DE3117948A1 - Anorexigene peptide - Google Patents
Anorexigene peptideInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Peptide der allgemeinen Formel I
A-B-C (I)
und deren pharmakologisch verträgliche Salze, wobei A einen Rest aus der Gruppe L-Pyroglutamyl (L-H-(pyro)-Glu),
D-Pyroglutamyl (D-H-(pyro)-Glu) und L-Homopyroglutamyl (L-H-
homo-(pyro)-Glu) bedeutet,
Ii HtHTi ]<e;;t. ;iw:i iln· Gruppe I.-Hi atidyl (L~Hir>), I)-Hi Mt,idyl
(D-His), L-3'-Methylhistidyl (L-Nim-3-MeHis), L-Phenylalanyl
(L-Phe), L-p-Aminophenylalanyl (L-p-NHpPhe) und L—ß-(Pyrazolyl-1)-alanyl
(L-ß-(pyrazolyl-1)Ala) bedeutet und C einen Rest aus der Gruppe Glycin und dessen niedere Alkylester
(GIy-OR, wobei R H oder nieder-Alkyl bedeutet), Glycinamjd
und dcsison nioder-Alkylumide (GIy-NlIH, wobei H II oder
nieder-Alkyl bedeutet), 2-Amino-1-hydroxyäthyl (Gly-ol), D-Alanin
(D-AIa), L-ß-(2-Thienyl)-alanin und NHR bedeutet, wobei
R nieder-Alkyl ist,
mit der Massgabe, dass C nicht Glycin oder Glycinamid ist, wenn A L-Pyroglutamyl und B L-Histidyl bedeuten.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, in diesem Verfahren
eingesetzte Zwischenprodukte, die Verwendung dieser Verbindungen als ano.rexigene Mittel zur Behandlung von Fettsucht
und anderen pathologischen Zuständen, bei denen eine Vt't'f i iigoruriK dft' Nahrung.·!- oder FuU -ernufriiihnm nufVzHtft IdI ,
bei Säugetieren, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung von pathologischen Zuständen, die bei überschüssiger
Sekretion von Magensäure und Pankreasflüssxgkeit auftreten, wie Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre oder akute Pankreatitis,
und bei der Behandlung von bestimmten kritischen Zuständen des zentral en Nervensystems, wie Bewußtseinsstörungen oder
Koma aufgrund von Hirnverletzungen.
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RS CAS 38 (SC-D - i) - 211 7948
Die für die Aminosäuren und deren Reste sowie für die Schutzgruppen
verwendeten Abkürzungen beruhen auf Empfehlungen der IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature (vgl. Biochemistry,
Bd. 11 (1972), S. 1726. Beispiele dafür sind: (Pyro)-Glu = 5-Oxoprolin oder Pyroglutaminsäure; homo-(pyro)-GIu =
Homopyroglutaminsäure; His = Histidin; N^-S-His = 3'-Methylhistidin;
Phe = Phenylalanin; p-NHpPhe = p-Aminophenylalanin,
ß-(pyrazolyl-1)Ala = ß-(pyrazol-1-yl)-alanin; GIy = Glycin; Gly-ol = 2-Aminoäthanol; und
Thi = ß-(2-Thienyl)-alanin.
Sämtliche Aminosäuren besitzen die natürliche oder L-Konfiguration,
sofern nichts anderes angegeben ist. D-His ist der Rest von D-Histidin, D-(pyro)-Glu der Rest von D-Pyroglutaminsäure
und D-AIa der Rest von D-alanin. Die Abkürzungen Me und Et werden für Methyl und Äthyl verwendet. Für Schutzgruppen
werden beispielsweise folgende Abkürzungen verwendet: Bog = tert.-Butyloxycarbonyl; Z = Benzyloxycarbonyl;
Tos = Tosyl; Dnp = Dinitrophenyl; Nim = Imidazolstickstoff
von Histidin; und Y = eine geeignete verankernde, an einen festen Harzträger gebundene, bei der Festphasensynthese verwendete
Gruppe, vorzugsweise
- 0 - CH2 -
Die humorale Appetitkontrolle, insbesondere über den Hypothalamus,
wird seit vielen Jahren diskutiert; vgl. beispielsweise den Übersichtsartikel von Schally et al., Am. J. Med.
Sei., Bd. 248 (1964), S. 79 und die darin genannten Literaturstellen.
Seit dieser Zeit ist es bekannt, dass der Hypothalamus an der Regulierung der Nahrungsaufnahme beteiligt
ist. Eine elektrische Stimulierung des lateralen Hypothalamusbereichs führt zu Hyperphagie und dessen Zerstörung zu Aphagie.
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Im Gegensatz dazu bewirkt eine Stimulierung des ventromedialen Kerns eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und dessen Zerstörung
Hyperphagie und Fettsucht.
Das Fettsuchtsyndrom, das durch Verabfolgung von Goldthioglucose hervorgerufen wird, ist zum Teil die Folge einer mit
Hypothalamusläsionen, die durch dieses Mittel hervorgerufen werden, verbundenen Hyperphagie. Die Theorien über die neu-
rale Kontrolle von Hunger, Appetit und Sättegefühl wurden
von verschiedenen Autoren diskutiert. Es wurden verschiedene Mechanismen vorgeschlagen:
1) Thermostatische Theorie
Gemäss dieser Theorie regulieren eine spezielle dynamische
Wirkung der Nahrung und ihr Einfluss auf die Körpertemperatur den Appetit.
2) Chemostatische Theorien
Diese Theorien postulieren, dass der Appetit durch intrazelluläre oder extrazelluläre Konzentrationen von Glucose
(glucostatische Theorie), Lipiden (lipostatische Theorie) und von verschiedenen Metaboliten, wie Serum-Aminosäuren,
reguliert wird.
3) Eine weitere Gruppe von Theorien nimmt an, dass Empfindungen des Verdauungstrakts, die beim Essen und beim Vor-,
handensein von Nahrung im Magen und im Darm auftreten, den Appetit regulieren. Zu den Faktoren, die am Entstehen des
Sättegefühls beteiligt sind oder das Absetzen der Nahrungsaufnahme bewirken, gehören die Dehnung des Magens durch
Nahrung oder nicht-nahrhafte Substanzen. Magenkontraktionen können mit dem Hungerverhalten in Beziehung gebracht
werden, jedoch sind diese Kontraktionen bei Tieren, die durch Hypothalamusläsionen künstlich in einen aphagischen
oder hyperphagischen Zustand versetzt worden sind, die gleichen wie bei Tieren, denen Futter und Wasser vorenthalten
wird.
— 5 —
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Diese Theorien sind nicht zur Erklärung sämtlicher experimenteller
Befunde in der Lage. Hierzu gehört, dass diabetische Tiere Hunger verspüren können. Schally et al.,
a.a.O., nehmen an, dass die bei Tieren mit Hypothalamusläsionen auftretende Fettsucht eher durch einen humoralen
als durch einen neurogenen Mechanismus übertragen wird und dass der Hypothalamus möglicherweise eine Substanz entwickelt,
die an der zentralen Appetitkontrolle beteiligt ist-Es werden vorläufige Befunde erläutert, die darauf hinweisen,
dass im neurohypophysialen Extrakt eine Substanz vorhanden ist,, die die dynamische Phase der Gewichtszunahme
bei mit Goldthioglycose behandelten Mäusen beeinflussen.
Ferner ist ein neuerer kurzer Übersichtsartikel von Schally et al. über den Status der Forschung bezüglich der Hypothalamuskontrolle
von Futteraufnahme und Fettsucht erschienen; vgl Recent Progress in Hormone Research, Proceedings of the
1967 Laurentian Hormone Conference, Bd. 24 (1968), S. 497, insbesondere S. 570 bis 571 und die dort genannten Literaturstellen.
Zu diesen Literaturstellen gehört die Arbeit von Schally u. Mitarb., Science, Bd. 157 (-1967), S. 210,
in der gezeigt wird, dass eine Verabfolgung von aus Hundeduodenum gereinigtem Enterogastron die Nahrungsaufnahme
von 17 Stunden ohne Futter belassenen Mäusen verringert. Diese Wirkung ist während der ersten 30 Minuten am grössten,
jedoch dauert die kumulative Verringerung mindestens 4 Stunden an. Andere aus Hundeduodenum oder -kolon isolierte Peptide
sowie Glucagon, Secretin, Glucose und Rinderserumalbumin erwiesen sich als unwirksam. Diese Autoren vermuten,
dass diese Wirkungen auf eine direkte Beseitigung von Hunger-Magenkontraktionen zurückzuführen sind oder dass
sie durch das Zentralnervensystem unter Freisetzung von Hypothalamussubstanzen hervorgerufen werden, obgleich ein
positiver Beweis für Hypothalamus-Neuroflüssigkeiten, die
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für eine indirekte oder direkte Kontrolle des Appetits verantwortlich sind, damals noch nicht geführt werden konnte,
Es hat den Anschein, dass dieser positive Beweis durch Trygstad et al., Acta Endocrinologica, Bd. 89 (1978),
S. 196 geliefert worden ist. Diese Autoren isolierten eine Anzahl von Peptiden aus dem Urin von Patienten, die an
kongenitaler, allgemeiner Lipodystrophie (Hypothalamussyndrom) litten. Diese Peptide riefen entsprechende Stoffwechselwirkungen
hervor. Nervöse Anorexie ist mit Hypothalamusstörungen verbunden. Bei primärer, nervöser Hypothalamusanorexie
ist die Hypothalamus-Hypophysen-Achse gestört, was zu einer geringen Gonadotropin-Freisetzung,
Amenorrhoe, einem Verlust des täglichen Rhythmus der ACTH-Ausscheidung,
einer verringerten Thyrotropin-Ausscheidung und einem anfänglichen Ansteigen und späteren Abnehmen der
Somatotropin-Ausscheidung führt.
Niederschläge aus Urinproben von 25 Patienten mit nervöser Anorexie wurden an mit Sephadex G-25-Gel gepackten Säulen
chromatographiert. Es ergab sich eine Einteilung in vier verschiedene chromatographische Muster: Eines war dem
Muster von normalen Kontrollpersonen ähnlich, eines zeigte Ähnlichkeit mit dem von Schizophreniepatienten, bei 5 Patienten
mit einer hysteriformen Neurose ergab sich ein drittes Muster und 10 Mädchen mit einem primären "Hypothalamus"-Typ
von nervöser Anorexie zeigten ebenfalls typische Chromatogramme. Fraktionen mit einem Einfluss auf
den Appetit bei Mäusen wurden nur in der letzten Gruppe gefunden, über mehrere chromatographische Stufen wurden zwei
appetitbeeinflussende Peptide isoliert. Injizierte man diese Peptide Mäusen, rief eines gesteigerten Appetit hervor,
während das zweite eine Appetitverminderung bewirkte. Die Peptide sind in Peptid-Trägerproteine eingehüllt und somit
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gegen einen enzymatischen Abbau geschützt, was ihre Isolierung aus dem Urin ermöglicht.
Die Struktur des anorexigenen Peptids wurde von Reichelt et al., Neuroscience, Bd. 3 (1978), S. 1207 in enger Zusammenarbeit
mit Trygstad aufgeklärt. Es handelt sich um das Tripeptid H-(pyro)-Glu-His-GlyOH, was durch Synthese
bestätigt wurde.
Bei einer Injektion von 12 nMol täglich des appetitzügelnden
Peptids an Mäuse über 20 Tage hinweg verringerte sich die Futteraufnahme etwa 6 Monate lang von 5,7 auf 3,0 g pro Tag.
Das Körpergewicht fiel von durchschnittlich 35 g auf ein Minimum von 24 g.
Das Tripeptid besitzt keine akute Wirkung auf den Glucosespiegel im Blut und auf den Insulinspiegel im Serum. Offensichtlich
wirkt es auf Rezeptoren in den den Appetit kontrollierenden Hypothalamuszentren.
Das appetitstimulierende Peptid erhöhte die tägliche Futteraufnahme
auf über 10 g, wobei das Körpergewicht auf durchschnittlich 57 g anstieg. Die Struktur des appetitstimulierenden
Peptids konnte nicht identifiziert werden.
Zwei ähnliche Faktoren, die ein gesteigertes und ein verringertes Futteraufnahmeverhalten zeigen, wurden auch bei
Patienten mit genetisch bedingter, metabolischer Fettsucht isoliert.
Erfindungsgemäss wurde nunmehr festgestellt, dass die Peptide
der allgemeinen Formel I
A-B-C
in der A, B und C die vorstehend angegebene Bedeutung haben,
aktiver sind und eine länger anhaltende Aktivität in bezug auf eine Verringerung des Appetits und eine Senkung der
Nahrungsaufnahme besitzen, als dies beim Tripeptid Pyroglutamyl-histidyl-glycin
(H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH), das von Trygstad et al., a.a.O. sowie von Reiehelt et al., a.a.O.,
isoliert wurde, der Fall ist. Die Peptide der allgemeinen Formel I und deren pharmakologisch verträgliche Salze, die
biologisch den vorgenannten Peptiden äquivalent sind, sind daher wertvolle appetitzügelnde Wirkstoffe zur Behandlung
von Fettsucht und damit verbundenen pathologischen Zuständen, bei denen eine Verringerung der Nahrungsaufnahme erforderlich
ist. Diese Wirkstoffe verringern auch die Magen- und Pankreassekretion. Sie eignen sich daher auch zur Behandlung
von pathologischen Zuständen, bei denen eine übermässige Bildung von Magensäure und/oder Pankreasflüssigkeit
gegeben ist. Ausserdem besitzen sie bestimmte Wirkungen auf das Zentralnervensystem, so dass sie für die akute Behandlung
von Bewusstseinsstörungen geeignet sind.
Die erfindungsgemässen Verbindungen besitzen gegenüber dem
natürlichen Tripeptid den Vorteil, dass sie aktiver sind und ihre Wirkung länger anhält. Diese beiden Vorteile sind
von besonderer praktischer Bedeutung: Aufgrund der geringeren minimalen wirksamen Dosen ergibt sich eine Verringerung
der Nebenwirkungen sowie auch der Kosten für die Herstellung der Verbindungen. Aufgrund der länger anhaltenden Wirkung
ist eine weniger häufige Verabfolgung erforderlich.
Aufgrund der Tatsache, dass die Peptide der allgemeinen Formel I und deren pharmakologisch verträgliche Salze biologisch
äquivalent sind, sind sämtliche vorangehenden und folgenden Hinweise auf die Peptide der allgemeinen Formel I
so zu verstehen, dass darunter die Peptide selbst als auch die Salze fallen.
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Gegenstand der Erfindung sind auch geschützte Zwischenprodukte,
die an einen festen Harzträger gebunden sind und die zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel
I verwendet werden.
Als Schutzgruppen bei der stufenweisen Festphasensynthese der Zwischenprodukte können solche Gruppen eingesetzt werden,
die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen fernt werden können, ohne dass eine Beeinträchtigung des
gewünschten Endprodukts der allgemeinen Formel I eintritt. Vorzugsweise werden diese Schutzgruppen so gewählt, dass
sie in einer einzigen Stufe zusammen mit anderen Schutzgruppen, beispielsweise zusammen mit der vorstehend definierten
Verankerungsgruppe Y, entfernt werden können. Eine besonders geeignete Schutzgruppe R , die bei der stufenweisen
oder Festphasensynthese der vorgenannten Zwischenprodukte eingesetzt wird, ist tert.-Butyloxycarbonyl (Boc).
Bevorzugte Schutzgruppen R zum Schutz des Imidazolstickstoffs
von Histidin sind Tosyl (Tos) oder Dinitrophenyl (Dnp). Eine geeignete Schutzgruppe R zum Schutz der Phenylaminogruppe
in p-Aminophenylalanin ist die Benzyloxyr
carbonylgruppe (Z). Eine geeignete Verankerungsgruppe zum Verknüpfen mit dem Harzträger ist die vorstehend definierte
Gruppe Y, beispielsweise -0-CHp-. Die vorgenannten Schutzgruppen sind gegenüber den Reagentien und unter den
Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der Schutzgruppe an der terminalen Aminogruppe und bei den nachfolgenden
Kupplungsreaktionen angewendet werden, stabil.
Der Ausdruck "nieder-Alkyl" bedeutet geradkettige oder verzweigte
Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.
Die Peptide der allgemeinen Formel I werden durch stufenweise Festphasensynthese beginnend mit der endständigen
Carboxylgruppe hergestellt. Dieses Verfahren lässt sich
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kurz folgendermassen zusammenfassen: Eine für C oder für
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B, wenn C NHR mit R = nieder-Alkyl bedeutet, gewählte spezielle
Aminosäure, die an der der oi-Aminogruppe eine geeignete Schutzgruppe und gegebenenfalls andere Schutzgruppen
aufweist und mit der vorstehend definierten Gruppe Y mit dem Harzträger verknüpft ist, wird einer Behandlung zur Entfernung
der Schutzgruppe an der oC-Aminogruppe unterzogen und mit der speziellen Aminosäure, die für B oder A, wenn
ι C die vorstehend definierte Bedeutung NHR hat, gekuppelt,
wobei als Kupplungsmittel ein geeignetes Dialkyl- oder Dieyeloalkylcarbodiimid gewählt wird. Das vorgenannte Verfahren
wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl an Aminosäuren miteinander verknüpft ist. Sodann wird
die Schutzgruppe an der terminalen Aminogruppe sowie gegebenenfalls
vorhandene andere Schutzgruppen und die Verankerungsgruppe Y entfernt. Nach Entfernen des Lösungsmittels
erhält man das gewünschte rohe Peptid. Das Rohprodukt wird chromatographisch, beispielsweise durch Gelfiltration gereinigt,
wodurch man das gewünschte Peptid in reinem Zustand erhält.
Die zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel I verwendeten Ausgangsmaterialien sind entweder handelsübliche
Verbindungen oder lassen sich leicht nach an sich bekannten Verfahren herstellen. Sämtliche zur Synthese der
genannten Peptide verwendeten Aminosäuren sind im Handel erhältlich, mit Ausnahme von Homo-(pyro)-glutaminsäure,
deren Herstellung von Greenstein und Winitz in "Chemistry
of the Amino Acids", J. Wiley, New York, 1961, S. 2407 bis
2462 beschrieben ist, und ß-(2-Thienyl)-alanin, dessen Herstellung
sich aus der vorgenannten Literaturstelle, S. 2707, ergibt.
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Geeignete feste Harzträger sind chlormethylierte und hydroxymethylierte
Harze, wobei die erstgenannten Harze bevorzugt werden. Bezüglich der Herstellung von Hydroxymethylharzen
wird auf M. Bodansky und .J. T. Sheehan, Chem. Ind., London, Bd. 38 (1966), S. 1597 verwiesen. Ein clilormethyliertes Harz
wird von der Firma Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, vertrieben. Bei Verwendung des chlormethylierten
Harzes wird eine Ester-Verankerungsgruppe mit der an der oi-Aminogruppe geschützten Aminosäure C (oder B, wenn C das
vorstehend definierte NHR bedeutet) gebildet, wobei gegebenenfalls weitere Schutzgruppen vorhanden sind.
(geschütztes C oder B) -0 -CH- I Harz
träger
Ein zweckmässiges Verfahren zur Umwandlung des verknüpften, geschützten Peptids zum C-terminalen (nieder-Alkyl)-a mid
besteht in der Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz durch Behandlung mit einem nieder-Alkylamin; vgl. D.H. Coy
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 57 (1974), S. 335, wodurch man das entsprechende geschützte Peptid-(niederalkyl)-amid
erhält. Anschliessend werden die Schutzgruppen des gebildeten Peptid-(nieder-alkyl)-amids durch Behandlung
mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder vorzugsweise durch Spaltung mit Chlorwasserstoff entfernt, wodurch man das entsprechende
Peptid der Erfindung erhält. Eine andere Verfahrensweise besteht darin, die Spaltung durch Umesterung
mit einem niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Gegenwart von Triäthylamin durchzuführen, wodurch
man den entsprechenden Ester erhält. Dieser Ester kann in das entsprechende (nieder-Alkyl) Amid umgewandelt werden.
Anschliessend können auf die vorbeschriebene Weise die Schutzgruppen entfernt werden. Ist die Bildung der freien
Carbonsäure erwünscht, wird die Spaltung vorzugsweise mit Fluorwasserstoff in Anisol durchgeführt. Wünscht man die
Bildung des Säureamids, führt man die Spaltung mit Ammoniak
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durch. Diesbezüglich wird auch auf J. M.Stewart und J.D.
Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, S. 40-49 verwiesen.
Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird an der o<
-Aminogruppe geschütztes Glycin, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonylglycin,
mit Hilfe eines Katalysators, vorzugsweise Cäsiumhydrogencarbonat oder Triäthylamin, mit einem
chlormethylierten Harz gekuppelt. Nach der Kupplung des an der c*-Aminogruppe geschützten Glycins an den Harzträger
wird die oi-Aminoschutzgruppe entfernt, beispielsweise unter
Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder Chlorwasserstoffsäure in Dioxan.
Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei Temperaturen von etwa 0° bis Raumtemperatur durchgeführt. Es können auch
andere Standard-Spaltungsreagentien und -Bedingungen zur Entfernung
von speziellen tf-Aminoschutzgruppen angewendet werden; vgl. E. Schroder und K. Lubke, "The Peptides", Bd. 1,
Academic Press, New York, 1965, S. 72 bis 75. Nach der Entfernung der oc-Aminoschutzgruppe werden die übrigen an der
o( -Aminogruppe geschützten Aminosäuren stufenweise in der
gewünschten Reihenfolge unter Bildung des gewünschten Peptids gekuppelt. Die geschützten Aminosäuren werden jeweils in einom
1-fnohen überschuss in den F^iJiphasenreaktor Mnßf1-bracht.
Die Kupplungsreaktion wird in Methylenchlorid oder Gemischen aus Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt.
In Fällen, bei denen die Kupplung unvollständig verläuft, wird das Kupplungsverfahren vor der'Entfernung der
<*-Aminoschutzgruppe und vor der Kupplung der nächsten Aminosäure
an die feste Phase wiederholt. Der erfolgreiche Verlauf der Kupplungareaktion in den einzelnen Synthesestufen
wird mit Hilfe der Ninhydrinreaktion gemäss E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., Bd. 34 (1970), S. 595, überwacht.
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Nach erfolgter Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz wird das geschütze Peptid vom Harzträger durch Behandlung
mit einem (nieder-Alkyl)-amin unter Bildung des geschützten Peptid-(nieder-alkyl)-amids entfernt. Bei Verwendung von
Dinitrophenyl oder Tosyl als Schutzgruppe für den Histidylrest werden diese Schutzgruppen ebenfalls während der Behandlung
mit dem (nieder-Alkyl)-amin entfernt. Das Peptid kann von dem Harz auch durch Umesterung mit einem niederen
Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Gegenwart von Triäthylamin abgetrennt werden, wonach der gewonnene
Ester chromatographisch an Kieselgel gereinigt wird. Die gewonnene Fraktion kann der Behandlung mit einem (nieder-AlkyD-amin
zur Umwandlung des nieder-Alkylesters, vorzugsweise des Methyl- oder Äthylesters, in das carboxyl-endständige
(nieder-Alkyl)-amid unterworfen werden. Zu beachten ist, dass gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene
Dinitrophenyl- oder Tosylgruppen ebenfalls abgespalten werden. Die verbleibenden Seitenkettenschutzgruppen des geschützten
Alkylamids werden sodann nach den vorstehend erläuterten Verfahren abgespalten, beispielsweise durch
Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff. Die Abtrennung des gewünschten Peptids vom
Harzträger kann auch mit Ammoniak unter Bildung des entsprechenden Amids oder mit Fluorwasserstoff und Anisol unter
Bildung der entsprechenden freien Säure vorgenommen werden. Peptide der allgemeinen Formel I, in der C 2-Aminohydroxyäthyl
(Gly-ol) bedeutet, werden durch Spaltung eines A-B-Dipeptid-Harzes
mit 2-Aminoäthanol hergestellt. Es ist zu beachten, dass gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene
Dinitrophenyl- oder Tosylgruppen bei diesem Verfahren ebenfalls abgespalten werden.
Wie bereits erwähnt, lassen sich die Peptide der allgemeinen Formel I auch in Form von Salzen mit Säuren erhalten.
Beispiele dafür sind Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure,
Methansulfonsäure und Toluolsulfonsäure, Polymer-
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säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose, und anorganischen
Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, sowie Schwefelsäure und Phosphorsäure.
Gegebenenfalls können spezielle Salze mit Säuren in Salze mit anderen Säuren, beispielsweise in nicht-toxische,
pharmakologisch verträgliche Salze übergeführt werden, indem man sie gemäss R.A. Boissonnas et al., HeIv. Chim. Acta.,
Bd. 43 (1960), S. 1349 mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz
behandelt. Beispiele für entsprechende Ionenaustauscherharze sind Kationenaustauscher auf Cellulosebasis, wie Carboxymethylcellulose
oder chemisch modifizierte, vernetzte Dextran-Kationenaustauscher, beispielsweise solche vom
Sephadex C-Typ, sowie stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die von J.P. Greenstein und M. Winitz
in "Chemistry of the Amino Acids", John Wiley and Sons, Inc., New York und London, 1961, Bd. 2, S. 1456, aufgeführten Harze.
Die Peptide der allgemeinen Formel I und ihre Salze besitzen wertvolle und langanhaltende Wirkungen, nämlich eine appetitzügelnde
Wirkung, eine Hemmwirkung auf die Sekretion von Magen- und Pankreassaft sowie eine ZNS-aktivierende
Wirkung.
Die appetitverringernde und anorexigene Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I lässt sich durch Fütterungsversuche
an Mäusen, Ratten oder Hunden, ähnlich den von Trygstad et al., a.a.O., und von Reichelt et al., a.a.O. beschriebenen Versuchen,
bestimmen. Die Hemmwirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Magen- und/oder Pankreassekretion
wird an unbetäubten Ratten oder vorzugsweise an unbetäubten Hunden mit Speiseröhren-, Magen- und Pankreasfistein oder
auch an Hunden mit Heidenhain-Taschen bestimmt; vgl.B.P.
Babkin, "Secretion Mechanism of Digestive Glands", 2. Aufl., B.P. Hoeber, New York, 1950, gemäss Zitat "Physiology",
Hrsg. E. Seikurt, Little, Brown and Company, Boston, 1963, S. 542 bis 544; L. Olbe, Gastroenterology, Bd. 32 (1959),
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S. 460; Antin et al., Journal of Comparative and Physiological Psychology, Bd. 89 (1975), S. 784; und Liebling et al.,
ibid., Bd. 89 (1975), S. 955. Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf das Zentralnervensystem, insbesondere
ihr charakteristisches Spektrum neurotroper Wirkungen, lässt sich durch eine Reihe von ZNS-Test ermitteln;
vgl. beispielsweise A.J. Kastin, R.D. Olson, A.V. Schally
und D.H. Coy, Life Scineces, Bd. 25 (1975), S. 401; A.J. Prange, G.R. Breese, J.M. Cott, B.R. Martin, B.R. Cooper,
I.C. Wilson und N.P. Plotnikoff, Life Sciences, Bd. 14
(1974), S. 447; und M. Brown und W. Vale, Endocrinology, Bd. 96 (1975), S. 1333.
Mäuse, Ratten und Hunde werden als Versuchstiere zur Bestimmung der appetitverringernden oder anorexigenen Wirkungen
von Arzneistoffen sowie zur Bestimmung der Hemmwirkung auf die Magen- und/oder Pankreassekretion bevorzugt,
da in zahlreichen Fällen ausgezeichnete Parallelen zwischen Tierversuchen und klinischen Untersuchungen am-Menschen
festgestellt wurden, beispielsweise beim Menschen unter kontrollierter oraler oder intragastrischer Ernährung mit flüssiger
Diät; vgl. H.A. Jordan, Journal of Comparative and Physiov^.
logical Psychology, Bd. 68 (1969), S. 498; G.A. Bray und
F.L. Greenway, Clinics in Endocrinology and Metabolism, Bd.5
(1976), S. 455; und H.D. Janowitz, "Role of gastrointestinal tract in regulation of food intake", zitiert in "Handbook
of Physiology", Abschnitt 6, Alimentary Canal., Hrsg. CF. Code und W. Heidel, American Physiological Society, Washington,
1967.
Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I und ihrer pharmakologisch verträglichen Salze als Appetithemmer und
anorexigene Mittel lässt sich unter Verwendung von Ratten zeigen. Ratten werden als Versuchstiere zum Nachweis der
Wirkung von Arzneistoffen, die die Nahrungsaufnahme hemmen, bevorzugt. Verschiedene Autoren haben die Parallelität zwischen
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den Ergebnissen an Ratten und an Menschen festgestellt; vgl. zum Beispiel G.A. Bray in "The Obese Patient", Bd. IX
von "Major Problems in Internal Medicine", W.B. Saunders Company, Philadelphia, London, Toronto, 1976. In Kapitel 9
mit dem Titel "Drug Therapy for the Obese Patient" sind unter dem Abschnitt "Pharmacology - Effects on the Central
Nervous System", auf S. 364, Tabelle 9-4 Daten aufgeführt,
die u.a. die Verringerung der Futteraufnahme bei Ratten durch eine Reihe von anorexigenen Arzneistoffen zeigen.
Im Abschnitt "Clinical Use of Anorectic Drugs" wird auf S. 369 in Tabelle 9-7 gezeigt, dass die gleichen Arzneistoffe
wie in Tabelle 9-4 auch für die klinische Anwendung geeignet sind.
Aufgrund der vorgenannten Eigenschaften sind die Peptide der allgemeinen Formel I zur Verabreichung an Säugetiere
in der Tiermedizin und auch in der Humanmedizin geeignet.
Aufgrund ihrer appetithemmenden und anorexigenen Eigenschaften eignen sie sich zur Behandlung von Fettsucht, einschliesslich
der präoperativen Verringerung des Körpergewichts, die häufig bei fettleibigen Patienten vor grösseren
Eingriffen erforderlich ist. Die Peptide sind aufgrund ihrer Eigenschaften auch wertvoll zur Behandlung von anderen
pathologischen Zuständen, die eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts erforderlich machen,
beispielsweise bei bestimmten Formen von Diabetes oder Kreislauferkrankungen·
Aufgrund ihror Hemmwi rkun/x auf die Sekretion von Magens/iure
und Pankreasflüssigkeit eignen sich die Peptide der allgemeinen Formel I zur Behandlung von pathalogischen Zuständen,
die mit einer Magen- und/oder Pankreashypersekretion an Magensäure oder Gastrin, Pepsin oder Histamin
einhergehen, beispielsweise bei Duodenumgeschwüren oder akuter Pankreatitis.
13 o"o 65/0857
RS CAS 38 (SC-1) - 18 -
Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf das Zentralnervensystem zeigt ein neurotropes Wirkungsprofil,
das sich signifikant von den Profilen tricyclischer Antidepressionsmittel
und herkömmlicher Arzneistoffe unterscheidet. Aufgrund ihrer ZNS-aktivierenden Wirkung sind
die Peptide der allgemeinen Formel. I wertvolle Wirkstoffe zur Behandlung bei Bewusstseinsstörungen oder Koma aufgrund
von Hirnverletzungen, beispielsweise im Fall von zerebralen Traumata oder Tumoren, in schweren Erfrierungsfällen oder bei bestimmten postoperativen Zuständen, sowie
bei Bewusstseinsstörungen, die durch bestimmte Gefässerkrankungen oder durch übermässige Arzneimitteleinnahme
(z.B. Intoxikationen durch Arzneistoffe) verursacht werden.
Bei Verwendung der Peptide der allgemeinen Formel I oder von deren pharmakologisch verträglichen Salzen bei Säugetieren
als appetitzügelndes oder anorexigenes Mittel zur Behandlung von Fettsucht oder anderen pathologischen Zuständen,
die eine Verringerung der Nahrungsaufnahme erforderlich machen, bei deren Verwendung als Mittel zur Hemmung
einer übermässigen Magen- oder Pankreassekretion oder bei ihrer Verwendung als ZNS-aktivierendes Mittel, beispielsweise
an Mäusen, Ratten oder Hunden, können diese Wirkstoffe allein oder zusammen mit pharmakologisch verträglichen
Trägerstoffen eingesetzt werden. Das Verhältnis von Arzneistoff und.Trägerstoff wird durch die Löslichkeit und
chemische Natur der Verbindung, den Verabfolgungsweg und die übliche biologische Praxis bestimmt. Beispielsweise
kann eine Wirkstoffmenge, die zur Verringerung des Appetits und/oder der Nahrungsaufnahme ausreicht, oral in fester
Form zusammen mit Trägerstoffen, wie Stärke, Zucker, bestimmten Arten von Tonen und dergleichen, verabfolgt werden.
- 18 130065/0857
RS CAS 38 (SC-1) - 19 -
In ähnlicher Weise können entsprechende Mengen oral in Form von Lösungen oder Suspensionen verabfolgt werden. Die Verbindungen
lassen sich auch parenteral injizieren. Für die orale oder parenterale Verabfolgung werden sterile Lösungen
oder Suspensionen in einem pharmakologisch verträglichen flüssigen Trägerstoff, wie Wasser, Äthanol, Propylenglykol
oder Pol yä thyl englykol, die andere gelö.ste Stoffe oder Suspendiermittel,
beispielsweise zur Herstellung von isotonen Lösungen ausreichende Mengen an Kochsalz oder Glucose, Salze
von Gallensäuren, Gummi-arabicum, Gelatine, Sorbitanmonooleat,
Polysorbat 80 (Oleatester von Sorbit und dessen mit Äthylenoxid copolymerisierte Anhydride), wie Tween 80,
■enthalten, verwendet.
Die Dosierung der Peptide der allgemeinen Formel T hängt vom
Verabfolgungsweg und von der speziellen, gewählten Verbindung ab. Ausserdem hängt sie von der speziellen, zu behandelnden
Person ab. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosen, die wesentlich unter der optimalen Dosis der Verbindung
liegt, begonnen. Anschliessend wird die Dosierung in kleinen Stufen erhöht, bis die optimale Wirkung unter den
gegebenen Umständen erreicht wird. Im allgemeinen werden die Verbindungen in Mengen verabfolgt, die eine Verringerung
des Appetits und/oder der Nahrungsaufnahme, eine Hemmung der Magen-und/oder Pankreassekretion oder eine Aktivierung
des Zentralnervensystems hervorrufen, ohne dass schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen auftreten. Derartige Dosen
liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1,0 ^Ag bis etwa
250^Ug pro kg Körpergewicht pro Tag, obgleich, wie vorstehend
erwähnt, diese Dosen variiert werden können. Besonders bevorzugt sind Dosierungen im Bereich von etwa 5 bis
etwa 100^g pro kg pro Tag, vorzugsweise in unterteilten
Dosen.
- 19 130065/0857
Die einzelnen pharmakologischen Wirkungen der Peptide der '
allgemeinen Formel I sind, bezogen auf das Gewicht, grosser als bei einer Anzahl von Arzneimitteln, die für die gleichen
Zwecke verwendet werden. Darüberhinaus besitzen die meisten der klinisch verwendbaren Appetitzügler eine dem
Phenäthylamin verwandte Struktur und weisen daher die mit dieser Struktur verbundenen unerwünschten Nebenwirkungen
auf. Die Peptide der allgemeinen Formel I besitzen keine Phenäthylaminstruktur und sind daher frei von diesen Nebenwirkungen.
Ausserdem besitzen sie eine geringe Toxizität und gewährleisten somit eine sichere Anwendung.
Bei Verwendung der Peptide der allgemeinen Formel I, vorzugsweise in Form von Salzen mit Säuren, in der Humanmedizin,
kann eine systemische Verabfolgung, entweder durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, oder eine
sublinguale oder nasale Verabfolgung, in Verbindung mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen durchgeführt,
werden.
Es können auch Arzneipräparate für die orale Verabfolgung hergestellt werden. Zu diesem Zweck werden die Wirkstoffe
mit geeigneten bekannten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln vermischt und in an sich bekannter Weise zu Präparaten,
wie Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen oder dispergierbaren Pulvern, verarbeitet.
Feste Zubereitungen können in Kapseln für die orale Verabfolgung gefüllt werden. Derartige Zubereitungen zur Abfüllung
in Kapseln können den festen Wirkstoff im Gemisch mit festen Materialien, die eine Pufferwirkung ausüben,
beispielsweise im Gemisch mit kolloidalem Aluminiumhydroxid oder Calciumhydrogenphosphat, oder zusammen mit einem
inerten Feststoff, wie Lactose, enthalten.
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Präparate in Form von Tabletten können auf an sich übliche Weise überzogen oder in Form von schäumenden oder nichtschäumenden Präparaten bereitgestellt werden. Hierbei können
inerte Verdünnungsmittel oder Trägerstoffe, wie Magnesiumcarbonat oder Lactose, zusammen mit üblichen Sprengmitteln,
wie Maisstärke und Alginsäure, und Gleitmitteln, wie Magnesiumstearat,
verwendet werden.
Zur Verabfolgung auf nasalem Wege in Form von Tropfen oder Sprays, werden die Peptide der allgemeinen Formel I vorzugsweise
in einem sterilen, wässrigen Träger eingesetzt, der auch andere gelöste Stoffe, wie Puffer oder Konservierungsmittel,
sowie zur Herstellung einer isotonen Lösung ausreichende Mengen an pharmakologisch verträglichen Salzen
oder an Glucose enthalten kann. Die Dosen für die intranasale Verabfolgung liegen im Bereich von 1,0 bis 250 ^g/kg/
Tag oder vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 100 ^g/kg/Tag.
Die Peptide der allgemeinen Formel I können auch in Form von Nasenpulvern oder Mitteln zur Einblasung verabfolgt
werden. Für diese Zwecke werden die Peptide in feinverteilter Form zusammen mit einem pharmakologisch verträglichen
festen Trägerstoff, z.B. mit feinverteiltem Polyäthylenglykol (Carbowax 1540), feinverteilter Lactose oder sehr
fein verteiltem Siliciumdioxid (Cab-0-Sil), verabfolgt. Derartige Mittel können auch andere Zusatzstoffe in feinverteilter
Form, wie Konservierungsmittel, Puffer oder oberflächenaktive Mittel, enthalten.
Die Peptide der allgemeinen Formel I können auch in Form von lange wirkenden Mitteln mit langsamer Wirkstoffabgabe
oder Depotwirkung, wie nachstehend erläutert, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantation,
verabreicht werden. Derartige Zubereitungsformen sind so
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RS CAS 38 (SC-1) - 22 -
beschaffen, dass sie etwa 5 bis etwa 100 pg pro kg Körpergewicht
pro Tag freisetzen.
Häufig ist es wünschenswert, die Peptide der allgemeinen Formel I kontinuierlich über längere Zeiträume hinweg in
Form von lange anhaltenden Präparaten mit langsamer Wirkstoff abgabe oder Depotwirkung zu verabreichen. Derartige
Zubereitungsformen können entweder ein pharmakologisch verträgliches Salz der Wirkstoffverbindung mit einer geringen
Löslichkeit in Körperflüssigkeit, beispielsweise -Salze mit Pamoasäure, Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose,
oder das Peptid der allgemeinen Formel I in Form eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem Schutzmittel,
das eine rasche Freisetzung verhindert, enthalten. Im letztgenannten Fall kann beispielsweise das Peptid der
allgemeinen Formel I mit nicht-antigener, teilweise hydrolysierter Gelatine in die Form einer viskosen Flüssigkeit
gebracht oder an einem pharmakologisch verträglichen, festen Trägerstoff, beispielsweise Zinkhydroxid gegebenenfalls
zusammen mit Protamin, absorbiert werden. Der Wirkstoff
kann auch in Form einer Suspension in einem pharmakologisch verträglichen, flüssigen Trägerstoff verabfolgt
werden. Ferner ist auch die Herstellung von Gelen oder Suspensionen mit einem nicht-antigenen Schutzhydrokolloid,
z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, Polygalacturonsäuren, wie Pektin,
oder bestimmten Mucopolysaccharide^ zusammen mit wässrigen oder nicht-wässrigen, pharmakologisch verträglichen, flüssigen
Trägerstoffen, Konservierungsmitteln oder oberflächenaktiven
Mitteln möglich. Beispiele für derartige -Präparate finden sich in üblichen pharmakologischen Handbüchern, wie
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975. Lang wirkende Präparate mit langsamer
Wirkstoffabgabe erhält man auch durch Mikroverkapselung in einem pharmakologisch verträglichen Überzugsmaterial,
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130065/0857
wie Gelatine, Polyvinylalkohol oder Äthylcellulose. Bezüglich
weiterer Beispiele für Überzugsmaterialien und Verfahren zur Mikroverkapselung wird auf J.A. Herbig in
"Encyclopedia of Chemical Technology" , Bd. 13, 2. Aufl., Wiley, New York, 1967, S. 436 bis 456 verwiesen. Derartige
Präparate sowie Suspensionen von Salzen der Peptide der allgemeinen Formel I, die in Körperflüssigkeiten nur wenig
löslich sind, sind so beschaffen, dass sie etwa 5 ;ug bis etwa
100 μ& des Peptids pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen.
Vorzugsweise werden sie durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Eine andere Möglichkeit besteht darin,
einige der vorstehend aufgeführten festen Präparate, beispielsweise bestimmte wenig wasserlösliche Salze oder Dispersionen
oder Adsorbate der Salze mit festen Trägerstoffen, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel
eines Polymerisats von Äthylenglykolmethacrylat oder ähnlichen vernetzten Monomeren; (vgl. US-PS 3 551 556) in Form
von Pellets zuzubereiten, die die vorstehend angegebenen Wirkstoffmengen freisetzen. Diese Pellets können subkutan
oder intramuskulär implantiert werden.
Bestimmte Peptide der allgemeinen Formel I, die in Wasser wenig löslich sind, können als Suspensionen in einer wässrigen
oder einer Emulsionsgrundlage zubereitet werden. Suspensionen auf Wasserbasis werden mit Hilfe von Netzmitteln,
wie Kondensationsprodukte von Polyäthylenoxid und Alkylphenolen,
Fettalkoholen oder Fettsäuren und Suspendiermitteln, wie hydrophilen Kolloiden, z.B. Polyvinylpyrrolidon,
hergestellt. Suspensionen auf Emulsionsbasis werden durch Suspendieren des Peptids mit Hilfe eines Netzmittels und
Suspendiermitteln in der Emulsionsbasis hergestellt, wobei die vorstehend erläuterten Emulgiermittel verwendet werden.
Suspensionen können zusätzlich Puffer und/oder Süsstoffe, Aromastoffe, Farbstoffe, Konservierungsmittel und Antioxi-'IaI
iutinro VI.. \.&] rnUuill r-n.
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Wie vorstehend erläutert, werden Arzneipräparate zur oralen oder parenteralen Verabfolgung aus den Verbindungen der
allgemeinen Formel I oder aus deren pharmakologisch verträglichen Salzen so hergestellt, dass 5 bis 100^ug/kg/Tag,
vorzugsweise in unterteilten Dosen abgegeben werden. Pro Dosiseinheit können 0,3 bis 15 mg Wirkstoff enthalten sein.
Für die parenterale Verabfolgung wird die Verwendung eines wasserlöslichen Peptids der allgemeinen Formel I oder eines
wasserlöslichen Salzes eines wenig wasserlöslichen Peptids der allgemeinen Formel I in wässriger, steriler Lösung bevorzugt.
Beispiele für Konservierungsmittel sind p-Hydroxybenzoesäuremethyl-
und -propylester, die zusammen mit anderen löslichen Bestandteilen, wie zur Herstellung von isotonen
Lösungen ausreichenden Mengen an Natriumchlorid oder Glucose, zugesetzt werden. Peptide der allgemeinen Formel I,
die in Wasser wenig löslich sind, können auch intramuskulär in Form von Lösungen oder Suspensionen in sterilen, flüssigen,
nicht-wässrigen Trägern verabfolgt werden, beispielsweise in pflanzlichen oder tierischen Ölen. Dabei können gegebenenfalls
die vorgenannten zusätzlichen Lösungsbestandteile oder Suspendiermittel enthalten sein.
Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung der Peptide
der allgemeinen Formel I näher erläutert.
Die carboxylendständige Aminosäure, die für C oder B, wenn
C das vorstehend definierte NHR bedeutet, ausgewählt worden ist, wird an der of-Aminogruppe geschützt, vorzugsweise
mit tert.-Butoxycarbonyl (R = Bog). Die geschütze Säure
wird sodann mit einem Hydroxymethylharz oder vorzugsweise einem chlormethylierten Harz mit Hilfe eines Katalysators,
vorzugsweise Cäsiumhydrogencarbonat oder Triäthylamin, gekuppelt. Anschliessend an die Kupplung wird die Schutzgruppe
an der o(-Aminogruppe entfernt, beispielsweise unter
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RS CAS 38 (SC-1) - 25 -
Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, wie
vorstehend erläutert, oder mit Hilfe eines der anderen vorstehend aufgeführten Verfahren. Die Entfernung der Schutzgruppe
wird vorzugsweise
temperatur durchgeführt.
temperatur durchgeführt.
gruppe wird vorzugsweise bei Temperaturen von 0 C bis Raum-
Ais chlormethyliertes Harz (1-prozentige Vernetzung) wird vorzugsweise das handelsübliche Produkt der Firma Biorad
Laboratories, Richmond, Kalifornien, verwendet.
Die mit Hilfe der vorstehend definierten Verankerungsgruppe an den Harzträger gebundene carboxylendständige Aminosäure, die den
Rest C oder B, wenn C NHR bedeutet, darstellt, wird in das Reaktionsgefäss eines automatischen Peptidsynthesegeräts
gebracht, das auf folgenden Waschzyklus programmiert ist:
(a) Methylenchlorid,
(b) 33-prozentige Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 mal),
(c) Methylenchlorid,
(d) Äthanol,
(e) Chloroform,
(f) 10% Triäthylamin in Chloroform (2 mal),
(g) Chloroform und
(h) Mi'Uiy IcHK'hlorid.
(h) Mi'Uiy IcHK'hlorid.
Dar· gewiKU"liriir Harz wird Modatin in Methylenchlor/id mil einer
entsprechend geschützten Aminosäure, die den Rest B oder A, wenn C NHR bedeutet, darstellt, gerührt. Als Schutz-Kruppe
für die c<-Aminofunktion wird t.ert.-Butoxyearbony'l
(Boc) bevorzugt. Bei den Aminosäuren für den Rest B wird für den Imidazolstickstoff (Nim) von Histidin als Schutzgruppe
die Tosylgruppe (Tos) bevorzugt. Als Schutzgruppe für die Phenylaminogruppe in p-Aminophenylalanin wird Benzyloxycarbonyl
(Z) bevorzugt. 3-Methylhistidin, ß-(P yrazolyl-1)-alanin
und ß-(?-Thienyl)-alanin benötigen mit Ausnahme
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RS CAS 38 (SC-1) - 26 -
der<X-Aminogruppe keinen Schutz. Eine im wesentlichen äquimolare
Menge eines Kupplungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder vorzugsweise Diisopropylcarbodiimid, wird zugesetzt.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur (22 bis 25 C) gerührt. Sodann wird das Aminosäureharz
mit Methylenchlorid (3 mal) gewaschen. Die Schutzgruppe der verknüpften Aminosäure wird mit 33% Trifluoressigsäure
in Methylenchlorid (2 mal) entfernt. Anschliessend werden die Stufen (c) bis (h) des vorstehend erläuterten Waschzyklus
durchgeführt.
Die vorgenannten Stufen werden mit einer entsprechend geschützten Aminosäure, die für den Rest A ausgewählt ist,
wenn C eine Aminosäure bedeutet, wiederholt. Das auf diese Weise fertiggestellte
geschützte Peptidharz wird 3 mal mit Methylenchlorid und anschliessend 3 mal mit Methanol gewaschen und sodann
unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält praktisch die theoretische Ausbeute (96 Prozent oder darüber).
Zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel I, in der C NHR bedeutet, oder eines Peptids der allgemeinen
Formel I, in der C ein Aminosäure-nieder-alkylamid bedeutet, wird das geschützte Peptidharz bei 00C im entsprechenden
nieder-Alkylamin suspendiert und mehrere Stunden gerührt, überschüssiges Alkylamin wird sodann bei Raumtemperatur
abgedampft. Das abgespaltene Peptid wird mit Dimethylformamid aus dem Harz ausgewaschen. Das geschützte
Peptid wird sodann durch Zusatz von Essigsäureäthylester ausgefällt und filtriert. Man erhält das geschützte Peptid,
in dem C NHR oder ein Aminosäure-nieder-alkylamid bedeutet.
Zur Herstellung von geschützten Peptiden, in der C ein Aminosäureamid
oder einen Aminosäure-nieder-alkylester bedeutet, wird das vorstehend erläuterte Verfahren unter Verwendung
von Ammoniak oder des entsprechenden Alkohols + Triäthylamin an Stelle von nieder-Alkylamin durchgeführt.
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RS CAS 38 (SC-1) -27-
Die Entfernung der Schutzgruppen aus dem auf die vorstehende Weise hergestellten Peptid wird durch eine
15- bis 60-minütige, vorzugsweise etwa 30-minütige Behandlung des Materials mit Fluorwasserstoff und Anisol bei 00C
durchgeführt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck und das Anisol durch Waschen mit Äther entfernt. Zur
Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I, in der C eine freie Aminosäure bedeutet, wird das entsprechend
geschützte Peptidharz auf die vorstehende Weise mit Fluorwasserstoff und Anisol behandelt. Dabei werden gleichzeitig
die Schutzgruppen und die Bindung an den Harzträger entfernt. Man erhält das gewünschte Peptid der allgemeinen Formel I,
in der C eine freie Aminosäure bedeutet.
Zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel I, in der C 2-Aminohydroxyäthyl (Gly-ol) bedeutet, wird das
A-B-Dipeptidharz mit 2-Aminoäthanol behandelt, wodurch man direkt das gewünschte Peptid der allgemeinen Formel I, in
der C Gly-ol bedeutet, erhält. Gegebenenfalls am Histidylrest vorhandene Dinitrophenyl- oder Tosylschutzgruppen
werden gleichzeitig entfernt.
Nachstehend werden biologische Untersuchungen an den Peptiden der Erfindung wiedergegeben.
Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Verringerung des Appetits und der Nahrungsaufnahme bzw.
die appetitzügelnde Wirkung wird durch Fütterungsveröuche
an Mäusen und Ratten im wesentlichen gemäss den Verfahren
von Trygstad et al., a.a.O., und Reichelt et al., a.a.O., ermittelt. Tn regelmäRsigen Abständen wird der tägliche
Futterverbrauoh auf 0,1 g genau und dan Körpergewicht auf
1 g genau bestimmt. Die anderen Messgrössen, wie Sauerstoff verbrauch, Körpertemperatur, Glucose- und/oder Insulinspiegel
im Plasma und quantitative Aminogramme, werden zu bestimmten Zeitpunkten ermittelt.
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RS CAS 38 (SC-1) - 28 - O11-7Q/Q
all/ 34ο
Die Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I auf die Magen- und/oder Pankreassekretion wird an Ratten oder vorzugsweise
an Hunden, die mit Speiseröhren-, Magen- und Pankreasfisteln versehen sind, gemäss Babkin, a.a.O., Liebling
et al., a.a.O. oder Olbe, a.a.O., bestimmt. Eine Scheinfütterung bei Hunden führte zu einer ausgeprägten Zunahme
des Säureausstosses, der 82 Prozent des maximalen Säureausstosses betrug, der durch Verabfolgung von 320 ^g/kg/Std.
Histamin erreichbar ist (13,55 + 1,8 niÄ'q/15 min). Gleichzeitig
ergab sich ein signifikanter Anstieg des Serum-Gastrinspiegels von einem Grundwert von 32+5 pg/ml auf
73 + 10 pg/ml. Eine Scheinfütterung führte auch zu einer ausgeprägten Zunahme der Pankreas-Proteinsekretion, die
71 Prozent des Maximalwertes betrug, der durch Verabfolgung von 0,5 ^g/kg/Std. Caerulein erreichbar ist (650 + 86 mg/
15 min). Die Peptide der allgemeinen Formel I verringerten bei intravenöser Infusion in Dosen von 25 bis 50 ^ug/kg/Std..
30 Minuten vor und während der Scheinfütterung den maximalen Säureausstoss um etwa 34 Prozent ohne signifikante
Veränderung des Serum-Gastrinspiegels und die Pankreas-Proteinausscheidung um etwa 38 Prozent.
Bei Hunden mit Magenfisteln und Heidenhain-Taschen führte s., die gastrische Verabreichung eines Leberextraktfutters zu
einer ausgeprägten Zunahme des Säureausstosses, die etwa 90 Prozent des Maximalwertes betrug, der durch Verabfolgung
von Histamin an Hunde mit Magenfisteln erreichbar ist, und etwa"35 Prozent des Maximalwerts bei Hunden bei Heidenhain-Taschen
betrug, während die Serum-Gastrinspiegel in sehr signifikanter Weise auf mehr als das 2-fache des Grundwerts
von 29 + 5 pg/ml auf 76 + 12 pg/ml stiegen. Bei Verabfolgung der Peptide der allgemeinen Formel I durch 1-stündige
intravenöse Infusion während des Fütterungsplateaus in Dosen von 50 jag/kg/Std. wurde die durch die Fütterung
mit Leberextrakt induzierte Säuresekretion bei Hunden mit
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rs cAs 38 (sc-1) - 29 - 311 79A8
Magenfisteln um 35 Prozent und bei Hunden mit Heidenhain-Taschen
um 41 Prozent verringert, ohne dass signifikante Veränderungen der Serum-Gastrinspiegel auftraten. Die Peptide
der allgemeinen Formel I hemmen auch den durch Fütterung bedingten Insulin- und Gastrinanstieg.
Bei Hunden mit Pankreasfisteln stimulierte eine normale Fütterung pankreatisches HCO-" zu 80 Prozent des Maximalwerts,
der durch Verabfolgung von 3 KU/kg/Std. Secretin erreichbar ist, und die Proteinausscheidung zu 92 Prozent
des Maximalwerts, der mit 0,5 ^g/kg/Std. .Caerulein erreichbar
ist. Die auf die vorstehend angegebene Weise verabfolgten Peptide der allgemeinen Formel I verringerten während
der zweiten Stunde nach der Fütterung den HCO-" -Ausstoss
um 35 Prozent und den Protein (Enzym)-Ausstoss um 46 Prozent, ohne Brechreiz oder andere Nebenwirkungen hervorzurufen.
Dir vornl'.ohonclon Ergobni:··μ<? zeigen klar, dass di« Peptide
der allgemeinen Formel I die Hirn-, Magen- und Darmphasen der Magen- und Pankreassekretion hemmen, vermutlich über
eine Suppresion der neuro-hormonalen Mechanismen, die für diese Sekretionen verantwortlich sind. Bei der Hirnphase
handelt es sich um die neurale, psychische oder Appetitphase der Magensekretion, deren Hemmung eine Unterdrückung
des Appetits und die anorexigene Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel I zeigt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
P-Pvrog]utamvl-L-histidvl-(to3vl·)~gl·vcv.^-0-CHp-Harz,
L' 11- (p.vru) Ülü-llis(MH"~l{ *) -Uly-O-CIL, -Uara. IiV.-- .lua.,.
2,70 g (1,00 mMol Glycin) des Boc-Glycinharzes der Formel
- 29 -
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Bog
- GIy - O - CH2 - Harz
werden in das Reaktionsgefäss eines automatischen Peptid-Synthesegeräts
(Beckmann Modell 990) gegeben, das auf folgenden Waschzyklus programmiert ist:
(a) Methylenchlorid,
(b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 mal, 1 bzw. 25 Minuten),
(c) Methylenchlorid,
(d) Äthanol,
(e) Chloroform,
(f) 10% Triäthylamin in Chloroform (2mal jeweils 2 Minuten),
(g) Chloroform und
(h) Methylenchlorid.
(h) Methylenchlorid.
Das gewaschene Harz wird sodann mit 3,0 mMol tert.-Butyloxycarbonyl-tosyl-histidin
in Methylenchlorid gerührt und mit 3,0 mMol Diisopropylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird
1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Peptidharz wird den Stufen (a) bis (h) des vorgenannten Waschzyklus unterworfen.
Sodann werden 3,0 mMol D-Pyrog^lutaminsäure auf die gleiche Weise angekuppelt, wodurch man die Titelverbindung
erhält.
Das fertige Tripeptidharz wird 3 mal mit Methylenchlorid und anschliessend 3 mal mit Methanol gewaschen. Nach dem
Trocknen erhält man 2,89 g Material.
Das Glycinharz dieses Beispiels wird aus handelsüblichem, chlormethyliertem Harz (1% Vernetzung, Bio Rad Laboratories,
Richmond, Kalifornien) hergestellt.
2,89 g des gemäss Beispiel 1 erhaltenen, geschützten Tri-
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RS CAS 38 (SC-1) - 31 -
peptidharzes werden 45 Minuten bei O0C in 40 ml Fluorwasserstoff
und 10 ml Anisol suspendiert. Sodann wird der Fluorwasserstoff mit Hilfe eines Stroms aus trockenem Stickstoff
abgedampft. Das Anisol wird durch Waschen mit Ä'ther entfernt.
Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer mit Sephadex G 15 (chemisch modifiziertes, vernetztes Dextran,"fine")
gepackten Säule der Abmessungen 2,5 x 95 cm gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen (320 bis 340 ml) werden lyophilisiert.
Man erhält 320 mg D-H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH in Form eines farblosen, flockigen Pulvers.
Das Produkt verhält sich bei, der Dünnschichtchromatographie
in 4 verschiedenen Lösungsmitteln auf Kieselgelplatten homogen. Dabei werden jeweils 20 bis 30 yg in Form von Flecken
aufgebracht. Die Entwicklung erfolgt mit Chlorgas und anschliessendem Besprühen mit Stärkereagens. Es ergeben sich
folgende R „-Werte: 1-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:5,
obere Phase), 0,08; Essigsäureäthylester : Pyridin : Essigsäure : Wasser (5:5:1:3) 0,28; 1-Butanol: Essigsäure : Wasser
Essigsäureäthylester (1:1:1:1) 0,18; 2-Propanol : 1 m Essigsäure (2:1) 0,20.
Bei der Aminosäureanalyse ergeben sich folgende Werte: GIu 1,03, GIy 1,00, His 0,99.
3 Teile D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin werden in 1000 Teilen
destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst. Zur Herstellung einer isotonen Lösung wird eine ausreichende Menge
Natriumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wird durch Autoklavisieren sterilisiert und in Ampullen abgefüllt. Man erhält
Mlir I iit'n.i I oli.il OMUMK f'l'il· ' iK-M'flpfHl ! ni-hc. /'wm'kr.
- 31 13006S/0857
Beispiel 4
Ein Geraisch aus 12 Teilen D-Pyroglutarayl-L-histidyl-glycin
und 500 Teilen weissem Magnesiumcarbonat und 20 Teilen Magnesiumstearat wird zu groben Stücken ^erpresst. Die
Stücke werden granuliert, durch ein 8 mesh-Sieb (2,38 mm) gegeben und verpresst. Die auf diese Weise erhaltenen
Tabletten eignen sich zur oralen Verabfolgung.
Ein Gemisch aus 12 Teilen D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin
und 500 Teilen weissem Magnesiumcarbonat wird durch Zumischen einer Lösung von 2 Teilen Natrium-dioctyl-sulfosuccinat
in einer ausreichenden Menge Methanol granuliert. Das Granulat wird durch ein 12 mesh-Sieb (1,68 mm) gegeben und
bei 50 bis 55 C getrocknet. Sodann wird das Granulat nochmals durch ein 12 mesh-Sieb gegeben. Nach Zusatz von 8 Teilen
Magnesiumstearat wird das Gemisch zu Tabletten für die orale Verabfolgung verpresst.
Ein Gemisch aus 24 Teilen D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin,
475 Teilen Lactose, 94 Teilen Maisstärke und 3 Teilen Magnesiumstearat wird zu groben Stücken verpresst. Die Stücke
werden zu einem Granulat zerkleinert, das durch ein 8 mesh-Sieb (2,38 mm) gegeben wird. Das Granulat wird sodann mit
einer ausreichenden Menge einer Lösung von 15 Teilen Schellack und 3 Teilen Rizinusöl in 800 Teilen Äthanol überzogen.
Hierauf werden 3 Teile Magnesiumstearat zugesetzt. Das Granulat wird zu Tabletten für die orale Verabreichung verpresst.
- 32 -
130065/08 5 7
24 Teile D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin werden in einer
Kugelmühle mit 576 Teilen Lactose vermischt. Das Gemisch wird in Gelatinekapseln abgefüllt. Man erhält ein Präparat für
die orale Verabfolgung.
Ende der Beschreibung
- 33 -
Claims (5)
- Patentansprüche1 .y Peptide der Formel A-B-C und deren pharmakologisch verträgliche Salze, wobeiA einen Rest aus der Gruppe L-Pyroglutarayl, D-Pyroglutamyl und L-Homopyroglutamyl bedeutet,B einen Rest aus der Gruppe L-Histidyl, L-3'-Methylhistidyl, D-Histidyl, L-Phenylalanyl, L-p-Aminophenylalanyl und L-ß-(Pyrazolyl-1)-alanyl bedeutet und C einen Rest aus der Gruppe Glycin, Glycinamid, Glycin-(nieder-alkyl)-amide, Glycin-nieder-alkylester, 2-Amino-1-hydroxyäthyl, D-Alanin, L-ß-(2-Thienyl)-alanin undι 1NHR bedeutet, wobei R nieder-Alkyl ist, mit der Massgabe, dass C nicht Glycin oder Glycinamid ist, wenn A L-Pyroglutamyl und B L-Histidyl bedeuten.1 3 0_0 ^ S / O 8 S 7RS CAS 38 (SC-1) -2- 3 Π 7948
- 2. D-Pyroglutamyl-L-histidyl-glycin nach Anspruch 1.ρ ο
- 3. Harzgebundene Peptide der Formel R -A-(RJ TB)-C-0-CHo-Harz,2 λwobei R Boc bedeutet, R Dnp oder Tos bedeutet und A, Bund C die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.ρ 21
- 4. Harzgebundene Peptide der Formel R-A-(R -B)-C-O-CH -Harz,2 4wobei R Boc bedeutet, R Z bedeutet und A, B und C diegleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.
- 5. tert.-Butyloxycarbonyl-D-pyroglutamyl-L-(Nim-tosyl)-histidyl-glycyl-O-CHp-Harz nach Anspruch 3·13006S/0ÖS7
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