KR100691540B1 - 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 ｃ 유도체, 이의제조방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩타이드가 결합된
안정화된 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 상기 비타민 C 유도체의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
안정화된 비타민 C 유도체, 펩타이드, 콜라겐

Description

펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 Ｃ 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물{STABILIZED VITAMIN C DERIVATIVES WITH A PEPTIDE MOLECULE, PREPARATION METHOD THEREOF, AND COMPOSITION CONTAINING THE SAME}
도 1은 본 발명의 화합물, 비티민 C, 마그네슘 아스코빌 포스페이트, 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드 및 팔미토일 펜타펩타이드를 사용하여 콜라겐 생합성능을 검정한 결과를 보여주는 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물, 비타민 C, 마그네슘 아스코빌 포스페이트, 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드 및 팔미토일 펜타펩타이드를 사용하여 세포 독성을 검정한 결과를 보여주는 것이다.
본 발명은 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 상기 비타민 C 유도체의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
피부는 보호 기능, 장벽 기능, 온도 조절 기능, 배설 기능, 호흡 기능 등을 하는 기관으로, 표피, 진피, 피하지방으로 이루어진다. 표피는 가장 얇은 층으로 각질 형성 세포와 멜라닌 세포의 유기적인 결합으로 이루어져 있다. 진피는 피부의 약 95%를 차지하며 피부의 보습 및 보호를 담당하는 층으로, 피부탄력(주름)에 중요한 역할을 하는 대표적인 단백질인 콜라겐, 엘라스틴이 그물처럼 짜여져 있고, 혈관과 신경이 존재하며, 알레르기 반응에 관여하는 비만세포, 및 Na-PCA 또는 히아루론산 등의 천연 보습 인자도 함유하고 있다. 피하 지방은 표피 및 진피로의 영양 공급, 체형 결정, 체온 유지, 외부적인 충격흡수 및 피하지방하 세포 보호 등의 역할을 한다.
이러한 피부는 나이가 들면서 내인성 또는 외인성 원인으로 인해 피부기능이 급격히 저하되는 노화를 겪게 된다. 노화가 진행되면서 피부의 구성 성분인 표피, 진피, 및 피하 지방의 두께가 얇아지고 콜라겐과 엘라스틴이 가늘어지고 느슨해져 탄력이 떨어지고 주름 등이 생긴다. 또한, 피부장벽의 기능을 맡고 있는 지질 장벽(Lipid barrier)의 지질 조성과 함량이 변화하면서 피부의 수분함량이 떨어지고 피부가 건조해지는 등의 생리적 변화를 겪게 된다. 또한, 기미, 주근깨, 색소 침착과 그 외 다양한 피부 병변이 유발된다.
이런 피부노화에 따른 문제점을 해결하기 위하여 피부개선 효과를 가지는 다양한 유효 성분과 이를 포함하는 조성물이 연구되어지고 있다.
피부노화를 억제시키는 효과가 있는 성분으로는 비타민 C, 비타민 E, 베타카로틴 등 항산화 비타민 등이 많이 사용되고 있다. 이중, 비타민 C는 자외선(UV) 차단 효과, 항산화 효과, 콜라겐 형성 촉진을 통한 피부 주름 개선, 기미/주근깨/검버섯 등의 색소 침착개선 효과, 면역체계 강화 등을 갖는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 비타민 C의 작용을 요약하면 다음과 같다.
비타민 C는 자외선, 특히 UV A에 대한 차단기능이 강하다 (Darr, D. et al., 1996, Acta Derm. Venereol. (Strckh). 76: 264-268; Black, H. S. et al., 1975, J. Invest. Dermatol. 65: 412-414). 또한, 비타민 C는 UV B에 의해 발생하는 피부 손상을 보호하는 역할을 하는데, UV B 조사전에 비타민 C를 돼지와 인간의 피부에 바르고 여기에 UV B를 조사하면 홍반과 햇볕에 타는 현상이 방지된다는 사실이 밝혀졌다 (Darr, D. et al., 1992, Brit. J. Dermatil. 127: 247-253; Murry, J. et al., 1991, J. Invest. Dermatol. 96: 587).
비타민 C는 피부, 혈액 및 기타 조직에서 화학적 오염, 흡연, 특히 자외선(UV)에 의해 유발되는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)를 중화시키는 강력한 생체 항산화제로서의 작용을 하며, 이와 같은 효과는 비타민 C가 두개의 전자를 받아들여 탈수소-L-아스코르브산(Dehydro-L-ascorbic acid) 형태로 쉽게 산화될 수 있는 구조에 기인하는 것이다. 비타민 C는 피부의 비효소적 항산화제 방어 시스템의 중요한 요소로 비타민 C가 고농도로 존재할 때 싱글렛 산소(singlet oxygen), 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion), 하이드록시 라디칼(hydroxy radical)과 같은 ROS 등이 단백질, 핵산, 세포막 지질 등의 생체 성분을 산화시키거나 변성시키기 전에 이들을 중화시키는 역할을 하는 것이다 (Buettner, G. R. et al. 1996. Cadenas, E., Packer, L., eds. Handbook of antioxidants. pp. 91-115).
또한, 비타민 C는 각질층으로 경피적으로 공급됨으로써 피부 광택, 피부색 개선, 주름 감소, 탄력 증가 등의 효과를 가지며 (미국 특허 제4,983,382호), 이러한 효과는 비타민 C에 의해 콜라겐 합성이 촉진되기 때문에 얻어지는 것이다. 콜라겐 폴리펩타이드의 10% 정도를 차지하는 히드록시프롤린은 프롤린 하이드록실라제(proline hydroxylase)에 의해 생합성되는데, 상기 효소의 보조인자(cofactor)로 비타민 C가 작용한다 (Tomita, Y. et al., 1980, J. Invest. Dermatol. 75(5): 379-382). 즉, 비타민 C는 프롤린 하이드록실라제의 활성을 촉진하여 하이드록실프롤린의 합성을 촉진하고, 이는 삼중나선 구조의 콜라겐 생합성을 촉진하여 피부 주름 형성 억제 등의 피부 개선 효과를 가지는 것이다.
또한, 비타민 C는 우수한 미백 효과를 가지며, 이러한 효과는 비타민 C가 멜라닌 형성에 중요한 티로시나아제(tyrosinase) 활성과 멜라닌 형성을 억제하기 때문에 얻어지는 것이다 (Tomita, Y. et al., 1980, J. Invset. Dermatol. 75(5); 379-382).
또한, 비타민 C는 면역체계를 강화시키는 효과를 가지며, 이는 비타민 C가 알러지 반응물질인 히스타민의 세포막에서의 방출을 억제함으로써 민감성 피부에서의 알러지 반응을 억제함으로써 나타나는 것이며, 쥐에서 항원에 접촉시 자외선 유도된 면역억제와 내성으로부터 보호한다는 것이 증명되었다(Nakamura, T. et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 109: 20-24). 또한, 비타민 C는 백혈구의 식균작용을 도와주고 감염이 전개되는 동안 백혈구 이동을 촉진시켜 감염을 억제하고 바이러스 증식 억제 물질인 인터페론의 생합성을 증가시키는 작용을 하여, 다양한 감염성 질환에 대한 생체 저항성을 상승시키는 역할도 한다. 그 외 비타민 C는 생체내 엽산 대사 및 아미노산의 대사 과정에도 관여하는 등 다양한 기능을 수행한다.
상기 언급한 다양한 역할을 담당하는 비타민 C는 C6H8O6의 화학식을 갖는 수용성의 물질이다. 비타민 C는 분자의 2, 3, 5, 6번 탄소에 위치하는 수산화기 때문에 친수성(hydrophilicity)을 나타낸다. 물과 같은 중성의 pH에서는 이들 수산화기, 특히 2번과 3번 탄소가 음의 전하를 가지게 되는데, 이로 인하여 수용액에 신속하게 완전히 녹게 되지만, 수용액이 아닌 피부와 같은 유기적인 환경에서는 용해도에 제한이 있다. 또한, 비타민 C는 외용제에 통상적으로 사용되는 유기용매, 예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 다양한 지방(fat) 등에 잘 녹지 않아서, 비타민 C를 피부로 운반하는데 한계가 있다. 즉, 비타민 C가 이온화되지 않았을 때, 피부장벽을 쉽게 통과하여 흡수 시 비이온 상태를 유지하기 위해서는 pH가 4.2 이하여야만 한다는 제한점이 있다.
비타민 C의 피부 축적양은 경구 투여보다 외용제로 사용하였을 때 20배 내지 40배 정도 높은 것으로 알려졌다. 자외선 차단 효과, 항산화 효과, 콜라겐 형성 촉진을 통한 피부 주름 개선 효과, 기미/주근깨/검버섯 등의 색소 침착 개선 효과, 면역체계 강화 효과 등을 도모하기 위한 목적으로 사용하는 피부외용제의 경우에는 유효 물질이 피부의 각질층을 통과하여 표피에 있는 세포까지 도달할 것을 필요로 하므로, 유효 물질의 경피 흡수율이 높아야 한다. 일반적으로 어떤 물질의 피부 침투율은 그 물질의 친유성(lipophilicity)과 관계가 있다. 피부의 친유성과 유사한 물질인 경우 피부로의 분배 계수가 커져 경피 흡수가 잘되는 것으로 알려져 있 는데, 비타민 C의 경우는 친수성이 높아 피부로의 분배가 낮아져서 경피 흡수가 어렵다.
상기한 바와 같이 비타민 C는 다양한 효과를 나타내지만, 안전성, 안정성, 피부 흡수가 낮기 때문에 이를 개선하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.
비타민 C 유도체의 연구를 유형별로 구분하는 경우, 한 가지 유형은 인산화된 아스코르브산 또는 인산화된 아스코르브산의 금속염 형태의 유도체를 제공하는 것이다. 상기 유도체는 아스코르브산의 2번 탄소와 3번 탄소의 하이드록시기를 인산화기와 에스테르 결합으로 연결하여 각각 아스코르빌-2-포스페이트 또는 아스코르빌-3-포스페이트(ascorbyl-3-phosphate)를 형성한 것들인데, 이런 종류의 유도체들은 다른 유도체에 비하여 인체가 사용할 수 있는 형태인 L-아스코르브산 형태로의 전환은 쉽게 이루어지지만 음의 전하를 가지기 때문에 피부흡수가 어렵다는 단점이 있다.
또 다른 유형은 지방산이 결합된 형태의 아스코르브산을 제공하는 것이다. 미국 특허 제5,409,693호는 아스코르브산의 친유성 지방산 에스테르(fat soluble fatty acid ester) 형태, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르빌 라우레이트, 아스코르빌 미리스테이트, 아스코르빌 스테아레이트 등의 비타민 C 유도체를 기재하고 있다. 이 중에서 아스코르빌-6-팔미테이트가 가장 널리 사용되는데, 상기 아스코르빌-6-팔미테이트는 피부에 쉽게 흡수는 되지만 L-아스코르브산 형태로 전환이 어렵다는 단점이 있다. 아스코르빌-6-팔미테이트는 쥐의 피부에서 광산화로부터 보호하는데 실패하였다는 결과가 발표되었으며 (Bissett, D. et al., 1990, Photodermatol Photoimmunol Photomed 7: 56-62), 10 wt%의 아스코르빌-6-팔미테이트를 포함한 혈청을 처리했을 때 피부에서 아스코르브산의 현저한 증가가 관찰되지 않았다는 결과도 발표되었다 (Pinnell, S. R. et al., 2001. Dermatologic Surgery. 27(2): 137-142).
세 번째 유형은 아스코르브산이 모노싸카라이드로 유도체화된 형태, 예를 들면 글리코실화, 만노실화, 프록토실화, 푸코실화, 갈락토실화, N-아세틸글루코스아민화, N-아세틸뮤라민화된 유도체들을 제공하는 것이다. 그러나 이들 유도체들의 생체 내에서의 생리 활성에 대한 구체적이고 정확한 규명은 아직 이루어지지 않은 실정이다.
네 번째 유형은 콜라겐 생성 펩타이드가 결합된 형태의 아스코르브산을 제공하는 것이다. 한국 특허 제0459679호는 아스코르브산의 5번 탄소 또는 6번 탄소의 하이드록시기에 숙시노일기를 에스테르 결합으로 연결하고 콜라겐 생성 펩타이드와 이미드결합하여 유도체환 것을 기재하고 있으며, 상기 아스코르브산 유도체는 아스코르브산보다 우수한 효능을 보이나, 안정성이 지속적이지 못하다는 단점이 있다.
한편, 콜라겐은 피부, 혈관, 내장, 뼈 등에서 매우 많이 발견되며, 피부를 구성하고 있는 진피의 70%는 콜라겐으로 이루어져 있고 근육을 둘러싸고 있는 근막 또한 콜라겐으로 구성되어 있다. 생체 단백질 총 중량의 30%를 차지하는 콜라겐은 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 유기체의 성장 또는 상처 치유시 세포 분할과 분화를 유도하는 기능을 한다. 콜라겐 은 섬유아세포에서 생합성되는데, 자연노화 및 광노화에 의해서 그 양이 감소하며, 20세에서 80세에 이르는 동안 65%의 감소가 일어난다고 알려져 있다 (Shuster S., 1975, British journal of determatology, 93(6): 639-643).
생체내 콜라겐의 합성이 활발해지면 진피 기질 성분이 증가되어 상처치유, 탄력증가, 주름개선등의 효과를 기대할 수 있다는 것이 밝혀지면서 화장품, 식품, 의약품등에 사용되고 있다. 이러한 콜라겐을 형성하는 최소의 활성 단위인 10개 이하의 올리고펩타이드는 메신저, 자극제, 신경 전달제로서의 역할과 성장조절, 수유, 면역, 소화, 혈압, 치유와 같은 생리 대사 작용과도 관련이 있다. 특히 피부 재생 효과가 밝혀진 펩타이드는 프랑스 특허 제2,668,265호, 미국 특허 제4,665,054호, 국제공개 WO91/3488, 국제공개 WO91/7431 등에 개시되어 있다. 그러나, 이러한 펩타이드들의 경우 침전이 형성되어 제품의 안정도가 크게 저하되는 단점이 있다.
따라서, 안전성 및 안정성이 개선되고 피부 침투력이 우수한 비타민 C 유도체를 얻기 위한 기술 개발이 요구되고 있는 실정이라 할 수 있다.
이러한 요구에 부응하여, 본 발명은 비타민 C에 인산 유도체와 펩타이드, 특히 콜라겐 생성 펩타이드를 도입하여, 안정성이 우수한 비타민 C 유도체를 제공함으로써, 상기 언급한 종래 비타민 C 유도체의 제한점을 극복하여, 안전성 및 안정성이 개선되고 피부 침투력 우수한 비타민 C 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 상기 비타민 C 유도체의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
우선, 본 발명은 비타민 C의 2번 위치에 인산기 유도체가 도입되고 5번 또는 6번 위치에 펩타이드, 바람직하게는 콜라겐 생성 펩타이드가 결합된, 안정화된 비타민 C 유도체, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112006044311766-pat00001
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 상이하고, -OH 또는
Figure 112006044311766-pat00002
이며, R1과 R2가 동시에 -OH 또는
Figure 112006044311766-pat00003
이 아니고,
X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이며,
Figure 112006044311766-pat00004
는 천연 또는 비천연 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이고,
R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이며,
n은 3 내지 10의 정수이고,
m은 2 내지 5의 정수이며,
W는
Figure 112006044311766-pat00005
또는 글루코오스이고,
R3는 -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, -NHCH2CH2CH3, -NHCH2C6H5, 및 -OH로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 하기 화학식 1a, 1b, 1c 또는 1d의 구조를 갖는 것일 수 있다:
Figure 112006044311766-pat00006
Figure 112006044311766-pat00007
Figure 112006044311766-pat00008
Figure 112006044311766-pat00009
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 상기 화학식 1 중의
Figure 112006044311766-pat00010
는 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 아르기닌, 글루타민, 메티오닌 및 글루탐산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 동일하거나 상이 한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이고,
상기 R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이며,
n은 3 내지 7의 정수이다.
보다 바람직한 예에 있어서,
상기 펩타이드
Figure 112006044311766-pat00011
는 n이 3 내지 6의 정수인 트리 내지 헵타 펩타이드일 수 있으며,
특히 바람직하게는 글리신-라이신-히스티딘, 글리신-히스티딘-라이신, 글리신-프롤린-히드록시프롤린, 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린 및 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩타이드일 수 있다.
또한, 상기 X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이고,
m은 2 내지 4의 정수, 보다 바람직하게는 2 또는 3일 수 있다.
특히 바람직하게는, 상기 X는 m이 2인 숙시닐기일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112006044311766-pat00012
상기식에서,
R4 및 R5는 각각 상이하고, -OC(O)(CH2)pCH3, 또는
Figure 112006044311766-pat00013
이며, R4과 R5가 동시에 -OC(O)(CH2)pCH3 또는
Figure 112006044311766-pat00014
는 아니고,
X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이며,
Figure 112006044311766-pat00015
는 천연 또는 비-천연 아미노산중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이고,
R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이며,
n은 3 내지 10의 정수이고,
m은 2 내지 5의 정수이며,
p는 10내지 20의 정수이고,
W는
Figure 112006044311766-pat00016
또는 글루코오스이며,
R3는 -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, -NHCH2CH2CH3, -NHCH2C6H5, 및 -OH로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
본 발명의 구체예에 있어서, 화학식 2의 구조를 갖는 화합물은 하기 화학식 2a, 2b, 2c 또는 2d의 구조를 갖는 화합물일 수 있다:
Figure 112006044311766-pat00017
Figure 112006044311766-pat00018
Figure 112006044311766-pat00019
Figure 112006044311766-pat00020
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 상기 화학식 2 중의
Figure 112006044311766-pat00021
는 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 아르기닌, 글루타민, 메티오닌 및 글루탐산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이고,
R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이며,
n은 3 내지 7의 정수이다.
보다 바람직하게는, 상기 펩타이드
Figure 112006044311766-pat00022
는 n이 3 내지 6의 정수인 트리 내지 헵타 펩타이드이며, 특히 바람직하게는 글리신-라이신-히스티딘, 글리신-히스티딘-라이신, 글리신-프롤린-히드록시프롤린, 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린 및 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 화학식 2 중의 X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이며,
m은 2 내지 4, 보다 바람직하게는 2 또는 3의 정수일 수 있다.
특히 바람직하게는, 상기 X는 m이 2인 숙시닐기일 수 있다.
또한, 상기 -OC(O)(CH2)pCH3는 p가 10 내지 20의 정수, 보다 바람직하게는 12 내지 16의 정수인 지방산이며, 특히 바람직하게는 p가 14인 팔미테이트일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2의 구조를 갖는 안정화된 비타민 C 유도체는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다:
2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌- 라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르부산, 2-포스포-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르부산, 2-포스포-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이실-세린)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-라이신-트레오 닌-트레오닌-라이신-세린)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타닐-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닐)-6-팔미틸 아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산 및 이들의 약학적으로 허용되는 염.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2의 구조를 갖는 안정화된 비타민 C 유도체는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다:
2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리실-프롤릴-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리 신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산 및 이들의 약학적으로 허용되는 염.
본 명세서에 있어서, "천연 아미노산"은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군 중에서 선택된 α-아미노산을 의미한다. 또한, "비-천연 아미노산" 은 핵산 코돈에 의해 암호화되지 않는 아미노산으로, 이의 예에는 상기한 바와 같은 천연 α-아미노산의 D-이성체; Aib(아미노부티르산), bAib(3-아미노이소부티르산), Nva(노르발린), β-Ala, Aad(2-아미노아디프산), bAad(3-아미노아디프산), Abu(2-아미노부티르산), Gaba(γ-아미노부티르산), Acp(6-아미노카프로산), Dbu(2,4-디아미노부티르산), α-아미노피멜산, TMSA(트리메틸실릴-Ala), alle(알로-이소류신), Nle(노르류신), 3급-Leu, Cit(시트룰린), Orn, Dpm(2,2'-디아미노피멜산), Dpr(2,3-디아미노프로피온산), α- 또는 β-Nal, Cha(사이클로헥실-Ala), 하이드록시프롤린, Sar(사코신) 등; 사이클릭 아미노산; N α-알킬화 아미노산, 예를 들어 MeGly(Nα-메틸글리신), EtGly(N α-에틸글리신) 및 EtAsn(Nα-에틸아스파라긴); 및 α-탄소가 2개의 측쇄 치환체를 갖는 아미노산 등이 포함된다.
또한, 본 명세서에 있어서, "펩타이드"란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합) 으로 연결된 10 개 이하, 바람직하게는 3 내지 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 펩타이드는 생체내의 단백질을 추출하고 단백질 분해효소를 처리하여 저분자량화시킨 것이거나, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 펩타이드는 목적하는 바에 따라서 특정 원자 또는 원자단이 하이드록시기 등으로 치환된 유도체일 수 있다. 이하, 펩타이드의 COOH 말단을 C-말단, NH2 말단을 N-말단이라 한다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 특히 콜라겐 생성 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 "콜라겐 펩타이드"란 콜라겐 단백질의 단편으로서, 콜라겐 합성을 촉진하거나 콜라겐 단백질의 구성요소로 사용될 수 있는 펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 구체예에서 사용 가능한 글리신-라이신-히스티딘, 글리신-히스티딘-라이신, 글리신-프롤린-히드록시프롤린, 라이신-트레오닌-트레오닌-라이실-세린 및 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 트리 내지 헵타 펩타이드는 진피 내부에 다량 존재하는 콜라겐과 글리코스아미노글리칸의 합성을 촉진시켜 수분 보유 효율을 높이고 진피의 탄력을 증진시킴으로써 보습효과와 주름개선 효과를 부여하는 기능을 갖는 것이다. 특히, 펜타 펩타이드인 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린(Lysine-Threonine-Threonine-Lysine-Serine)는 피부결합조직과 주름형성 및 보습과 관련하여 중요한 콜라겐 타입 I의 C 말단 단편(fragment)으로써, 콜라겐을 생합성하는 세포인 섬유아세포의 세포배양에서 콜라겐 타입 I과 III 및 세포와 세포의 접착과 관련하여 세 포간 정보전달이 원활하게 되도록 도와주는 파이브로넥틴(fibronectin)과 성장인자인 β-TGF의 합성을 촉진하며(Kou Katayama et al., 1991, Biochemistry 30: 7097-7104), 콜라겐 유전자의 프로모터에 결합하여 이의 전사를 촉진시키는 것으로 보고되어 있다 (Kou Katayama et al., 1993, The journal of Biological Chemistry 268(14): 9941-9944).
또한, 본 명세서에 있어서, '약학적으로 허용 가능한 염'이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은나트륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, '아스코르브산'은 '비타민 C'와 동일한 의미를 나타내는 것으로 사용된다.
본 발명의 비타민 C 유도체는, 기존의 비타민 C가 항산화 활성 및 피부 미백, 피부 재생 등의 피부 상태 개선 활성이 우수하지만 안정성이 낮다는 문제점을 개선한 것으로, 비타민 C의 2번 탄소 위치에 인산 유도체 또는 글루코오스가 도입됨으로써 안정성이 개선된 것이며, 더욱이, 5번 또는 6번 탄소 위치에 소정의 펩타이드를 도입시켜 안정성이 더욱 개선되었으며, 특히, 상기 펩타이드가 콜라겐 생성 펩타이드인 경우에는 콜라겐에 의한 주름 개선, 탄력 부여 등의 부가적 피부 상태 개선 효과를 추가적으로 얻을 수 있다는 이점을 갖는다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은
비타민 C의 2번 탄소 위치에 인산 유도체, 또는 글루코오스를 도입하고,
5번 탄소 또는 6번 탄소 위치 중 어느 하나에 -OH, 또는 탄소수 12 내지 22의 지방산 에스테르를, 다른 하나에 아미노산 잔기 3 내지 10개를 갖는 펩타이드를 도입시키는 단계를 포함하는,
안정화된 비타민 C 유도체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 안정된 비타민 C 유도체의 제조 방법은
비타민 C의 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 글루코오스, 인산기 또는 하기의 화학식 8의 구조를 갖는 인산 유도체를 도입하는 단계 (이 때, 임의로, 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기 등의 보호기를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다); 및
비타민 C의 5번 또는 6번 탄소 위치의 중 어느 하나에 하이드록시기를 생성시키고, 다른 하나에는 디카르복실산 HOOC(CH2)mCOOH (m은 2 내지 5의 정수)을 에스테르 결합시킨 후 아미노산 잔기 3 내지 10개의 펩타이드와 아미드 결합시키는 단계
를 포함하는, 화학식 1의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법일 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기의 화학식 1의 구조를 갖는 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법을 보다 구체적으로 설명하면, 다음과 같은 단계를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
다음의 화학식 3의 구조를 갖는 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 다음의 화학식 4의 구조를 갖는 벤질할라이드와 반응시켜 상기 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산의 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기를 도입시켜 다음의 화학식 5의 구조를 갖는 벤질기가 도입된 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 제조하는 단계;
상기에서 제조된 화학식 5의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체를 하기의 화학식 6의 구조를 갖는 포스포로디아미딕 할라이드와 반응시켜 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 포스포로디아미드를 도입시켜, 하기의 화학식 7의 구조를 갖는 벤질기와 포스포로디아마이드가 도입된 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 제조하는 단계;
상기에서 제조된 화학식 7의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체를 개환시킨 후, 5번 탄소 또는 6번 탄소 위치 중 어느 하나에 하이드록시기를 생성시키고, 나머지 하나에 다음의 화학식 8의 구조를 갖는 디카복실산을 도입시켜, 다음와 화학식 9의 구조를 갖는 디카복실산과 에스테르 결합된 아스코르브산 유도체를 제조하는 단계;
상기에서 제조된 화학식 9의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체를 다음의 화학식 10의 구조를 갖는 펩타이드와 아미드 결합시키는 단계; 및
상기의 벤질기를 제거하는 단계.
Figure 112006044311766-pat00023
Figure 112006044311766-pat00024
Figure 112006044311766-pat00025
Figure 112006044311766-pat00026
Figure 112006044311766-pat00027
HOOC(CH2)mCOOH
Figure 112006044311766-pat00028
Figure 112006044311766-pat00029
상기 식에서,
m은 2 내지 5의 정수이고,
Bn은 벤질이며,
Y는 염소, 브롬, 불소 또는 요오드이고,
R3'는 디메틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 또는 벤질아민이고,
R1′과 R2′는 각각 상이하고, -OH 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH이며, R1′과 R2′가 동시에 -OH 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH가 아니며,
R은 보호되거나 보호되지 않은 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기의 곁가지이고,
n은 3 내지 10의 정수이다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음과 같이 제조될 수 있다.
우선, 상기 화학식3의 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산에 화학식 4의 벤질할라이드, 바람직하게는 벤질클로라이드(Y=염소)를 첨가하여, 3 내지 5 시간 동안, 바람직하게는 4 시간 동안, 4 내지 50℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 아스코르브산 (비타민 C)의 2번 탄소의 하이드록시기에 벤질기를 도입시킨다. 또한, 이와 같이 얻어진 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기가 도입된 화학식 5의 생성물에 화학식 6의 포스포로디아미딕 할라이드, 바람직하게는 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미딕 클로라이드를 첨가하여 5 내지 7 시간 동안, 바람직하게는 6 시간 동안 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 아스코르브산의 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기가, 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미드가 도입된 화학식 7의 생성물을 얻는다.
상기 생성물에 산, 바람직하게는 트리플루오르아세트산을 첨가하여 3 내지 5 시간 동안, 바람직하게는 4 시간 동안 반응시켜 5,6-이소프로필리디엔 환을 개환시키고, 화학식 8의 디카복실산, 바람직하게는 숙신산을 첨가하여 15 내지 17 시간, 바람직하게는 16시간 동안, 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 아스코르브산과 에스테르 결합시켜서, 화학식 9의 화합물을 합성한다. 그리고 나서, 수지상에서 통상적인 고상 합성법에 의하여, 보호된 펩타이드 N-말단의 NH2를 상기 디카복실산에 아미드 결합시킨 후, 보호기를 제거한다.
상기 반응은 무수 조건하, 예를 들어 무수 유기 용매를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 무수 유기 용매로는 통상적인 무수 유기 용매가 모두 사용 가능하며, 예를 들어, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, N-메틸피롤리디논, 디클로로메탄 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 디메틸포름아미드를 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응에 있어서, 축합제를 사용할 수 있으며, 상기 축합제로서 DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), HOBT (N-hydroxybenzotriazole), EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimide], PyBOP (benzo -triazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino- phosphonium hexafluorophosphate), HBTU [2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,3,3-tetramethyluronium hexafluoro- phosphate] 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 안정된 비타민 C 유도체의 제조 방법은,
비타민 C의 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 글루코오스, 인산기 또는 하기의 화학식 6의 구조를 갖는 인산 유도체를 도입하는 단계 (이 때, 임의로, 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기 등의 보호기를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다); 및
비타민 C의 5번 또는 6번 탄소 위치의 중 어느 하나의 하이드록시기에 탄소수 12 내지 22의 지방산 에스테르를 결합시키고, 다른 하나의 하이드록시기에는 디카르복실산 HOOC(CH2)mCOOH (m은 2 내지 5의 정수)을 에스테르 결합시킨 후 아미노산 잔기 3 내지 10개의 펩타이드와 아미드 결합시키는 단계를 포함하는, 화학식 2의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법일 수 있다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법을 보다 구체적으로 설명하면, 다음과 같은 단계를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
하기의 화학식 3의 구조를 갖는 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 화학식 4의 구조를 갖는 벤질할라이드와 반응시켜, 상기 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산의 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기를 도입시켜, 다음의 화학식 5의 구조를 갖는 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 제조하는 단계;
상기에서 제조된 화학식 5의 아스코르브산 유도체를 하기의 화학식 6의 포스포로디아미딕 할라이드와 반응시켜 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 포스포로디아 미드를 도입시켜, 하기의 화학식 7의 구조를 갖는 벤질기와 포스포로디아마이드가 도입된 5,6-이소프로필리디엔-아스코르브산을 제조하는 단계,
상기에서 제조된 화학식 7의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체를 개환시킨 후, 5번 탄소 또는 6번 탄소 위치의 하이드록시기 중 어느 하나는 하기의 화학식 11의 구조를 갖는 지방산을 반응시키고, 다른 하나는 하기의 화학식 8의 구조를 갖는 디카복실산과 반응시켜, 하기의 화학식 12의 구조를 갖는 지방산과 디카복실산이 에스테르 결합된 아스코르브산 유도체를 제조하는 단계;
상기에서 제조된 화학식 9의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체에 하기의 화학식 10의 펩타이드를 반응시켜, 상기 디카르복실산과 아미드 결합시키는 단계; 및
상기 벤질기를 제거하는 단계.
[화학식 3]
Figure 112006044311766-pat00030
[화학식 4]
Figure 112006044311766-pat00031
[화학식 5]
Figure 112006044311766-pat00032
[화학식 6]
Figure 112006044311766-pat00033
[화학식 7]
Figure 112006044311766-pat00034
[화학식 8]
HOOC(CH2)mCOOH
[화학식 10]
Figure 112006044311766-pat00035
CH3(CH2)pCOOH
Figure 112006044311766-pat00036
상기 식에서,
m은 2 내지 5의 정수이고,
Bn은 벤질이며,
Y는 염소, 브롬, 불소 또는 요오드이고,
R3'는 디메틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 또는 벤질아민이고,
R4′와 R5′는 각각 상이하고, -OC(O)(CH2)pCH3 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH이며, R4′와 R5′가 동시에 -OC(O)(CH2)pCH3 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH는 아니며,
R은 보호되거나 보호되지 않은 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기의 곁가지이고,
n은 3 내지 10의 정수이며,
p는 10 내지 20의 정수이다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 화학식 2의 구조를 갖는 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다음과 같이 제조될 수 있다.
우선, 상기 화학식 3의 구조를 갖는 아스코르브산 유도체에 화학식 4의 벤질 할라이드, 바람직하게는 벤질클로라이드 (Y=염소)를 첨가하여 3 내지 5시간, 바람직하게는 4시간 동안, 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 아스코르브산의 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기가 도입된 화학식 5의 아스코르브산 유도체를 제조한다. 상기 제조된 아스코르브산 유도체에 포스포로디아미딕 할라이드, 바람직하게는 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미딕 클로라이드를 첨가하여 5 내지 7시간, 바람직하게는 6 시간 동안, 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 아스코르브산의 3번 탄소 위치의 하이드록시기에 벤질기가 도입되고, 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미드가 도입된 화학식 7의 아스코르브산 유도체를 제조한다. 상기 제조된 아스코르브산 유도체에 산, 바람직하게는 트리플루오르아세트산을 첨가하여 3 내지 5시간, 바람직하게는 4시간 동안 반응시켜, 5,6-이소프로필리디엔 환을 개환시킨다. 여기에, 화학식 11의 지방산, 바람직하게는 팔미트산을 첨가하여 15 내지 17시간, 바람직하게는 16시간 동안, 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 상기 개환된 아스코르브산 유도체의 5번 또는 6번 탄소의 하이드록시기과 에스테르 결합시킨다. 여기에, 화학식 8의 디카복실산, 바람직하게는 숙신산을 첨가하여 15 내지 17시간, 바람직하게는 16시간 동안, 4 내지 70℃에서, 바람직하게는 20 내지 30℃에서, 특히 바람직하게는 25℃에서 반응시켜, 상기 개환된 아스코르브산의 5번 또는 6번 탄소의 하이드록시기 중 상기 지방산이 결합되지 않은 하이드록시기와 에스테르 결합시켜서, 화학식 12의 아스코르브산 유도체를 제조 한다. 상기 제조된 아스코르브산 유도체를 수지상에서 통상적인 고상 합성법에 의해 보호된 펩타이드의 N-말단의 NH2를 상기 디카복실산과 아미드 결합시킨 후, 탈보호화시킨다.
상기 반응은 무수 조건하, 예를 들어 무수 유기 용매를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 무수 유기 용매로는 통상적인 무수 유기 용매가 모두 사용 가능하며, 예를 들어, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, N-메틸피롤리디논, 디클로로메탄 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 디메틸포름아미드를 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응에 있어서, 축합제를 사용할 수 있는데, 상기 축합제로서 DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), HOBT (N-hydroxybenzotriazole), EDC [N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimide], PyBOP (benzo -triazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino- phosphonium hexafluorophosphate), HBTU [2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,3,3-tetramethyluronium hexafluoro- phosphate] 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 축합제, 촉매, 및 용매 등은 반응에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서 당 업계에 통상적으로 사용되는 모든 것을 사용할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 화학식 1 및 2의 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체는 통상의 분리, 정제 방법, 예를 들어 재결정 또는 칼럼 크로마토그래피법을 사용하여 정제할 수 있다.
상기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 화합물을 제조하기 위한 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 제조방법에서, 하이드록시기가 벤질기로 보호된 아스코르브산과 결합되는 펩타이드는 고상 합성법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 각각의 아스코르브산의 하이드록시기를 보호한 후, 보호되지 않은 하이드록시기에 선택적으로 숙시닐기를 도입하고, 수지상에서 전형적인 고상 합성법에 의해 합성된 펩타이드의 N-말단에 숙시닐기가 도입된 아스코르브산을 반응시킨 후, 아스코르브산과 펩타이드의 보호기를 제거한다.
본 발명의 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 비타민 C 유도체 화합물을 고상 또는 용액상 합성법을 이용하여 제조하는 방법을 예시하기 위하여, 이를 도식화하여 하기 반응식 1 및 2에 나타내었다. 반응식 1은 특히 화학식 1a와 화학식 1c의 화합물의 제조 과정을 나타내며, 반응식 2는 특히 화학식 1b와 화학식 1d의 화합물의 제조 과정을 나타내며, 반응식 3은 특히 화학식 2b와 화학식 2d의 화합물의 제조 과정을 나타내며, 반응식 4는 특히 화학식 2a와 화학식 2c의 화합물의 제조 과정을 나타낸다.
Figure 112006044311766-pat00037
a. BnCl, K2CO3, DMF, 25℃, 4hr
b. P(O)N(CH3)2Cl, DMAP, DCM, 25℃, 6hr
c. TFA, DCM, 25℃, 4hr
d. TrtCl, TEA, DCM, 25℃, 24hr
e. 숙신산 무수물, DMAP, DCM, 25℃, 16hr
f. 고상 합성
g. TFA, 25℃, 3hr
h. 10%Pd/C, MeOH , H2, 25℃, 1hr
i. Dowex 50w-8x, H2O, 25℃, 24hr
(BnCl: 벤질클로라이드; K2CO3 : 탄산칼륨; DMF: 디메틸포름아미드; P(O)N(CH3)2Cl: 테트라메틸포스포로디아미딕클로라이드; DMAP:디메틸아미노피리딘; TrtCl:트리페닐메틸클로라이드; TFA: 트리플루오르아세트산; DCM: 디클로로메탄 ; TEA: 트리에틸아민; MeOH: 메탄올; Dowex 50w-8x:양이온 교환 수지)
Figure 112006044311766-pat00038
a. (t-Boc)2O, TEA, DCM, 25℃, 12hr
b. Dowex 50w-8x, MeOH, 60℃, 24hr
c. 숙신산 무수물, DMAP, DCM, 25℃, 16hr
d. 고상 합성
e. TFA, 실온, 3hr
f. 10%Pd/C, MeOH , H2, 25℃, 1hr
g. Dowex 50w-8x, H2O, 25℃, 24hr
((t-Boc)2O : 디tert부틸디카바메이트; TFA: 트리플루오르아세트산; DCM: 디클로로메탄 ; TEA: 트리에틸아민; MeOH: 메탄올; Dowex 50w-8x:양이온 교환 수지)
Figure 112006044311766-pat00039
a. CH3(CH2)14C(O)Cl, TEA, 25℃, 16hr
b. Dowex 50w-8x, MeOH, 60℃, 24hr
c. 숙신산 무수물, DMAP, DCM, 25℃, 16hr
d. 고상 합성
e. TFA, 실온, 3hr
f. 10%Pd/C, MeOH , H2, 25℃, 1hr
g. Dowex 50w-8x, H2O, 25℃, 24hr
(CH3(CH2)14C(O)Cl : 팔미토일클로라이드; TFA : 트리플루오르아세트산; DCM : 디클로로메탄; TEA : 트리에틸아민; MeOH : 메탄올; Dowex 50w-8x :양이온 교환 수지)
Figure 112006044311766-pat00040
a. (t-Boc)2O, TEA, DCM, 25℃, 12hr
b. Dowex 50w-8x, MeOH, 60℃, 24hr
c. CH3(CH2)14C(O)Cl, TEA, 25℃, 16hr
d. Dowex 50w-8x, MeOH, 60℃, 48hr
e. 숙신산 무수물, DMAP, DCM, 25℃, 16hr
f. 고상 합성
g. TFA, 실온, 3hr
h. 10%Pd/C, MeOH , H2, 25℃, 1hr
i. Dowex 50w-8x, H2O, 25℃, 24hr
((t-Boc)2O : 디tert부틸디카바메이트; CH3(CH2)14C(O)Cl : 팔미토일클로라이드; TFA : 트리플루오르아세트산; DCM : 디클로로메탄; TEA : 트리에틸아민; MeOH : 메탄올; Dowex 50w-8x :양이온 교환 수지)
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기의 화학식 9 또는 화학식 12의 구조를 갖는 화합물을 포함하는 아실화제 또는 이를 사용하는 아실화 방법을 제공한다.
[화학식 9]
Figure 112006044311766-pat00041
[화학식 12]
Figure 112006044311766-pat00042
상기 식 중, R3'는 디메틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 또는 벤질아민이 고,
R1′과 R2′는 각각 상이하고, -OH, 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH이며, R1′과 R2′가 동시에 -OH 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH가 아니며,
R4′와 R5′는 각각 상이하고, -OC(O)(CH2)pCH3 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH이며, R4′와 R5′가 동시에 -OC(O)(CH2)pCH3 또는 -OC(O)(CH2)mC(O)OH가 아니다.
상기에서 설명한 바와 같이, 상기 화학식 9 또는 화학식 12의 구조를 갖는 화합물을 사용하여 아실기와 치환 가능한 작용기를 갖는 화합물과 반응하여 아실화시키는 반응을 수행할 수 있다. 예컨대, 상기 화학식 9 또는 화학식 12의 구조를 갖는 화합물을 아미노기를 갖는 화합물과 반응시켜 아미드 결합을 생성시키는 반응을 수행할 수 있다. 상기 아미노기를 갖는 화합물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 펩타이드, 또는 단백질일 수 있다.
상기 제조된 본 발명의 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 우수한 항산화, 항노화, 피부주름 개선, 미백효과를 나타낼 뿐만 아니라, 피부 자극, 감작성, 및 광독성 등을 나타내지 않는다. 또한, 본원 발명의 비타민 C 유도체는 친수성의 비타민 C가 피부와 유사한 친유성을 갖도록 콜라겐 생성 펩타이드 등을 결합시켜 유도체화 되어 있으므로, 피부 침투력도 매우 우수하다. 또한, 이와 같이 콜라겐 생성 펩타이드가 결합된 경우 피부 주름 개선 효과에 대하여 상승적인 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본원 발명의 비타민 C 유도체는 인산 유도체와 결합되어 안정성 면에서도 현저하게 개선된 효과 를 갖는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 유효성분으로 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 화학식 2의 구조를 갖는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 함유하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 경피 투여를 위하여 피부 외용으로 적용되는 것이 바람직하며, 상기 유효성분의 우수한 경피 흡수성과 안정성으로 인하여, 피부 노화 방지, 주름 개선, 피부 거칠음 개선, 미백, 보습 등에 있어서 우수한 효과를 나타내어, 우수한 피부 상태 개선 및 피부 상태 악화 억제 효과를 갖는다.
본 명세서에 있어서, 상기 '피부외용'이란 용어는 피부의 보습효과, 미백 효과, 주름 억제효과, 피부 거칠음 개선효과, 경피 흡수 촉진효과 등의 다양한 효과를 나타내어 피부 상태를 개선하거나 피부 상태의 악화를 억제하기 위해 사용한다는 것을 의미한다. 본 발명의 피부외용제는 화장료, 의약품, 특히, 연고 등의 외용 의약품 등으로 사용될 수 있다. 그 중에서도 화장료 형태의 사용이 바람직하며, 이러한 화장료의 형태는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 화학식 2의 구조를 갖는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상의 물질의 함량은 조성물의 적용 용도, 형태 및 목적 등에 의하여 적절하게 결정될 수 있다. 상기 유효 함량의 조성물 내 함량이 0.001% 미만인 경우에는 실질적인 피부 개선 효과를 얻을 수 없으므로, 상기 범위 이상인 것이 좋다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 피부 개선용 조성물은 상기 유효 성분을 0.001 내지 50%(ww), 바람직하게는 0.001 내지 5%(w/w), 보다 바람직하게는 0.01 내지 3%(w/w)의 양으로 함유하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 개선용 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다. 이러한 용매를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하는 경우 화합물의 종류에 따라, 용매의 혼합비에 따라 용매에 대한 화합물의 용해도가 조금씩 다르나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 피부 개선용 조성물은 적용되는 형태에 따라서 적절한 향료, 색소, 방부제, 부형제 등의 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명의 피부 개선용 조성물은 외용 연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩 등의 다양한 형태로 제품화될 수 있다. 예컨대, 피부외용 연고로 적용되는 경우, 상기 화학식 1 또는 2의 화합물의 유효 성분 이외에 바셀린 50.0 내지 97.0중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5.0중량%를 함유하도록 제조될 수 있다. 또한, 유연화장수로 적용되는 경우, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 다가알콜류 1.0 내지 10.0중량% 및 폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 계면활성제 0.05 내지 2.0 중량%를 함유 하도록 제조될 수 있다. 또한, 영양화장수 또는 영양크림으로 적용되는 경우, 상기 유효성분 이외에 스쿠알렌, 바셀린, 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5.0 내지 20.0중량% 및 에탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등의 왁스성분 3.0 내지 15.0중량%을 함유하도록 제조될 수 있다. 또한, 에센스로 적용되는 경우에는, 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가알콜류 5.0 내지 30.0중량%를 함유하도록 제조될 수 있다. 또한, 마사지크림으로 적용되는 경우에는, 상기 유효성분 이외에 유동 파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 30.0 내지 70.0중량% 함유하도록 제조될 수 있으며, 팩으로 적용되는 경우에는, 폴리비닐알콜을 5.0 내지 20.0중량% 함유하는 필오프 팩 또는 일반 유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5.0 내지 30.0 중량% 함유된 워시오프 팩으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 개선용 조성물은 일반 화장료에 배합되는 통상적인 성분, 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 좀더 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 3- O -벤질-2- O -테트라메틸포스포로디아미딕-6- O -트리페닐메틸-5- O -숙시닐-아스코르브산 합성
하기의 반응식에 나타난 바에 따라서, 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아 미딕-6-O-트리페닐메틸-5-O-숙시닐-아스코르브산을 제조하였다. 이하, 기재된 단계는 하기의 반응식에 기재된 것을 기준으로 한 것이다.
Figure 112006044311766-pat00043
(a) 벤질기에 의한 보호화 단계
5,6-이소프로필리디엔-L-아스코르브산(290g, 1.34mol)을 디메틸포름아미드 2L에 용해시킨 후, 고체 탄산칼륨(92.7g, 0.67mol)을 첨가하였다. 상기 용액에 벤질클로라이드(115g, 0.67mmol)를 가한 후, 25℃에서 4시간 동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디메틸포름아미드를 제거하였다. 상기 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 2L에 용해시킨 후, 물 2L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 물에 녹는 불순물들을 제거하였다. 추출된 유기층에 무수 황산나트륨 500g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 3 번 탄소 위치의 하이드록시기가 벤질기로 보호화된 5,6-이소프로필리디엔-L-아스코르브산 300g을 얻었다.
(b) 인산 유도체의 도입 단계
상기 생성된 화합물 300g과 디메틸아미노피리딘 120g을 디클로로메탄 2L에 녹인 후, 테트라메틸포스포로디아미딕클로라이드 180g을 가하고, 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 상기 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 2L로 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 2L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 500g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 2번 탄소 위치에 테트라메틸포스포로디아미드기가 도입된 5,6-이소프로필리디엔-L-아스코르브산 300g을 얻었다.
(c) 산 첨가에 의한 개환 단계
상기 생성된 화합물 300g을 디클로로메탄 800ml에 녹인 후, 20%(v/v) 트리플루오르아세트산 (TFA) 200ml를 첨가하고, 25℃에서 4시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄과 TFA를 제거한 후, 재결정화하여 옅은 노란색의 반고체 형태의 개환된 아스코르브산 유도체 250g을 얻었다.
(d) 6번 탄소 위치의 하이드록시기의 보호화 단계
상기 생성된 화합물 250g과 트리에틸아민 64g을 디클로로메탄 1L에 녹인 후, 트리페닐메틸클로라이드 180g을 가하고, 25℃에서 24시간동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 상기 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트로 2L로 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 2L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 500g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 6번 탄소 위치의 하이드록시기가 트리페닐메틸클로라이드로 보호화된 아스코르브산 유도체 240g을 얻었다.
(e) 5번 탄소 위치에 숙신산이 결합된 아스코르브산 유도체의 합성 단계
상기 수득된 화합물 240g을 디클로로메탄 2L에 용해시키고, 디메틸아미노피리딘(1.1eq.)과 숙신산(1.2eq.)을 가한 후 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거한 후, 농축된 용액을 에틸아세테이트로 2L로 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 2L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 500g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 농축된 용액을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 옅은 노란색의 반 고체형태의 화합물 270g을 얻었다 (전체수율: 27.1%). 상기 얻어진 화합물을 NMR 분석한 결과는 다음과 같았으며, 이를 통하여, 얻어진 화합물이 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-5-O-숙시닐-아스코르브산임을 확인하였다.
표제 화합물의 1HNMR (CDCl3) : 2.63(tt, 4H, CH 2CH 2COOH), 2.7(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2), 5.53(dd, 2H, O-CH 2-Ph), 7.33(m, 20H, Ar-H)
실시예 2: 3- O -벤질-2- O -테트라메틸포스포로디아미딕-5- O -tert-부틸록시카르보닐-6- O -숙시닐-아스코르브산 합성
하기의 반응식에 나타난 바에 따라서, 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-5-O-tert-부틸록시카르보닐-6-O-숙시닐-아스코르브산을 제조하였다. 3-O-벤 질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산의 합성 과정은 실시예 1에 따랐다. 이하, 기재된 단계는 하기의 반응식에 기재된 것을 기준으로 한 것이다.
Figure 112006044311766-pat00044
(a) 5번 탄소 위치의 하이드록시기의 보호화 단계
3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산(100g, 0.1556mol)과 트리에틸아민(18g)을 디클로로메탄 1L에 용해시킨 후, 상기 용액에 디tert부틸디카바메이트(37g)를 가한 후, 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 상기 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 1L에 용해시킨 후, 5% 황산수소나트륨 용액 1L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 물에 녹는 불순물들을 제거하였다. 추출된 유기층에 무수 황산나트륨 300g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 5 번 탄소 위치의 하이드록시기가 tert-부틸록시카르보닐기로 보호화된 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-5- O-tert-부틸록시카르보닐-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산 104g을 얻었다.
(b) 6번 탄소 위치의 탈보호화 단계
상기 생성된 화합물 104g을 메틸알코올 1L에 녹인 후, 양이온 교환수지 Dowex50w-8x을 첨가하고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 여과하고, 감압하에서 메틸알코올을 제거하였다. 이와 같이 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 1L에 녹이고, 5% 탄산수소나트륨 용액 1L를 가하고, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 300g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 6번 탄소 위치가 탈보호화되어 하이드록시기를 갖는 아스코르브산 유도체 63g을 얻었다.
(c) 6번 탄소 위치에 숙신산이 결합된 아스코르브산 유도체의 합성 단계
상기 수득된 화합물 63g을 디클로로메탄 1L에 용해시키고, 디메틸아미노피리딘(1.1eq.)과 숙신산(1.2eq.)을 가한 후 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거한 후, 농축된 용액을 에틸아세테이트로 1L로 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 1L를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 300g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 농축된 용액을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 옅은 노란색의 반 고체형태의 화합물 68g을 얻었다 (전체수율: 25%). 상기 얻어진 화합물을 NMR 분석한 결과는 다음과 같았으며, 이를 통하여, 얻어진 화합물이 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-5-O-tert-부틸록시카르보닐-6-O-숙시닐-아스코르브산임을 확인하였다.
표제 화합물의 1HNMR (CDCl3) : 1.42(s, 9H, OC(CH 3 )3), 2.63(tt, 4H, CH 2CH 2COOH), 2.7(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2), 5.53(dd, 2H, O-CH 2-Ph), 7.33(m, 5H, Ar-H)
실시예 3: 3- O -벤질-2- O - 테트라메틸포스포로디아미딕 -5- O - 팔미토일 -6- O - 숙시닐 -아스코르브산 합성
하기의 반응식에 나타난 바에 따라서, 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-5-O-팔미토일-6-O-숙시닐-아스코르브산을 제조하였다. 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산의 합성 과정은 실시예 1에 따랐다. 이하, 기재된 단계는 하기의 반응식에 기재된 것을 기준으로 한 것이다.
Figure 112006044311766-pat00045
(a) 5번 탄소 위치에 팔미토일기 도입 단계
3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산 10g과 트리에틸아민 2g을 디클로로메탄 100ml에 녹인 후, 팔미토일클로라이드 5g를 가하고, 25℃에서 16 시간동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 100ml을 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 5번 탄소 위치에 팔미토일기가 도입된 아스코르브산 유도체 10g을 얻었다.
(b) 6번 탄소 위치의 탈보호화 단계
상기 생성된 화합물 10g을 메틸알코올 100ml에 녹인 후, 양이온 교환수지 Dowex50w-8x을 첨가하고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 여과하고, 감압하에서 메틸알코올을 제거하였다. 이와 같이 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 녹이고, 5% 탄산수소나트륨 용액 100ml을 가하고, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 6번 탄소 위치가 탈보호화되어 하이드록시기를 갖는 아스코르브산 유도체 5g을 얻었다.
(c) 6번 탄소 위치에 숙신산 도입 단계
상기 수득된 화합물 5g을 디클로로메탄 50ml에 용해시키고, 디메틸아미노피리딘(1.1eq.)과 숙신산(1.2eq.)을 가한 후 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거한 후, 농축된 용액을 에틸아세테이트 50ml에 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 50ml를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 10g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 농축된 용액을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 옅은 노란색의 반 고체형태의 화합물 5g을 얻었다 (전체수율:13.3%). 상기 얻어진 화합물을 NMR 분석한 결과는 다음과 같았으며, 이를 통하여, 얻어진 화합물이 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포러디아미딕-5-O-팔미토일-6-O-숙시닐-아스코르브산임을 확인하였다.
표제 화합물의 1HNMR (CDCl3) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.59(tt, 4H, CH 2CH 2COOH), 2.7(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2), 5.53(dd, 2H, O-CH 2-Ph), 7.33(m, 5H, Ar-H)
실시예 4: 3- O -벤질-2- O -테트라메틸포스포로디아미딕-6- O -팔미토일-5- O -숙시닐-아스코르브산 합성
하기의 반응식에 나타난 바에 따라서, 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-팔미토일-5-O-숙시닐-아스코르브산을 제조하였다. 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산의 합성 과정은 실시예 1에 따름. 이하, 기재된 단계는 하기의 반응식에 기재된 것을 기준으로 한 것이다.
Figure 112006044311766-pat00046
(a) 5번 탄소 위치의 하이드록시기의 보호화 단계
3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산(10g, 15,56mmol)과 트리에틸아민(1.8g)을 디클로로메탄 100ml에 용해시킨 후, 상기 용액에 디tert부틸디카바메이트(3.7g)를 가한 후, 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 상기 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 용해시킨 후, 5% 황산수소나트륨 용액 100ml를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 물에 녹는 불순물들을 제거하였다. 추출된 유기층에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수 분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 5 번 탄소 위치의 하이드록시기가 tert-부틸록시카르보닐기로 보호화된 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-5-O-tert-부틸록시카르보닐-6-O-트리페닐메틸-아스코르브산 10g을 얻었다.
(b) 6번 탄소 위치의 탈보호화 단계
상기 생성된 화합물 10g을 메틸알코올 100ml에 녹인 후, 양이온 교환수지 Dowex50w-8x을 첨가하고 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 여과하고, 감압하에서 메틸알코올을 제거하였다. 이와 같이 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 녹이고, 5% 탄산수소나트륨 용액 100ml를 가하고, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 6번 탄소 위치가 탈보호화되어 하이드록시기를 갖는 아스코르브산 유도체 6.3g을 얻었다.
(c) 6번 탄소 위치에 팔미토일기 도입 단계
상기 생성된 화합물 6.3g과 트리에틸아민 2g을 디클로로메탄 100ml에 녹인 후, 팔미토일클로라이드 5g를 가하고, 25℃에서 16 시간동안 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거하였다. 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 100ml을 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 6번 탄소 위치에 팔미토일기가 도입된 아스코르브산 유도체 10g을 얻었다.
(b) 5번 탄소 위치의 탈보호화 단계
상기 생성된 화합물 10g을 메틸알코올 100ml에 녹인 후, 양이온 교환수지 Dowex50w-8x을 첨가하고 60℃에서 48시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 여과하고, 감압하에서 메틸알코올을 제거하였다. 이와 같이 얻어진 농축된 용액을 에틸아세테이트 100ml에 녹이고, 5% 탄산수소나트륨 용액 100ml을 가하고, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 30g을 가하여 수분을 제거하고 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하여, 5번 탄소 위치가 탈보호화되어 하이드록시기를 갖는 아스코르브산 유도체 5g을 얻었다.
(e) 5번 탄소 위치에 숙신산 도입 단계
상기 수득된 화합물 5g을 디클로로메탄 50ml에 용해시키고, 디메틸아미노피리딘(1.1eq.)과 숙신산(1.2eq.)을 가한 후 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 감압하에서 상기 용액 중의 디클로로메탄을 제거한 후, 농축된 용액을 에틸아세테이트 50ml에 녹이고, 5% 황산수소나트륨 용액 50ml를 가한 후, 분액여두를 이용하여 유기층을 추출하였다. 상기 추출물에 무수 황산나트륨 10g을 가하여 수분을 제거하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에서 농축하였다. 농축된 용액을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 옅은 노란색의 반 고체형태의 화합물 4.8g을 얻었다 (전체수율:12%). 상기 얻어진 화합물을 NMR 분석한 결과는 다음과 같았으며, 이를 통하여, 얻어진 화합물이 3-O-벤질-2-O-테트라메틸포스포로디아미딕-6-O-팔미토일-5-O-숙시닐-아스코르브산임을 확인하였다.
표제 화합물의 1HNMR (CDCl3) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.59(tt, 4H, CH 2CH 2COOH), 2.7(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2), 5.53(dd, 2H, O-CH 2-Ph), 7.33(m, 5H, Ar-H)
실시예 5: 펩타이드 합성
본 발명에 사용되는 다양한 종류의 펩타이드의 합성은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)을 Nα-아미노산의 보호기로 사용하는 고상법에 의해 합성하였으며, HOBt-DCC (N-hydroxybenzotriazole-dicyclohexylcarodiimide) 방법에 따라 펩타이드를 연장하였다 (Wang C. Chan, Perter D. white, "Fmoc solid phase peptide synthesis" Oxford). 글리신-히스티딘-라이신 (GHK), 글리신-라이신-히스티딘(GKH), 글리신-프롤린-히드록시프롤린(GPO), 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린(KTTKS), 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌(EEMQRR) 펩타이드를 합성하였다.
실시예 6: 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체의 합성
6-1: 화학식 1a의 화합물의 합성
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기 실시예 5에서 합성된 펩타이드(1mmol)에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액 50ml을 가하여 Fmoc기를 제거하였다. 그리고 나서, N-메틸피롤리돈과 디클로로메 탄(dichloromethane)으로 세척한 후, 상기 실시예 1에서 합성된 비타민 C 유도체를 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음, 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 50ml를 첨가하고 25℃에서 3시간 반응시켜, 펩타이드 보호기와 비타민 C의 6번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 트리페닐메틸기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.
비타민 C의 3번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C 0.1g을 메탄올 50ml에 첨가하고, 수소 분위기 하에서 약 1시간 동안 25℃에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이와 같이 얻은 비타민 C 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴을 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써, 상기 화학식 1a의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.5g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 Ia-1 내지 Ia-5의 화합물).
6-2: 화학식 1b의 화합물의 합성
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기 실시예 5에서 합성된 펩타이드(1mmol)에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액 50ml을 가하여 Fmoc기를 제거하였다. 그리고 나서, N-메틸피롤리돈과 디클로로메 탄(dichloromethane)으로 세척한 후, 상기 실시예 2에서 합성된 비타민 C 유도체를 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음, 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 50ml를 첨가하고 25℃에서 3시간 반응시켜, 펩타이드 보호기와 비타민 C의 5번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 tert부틸록시카르보닐기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.
비타민 C의 3번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C 0.1g을 메탄올 50ml에 첨가하고, 수소 분위기 하에서 약 1시간 동안 25℃에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이와 같이 얻은 비타민 C 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴을 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써, 상기 화학식 1b의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.5g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 Ib-1 내지 Ib-5의 화합물).
6-3: 화학식 1c의 화합물의 합성
상기 실시예 6-1에서 합성한 화학식 1a의 화합물 0.5g을 3차 정제수 50ml에 녹이고 양이온 교환수지 Dowex50w-8x 0.5g을 첨가하고 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 여과하고 여액에 에탄올 500ml을 첨가하여 고체를 생성시 키고, 여과하여 진공 건조함으로써, 상기의 화학식 1c의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.4g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 Ic-1 내지 Ic-5의 화합물).
6-4: 화학식 1d의 화합물의 합성
상기 실시예 6-2에서 합성한 화학식 1b의 화합물 0.5g을 3차 정제수 50ml에 녹이고 양이온 교환수지 Dowex50w-8x 0.5g을 첨가하고 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 여과하고 여액에 에탄올 500ml을 첨가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 진공 건조함으로써, 상기의 화학식 1d의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.4g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 Id-1 내지 Id-5의 화합물).
6-5: 화학식 2a의 화합물의 합성
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기 실시예 5에서 합성된 펩타이드(1mmol)에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액 50ml을 가하여 Fmoc기를 제거하였다. 그리고 나서, N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 세척한 후, 상기 실시예 3에서 합성된 비타민 C 유도체를 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음, 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 50ml를 첨가하고 25℃에서 3시간 반응시켜, 펩타이드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.
비타민 C의 3번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C 0.1g을 메탄올 50ml에 첨가하고, 수소 분위기 하에서 약 1시간 동안 25℃에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이와 같이 얻은 비타민 C 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴을 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써, 상기 화학식 2a의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.6g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 IIa-1 내지 IIa-5의 화합물).
6-6: 화학식 2b의 화합물의 합성
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기 실시예 5에서 합성된 펩타이드(1mmol)에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액 50ml을 가하여 Fmoc기를 제거하였다. 그리고 나서, N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 세척한 후, 상기 실시예 4에서 합성된 비타민 C 유도체를 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음, 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 50ml를 첨가하고 25℃에서 3시간 반응시켜, 펩타이드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.
비타민 C의 3번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C 0.1g을 메탄올 50ml에 첨가하고, 수소 분위기 하에서 약 1시간 동안 25℃에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이와 같이 얻은 비타민 C 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴을 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써, 상기 화학식 2b의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.6g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 IIb-1 내지 IIb-5의 화합물).
6-7: 화학식 2c의 화합물의 합성
상기 실시예 6-5에서 합성한 화학식 2a의 화합물 0.5g을 3차 정제수 50ml에 녹이고 양이온 교환수지 Dowex50w-8x 0.5g을 첨가하고 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 여과하고 여액에 에탄올 500ml을 첨가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 진공 건조함으로써, 상기의 화학식 2c의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.5g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 IIc-1 내지 IIc-5의 화합물).
6-8: 화학식 2d의 화합물의 합성
상기 실시예 6-2에서 합성한 화학식 1b의 화합물 0.5g을 3차 정제수 50ml에 녹이고 양이온 교환수지 Dowex50w-8x 0.5g을 첨가하고 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 여과하고 여액에 에탄올 500ml을 첨가하여 고체를 생성시키고, 여과하여 진공 건조함으로써, 상기의 화학식 2d의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체 0.5g을 합성하였다 (하기 표 1의 화합물 번호 IId-1 내지 IId-5의 화합물).
Figure 112006044311766-pat00047
Figure 112006044311766-pat00048
상기 표 1에서 화합물 번호 Ia, Ib, Ic, Id, IIa, IIb, IIc 및 IId는 각각 화학식 1a, 1b, 1c, 1d, 2a, 2b, 2c 및 2d의 화합물을 나타낸다.
화합물 Ia-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ia-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ia-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ia-4에 대한 1H NMR (D2O) : 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ia-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.91(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.61(m, peptide-H), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ib-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ib-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ib-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ib-4에 대한 1H NMR (D2O) : 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ib-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.91(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.61(m, peptide-H), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ic-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ic-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ic-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ic-4에 대한 1H NMR (D2O) : 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Ic-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.91(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.61(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Id-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Id-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Id-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Id-4에 대한 1H NMR (D2O) : 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 Id-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.91(m, peptide-H), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.61(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIa-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIa-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIa-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIa-4에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIa-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.91(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.61(m, peptide-H), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIb-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIb-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIb-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIb-4에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIb-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.91(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.61(m, peptide-H), 2.70(m, 12H, P(O)(N(CH 3)2)2), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIc-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIc-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIc-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIc-4에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IIc-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.91(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.61(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IId-1에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.95(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.21(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IId-2에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IId-3에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.93(m, peptide-H), 1.22(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.66(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.17(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.08(s, 2H, peptide-H), 4.55(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IId-4에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 2.01(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 3.51(m, peptide-H), 4.09(s, 2H, peptide-H), 4.40(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
화합물 IId-5에 대한 1H NMR (D2O) : 0.88(t, 3H, C(O)CH2(CH2)13CH 3), 0.91(m, peptide-H), 1.28(m, 26H, C(O)CH2(CH 2)13CH3), 1.55(m, peptide-H), 2.13(m, peptide-H), 2.42(m, peptide-H), 2.52(m, 4H, CH 2CH 2CONH), 2.53(t, 2H, C(O)CH 2(CH2)13CH3), 2.61(m, peptide-H), 3.33(tt, 2H, C-6-H 2), 4.53(m, peptide-H), 4.98(s, 1H, C-5-H), 5.43(t, H, C-4-H 2)
시험예 1: 콜라겐 생합성능
사람의 피부 섬유아세포에 본 발명의 유효 활성 물질을 첨가하여 세포 수준에서 콜라겐 합성 촉진 효과를 시험하였다.
생합성된 콜라겐의 측정은 ELISA assay 방법을 이용하여 콜라겐 생합성 촉진 효과를 측정하였으며 대조군으로 시료를 첨가하지 않은 것을 100%로 하여 상대적인 콜라겐 생성능을 계산하였다. 상세한 실험방법은 다음과 같다.
사람의 정상 섬유아세포(Dermal fibroblast neonatal, Cambrex)는 세포 배양용 96 웰 플레이트에 3,000개의 세포수로 일정하게 분주하여 0.1% FBS(Fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco BRL)에서 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양되었다. 시험 물질을 각 각 10μM의 농도로 0.1% FBS가 함유된 DMEM에 녹여서, 각 각 200μl를 세포에 처리한 후 72 시간동안 배양하고, 배양 종료 후 상층액을 type 1 콜라겐 항체가 코팅되어 있는 96 웰 플레이트에 처리하여, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상층액을 제거하고 0.05% tween 20이 포함된 PBS(PBST)를 이용하여 세척해 주었고, 바이오틴이 결합된 2차 항체를 96 웰 플레이트에 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 이전과 동일한 방법으로 남아 있는 상층액을 제거하고 PBST를 이용하여 세척해 주었으며, 결합된 콜라겐을 측정하기 위하여 SA-HRP(Streptavidin-Horseradish peroxidase, Sigma)를 결합시켰다. 발색반응을 확인하기 위해 기질로 TMB(3,3'-5,5' tetramethylbenzidine, Sigma)를 처리하여 빛이 차단된 상온에서 15분간 반응시킨 후 1N 황산으로 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기에서 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 Ic-1은 비타민 C(Vc), 마그네슘 아스코빌 포스페이트(MAP), 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드(Vc-KTTKS) 및 팔미토일 펜타펩타이드(Pal-KTTKS) 등의 화합물보다 훨씬 뛰어난 콜라겐 생합성능을 나타내었다. 또한 상기 화합물 Ic-1과 비교해 볼 때, 본 발명의 화합물 Ic-2, Ic-3, Ic-4, 및 Ic-5도 뛰어난 콜라겐 생합성능을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물 Ic-1, Ic-2, Ic-3, Ic-4 및 Ic-5는 안정성 개선 효과와 더불어 우수한 콜라겐 생합성능을 갖는다는 사실을 입증하는 것이다.
시험예 2: 세포 독성 평가
화장품에 사용되는 원료로서의 1차 안전성을 검증하고자 본 발명의 화합물 Ic-1, Ic-2, Ic-3, Ic-4 및 Ic-5와 비타민 C(Vc), 마그네슘 아스코빌 포스페이트(MAP), 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드(Vc-KTTKS) 그리고 팔미토일 펜타펩타이드(Pal-KTTKS)의 세포 독성을 확인하였다. 세포 독성 확인을 위하여, 사람 피부 섬유아세포(Dermal fibroblast neonatal, Cambrex) 3,000개를 세포배양용 96 웰 플레이트에 분주하고 0.1% FBS가 함유된 DMEM(Gibco BRL)으로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양시켰다. 측정하고자하는 시험물질을 각각 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT assay(Mossman T., 1983, Journal of Immunological Methods 65, 55-63)방법에 따라 세포독성을 평가하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 Ic-1는 비타민 C(Vc), 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드(Vc-KTTKS) 및 팔미토일 펜타펩타이드(Pal-KTTKS)와 비교할 때 5 mM 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으며, 본 발명의 다른 화합물 Ic-2, Ic-3, Ic-4, Ic-5의 경우도 5 mM에서 세포독성이 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명의 화합물의 우수한 안전성을 갖는다는 것이 입증되었다.
시험예 3: 안정성 평가
본 발명의 화합물 Ia-1, Ic-1, 비타민 C, 마그네슘 아스코빌 포스페이트 및 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드를 각 각 10μg/ml이 되게 3차 정제수에 녹이고 25℃와 50℃에 30일 동안 보관하면서 UV(254nm)에서의 흡광도 변화를 통하여 시험 물질의 안정성을 평가하였다.
Figure 112006044311766-pat00049
실험 결과, 상기 표 2에서 나타내는 바와 같이 본 발명의 화합물들은 비타민 C와 숙시노일 아스코빌 펜타펩타이드보다 우수한 안정성을 가지며, 기존의 가장 안정한 비타민 C 유도체로 알려진 마그네슘 아스코빌 포스페이트와 동일 이상의 안정성을 나타내며, 상기 이와 더불어 우수한 콜라겐 생합성 효과도 나타내어 낸다.
상기 시험예 1 내지 3에서 얻어진 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 비타민 C 유도체 화합물은 기존의 가장 안정한 비타민 C 유도체로 알려진 물질과 동등 이상의 안정성과 낮은 세포독성을 나타내면서, 이보다 우수한 콜라겐 생합성능을 가지므로, 피부 적용시 비타민 C의 고유의 효과에 더하여 콜라겐에 의한 효과를 동시에 얻을 수 있어서 피부 상태 개선에 상승된 효과를 얻을 수 있다는 이점이 있다.
본 발명의 콜라겐 생성 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C의 유도체는 피부 자극 등의 독성이 없이, 안정성, 안전성, 피부 침투력 등이 향상되어, 피부 상태의 개선 및 악화 억제에 매우 효과적이어서, 외용 의약품, 화장품 제조 등의 산업 분야에 유용한 물질이다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure 112006044311766-pat00050
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 각각 상이하며, -OH 또는
    Figure 112006044311766-pat00051
    이고,
    X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이고,
    Figure 112006044311766-pat00052
    는 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 및 아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이며,
    R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이고,
    n은 3 내지 10의 정수이며,
    m은 2 내지 5의 정수이고,
    W는
    Figure 112006044311766-pat00053
    또는 글루코오스이며,
    R3는 -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, -NHCH2CH2CH3, -NHCH2C6H5, 및 -OH로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1은
    Figure 112006044311766-pat00054
    이고, 상기 R2는 -OH인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 상기 n이 3 내지 6의 정수이고, m이 2인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서, 상기
    Figure 112006044311766-pat00055
    가 글리신-히스티딘-라이신, 글리신-라이신-히스티딘, 글리신-프롤린-히드록시프롤린, 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린 및 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩타이드인, 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서, 상기 R3는 디메틸아민 및 하이드록시기로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비타민 C 유도체는 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산 및 2-포스포-5-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 하기 화학식 2의 구조를 갖는 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
    [화학식 2]
    Figure 112006063783232-pat00056
    상기식에서,
    R4 및 R5는 각각 상이하며, -OC(O)(CH2)pCH3, 또는
    Figure 112006063783232-pat00057
    이고,
    X는 -OC(O)(CH2)mC(O)-이며,
    Figure 112006063783232-pat00058
    는 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 및 아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드이며,
    R은 상기 아미노산 잔기의 곁가지이고,
    n은 3 내지 10의 정수이며,
    m은 2 내지 5의 정수이고,
    p는 10 내지 20의 정수이며,
    W는
    Figure 112006063783232-pat00059
    또는 글루코오스이고,
    R3는 -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, -NHCH2CH2CH3, -NHCH2C6H5, 및 -OH로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 R4는 -OC(O)(CH2)pCH3이고, 상기 R5는
    Figure 112006044311766-pat00060
    인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 이의 염.
  9. 제7항에 있어서, 상기 n은 3 내지 6의 정수이고, m은 2이며, p는 14인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제7항에 있어서, 상기
    Figure 112006044311766-pat00061
    는 글리신-히스티딘-라이신, 글리신-라이신-히스티딘, 글리신-프롤린-히드록시프롤린, 라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린 및 글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩타이드인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제7항에 있어서, 상기 R3은 디메틸아민 및 하이드록시기로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제7항에 있어서, 상기 비타민 C 유도체는 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-라이신-트레오닌-트레오닌-라이신-세린)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-라이신-히스티딘)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-히스티딘-라이신)아스코르브산, 2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산, 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글리신-프롤린-히드록시프롤린)아스코르브산2-테트라메틸포스포로디아미딕-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산 및 2-포스포-5-팔미틸-6-(숙시닐-글루탐산-글루탐산-메티오닌-글루타민-아르기닌-아르기닌)아스코르브산으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  13. 비타민 C의 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 글루코오스, 또는 인산기, 또는 하기의 화학식 6의 인산 유도체를 도입하는 단계 및
    비타민 C의 5번 또는 6번 탄소 위치의 중 어느 하나에 하이드록시기를 생성 시키고, 다른 하나에는 하기의 화학식 8의 디카르복실산을 에스테르 결합시킨 후, 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 및 아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 잔기 3 내지 10개를 갖는 펩타이드와 아미드 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법:
    [화학식 6]
    Figure 112006044311766-pat00062
    [화학식 8]
    HOOC(CH2)mCOOH
    상기 식 중,
    R3'는 디메틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 및 벤질아민으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
    Y는 염소, 브롬, 불소, 및 요오드로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩타이드 내의 아미노산 잔기의 수가 3 내지 6개 이고, m은 2이며, Y는 염소인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 R3'가 디메틸아민인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 비타민 C의 2번 탄소 위치의 하이드록시기에 글루코오스, 또는 인산기, 또는 하기의 화학식 6의 인산 유도체를 도입하는 단계 및
    비타민 C의 5번 또는 6번 탄소 위치의 중 어느 하나의 하이드록시기에 하기의 화학식 11의 지방산을 결합시키고, 다른 하나의 하이드록시기에는 하기의 화학식 8의 디카르복실산을 에스테르 결합시킨 후, 글리신, 라이신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 히드록시프롤린, 트레오닌, 글루탐산, 메티오닐, 글루타민 및 아르기닌으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 잔기 3 내지 10개를 갖는 펩타이드와 아미드 결합시키는 단계를 포함하는, 제7항 내지 제12항에 따른 화학식 2의 구조를 갖는 펩타이드가 결합된 안정화된 비타민 C 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법.
    [화학식 6]
    Figure 112006044311766-pat00063
    [화학식 8]
    HOOC(CH2)mCOOH
    [화학식 11]
    CH3(CH2)pCOOH
    상기 식 중,
    R3'는 디메틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 및 벤질아민으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,
    Y는 염소, 브롬, 불소, 및 요오드로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고,
    m은 2 내지 5의 정수이며
    p는 10 내지 20의 정수이다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드 내의 아미노산 잔기의 수가 3 내지 6개 이고, m은 2이며, Y는 염소인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 R3'가 디메틸아민인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 삭제
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 조성물.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물.
  22. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비타민 C 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물.
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