DE69021386T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur heilung von geschwüren. - Google Patents

Verfahren und zusammensetzungen zur heilung von geschwüren.

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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Heilung und/oder Prävention von Ulcera im allgemeinen und genauer gesagt die Verwendung von Glycyl-L-histidyl-L-lysin, L-Lysyl-L-histidylglycin, Glycyl-L-histidyl-L-lysin: Kupfer(II), L-Lysyl-L- histidyl-glycin:Kupfer(II) und Derivaten derselben als aktive therapeutische Substanzen und für die Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Heilung und/oder Prävention von Ulcera bei Warmblütern.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die Behandlung von Magenulcera bleibt trotz der Entwicklung von zahlreichen Medikamenten gegen Ulcera ein bedeutendes Gesundheitsproblem. Traditionellerweise sind Ulcera des Verdauungstraktes durch Neutralisation von überschüssiger Magensäure oder durch Diät und Verhaltens- oder Emotionsmodifikation behandelt worden. Gut bekannte Magensäure-Neutralisationsmittel schließen Natriumbicarbonat, Magnesiumhydroxid, Calciumcarbonat, Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Magnesiumtrisilicat und dreibasiges Calciumphosphat ein. Bestimmte Polyaminmethylenharze sind ebenfalls versucht worden. Versuche sind unternommen worden, den Fluß der Magensäure zu hemmen, obgleich diese Versuche durch ziemlich schwerwiegende Nebenwirkungen gekennzeichnet sind. Genauer gesagt ist festgestellt worden, daß, obgleich eine Verbindung, die als Cimetidin bezeichnet wird, darin wirksam gewesen ist, die Sekretion von Magensäure durch Blockierung von Histaminstellen zu stoppen, sie bestimmte unerwünschte Eigenschaften besitzt, einschließlich Beeinträchtigung der Nierenfunktion und geistige Verwirrung. Obgleich von bestimmten Zusammensetzungen mit niedrigem Molekulargewicht, wie etwa Salicylat-Kupfer oder Diisopropylsalicylat-Kupfer, berichtet worden ist, daß sie die Entstehung von Magenulcera hemmen, neigen diese Komplexe dazu, im Magen leicht in freies Kupfer und Salicylat zu dissoziieren, was ihren praktischen Nutzen beschränkt. Zusätzlich neigen diese kleinen Kupferkomplexe dazu, unter wässrigen Bedingungen schlecht löslich zu sein, und müssen zusammen mit gewebeirritierenden Löslichmachungsmitteln verabreicht werden. Ein weiteres solches Mittel, der Penicillamin-Kupfer-Komplex, bewirkt oft Hautausschläge und Persönlichkeitsveränderungen ("Penicillamin-Psychose").
  • Neuere medizinische Behandlungsmethoden umfassen die Verwendung von H&sub2;-Rezeptorblockern, wie etwa Cimetidin, oder die Verwendung von Wachstumsfaktoren, wie etwa Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, Urogastron) oder Peptidfragmenten von EGF. Diese Behandlungsmethoden leiden jedoch unter einer Anzahl von Nachteilen, einschließlich Instabilität, Schwierigkeiten bei der Synthese und Verabreichung und hohen Herstellungskosten.
  • Die WO 88/08714 offenbart die Verwendung von Glycyl-L-histidyl-L-lysin und Derivaten desselben bei der Prävention von Magenulcera.
  • Es besteht daher ein Bedürfnis auf diesem Gebiet nach einer verbesserten Zusammensetzung zur Heilung und/oder Prävention der Bildung von Ulcera. Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Zusammensetzung zur Verfügung und stellt außerdem andere verwandte Vorteile bereit.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung eine Reihe von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung als aktive therapeutische Substanzen. Zusätzlich ist die Verwendung von Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln offenbart, die zur Verwendung in den im folgenden beschriebenen Verfahren geeignet sind: a) Verringerung der Bildung von Magenulcera in Warmblütern; b) Verringerung der Sekretion von Magensäure in Warmblütern; c) Erhöhung der Sekretion von zytoprotectivem Schleim im Magen von Warmblütern; und d) Heilung etablierter gastrischer (Magen-) oder duodenaler (Darm-)Ulcera in Warmblütern.
  • Die hierin beschriebenen Verbindungen schließen Glycyl-L- histidyl-L-lysin (GHL), L-Lysyl-L-histidyl-glycin (LHG), Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Kupfer(II) (GHL-Cu), L-Lysyl-L- histidyl-glycin:Kupfer (II) (LHG-Cu) und verschiedene Derivate von GHL-Cu und LHG-Cu ein.
  • Die Derivate von GHL-Cu haben die allgemeine Formel:
  • [Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R] :Kupfer(II),
  • worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L- valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Derivaten können andere chemische Modifikationen vorgenommen werden, um die biologische Aktivität von GHL und GHL-Cu-Derivaten zu verändern. Zum Beispiel kann Glycin durch eine Reihe von anderen kleinen Aminosäuren ersetzt werden, einschließlich Alanin, Serin und Valin. Außerdem kann die Kupfer(II)-Bindungsaffinität des Moleküls durch Hinzufügen einer N-terminalen Aminosäure wie etwa Glycin, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin in Glycyl-L-glycyl- L-histidyl-L-lysin umzuwandeln, erhöht werden. Zusätzlich könnte Glycin zu einem Derivat, wie oben beschrieben, hinzugefügt werden, um das entsprechende Tetrapeptid zu schaffen. Die Bindungsaffinität für Kupfer(II) der Imidazolgruppe im Histidylrest kann durch Ersetzen von Histidin durch 3-Methylhistidin oder durch Verlängern der Lysyl-Seitenketten durch Hinzufügen zusätzlicher Kohlenstoffatome zur Kette modifiziert werden.
  • Die Derivate von LHG-Cu haben die allgemeine Formel:
  • [L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R] : Kupfer(II),
  • worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylanalyl-L- valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Derivaten können andere chemische Modifikationen vorgenommen werden, um die biologische Aktivität von LHG und LHG-Cu-Derivaten zu verändern. Zum Beispiel kann Lysin durch eine Reihe von anderen kleinen Aminosäuren ersetzt werden, einschließlich Alanin, Serin und Valin. Außerdem kann die Kupfer(II)-Bindungsaffinität des Moleküls durch Hinzufügen einer N-terminalen Aminosäure wie etwa Glycin, um L-Lysyl-L-histidyl-glycin in Glycyl-L-lysyl-L- histidyl-glycin umzuwandeln, erhöht werden. Zusätzlich könnte Glycin zu einem Derivat, wie oben beschrieben, hinzugefügt werden, um das entsprechende Tetrapeptid zu schaffen. Die Bindungsaffinität für Kupfer(II) der Imidazolgruppe im Histidylrest kann durch Ersetzen von Histidin durch 3- Methylhistidin oder durch Verlängern der Lysyl-Seitenketten durch Hinzufügen zusätzlicher Kohlenstoffatome zur Kette modifiziert werden.
  • Die oben beschriebenen Verfahren umfassen allgemein die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer der oben beschriebenen Zusammensetzungen an das Tier, um den gewünschten Zweck zu bewirken. Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und beigefügte Zeichnung deutlich werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Figur 1 ist eine Photographie von Rattenmägen, die die Ulcerationen in Kontrolltieren, verglichen mit behandelten Tieren, zeigt. Die eingekreisten schwarzen Flecken in der Magenwand sind Magenulcera.
  • Figur 2 zeigt den Anstieg im Magen-pH (was eine Magensäuresekretion anzeigt) bei einer ansteigenden Dosis von GHL-Cu.
  • Figur 3 veranschaulicht die Abnahme in der Bildung sichtbarer Ulcera bei einer ansteigenden Dosis von GHL-Cu.
  • Figur 4 zeigt die Heilung von duodenaler Ulceration, die im Anschluß an Trinkwasserbehandlung beobachtet wurde.
  • Figur 5 ist eine Photographie von Rattenmägen, die die Hemmung der Bildung von Magenulcera durch Vorbehandlung mit GHL-Cu veranschaulicht.
  • Figur 6 veranschaulicht die Heilung von mit Ethanol induzierten gastrischen Ulcera.
    • Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
  • Wie hierin beschrieben, können GHL, LHG, GHL-Cu, LHG-Cu und verschiedene Derivate derselben als aktive therapeutische Substanzen verwendet werden und können bei der Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden, die zur Verwendung bei (a) der Verringerung der Sekretion von Magensäure in Warmblütern, (b) der Erhöhung der Sekretion von zytoprotektivem Schleim im Magen von Warmblütern, (c) der Verringerung der Bildung von Magenulcera in Warmblütern und (d) der Heilung etablierter Magen- oder Darmulcera in Warmblütern geeignet sind. Derivate der vorliegenden Erfindung sind im Detail in U.S. Patent No. 4,665,054 und U.S. Patent Application No. 312,295 beschrieben, die hierdurch durch Bezugnahme mit einbezogen werden. Die Derivate der vorliegenden Erfindung können durch Veresterung, durch die Entfernung eines Wassermoleküls oder durch die Addition einer Gruppe (entweder eines Alkohols, wie etwa Octanol, Methanol, Benzylalkohol, oder NH&sub3;) an den Carbonsäure- Terminus von GHL oder LHG hergestellt werden, was zur Bildung eines lipophileren Derivats führt.
  • GHL, LHG, GHL-Cu, LHG-Cu und mehrere Analoge sind in Tiermodellen von sowohl gastrischen als auch Duodenal-Ulcera getestet worden. Es ist festgestellt worden, daß GHL-CU, LHG-Cu und ihre Analogen die Bildung gastrischer Ulcera verhindert, die sowohl durch exzessive Säuresekretion als auch durch Ingestion von 95%igem Ethanol hervorgerufen worden sind. Beim Modellsystem mit überschüssiger Säure (Shay) senkten ansteigende Konzentrationen von GHL-Cu, LHG-Cu oder Analogen derselben die Magensäuresekretion und führten zu weniger sichtbaren Läsionen, verglichen mit Kontrollversuchen mit physiologischer Kochsalzlösung. Es wurde festgestellt, daß Vorbehandlung mit GHL-Cu, LHG-Cu und Analogen derselben gastrische Irritation und Ulceration verhindert, die durch Ingestion von 95%igem Ethanol hervorgeruf en worden sind. Verabreichung von GHL-Cu, LHG-Cu und seinen Analogen im Trinkwasser beschleunigt auch die Heilung von Ulcera, die durch den Ethanol hervorgerufen worden sind.
  • GHL-Cu, LHG-Cu und Analoge derselben beschleunigen auch die Heilung von etablierten Duodenal-Ulcera. In diesem Modellsystem werden Ulcera durch Cysteamin-Injektion induziert. Kurz gesagt wurden Ratten mit chirurgisch bestätigten Ulcera mit GHL-Cu oder LHG-Cu im Trinkwasser behandelt. Am Ende der Studie zeigten die behandelten Ratten sowohl weniger Ulcera als auch weniger schwerwiegende Ulcera als die Kontrollgruppe.
  • GHL-Cu, LHG-Cu und ihre Analogen sind auch wirksam bei der Prävention sowohl der Bildung von Magenulcera als auch bei der Heilung von etablierten Magen- und Duodenalulcera.
  • Die chemische Gesamtreaktion bei der Synthese von GHL-Derivaten kann charakterisiert werden:
  • GHL-OH + R-H T GHL-R + H&sub2;O.
  • In der Praxis wird die Reaktion am einfachsten durchgeführt, indem die R-Gruppe zur Aminosäure Lysin vor der Kombination von Lysin mit den anderen zwei Aminosäuren zu GHL hinzugefügt wird. Nach der Bildung und Isolierung von GHL-R wird Kupfer(II) an das Molekül chelatisiert, um den bioaktiven Komplex zu bilden.
  • Die Gesamtreaktion, um die lipophileren Derivate von GHL-Cu zu bilden, können characterisiert werden:
  • 1) Lysin-OH + R-H T Lysin-R + H&sub2;O
  • 2) Lysin-R + blockiertes L-Histidin T blockiertes L- Histidin-L-lysin-R
  • 3) blockiertes L-Histidin-L-lysin-R T teilweise blockiertes L-Histidin-L-lysin-R
  • 4) teilweise blockiertes L-Histidin-L-lysin-R + blokkiertes Glycin T blockiertes Glycyl-L-histidin-L- lysin-R
  • 5) blockiertes Glycyl-L-histidin-L-lysin-R T Glycyl- L-histidin-L-lysin-R
  • 6) Glycyl-L-histidin-L-lysin-R + Kupfer(II) T Glycyl- L-histidin-L-lysin-R:Kupfer(II).
  • Die Gesamtreaktion, um die lipophileren Derivate van LHG-Cu zu bilden, ist dieselbe, wie oben für GHL-Cu umrissen, mit der Ausnahme, daß Glycin-OH statt Lysin-OH die anfängliche Reaktionskomponente ist und blockiertes Lysin anstelle von blokkiertem Glycin in Schritt 4 verwendet wird.
  • Die hierin offenbarten Ergebnisse legen nahe, daß GHL, LHG, GHL-Cu, LHG-Cu und Derivate derselben heilende Wirkungen auf eine Reihe von gastrointestinalen Erkrankungen ausüben werden, wie etwa Kolonheilung nach Anastomose, Läsionen, die im Anschluß an Intestinal- und Darmischämie auftreten, nekrotisierende Enterokolitis und Wunden des Mundes, des Rachens und des Oeophagus. Die allgemeinen Heileigenschaften von GHL-Cu sind in U.S. Patent Nos. 4,810,693 und 4,760,051 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme mit einbezogen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform liegen GHL oder LHG oder ein Derivat von GHL-Cu oder LHG-Cu in einem 1:1- bis 2:1- Verhältnis vor. In der vorliegenden Erfindung ist es allgemein bevorzugt, die Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, oral und in einer Kapselform zu verabreichen. Verfahren zur Einkapselung von Zusammensetzungen (wie etwa in einem Mantel aus Hartgelatine) zur oralen Verabreichung sind in der Technik gut bekannt (Baker, Richard, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley and Sons, 1986). Es ist auch allgemein bevorzugt, die Zusammensetzungen in Dosierungen von etwa 0,1 bis 100 mg/kg Patienten-Körpergewicht zu verabreichen, obgleich die Dosierung durch den Zustand des Patienten beeinflußt werden kann. Außerdem kann es bevorzugt sein, am Anfang damit zu beginnen, eine Behandlung mit GHL-Cu oder LHG-Cu zu verwenden, und dann mit einer Behandlung fortzufahren, die das freie Peptid (GHL oder LHG) mit oder ohne eine geringe Menge Kupfer(II) verwendet.
  • Um die folgenden Beispiele zusammenzufassen, veranschaulicht Beispiel 1 die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin- benzylester:Kupfer(II). Beispiel 2 zeigt die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester:Kupfer(II). Beispiel 3 veranschaulicht (A) die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L- lysin-n-stearylester:Kupfer(II) und (B) seine Synthese mit einem alternativen Verfahren. Auf der Grundlage jedes der beiden Verfahren kann ein Fachmann auf diesem Gebiet n-stearylalkohol (18 Kohlenstoffe) durch n-Palmitylalkohol (16 Kohlenstoffe) ersetzen, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-Stearylester:Kupfer(II) zu liefern. Beispiel 4 veranschaulicht (A) die Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl-L-phenylalanyl-L-valin:Kupfer(II) und Glycyl-L-histidyl- L-lysyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin:Kupfer(II) mit Festphasensynthese und (B) die Herstellung von Glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin mit Lösungssynthese. Beispiel 7 zeigt die Hemmung der Magensäureakkumulation, die Stimulation der Sekretion von zytoprotektivem Schleim und eine Verringerung in der Bildung von Magenulcera in Warmblütern. Beispiel 8 zeigt die Heilung von etabliertem Magenulcera mit GHL-Cu, LHG-Cu und Derivaten derselben. Beispiel 9 veranschaulicht die Heilung von Duodenal-Ulcera im Anschluß an orale Verabreichung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Beispiel 10 zeigt die Heilung und Prävention von mit Ethanol induzierten Ulcera.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.
    • BEISPIELE Herstellung von GHL, LHG, GHL-Cu und LHG-Cu zur Verwendung bei Tieren
  • GHL und LHG wurden durch Lösen, im Glasgefäß, in destilliertem Wasser (50 mg/ml), dann Zentrifugieren bei 20.000 x g für 1 Stunde bei 3ºC gereinigt. Dies entfernt schwer wasserlösliches Material, das aus dem Syntheseverfahren zurückgeblieben ist. Der Überstand wird lyophilisiert, dann durch eine Sephadex-G- 10-Säule bei 3ºC in einem Lösungsmittel 0,5% Essigsäure hindurchgegeben. Der Hauptpeak, der hinter der Lösungsmittelfront eluiert (überwacht durch Absorption bei 254 Nanometern), wird bis zur Trockne lyophilisiert. GHL-Cu und LHG-Cu wurden durch Kombination von gereinigtem GHL oder LHG mit äquimolaren Mengen Kupfer(II)-acetaten und Natriumhydroxid hergestellt, dann durch Verwendung von Ethanolzugabe und niedriger Temperatur nach veröffentlichten Verfahren (Perkins et. al., Inorg. Chim. Acta 67:93-99, 1984) ausgefällt.
    • Herkunft der Chemikalien.
  • Chemikalien und Peptidzwischenstufen, die in den folgenden Beispielen eingesetzt wurden, können von den folgenden Lieferanten bezogen werden: Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); Peninsula Laboratories (San Carlos, Calif.); Aldridge Chemical Co. (Milwaukee, Wis.); Vega Biochemicals (Tucson, Ariz.); Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.); Research Biochemicals (Cleveland, Ohio), Van Waters and Rogers (South San Francisco, Calif.); Bachem, Inc. (Torrance, Calif.)
    • BEISPIEL 1 Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester:Kupfer(II)
  • Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin-benzylester wurde in 1:1 Hexan- Ethylacetat gelöst und an Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als einem Kopplungsmittel gekoppelt. Natriumbicarbonat (10 %) wurde zugegeben und das Produkt in die organische Schicht hinein extrahiert. Das Produkt, Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin-benzylester, wurde aus Lösung kristallisiert. Die N-terminale Gruppe des blockierten Dipeptids wurde durch Rühren in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten entfernt, dann im Vakuum eingedampft. Das Produkt, Nim-Benzyloxycarbonnyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysin-benzylester, wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid als einem Kopplungsmittel an Lysin gekoppelt. Blockierende Gruppen wurden durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von 10 % Palladium auf Kohlenstoff in Eisessig entfernt. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester, in Wasser gelöst und durch Ionenaustauschchromatographie auf Dowex 50 X-4-Kationenaustauschharz und Elution mit 0,1 M Ammoniumhydroxid gereinigt, wobei das Eluat sofort mit Essigsäure neutralisiert wurde. Ein weiterer Durchgang durch eine Anionenaustauschsäule BioRex 63 bei neutralem pH entfernte Abbauprodukte mit freien Carbonsäuregruppen.
  • Der Glycyl-L-histidyl-L-lysin-benzylester wurde in Wasser gelöst, wobei aquimolar Kupferacetat zugegeben wurde. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde bei 20.000 x g für 1 Stunde bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlösliches Material zu entfernen. Der überstand wurde lyophilisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysinbenzylester: Kupfer(II) zu erhalten.
    • BEISPIEL 2 Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester: Kupfer(II)
  • Eine Mischung aus Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Octanol, Benzol und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde über Nacht unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle zur Entfernung von Wasser unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wurde trockener Ethylether zugegeben. Die Lösung ließ man dann bei 0ºC über Nacht ausfallen. Ein Teil des ausgefallenen Feststoffes wurde zu 50 ml Kaliumcarbonatlösung und 50 ml Dichlormethan zugegeben. Nach Extraktion wurden die Schichten getrennt und die organische Phase mit Wasser und Salzlösung gewaschen, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flashsäulenchromatographie ergab n-Octyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat. Das Produkt wurde in Tetrahydrofuran gelöst und mit Na-tert.-Butyloxycarbonyl-L- Nim-benzyloxycarbonyl-L-carbonyl-L-histidin, Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin gemischt. Nach dem Eindampfen wurden Wasser und Ethylacetat zugegeben. Das Produkt wurde in die organische Phase hinein extrahiert, die mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wurde. Filtration, Eindampfen und Reinigung mit Flashsäulenchromatographie ergab Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat.
  • Das Produkt wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n- Octyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L- lysinat gebildet wurde. Dieses wurde in Tetrahydrofuran gelöst und Isobutylchlorformiat, N-Methylmorpholin und Benzyloxycarbonylglycin wurden zugegeben, um n-Octyl-benzyloxycarbonylglycin-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat zu bilden. Dieses wurde in Eisessig gelöst und über Nacht hydriert.
  • Der resultierende n-Octylester von Glycyl-L-histidyl-L-lysin wurde durch die Zugabe einer äquimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben. Die Lösung wurde mit 20.000 x g für 1 Stunde. bei 3ºC zentrifugiert, um schlecht wasserlösliches Material zu entfernen. Der überstand wurde lyophilisiert, um Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-octylester: Kupfer(II) zu erhalten.
    • Beispiel 3 A. Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester: Kupfer(II)
  • Eine Mischung aus Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Stearylalkohol, Benzol und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde über Nacht unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle zur Entfernung von Wasser unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wurde trockner Propylether zugegeben, um das Gesamtvolumen auf das Sechsfache zu erhöhen. Das Produkt ließ man bei 0ºC über Nacht ausfallen und wurde filtriert. Ein Teil des Filtrats wurde zu 50 ml Kaliumcarbonat und 50 ml Dichlormethan zugegeben. Nach Extraktion wurden die Schichten getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, dann mit wasserfreiem Maguesiumsulfat getrocknet. Filtration, Eindampfen und Reinigung durch Flashsäulenchromatographie ergab n-Stearyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat. Das Produkt wurde in Tetrahydrofuran gelöst und mit Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin und Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin gemischt. Nach dem Eindampfen wurden Wasser und Propylacetat zugegeben und das Produkt wurde in die organische Phase hinein extrahiert, dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration, Eindampfen und Reinigung mit Flashsäulenchromatographie ergab Na- tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat.
  • Das Produkt wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n- Stearyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl- L-lysinat gebildet wurde, das in Tetrahydrofuran, Isobutylchlorformiat, N-Methylmorpholin und Benzyloxycarbonylglycin gelöst wurde, um n-Stearyl-benzyloxycarbonylglycin-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-lysinat zu bilden. Das Produkt wurde in 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 30 Minuten gelöst, dann eingedampft, wodurch n-Stearylester-glycyl-L-histidyl-L-lysin gebildet wurde.
  • Der resultierende Molekül, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester, wurde durch die Zugabe einer äquimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben, um ein für Tierversuche brauchbares Produkt zu erhalten.
  • Durch Ersetzen von n-Stearylalkohol durch n-Palmitylalkohol kann Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylester in ähnlicher Weise synthetisiert werden.
    • B. Alternative Synthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n- stearylester: Kupfer(II)
  • Ne-Benzyloxycarbonyl-L-lysin, n-Stearylalkohol, p-Toluolsulfonsäure und Monohydrat und Benzol wurden zusammen unter Verwendung einer Dean-Stark-Falle zur azeotropen Entfernung des entstehenden Wassers unter Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur und anschließendem Zugeben von trockenem Ethylether wird n-Stearyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L- lysinat-p-toluolsulfonatsalz durch Filtration gesammelt, mit 2 M wässriger Kaliumbicarbonatlösung behandelt und in Dichlormethan hinein extrahiert. Eindampfen ergibt das freie Amin, das in trockenem Tetrahydrofuran (THF) wieder gelöst und zu einer gerührten Lösung von Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim- benzyloxycarbonyl-L-histidin, N-Methylmorpholin und Isobutylchlorformiat in trockenem THF bei -15ºC zugegeben wird. Der resultierende, vollständig geschützte Dipeptidester wird mit 1/1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan bei Raumtemperatur behandelt, mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung neutralisiert und in Ethylacetat hinein extrahiert. Eindampfen ergibt das teilweise von Schutzgruppen befreite Dipeptid, das in trockenem THF wieder gelöst und zu einer gerührten Lösung von Benzyloxycarbonyl-glycin, N-Methylmorpholin und Isobutylchlorformiat in trockenem THF bei -15ºC zugegeben wird. Der gebildete, vollständig geschützte Tripeptidester wird durch Behandlung mit Wasserstoffgas in Eisessig bei Raumtemperatur in der Gegenwart von Pd-C-Katalysator vollständig von Schutzgruppen befreit. Filtration, Eindampfen und Reinigung auf einer Säule aus mikrokristalliner Zellulose, gefolgt von Lyophilisation, ergibt den gewünschten Tripeptidester als sein Triacetatsalz.
  • Das resultierende Molekül, Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-stearylester, wurde die Zugabe einer äquimolaren Menge Kupferdiacetat in den Kupferkomplex überführt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf Neutralität angehoben, um ein für Tierversuche brauchbares Produkt zu erhalten.
  • Durch Ersetzen des n-Stearylalkohols durch n-Palmitylalkohol kann Glycyl-L-histidyl-L-lysin-n-palmitylester in ähnlicher Weise synthetisiert werden.
    • BEISPIEL 4 A. Festphasensynthese von Glvcyl-L-histidyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin:Kupfer(II) und von Glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin:Kupfer(II)
  • Diese Peptide werden durch Kaltphasen-Standardmethoden synthetisiert, die auf dem Peptidgebiet üblich sind (LT. Stewart und LT. Young, Solid Phase Petide Synthesis, Pierce Chemical Co., 1984). Kurz gesagt wurde das Boc-Val-O-Harz sequentiell mit anderen blockierten Aminosäuren unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als einem Reaktionsmittel gekoppelt. Geschützte Aminosäuren, Harze für Festphasensynthese und Kopplungsmittel wurden erhalten von Peninsula Laboratories, San Carlos, California. Blockierte Aminosäuren werden in sequentieller Reihenfolge zugegeben, um das gewünschte Peptid zu erhalten. Das letztendliche Peptid wird unter Verwendung von Fluorwasserstoff von Schutzgruppen befreit. Das letztendliche Peptid wird in 0,5%iger Essigsäure gelöst und durch Durchgang durch eine Sephadex G-15-Säule (Pharmacia) gereinigt. Zugabe von äquimolarem Kupfer(II)-acetat, gefolgt von Lyophilisation, erzeugt das aktive Molekül.
    • B. Lösungssynthese von Glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-valyl-L- phenylalanyl-L-valin
  • Glycyl-L-histidyl-L-lysyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin in einer Menge von mehreren Gramm wurde mit der Lösungsphasen- Standardmethode unter Verwendung der tert.-Butyloxycarbonyl- Schutzgruppe für den Seitenkettenschutz und der Mischanhydrid- Methode für die Kopplung synthetisiert. Kurz gesagt wurde L- Valin-benzylester-p-Toluolsulfonatsalz mit tert.- Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin unter Verwendung von Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin als Kopplungsmittel (2 Stunden bei -20ºC, dann 1 Std. bei Umgebungstemperatur) gekoppelt. Die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe des Peptids wurde dann mit 30%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan bei Raumtemperatur für 30 Minuten entfernt. Blockierte Aminosäuren (tert.-Butyloxycarbonyl-L-valin, Na-tert.-butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-lysin, Na-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin, Benzyloxycarbonylglycin) wurden in sequentieller Reihenfolge zugegeben, um das gewünschte Peptid zu erhalten. Das letztendliche Peptid wurde aus Wasser lyophilisiert und durch Flüssigkeitschromatographie auf einer C-18-Umkehrphasensäule gereinigt, um das gewünschte Hexapeptid in einer Menge von mehreren Gramm herzustellen.
    • BEISPIEL 5 Synthese von L-Lysyl-L-histidyl-glycin
  • Nα-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin wurde in Tetrahydrofuran (THF) gelöst und mit einem Äquivalent N-Methylmorpholin neutralisiert. Es wurde dann mit Benzylglycinat-p-Toluolsulfonatsalz unter Verwendung von Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin gekoppelt. Nach zwei Stunden bei -20ºC und einer zusätzlichen Stunde bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktion mit 2 wässrigem Kaliumbicarbonat gelöscht. Das Produkt wurde in Ethylacetat hinein extrahiert, als erstes mit 1 wässriger Zitronensäure und als zweites mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Eindampfen ergab Nα-tert.- Butyloxycarbonyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-glycinat.
  • Dieses Produkt wurde in wasserfreiem methanolischem Chlorwasserstoff (gesättigt bei 0ºC) für 5 Minuten gelöst, gefolgt von der Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck, wodurch Benzyl-Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-glycinat gebildet wurde. Dieses wurde in Tetrahydrofuran gelöst und Isobutylchlorformiat, N-Methylmorpholin und Nα, Nε-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysin wurden zugegeben, um Nα,Nε-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-histidyl-glycinat zu bilden (3 Stunden bei -20ºC, dann 1 Stunde bei Umgebungstemperatur). Dieses Produkt wurde dann in Methanol/Essigsäure [1:1 (v/v)] gelöst und über Nacht in der Gegenwart von 10 % Pd-C-Katalysator hydriert. Das resultierende L-Lysyl-L-histidyl-glycin wurde mehrmals aus Wasser lyophilisiert, dann durch Flüssigkeitschromatographie auf einer C-18-Umkehrphasensäule gereinigt, um das gewünschte Tripeptid-Triacetatsalz als einen schaumigen weißen Feststoff zu liefern.
    • BEISPIEL 6 Synthese von L-Lysyl-L-histidyl-glycyl-L-valyl-L-phenylalanyl- L-valin
  • L-Lysyl-L-histidyl-glycyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin in einer Menge von mehreren Gramm wurde mit der Lösungsphasen- Standardmethode unter Verwendung der tert.-Butyloxycarbonyl- Schutzgruppe für den Alpha-Stickstoff, der Benzyloxycarbonyl- Gruppe für den Seitenkettenschutz und der Mischanhydrid- Methode für die Kopplung synthetisiert. Kurz gesagt wurde L- Valin-benzylester-p-Toluolsulfonatsalz mit tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin unter Verwendung von Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin als Kopplungsmittel gekoppelt (2 Stunden bei -20ºC, dann 1 Stunde bei Umgebungstemperatur). Die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe des Dipeptids wurde dann mit 30%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan bei Raumtemperatur für 30 Minuten entfernt. Blockierte Aminosäuren (tert.-Butyloxycarbonyl-L-valin, tert.- Benzyloxycarbonylglycin, Nα-tert.-Butyloxycarbonyl-Nim- benzyloxycarbonyl-L-histidin, Nα,Nε-Dibenzyloxycarbonyl-L- lysin) wurden in sequentieller Reihenfolge zugegeben, um das gewünschte Peptid zu erhalten. Das letztendliche Peptid wurde unter Verwendung von Wasserstoffgas in Eisessig für 5 Tage in der Gegenwart von 10% Pd-C-Katalysator vollständig von Schutzgruppen befreit. Das letztendliche Peptid wurde aus Wasser lyophilisiert und durch Flüssigkeitschromatographie auf einer C-18-Umkehrphasensäule gereinigt, um das gewünschte Hexapeptid in einer Menge von mehreren Gramm herzustellen.
  • Die obige systematische Synthese erwies sich als vorteilhaft gegenüber einigen Festphasen-Methoden bei der Bereitstellung einer Menge von mehreren Gramm des gewünschten Peptids in hoher Reinheit mit minimaler Reinigung.
    • BEISPIEL 7 Shay-Modell-Studien
  • Magenulcera wurden in Ratten mit dem Shay-Verfahren induziert. Kurz gesagt wird die Passage zwischen dem Magen und dem Darm in der Ratte abgeschnürt, wodurch ein Aufbau von Magensäure bewirkt wird, was zu Ulceration führt. Zur Behandlung erhielten die Ratten 10 mg GHL oder GHL-Cu oder ein Derivat davon in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung in den Magen intubiert. Kontrollratten erhielten nur physiologische Kochsalzlösung. Nach 24 Stunden wurden die Mägen photographiert und die Magenacidität bestimmt.
  • Die Ergebnisse der Experimente sind in Tabelle 1 dargestellt, welche die Hemmung von Magensäureakkumulation und Stimulation der Sekretion von zytoprotectivem Schleim in den Ratten zeigt. Die Schleimproduktion wurde visuell bewertet von 0 bis ++++, wobei 0 im wesentlichen keinen beobachteten Schleim bedeutet und ++++ eine sehr kräftige Schleimsekretion bedeutet. TABELLE 1 Magenacidität pH + Standardabweichung Schleim-Produktion Kontrolle nicht beobachtbar
    • BEISPIEL 8 Shay-Modell-Studien
  • Magenulcera wurden in Ratten mit dem Shay-Verfahren induziert. Kurz gesagt wird die Passage zwischen dem Magen und dem Darm in der Ratte abgeschnürt, wodurch ein Aufbau von Magensäure bewirkt wird. Ulcusbildung ist nach 18-24 Stunden Ligation sichtbar.
  • Zur Behandlung erhielten die Ratten entweder GHL-Cu oder ein Derivat in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung in den Magen über eine Magensonde unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff. Kontrollratten erhielten nur physiologische Kochsalz lösung. Nach 24 Stunden wurden die Ratten geopfert, die Mägen wurden entfernt und photographiert. Die Acidität des Mageninhalts wurde ebenfalls gemessen.
  • In den hier berichteten Experimenten wurden die Ratten mit verschiedenen Dosen Glycyl-L-histidyl-L-lysin (GHL), GHL-Cu- (2:1) oder GHL-Cu(1:1)-Komplex oder verschiedenen Analogen von GHL als den 1:1-Kupferkomplexen behandelt.
  • Magenulcera wurden in Gruppen von Ratten induziert, wie oben beschrieben. Den Tieren wurden ansteigende Mengen von entweder GHL:Cu in einem Molverhältnis von 2 Mol GHL zu 1 Mol Cu (2:1), äquimolarem Komplex (1:1) und GHL ohne Kupfer verabreicht. Nach 24 Std. wurden die Mägen entfernt, der pH wurde bestimmt und der Prozentanteil an Mägen mit sichtbaren Ulcera wurde bestimmt.
  • Die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten sind in Tabelle 2 dargestellt, welche die Hemmung der Magensäuresekretion (wie gezeigt durch den höheren pH der Magenflüssigkeit, verglichen mit dem Kontrollversuch) und dem Prozentanteil der Mägen, die sichtbare Ulcera zeigten, zeigt. Das Vorhandensein von Ulcera ist positiv bewertet, wenn eine einzelne Läsion bemerkt wird, unabhängig von der Größe. Die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Mägen hatten mehrere große Läsionen, während behandelte Tiere kleinere, weniger zahlreiche Ulcera hatten, wenn überhaupt. Sowohl das Glycyl-L-histidyl-L- lysin:Cu (2:1) als auch Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu (1:1) hemmte die Ulcusbildung und hob den pH des Mageninhaltes in einer dosisabhängigen Weise an. TABELLE 2 HEMUUNG DER BILDUNG VON MAGENULCERA UND SÄURESEKRETION DURCH GHL-KUPFER-KOMPLEXE VERBINDUNG DOSIS % MIT ULCERA PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLÖSUNG
  • Repräsentative Photographien von Rattenmägen aus einem typischen Experiment sind in Figur 1 wiedergegeben. Die oberen Photographien veranschaulichen mit physiologischer Kochsalzlösung behandelte Mägen nach 24 Stunden und zeigen mehrere Ulcus-Läsionen. Die unteren Photographien veranschaulichen die Behandlung mit GHL-Cu (1:1), 10 mg, und zeigen vollständige Hemmung der Bildung von Läsionen. Der ansteigende Magen-pH (der ein Absinken in der Magensäuresekretion anzeigt) mit ansteigender Dosis von GHL-Cu (1:1) ist in Figur 2 ebenfalls gezeigt. Die Abnahme in der Bildung sichtbarer Ulcera mit den entsprechenden Dosierungen von GHL-Cu ist in Figur 3 gezeigt.
  • Es ist festgestellt worden, daß auch Analoge von Glycyl-L- histidyl-L-lysin die Ulcusbildung im Rattenmodell hemmen. Eine Zusammenfassung einiger der getesteten Analoge ist in Tabelle 3 gezeigt. Alle Verbindungen sind als die 1:1-Kupfer-Komplexe getestet worden. TABELLE 3 HEMMUNG DER BILDUNG VON MAGENULCERA UND SÄURESEKRETION DURCH GHL- UND LHG-ANALOG-KUPFER-KOMPLEXE VERBINDUNG DOSIS % MIT ULCERA PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLÖSUNG GH(1-methyl)L:Cu GHL-pentadecylester:Cu
    • BEISPIEL 9 Heilung von Duodenal-Ulcera
  • Cysteamin wird chronische Duodenal-Ulcera in Ratten induzieren, wenn es subkutan injiziert wird (Olsen, P.S., Poulsen, S.S., Therkelsen, K. und Nexo, E., Oral administration of synthetic human urogastrone promotes healing of chronic duodenal ulcers in rats, Gastroenterology 90:911-917(1986)).
  • Duodenal-Ulcera wurden in einer Gruppe von 40 S.D.-Ratten (männlich und weiblich) durch subkutane Injektionen von Cysteamin (350 mg/kg und 175 mg/kg) im Abstand von 6 Stunden induziert. Physiologische Kochsalzlösung wurde subkutan injiziert (5 cc), um Flüssigkeit bereitzustellen. Überlebende Tiere (n=34) wurden über 7 Tage verfolgt, dann wurden Laparotomien durchgeführt. Äußere Untersuchungen des Duodenums wurden vorgenommen, um das Ausmaß der Adhäsion der Leber oder anderer umgebender Gewebe zu bestimmen. Tiere mit Duodenal- Ulcera wurden (nach Geschlecht) randomisiert, um GHL-Cu (2:1) in destilliertem Wasser oder reines destilliertes Wasser zu erhalten. Die Tiere wurden für 25 Tage erhalten, wonach sie sediert, Mägen und Duodenums entfernt und zur inneren Untersuchung seziert wurden. Die Ergebnisse wurden erhalten und aufgezeichnet, Proben in 10% gepufferten Formalin zur Analyse mit einem Stereomikroskop eingetaucht.
  • Die folgende Bewertungsskala wurde verwendet, um die Schwere der Ulceration auszudrücken:
  • 0 - kein Anzeichen von Ulceration
  • 1 - milde Ulceration, keine Ausdehnung durch Duodenum
  • 2 - mäßige Ulceration, Fixation von umgebendem Gewebe
  • 3 - extreme Ulceration durch Duodenum
  • Am Tage der Laparotomie wurden 28 Ratten (6 weibliche, 12 männliche) bestimmt, die eine signifikante Adhäsion des Duodenums an umgebende Gewebe zeigten. Diese Tiere wurden nach Geschlecht randomisiert in entweder die GHL-Cu- oder die Kontrollgruppe. Im Anschluß an 25 Tage Trinkwasserbehandlung (Gesamtdosis pro Tag 0,6 mg/kg) wurden die Ratten sediert und zur Sektion vorbereitet. Der Magen und das Duodenum wurden entfernt, Anmerkungen gemacht zum Ausmaß von Restadhäsionen. Innere Untersuchung des Duodenums wurde vor dem Eintauchen der Probe in 10% Formalin durchgeführt. Die Ergebnisse zum Zeitpunkt der Grobinspektion zeigten, daß 11 von 14 Kontrolltieren signifikante Restulcerationen aufwiesen, die sich primär zur Leber hin erstreckten. GHL-Cu-Tiere zeigten etwas mildere Ulcerationen bei 7 von 14 Tieren.
  • Die Ergebnisse aus der mikroskopischen Untersuchung und die Bewertung der Schwere der Ulcera waren wie folgt: Bewertung # Kontrolltiere # GHL-Cu(2:1)-Tiere
  • Der Ulcerationsgrad ist graphisch in Figur 4 dargestellt.
  • Zusammenfassend gesagt gibt es Anzeichen, daß GHL-Cu(2:1)- Tiere von der Behandlung profitierten, verglichen mit Kontrolltieren. Obgleich in den meisten GHL-Cu-Ratten Ulcera vorhanden waren, war die Schwere verringert. Vier Tiere hatten keinen nachweisbaren Ulcera zum Zeitpunkt der mikroskopischen Untersuchung. Die Tiefe der Ulcuspenetration war in der GHL- Cu-Gruppe verringert.
    • BEISPIEL 10 Mit Ethanol induzierte Magenulcera
  • Eine Reihe von Studien an mit Ethanal induzierten Magenulcera wurde durchgeführt. Ulcera wurden durch orale Verabreichung von 95%ige Methylalkohol induziert (Scan. LT. Gastroenterol 23:665-671 (1988)). Die Studien wurden durchgeführt, um sowohl die präventiven als auch heilenden Wirkungen von Glycyl-L- histidyl-L-lysin:Cu zu bestimmen.
    • Dosiswirkung von Ethanol
  • Eine erste Dosis-Wirkungs-Studie wurde durchgeführt, um die optimale Dosis von Ethanol für die Ulcusbildung zu bestimmen. Im Anschluß an ein 12stündiges Fasten wurde einer Gruppe von SD-Ratten mit 300-400 g eine Infusion mit ansteigenden Mengen Ethanol über eine Magensonde verabreicht. Die folgenden Dosen wurden verwendet:
  • 1,25 ml/kg (n=3)
  • 2,5 ml/kg (n=3)
  • 5,0 ml/kg (n=3)
  • Nach einer Stunde wurde den Ratten eine Überdosis Pentobarbital verabreicht und die Mägen wurden entfernt. Untersuchung der Magenmucosa zeigte mehrere große oberflächliche Ulcera einschließlich Blutgefäßerosion. Schwere Ulcera mit "Dellenbildung" waren in allen Dosisgruppen zu beobachten. Die 5,0 mg/kg-Gruppe erlitt die schwerste Schädigung der Magenmucosa, die 1,25 mg/kg-Gruppe die geringste Schädigung.
    • Ulcusprävention
  • Eine Dosis von 2,0 ml/kg 95%iger Ethanol wurde ausgewählt, um Magenulcera in Ratten zu induzieren. Vor der Ethanolingestion wurden drei Gruppen von Ratten mit 0,5 ml 2% Glycyl-L- histidyl-L-lysin:Cu(1:1) wie folgt vorbehandelt:
  • Gruppe 1: 2 Stunden vor Ethanol-Verabreichung
  • Gruppe 2: 4 Stunden vor Ethanol-Verabreichung
  • Gruppe 3: 6 Stunden vor Ethanol-Verabreichung
  • Zusätzlich dienten vier Ratten als Kontrolltiere ohne Vorbehandlung. Eine Stunde im Anschluß an die Ethanol-Verabreichung wurden die Mägen entfernt und auf Ulceration untersucht, wie oben beschrieben. Alle Kontrolltiere hatten Ulcera die ähnlich zu denjenigen waren, die in der Dosis-Wirkungs-Studie zu beobachten waren, d.h. rote oberflächliche Ulcerationen, die Blutgefäße in der Magenwand umfaßten.
  • Die Vorbehandlung mit Glycyl-L-histidy-L-lysin:Cu(1:1) ergab die folgenden Ergebnisse:
  • Gruppe 1: 2 Stunden vorher - kein Anzeichen von Ulceration
  • Gruppe 2: 4 Stunden vorher - signifikant besser als Kontrolltiere, jedoch waren kleine Ulcera sichtbar.
  • Gruppe 3: 6 Stunden vorher - gemischte Ergebnisse. Eine Ratte hatte mehrere Läsionen, sehr ähnlich zur Kontrollgruppe. Eine Ratte hatte keine sichtbaren Ulcera, eine Ratte hatte kleine Ulcera ähnlich zur 4-Stunden- Gruppe.
  • Photographien der Kontrollmägen, d.h. keine Vorbehandlung (obere Photographie), und der mit GHL-Cu 2 Stunden vor Ethanolverabreichung vorbehandelten Mägen (untere Photographie) sind in Figur 5 dargestellt.
  • Die Vorbehandlung mit dem Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu(1:1) hemmte erfolgreich die Bildung von Magenulcera, wobei eine Schädigung vollständig verhindert wurde, wenn es 2 Stunden vor der Verabreichung von 95%igen Ethanol verabreicht wurde.
  • Solche Ergebnisse legen nahe, daß die Behandlung von z.B. Alkoholikern mit Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Alkohol induzierte Magen- oder Duodenal-Ulcera verhindern könnte, die üblicherweise bei solchen Personen anzutreffen sind. Außerdem könnte die Vorbehandlung die Menge von in den Blutstrom absorbiertem Alkohol verringern, wodurch das Auftreten einer Vielzahl von unerwünschten, mit Alkohol zusammenhängenden Nebenwirkungen verringert würde.
    • Heilung von Magenulcera
  • Die Fähigkeit von Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu(2:1), Ulcera zu heilen, die durch 95%igen Ethanol induziert worden sind, ist ebenfalls untersucht worden. In dieser Studie wurden Ulcera durch Verabreichung von 4 ml/kg 95%igem Ethanol induziert. Die Ratten wurden dann mit Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Cu(2:1) im Trinkwasser mit einer Dosis von 0,01 mg/ml und 0,1 mg/ml (Gesamtdosis pro Tag 1,6 mg/kg bzw. 16 mg/kg) behandelt. Die Ratten wurden am Tag 7 nach Ulcusinduktion getötet und die Mägen auf das Vorhandensein von Ulcera untersucht.
  • Die folgende Bewertungsskala wurde verwendet, um die Schwere der Ulceration auszudrücken:
  • 0 - kein Anzeichen von Ulceration
  • 1 - etwas Reizung
  • 2 - kleine Ulcera vorhanden
  • 3 - große Ulcera vorhanden
  • Die Ergebnisse aus der Untersuchung und der Bewertung der Schwere der Ulcera waren wie folgt: Bewertung # Kontrolltiere # GHL-Cu-Tiere
  • Der Ulcerationsgrad ist graphisch in Figur 6 dargestellt.
  • Die mit GHL-Cu behandelten Tiere bei beiden Dosisniveaus profitierten von der Behandlung, verglichen mit den Kontrolltieren. Es waren weniger Ulcera in den mit GHL-Cu behandelten Ratten vorhanden und die Schwere der bestehenden Ulcera war verringert. Die Mehrzahl der Tiere hatten zum Zeitpunkt der Untersuchung keine nachweisbaren Ulcera.
  • Aus dem vorstehenden wird man anerkennen, daß, obgleich spezifische Auswirkungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung, ausgenommen durch die beigefügten Ansprüche, nicht beschränkt.

Claims (6)

1. Eine Zusammensetzung zur Verwendung als eine aktive therapeutische Substanz, die eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
L-Lysyl-L-histidyl-glycin: Kupfer(II),
L-Lysyl-L-histidyl(1-methyl)-glycin:Kupfer(II), einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten&sub1; die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-va- lyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von LHG-Cu mitder allgemeinen Formel:
[X-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin X Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Pro- lyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
2. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung der Sekretion von Magensäure in Warmblütern, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
L-Lysyl-L-histidyl-glycin,
L-Lysyl-L-histidyl-glycin:Kupfer(II),
L-Lysyl-L-histidyl (1-methyl)-glycin:Kupfer(II),
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[X-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin X Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
3. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erhöhung der Sekretion von zytoprotektivem Schleim im Magen von Warmblütern, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
L-Lysyl-L-histidyl-glycin,
L-Lysyl-L-histidyl-glycin:Kupfer(II),
L-Lysyl-L-histidyl(1-methyl)-glycin:Kupfer(II),
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-va- lyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[X-L-Histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin x Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
4. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung der Bildung von Magenulcera in Warmblütern, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
L-Lysyl-L-histidyl-glycin,
L-Lysyl-L-histidyl-glycin: Kupfer(II),
L-Lysyl-L-histidyl (1-methyl) -glycin:Kupfer(II),
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-va- Iyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[X-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin X Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten&sub1; die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten&sub1; Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
5. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Heilung von Magen- oder Darmulcera in Warmblütern, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Glycyl-L-histidyl-L-lysin,
Glycyl-L-histidyl-L-lysin:Kupfer(II),
Glycyl-L-histidyl(1-methyl)-L-lysin:Kupfer(II),
einem Derivat von GHL-Cu mit der allgemeinen Formel:
[Glycyl-L-histidyl-L-lysin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von GHL-Cu mit der allgemeinen Formel:
[X-L-histidyl-L-lysin- -R]:Kupfer(II),
worin X Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Pro- lyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
6. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Heilung von Magen- oder Darmulcera in Warmblütern, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
L-Lysyl-L-histidyl-glycin,
L-Lysyl-L-histidyl-glycin:Kupfer(II),
L-Lysyl-L-histidyl(1-methyl)-glycin:Kupfer(II),
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[L-Lysyl-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten&sub1; die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L- valin ist, und
einem Derivat von LHG-Cu mit der allgemeinen Formel:
[X-L-histidyl-glycin- -R]:Kupfer(II),
worin X Glycyl-L-alanyl, Glycyl-L-seryl oder Glycyl-L- valyl ist und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, Aryleinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, Alkoxyeinheiten, die von 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, und Aryloxyeinheiten, die von 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, oder worin R L-Prolyl-L-valyl-L-phenylalanyl-L-valin oder L-Valyl-L-phenylalanyl-L-valin ist.
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