarbonyl, bedeutet,

mit einem reaktionsfähigen Derivat des Tripeptide der Formel III

pGlu-His-Trp (III)

umgesetzt wird, wonach erforderlichenfalls die Schutzgruppen abgespaltet werden.

Die in Betracht kommenden Reaktionen lassen sich entweder in Lösung durchführen, was der klassischen Präparationstechnik der Peptidchemie entspricht (E. Schroeder, K. Lübke, The Peptides, Bd. I und II, Acad. Press, New York, 1965), oder aber in fester Phase (J. M. Stewart, J. D. Young, Solid phase peptides synthe-

sis, W. H. Freeman Comp., San Francisco, 1969). Die terminalen Aminogruppen werden mit Vorteil durch Einführung einer Benzyloxycarbonylgruppe vorübergehend geschützt. Die funktioneilen Gruppen in den Seitenketten - mit der einzigen Ausnahme von Arg - bedürfen in der Regel keines Schutzes; der Schutz der Guanidingruppierung des Arginin restss in 8-Stellung erfolgt zweckmäßig durch eine Tosylgruppe. Die Abspaltung der Tosylgruppen läßt sich nach üblichen Verfahren durchführen, jedoch ist es empfehlenswert, die Tosylgruppen unter Verwendung einer Trifluormethansulfonsäurelösung in Trifluoressigsäure in Gegenwart eines geeigneten Schutzmittels, zB von Thioglycolsäure (vgl die Beispiele) abzuspalten. Diese neue Arbeitsweise ermöglicht die rasche und zugleich schonende Abspaltung der Tosylgruppen ohne jegliche sonstige unerwünschte Eingriffe in das empfindliche Peptidmolekül und liefert wesentlich höhere Ausbeuten des gewünschten Produkts als die bisher bekannten Abspaltungsverfahren.

Nach der Abspaltung der Schutzgruppe läßt sich das erhaltene Produkt unmittelbar durch die Flüssigkeitschromatographie reinigen; hierdurch kann das erfindungsgemäße Nonapeptid mit hoher Reinheit gewonnen werden. Hierbei wird als stationäre Phase mit Vorteil diejsogenannte "umgekehrte Phase" (reverse phase), dh Silicagel (Korngröße 10 bis 30 μπι), das an der Oberfläche mit einer chemisch gebundenen Schicht von C_R- bis C,„-Kohlenwasserstoffen versehen ist, verwendet. Die Elution erfolgt vorzugsweise mit einer mobilen Phase aus einem Gemisch von Methanol (20 bis 60 Vol.-?o je nach der zu verarbeitenden Peptidverbindung) und einer 0,1 bis 0,5?oigen und am günstigsten 0,2?oigen wässerigen Trifluoressigsäurelösung. Die Anwesenheit von Trifluoressigsäure dient zur Unterdrückung der Ionisation der Substanzen und ist für eine wirksame Stofftrennung bzw. Reinigung notwendig. Diese

-IQ-

Arbeitsweise ermöglicht, die zu verarbeitenden Produkte in einer einzigen Stufe ohne zusätzliches Entsalzen wirksam zu reinigen.

Die Flüssigkeitschromatographie wurde, soweit bekannt, zur Reinigung von Peptidverbindungen dieser Art bisher nicht herangezogen. Die oben erwähnte mobile Phase wurde als vorteilhafter Ersatz der herkömmlichen Elutionssysteme mit einem Gehalt an Pufferlösungen verschiedener pH-Werte zur Unterdrückung der Ionisation entwickelt. Unter Verwendung solcher gepufferter Mobilphasen mußten nämlich die so behandelten Produkte stets noch entsalzt werden, was mit einem zusätzlichen Zeit- und Materialaufwand verbunden und daher nachteilig war.

Nähere Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der biologisch aktiven Nonapeptidderivate der Formel I sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen. Im folgenden bedeuten: Z Benzyloxycarbonyl, Tos Tosyl, dh p-Toluolsulfonyl, und DCHA Dicyclohexylamin.

Z-Pro-NH(Et) (I)

50 g (0,2 mol) Z-Pro werden in 170 ml Dimethylformamid gelöst und mit 21 ml Pyridin versetzt, worauf die Lösung auf -40 ⁰C abgekühlt wird. Nach Zusatz von 29 ml (0,22 mol) Pivaloylchlorid wird das Gemisch 10 min bei -30 C gerührt. Nach Abkühlen auf -40 C gibt man eine Lösung von 10 g (0,21 mol) Ethylamin in 50 ml Dimethylformamid zu. Nach Stehenlassen über Nacht bei 0 C dampft man das Dimethylformamid ab, löst den Rückstand in Ethylacetat und läßt die Lösung kristallisieren. Die Ausbeute des Produkts beträgt 50 g (91 % d. Th.); F. 125 - 130 ⁰C.

Z-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (II)

Von 4,5 g (16,2 mmol) Z-Pro-NH-Et wird die Schutzgruppe durch Einwirkung von Bromwasserstofflösung in Essigsäure abgespalten. Nach 20 min Stehenlassen bei Raumtemperatur scheidet sich das Produkt nach Zugabe von Ether als Hydrobromid aus, das sogleich in 30 ml Dimethylformamid gelöst wird.

Man zerlegt 10 g (17,8 mmol) Z-Arg(Tos), DCHA mit 2 N Salzsäure; das freigesetzte Z-Arg(Tos) wird in Ethylacetat aufgenommen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels gewinnt man das Produkt in Form eines Schaums. Man löst das Rohprodukt in 60 ml Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf -40 ⁰C ab und versetzt sie bei dieser Temperatur mit 1,4 ml (20 mmol) Pyridin, 2,2 ml N-Ethylpiperidin und 2,1 ml (18 mmol) Pivaloylchlorid. Nach 20 min Rühren bei -30 C läßt man eine vorher bereitete Lösung von Pro-NH-Et · HBr zufließen, stellt das Reaktionsgemisch mit^N-Ethylpiperidin auf pH 7,5 und läßt es über Nacht im Kühlschrank stehen. Danach dampft man die flüchtigen Anteile ab, nimmt den Rückstand in Ethylacetat auf und wäscht den Ethylacetatextrakt nacheinander mit IN Salzsäure, 5?oiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser. Darauf wird das Lösungsmittel unter gleichzeitiger azeotroper Trocknung abdestilliert. Auf diese Weise werden 6,02 g (63 % d. Th.) Produkt in Form eines Schaums erhalten. Aminosäureanalyse: Pro 0,91, Arg 1,09.

Z-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (III)

Von 6 g (8,7 mmol) Z-Arg(Tos)-Pro-NH-Et wird die Schutzgruppe mit Bromwasserstoff in Essigsäure abgespalten. Nach Umfällung aus der Lösung durch Zugabe von Ether wird das ausgeschiedene Hydrobromid abgetrennt und sogleich in 25 ml Dimethylformamid gelöst. Die anschließende Umsetzung wird wieder nach der obigen Methode

der gemischten Anhydride unter Verwendung von 3,72 g (8,7 mmol) Z-Leu · DCHA, 1,2 ml (10 mmol) Pivaloylchlorid, 0,83 ml (8,7 mmol) Pyridin und 1,19 ml (8,7 mmol) N-Ethylpiperidin in Dimethylformamid als Lösungsmittel durchgeführt. Das Produkt wird wie die obige Verbindung II isoliert. Auf diese Weise werden 4,5 g (73 % d. Th.) Produkt in Form eines Schaums erhalten. Aminosäureanalyse: Leu 0,98, Arg 1,09, Pro 0,93.

Z-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (IV)

Aus 2,6 g (5,82 mmol) Z-D-TIe · DCHA wird mit 0,1N Schwefelsäure Z-D-TIe freigesetzt und in Ethylacetat aufgenommen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels werden 2 g eines öligen Produkts erhalten, das sogleich in 20 ml Methylenchlorid gelöst ifjird.

4 g (5,7 mmal) Verbindung II werden mit Bromwasserstoff in Essigsäure von der Schutzgruppe befreit. Das Produkt wird aus dem erhaltenen Hydrobromid an einer Anionenaustauschersäule (0H-Form) in methanolischer Lösung freigesetzt. Auf diese Weise werden 2,9 g Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et in Form eines Schaums erhalten. Das Produkt ist bei pH 2,5 und 5,7 elektrophoretisch einheitlich (Nachweis mit Ninhydrin). Das erhaltene freie Tripeptidamid wird dann sogleich in 15 ml Methylenchlorid gelöst; nach Abkühlen der Lösung auf -20 C werden nacheinander eine vorher bereitete Lösung von Z-D-TIe und eine Lösung von 2 g (9,7 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Methylenchlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 4 d im Kühlschrank aufbewahrt. Danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert; das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Das Produkt wird nach wiederholtem Waschen der Ethylacetatlösung mit IN Salzsäure, danach mit 5?oiger Natriumhydrogencarbonatlösung sowie mit Wasser als neutraler Stoff isoliert. Auf diese Weise werden 3,9 g (93 % d. Th.) des Peptids in Form eines Schaums erhalten. Das Produkt

ist chromatographisch einheitlich (Dünnsehichtchromatographie auf Silicagel in Chloroform - Methanol 9 : 1). Aminosäureanalyse: D-TIe 0,92, Leu 0,98, Arg 1,01, Pro 0,93.

Z-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (V)

Aus 3,6 g Verbindung IV wird durch Hydrierung an Palladium die Schutzgruppe abgespalten, wodurch 3,0 g (4,4 mmol) des freien Tetrapeptids gewonnen werden. Die Fragmentkondensation mit Z-Ser-Tyr-N-, wird in einem wasserfreien Dimethylformamid-Methylenchlorid-Gemisch bei -30 C unter Verwendung von 1,9 g Z-Ser-Tyr-N^H-,, 1,5 ml 8N Chlorwasserstoff in Dioxan und 0,9 ml n-Butylnitrit durchgeführt. Zur Einstellung auf pH 8 wird N-Ethylpiperidin verwendet. Man läßt das Reaktionsgemisch 3 d im Kühlschrank bei 0 C stehen, dampft danach die flüchtigen Anteile ab, löst den Rückstand in Ethylacetat, wäscht die Lösung wiederholt mit IN Salzsäure, 5?oiger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser und dampft sie nach dem Trocknen ein. Auf diese'Weise werden 4,14 g (76 % d. Th.) des nichtkristallinen rohen Hexapeptids gewonnen. Nach Flüssigkeitschromatographie (Säule 0,4 χ 25 cm; stationäre Phase modifiziertes Silicagel, mobile Phase 70 Vol.-% Methanol und 30 Vol.-?i Phosphatpuffer pH 4,4) enthält das Produkt 82 % Hexapeptid. Aminosäureanalyse: Ser 1,14, Tyr 1,05, D-TIe 0,98, Leu 1,03, Arg 1,04, Pro 1,00.

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg(Tos)-Pro-NH-Et (VI)

Aus 3,8 g des obigen Hexapeptids V wird durch Hydrierung an Palladium in methanolischer Lösung die Schutzgruppe abgespalten, wobei 3,2 g eines Produkts mit einem Gehalt von 88 % des freien Hexapeptids erhalten werden (Bestimmung durch Flüssigkeitschromatographie; Säule und stationäre Phase wie oben, mobile Phase 50 \lol.-% Methanol und 50 Vol.-?o Trifluoressigsäure-Triethylamin-Puffer pH 3,9, Nachweis im UV-Bereich bei 220 nm).

Die Umsetzung des Azids imird in einem wasserfreien Dimethylformamid-Dimethylsulfoxid-Gemisch (1 : 1) unter Verwendung von 1,6 g pGlu-His-Trp-Ν,-,Η-,, 3,2 g des obigen Hexapeptids \l und 0,5 ml n-Butylnitrit durchgeführt; die Umsetzung erfolgt bei -20 C, die Azidbildung innerhalb 30 min, bei der gleichen Temperatur. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Triethylamin auf pH 8 bis 9 eingestellt und 4 d lang unter zeitweiliger pH-Kontrolle im Kühlschrank stehengelassen. Danach werden die Lösungsmittel abgedampft; nach Lösen des Rückstands in wenig Ether wird die erhaltene ölige Lösung mit 30 ml Methanol verdünnt. Das Produkt wird durch Zugabe von Ethylacetat ausgeschieden, abfiltriert und mit einem Ethylacetat-Ether-Gemisch gewaschen. Auf diese Weise werden 3,65 g (87 % d. Th.) des rohen Nonapeptids erhalten. Aufgrund der Flüssigkeitschromatographie (Säule und stationäre Phase wi^oben, mobile Phase 60 \lol.~% Methanol und 40 Vol.-?i Phosphatpuffer pH 7,0, Nachweis bei 210 nm) enthält das Rohprodukt 70 % des obigen Nonapeptids zusammen mit einer gewissen Menge der Ausgangsstoffe (die Peaks wurden durch Einspritzen von Gemischen mit Standards identifiziert), wie auch aus der Aminosäureanalyse des Rohprodukts hervorgeht: GIu 1,43, His 1,41, Trp 1,10, Ser 1,09, Tyr 1,20, D-TIe 0,89, Leu 1,00, Arg, 0,88, Pro 0,90.

Zur Bewertung der biologischen Wirksamkeit wurde der Wirkstoff zunächst durch präparative Chromatographie gereinigt (Säule 2,5 χ 30 cm, stationäre Phase modifiziertes Silicagel (Korngröße 10 μπι), mobile Phase 60 Vol.-?o Methanol und 40 Vol.-?i 0,2?iige wässerige Trifluoressigsäurelösung, Nachweis bei 210 nm). Aus 300 mg des rohen Nonapeptids (in 3 ml der mobilen Phase eingespritzt) werden so 148 mg des gereinigten, 98?iigen Produkts erhalten. Aminosäureanalyse: GIu 1,01, His, 1,01, Trp 0,90, Ser 0,95, Tyr 1,01, D-TIe 0,95, Leu 1,00, Arg 0,99, Pro 1,01.

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (VII)

30 mg der gereinigten Verbindung VI werden in 0,6 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach Zusatz von 0,5 ml Thioglycolsäure wird das Gemisch auf 0 C abgekühlt. Darauf werden 0,4 ml Trifluormethansulfonsäure gegeben und 30 min im Kühlschrank stehengelassen. Das Produkt wird durch Zugabe von Ether ausgefällt und abfiltriert. Das erhaltene mäßig hygroskopische Pulver löst man in IM Essigsäure, friert die Lösung ein und trocknet sie unter vermindertem Druck. Man gewinnt so 25 mg Rohprodukt. Die Reinigung erfolgt durch Flüssigkeitschromatographie an einer Säule von 2,5 χ 30 cm mit modifiziertem Silicagel als stationärer Phase und einem Gemisch von 55 Vol.-?o 45?oigem Methanol und 45 Vol.-?o 0,2%iger wässeriger Trifluoressigsäurelösung als mobiler Phase. 25 mg der Substanz werden in 0,5 ml der mobilen Phase gelöst und eingespritzt. Die Registrierung erfolgt bei 280 nm. Man vereinigt die Fraktionen, die das reine Produkt enthalten, dampft das Methanol bei 30 C unter vermindertem Druck ab und isoliert das Produkt durch Gefriertrocknung aus IM Essigsäure. Auf diese Weise werden 10,5 mg des obigen Nonapeptids mit 98?oiger Reinheit erhalten. Aminosäureanalyse: GIu 1,03, His 0,94, Trp 0,80, Ser 0,95, Tyr 0,96, D-TIe 0,90, Leu 0,99, Arg 1,06, Pro 1,01.

Claims (8)

1. Ansprüche

   6 7 8 9

   pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et (I),

   in der X ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeutet.
2. 2. Analogon der Formel I nach Anspruch 1 mit X = Tosyl.
3. 3. Verfahren zur Herstellung der Analoga nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entsprechenden Aminosäurebzw niederen Peptidreste nach an sich bekannten präparativer Methoden der Peptidchemie miteinander verknüpft werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hexapeptidderivat der allgemeinen Formel II

   Y-Ser-Tyr-D-Tle-Leu-Arg-Pro-NH-Et

   (II),

   in der X dieselbe Bedeutung wie in Formel I hat und Y ein Wasserstoffatom oder eine hydrogenolytisch abspaltbare Schutzgruppe, vorzugsweise Benzyloxycarbonyl, bedeutet,

   mit einem reaktionsfähigen Derivat des Tripeptids der Formel III

   pGlu-His-Trp

   (III)

   233-S10262-SF-Bk

   umgesetzt wird, wonach erforderlichenfalls die Schutzgruppen abgespalten werden.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abspaltung der Schutzgruppe Tosyl in 8-Stellung mit Trifluormethansulfonsäurelösung in Trifluoressigsäure in Gegenwart eines Schutzmittels durchgeführt und danach das Produkt

   in reiner Form gewonnen wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Schutzmittel Thioglycolsäure eingesetzt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung der reinen Reaktionsprodukte
   durch Phasenumkehr-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Trifluoressigsäurelösung in wässerigem
   Methanol als mobiler Phase vorgenommen wird.
8. 8. Pharmazeutische Mittel, gekennzeichnet durch mindestens ein Analogon nach Anspruch 1 oder 2 als Wirkstoff.