DE69018275T2

DE69018275T2 - Peptide, deren Verwendung als Hemmer gegen Entwicklung von t-Lymphocyten und Wirksamkeit von Makrophagen und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE69018275T2
Application number: DE69018275T
Authority: DE
Inventors: Gyorgy Dr Hajos; Lajos Dr Kisfaludy; Denes Dr Laszlo; Nee Kuprina Olga Nyeki; Istvan Dr Schoen; Laszlo Dr Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1995-08-03
Anticipated expiration: 2010-01-13
Also published as: CN1044102A; HUT53123A; EP0378432A2; EP0378432B1; CN1031344C; HU201964B; CA2008438A1; DK0378432T3; ES2071004T3; IL93107A; DE69018275D1; JPH02270895A; EP0378432A3; AU4792290A; IL93107A0; ATE120758T1; US5093320A; AU632526B2

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptide, ihre Verwendung für die Inhibierung der Reifung von T-Lymphocyten und der Aktivität von Makrophagen, und Verfahren zu ihrer Herstellung.
In einem gesunden Organismus hält die ausgeglichene Funktion des Immunsystems einen starken Schutzmechanismus aufrecht, der in der Lage ist, Mikroorganismen abzutöten, Fremdmaterialien und Tumorzellen zu zerstören, und sie aus dem Organismus zu entfernen, während sichergestellt wird, daß gesunde Zellen des Organismus selbst nicht geschädigt werden.
Bei Verminderung der Leistungsfähigkeit des Immunsystems (suboptimal) können infektiöse fremde oder Tumorzellen sich leichter vermehren, was zu einer vollständigen Zerstörung der meisten Wirtsorganismen führen kann, wogegen bei Überaktivität des Immunsystems gesunde Gewebe ebenfalls geschädigt werden können (z. B. Autoimmunkrankheiten und allergische Krankheiten). Z. B. kann bei organtransplantationen das eingepflanzte Organ oder Gewebe durch eine natürliche Abwehrreaktion (Antwort) des Organismuses gestoßen werden.
Die aus dem Thymus stammenden Lymphocyten, die sogenannten T-Zellen, spielen eine Schlüsselrolle bei der Auslösung, der Aufrechterhaltung und der Beendigung einer Immunantwort. Man weiß, daß aufgrund der "Informations-Übermittlung" die Funktion des Immunsystems im lebenden Organismus durch eine Anzahl von Peptiden und Proteinen beeinflußt wird.
Thymushormone und Informations-übermittelnde Faktoren (Cytokine), die von den Immunzellen hergestellt werden, sind in weitem Umfang bei der Behandlung von Tumor- und Immunerkrankungen/Drugs of the Future 11, 784 (1986); Drugs Exp. Clin. Res. 13, 327 (1987)/ untersucht worden. Ein solcher Faktor ist die sogenannte Thymosinfraktion 5, ein teilweise gereinigter Extrakt aus dem Kalbsthymus, der die bekannten Thymushormone enthält/Cancer Immunol. Immunther. 18, 185 (1984)/. Vorteilhafte Ergebnisse wurden unter Verwendung von durch biotechnologischen Verfahren hergestellte Cytokine bei der Behandlung von Krebserkrankungen erzielt/N. Engl. J. Med. 313, 1485 (1985)/.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen werden immer höhere Qualitätsanforderungen gesetzt. Wenn organextrakte und biosynthetische Makromoleküle nicht rein genug sind, um homogen zu sein, können die Kontaminationen (Verunreinigungen) unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen. Aus diesem Grund werden überall Anstrengungen unternommen, bei der Therapie Zusammensetzungen mit einer genau definierten Struktur und hoher Reinheit zu verwenden. Eine immunstimulierende Wirkung, wie oben im Zusammenhang mit den Makromolekülen erwähnt, könnte auch unter Verwendung kleinerer Peptide erreicht werden (US-PS Nrn. 4 190 646, 4 215 112, 4 232 008, 4 261 886, 4 395 404 und 4 442 031; DE-PS Nrn. 2 938 420, 3 001 775 und 3 100 974; HU-PS Nr. 185 263 und HU-OS Nr. 4827/86).
Die in den obigen Literaturstellen beschriebenen kurzen Polypeptide weisen die Vermehrung von T- und B-Zellen nach und besitzen einen allgemein immunstimulierenden Effekt. Für die Reproduktion des gesamten Wirkungsspektrums nativer immunmodulierender Mittel sind Substanzen erforderlich, die ihre Wirkung während verschiedener Perioden der allgemeinen Immunantwort in einer Weise ausüben, die sich von bekannten immunstimulierenden Mitteln unterscheidet.
WO 86/04334 offenbart eine Anzahl von Peptiden mit einem immunsuppressiven Effekt durch Suppression der Poliferation von T-Zellen. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide die Immunantwort, die zuvor in in vitro- und in vitro-Tests hervorgerufen wurde, inhibiert. Jedoch sind auch Überlegungen in Gange, daß diese Peptide eine immunstimulierende Wirkung bei niedrigeren Konzentrationen zeigen, d. h. die Peptide haben eine immunmodulierende Wirkung. Ferner sind die verwendeten und vorgeschlagenen Dosen relativ hoch.
Die erfindungsgemäßen Peptide üben einen allgemein suppressiven Effekt auf die Funktion des Immunsystems aus, und insbesondere inhibieren sie die Reifung von T-Zellen und die Aktivität von Makrophagen. Diese Wirkung ermöglicht die Verwendung dieser Peptide zur Behandlung von Symptomen, die mit einer erhöhten Funktion des Immunsystems einhergehen. Die gegenwärtig in der Therapie verwendeten immunsupprimierenden Arzneimittel, wie Cyclophosphamid (d. h. 2-/Bis(2-chlorethyl)amino)-tetrahydro-2H-1,3,2-oxazaphosphorin-2-oxid), Azathioprin (d. h. 6-(1-Methyl-4-nitro-6-imidazolylthio)purin), Corticosteroide oder ein Cyclosporin, besitzen einen therapeutischen Index unterhalb von 10, d. h. die therapeutische Dosis unterscheidet sich nicht wesentlich von der toxischen Dosis. Sie können daher nur unter strikter medizinischer Kontrolle eingesetzt werden.
Ein besonderer Vorteil von immunsuppressiven Peptiden ist, daß sie sehr schnell im Organismus abgebaut werden, und nicht in den Geweben und Zellen akkumulieren. Aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit sind sie jedoch in der Lage, Verbundprozesse auszulösen, die zu einer signifikanten Wirkung führen. Sie kennzeichnen sich durch eine niedrige Toxizität (/LD&sub5;&sub0; > 1000 mg/kg intravenös (i.v.)).
Gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt haben wir gefunden, daß neue Peptide mit der Formel (1) bis (20)
Arg-Lys(Chc)-Asp-Val (1)
Arg-Lys(Chc)-Asp (2)
Arg-Sar-Asp-Val (3)
Orn-Lys-Asp-Val (5)
Orn-Lys-Asp (6)
Arg-Lys-Aad-Val (7)
Arg-Lys-Aad (8)
[Arg-Lys-Asp-NH-CH&sub2;-]&sub2; (9)
Arg-Lys-Asp-Val-NH- H&sub2; (10)
Arg-Lys-Asp-NH- H&sub2;
[Arg-Lys-Asp-V l-NH-CH&sub2;-]&sub2; (11)
Arg-Lys-Asp-C s-NH&sub2;]&sub2; (12)
Ser-Ser-Ser-Thr (15)
Lys-Glu-Thr (16)
Lys-Lys-Thr-Glu (19)
Lys-His-Leu-NH&sub2; (20)
und ihre Säureadditionssalze, die Reifung von T-Zellen-abhängigen Antikörper-produzierenden Zellen inhibieren, die Aktivität von Antikörper-produzierenden Zellen in neugeborenen Mäusen mindern, die Phagocytose supprimieren und die späte hypersensitive Antwort verringern.
Die inhibitorischen Effekte dieser Peptide, die im allgemeinen in der L-Form vorliegen, beruhen vermutlich auf dem Phänomen, daß sie die Antigenerkennung der T-Zellen in den Immunprozessen supprimieren. Tatsächlich wird ein Verbundmechanismus der Immunantwort durch dieser Prozesse und die Wechselwirkungen nahegelegt. Man kann daher vorhersagen, daß die immunsuppressive Wirkung dieser Peptide in der Anfangsphase der Immunantwort wirksam ist.
Die neuen erfindungsgemäßen Peptide mit den Formeln (1) bis (20) können durch schrittweise Kettenverlängerungsreaktionen in Lösung hergestellt werden. Dies kann z. B. durch sukzessive Abfolge von Kopplungsschritten nach einem aktiven Ester-, einem gemischten Anhydrid- und/oder einem Azidverfahren, die in der Peptidchemie bekannt sind, und nachfolgender Entfernung der Schutzgruppe der α- und/oder &epsi;-Aminogruppe(n) erfolgen, wodurch, ausgehend von
(a&sub1;) Aminosäurederivaten, die eine mit einer durch Hydrierung oder Acidolyse entfernbare Schutzgruppe veresterte Carboxygruppe tragen, und die gegebenenfalls eine geschützte Seitenkettenhydroxyl- und/oder Aminogruppe und/oder eine durch eine Schutzgruppe, die durch Hydrierung entfernbar ist, aminierte oder veresterte C-terminale Carboxygruppe tragen, oder
(a&sub2;) ausgehend mit 1,2-Diaminoethan, dem Mono-L-Valinderivat von 1,2-Diaminoethan oder L-Cystindiamid,
Derivate der Peptide mit den Formeln (1) bis (20) gebildet werden, die an ihrer C-terminalen Carboxygruppe, die mit einer durch Hydrierung oder Acidolyse entfernbaren Schutzgruppe geschützt sind, unter Anwendung der oben beschriebenen Kopplungsschritte aminiert, acyliert oder verestert sind; und die an ihrer anderen Carboxylgruppe mit einer durch Hydrierung oder Äcidolyse entfernbaren Schutzgruppe verestert sind, und die auch Schutzgruppen Boc oder Z an ihren Aminogruppen tragen, die nicht an der Peptidverknüpfung beteiligt sind, und/oder an ihrer Hydroxylgruppe geschützt sind;
(b) anschließendes Entfernen der vorhandenen Schutzgruppen durch katalytische Hydrierung und/oder Säurebehandlung; und
(c) gegebenenfalls Umwandeln der freien Peptide mit den Formeln (1) bis (20) in ihre Säuradditionssalze durch Behandlung mit einer geeigneten Säure; und/oder
(d) gegebenenfalls Freisetzen der freien Peptide mit den Formeln (1) bis (20), die in Form ihrer Salze erhalten wurden, und/oder Umwandlung in andere Salze, wobei diese mit anderen Säuren gebildet werden.
In einigen Fällen wird eine Kombination von Schutzgruppen bei der Synthese verwendet, um so die selektive Entfernung der Aminoschutzgruppen zu ermöglichen, und dann alle übrigen Schutzgruppen in einer oder zwei Schritten am Ende der Synthese abzuspalten. Um die Peptidverknüpfung zu erreichen, kann ein Verfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidester/Wünsch: Synthese von Peptiden, Bd. 2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974, Seite 14)/, von Pentafluorphenylester (HU-PS Nr. 168 431) oder gemischten Anhydriden (HU-PS Nr. 183 579) angewandt werden.
Für die Synthese von Verbindungen vom Dimertyp mit den Formeln (9) bis (12) werden 1,2-Diaminoethan oder seine Mono-L-Valinderivate oder L- Cysteindiamid als Ausgangssubstanzen verwendet. Bei einer schrittweisen Kettenverlängerung werden ca. 2 mol des acylierenden Aminosäurederivats, berechnet für ein mol der obigen Ausgangssubstanz, eingesetzt (das tatsächliche Molverhältnis hängt davon ab, welche der Reaktanten geeigneterweise in einem Überschuß verwendet werden sollte).
Offensichtlich hat bei der Synthese der Verbindungen mit den Formeln (9), (11) und (12) jedes der Zwischenprodukte eine symmetrische Struktur, während das der Formel (10) asymmetrisch ist.
Aminogruppen können durch eine Boc- oder Z-Gruppe geschützt sein. Carboxylgruppen können t-Butyl-, Benzyl- oder 4-Nitrobenzylester-Schutzgruppen verwenden.
Nach Abschluß der Synthese werden die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen aus dem geschützten, auf die obige Weise erhaltenen Peptid entfernt, und anschließend wird gegebenenfalls das freie Peptid in sein Säureadditionssalz durch Behandlung mit einer Säure umgewandelt. Katalytische Hydrierung oder Acidolyse kann zum Entfernen der Schutzgruppen eingesetzt werden. Die so erhaltenen Peptide sind im allgemeinen ausreichend rein für therapeutische Verwendung und erfordern keine weitere Reinigung. Falls jedoch erwünscht, können sie durch Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt werden. Die in Form einer Lösung erhaltenen Peptide können durch Verdampfung oder Lyophilisierung der Lösung isoliert werden. Ein freies Peptid kann gegebenenfalls in ein Salz überführt werden.
Die Reinheit des Endprodukts kann unter Verwendung von HPLC-Analyse überprüft werden.
Der Effekt auf das Immunsystem von einigen der Zielverbindungen wurde in den im folgenden beschriebenen Tests untersucht.

1. Wirkung auf Antikörper-produzierende Zellen bei neugeborenen Ratten

Diese Untersuchung wurde mit Splenocyten durchgeführt, die aus neugeborenen Ratten nach dem Verfahren von Canningham (Handbook of Experimental Immunology, Herausgeber: D. M. Weir, Bd. 2, Blackwell, Oxford-London, Seite 285, 1978) erhalten wurden. Zwölf Wistar-(LATI)-Ratten, die von einem einzelnen Wurf stammten, wurden intraperitoreal (i.p.) mit 7,5 ug der Testsubstanz mit einer Dosis von 1 mg/kg innerhalb 12 Stunden nach ihrer Geburt behandelt. Am 14. Tag nach der Geburt wurden die Tiere i.p. mit 0,5 ml einer 1%igen Suspension von Schafserythrocyten immunisiert, anschließend durch Entfernen des Kopfes nach 7 Tagen ausgeblutet. Aus den von den Tieren erhaltenen Splenocyten wurde eine homogene Suspension unter Verwendung einer Schaf-Erythrocytensuspension und -Komplement hergestellt, welches anschließend in eine für den Erhalt einer monozellulären Schicht geeigneten Kammer eingebracht wurde. Die mit Paraffin verschlossenen Kammern wurden bei 37ºC 45 Minuten inkubiert. Um die Antikörper-produzierenden Splenocyten wurden lytische Gebiete, sogenannte Plagues, gebildet. Unter der Wirkung der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen nahm die Anzahl der Plague-bildenden Zellen (Plaque-forming cells, PFC) ab. Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Daten erläutern diesen Verlust in Prozent, berechnet auf Basis der von unbehandelten Kontrolltieren erhaltenen Zellen. Unter den gleichen Bedingungen ist die Anzahl der Plague-bildenden Zellen signifikant durch immunstimulierende Peptide erhöht. TABELLE 1 Suppression der Antikörperproduktion Peptide Veränderung %

2. Wirkung auf die primäre Antikörperproduktion bei neugeborenen Ratten

Diese Untersuchung beruht auf dem Phänomen der Agglutinierung. Ein spezifisches Antiserum haftet an die Oberfläche des Antigens unter Bildung großer Klumpen, die sich rasch absetzen (Agglutinat).
Neugeborene Wistar-(LATI)-Ratten wurden intraperitoneal (i.p.) mit einer Dosis von 1 mg/kg Testsubstanz innerhalb 12 Stunden nach ihrer Geburt behandelt. Am 14. Tag wurden die Tiere i.p. mit 0,5 ml einer 1%igen Suspension von Schafserythrocyten immunisiert, Am 7. Tag nach der Immunisierung wurde Retroorbitalblut entnommen. Nach 30 Minuten wurden die Seren durch Zentrifugation aufgetrennt und der Haemagglutinintiter wurde nach dem Verfahren nach Tak tsy (Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 3, 191 (1955)/ bestimmt. Aus den gemischten Seren (50 ul) zweier Ratten wurden in 12 Schritten auf die Hälfte reduzierte Verdünnungen hergestellt. Zu jeder Probe wurden 25 ul einer 2%igen Suspension von Schaftserythrocyten gegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC/h unter Auswertung der Agglutination inkubiert. Die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt, die den supprimierenden (inhibierenden) Effekt einiger erfindungsgemäßer Verbindungen auf die Primärantikörperproduktion als Prozentsatz in Bezug auf die unbehandelten Tiere zeigt. Immunstimulierende Substanzen zeigen gerade den gegenteiligen Effekt in diesem Test. TABELLE 2 Effekt auf die Primärantikörperproduktion Peptide Veränderung in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle %

3. Inhibierung der phagocytierenden Fähigkeit ruhender Makrophagen

Die phagocytierende Fähigkeit ruhender Makrophagenzellen wurde an Mäusen untersucht (J. Immunopharmacol. 4, 265 (1982-1983)/. Männliche CFLP-(LATI)-Mäuse mit 22 bis 28 g Gewicht wurden subkutan (s.c.) täglich mit einer Dosis von 1 mg/kg Testsubstanz über 7 Tage behandelt. Nach Ausbluten der Tiere wurden ihre Bauchhöhlen mit 8 ml PBS-Pufferlösung (Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH = 7,2) die jeweils 10 I.E. Heparin enthielt, gewaschen. Die aus der Bauchhöhle ausgewaschene Suspension wurde von Erythrocyten durch Schockbehandlung mit destilliertem Wasser befreit, anschließend 3 mal mit PBS-Pufferlösung gewaschen. Die Sedimentation zwischen den zwei Waschschritten erfolgte durch Zentrifugation bei 1000 Upm für 5 Minuten. Die Konzentration jeder Zellsuspension wurde 10&sup6; Zellen/ml eingestellt, und man ließ die Suspension 30 Minuten in einer Boyden-Kammer bei 37ºC in einer 5 % Kohlendioxid-haltigen Atmosphäre absetzen. Über die auf der Glaswand anhaftenden Makrophagen wurde eine Schicht opsonisierter Hefe ausgebracht. Nach Entfernung der nicht-phagocytierten Teilchen wurden diejenigen, die von den Makrophagen aufgenommen wurden, in jeder Zelle gezählt. In Tabelle 3 ist der Prozentsatz der Abnahme der Zählung phagocytierter Hefezellen in Bezug auf die aus unbehandelten Tieren als Kontrolle isolierten Makrophagen angegeben. TABELLE 3 Veränderung in der phagozytierenden Fähigkeit ruhender Makrophagen Peptide Veränderung % Cyclophosphamid in einer Dosis von 150mg/kg i.p. -75,0

4. Effekt auf die späte hypersensitive Antwort (DTH)

Dieser Test wurde an männlichen CFLP-(LATI)-Mäusen mit einem Gewicht von 25 bis 30 g durchgeführt. Zu Beginn des Experiments wurden die Mäuse mit einer 3%igen Oxazolon-Lösung in wasserfreiem Ethanol durch Verabreichung von 20 ul der Lösung jeweils an beiden Ohren und Vorderklauen behandelt. Am 7. Tag nach der Behandlung wurden die Tiere mit einer Dosis von 1 mg/kg i.p. einiger erfindungsgemäßen Verbindungen, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, behandelt. Kontrollen wurden nur mit Kochsalzlösung behandelt. Am Tag 10 des Experiments wurden 20 ul einer 2,5%igen Olivenöllösung von Oxazolon auf jedem Ohr des Tieres verschmiert. Die Dicke der Ohren wurde zweimal gemessen, d. h. bevor und 24 Stunden nach Verabreichung des Antigens. Die Dicke an beiden Ohren wurde in der Mitte der Ohrmuscheln mit einer Genauigkeit von 0,01 mm gemessen. Die Veränderung wurde mit der Kontrollgruppe verglichen. Die Daten betreffen die Suppression der Entwicklung einer DTH-Antwort sind als Prozentwerte in Tabelle 4 angegeben. TABELLE 4 Suppression der DTH-Anwort Peptide Suppression % Cyclophosphamid in einer Dosis von 150mg/kg i.p.
Für die Peptide "A", "B" und "C" in den obigen Tabellen zum Vergleich:
"A" und "B" sind in HU-PS 185 263 beschrieben;
"C" ist bekannt aus US-PS 4 190 646.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Säureadditionssalze können in Form üblicher pharmazeutischer Zusammensetzungen in jedem therapeutischen Anwendungsbereich eingesetzt werden, wo eine Abnahme in der Aktivität des Immunsystems erwünscht ist. Die Peptide mit den Formeln (1) bis (20) können per se oder in Form ihrer Salze und auch in Verbindung mit einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung, wie in der Therapie eingesetzt, verwendet werden. Diese Formulierungen (Medikamente) können in einem festen oder flüssigen Zustand vorliegen, und können unter Verwendung von Füllstoffen, Verdünnern, Stabilisatoren, pH und den osmotischen Druck beeinflussenden Mitteln wie auch von Zusätze zur Förderung der Formulierung, die üblicherweise in solchen Formulierungen eingesetzt werden, hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung (lebender) Tiere (einschließlich dem Menschen) unter Beeinflussung der Funktion des Immunsystems des behandelten Subjekts durch Verabreichung einer oder mehrerer effektiver Dosen von einer oder mehrerer der Verbindungen der Formeln (1) bis (20) per se oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Peptide mit den Formeln (1) bis (20) oder ihrer Säureadditionssalze davon bei der Herstellung eines Medikaments der Verwendung für die Herabsetzung der Aktivität des Immunsystems in Säugern einschließlich dem Menschen.
Die Erfindung wird im folgenden durch die nicht-beschränkenden Beispiele erläutert.
Die in der Beschreibung verwendeten Abkürzungen entsprechen den im allgemeinen in der Literatur verwendeten /Biochem. J. 219, 345 (1984)/. "Chc" bedeutet Cyclohexylcarbamoyl und "Aad" ist eine tL-L-Aminoadipylgruppe. Die Schmelzpunkte wurden in einer Dr. Tottoli-Vorrichtung (hergestellt von Büchi, Schweiz) gemessen. Dünnschichtchromatographie-Untersuchungen wurden unter Verwendung eines sofort einsetzbaren Adsorbens (DC-Fertigplatten, hergestellt von Merck, BRD) durchgeführt, und die folgenden Lösungsmittelmischungen wurden verwendet (worin eine "Stock-Lösung" eine 20:6:11 Mischung von Pyridin/Essigsäure/Wasser ist):
1. Ethylacetat/Stock-Lösung 19:1;
2. Ethylacetat/Stock-Lösung 9:1;
3. Ethylacetat/Stock-Lösung 4:1;
4. Ethylacetat/Stock-Lösung 7:3;
5. n-Butanol/Stock-Lösung 3:7;
6. n-Butanol/Stock-Lösung 1:4; und
7. n-Butanol/Essigsäure/Ethylacetat/Wasser 1:1:1:1.
(Die Verhältnisse sind in Volumenverhältniswerte angegeben).
Die Chromatogramme wurden durch Ninhydrin oder nach Chlorierung unter Verwendung eines Kaliumjodid/Tolidinreagens sichtbar gemacht.
Die HPLC-Analysen wurden unter Verwendung einer mit einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge vom Labor-MIM OE 975-Typ, Altex-Pumpe und KUTESZ 175-Typ durchgeführt. Für die Abtrennung wurde eine Kartusche von 250 mm Länge, 4,6 mm innerem Durchmesser mit einer festen Phase aus mit C&sub1;&sub8;-Alkylgruppen alkyliertem Kieselgel (Labor MIM) verwendet. Die folgenden Mischungen wurden für die Elution verwendet:
A. Eine Mischung bestehend aus 25 ml Methanol und 75 ml 0,01M wäßrigem Natriumsulphat, enthaltend 0,5 Vol.% Trifluoressigsäure;
B. eine 1,5:1,0:97,5-Mischung von Acetonitril/Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser.
Die Messung erfolgte mit einer Flußrate von 1 ml/min und die Absorption der Lösung wurde bei 212 nm detektiert. Die Chromatogramme wurden durch Flächennormalisierung ausgewertet.
Die Reinheit der Zielverbindungen war nicht mehr als 95 % auf Grundlage von sowohl der HPLC- als auch der Dünnschichtchromatographie-(TLC)- Analysen.
Die spezifische optischer Rotation wurde in einem Perkin-Elmer 241- Polarimeter gemessen. Alle Lösungsmittel wurden in einem Büchi-Rotationsverdampfer in einem Wasserbad bei 40ºC entfernt oder abgezogen.
Die Aminosäureanalysen der Zielverbindungen wurden in einer Biotronik LC 5001-Vorrichtung durchgeführt. Die Proben wurden in Salzsäurelösung mit einer 6-molaren Konzentration bei 110ºC 24 Stunden hydrolysiert. Die Analyseergebnisse lagen in allen Fällen innerhalb einer Fehlermarge von ±5 %.
Die Ausgangsverbindungen der Synthesen sind in der Literatur allgemein bekannt.

BEISPIEL 1

Herstellung von Arg-Sar-Asp-Val (Verfahren "A")

1,68 ml (12,0 mmol) Triethylamin werden zu einer 2,58 g (12,0 mmol) H-Val-OtBu.HCl- und 4,62 g (11,0 mmol) Z-Asp(OtBu)-OSu-haltigen Suspension in 25 ml Diethylformamid (DMF) gegeben. Man läßt die Reaktionsmischung über Nacht stehen, verdampft dann unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird mit 50 ml Ethylacetat vermischt, und die erhaltene Suspension wird der Reihe nach mit 25 ml Wasser drei mal mit 25 ml von jeweils 1 mol/l Salzsäure, drei mal mit 25 ml 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und abschließend mit 225 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck unter Erhalt von 4,3 g (81,7 %) von öligem Z-Asp(OtBu)-Val-OtBu-geschütztem Dipeptid, Rf¹ = 0,85, eingedampft.
4,07 g (8,5 mmol) des obigen geschützten Dipeptids werden in 40 ml Methanol gelöst und unter Durchblasen von Wasserstoff durch die Lösung in Gegenwart von 1,0 g Palladium-auf-Kohle unter Rühren hydriert. Die Hydrierung ist innerhalb 2 Stunden abgeschlossen. Dann wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand wird in 50 ml Ether gelöst, und der pH wird auf 4 durch Zugabe von Salzsäurelösung in Dioxan mit einer Konzentration von 6 mol/l eingestellt. Das Präzipitat wird unter Erhalt von 3,2 g (91,5 %) H-Asp(OtBu)- Val-OtBu.HCl, das frei von Dipeptidhydrochlorid ist, abfiltriert, Schmelzpunkt: 187 - 189ºC, Rf² = 0,40.
3,0 g (10,0 mmol) Z-Sar-OSu und 3,05 g (8,0 mmol) H-Asp(OtBu)-Val- OtBu.HCl in 30 ml DMF werden in Gegenwart von 1,40 ml (10,0 mmol) Triethylamin umgesetzt. Am nächsten Tag wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand wird in 50 ml Ethylacetat gelöst, und die erhaltene Suspension wird der Reihe nach mit 20 ml Wasser, zwei mal mit 20 ml 1 mol/l Salzsäure, zwei mal mit 20 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.
Das erhaltene ölige geschützte Z-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu-Tripeptid in einer Ausbeute von 4,2 g (7,6 mmol) (Rf¹ = 0,75) wird in 40 ml Methanol gelöst, und nach Zugabe von 0,8 g Palladium-auf-Kohle-Katalysator wird die Mischung in üblicher Weise hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators werden 1,0 g (8,0 mmol) Oxalsäuredihydrat zum Filtrat zugegeben, die Lösung wird verdampft, und der Rückstand durch Zugabe von Ether unter Erhalt von 2,24 g H-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu.Oxalat (freies Tripeptidoxalat) verfestigt, Schmelzpunkt: 190 - 192ºC, Rf³ - 0,30.
Eine Lösung von 1,14 g (3,5 mmol) Boc-Arg(HCl)-OH.H&sub2;O in 10 ml DMF wird auf -10ºC gekühlt, worauf 0,55 ml (4 mmol) Isobutylchlorformiat und dann eine Lösung von 0,44 ml (4 mmol) N-Methylmorpholin, gelöst in 5 ml DMF, bei der gleichen Temperatur zugegeben werden. Das erhaltene gemischte Anhydrid wird bei -10ºC 10 Minuten gerührt, anschließend wird eine Lösung von 1,5 g (3 mmol) des obigen freien Tripeptidoxalats und 0,84 ml (6 mmol) Triethylamin in 5 ml DMF bei der gleichen Temperatur zugegeben. Man läßt die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmen und läßt sie über Nacht stehen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgezogen, der Rückstand in 50 ml Chloroform gelöst, und diese Lösung wird drei mal mit 20 ml Salzsäure, dann mit 20 ml Wasser gewaschen, und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der ölige Rückstand wird durch Zugabe von Ether verfestigt und die Suspension wird filtriert unter Erhalt von 1,30 g (66 %) amorphen Boc-Arg(-Cl)-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu, Rf³ = 0,18, Rf&sup4; = 0,24; /α/²&sup0;D = -37,0º (C=1, Methanol).
1,20 g (1,8 mmol) des oben erhaltenen geschützten Tetrapeptids werden mit Trifluoressigsäure bei 40ºC für 2 Stunden behandelt, anschließend wird die Mischung durch Zugabe von 60 ml Ether verdünnt, die Suspension wird filtriert und das Präzitpitat wird mit Ether gewaschen. Nach Lösen des Trifluoressigsäuresalzes in 10 ml Wasser werden die Trifuoressigsäureionen durch Acetationen mittels 5 ml Anionen-Austauscherharz vom Acetatzyklus (DOWEX 2 x 8) ersetzt. Nach Eindampfen der Lösung unter vermindertem Druck wird der Rückstand verfestigt durch Zugabe von 5 ml 90%igen wäßrigen Ethanols unter Erhalt von 0,6 g amorphen Arg-Sar-Asp-Val; /α/²&sup0;D= -32,3º (c=1, 10 %ige Essigsäure).
Aminosäureanalyse: Asp 1,03 (1), Val 0,97 (1), Arg 1,00 (1)

BEISPIEL 2

Herstellung von Lys-Glu-Thr (Verfahren "B")

Nach Suspendierung 3,3 g (11,0 mmol) H-Thr(tBu)-OtBu.Oxalat in 60 ml Ether wird die Suspension mit 30 ml 5%iger wäßriger Kaliumhydrogencarbonatlösung bis zur Auflösung geschüttelt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit zusätzlichen 20 ml 5%ige wäßrige Kaliumhydrogencarbonatlösung und dann mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Zur Lösung des öligen Rückstands in 20 ml DMF werden 4,12 g (9,5 mmol) Z-Glu(OtBu)-Osu zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Ethylacetat gelöst und der Reihe nach drei mal mit 15 ml 10%iger wäßriger Zitronensäurelösung, zwei mal mit 15 ml 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit 15 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. 4,4 g (8,0 mmol) von geschütztem öligem Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-OtBu-Dipeptid (Rf¹ = 0,85) werden erhalten, das in 50 ml Methanol gelöst wird, und wie in Beispiel 1 beschrieben hydriert wird. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter Gewinnung des freien H-Glu(Ot-Bu)-Thr(tBu)- OtBu-Dipeptids (Rf² = 0,22) eingedampft, welches anschließend in 20 ml DMF gelöst wird, und nach Zugabe von 4,77 g (10 mmol) Z-Lys(Boc)-OSu wird die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Lösen des öligen Rückstands in 50 ml Ethylacetat wird die Lösung über mehrere Schritte in üblicher Weise gereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Der ölige Verdampfungsrückstand wird aus Ether unter Gewinnung von 4,75 g (74 %) von Z-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-OtBu-geschütztem Tripeptid umkristallisiert, Schmelzpunkt 114 - 115ºC; Rf² = 0,80; /g/²&sup0;D = -22,8º (c=1, Methanol).
4,4 g (5,6 mmol) des obigen geschützten Tripeptids werden in 40 ml Methanol gelöst und katalytisch wie in Beispiel 1 beschrieben hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft, und der ölige Rückstand wird in 40 ml Chlorwasserstoff- Dioxanlösung mit einer Konzentration von 6 mol/l gelöst. Nach 15 Minuten tritt ein Präzipitat auf. Nach einer Stunde wird die Suspension mit 100 ml Ether verdünnt, filtriert und das Filtrat wird mit Ether unter Erhalt von 2,3 g (91 %) amorphen Lys-Glu-Thr.2HCl-Tripeptiddihydrochlorid gewaschen, Schmelzpunkt: 213 - 215ºC (unter Zersetzung); /α/²&sup0;D = +2,7º (c=1, 1,1 % Essigsäure).
Nach Lösen des obigen Lys-Glu-Thr.2HCl-Tripeptiddihydrochlorids in 20 ml Wasser werden die Chloridionen durch Acetationen auf einem Harz aus Acetatzyklus (DONEX 2 x 8) ersetzt, anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft, und der Rückstand wird durch Zugabe von Ethanol verfestigt. Auf diese Weise werden 2,27 g amorphen Lys-Glu-Thr- Acetats erhalten; /α/²&sup0;D = +3,5º (c=1, 10 % Essigsäure). Aminosäureanalyse: Glu 1,01 (1), Thr 1,00 (1), Lys 1,00 (1).

BEISPIEL 3

Herstellung von Lys-His-Leu-NH&sub2;-Acetat (Verfahren "C")

Zu einer Lösung von 2,42 g (10 mmol) His.OMe.2HCl in 30 ml DMF werden 2,8 ml (20 mmol) Triethylamin und dann 5,6 g (11 mol) Z-Lys(Z)-OSu zugegeben. Am nächsten Tag wird die Reaktionsmischung eingedampft, der ölige Rückstand wird in 45 ml Chloroform gelöst, die Lösung wird zwei mal mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Verfestigung des öligen Rückstandes durch Zugabe von Ethylacetat werden 4,54 g (80 %) Z-Lys(Z)-His-OMe erhalten, Schmelzpunkt:
135 - 136ºC, Rf³ = 0,45.
4,0 g (7 mmol) des oben erhaltenen geschützten Dipeptidesters werden in 40 ml warmen Methanol gelöst, und es werden 4 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 3 Tage stehengelassen, dann auf die Hälfte ihres Volumens unter vermindertem Druck eingedampft und mit 50 ml Ether verdünnt. Das amorphe Präzipitat wird filtriert und mit Ether unter Erhalt von 3,70 g Z-Lys(H)-His-N&sub2;H&sub3;-geschütztem Dipeptidhydrazid filtriert, Schmelzpunkt 150 -153ºC; Rf³ = 0,20.
Eine 3,65 g (6,0 mmol) des obigen Z-Lys(Z)-His-N&sub2;H&sub3; in 15 ml DMF-haltige Lösung wird auf -10ºC gekühlt, und es werden 2,5 ml Chlorwasserstoff in Dioxan mit einer Konzentration von 7 mol/l und anschließend 0,75 ml (6,6 mmol) teritär-Butylnitrit in 4 ml DMF bei der gleichen Temperatur zugetropft. Nach Rühren der Reaktionsmischung bei -10ºC für 20 Minuten werden 2,0 ml Triethylamin zugegeben, und anschließend wird eine Lösung von 1,33 g (7 mmol) Leu-NH&sub2;-Acetat und 1 ml Triethylamin in 10 ml DMF zugetropft. Die Mischung wird dann bei 0ºC 30 Minuten gerührt, und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck verdampft, und der Rückstand wird in Wasser suspendiert. 3,7 g Rohprodukt werden erhalten, das aus 30 ml Isopropanol unter Erhalt von 2 g (65 %) Z-Lys(Z)-His-Leu-NH&sub2; umkristallisiert wird, Schmelzpunkt: 110 - 113ºC, Rf&sup4; = 0,30; /α/²&sup0;D = -20,1º (c=1, Methanol).
1,2 g (1,8 mmol) oben erhaltenes geschütztes Tripeptid wurden in 20 ml einer 5:1:2-Mischung von Methanol/Wasser/Essigsäure gelöst und wie in Beispiel 1 beschrieben katalytisch hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck verdampft. Nach Zugabe von Ethanol zum Rückstand und Eindampfen wird der Rückstand mit Ether unter Erhalt von 0,75 g von amorphem hygroskopischen Lys-His-Leu-NH²-Acetat trituriert; /α/²&sup0;D = -5,7º (c=1, in 1 mol/l Essigsäure). Aminosäureanalyse: Leu 0,95 (1), His 1,03 (1), Lys 1,04 (1).
Die in Tabelle 5 gezeigten geschützten Peptidderivate und die in Tabelle 6 angegebenen erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in analoger Weise gemäß den in den Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellt. TABELLE 5 Geschutzte Peptide, Hergestellt gemäß den obigen Beispielen, Herstellungsverfahren und physikalische Eigenschaften Geschutztes Peptid Verfahren Rf (Mischung) TABELLE 6 Erfindungsgemäße Verbindungen, hergestellt gemäß den obigen Beispielen, und ihre physikalischen Eigenschaften Zielverbindung Rf (Mischung) Essigsäure (Stock-Lösung)

Claims

Peptide mit den Formeln (1) bis (20)

Arg-Lys(Chc)-Asp-Val (1)

Arg-Lys(Chc)-Asp (2)

Arg-Sar-Asp-Val (3)

Qrn-Lys-Asp-Val (5)

Orn-Lys-Asp (6)

Arg-Lys-Aad-Val (7)

Arg-Lys-Aad (8)

[Arg-Lys-Asp-NH-CH&sub2;-] (9)

Arg-Lys-Asp-Val-NH- H&sub2; (10)

Arg-Lys-Asp-NH- H&sub2;

[Arg-Lys-Asp-V l-NH-CH&sub2;-]&sub2; (11)

[Arg-Lys-Asp-C s-NH&sub2;]&sub2; (12)

Ser-Ser-Ser-Thr (15)

Lys-Glu-Thr (16)

Lys-Lys-Thr-Glu (19)

Lys-His-Leu-NH2 (20)

und Säureadditionssalze davon.
2. Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden gemäß Anspruch 1 und deren Säureadditionssalzen, mit Ausnahme derjenigen der Formeln (9) bis (12) und ihrer Säureadditionssalze, welches umfaßt sukzessives Kettenverlängern in Lösung durch sukzessive Abfolge von Kopplungsschritten nach einem aktiven Ester-, einem gemischten Anhydrid- und/oder einem Azidverfahren und nachfolgender Entfernung der Schutzgruppe der α- und/oder &epsi;-Aminogruppe(n), wodurch ausgehend von

(a&sub1;) Aminosäurederivaten, die eine Carboxygruppe enthalten, die mit einer durch Hydrierung oder Acidolyse entfernbaren Schutzgruppe verestert ist, und die gegebenenfalls eine geschützte Seitenkettenhydroxyl- und/oder Aminogruppe und/oder eine C-terminale Carboxygruppe enthält, die mit einer durch Hydrierung entfernbaren Schutzgruppe aminiert oder verestert ist,

Derivate der Peptide mit den Formeln (1) bis (8) und (15) bis (20) gebildet werden, die an ihrer C-terminalen Carboxygruppe, die mit einer durch Hydrierung oder Acidolyse entfernbaren Schutzgruppe geschützt ist, unter Anwendung der oben beschriebenen Kopplungsschritte aminiert, acyliert oder verestert sind; und die an ihrer anderen Carboxylgruppe mit einer durch Hydrierung oder Acidolyse entfernbaren Schutzgruppe verestert sind, und die auch Schutzgruppen Boc oder Z an ihren Aminogruppen tragen, die nicht an der Peptidverknüpfung beteiligt sind, und/oder an ihrer Hydroxylgruppe geschützt sind;

(b) anschließendes Entfernen der vorhandenen Schutzgruppen durch katalytische Hydrierung und/oder Säurebehandlung; und

(c) gegebenenfalls Umwandeln der freien Peptide mit den Formeln (1) bis (8) und (15) bis (20) in ihre Säureadditionssalze durch Behandlung mit einer geeigneten Säure; und/oder

(d) gegebenenfalls Freisetzen der freien Peptide mit den Formeln (1) bis (8) und (15) bis (20), die in Form ihrer Salze erhalten werden, und/oder Umwandlung in andere Salze, wobei diese mit anderen Säuren gebildet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Peptiden der Formeln (9) bis (12) wie in Anspruch 1 definiert, und ihrer Säureadditionssalze, mit der Maßgabe, daß das in Abschnitt (a&sub1;) von Anspruch 2 verwendete Ausgangsmaterial entweder 1,2-Diaminoethan, sein Mono-L-Valinderivat oder L-Cystindiamid ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, welches die Verwendung von geschützten Aminosäurederivaten, enthaltend eine durch eine tertiäre Butylgruppe veresterte Carboxylgruppe enthält, umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, welches die Verwendung von durch eine Boc-Gruppe an der Aminogruppe acetylierten geschützten Aminosäurederivaten enthält, umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, welches die Verwendung von durch eine Z-Gruppe an der Aminogruppe acetylierten geschützten Aminosäurederivaten umfaßt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, welches die Verwendung von durch eine tertiäre Butylgruppe an der Hydroxylgruppe geschützten Aminosäurederivaten umfaßt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7 zur Herstellung von Peptiden der Formel (1) bis (3) und (7) bis (12) wie in Anspruch 1 definiert, das die Verwendung eines durch Chlorwasserstoff an seiner Guanidinogruppe geschützten Argininderivats umfaßt.
9. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welches das Vermischen eines oder mehrerer der Peptide der Formeln (1) bis (20) wie in Anspruch 1 definiert oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon als Wirkstoff in einer therapeutisch wirksamen Dosis mit einer oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Verdünnern, Füllstoffen, Stabilisatoren, pH- und den osmotischen Druck beeinflussenden Mitteln, wie sie in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, umfaßt.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche als Wirkstoff ein oder mehrere Peptide der Formeln (1) bis (20) wie in Anspruch 1 definiert oder ein Säureadditionssalz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Verdünnern, Füllstoffen, Stabilisatoren, pH- und osmotischen druckbeeinflussenden Mitteln, wie sie in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, umfaßt.
11. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1 oder ihrer Säureadditionssalze bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung der Reifung von T-Lymphocyten und der Aktivität von Makrophagen.