HU201964B

HU201964B - Process for producing peptides inhibiting maturation of t-lymphocytes and activity of macrophages, as well as pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU201964B
Application number: HU89116A
Authority: HU
Inventors: Gyoergyne Nyeki; Istvan Schoen; Lajos Kisfaludy; Laszlo Denes; Gyoergy Hajos; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1989-01-13
Publication date: 1991-01-28
Also published as: CN1044102A; HUT53123A; EP0378432A2; EP0378432B1; DE69018275T2; CN1031344C; CA2008438A1; DK0378432T3; ES2071004T3; IL93107A; DE69018275D1; JPH02270895A; EP0378432A3; AU4792290A; IL93107A0; ATE120758T1; US5093320A; AU632526B2

Description

A leírás terjedelme: 8 oldal, ábra nélkül (12) [H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH2]2 (13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH (14) H-Ser-Lys-Leu-OH (15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH (16) H-Lys-Glu-Thr-OH (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH (20) H-Lys-His-Leu-NH₂ képletű új peptidek és savaddíciós sóik, valamint az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás képezi.

HU 201 964 B

-1HU 201964 Β

A találmány tárgya a T-limfociták és a makrofágok aktivitását gátló, (1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH (2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH (4) H-Arg-Sar-Asp-OH (5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH (6) H-Om-Lys-Asp-OH (7) H-Arg-Lys-Aad-Val-OH (8) H-Arg-Lys-Aad-OH (9) -[H-Arg-Lys-Ap-NH-CH₂-]₂

H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂ (11) [H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-]2 (12) [H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂]₂ (13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH (14) H-Ser-Lys-Leu-OH (15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH (16) H-Lys-Glu-Thr-OH (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH (20) H-Lys-His-Leu-NH₂ képletű új peptidek és savaddiciós sóik, valamint az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás képezi.

Egészséges szervezetben az immunrendszer kiegyensúlyozott működése erős védekezési mechanizmust tart fenn, mely képes a behatoló mikroorganizmusokat, idegen anyagokat és daganatsejteket elpusztítani és a szervezetből eltávolítani, miközben a saját egészséges sejtjeit nem károsítja.

Ha az immunrendszer csökkent aktivitással (szuboptimálisan) működik, a fertőző idegen vagy rákos sejtek elszaporodhatnak, és ez végső soron a gazdaszervezet működésének teljes felbomlásához vezet. Viszont túlfokozott immunrekciókban nemcsak a behatoló idegen sejtek pusztulnak el, hanem egészséges szövetek is károsodhatnak (azutoimmun és allergiás betegségek). Szervátültetéskor például a szervezet természetes védekezési reakciója a beültetett szövet vagy szerv kilökődéséhez vezet.

Az immunválasz megindításában, fenntartásában és felfüggesztésében kulcsszerepet játszanak a timuszeredetű limfociták, az úgynevezett T-sejtek. Ismeretes, hogy az élő szervezetben az immunrendszer működését számos peptid és fehérje befolyásolja információtovábbítás révén. A timuszhormonokat és az immunsejtek által termelt információközvetítő faktorokat (citokineket) széles körben kipróbálták daganatos is immunbetegségek kezelésére [Drugs of the Future, 11, 783. (1986)/; Drugs Exp. Clyn. Rés. 13,327 (1987)]. Ezek közé tartozik az úgynevezett timozin 5. frakció, a borjú timusz részben tisztított kivonata, mely az ismert timuszhormonokat tartalmazza [Cancer Immunoi. Immunther., 18,185. (1984)]. Rákos megbetegedések kezelésében kedvező eredményeket kaptak géntechnológiával készült citokinekkel [N. Engl. J. Med. 575,1485. (1985)].

A gyógyszerkészítményekkel szemben egyre szigorúbb minőségi követelményeket támasztanak. Ha a szervkivonatok és bioszintetikus makromole2 kulák nincsenek homogenitásig megtisztítva, a szennyezések nem kívánatos mellékhatásokat okozhatnak. Ez a magyr ázata annak, hogy a gyógyászatban mindenütt a pontos szerkezetű és nagy tisztaságú készítmények alkalmazására törekszenek. Az előzőekben említett nagy molekulák immunstimuláló hatását kisebb peptidekkel is sikerült kiváltani (4, 190,646, 4,215,112, 4,232, 008, 4,261,886, 4,395,404 és 4,442,031 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; 2 938 420,3 001775 és 3 100 974 számú német szövetségi köztársasági szabadalmi leírások, 185 263 és 198 088 számú magyar szabadalmi leírás).

A fenti iratokban leírt rövid peptidek megindítják a T- és B-sejtek proliferációját, és általános immunstimuláló hatással rendelkeznek. Ahhoz, hogy a természetes immunszabályozó anyagok teljes hatásspektrumát reprodukálni tudjuk, olyan anyagokra is szükség van, melyek az ismert immunstimulátoroktól eltérő módon az általános immunreakció különböző szakaszaiban fejtik ki hatásukat.

Jelen találmány tárgyát képező peptidek általános gátló hatást fejtenek ki az immunrendszer működésére, különösen a T-sejtek érését és a makrofágok aktivitását gátolják. Ez a hatás lehetővé teszi a peptidek alkalmazását az immunrendszer fokozott működésére visszavezethető kórképek kezelésére. A gyógyászatban jelenleg alkalmazott immunszuppresszív gyógyszerek {ciklofoszfamid -[bisz(2klór-etil)-amino]-tetrahidro-2H-l,3,2-oxazafoszf orin-2-oxid, azatiprin -(l-metil-4-nitro-imidazol-5il-tio)-purin, kortikoszterodidok, cikloszporin] terápiás indexe tíznél kisebb, azaz a terápiás és mérgező dózis nem tér el jelentősen egymástól, ezért csak szigorú orvosi ellenőrzés mellett alkalmazhatók.

Az immunszuppresszív hatású peptidek különös előnyének tekinthető, hogy a szervezetben gyorsan elbomlanak, nem halmozódnak fel a szövetekben és sejtekben, de rövid élettartamuk alatt is képesek elindítani jelentős hatáshoz vezető összetett folyamatokat. Toxicitásuk jellemzően kicsi (LD50 1000 mg/kg i.v.).

Az találtuk, hogy az (1)-(20) képletű új peptidek gátolják a T-sej-függő ellenanyag-termelő sejtek érését, csökkentik az ellenanyag-termelő sejtek aktivitását újszülött egerekben, gátolják a fagocitózist, és csökkentik a késői típusú túlérzékenységi reakciót. A peptidek gátló hatásainak az a sajátossága, hgoy az immunfolyamatokban feltehetően gátolják a makrofágok antigén prezentációját és/vagy a T-sejtek antigén felismerését. Tulajdonképpen ezek a folyamatok és kölcsönhatások indítják meg az immunválasz összetett mechanizmusát, így e peptidek immunszuppressziója feltehetően az immunreakció kezdeti szakaszában érvényesül.

A találmány szerint az (11)-(20) képletű új peptideket oldatban, lépésenkénti lánchosszabbítással úgy állítjuk elő, hogy aktív észteres, vegyes anhidrides és/vagy azidos kapcsolási és a- és/vagy ε-aminocsoport-felszabadítási lépések egymást követő alkalmazásával hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett karboxilcsoportot, adott esetben védett oldalláncbelihidro-2HU 201964 Β xil- és/vagy amino-csoportot és/vagy hidrogénezéssel eltávolítható csoporttal észterezett vagy amidált C-terminális karboxil-csoportot tartalmazó aminosav-származékból, illetve 1,2-diamino-etánból, ennek mono-L-valin-származékából vagy L-cisztindiamidból kiindulva az (1)-(20) képletű peptidek C-terminális karboxil-csoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észerezett vagy amidált, egyéb karboxil-csoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett, a peptidkötésben részt nem vevő amino-csoportokon Boc- vagy Z-védőcsoportot hordozó és/vagy a hidroxil-csoporton védett származékait állítjuk eló, majd a jelenlevő védőcsoportokat katalitikus hidrogénezéssel és/vagy savas kezeléssel eltávolítjuk, és kívánt esetben a kapott (1)-(20) képletű peptldeket savakkal reagáltatva savaddíciós sókká alakítjuk és/vagy a sók formájában kapott (1)-(20) képletű peptideket kívánt esetben sóikból felszabadítjuk é,sj\a,gj valamely más savval alkotott sóvá alakítjuk.

Egyes esetekben a szintézis során olyan védőcsoport-kombinációt alkalmazunk, mely lehetővé teszi az amino-csoport védőcsoportjának szelektív eltávolítását, majd a szintézis végén az összes védőcsoport egy vagy két lépésben történő lehasítását. A peptidkötés kialakítására előnyösen az N-hídroxiszukcinimidészteres [Wünsch: Synthese von Pepiiden, 2. kötet, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974., 149. oldal], a 168 431 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett pentafluor-fenilészteres, vagy a 183 579 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett vegyes anhidrides módszert alkalmazhatjuk.

A dimer típusú (9)-(12) képletű vegyületek esetében a szintézisek kiindulási anyaga az 1,2-diamino-etán, ennek mono-L-valin-származéka vagy az L-ciszint-diamid. Ezek egy móljára számítva mintegy 2 mól acilező aminosav-származékot használunk a lépésenkénti lánchosszabbítás során (a pontos mólarány attól függ, melyik reakciópartnert célszerű feleslegben alkalmazni). Értelemszerűen a (9), a (11) és a (12) képletű vegyületek szintézisének minden egyes közti terméke szimmetrikus vegyület, a (10) képletúé viszont aszimmetrikus.

Az amino-csoportok védelmére a Boc- vagy a Z-csoportot, a karboxil-csoportok védelmére a terc-butil, a benzil- vagy a 4-nitro-benzilészter-csoportot használjuk.

A fenti módon szintetizált védett peptidról a szintézist követően eltávolítjuk az adott esetben rajta levő védőcsoportokat, majd a szabad pepiidet kívánt esetben savakkal kezelve savaddíciós sót képezünk. A védőcsoportok eltávolítására katalitikus hidrogénezést vagy savas kezelést használunk. A kapott peptidek általában gyógyászati felhasználásra alkalmas tisztaságúak, nem igényelnek további tisztítást. Szükséges esetben azonban például szilikagél tölteten oszlopkromatográfiával tisztíthatók. Az oldat formájában kapott peptideket az oldat bepárlásával vagy liofilezéssel nyerhetjük ki az oldatból. A szabad pepiidet tetszőleges sóvá alakíthatjuk. A végtermékek tisztaságát analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiásán ellenőrizzük.

A célvegyületek immunrendszerre gyakorolt hatását a következő tesztekben vizsgáltuk.

1. Az ellenanyag-termelő sejtekre gyakorolt hatás újszülött patkányban

Az ellenanyag-termelő sejtekre gyakorolt hatást újszülött patkányokból nyert lépsejtekkel végeztük Canningham módszere szerint (Handbook of Experimental Immunology, 2. kötet, Blackwell, Oxford-London, 1978., 285. oldal). 12 darab egy alomból származó Wistar (LATI) patkányt a születésük után 12 órán belül 7,5 μg vizsgálandó anyaggal kezelünk intraperitoneálisan (1 mg/kg dózisban). Az állatokat 14 napos korukban 0,5 ml 1%-os birka vörösvértest-szuszpenzióval immunizáljuk intraperitoneálisan, majd az ezt követő 7. napon az állatokat dekapitációval elvéreztetjük. Az állatokból kinyert lépsejtekből birka vörösvértest-szuszpenzióval és komplementtel homogén szuszpenziót készítünk, és ezt egysejtréteg kialakítására alkalmas kamrába helyezzük. A paraffinnal lezárt kamrákat 45 percig 37 ’C-on inkubáljuk. Az ellenanyagot termelő lépsejtek körül plakkok, úgynevezett litikus udvarok képződnek. A gátló anyagokkal való kezelés hatására a plakk-képző sejtek (PFC) száma csökken. Az 1. táblázatban közölt adatok ezt a csökkenést adják meg százalékban kifejezve a nem kezelt kontroll állatokból kinyert sejtekhez képest. Ugyanilyen körülmények között az immunstimuláló peptidek jelentősen növelik a plakk-képző sejtek számát.

2. Az elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt hatás vizsgálata újszülött patkányban

A vizsgálat az agglutináció jelenségén alapszik. Egy specifikus antisavó az antigén felszínéhez tapadva nagy granulákat képez, és ezek gyorsan leülepszenek (agglutinálódnak).

Újszülött Wistar (LATI) patkányokat a születésük után 12 órán belül a vizsgálandó anyaggal kezelünk intraperitoneálisan 1 mg/kg dózissal. A

14. napon az állatokat 0,5 ml 1%-os birka vörösvértest-szuszpenzióval immunizáljuk intrapcritoneálisan. Az immunizálást követő 7. napon retroorbitálisan vért veszünk, és 30 perc után a savókat centrifugálással leválasztjuk, majd Takátsy módszerével [Acta Microbiol.Acad.Sci.Hung., 3, 191. (1955)] meghatározzuk a hemagglutinációs titert. Két patkány összekevert savójából (50 μΐ) felező hígításokat készítünk 12 lépésben. Minden egyes mintához egységesen 25 μΐ 2%-os birka vörösvértest-szuszpenziót adunk. Az elegyet 1 órán keresztül 37 ’C-on inkubáljuk az agglutináció értékeléséhez. A 2. táblázatban foglaljuk össze a kapott adatokat, melyek a nem kezelt állatokhoz képest mutatják a vegyületek elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt gátló hatását százalékban kifejezve. Ebben a tesztben az immunstimuláló anyagok éppen ellentétes hatásúak.

3. A nyugvó makrofágsejtek fagocitáló képességénekgátlása

Nyugvó makrofág sejtek fagocitáló képességét egéren vizsgáltuk meg [J. Immunopharmacol., 4, 265. (1982-1983)]. 22-28 g-os hím CFLP (LATI)

-3HU 201964 Β

2. táblázat egereket hét napon át naponta kezelünk szubkután 1 mg/kg dózisban adott vizsgálandó anyaggal. Ezután az állatokat elvéreztetjük, majd 8 ml, 10 NE heparint tartalmazó, 7,2-es pH-jú PBS puffer-oldattal kimossuk a peritóneumot. Desztillált vizes sokkolással a peritóneumból kimosott sejtszuszpenziót vörösvértest-mentesítjük, majd PBS puffer-oldattal háromszor mossuk. Közben 1000/min fordulatszámon 5 perces centrifugálással ülepítünk. Az egyes sejtszuszpenziók koncentrációját 10^ö sejt/ml értékre állítjuk, és 37 ’C-on 30 percen keresztül ülepítjük a szuszpenziókat 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában Boyden-kamrában. Az üvegfelületre kitapadt makrofágok fölé opszonizált élesztőt rétegezünk. A nem fogocitált részecskék eltávolítása után sejtenként megszámoljuk a bekebelezett részecskéket. A 3. táblázat a nem kezelt állatokból izolált makrofág kontrolihoz képest ftdja meg a fagocitált élesztősejtek számának %-os csökkenését.

4. A késői típusú túlérzékenységi (DTH) reakcióra gyakorolt hatás

A vizsgálatokat 25-30 g-os hím CFLP (LATI) egerekkel végezzük. A vizsgálat kezdetén az egereket vízmentes etanolban oldott 3%-os oxazolon-oldattal kezeljük úgy, hogy 20-20 μ.1 oldatot viszünk fel az egér mindkét fülére és mellső talpára. A kezelés utáni 7. napon az állatokat intraperitoneálisan 1 mg/kg dózisban kezeljük a vegyületekkel, melyeket fiziológiás nátrium-klorid-oldatban oldunk. A kontroll állatokat csak ezzel az oldattal kezeljük. A vizsgálat 10. napján az állatok füleire 20-20 μΐ 2,5%-os olivaolajos oxazolon-oldatot kenünk, és az állatok fülének vastagságát kétszer megmérjük: az antigén adása előtt és 24 órával ezután. A vastagságot mindkét fülön, a fülcimpák közepén mérjük 0,01 mm-es pontossággal. A változást a kontrollcsoporthoz hasonlítjuk. A 4. táblázat a DTH reakció kifejlődésének gátlását adja meg %bán kifejezve.

1. táblázat

Az ellenanyag-termelés gátlása %-ban

Peptid	változás (%)
(1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH	-14,4
(2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH	-27,1
(3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH	-25,5
(4) H-Arg-Sar-Asp-OH	-21,5
(5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH	-19,5
(8) H-Arg-Lys-Aad-OH	-10,6
(10) H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂	-22,4
H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂
(11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-)2	-21,2
(16) H-Lys-Glu-Thr-OH	-36,8
(17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH	-23,2
(18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH	-19,4
(10) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH	-22,9
(20) H-Lys-His-Leu-NH₂	-25,3
A H-Arg-Lys-Asp-OH	+ 68.6
B H-Arg-Lys-Asp-Val-OH	+ 58,0
C H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH	+ 46,9

Az elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt gát-

lás%-ban
Peptid változás a keletien kontrolihoz (%)
(3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH (4) H-Arg-Sar-Asp-OH (11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-)₂ (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂)₂(19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH A H-Arg-Lys-Asp-OH B H-Arg-Lys-Asp-Val-OH C H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH	-17,9 -10,7 -14,9 -10,7 -10,8 + 13,7 + 28,1 + 41,3
3. táblázat Nyugvó makrofágok fagocitáló képességének változása
Peptid Változás % (%)
(1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH (2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH (4) H-Arg-Sar-Asp-OH (7) H-Arg-Lys-Aad-Val-OH (8) H-Arg-Lys-Aad-OH (9) (H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂-)₂ (11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-)₂ (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂)₂(14) H-Ser-Lys-Leu-OH (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH (20) H-Lys-His-Leu-NH₂ Ciklofoszfamid 150 mg/kg i.p. dózisban	-11,2 -47,3 -10,5 -22,7 -28,7 -29,1 -11,6 -16,5 -40,1 -14,0 -17,5 -11,7 -18,6 -39,6 -75,0
4. táblázat
A DTH reakció kiváltásának gátlása %-ban
Peptid	Gátlás (%)
(I) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH (5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH (6) H-Orn-Lys-Asp-OH (8) H-Arg-Lys-Aad-OH (II) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-)₂ (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂)₂ (13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH (14) H-Ser-Lys-Leu-OH (15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH (16) H-Lys-Glu-Thr-OH (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH	39.1 28.3 39.6 36,8 27,0 35.3 28.2 22.7 18,0 27.5 35.5

ék fenti táblázatokban összehasonlítás céljából megadott „A”, „B” és „C” jelű peptidek a következő anterioritásokból ismertek: „A” és „B”: 185 263 számú magyar szabadalmi leírás; „C”: 4,190,646 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

-4HU 201964 Β

A találmány szerinti vegyületeket, valamint azok savaddíciós sóit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban mindenütt, ahol az immunrendszeraktivitásának csökkentésére van szükség. Az (1)-(20) képletű peptidek önmagukban vagy sóik alakjában, célszerűen a gyógyászatban szokásos kikészítési formában kerülnek felhasználásra. Ezek a kikészítési formák (gyógyszerek) szilárd vagy folyékony halmazállapotúak lehetnek, és előállításuknál az ilyen készítmények gyártására szokásos töltő, hígító, stabilizáció fokozó, pH- és ozmózisnyomás-befolyásoló, valamint a formulálást megkönnyítő, illetve lehetővé tevő adalék és segédanyagokat használunk.

A leírásban alkalmazott rövidítések megfelelnek a szakirodalomban [BiochemJ., 219, 345. (1984)] általánosan elfogadottaknak. Minden aminosavcsoport „L”-konfigurációjú. A Che ciklohexü-karbamoil-, az Aad L-a-amino-adipoü-csoportot jelent. Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoliféle készülékben (Büchi, Svájc) történtek. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat előregyártott kovasavgél adszorbensen (DC-Fertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószer-elegyekben (a megadott arányok térfogatokra vonatkoznak):

(A törzsoldat 6:20:11 arányú piridin-ecetsav-víz elegy.)

1.19:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy

2.9:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy

3.4:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy

4.7:3 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy

5.3:7 arányú n-butanol-törzsoldat elegy

6.1:4 arányú n-butanol-törzsoldat elegy

7. 1:1:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-etil-acetátvíz elegy.

A kromatogramokat ninhidrinnel, majd klórozást követően kálium-jodid/tolifin reagenssel hívtuk elő. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Labor MIM OE975 típusú, változtatható hullámhosszú UV detektorral, Altex pumpával, valamint KUTESZ 175 típusú rekorderrel végeztük. Az elválasztáshoz 10 μ,ιη szemcseméretű, 18 szénatomos alkil-csoportokkal alkilezett szilikagél állófázisú, 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet (Labor MIM) használtunk. Elúcióra a következő elegyeket használtuk:

A. 25 ml metanol és 75 ml, 0,5 térfogatszázalék trifluor-ecetsavat tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú vizes nátrium-szulfát-oldat elegye;

B. 1,5:1,0:97,5 arányú acetonitrü/trifluor-ecetsav/desztülált víz elegy.

A mérést 1 ml/min áramlási sebességgel végeztük 215 nm-en detektálva az oldat fényelnyelését. A kromatogramok kiértékelését területnormalizációval végeztük.

A célvegyületek tisztasága mind nagynyomású folyadékkromatográfiás, mind vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel mérve meghaladta a 95%ot.

A fajlagos optikai forgatóképességet Perkin-Elmer 241 típusú polariméterrel határoztuk meg. Valamennyi oldószer-eltávolítási, illetve bepárlási Büchi-féle rotációs vákuum-bepárlón végeztünk °C-os vízfürdőn.

A célvegyületek aminosavanalízisét Biotronik LC 5001 típusú készülékben határoztuk meg. A mintákat 6 mól/1 koncentrációjú sósav-oldatban 110 °C-on hidrolizáltuk 24 órán keresztül. Az analízis értékei minden esetben a ± 5% hibahatáron belül voltak.

A szintézisek kiindulási anyagai az irodalomból jól ismertek.

A találmány szerinti eljárás további részleteit a találmány korlátozásának szándéka nélkül a következő kiviteli példákkal szemléltetjük.

1. példa

H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-acetát (A módszer)

2,58 g (12,0 mmól) H-Val-O‘Bu.HCl és 4,62 g (11,0 mmól) Z-Asp(Ó^lBu)-OSu 25 ml dimetil-formamiddal készült szuszpenziójához 1,68 ml (12,0 mmól) trietil-amint adunk. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és a szuszpenziót 25 ml vízzel háromszor 25-25 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósav-oldattal, háromszor 25-25 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 25 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. így 4,3 g (81,7%) Z-AspíC/Buj-Val-CTBu védett dpeptidet kapunk olaj formájában. Rfi = 0,85.

4,07 g (8,5 mmól) fenti védett dipeptidet 40 ml metanolban oldunk, és 1,0 g csontszenes Pd-katalizátor jelenlétében keverés közben átbuborékoltatással hidrogénezzük. 2 óra alatt a reakció teljessé válik, ekkor a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml éterben oldjuk, és az oldat kémhatását pH = 4,-re állítjuk 6 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-kloridoldattal. A kivált csapadékot kiszűrjük. így 3,2 g (91,5%) H-AspíO^uj-Val-O^u-HCl szabad dipeptid-hidrokloridot kapunk, olvadáspontja: 187189 ’C. Rr=0,40.

3,0 g (10,0 mmól) Z-Sar-OSu-t és 3,05 g (8,0 mmól) H-Asp(O^tBu)-Val-O^tBu.HCL-ot 30 ml dimetil-formamidban oldva reagáltatunk 1,40 ml (10,0 mmól) trietil-amin jelenlétében. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml etü-acetátban oldjuk, és a szuszpenziót 20 ml vízzel, kétszer 20-20 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósav-oldattal, kétszer 20-20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk.

A kapott Z-Sar-AspíCÉBuJ-Val-CÉBu, olaj konzisztenciájú védett tripeptidet (tömege: 4,2 g,

7,6 mmól; Rn = 0,75) 40 ml metanolban oldjuk, az oldathoz 0,8 g csontszenes Pd-katalizátort teszünk, és az elegyet a szokásos módon hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után a szűrlethez 1,0 g (8,0 mmól) oxálsav-dihidrátot teszünk. Az oldatot bepároljuk, és a maradékot éterrel megszüárdítjuk. így 2,24 g H-Sar-AspíC/BuJ-Val-O'Bu.oxalát szabad tripeptid-oxalátot kapunk. Olvadáspontja: 190-192 ’C, Rb = 0,30.

1,14 g (3,5 mmól) Boc-Arg(HCl)-OH.H₂0 10 ml dimetil-formamiddal készült oldatát -10 ’Cra hűtjük, az oldathoz ezen a hőmérsékleten hozzá5

-5HU 201964 Β adunk 0,55 ml (4 mmól) klórszénsav-i-butilésztert, majd 0,44 ml (4 mmól) N-metil-morfolin 5 ml dimetil-formamiddal készült oldatát. A kapott vegyes anhidridet 10 percen keresztül -10 ^eC-on keverjük, majd hozzáadunk 1,5 g (3 mmól) fentiek szerint kapott szabad tripeptid-oxalátot és 0,84 ml (6 mmól) trietil-amint 5 ml dimetil-formamidban oldva ugyanezen a hőmérsékleten. Ezután a reakcióelegyet hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre. Másnap az oldószert vákuumban lepároljuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk és az oldatot háromszor 20 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósavoldattal és 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk. A kapott olajat éterrel megszilárdítjuk, a szuszpenziót szúrjuk. így 1,30 g (66%) amorf Boc-ArgfHClj-Sar-AspfO'Bul-ValO^lBu-t kapunk. Rb - 0,18; Rf4 = 0,24; [a] d = -37,0° (c=1; metanolban).

A fent kapott védett tetrapeptid 1,20 g-ját (1,8 mmól) 2 órán keresztül 40 ’C-on kezeljük trifluor-ecetsawal. A reakcióelegyet 60 ml éterrel hígítjuk, a kapott szuszpenziót szűrjük, és a csapadékot éterrel mossuk. A kapott trifluor-acetát-sót 10 ml vízben oldjuk, és 5 ml acetátciklusú anioncseréló gyantával (DOWEX 2 x 8) a trifluor-acetát ionokat acetát ionokra cseréljük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 5 ml 90%-os vizes etanollal szilárdítjuk meg. így 0,6 g amorf H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-acetátot kapunk. [ct]²⁰D = -32,3° (c = 1; 10%-os ecetsavban). Aminosavanalízis: Asp 1,03 (1), Val 0,97 (1), Arg 1,00 (1).

2. példa

H-Lys-Glu-Thr-OH-hidroklorid és -acetát (B módszer)

3,3 g (11,0 mmól) H-ThrfBuJ-O'Bu.oxalátot 60 ml éterben szuszpendálunk, majd a szuszpenziót oldódásig összerázzuk 30 ml 5%-os, vizes káliumhidrogén-karbonát-oldattal. A szerves fázist elválasztjuk, majd még 20 ml 5%-os, vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal és 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradék olajat 20 ml dimetilformamidban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk

4,12 g (9,5 mmól) Z-Glu(O‘Bu)-OSu-t. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és az oldatot háromszor 15 ml 10%-os, vizes citromsav-oldattal, kétszer 15 ml 5%os, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 15 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és vákuumban bepároljuk. így 4,4 g (8,0 mmól) olajszerű Z-GluíO'Buj-ThrfBuj-O^ Bu védett dipeptidet kapunk (Rfi = 0,85), amit 50 ml metanolban oldva az 1, példában megadott módon katalitikusán hidrogénezünk. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet bepároljuk, és a kapott szabad H-Glu/o'Bu^Thr/'Bu^o’Bu dipeptidet (Rq = 0,22) 20 ml dimetil-formamidban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 4,77 g (10 mmól) ZLys(Boc)-OSu-t. A reakcióelegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradék olajat 50 ml etil-acetátban oldva a szokásos módon kirázásokkal tisztítjuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuum6 bán bepároljuk. Az olajszerű bepárlási maradékot éterrel kristályosítjuk. így 4,75 g (74%) ZLysfBocJ-Glu/O'B^-Thrf'Buj-O'Bu védett tripeptidet kanunk. Olvadáspontja: 114-115 °C; Rf2 = 0,80; [a] d = -22,8° (c = 1; metanolban).

A fenti védett tripeptidet (4,4 g, 5,6 mmól) 40 ml metanolban oldva az 1. példában megadott módon katalitikusán hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet vákuumban bepároljuk, és a maradék olajat 40 ml 6 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-klorid-oldatban oldjuk. 15 perc után az oldatból csapadék válik ki. 1 óra elteltével a szuszpenziót 100 ml éterrel hígítjuk, szűrjük, a csapadékot éterrel mossuk.

így 2,3 g (91%) amorf H-Lys-Glu-Thr-OH.2HC1 tripeptid-dihidroklorid sót kapunk. Olvadáspontja: 213-215’C (bomlik). [<x]²⁰d = +2,7°(c = l, 1%os ecetsav-oldatban).

A kapott H-Lys-Glu-Thr-OH.2HC1 tripeptiddihidroklorid sót 20 ml vízben oldjuk és 7 ml acetátciklusú gyantával (DOWEX 2.8) a klorid ionokat acetát ionokra cseréljük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot etanollal megszilárdítjuk. így 2,27 c amorf H-Lys-Glu-Thr-OHacetátot kapunk, [a] d = +3,5° (c=l; 10%-os ecetsavban); aminosavanalízis: Glu 1,01 (1), Thr 1,00 (l),Lys(l,00 (1).

3. példa

H-Lys-His-Leu-NH2-acetát (C módszer)

2,42 g (10 mmól) H-His-OMe.2HCl-ot 30 ml dimetil-formamidban oldunk, és az oldathoz hozzáadunk 2,8 ml (20 mmól) trietil-amint, majd 5,6 g (11 mmól) Z-Lys-(Z)-OSu-t. Másnak a reakcióelegyet bepároljuk, a maradék olajat 45 ml kloroformban oldjuk, az oldatot kétszer 20-20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradék olajat etil-acetáttal megszilárdítjuk. így 4,54 g (80%) Z-Lys(Z)His-OMe-t kapunk. Olvadáspont: 135-136 ’C; Rb = 0,45.

A fenti védett dipeptidészter 4,0 g-ját (7 mmól) 40 ml meleg metanolban oldjuk, és az oldathoz hozzáadunk 4 ml hidrazin-hidrátot. A reakcióelegyet 3 napon át szobahőmérsékleten tartjuk, majd vákuumban fele térfogatig bepároljuk, és 50 ml éterrel hígítjuk. Az amorf csapadékot szűrjük, és éterrel mossuk. így 3,70 g Z-Lys(Z)-His-N2H3 védett dipeptid-hidrazidot kapunk. Olvadáspont: 150-153’C; R_o = 0,20.

3,65 g (6,0 mmól) Z-Lys-(Z)-Hís-N₂H3-ot 15 ml dimetil-formamidban oldunk, majd az oldatot 10 ’C-ra hűtjük. Ezen a hőmérsékleten az oldathoz hozzácsepegtetünk 2,5 ml 7 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-klorid-oldatot, majd 0,75 ml (6,6 mmól) terc-butil-nitritet 4 ml dimetil-formamidban oldva. A reakcióelegyet 20 percig -10 ’C-on keverjük, majd 2,0 ml trietil-amint adunk hozzá, és becsöpögtetünk 1,33 g (7 mmól) Leu-NH2-acetátot és 1 ml trietil-amint 10 ml dimetil-formamidban oldva. A reakcióelegyet 30 percig 0 ’C-on keverjük, majd állni hagyjuk szobahőmérsékleten. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot vízzel szuszpendáljuk. Az így kapott 3,7 g nyers terméket 30 ml izopropilalkoholból átkristályosít-6HU 201964 Β juk. így 2 g 65% Z-Lys(Z)-His-Leu-NH2-ot kapunk. Olvadáspont: 110-113 °C; Rf4=0,30; [a]²°D = -20,1° (c/1, metanolban).

1,2 g (1,8 mmól) fenti védett tripeptidet 5:1:2 arányú metanol-ecetsav elegy 20 ml-ében oldunk, 5 és az 1. példában megadott módon katalitikusán hidrogénezünk. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet vákuumban bepároljuk, a maradékhoz etanolt adunk, majd bepároljuk, végül a bepárlási maradé12 kot éterrel szétdörzsöljük. így 0,57 g amorf, higroszkópos H-Lys-His-Leu-NH2-acetát kapunk. [a]^Z0D = -5,7° (c = 1; 1 mól/1 ecetsavban); aminosavanalízis: Leu 0,95 (1), His 1,03 (1), Lys 1,04 (1).

A fentiekben részletesen megadott kiviteli példákat követve állítottuk eló az 5. táblázatban feltüntetett védett peptid-származékokat, illetve a 6. táblázatban megadott célvegyületeket.

5. táblázat

A kiviteli példákban megadottak szerint előállított védett peptidek, az előállításuk módja és fizikai jellemzői

A védett peptid neve

Módszer [ot]²°D Rf(elegy)

1. Boc-Arg(Hcl)-Lys(Chc)-Asp(O^tBu)-Val-O^tBu

2. Boc-Arg(HCl)-Sar-Asp(O^tBu)-O^tBu

3. Boc-Arg(HCl)-Sar-Asp(O^tBu)-Val-O^tBu

4. Boc-ArgíHCÓ-Sar-AspíO^uj-O^U

5. Boc-Orn^Bocj-LysíBoc-Asp^Bu^Val-O'Bu

6. Boc-Orn(Boc)-Lys(Boc)-Asp(O^tBu)-O^tBu

7. Boc-ArgíHCO-LysíBocí-AadCO'Buj-Val-O^u

8. Boc-Arg(HCl)-Lys(Boc)-Aad(O^tBu)-O^tBu

9. [Boc-Arg(HCl)-Lys(Boc)-Asp(O^tBu)-NH-CH₂]₂

10. Boc-Arg(HCl)-Lys(Boc)-Asp(O^tBu)-Val-NH-CH2 Boc-Arg(HCl)-Lys(Boc)-Asp(O'Bu)-NH-CH₂

11. [Boc-Arg(HCl)-Lys(Boc)-Asp(O^tBu)-Val-NH-CH₂]₂

12. [Boc-ArgtHClj-LysCBotO-Asp^Buí-Cys-Nfü]::

13. Z-LysfBocJ-Ser^Buj-LysíBocj-Leu-O'Éu

14. Z-ServBuJ-LysfBocj-Leu-O^u

15. Z-Ser(^tBu)-Ser(‘Bu)-Ser(^tBu)-Thr(^tBu)-O^tBu

16. Z-Lys(Boc)-Glu(O^fBu)-Thr(^fBu)-O‘Bu

17. Z-Lys(Boc)-Thr(^tBu)-Glu(O^tBu)-Thr(^tBu)-O^tBu

18. Boc-Pro-Lys(Boc)-Leu-Thr(^tBu)-O^tBu

19. Boc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(^tBu)-Glu(O^tBu)-O^tBu)

20. Z-Lys(Z)-His-Leu-NH₂

A	-30,8°	0,28(4)
A	-20,6°	0,45(4)
A	-37,0°	0,35(4)
A	-20,4°	0,25(4)
A	-31,6°	0,76(2)
A	-21,3’	0,76 (2)
A	-32,6’	0,40 (4)
A	-21,2°	0,40 (4)
A	-80,8°	0,25(4)
A	-29,6’	0,35 (4)
A	-39,0’	0,35(4)
A	-61,0°	0,50 (4)
B	-29,9’	0,70 (2)
B	-28,6’	0,80 (2)
B	0,80 (1)
B	-22,8’	0,80 (2)
B	0,85 (2)
B	-58,7	0,75(2)
B	-15,1’	0,77 (2)
C	-20,1’	0,30 (4)

6. táblázat

A kiviteli példákban megadottak szerint előállított további célvegyületek és fizikai jellemzőik

A célvegyület neve	r i20 [a] D 10%-os, 1 mól/l-es és 100%-os ecetsavban	(5)	Rf(elegy) (6) (7)	(törzso.)
(1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH	-17,8’		0,50
(2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH	+ 1,0’		0,50
(3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH	-32,3°	-21,8	0,26		0,18
(4) H-Arg-Sar-Asp-OH	+11,3°	+ 9,0	0,24		0,14
(5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH	-25,9		0,10		0,13
(6) H-Orn-Lys-Asp-OH	-1,5°		0,05		0,12
(7) H-Arg-Lys-Aad-Val-OH	-24,4’		0,15
(8) H-Arg-Lys-Aad-OH	-2,6		0,07
(8) [H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂]₂	-18,7°					0,15
(10) H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂	0	-57,2°				0,10
H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂
(11) [H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂	12-35,5’			0,05
(12) [H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂]₂	-72,8			0,03
(13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH	-27,8		0,19		0,19
(14) H-Ser-Lys-Leu-OH	-30,0		0,54		0,34
(15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH	-32,4		0,24		0,37
(16) H-Lys-Glu-Thr-OH	+ 3,5°		0,16		0,15

-7HU 201964 Β

6. táblázat folytatása

A célvegyület neve	F l20 [a] D 10%-os, 1 mól/l-es és 100%-os ecetsavban	(5)	Rf(elegy) (6) (7) (törzso.)
(17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH	-25,0°	0,20	0,10
(18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH	-57/7°	0,34	0,17
(19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH	-21,7°	0,12	0,10
(20) H-Lys-His-Leu-NH₂	-5,7°	0,34	0,10

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás új (1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH (2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH (4) H-Arg-Sar-Asp-OH (5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH (6) H-Orn-Lys-Asp-OH (7) H-Arg-Lys-Aad-Val-OH (8) H-Arg-Lys-Aad-OH (9) -[H-Arg-Lys-Ap-NH-CH₂-]₂

H-Arg-Lys-Asp-NH-CH₂ (11) [H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH₂-]₂ (12) [H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH₂]₂ (13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH (14) H-Ser-Lys-Leu-OH (15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH (16) H-Lys-Glu-Thr-OH (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH (20) H-Lys-His-Leu-NH₂ képletű peptidek és savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy aktív észteres, vegy anhidrides és/vagy azidos kapcsolási lépésekkel hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett karboxil-csoportot, adott esetben védett oldallánccal hidroxil- és/vagy amino-csoportot és/vagy hidrogénezéssel eltávolítható csoporttal észterezett vagy amidéit C-terminális karboxil-csoportot tartalmazó aminosav-származékból, illetve 1,2-diaminoetánból, ennek mono-L-valin-származékából vagy L-ciszint-diamidból kiindulva az (1)-(20) képletű peptidek C-terminális karboxil-csoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett vagy amidéit, egyéb karboxilcsoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett, a peptidkötés15 ben részt nem vevő amino-csoportot hordozó és/vagy a hidroxil-csoporton védett származékait állítjuk, majd a jelenlevő védőcsoportokat katalitikus hidrogénezéssel és/vagy savas kezeléssel eltávolítjuk, és kívánt esetben a kapott (1)-(20) képletű peptideket savakkal reagáltatva savaddíciós sókká alakítjuk és/vagy a sók formájában kapott (1)-(20) képletű peptideket kívánt esetben sóikból felszabadítjuk és/vagy valamely más savval alkotott sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy terc-butil-csoporttal észterezett karboxicsoportot tartalmazó védett aminosav-származékot alkalmazunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amino-csoporton terc-butil-oxikarbonil-csoporttal acilezett védett aminosav-származékokat alkalmazunk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amino-csoporton benzil-oxi35 karbonil-csoporttal acilezett aminosav-származékokat alkalmazunk.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxil-csoporton terc-butil-csoporttal védett aminosav-származéko40 kát alkalmazunk.
6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás az (1)-(4) és (7)-(12) képletű peptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy az argmin guanidino-csoporton hidrogén-kloriddal védett származé45 kát alkalmazzuk.
7. Eljárás a T-limfociták érését és a makrofágok aktivitását gátló gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárással készített (1)-(20) képletű peptidek közül egyet vagy többet szabad állapotban vagy savaddíciós sója formájában a gyógyászati készítmények előállításánál szokásosan alkalmazott töltő-, hígító-, stabilizáló-, pH- és ozmózus nyomás beállító segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.

Kiadja: Országos Találmányi Hivatal, Budapest Felelős kiadó: dr.Szvoboda Gabriella

KÓDEX