KR101704617B1

KR101704617B1 - 황금누에고치 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101704617B1
Application number: KR1020150073974A
Authority: KR
Inventors: 이재덕; 안현진; 장래윤; 권수한
Original assignee: 여명바이오켐 주식회사
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2017-02-08
Also published as: KR20160139324A

Abstract

본 발명은 황금누에고치 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 황금누에고치 유래 다이-펩타이드(di-peptide), 'Ser-Ser' 또는 황금누에고치를 가수분해하여 얻어진 세리신(Sericin) 펩타이드를 페길레이션하여 제조된 화합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 미백 효과를 발휘한다.

Description

황금누에고치 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin whitening with peptide from golden silkworm}

본 발명은 황금누에고치 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적 및 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지, 즉, 표피, 진피, 그리고 피하조직으로 나누어진다. 사람의 피부색은 주로 피부 세포 속에 들어있는 멜라닌을 함유하는 멜라노좀의 숫자, 크기, 종류 및 분포도에 따라 다르게 나타난다. 멜라노좀은 멜라닌 세포에 의해 생산되고, 표피에서 생성되는 검은 색소인 멜라닌은 멜라노사이트라는 세포에서 생산된다. 멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛에너지를 흡수하여 더 깊숙이 있는 세포들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고 반대로 자외선 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 기미, 주근깨를 형성하게 되고, 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.

멜라닌 형성과정에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 티로시나아제 효소로 알려져 있다. 이 효소는 조직 중에 존재하는 티로신이라고 하는 아미노산에 작용하는 도파퀴논을 생성시키며 이 도파퀴논으로부터 여러 단계의 자동 산화과정을 거쳐 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다.

한편, 여러 방법으로 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 미백용 조성물을 만들 수 있다.

첫 번째 방법은 멜라닌 생성의 주원인인 자외선을 차단할 수 있는 성분을 함유시키는 것이다. 이 방법에 의한 조성물은 광 산란제 또는 광 차단제를 함유함으로써 자외선에 의한 DNA 손상 또는 염증을 줄여 글루코사민과 같은 티로시나아제가 활성을 나타내기 위해 필요한 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시킬 수 있다. 두 번째 방법은 효소산(코직산), 루시놀, 에릭산 또는 알부틴과 같이 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제의 기능을 방해하는 물질을 사용하는 것이다. 세 번째 방법은 도파크롬을 안정화하여 흑색 멜라닌인 유-멜라닌(Eu-Melanin)으로의 진행을 저지하는 것이다. 네 번째 방법은 티로신이 도파와 도파크롬을 거쳐 복잡한 산화와 축합반응을 거치는 동안에, 강한 항산화 효과를 발휘하여 미백효과를 낼 수 있는 비타민 C와 같은 물질을 사용하는 것이다. 다섯 번째 방법은 효소 또는 알파 하이드록시 애씨드(AHA, Alpha Hydroxy Acid) 등을 사용하여, 생성된 멜라닌을 각질층에서 제거 및 환원시키는 것이다.

한편, 누에의 원사는 피브로인과 이를 싸고 있는 세리신이라는 단백질로 구성되어 있으며, 일반적으로는 누에가 뽑은 원사를 정련작업을 통해 세리신을 제거하고 남은 피브로인으로 실크를 제조한다. 세리신은 정련과정에서 폐기되는 물질로서, 인체친화적인 유용한 단백질로 응용 분야가 확대되고 있다. 정련과정에서 발생된 세리신은 폴리펩타이드의 형태를 가지는데, 이를 합성원료로 적용하기 위해서는 분자량을 낮추는 기술이 필요하다.

한편, 황금누에고치는 컬러 누에의 일종으로 천연 컬러 실크 생산 목적으로 개발되었다. 그러나, 아직까지 백색누에고치에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있을 뿐, 황금누에고치의 산업적 이용, 특히 화장품 소재로서의 개발이 미미한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0428431호 (등록일자: 2004.04.09)에는, 누에고치로부터 수용성의 세리신 제거 후 중성염으로 용해시킨 다음 염을 제거하여 분리된 고분자 실크 프로테인을 단백질 분해효소로 가수분해시켜 제조되는 저분자 실크 프로테인 분말 0.5~10.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 저분자 실크 프로테인을 함유하는 화장품 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1506505호 (등록일자: 2015.03.23)에는, 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 수미자임(Sumizyme), 알칼라제(Alcalase) 및 코지자임(Kojizyme)이 각각 0.1~2.0 : 0.5~2.0 : 0.1~1.0 : 0.1~1.0 : 1.0의 비율로 혼합된 효소용매로 추출된 황금누에의 누에고치 추출물을 화장료의 총 중량에 대하여 0.00001~30.0%(w/w) 함유하는 화장료 조성물에 대한 기술이 기재되어 있다.

본 발명은 황금누에고치 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 황금누에고치 유래 다이-펩타이드(di-peptide), 'Ser-Ser'을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다. 일반적으로 누에고치의 세리신은 폐기되고 있는데, 본 발명에서는 세리신을 유효성분으로 함유하여 피부미백 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공한다. 상기 세리신은, 세리신으로부터 분리된 다양한 분획물을 의미하며, 가장 바람직하게는 다이-펩타이드(di-peptide), 'Ser-Ser'인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 황금누에고치를 가수분해하여 얻어진 세리신(Sericin) 펩타이드를 페길레이션하여 제조된 것으로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다. 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부미백능을 발휘한다.

[화학식 1]

상기 페길레이션 하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 다이-펩타이드 또는 상기 화합물은, 바람직하게 화장료 조성물 총 중량에 대하여, 0.000001~30.0중량%가 함유되는 것이 좋다. 0.000001중량% 미만으로 함유되면 미백 효과가 미미하며, 30.0중량%를 초과하면 경제적이지 못하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있다. 다만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일 예로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나, 떼어내거나, 물로 씻어낼 수도 있다. 일 예로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누일 수 있고, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩일 수 있으며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔일 수 있다. 다만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 황금누에고치 유래 다이-펩타이드(di-peptide), 'Ser-Ser'을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부미백 효과를 발휘한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 황금누에고치를 가수분해하여 얻어진 세리신(Sericin) 펩타이드를 페길레이션하여 제조된 화합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 미백 효과를 발휘한다.

도 1은 황금누에고치 세리신의 추출과정을 나타낸 도이다.
도 2는 황금누에고치에서 추출한 세리신의 GPC(Gel permeation chromatography) 측정 결과이다.
도 3은 황금 실크펩타이드 분획물의 사진이다.
도 4는 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물의 MALDI TOF/TOF MS 스펙트럼이다.
도 5는 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물의 MALDI TOF/TOF MS 스펙트럼이다.
도 6은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물의 ESI 스펙트럼이다.
도 7은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 1~6의 사진이다.
도 8은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 ESI 스펙트럼이다.
도 9는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 residue 1의 아미노산 서열을 확인한 결과이다.
도 10은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 residue 2의 아미노산 서열을 확인한 결과이다.
도 11은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 이온 분석 결과이다.
도 12는 황금 실크펩타이드의 세포독성을 확인한 결과이다. (A) 시료의 농도가 50 ppm인 경우, (B)는 시료의 농도가 100 ppm인 경우, (C)는 시료의 농도가 150 ppm인 경우 세포독성 확인 결과이다. 'Blank'는 시료 무처리군, 'W-Sericin'은 백색 세리신, 'G-Sericin' 황색 세리신, 'UF-50'은 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물, 'UF-10'은 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물, 'UF-1.0'은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물, 'B-P1'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 1, 'B-P2'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 2, 'B-P3'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 3, 'B-P4'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 4, 'B-P5'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 5, 'B-P6'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6을 의미한다.
도 13은 황금 실크펩타이드의 멜라닌 생성 억제효과를 확인한 결과이다. 'Blank'는 시료 무처리군, 'W-Sericin'은 백색 세리신, 'G-Sericin' 황색 세리신, 'UF-50'은 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물, 'UF-10'은 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물, 'UF-1.0'은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물, 'B-P1'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 1, 'B-P2'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 2, 'B-P3'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 3, 'B-P4'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 4, 'B-P5'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 5, 'B-P6'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6을 의미한다.
도 14는 NH-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc의 합성 스킴이다.
도 15는 Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH의 합성 스킴이다.
도 16은 Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc의 합성 스킴이다.
도 17은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 합성 스킴이다.
도 18은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 19는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 20은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 HPLC 스펙트럼이다.
도 21은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 MS 스펙트럼이다.
도 22는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 합성 스킴이다.
도 23은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 24는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 25는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 HPLC 스펙트럼이다.
도 26은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane] MS 스펙트럼이다.
도 27은 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 합성 스킴이다.
도 28은 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 29는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 30은 황금 실크펩타이드 유도체의 세포독성을 확인한 결과이다. '①'은 황금 실크펩타이드, '②'는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '③'은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '④'는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)를 의미한다.
도 31은 황금 실크펩타이드 유도체의 멜라닌 생합성 억제 효과를 확인한 결과이다. '①'은 황금 실크펩타이드, '②'는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '③'은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '④'는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)를 의미한다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 황금누에고치로부터 세리신 추출]

본 실시예에서는 황금누에고치로부터 세리신을 추출하고자 하였다.

농촌진흥청에서 수매한 황금누에는 위탁기관인 충북대학교 산학협력단에서 절각하여 실험에 사용하며, 황금누에는 모든 실험 전에 세절하여 사용하였다.

세절견과 정제수를 1:40 비율로 진공펌프를 이용하여 완전히 침지시키고 110℃에서 11시간 동안 2회 추출하였다. 그 후, 15 ㎛ 카트리지 필터(cartridge filter)로 여과하였다. 그 후, 53℃에서 감압농축하여 4 brix의 농축물을 제조하였다. 상기 농축물에 2% (w/w)(농축액 대비) 비율로 단백질 분해효소를 첨가한 후, 55℃에서 9시간 동안 혼합하였다. 그 후, 멤브레인 카트리지 필터로 여과하여 분자량이 80,000~200,000인 것을 여과하였고, 이를 53℃에서 감압농축하여 15 brix의 농축물을 제조하였다. 그 후, 90℃에서 1시간 동안 살균시킨 후, 송풍 170℃, 배풍 120℃의 조건으로 분무 건조하여 황금누에고치 세리신 분말을 수득하였다 (도 1 참조). 이하에서는 상기와 같이 수득된 황금누에고치 세리신을 '황금 세리신'이라고 지칭하였다. 도 1은 황금누에고치 세리신의 추출과정을 나타낸 도이다.

[ 실험예 1: 황금누에고치 세리신 분말의 분자량 및 아미노산 조성 분석]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득한 황금누에고치 세리신 분말(황금 세리신 분말)의 분자량 및 아미노산 조성을 분석하고자 하였다.

(1) 분자량 ( GPC ) 분석

황금누에고치에서 추출한 세리신분말의 분자량 분포를 분석하기 위하여 GPC(Gel Permeation Chromatography)분석을 하였다. 분석하기 앞서 표준시료(PEG/PEO)를 이용하여 캘리브레이션(Calibration) 및 Mw 표준검량선을 작성하였으며, 신뢰성을 위하여 표준시료의 Mw 표준검량선을 3~4회 반복실험 통하여 재현성 확인 후 표준검량선을 작성하고, 세리신 분말 용액을 측정(분석)하여 황금 세리신 분말의 분자량을 측정하였다.

분석결과, 황금누에고치에서 추출한 세리신의 분자량 분포는 Mw 350~50,000의 분자량 분포를 가지며, Mw(평균분자량)는 5,881 Da임을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 황금누에고치에서 추출한 세리신의 GPC(Gel permeation chromatography) 측정 결과이다.

(2) 아미노산 조성 분석

황금누에고치에서 추출한 세리신 분말의 아미노산 조성을 살펴보기 위하여 6N-HCl을 이용하여 가수분해(Hydrolysis)하고, PITC(Phenyl isothiocyanate)로 유도체화 시킨 후 분석용 시료로 사용하였다. 아미노산 조성 분석은 아미노산 조성 분석(HPLC PICO-TAG system)을 이용하여 분석하였다. 황금누에고치에서 추출한 세리신 분말의 아미노산 조성은 하기 표 1에 나타내었고, 백색누에고치에서 수득한 세리신 분말 (백색 세리신)의 아미노산 조성은 하기 표 2에 나타내었다.

AA	Result	MOL%	(ug/mg)^a	(nmol/mg)^b
ASX**	3082.04	15.78	134.99	1014.16
GLX**	799.74	4.10	38.72	263.16
SER	7117.89	36.45	246.14	2342.18
GLY	2906.24	14.88	71.79	956.31
HIS	153.74	0.79	7.85	50.59
ARG	416.98	2.14	23.90	137.21
THR	1958.96	10.03	76.79	644.61
ALA	1163.40	5.96	34.11	382.82
PRO	55.94	0.29	2.12	18.41
TYR	189.22	0.97	11.28	62.27
VAL	747.36	3.83	28.81	245.92
MET	72.78	0.37	3.57	23.95
ILE	129.06	0.66	5.57	42.47
LEU	179.60	0.92	7.75	59.10
PHE	23.30	0.12	1.27	7.67
LYS	531.63	2.72	25.57	174.94
TOTAL	19527.88	100.00	720.23	6425.76

** ASX, GLX mean the sum of asparagine & aspartic acid and glutamine & glutamic acid, respectively.

AA	Result	MOL%	(ug/mg)^a	(nmol/mg)^b
ASX**	2403.88	15.72	104.15	782.51
GLX**	803.53	5.25	38.48	261.57
SER	4872.45	31.86	166.68	1586.08
GLY	2632.76	17.22	64.34	857.02
HIS	162.61	1.06	8.21	52.93
ARG	436.96	2.86	24.78	142.24
THR	1124.63	7.35	43.61	366.09
ALA	1079.62	7.06	31.31	351.44
PRO	114.04	0.75	4.27	37.12
TYR	345.62	2.26	20.39	112.51
VAL	412.42	2.70	15.73	134.25
MET	31.99	0.21	1.55	10.41
ILE	75.93	0.50	3.24	24.72
LEU	128.92	0.84	5.50	41.96
PHE	51.95	0.34	2.79	16.91
LYS	615.49	4.02	29.29	200.36
TOTAL	15292.81	100.00	564.34	4978.13

분석 결과, 황금, 백색누에고치 세리신 모두 대표적인 아미노산이 Ser(세린), Gly(글라이신), Asp(아스파틱산)으로 대부분 조성되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 황금누에고치 세리신의 Ser(세린) 함량이 백색누에고치 세리신에 비해 높은 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2: 황금누에고치 세리신으로부터 황금 실크펩타이드 분획 - 한외여과 (Ultracilation)]

본 실시예에서는 황금누에고치로부터 추출된 황금누에고치 세리신 분말을 이용하여 황금 실크펩타이드를 분획하고자 하였다.

(1) 한외여과 ( Ultrafilation ) 분획

황금누에고치 세리신 분말 (황금 세리신)을 증류수를 이용하여 2% 용액으로 제조하고, 2% 용액을 원심분리 (4000rpm/0.5hr)하여 상등액을 분리하였다. 그 후, 0.45 ㎛ 나일론 멤브레인 필터(Nylon membrain filter)를 이용하여 불용성 황금 세리신을 제거하였다. 그 후, 여액을 한외여과장치(Amicon Stirred Cell)를 이용하여 분획하였다. 한외여과장치의 조건은, 멤브레인 필터(Membrain filter, 76 mm 디스크필터 50 Kda, 10 Kda, 1.0 Kda /Millipore 사)와 1.0~2.0 bar(N2 gas) 여과 압력조건에서 교반하면서 분획 여과하였다. 분획을 통하여, 황금 실크펩타이드 분획물 3종 (Peptide 50 Kda, Peptide 10 Kda, Peptide 1.0 Kda)을 수득하였다 (도 3). 도 3은 황금 실크펩타이드 분획물의 사진이다. 이하에서는 한외여과를 통해 분획된 황금 실크펩타이드 분획물을 'UF-분획물'이라고 하였다.

(2) 황금 실크펩타이드 분자량 분석

한외여과 분획법을 이용하여 황금누에고치 세리신 분말로부터 분획된 황금 실크펩타이드의 분자량을 분석하였다.

황금 실크펩타이드의 크기가 50 Kda, 10 Kda인 것은 MALDI TOF/TOF MS를 이용하여 분석하였고, 1.0 Kda인 것은 ESI 스펙트럼을 이용하여 분석하였다. 분석 결과 50 Kda 이하 분획물에서는 분자량의 분포가 2.0~10 Kda의 분자량을 가지며 (도 4), 10 Kda 이하 분획물에서는 분자량의 분포가 2.0~5.0Kda의 분자량을 가지고 (도 5), 1.0 Kda 이하 분획물의 경우 500~50 da 사이의 분자량 분포를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 도 4는 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물의 MALDI TOF/TOF MS 스펙트럼이고, 도 5는 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물의 MALDI TOF/TOF MS 스펙트럼이며, 도 6은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물의 ESI 스펙트럼이다.

[ 실시예 3: 한외여과(Ultracilation)로 분획된 황금 실크펩타이드의 바이오겔 (Biogel) 분획]

본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 한외여과(Ultracilation)로 분획된 황금 실크펩타이드를 바이오겔(Biogel)로 분획하고자 하였다.

(1) 바이오겔 ( Biogel ) 분획

바이오겔 P2 겔(Bio-Gel P2 Gel (Bio-rad co,))을 충진한 컬럼(φ3.0×96)을 사용하여 황금 실크펩타이드 분획물 (1.0 Kda) 1 g을 증류수 2 ㎖로 용해시킨 후 20 ㎖/hr 유속으로 증류수로 용출시켰다. 이때 용출액을 튜브(Tube)당 20 ㎖씩 분획하였고, 하기 표 3과 같이 순번을 부여하여 최종 분획물 6종을 'Prep 1~6'이라고 지칭하였다. 도 7은 황금 실크펩타이드 Prep 1~6 분획물의 사진이다. 또한, 종결점을 닌하이드린 테스트(Ninhydrin Test)를 통하여 분획물 용출 여부를 확인 하였다. 이하에서는 한외여과하여 분획된 황금 펩타이드 분획물을 바이오겔로 더욱 분획하여 수득한 황금 실크펩타이드 분획물을 'BioGel-분획물'이라고 하였다.

(2) 분자량 및 아미노산 서열( squence ) 확인

상기 분획된 Prep 1~6은 하기 표 3에 기재된 바와 같이 각각의 분석장비를 이용하여 분자량 및 아미노산 서열을 확인하였다.

분획물의 순번이 높을수록 분자량이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 최종 분출물의 분자량은 193.2 Da, 서열은 Ser-Ser으로 확인되었다. Ser-Ser의 이론 분자량은 192.17 Da이다 (도 8 내지 도 10). 도 8은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 ESI 스펙트럼이고, 도 9는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 residue 1의 아미노산 서열을 확인한 결과이며, 도 10은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 residue 2의 아미노산 서열을 확인한 결과이다.

순번	샘플명	분자량(Da)	분석장비
1	Prep 1	2147	MALDI TOF/TOF MS
2	Prep 2	679	MALDI TOF/TOF MS
3	Prep 3	568	MALDI TOF/TOF MS
4	Prep 4	441	MALDI TOF/TOF MS
5	Prep 5	417	MALDI TOF/TOF MS
6	Prep 6	193	ESI

[ 실험예 2: 황금 실크펩타이드의 물리화학적 특성 분석]

본 실험예에서는 백색 세리신, 상기 실시예 1에서 분획된 황금 세리신, 실시예 2에서 한외여과로 분획된 50 Kda, 10 Kda, 1.0 Kda 황금 실크펩타이드 분획물 (UF-분획물) 및 실시예 3에서 분획된 Prep 1~6 황금 실크펩타이드 분획물 (BioGel-분획물)의 pH 및 건조감량을 측정하였다.

pH 측정 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 건조감량 측정은 105℃에서 3시간 동안 건조한 후 측정하였으며, 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

샘플	pH (2% sol)
백색 세리신	6.6
황금 세리신	6.7
황금 실크펩타이드 분획물 - 50 Kda	6.8
황금 실크펩타이드 분획물 - 10 Kda	6.8
황금 실크펩타이드 분획물 - 1.0 Kda	6.8
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 1	6.7
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 2	6.8
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 3	6.7
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 4	6.7
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 5	6.7
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 6	6.8

샘플	건조감량 (%)
백색 세리신	0.7
황금 세리신	0.8
황금 실크펩타이드 분획물 - 50 Kda	0.6
황금 실크펩타이드 분획물 - 10 Kda	0.6
황금 실크펩타이드 분획물 - 1.0 Kda	0.5
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 1	0.5
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 2	0.8
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 3	0.9
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 4	0.9
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 5	1.1
황금 실크펩타이드 분획물 - Prep 6	1.2

pH 측정결과, 모든 샘플의 pH가 6.6~6.8임을 확인할 수 있었다.

건조감량 측정결과, 황금 실크펩타이드 중 Prep 1~6은 분자량이 작을수록 건조감량이 크게 측정됨을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 3: 황금 실크펩타이드 총 질소함량 분석]

본 실험예에서는 이온 분석(EA : Elemental analyzer)을 이용하여 상기 실시예 3에서 분획된 황금 실크펩타이드 Prep 6의 총 질소함량 (%)을 분석하고자 하였다.

고온 (약 1000℃)에서 촉매를 이용하여, 각각 CO₂, H₂O, NO₂, SO₂로 산화시키고, 발생가스를 GC컬럼을 이용하여 분리하였다. 검출은 TCD(Thermal conductive detector)를 이용하였고, 미리 표준물질을 이용하여 각 C, H, N, S의 검량곡선을 그리고, GC 크로마토그램으로부터 질소(N) 원소의 함량 (%)을 정량하였다.

황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6을 이온 분석(EA)한 결과, 질소(N) 함량 (%)이 13.03%로 측정되었다 (도 11). 도 11은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6의 이온 분석 결과이다.

[ 실험예 4: 황금 실크펩타이드의 세포독성 확인]

본 실험예에서는 백색 세리신, 황금 세리신, UF-분획물 3종 (50 Kda, 10 Kda, 1.0 Kda), BioGel-분획물 6종(Prep 1, Prep 2, Prep 3, Prep 4, Prep 5, Prep 6)의 세포독성을 확인하고자 하였다.

6웰 플레이트(6well plate)에 B16/F1 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 24시간 후, 시료를 50, 100, 150 ppm 농도로 처리하였다. 24시간 후 WST assay방법으로 세포독성을 조사하였다. 물질 처리는 72시간 후에 세포를 회수하고 계수하여 세포 농도와 생존율을 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복 실험하였다.

실험 결과, 백색 세리신, 황금 세리신, UF-분획물 3종 (50 Kda, 10 Kda, 1.0 Kda), BioGel-분획물 6종 (Prep 1, Prep 2, Prep 3, Prep 4, Prep 5, Prep 6) 모두 무처리군을 대조군으로 하여 100%라고 했을 때. 각 농도별로 5% 이하의 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 12). 도 12는 황금 실크펩타이드의 세포독성을 확인한 결과이다. (A)는 시료의 농도가 50 ppm인 경우, (B)는 시료의 농도가 100 ppm인 경우, (C)는 시료의 농도가 150 ppm인 경우 세포독성 확인 결과이다. 'Blank'는 시료 무처리군, 'W-Sericin'은 백색 세리신, 'G-Sericin' 황색 세리신, 'UF-50'은 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물, 'UF-10'은 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물, 'UF-1.0'은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물, 'B-P1'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 1, 'B-P2'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 2, 'B-P3'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 3, 'B-P4'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 4, 'B-P5'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 5, 'B-P6'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6을 의미한다.

[ 실험예 5: 황금 실크펩타이드의 미백 효과 확인- 멜라닌생합성 저해효과]

본 실험예에서는 백색 세리신, 황금 세리신, UF-분획물 3종 (50 Kda, 10 Kda, 1.0 Kda), BioGel-분획물 6종(Prep 1, Prep 2, Prep 3, Prep 4, Prep 5, Prep 6)의 미백 효과를 확인하고자 농도 100 ppm에서 멜라닌생성 억제 효과를 확인하였다.

실험은 B-16/F1(murinemelanoma)를 FBS(fetalbovineserum)가 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트(6-well plate)에 웰(well)당 1개로 접종한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 세포가 웰(well) 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료가 적당 농도로 희석된 배지로 교체한 후, 5% CO₂, 37℃ 하에서 일 정시간 배양하였다. 시료의 농도범위는 크리스탈 바이올렛 어세이(crystal violet assay)를 이용한 독성실험을 통하여 결정하였다.

배지를 제거한 세포를 PBS(phosphatedbuffersaline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 세포 수를 측정한 후 5,000~10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛(pellet)을 수득하였다. 상기 세포 펠렛(pellet)은 60℃에서 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 얻었다. 상기 액을 가지고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포일정수 당 멜라닌양 또는 일정 단백질당 멜라닌양을 구하였다. 공시험으로 보정하였으며, 모든 실험은 3회 반복 실험하였다.

실험결과, 황금 세리신이 백색 세리신보다 멜라닌생성 억제 효과가 훨씬 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 황금 실크펩타이드 분획물 또한 우수한 멜라닌생성 억제 효과를 나타내었는데, 특히 황금 실크펩타이드 분획물 중 Prep 6의 멜라닌 생성 억제 효과가 20.3%로, 다른 분획물에 비해 우수한 멜라닌생성 억제 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다 (도 13). 도 13은 황금 실크펩타이드의 멜라닌 생성 억제효과를 확인한 결과이다. 'Blank'는 시료 무처리군, 'W-Sericin'은 백색 세리신, 'G-Sericin' 황색 세리신, 'UF-50'은 황금 실크펩타이드 50 Kda 분획물, 'UF-10'은 황금 실크펩타이드 10 Kda 분획물, 'UF-1.0'은 황금 실크펩타이드 1.0 Kda 분획물, 'B-P1'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 1, 'B-P2'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 2, 'B-P3'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 3, 'B-P4'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 4, 'B-P5'는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 5, 'B-P6'은 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6을 의미한다.

[ 실시예 4: 페길화 소재의 중간체 합성]

(1) NH -[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane ]- Boc 합성

둥근바닥 플라스크에 메탄올(MeOH) 20 ㎖를 넣고 무게를 잰 다음, 0℃에서 염화수소(HCl) 가스를 15분간 버블링(bubbling)하였다. 이것을 상온에서 15분간 교반(stirring)하였다. 교반 후, 버블링(bubbling) 하기전과 후의 무게 차이를 쟀다.

500 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 메탄올(MeOH)에 녹인 염산(HCl, 0.2 g, 6.74mmol)을 넣었다. 그 후, 0℃에서 1,8-디아미노-3,6-디옥테인(1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane, 1g, 6.74mmol)을 천천히 첨가하였다. 이것을 상온에서 15분 반응시킨 후, 증류수를 암모니움 솔트(ammonium salt)가 완전히 사라질 때까지 천천히 첨가하였다. 그 후, 상온에서 15분 동안 반응시킨 다음, 상온에서 (Boc)₂O (1.47 g 6.74mmol)을 첨가하였다. 그 후, 상온에서 15분 반응시킨 후, 반응을 종결하고, 용매를 감압으로 제거한 다음 에테르(ether)와 증류수를 첨가하였다. 그 후, 물 층만 분리한 다음 물층에 1N 수산화나트륨(NaOH) 50 ㎖를 첨가하였다. 상기 물층을 3, 4회 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride)로 추출하고, 무수 황산망간(MsSO₄)으로 건조한 다음, 필터 후 감압하여 용매를 제거하여 NH-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc를 수득하였으며 (도 14 참조). 수득율은 74%였다. NH-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR 400MHz, CDCl3 δ(ppm) : 1.14 (s, BOC), 2.59 (t, 6H), 3.02 (t, 1H), 3.25 (t, 3H, 4H), 3.36 (t, 2H, 5H). 도 14는 NH-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc의 합성 스킴이다. 이하에서는, NH-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc를 'NH-PEG2-Boc'라고 지칭하였다.

(2) Cbz - Ser ( Me )- Ser ( Me )- OH의 합성

< NH - Ser ( OH )- Ser ( OH )- OH의 아민 프로텍션 ( Amine Protection ) - Step 1>

황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6 (Ser-Ser/Dipeptide)(1.0 g, 5.2 mmol)을 탄산수소나트륨 (NaHCO₃, 1.1 g, 11.3 mmol)수용액 10 ㎖에 녹인 후 0℃에서 Cbz-Cl (1.0g, 5.72mmol)를 천천히 첨가하였다. 0℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 디에틸에테르(diethyl ether)로 씻어준 다음, 물 층을 5% 염산(HCl) 용액으로 pH 2.5~3 정도로 산성화(acidification)하였다. 이를 다시 디에틸에테르(diethyl ether)로 추출한 후, 농축하여 흰색 고체 형태의 생성물 (Cbz-Ser(OH)-Ser(OH)-OH) 1.65 g을 수득하였으며 (도 15 참조), 수득률은 97.2%이였다. Cbz-Ser(OH)-Ser(OH)-OH의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 2.00 (2H), 3.65 (3H), 3.70 (2H), 4.02 (1H), 4.14~4.16 (4H), 7.23~7.33 (5H), 8.03 (1H), 11.00 (1H).

< Cbz - Ser ( OH )- Ser ( OH )- OH의 알코올 프로텍션 ( Alcohol Protection ) - Step 2>

Cbz-Ser(OH)-Ser(OH)-OH (1.65 g, 5.01 mmol)을 아세톤니트릴 (acetonitrile 160 ㎖)에 녹인 후, 메틸 요오드화물 (methyl iodide, 11 ㎖, 76.0mmol)과 산화은 (silver(Ⅱ) oxide, 9.1 g, 38 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 24시간 동안 반응한 후 여과하여 메탈(metal)을 걸러내고 농축하였다. 그 후, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(Flash column chromatography, hexane:EtOAc, 3:1)로 정제하여 옅은 노란색 오일(oil) 형태의 생성물 1.69 g 수득하였으며 (도 15 참조), 수득률은 90.9%였다. Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-Me의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 2.00 (1H), 3.30 (6H), 3.58 (2H), 3.69 (7H), 3.89 (1H), 4.22 (1H), 7.23~7.33 (5H), 8.03 (1H).

< Cbz - Ser ( Me )- Ser ( Me )- Me의 디프로텍션 ( Deprotection ) - Step 3>

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-Me (1.69 g, 4.58mmol)을 THF (90 ㎖)/methanol (9.8 ㎖)/H₂O(7.4 ㎖)에 녹인 후 0℃에서 수산화리튬(lithium hydroxide monohydrate (0.95 g, 22.4 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 1.5시간 동안 반응시킨 다음 1N 황산수소칼륨(KHSO₄)을 이용하여 pH 2.5~3.0이 될 때까지 산성화(acidification) 시켜주었다. 이를 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출하여 브린(brine)으로 씻어준 후, 유기층을 건조 및 농축하여 얻어진 흰색 고체 형태의 생성물(Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH)을 1.38 g 수득하였으며 (도 15참조), 수득률은 85%였다. Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 2.00 (1H), 3.30 (6H), 3.58 (4H), 3.89 (1H), 4.26 (1H), 7.23~7.33 (5H), 8.03 (1H). 도 15는 Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH의 합성 스킴이다.

(3) Cbz - Ser ( Me )- Ser ( Me )-[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane ]- Boc ( Cbz - Ser ( Me )-Ser(Me)-PEG2-Boc)의 합성

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH(1.38 g, 3.4 mmol)를 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 4.0 ㎖)에 녹이고, 0℃에서 NMM (0.5 ㎖, 5.0 mmol), 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride, 6.6 ㎖)에 녹인 NH-PEG2-Boc (0.84 g, 3.4 mmol)를 차례로 첨가하였다. 여기에 하이드록시벤조트리졸(HOBt, 0.46 g, 3.4 mmol), DCC (0.70 g, 3.4 mmol)를 첨가하고 온도를 상온으로 올려 2.5시간 동안 반응시켰다. 반응 중 생겨난 DCU를 걸러준 후 농축한 다음 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography, n-hexane:EtOAc, 4.5:1)로 정제하여, 옅은 노란색 오일(oil) 형태의 생성물(Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc) 1.06 g을 수득하였으며 (도 16 참조), 총 수득률은 71.6%였다. Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 1.27 (9H), 2.00 (1H), 2.72 (2H), 3.54~3.65 (12H), 3.98 (1H), 4.16~4.26 (7H), 4.62 (1H), 7.23~7.26 (5H), 8.03 (2H). 도 16은 Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc의 합성 스킴이다. 이하에서는, Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]-Boc를 'Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc'이라고 지칭하였다.

[ 실시예 5: 페길화 소재의 합성 - Ser - Ser -[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane ]의 합성]

상기 실험예 5에서 황금 실크펩타이드 분획물의 미백 효능 평가 결과 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6 (Ser-Ser/dipeptide)에서 미백 효능이 가장 우수함을 확인하였다. 따라서, 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6 (Ser-Ser/dipeptide)을 소재 합성의 출발물질로 하였고, PEG를 이용하여 페길화(Pegylation)하여 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]을 합성하였다.

< Cbz - Ser ( Me )- Ser ( Me )- PEG2 - Boc의 디프로텍션 ( Deprotection )>

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc (1.06 g, 2.40 mmol)을 메탄올(methanol, 6.3 ㎖)에 녹인 후, 10% Pd/C (0.5 g)을 첨가하였다. 이를 수소 가스(H₂ gas)로 포화시켜 4시간 동안 반응한 뒤, 메탈(metal)을 걸러내고 농축하여 오일(oil) 형태의 생성물을 얻었다. 그 후, 분해용액 (Trifluoro acetic acid(TFA)/1,2-Ethane dithiol(EDT)/Triisopropyl silane(TIS)/H₂O:9.5/0.2/0.1/0.2)이 건조된 용액 0.1 g당 1 ㎖ 생성물을 넣고 4시간 동안 반응 후 여과하였다. 분해용액을 제거하기 위해 차가운 에테르에 분산시킨 후 원심분리기를 이용하여 3,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 분해용액이 제거될 때까지 반복하였고, 이후 건조 오븐(dry-oven)에서 건조하여 생성물(NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-NH) 0.7 g을 수득하였으며 (도 17 참조), 수득률은 83.3%였다. NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-NH의 ¹H NMR은 다음과 같았다. ¹H NMR은 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 3.07 (2H), 3.30 (6H), 2.72 (2H), 3.54~3.58 (6H), 3.65~3.69 (4H), 3.76 (2H), 3.89 (1H), 4.22~4.25 (3H), 5.11 (4H), 8.03 (1H).

< NH - Ser ( Me )- Ser ( Me )- PEG2 - NH의 디프로텍션 ( Deprotection )>

요오드화나트륨 (NaI, 30.0 g, 200 mmol)을 아세톤니트릴 (Acetonitrile, 100 ㎖)과 혼합한 후, 물 (0.18 g, 10 mmol)을 넣고, 40℃에서 30분간 교반하였다. 그 후, 트리메틸클로로실란(Trimethylchlorosilane, 21.75 g, 200mmol)을 넣고 40℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 용액에 NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-NH (0.7 g, 2.0mmol)을 첨가한 후, 40℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 에틸아세테이트 (EtOAc, 250 ㎖), 물 (125 ㎖)을 이용하여 세척 및 분리하였으며, 분리 후 유기층에 10% 브린(brine) 용액 (50 ㎖)을 이용하여 2회 세척하였다. 유기층 용액을 황산나트륨(Na₂SO₄)을 이용하여 건조한 후, 여과, 농축 및 건조하여 생성물 (Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]) 0.58 g을 수득하였으며 (도 17 참조), 수득률은 89.8%였다. 도 17은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 합성 스킴이다.

[ 실험예 5: Ser - Ser -[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane ]의 분석]

본 실험예에서는 상기 실시예 4에서 수득된 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]를 분석하고자 하였다.

(1) NMR 분석( Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer )

Bruker AVANCE400 400MHz FT-NMR 핵자기공명 분광계로 ¹H-NMR 스펙트라(spectra)를 측정하였다.

¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) 측정결과, Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 OH (3.65 : 2H), NH₂ (5.1 : 4H), NH (8.03 : 1H), CH, CH₂ (3.07 ~ 4.25 : 18H)에서 확인 되었다 (도 18). 도 18은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

(2) FT - IR 분석( Fourier Transform Infrared Spectrometer )

Bruker ALPHA-T FT-IR 스펙트로미터(Spectrometer)를 이용하여 FT-IR 분석을 실시하였다.

Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼은 3200~3500 cm^-1 O-H, 3300 cm^-1N-H, 2850~3000 cm^-1 C-H, 1650~1780 cm^-1 C=O, 1100 cm^-1 C-O 피크(peak)를 확인하였다 (도 19). 도 19는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼이다.

(3) HPLC 분석( High Performance Liquid Chromatography )

Shimadzu Prominence HPLC를 사용하여 HPLC 분석을 실시하였다.

HPLC 이용하여 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 물질 순도 및 합성 여부를 확인할 수 있었다. 확인 결과, 순도는 96.804%로 확인되었고, 이로부터 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane] 합성이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 20). 도 20은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 HPLC 스펙트럼이다.

(4) MS 분석

MS분석 결과, Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 분자량은 323.3 Da임을 확인할 수 있었다. Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 이론 분자량이 323.34 Da이므로, 상기 결과로부터 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane] 합성이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 21). 도 21은 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 MS 스펙트럼이다.

[ 실시예 6: 페길화 소재의 합성 - Lipoyl - Ser - Ser -[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane ]의 합성]

본 실시예에서는 상기 실시예 5에서 합성된 황금실크펩타이드 페길화 소재인 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]을 출발 물질로 하였고, 여기에 리포산(Lipoic Acid)을 합성하여 새로운 황금실크펩타이드 페길화 소재인 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]을 합성하였다.

< LA - Ser ( Me )- Ser ( Me )- PEG2 - Boc의 합성( Pegylation )>

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc (0.5 g, 0.85 mmol)을 메탄올 (methanol, 1.8 ㎖)에 녹인 후, 10% Pd/C (0.13 g)을 첨가하였다. 이를 수소 가스(H₂ gas)로 포화시켜 4시간 동안 반응한 뒤, 메탈(metal)을 걸러내고 농축하여 오일(oil) 형태의 생성물을 얻었다. 그 후, NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc (0.45 g, 1.0 mmol)를 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 2.0 ㎖)에 녹이고, 0℃에서 NMM(0.3 ㎖, 2.5 mmol), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 3.3 ㎖)에 녹인 리포산(Lipoic Acid, 0.21 g, 1.0 mmol)을 차례로 첨가하였다. 여기에 하이드록시벤조트리졸 (HOBt, 0.16 g, 1.18 mmol), DCC(0.27 g, 1.32 mmol)를 첨가하고 온도를 상온으로 올려 2.5시간 동안 반응시켰다. 반응 중 생겨난 DCU를 걸러준 후 농축하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography, n-hexane:EtOAc, 4.5:1)로 정제하여, 옅은 노란색 오일(oil) 형태의 생성물 (LA-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc)을 0.45 g 수득하였다 (도 22 참조). 총 수득률은 72%이였다. LA-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc의 ¹H NMR은 다음과 같았다.¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm): 1.27 (13H), 1.55 (4H), 2.00 (5H), 2.52 (1H), 2.61 (2H), 2.72 (2H), 3.30 (6H), 3.54~3.69 (12H), 4.25 (3H), 4.86 (1H), 8.03 (2H).

< LA - Ser ( Me )- Ser ( Me )- PEG2 - Boc의 디프로텍션 ( Deprotection )>

요오드화나트륨(NaI, 30.0 g, 200 mmol)을 아세톤니트릴 (Acetonitrile, 100 ㎖)로 혼합 후, 물(0.18 g, 10mmol)을 넣고, 40℃에서 30분간 교반한 후 트리메틸클로로실란(Trimethylchlorosilane, 21.75 g, 200mmol)을 넣고 40℃에서 30분 교반하였다. 상기 용액에 LA-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2-Boc (0.45 g , 0.72 mmol)을 첨가 한 후, 40℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 에틸아세테이트 (EtOAc, 250 ㎖), 물 (125 ㎖)을 이용하여 세척 및 분리 하였으며, 분리 후 유기층에 10% 브린(brine) 용액 (50 ㎖)을 이용하여 2회 세척하였다. 그 후, 유기층 용액을 Na₂SO₄를 이용하여 건조한 후, 여과, 농축 및 건조하였다. 그 후, 분해용액 (Trifluoro acetic acid(TFA)/1,2-Ethane dithiol(EDT)/ Triisopropyl silane(TIS)/ H2O:9.5/0.2/0.1/0.2)이 건조된 용액 0.1 g당 상기 유기층 용액 1 ㎖를 넣고 4시간 동안 반응 후 여과하였다. 분해용액을 제거하기 위해 차가운 에테르에 분산시킨 후 원심분리기를 이용하여 3,500 rpm으로 5분간 원심분리하여 분해용액이 제거될 때까지 반복하였다. 이후 건조 오븐(dry-oven)에서 건조하여 생성물 (LA-Ser-Ser-PEG2-NH) 0.31 g을 수득하였으며 (도 22 참조), 수득률은 84.2%였다 (도 22 참조). 도 22는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 합성 스킴이다.

[ 실험예 6: Lipoyl - Ser - Ser -[1,8- Diamino -3,6- dioxaoctane 분석]

본 실험예에서는 상기 실시예 6에서 합성된 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]를 분석하고자 하였다.

(1) NMR 분석( Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer )

¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) 측정 결과, Ser-Ser의 OH는 3.65 : 2H, NH는 8.03 : 2H에서 확인되었으며, [1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 NH₂는 5.1 : 2H, CH, CH₂는 3.00~4.62 :14H에서 확인할 수 있었다. 또한, 리포산(Lipoic Acid)의 CH, CH₂는 1.30~2.50 : 13H에서 확인할 수 있었다 (도 23). 도 23은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼은 3200~3500 cm^-1 O-H, 3300 cm^-1N-H, 2850~3000 cm^-1 C-H, 1650~1780 cm^-1C=O, 1100 cm^-1 C-O 피크(peak)를 확인할 수 있었고, 리포산(Lipoic Acid)의 S-S 본드(bond)의 특정 피크(Peak)는 500~600 cm^-1에서 확인할 수 있었다 (도 24). 도 24는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 FT-IR 스펙트럼이다.

Shimadzu Prominence HPLC를 사용하여 HPLC 분석을 실시하였다.

HPLC를 이용하여 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 물질 순도 및 합성 여부를 확인할 수 있었다. 확인 결과, 순도는 96.159%임을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로부터, Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]합성이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 25). 도 25는 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 HPLC 스펙트럼이다.

(4) MS 분석

MS분석 결과, Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 분자량은 511.2 Da임을 확인할 수 있었다. Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 이론 분자량이 511.65 Da이므로, 상기와 같은 결과로부터, Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]의 합성이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 26). 도 26은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane] MS 스펙트럼이다.

[ 실시예 7: Ser - Ser -[ Poly ( ethylene glycol ) diamine ( average Mn 2,000)]- Ser - Ser의 합성]

본 실시예에서는 황금 실크펩타이드 분획물 Prep 6 (Ser-Ser/dipeptide)을 PEG(diamine)의 양쪽의 아민(Amine) 위치에 도입하여 새로운 황금실크펩타이드 페길화 소재인 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser를 합성하고자 하였다.

< Ser - Ser -[ PEG2000 diamine ]- Ser - Ser의 합성( Pegylation )>

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-OH (1.0 g, 2.8 mmol)를 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 10.6 ㎖)에 녹이고, 0℃에서 NMM(1.38 ㎖, 11.5 mmol), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 15.2 ㎖)에 녹인 PEG2000 diamine (2.8 g, 1.4 mmol)를 차례로 첨가하였다. 여기에 하이드록시벤조트리졸(HOBt, 0.74 g, 5.4 mmol), DCC (1.24 g, 6.1 mmol)를 첨가하고 온도를 상온으로 올려 2.5시간 동안 반응시켰다. 반응 중 생겨난 DCU를 걸러준 후 농축 및 건조하여 생성물 (Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2000-Ser(Me)-Ser(Me)-Cbz) 2.9 g을 수득하였으며 (도 27 참조), 수득률은 82%였다. Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2000-Ser(Me)-Ser(Me)-Cbz의¹H NMR 분석결과는 다음과 같았다.¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) : 2.00 (2H), 3.30~3.89 (190H), 4.86 (2H), 7.23~7.33 (10H), 8.03 (4H).

< Cbz - Ser ( Me )- Ser ( Me )- PEG2000 - Ser ( Me )- Ser ( Me )- Cbz의 디프로텍션 (Deprotection)>

Cbz-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2000-Ser(Me)-Ser(Me)-Cbz (2.9 g, 1.07 mmol)을 메탄올(methanol, 5.0 ㎖)에 녹인 후 10% Pd/C (0.26 g)을 첨가하였다. 이를 수소 가스(H₂ gas)로 포화시켜 4시간 동안 반응시킨 뒤, 메탈(metal)을 걸러내고 농축하여 오일(oil) 형태의 생성물 (NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2000-Ser(Me)-Ser(Me)-NH) 2.72 g을 수득하였으며, 수득률은 94%였다.

그 후, 요오드화나트륨(NaI, 60.0 g, 400 mmol)과 아세톤니트릴(Acetonitrile, 200 ㎖)을 혼합한 후, 물 (0.36 g, 20mmol)을 넣고 40℃에서 30분간 교반 후, 트리메틸클로로실란 (Trimethylchlorosilane, 43.5 g, 400mmol)을 넣고 40℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 용액에 NH-Ser(Me)-Ser(Me)-PEG2000-Ser(Me)-Ser(Me)-NH(2.72 g , 1.0 mmol)을 첨가한 후, 40℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 에틸아세테이트 (EtOAc, 500 ㎖), 물 (250 ㎖)을 이용하여 세척 및 분리하였으며, 분리 후 유기층에 10% 브린(brine) 용액 (100 ㎖)을 이용하여 2회 세척하였다. 상기 유기층 용액을 황산나트륨(Na₂SO₄)을 이용하여 건조한 후, 여과, 농축 및 건조하여 생성물 (Ser-Ser-PEG2000-Ser-Ser) 2.2 g을 수득하였으며 (도 27 참조), 수득률은 81%였다. 도 27은 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 합성 스킴이다.

[ 실험예 7: Ser - Ser -[ Poly ( ethylene glycol ) diamine ( average Mn 2,000)]- Ser - Ser의 분석]

본 실험예에서는 상기 실시예 7에서 합성된 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser를 분석하고자 하였다.

(1) NMR 분석( Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer )

¹H NMR 400MHz, DMSO-d₆ δ(ppm) 측정 결과, Ser-Ser의 OH는 3.65 : 4H), NH₂는 1.1 : 4H, NH는 8.03 : 4H에서 확인할 수 있었고, [Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]의 CH, CH₂는 3.07 ~ 4.25 : 190H에서 확인할 수 있었다 (도 28). 도 28은 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 FT-IR 스펙트럼은, 3200~3500 cm^-1 O-H, 3300 cm^-1N-H, 2850~3000 cm^-1 C-H, 1650~1780 cm^-1 C=O, 1100 cm^-1 C-O 피크(peak)를 확인할 수 있었다 (도 29). 도 29는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser의 FT-IR 스펙트럼이다.

[ 실험예 8: 황금 실크펩타이드 유도체의 세포독성 확인]

본 실험예에서는 황금 실크펩타이드 분획물 (Prep 6), 황금 실크펩타이드 유도체 (Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)의 세포독성을 확인하고자 하였다.

실험 결과, 무처리군을 대조군으로 하여 100% 했을 때 각 농도별로 5%이하의 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 30). 도 30은 황금 실크펩타이드 유도체의 세포독성을 확인한 결과이다. '①'은 황금 실크펩타이드, '②'는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '③'은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '④'는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)를 의미한다.

[ 실험예 9: 황금 실크펩타이드 유도체의 미백 효과 확인- 멜라닌생합성 저해효과]

본 실험예에서는 황금 실크펩타이드 분획물 (Prep 6), 황금 실크펩타이드 유도체 (Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)의 미백 효과를 확인하고자 농도 (50, 100, 150 ppm)를 달리하여 멜라닌생성 억제 효과를 확인하였다.

실험결과, 100 ppm의 농도에서 모든 샘플이 가장 우수한 멜라닌 생합성 억제효과를 나타내었다. 100 ppm에서 황금 실크펩타이드 유도체 중 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane]가 24.3%로 가장 우수한 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 31). 도 31은 황금 실크펩타이드 유도체의 멜라닌 생합성 억제 효과를 확인한 결과이다. '①'은 황금 실크펩타이드, '②'는 Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '③'은 Lipoyl-Ser-Ser-[1,8-Diamino-3,6-dioxaoctane], '④'는 Ser-Ser-[Poly(ethylene glycol) diamine(average Mn 2,000)]-Ser-Ser)를 의미한다.

Claims

삭제
황금누에고치를 가수분해하여 얻어진 세리신(Sericin) 펩타이드를 페길레이션하여 제조된 것으로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제2항에 있어서,
상기 화합물은,
화장료 조성물 총 중량에 대하여,
0.000001~30.0중량%가 함유되는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.