KR20180108974A - 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방용 펜타펩타이드와 펜타펩타이드 다이머의 제조방법과 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

피부 노화 방지 및 피부 주름 예방용 펜타펩타이드와 펜타펩타이드 다이머의 제조방법과 이를 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1내지 4로 표시되는 신규한 펜타펩타이드와 펜타펩타이드 다이머의 제조방법과 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머를 유효성분으로 포함하여 다양한 요인으로 노화된 피부의 감소된 콜라겐 생성량을 프로콜라겐 타입Ⅰ 및 타입Ⅱ를 증가시킴으로써 피부 노화를 방지하거나 피부 주름을 예방하는 효과가 우수한 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선용 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머는 스킨, 로션, 크림, 에센스, 겔, 팩 또는 비누형태 등의 다양한 기초 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있으며 피부자극이 없고 피부안정성도 우수한 특징을 갖는다.
[화학식 1］
[Cys-Gly-Gln-X-Arg]
[화학식 2]
[Gly-X-Pro-Arg-Cys]
[화학식 3]
[Cys-Gly-Gln-X-Arg]2
[화학식 4]
[Gly-X-Pro-Arg-Cys]2
(상기 화학식 1내지 4에서, X는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린 및 발린에서 선택되며, [ ]2는 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체(dimer)를 나타낼 수 있다.)

Description

피부 노화 방지 및 피부 주름 예방용 펜타펩타이드와 펜타펩타이드 다이머의 제조방법과 이를 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing anti-aging and wrinkle preventing pentapeptide and pentapeptide dimer production method}
본 발명은 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방용 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 화장료 조성물에 관한 것으로서, 특히 피부노화 방지 및 피부주름 개선용 화장품에서 가장 중요한 요소인 콜라겐의 합성 및 발현을 촉진시키는 신규한 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머의 제조방법과 이를 함유하는 화장료 및 의약용 조성물에 관한 것이다.
인체의 피부는 신체 외부를 덮고 있는 하나의 막으로, 유해한 환경요소로부터 신체를 보호하는 동시에 외적 미적기능을 담당한다. 이러한 피부는 노화가 진행됨에 따라 피부 면역력이 저하됨과 동시에 피부 탄력 감소, 피부색 변화, 피부주름 형성 등의 외형적인 변형도 수반된다. 피부 노화 과정은 내인성 노화와 외인성 노화로 분류되며 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 자연적으로 일어나는 자연 노화로, 주로 유전적인 요인으로 나타나는 노화 현상으로서 인위적인 조절이 어렵다. 반면, 외인성 노화의 경우 자외선과 같은 환경적 요인에 의해 영향을 받는 노화 현상으로 인위적인 조절을 통한 예방이 가능하다. 따라서 외인성 노화를 중심으로 피부노화 방지 및 피부 주름 예방을 위한 기능성 소재 발굴 연구가 활발히 이루어지고 있다.
외인성 노화를 일으키는 환경적 요인에는 자외선 노출, 대기오염, 스트레스 등이 있으며, 이러한 유해환경에 계속하여 노출이 되면 체내의 활성산소(oxygen free radical)가 증가되고, 진피의 결합 조직인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 등이 파괴되어 주름이 생성된다. 특히, 외인성 노화를 일으키는 다양한 요인들 중 가장 높은 비중을 차지하는 요인은 반복적인 자외선의 노출이다. 자외선(UV)은 320∼400 nm 파장의 자외선 A(UVA)와 290∼320 nm 파장의 자외선 B(UVB), 200∼290 nm파장의 자외선 C(UVC)로 분류되며, 이 중 자외선 B(UVB)가 피부에 가장 많은 영향을 주어 광노화를 일으키는 외인성 노화의 주된 요인으로 보고되고 있다.
콜라겐은 피부의 진피를 구성하고 있는 주요한 성분으로 이 중 typeⅠ 콜라겐이 전체의 80% 차지하고 있다. 자외선에 피부가 장시간 노출될 경우 피부 내 활성산소가 다량 생성되고, 이로 인하여 콜라겐 합성이 저하되거나 분해가 되는 현상이 일어나, 결국 피부 탄력이 감소하고 주름이 생성된다. 따라서, 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 및 치료를 위한 신소재를 발굴하는데 있어 콜라겐 합성을 촉진시키는 물질을 찾는 것이 좋은 전략이 될 수 있다.
현재 피부 노화 예방 및 치료제로 주로 사용되고 있는 레티노인산은 지용성의 물성으로 인하여 피부 흡수력이 낮은 단점으로 인하여, 진피 내 콜라겐 합성의 증진기능 효과를 크게 기대하기 어렵고 피부 자극성이 있으며, 또한 생체 내에서의 빠른 효소분해로 인한 안전성 및 안정성 문제가 대두되고 있다. 따라서 외피로부터의 흡수력이 우수하며 생체 내에서의 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 기능이 극대화되고, 피부 안전성이 향상된 새로운 피부 노화 방지 및 예방 소재의 개발이 요구되고 있다.
한편, 최근에는 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 기능성 성분으로 펩타이드가 주목받고 있다. 펩타이드는 화장품, 식료품, 의약품 등 여러 연구영역에서 주목받는 소재로서, 20개의 필수 아미노산 중 약 2∼50개가 아미드 결합(amide bond)을 통해 연결되어 있는 중합체이다. 펩타이드는 단백질보다 그 크기와 구조는 단순하나 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 커 생체 내 대사과정 등에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 펩타이드는 그 자체가 생체내 존재하는 물질일 뿐만 아니라 생체 내에 유입되어도 일정 기간 활성을 띈 다음 아미노산으로 분해되기 때문에 기존의 다른 소재보다 안전성이 매우 뛰어나며 단백질의 구성 성분으로서 피부 재생 활성에도 도움을 주는 소재이다.
국내공개특허 제10-2012-0012904호
Katayama et al. (1993) J. Biol. Chem., 268, 9941-9944 Shuster S., (1975) British Journal of Dermatology, 93, 639-643 음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 화합물 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머의 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 효과를 확인하기 위하여 피부 섬유아세포종(Human dermal fibroblast)세포주를 이용한 in vitro assay를 확립하여 2종의 프로콜라겐의 생합성 능력을 확인함으로써 화합물 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머가 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 피부 침투성이나 안전성이 뛰어난 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머의 제조방법 및 이를 함유하는 피부 노화 방지 및 주름 예방 효과를 나타내는 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1］
[Cys-Gly-Gln-X-Arg]
[화학식 2]
[Gly-X-Pro-Arg-Cys]
[화학식 3]
[Cys-Gly-Gln-X-Arg]2
[화학식 4]
[Gly-X-Pro-Arg-Cys]2
상기 화학식 1 내지 4에서, X는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린 및 발린에서 선택되며, [ ]2는 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체(dimer)를 나타냄.
바람직하게는, 상기 화학식 1 내지 4의 펩타이드는,
[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg] (화합물 1)
[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg] (화합물 2)
[Cys-Gly-Gln-Asn-Arg] (화합물 3)
[Cys-Gly-Gln-Lys-Arg] (화합물 4)
[Cys-Gly-Gln-Asp-Arg] (화합물 5)
[Cys-Gly-Gln-Tyr-Arg] (화합물 6)
[Cys-Gly-Gln-Ser-Arg] (화합물 7)
[Cys-Gly-Gln-Phe-Arg] (화합물 8)
[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg] (화합물 9)
[Gly-Gln-Ile-Arg-Cys] (화합물 10)
[Gly-Met-Pro-Arg-Cys] (화합물 11)
[Gly-Thr-Pro-Arg-Cys] (화합물 12)
[Gly-Arg-Pro-Arg-Cys] (화합물 13)
[Gly-Leu-Pro-Arg-Cys] (화합물 14)
[Gly-Phe-Pro-Arg-Cys] (화합물 15)
[Gly-Ser-Pro-Arg-Cys] (화합물 16)
[Gly-Asp-Pro-Arg-Cys] (화합물 17)
[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys] (화합물 18)
[Gly-Lys-Pro-Arg-Cys] (화합물 19)
[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys] (화합물 20)
* 지질(Stearic, Palmitic, arachidic 등 )
[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg] (화합물 21)
[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg] (화합물 22)
[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg] (화합물 23)
[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys] (화합물 24)
[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys] (화합물 25)
[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2 (화합물 26)
[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]2 (화합물 27)
[Cys-Gly-Gln-Asn-Arg]2 (화합물 28)
[Cys-Gly-Gln-Lys-Arg]2 (화합물 29)
[Cys-Gly-Gln-Asp-Arg]2 (화합물 30)
[Cys-Gly-Gln-Tyr-Arg]2 (화합물 31)
[Cys-Gly-Gln-Ser-Arg]2 (화합물 32)
[Cys-Gly-Gln-Phe-Arg]2 (화합물 33)
[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]2 (화합물 34)
[Gly-Gln-Ile-Arg-Cys]2 (화합물 35)
[Gly-Met-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 36)
[Gly-Thr-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 37)
[Gly-Arg-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 38)
[Gly-Leu-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 39)
[Gly-Phe-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 40)
[Gly-Ser-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 41)
[Gly-Asp-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 42)
[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 43)
[Gly-Lys-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 44)
[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 45)
* 지질(Stearic, Palmitic, arachidic 등 )
[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2 (화합물 46)
[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]2 (화합물 47)
[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]2 (화합물 48)
[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 49)
[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 50)
에서 선택되며, 상기 화합물에서 [ ]2는 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체 (dimer)를 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 4의 펩타이드, 또는, 상기 화합물 1 내지 50의 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 주름개선용 조성물을 제공한다.
이에, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 4의 펩타이드, 또는, 상기 화합물 1 내지 50의 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 주름개선용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 펩타이드는 약학적 조성물에0.0001~1.0 중량%로 포함될 수 있다.
또 다른 형태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 4의 펩타이드, 또는 상기 화합물 1 내지 50의 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드는 화장료 조성물에 0.0001~1.0 중량%로 포함될 수 있다. 상기 화장료는 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일, 립스틱 및 파운데이션에서 선택되는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명의 펩타이드 중, 화합물 26 내지 50의 펩타이드는 각각 화합물 1 내지 25의 펩타이드의 시스테인(펩타이드의 말단에 위치한 시스테인) 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체(dimer)이다. 예를 들어, 화합물 1의 시스테인 잔기인 티올기를 환원체 형태로 변형한 이중체가 화합물 26이며, 화합물 2의 시스테인 잔기인 티올기를 환원체 형태로 변형한 이중체가 화합물 27이다. 이와 같은 방법으로 화합물 3 내지 화합물 28으로 각각 화합물 1 내지 화합물 25의 이중체를 제조할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 고체상에 일정하게 결합된 아미노산 골격에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 연속적으로 아미드 결합을 형성하는 식으로 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 펩타이드는 안정성을 크게 저하시키지 않는 범위에서 다른 아미노산의 삽입, 치환, 삭제가 가능하며, 이 또한 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 본 발명의 펩타이드의 세포내 이동을 촉진하는 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)를 펩타이드 C-말단 또는 N-말단에 결합하여 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 펩타이드에는 TAT 펩타이드(Arg-Lys-Lys -Arg-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg) 및 Tat-PTD 펩타이드(Gly-Arg-Lys-Lys-Arg -Arg-Gln-Arg-Arg-Arg:Tat PTD)일 수 있으나, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 세포 투과성 펩타이드가 본 발명에 따른 펩타이드의 활성을 저해하지 않는 범위 내의 것이라면 어느 것이라도 사용가능하다.
한편, 본 발명의 펩타이드는 염의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용 가능한 염의 형태는 화합물의 최종분리 및 정제 동안 또는 아미노기를 적절한 산과 반응 시키는 것에 의해 만들어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 산 부가염으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로 포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요 오다이드, 2-하이드록시에탄 설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네 이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이 트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레 산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 때, 트리플로로아세테이트 염 또는 아세테이트 염을 함유한 펩타이드 형태가 가장 바람직하다.
본 발명의 펩타이드 제조를 위해 이용되는 아미노산의 아미노기 또는 카복실기는 적합한 보호기에 의해 보호될수 있다. 보호된 아미노산은 고체 지지체에 부착되거나 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용 액 중에서 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 보호기는 적합한 보호기로 보호된 아미 노산을 첨가하기 이전에 완전히 제거될 수 있다. 모든 아미노산이 목적하는 바에 따라 연결된 후, 유리된 잔류 보호기 및 유리된 고형 지지체로부터 연속적으로 또는 동시에 분리하여 최종 목적하는 펩타이드를 얻을 수 있다.
본 발명에서는 키랄 센터가 라세미화되지 않는 조건하에서 적합하게 보호된 테트라 펩타이드를 적절하게 보호된 또 다른 디펩타이드와 축합시켜 아미드결합을 형성시 킨 후 탈보호하여 목적하는 헥사펩타이드를 합성하여 얻는 절편 축합반응 기술을 이용하여 펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물을 제조하기 위한 가장 바람직한 합성 방법으로는 고체 상 폴리머 지체를 이용하여 합성하는 고체상 펩타이드 합성방법을 이용할 수 있으 며, 상기 방법을 통해 제조된 펩타이드의 α-아미노기는 산 또는 염기 민감성 작용기 에 의해 보호될 수 있다. 이 때의 아미노산의 보호기는 펩타이드 축합반응 조건에서 안정한 성질을 가져야만 하고, 연장되는 펩타이드 사슬의 파괴 없이 또는 거기에 함 유된 임의의 키랄 센터의 라세미체화 없이 용이하게 제거 가능한 성질을 가져야만 한다. 따라서, 적합한 보호기들로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), t-부톡시카 보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (α,α)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페 닐, 2-시아노-t-부틸옥시카보닐 등일 수 있으며, 이러한 목적으로 당업계에 알려진 적합한 다른 보호기들 또한 본 발명의 범위 내에서 사용가능하다.
본 발명의 펩타이드 합성에서 사용된 아미노산의 가장 바람직한 보호기로는 9-플루 오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 보호기가 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 펩타이드 합성에서 사용되는 아미노산 잔기의 보호기로는 N-메틸 글루타민산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 라이신의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 세 린의 경우, 7t-부틸(t-Bu)이고; 트레오닌 및 알로트레오닌의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 시스테인의 경우, 트리틸(Trt)인 것이 바람직하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
고체상 펩타이드 합성 방법에서, C-말단 아미노산은 적합한 고형 지지체 또는 수지 에 부착될 수 있다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고형 지지체로는 단계적 축합 -탈보호 반응의 시약 및 반응 조건에 불활성이고 사용되는 매질에 불용성인 물질이 바람직하며, 예를 들면, 링크 아미드(rink amid) 또는 링크 아미드 4-메틸벤질히드
릴아민 수지(rink amid MBHA resin)일 수 있다.
특히, C-말단 아미드 펩타이드에 대해 바람직한 고형 지지체는 Novabiochem Cor poration으로부터 시판되는 링크아미드 4-메틸벤질히드릴아민 수지일 수 있다.
C-말단 아미드(amide)는 디클로로메탄, N-메틸피리돈(NMP) 또는 DMF와 같은 용 매 중에서 10℃ 내지 50℃의 온도에서, 바람직하게는 30℃의 온도조건에서, 1 내지 24시간 동안 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), N- 메틸모르폴린(NMM),벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는　비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀클로라이드(BOP　CI)의 존재 또는 부재하에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC),　N,N'-디이　소프로필카보디이미(DIC), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로　늄헥사플루로포스페이트](HATU) 또는　O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라　메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU)에 카르복실산을 활성화시켜 축합을 통해 수지 또는 고체상 지지체에 축합(결합, 커플링)될 수 있다.
고형 지지체가 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민 수지인 경우, 바람직한　보호기로　서 Fmoc 작용기는 C-말단 아미노산으로 축합하기 전에 2급 아민 용액,　바람직하　게는 20%의 피페리딘 DMF 용액을 과량 사용하여 절단한다.　상기 탈보호된　4-(2'　,4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도에틸 수지에 목적하는 아미　노산을 축합시키는데 사용되는 바람직한 시약들로는 적합하게 보호된 아미노산에 대하여 DMF 용매 중에서 N-메틸모르폴린　(NMM),　1-하이드록시벤조트리아졸(H　OBt) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스　페이트](HATU),O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트　(HBTU), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는N,N'-디이소프로　필카보디이미드(DIC)와 같은 축합 반응 시약들이다.
본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려　져 있는 자동 펩타이드 합성기를 이용하거나 또는 수동으로 직접 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 그룹으로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 피페리딘으로 처리하여 탈보호시킨 후, 충분히 과량의 용매로 세　척하고 축합을 원하는 또 다른 각각의 보호된 아미노산을 이어서 3~7배 몰 과량 첨가하여, 바람직하게는 DMF 용매 중에서 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호 그룹들을 탈보호시킬수 있다. 수지로부터 펩 타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈보호 조건으로는 일반적으로 수 지-펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, 트리플루오로아 세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 티오아니졸, 물 또는 에탄디티올(EDT)등으　로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하므로써 침전물을　생성　시킬 수　있다. 이상과 같이 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고　과　량의 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 티오아니졸, 물 및 에탄디티올 등　을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 이상 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻을 수 있다. 이 때, 완전히 탈보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매 및　역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제할 수 있다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조를 이용하여 완전히 농축건조함으　로써 고형의 펩타이드를 얻을 수 있다.
본 발명의 펩타이드들은 콜라겐 합성 효과가 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물은 주름개선용 약학적 조성 물 또는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우,　본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포 함한다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알 기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 정 제수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활 석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제　, 습윤제, 감미제, 향미제, 유 화제, 현탁제, 보존제 등과 같이 통상적으로 이용되는　첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구 투여가 좋으며, 보다 바람직　하게는, 도포에 의한 국소 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 유효성분인 펩타이드의 투여량은 성인 기준으로 0.001~100㎎/kg, 바람직하게는 0.1~100㎎/kg, 보다 바람직하게는 1~50㎎/kg이며, 상기 투여량을 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 펩타이　드는 상기 약학적 조성물 총중량에 대하여 바람직하게는 0.0001~1.0 중량%, 더 바람　직하게는 0.001~1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~0.01% 중량%가 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분인 펩타이드 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제,　비　타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 또한,　상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가알코올류　(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급지방산류(팔미틸산 또는　리　놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유,　마카데미아땅콩유, 아보가드유, 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 필요에 따라, 계면활성제, 보습제, 방부제,　산화방지　제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 계면활성제로는, 음이온계 계면활성제　로서, 알킬벤젠설폰산염, 폴리옥시알킬렌알킬황산 에스테르염, 알킬황산 에스테르염, 올레핀설폰산염, 알킬인산염, 폴리옥시알킬렌알킬에테르인산염, 디알킬설포석신산염, 지방산염 등을 들 수 있고, 비이온성 계면활성제로서, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산 에스테르, 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리옥시에틸렌 다가 알콜지방산 부분 에스테르, 폴리글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 유도체, 지방산디에탄올아미드 등을 들 수 있다. 또한, 양이온성 계면활성 제로서는, 3급 지방족 아민염, 알킬트리메틸암모늄할라이드, 디알킬디메틸암모늄할라이드 등을 들 수 있고, 양쪽성 계면활성제로서는, 아미드베타인형, 이미다졸리늄　베타인형, 설포베타인형 등을들 수 있다. 상기 보습제로서는, 글리세린,　프로필렌　글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다. 상기 방부 제로서는, 벤조산, 데하이드로아세트산, 파라옥시벤조산에스테르(파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산부틸 등), 페녹시에탄올 등을 들 수 있다. 또한, 상기 산화방지제로　서는, 아스코르브산, BHA 등을 들 수 있으며, 이외에도, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 상기 화장료 조성물 총중량에 대하여 바람직하게는 0.0001 ~1.0 중량%, 더 바람직하게는 0.001~1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~0.01% 중량%가 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 화장료의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일 등의 스킨케어 화장료, 립스틱, 파운데이션 등의 메이크업 화장료 등을 들 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며 또한 정해지지 않은 기간 동안 에도 사용할 수 있다. 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입, 펩타이 드의 농도에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
본 발명에 의하면 피부자극이 없고 피부안정성도 우수하며 콜라겐 생합성 증진효과를 나타냄이 확인된, 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 효과를 나타내는데 탁월한 효능을 갖는 피부 약학 조성물 및 화장료 조성물이 제공된다.
도 1은 본 발명의 화합물들의 프로콜라겐 타입Ⅰ 합성 증가효과를 그래프로 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물들의 프로콜라겐 타입Ⅱ 합성 증가효과를 그래프로 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 화합물들의 세포생존율을 도식화한 것이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여 기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분 히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1-1. 화합물 1의 합성>
본 발명에 사용되는 아미노산의 명명 및 약어는 아래와 같이 표기한다.
Ala : 알라닌 / Cys : 시스테인 / Gly : 글라이신 / Val : 발린 / Pro : 프롤린 / Phe : 페닐알라닌 / Met : 메테오닌 / Trp : 트립토판 / Glu : 글루타민 /
Novabiochem corporation으로부터 구입한 2-chlorotrityl chloride resin(g당 1.4mmol이 로딩된 수지)을 71.4㎎(0.10mmol) 측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3㎖의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 반응(sweeling)시킨 다음, 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 3㎖ 첨가하고 20분간 교반(shaking)하고 피페리딘 DMF 용액을 제거한 후, 10㎖의 DMF 용매를 이용하여 5회 세척하였다(10㎖씩 5회 세척) * DMF : 디메틸포름아미드.
Fmoc-Gly(Trt)-OH(468.6㎎, 0.80mmol), HOBt(108.1㎎, 0.80mmol) 및 DIC(0.124㎖, 0.80mmol)를 2㎖의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 8시간 동안 교반(shaking)한 후, 10㎖의 DMF 용매로 5회 세척하였다. 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 3㎖ 첨가하고 10분간 교반(shaking)하고 피페리딘 용액을 제거한 후, 다시 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 20분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10㎖의 DMF 용매를 이용하여 5회 세척하였다(10㎖씩 5회 세척). 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem., 1970, 34(2), 595~598.]를 실시하여 확인하였다. * Fmoc : 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 / HOBt : 1-하이드록시벤조트리아졸 / DIC : N,N'-디이소프로필카보디이미드.
다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 펩타이드를 축합(커플링) 시켰다.
(1) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;
(2) 20%(w/v) 피페리딘 DMF 용액(3㎖)을 사용하여 10분간 2회 탈보호 ;
(3) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;
(4) Fmoc-아미노산 첨가 ;
(5) 축합 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2시간 축합 ;
(6) DMF 용매(10㎖)로 5회 세척 ;
상기 (1) 내지 (6)은 계속 반복하였으며, 이 때, Fmoc-Cys(Trt)-OH 이후의 Fmoc으로 보호된 아미노산(0.80mmol)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 축합시켰다.
(i) Fmoc-Arg-OH ;
(ii) Fmoc-Gly-OH ;
(iii) Fmoc-Gln-OH ;
(iv) Fmoc-Glu-OH ;
(v) Fmoc-Cys(Trt)-OH ;
Fmoc-Cys(Trt)-OH 축합 후의 (7) 이후에는, 마지막으로, 20% 피페리딘 DMF 용액(3㎖)을 처리하였다.
상기와 같은 합성 종결 즉시, 펩타이드가 축합된 수지를 3시간 동안 트리플루오로아세트산/티오아니졸/에탄디티올/트리이소프로필실래인/물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용(10㎖)하여, 수지로부터 펩타이드를 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액에 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 100㎖ 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리하여 완전히 침전시키고 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 1차 제거하고 이상의 절차(디에틸에테르 용매를 100㎖ 첨가하여 침전물을 세척하고 원심분리하는 단계 - 1차 제거를 시도했던 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 제거하기 위한 작업)를 2회 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다. 상기 침전물(펩타이드)을 C-18 칼럼을 사용하여 50분에 걸쳐 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 콜라겐 합성촉진 펩타이드 H2N-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H(100㎎)을 얻었다.
화합물 1 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 416.49; (100㎎)
<실시예 1-2. 화합물 2~20의 합성>
상기 실시예 1-1과 동일한 제조 과정을 이용하되, Fmoc으로 보호된 아미노산의 순서를 달리하여 하기의 화합물 2~20의 펩타이드를 제조하였다.
화합물 2 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 456.55; (109㎎)
화합물 3 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Asn-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 473.54; (101㎎)
화합물 4 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Lys-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 487.61; (107㎎)
화합물 5 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Asp-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 474.52; (105㎎)
화합물 6 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Tyr-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 522.61; (110㎎)
화합물 7 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Ser-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 446.51; (104㎎)
화합물 8 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Phe-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 506.61; (120㎎)
화합물 9 : H2N-[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 472.59; (101㎎)
화합물 10 : H2N-[Gly-Gln-Ile-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 472.59; (109㎎)
화합물 11 : H2N-[Gly-Met-Pro-Arg-Cys] -CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 459.61; (102㎎)
화합물 12 : H2N-[Gly-Thr-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 542.69; (105㎎)
화합물 13 : H2N-[Gly-Arg-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 429.52; (109㎎)
화합물 14 : H2N-[Gly-Leu-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 441.56; (110㎎)
화합물 15 : H2N-[Gly-Phe-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 576.71; (100㎎)
화합물 16 : H2N-[Gly-Ser-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 516.61; (102㎎)
화합물 17 : H2N-[Gly-Asp-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 475.59; (103㎎)
화합물 18 : H2N-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 442.52; (103㎎)
화합물 19 : H2N-[Gly-Lys-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 456.59; (107㎎)
화합물 20 : H2N-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 457.53; (109㎎)
<실시예 1-3. 화합물 26의 합성>
상기 콜라겐 합성촉진 펩타이드 H2N-[Cys-Glu-Gln-Gly-Arg]-CO2H(50㎎)을 디메틸설폭사이드(DMSO) 2㎖에 녹인 후 10㎖의 물을 첨가하고 3일간 상온에서 교반시켜, 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체(dimer) 형태의 최종 콜라겐 합성촉진 펩타이드(50㎎)를 얻었다.
화합물 26 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Gly-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 832.98; (50㎎)
<실시예 1-4. 화합물 27~45의 합성>
상기 실시예 1-3과 동일한 제조 과정을 이용하되, Fmoc으로 보호된 아미노산의 순서를 달리하여 하기의 화합물 22~40의 펩타이드를 제조하였다.
화합물 27 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Pro-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 913.1; (52㎎)
화합물 28 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Asn-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 947.08; (48㎎)
화합물 29 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Lys-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 957.22; (44㎎)
화합물 30 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Asp-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 949.04; (49㎎)
화합물 31 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Tyr-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1045.22; (48㎎)
화합물 32 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Ser-Arg] 2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 893.02; (54㎎)
화합물 33 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Phe-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1013.22; (50㎎)
화합물 34 : H2N-[Cys-Glu-Gln-Leu-Arg]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 945.16; (48㎎)
화합물 35 : H2N-[Gly-Gln-Ile-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 945.18; (52㎎)
화합물 36 : H2N-[Gly-Met-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 919.22; (52㎎)
화합물 37 : H2N-[Gly-Thr-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1085.38; (48㎎)
화합물 38 : H2N-[Gly-Arg-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 859.04; (56㎎)
화합물 39 : H2N-[Gly-Leu-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 883.12; (59㎎)
화합물 40 : H2N-[Gly-Phe-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1153.42; (52㎎)
화합물 41 : H2N-[Gly-Ser-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1033.22; (42㎎)
화합물 42 : H2N-[Gly-Asp-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 951.18; (52㎎)
화합물 43 : H2N-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 885.04; (48㎎)
화합물 44 : H2N-[Gly-Lys-Pro-Arg-Cys] 2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 913.18; (45㎎)
화합물 45 : H2N-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
MS(ESI)m/e, [M+H]+= 915.06; (46㎎)
< 실시예 1-5. 화합물 21의 합성 >
상기 20가지 펩타이드에 선택된 5가지 중 화합물 1 펩타이드에 수지로부터 펩타이드를 절단하기 전 단계에서 DMF(4ML)와 Stearyl chloride 1.06mL(10eq)와 DIPEA 1.96mL(10eq)를 가하여 반응시켰다. 10㎖의 DMF 용매를 이용하여 5회 세척(10㎖씩 5회 세척) * DMF : 디메틸포름아미드 반응 완결은 Kaiser test로 확인한 후 지질과 펩타이드가 축합된 수지를 3시간 동안 트리플루오로아세트산/　티오아니졸/에탄디티올/트리이소프로필실래인/물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용(10㎖)하여, 수지로부터 펩타이드를 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액에 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 100㎖ 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리하여 완전히 침전시키고 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 1차 제거하고 이상의 절차(디에틸에테르 용매를 100㎖ 첨가하여 침전물을 세척하고 원심분리하는 단계 - 1차 제거를 시도했던 트리플루오로아세트산, 티오아니졸 및 에탄디티올을 제거하기 위한 작업)를 2회 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다. 상기 침전물(펩타이드)을 C-18 칼럼을 사용하여 50분에 걸쳐 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 콜라겐 합성촉진 펩타이드 Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H(102㎎)을 얻었다. 이와 같은 방법으로 화합물 21~25을 합성하였다.
* 지질의 종류
ⅰ) Stearic acid
ⅱ) Palmitic acid　
ⅲ) arachidic acid
ⅳ) Oleic acid
ⅴ) Erucic acid
ⅵ) Linoleic acid
ⅶ) Linolenic acid
위와 같은 실시예 1-1, 1-2의 20개의 화합물의 콜라겐 합성능 및 mmp-1 합성 저해능 실험을 통해 , 콜라겐 합성율이 높은 상위 5개를 선택적으로 지질을 붙여 실험을 진행하였다.
화합물 21 : Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H
화합물 22 : Palmitoyl-[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]-CO2H
화합물 23 : Linoleyl-[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]-CO2H
화합물 24 : Linolenyl-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]-CO2H
화합물 25 : Erucyl-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]-CO2H
<실시예 1-6. 화합물 46의 합성>
실시예 1-5에서 얻어진 상기 콜라겐 합성촉진 펩타이드 Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H (53mg) 메틸설폭사이드(DMSO) 2㎖에 녹인 후 10㎖의 물을 첨가 하고 3일간 상온에서 교반시켜, 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S- S-)로 변형한 이중체 (dimer) 형태의 최종 콜라겐 합성촉진 펩타이드 Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2-CO2H(50㎎)를 얻었다. 이와 같은 방법으로 화합물 41~45을 합성 하였다.
화합물 46 : Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2-CO2H
화합물 47 : Palmitoyl-[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]2-CO2H
화합물 48 : Linoleyl-[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]2-CO2H
화합물 49 : Linolenyl-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
화합물 50 : Erucyl-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2-CO2H
위와 같은 실시예 1-3, 1-4 20개의 화합물의 콜라겐 합성능 및 mmp-1 합성 저해능 실험을 통해, 콜라겐 합성율이 높은 상위 5개를 선택적으로 지질을 붙여 실험을 진행하였으며, 모노머와 같은 방법으로 선정하였다.
실험예 1 : 펩타이드의 프로콜라겐 Ⅰ 합성 촉진 효과 측정 ( in vitro )
0.54세포/㎖ 농도로 12 well plate에 인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast)를 1 ㎖씩 분주하고, 37℃, 5% C02, 가습 조건하에서 2일 배양을 진행 하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 5%로 함유한 배지를 각 웰당 1 ㎖씩 사용하였다.
이어서, PBS를 이용하여 세포배양액을 세척한 뒤, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고 37℃, 5% C02, 가습 조건하에서 1일 배양을 진행 하였다. 배양 후, 1 ㎖의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후, 본 발명의 화합물을 각각 50 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.
프로콜라겐 I 생산 촉진 시험에 있어서는 본 발명의 화합물이 첨가한 후에 3일 배양한 뒤, 배양액을 채취하여 배양액 중에 분비된 타입 I 프로 콜라겐의 농도를 효소 결합 면역 측정법(ELSIA, Procollagen type I c-peptide EIA Kit; R&D system 제조)으로 정량하였다.
정량 결과를 기초로, 합성된 타입 I 프로 콜라겐의 양(pg/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 1에 따라 타입 I 프로 콜라겐 생성율을 계산하였으며, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.
[수학식 1]
타입 I 프로 콜라겐 생성율(%) = (실험군 타입 I 프로 콜라겐 양 / 대조군 타입 I 프로 콜라겐 양) * 100
각 화합물의 프로콜라겐 I 생성율 비교
구분 피부 섬유아세포
프로콜라겐 Ⅰ 생성율(%)		 구분 피부 섬유아세포
프로콜라겐 Ⅰ 생성율(%)
화합물 1 150.1 화합물 26 167.9
화합물 2 152.7 화합물 27 168.1
화합물 3 142.0 화합물 28 159.9
화합물 4 144.4 화합물 29 155.2
화합물 5 146.6 화합물 30 154.1
화합물 6 148.9 화합물 31 154.3
화합물 7 147.9 화합물 32 166.0
화합물 8 148.0 화합물 33 166.0
화합물 9 149.5 화합물 34 166.6
화합물 10 144.5 화합물 35 164.2
화합물 11 137.2 화합물 36 163.5
화합물 12 135.0 화합물 37 161.7
화합물 13 134.4 화합물 38 162.4
화합물 14 135.4 화합물 39 159.8
화합물 15 134.3 화합물 40 159.9
화합물 16 134.1 화합물 41 166.3
화합물 17 132.8 화합물 42 166.0
화합물 18 152.9 화합물 43 170.2
화합물 19 149.0 화합물 44 165.9
화합물 20 154.3 화합물 45 171.3
화합물 21 158.6 화합물 46 178.8
화합물 22 155.7 화합물 47 176.1
화합물 23 154.9 화합물 48 175.0
화합물 24 157.2 화합물 49 171.4
화합물 25 160.1 화합물 50 170.9
상기 표 1 및 도 1을 참고하면, 본 발명의 화합물 1~50은 모두 프로콜라겐 Ⅰ생성 촉진 효과를 보이며, 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방에 대해 충분한 효과를 나타내는 것으로 확인된다.
한편, 펩타이드는 체내에 투과되었을 때에 여러 가지의 가수분해효소들에 의해 매우 빨리 분해되어 그 능력이 급감하기 때문에, 펩타이드의 분해 속도를 늦추는 것이 매우 중요하다. 일반적으로 다양한 가수분해 효소들은 펩타이드의 구조 중에서 아미드 결합(-C(=O)NH-)부위를 카르복실산(-CO2H)와 아민(-NH2)으로 분해하는데, 본 발명은 펩타이드 화합물이 갖는 시스테인 다이머 구조는(-S-S-) 골격을 가지고 있어서 일반적인 가수분해 효소들의 분해 능력을 낮추거나 교란시키는 기능을 한다. 즉, 상기 펩타이드 화합물 중, 이중체 형태의 화합물 26~50은 단량체 형태의 화합물 1~25에 비해 생체 내 가수분해효소에 의해 분해되는 정도가 더디다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 화합물 중, 시스테인 다이머를 갖는 화합물 26~50의 경우, 체내 안정성이 매우 우수할 것으로 판단된다. 더 나아가, 지질화한 펩타이드 21~25와 46~50은 그렇지 않은 펩타이드에 비해 콜라겐 생성 촉진 정도가 비슷하거나 높았다.
실험예 2 : 펩타이드의 프로콜라겐 Ⅱ 합성 촉진 효과 측정 ( in vitro )
0.54세포/㎖ 농도로 12 well plate에 인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast)를 1 ㎖씩 분주하고, 37℃, 5% C02, 가습 조건하에서 2일 배양을 진행 하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 5%로 함유한 배지를 각 웰당 1 ㎖씩 사용하였다.
이어서, PBS를 이용하여 세포배양액을 세척한 뒤, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고 37℃, 5% C02, 가습 조건하에서 1일 배양을 진행 하였다. 배양 후, 1 ㎖의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후, 본 발명의 화합물을 각각 50 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.
프로콜라겐 Ⅱ 생산 촉진 시험에 있어서는 본 발명의 화합물이 첨가한 후에 3일 배양한 뒤, 배양액을 채취하여 배양액 중에 분비된 타입 Ⅱ 프로 콜라겐의 농도를 효소 결합 면역 측정법(ELSIA, Human Procollagen type Ⅱ ELISA Kit; R&D system 제조)으로 정량하였다.
정량 결과를 기초로, 합성된 타입 Ⅱ 프로 콜라겐의 양(pg/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 2에 따라 타입 Ⅱ 프로 콜라겐 생성율을 계산하였으며, 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
[수학식 2]
타입 Ⅱ 프로 콜라겐 생성율(%) = (실험군 타입 Ⅱ 프로 콜라겐 양 / 대조군 타입 Ⅱ 프로 콜라겐 양) * 100
각 화합물의 프로콜라겐 Ⅱ 생성율 비교
구분 피부 섬유아세포
프로콜라겐 Ⅱ 생성율(%)		 구분 피부 섬유아세포
프로콜라겐 Ⅱ 생성율(%)
화합물 1 179.1 화합물 26 192.0
화합물 2 173.2 화합물 27 180.4
화합물 3 168.8 화합물 28 174.4
화합물 4 169.0 화합물 29 176.0
화합물 5 169.9 화합물 30 173.9
화합물 6 171.4 화합물 31 174.4
화합물 7 170.5 화합물 32 176.5
화합물 8 170.2 화합물 33 176.6
화합물 9 178.5 화합물 34 184.6
화합물 10 167.3 화합물 35 173.3
화합물 11 163.0 화합물 36 170.4
화합물 12 163.9 화합물 37 170.1
화합물 13 164.5 화합물 38 174.2
화합물 14 164.5 화합물 39 177.5
화합물 15 164.2 화합물 40 177.5
화합물 16 165.1 화합물 41 177.6
화합물 17 170.4 화합물 42 179.0
화합물 18 177.7 화합물 43 186.1
화합물 19 172.8 화합물 44 176.3
화합물 20 172.6 화합물 45 179.7
화합물 21 180.1 화합물 46 195.5
화합물 22 180.0 화합물 47 193.7
화합물 23 179.3 화합물 48 194.1
화합물 24 178.6 화합물 49 187.7
화합물 25 179.7 화합물 50 188.8
상기 표 2 및 도 2를 참고하면, 본 발명의 화합물 1~50은 모두 프로콜라겐 Ⅱ 생성 촉진 효과를 보이며, 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방에 대해 충분한 효과를 나타내는 것으로 확인된다. 다수의 펩타이드 화합물 중, 지질화한 펩타이드 21~25와 46~50은 그렇지 않은 펩타이드에 비해 프로콜라겐 Ⅱ 생성 촉진 정도가 비슷하거나 높았다.
실험예 3 : 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머의 안전성 확인 ( in vitro )
인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast, Thermo사 제조)를 0.53세포/㎖ 농도로 96웰 플레이트에 100 ul씩 분주하고, 37℃, 5% C02, 가습 조건하에서 2일 배양을 실시하였다. 배양액은, DMEM medium(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco사 제조)에 FBS(Gibco사 제조)를 10%로 함유한 배지를 각 웰당 100 ul씩 사용하였다.
이어서, FBS(Gibco)가 포함되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma사 제조)으로 교환하고, 다시 100 ul의 PBS(Phosphate Buffered Saline, Sigma사 제조)로 세척 한 후 본 발명의 화합물을 200 uM 처리하여 배양하였다. 상기 화합물을 용해하지 않는 PBS를 100㎕ 첨가한 것을 대조군으로서 사용하였다.
시험 시료를 넣고 48시간 배양 후, MTT를 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 이후에 배양액은 제거하고 DMSO를 넣고 생성된 formazan을 충분히 용해시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값을 기초로, 수학식 3에 따라 세포 생존율을 계산하였으며, 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.
[수학식 3]
세포 생존율(%) = (실험군 540 nm 흡광도 / 대조군 540 nm 흡광도) * 100
각 화합물의 세포 독성
구분 세포 생존율(%) 구분 세포 생존율(%)
대조군 100 대조군 100
화합물 1 102.2 화합물 26 100.6
화합물 2 101.8 화합물 27 97.2
화합물 3 100.3 화합물 28 98.1
화합물 4 99.9 화합물 29 97.9
화합물 5 99.8 화합물 30 99.2
화합물 6 98.7 화합물 31 100.0
화합물 7 98.8 화합물 32 101.4
화합물 8 96.1 화합물 33 101.2
화합물 9 99.0 화합물 34 98.7
화합물 10 98.6 화합물 35 98.3
화합물 11 98.5 화합물 36 99.4
화합물 12 102.1 화합물 37 99.5
화합물 13 101.9 화합물 38 99.0
화합물 14 100.2 화합물 39 99.0
화합물 15 100.4 화합물 40 99.1
화합물 16 99.7 화합물 41 98.9
화합물 17 99.8 화합물 42 100.7
화합물 18 98.7 화합물 43 100.4
화합물 19 98.5 화합물 44 101.2
화합물 20 103.2 화합물 45 99.9
화합물 21 95.7 화합물 46 97.1
화합물 22 95.8 화합물 47 96.0
화합물 23 96.1 화합물 48 96.6
화합물 24 95.9 화합물 49 95.7
화합물 25 96.0 화합물 50 95.5
상기 표 3 및 도 3을 참고하면, 본 발명의 모든 화합물은 모두 세포 생존율이 대조군과 비교하였을 때, 95% 이상의 세포 생존율을 보이는 것을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 본 발명의 화합물은 모두 인간 피부 섬유아세포를 포함하는 동물세포에서 안전성(Safety)이 확인되어 안전한 원료임을 확인하였다.
실험예 4 : 화장품 제형의 제조
상기 콜라겐 합성 촉진 펩타이드인 신규 헵타펩타이드 단당체 및 이량체를 포함하는 화장료의 효과를 평가하기 위하여, 하기의 표 4와 같은 성분들을 배합하여 크림 형태의 화장품 제형을 제조하였다.
주름 개선 효과 평가를 위한 크림 Formulation
성분 실험예 1(중량%) 비교예 1(중량%)
헵타펩타이드 단당체 0.01 -
헵타펩타이드 이량체 0.01 -
보습성분 10 10
피이지-100 스테아레이트 0.5 0.5
글리세릴스테아레이트 0.3 0.3
폴리소르베이트 60 0.2 0.2
세틸알코올 0.1 0.1
스쿠알란 5 5
토코페릴아세테이트 0.2 0.2
피이지-5 레이프씨드스테롤 0.05 0.05
글리세린 2 2
세테스-3 0.02 0.02
디소듐이디티에이 0.02 0.02
1,2-헥산디올 0.1 0.1
옥틸도데칸올 0.25 0.25
디프로필렌글라이콜 0.23 0.23
점증제 적량 적량
향, 보존제 적량 적량
정제수 잔량 전부 잔량 전부
합 계 100.0 100.0
실험예 5: 눈가 주름 개선 효과 평가 (육안평가)
본 발명에 따른 화장료 조성물의 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 만 30 내지 55세의 대한민국 여성 20명을 대상으로 각 8주간 일상적인 크림 사용과 같은 방법으로 평가하였다.
실험예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 화장료를 얼굴의 각 면에 구분 지어 사용하게 하였으며, 피검자의 주름개선 효과를 숙련된 검사자의 육안 관찰을 통하여 평가하였다.
눈가 주름 개선 효과 평가 결과
구분 주름개선 효과
우수 약간 없음 유효율(%)
실험예 1 12 6 2 75%
비교예 1 1 8 11 25%
상기 표 5를 참조하면, 실험예 1과 같이 콜라겐 합성 촉진 효능을 가지고 있는 펜타펩타이드 및 펜타펩타이드 다이머를 포함하여 제조된 화장료가 비교예 1과 같이 상기 성분들을 포함하지 않고 제조된 화장료보다 주름개선 효과가 현저히 향상되었음을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 하기 화합물 1 내지 20 및 26 내지 45에 해당하는 콜라겐 합성 촉진 펩타이드는

    [Cys-Gly-Gln-Gly-Arg] (화합물 1),
    [Cys-Gly-Gln-Pro-Arg] (화합물 2),
    [Cys-Gly-Gln-Asn-Arg] (화합물 3),
    [Cys-Gly-Gln-Lys-Arg] (화합물 4),
    [Cys-Gly-Gln-Asp-Arg] (화합물 5),
    [Cys-Gly-Gln-Tyr-Arg] (화합물 6),
    [Cys-Gly-Gln-Ser-Arg] (화합물 7),
    [Cys-Gly-Gln-Phe-Arg] (화합물 8),
    [Cys-Gly-Gln-Leu-Arg] (화합물 9),
    [Gly-Gln-Ile-Arg-Cys] (화합물 10),
    [Gly-Met-Pro-Arg-Cys] (화합물 11),
    [Gly-Thr-Pro-Arg-Cys] (화합물 12),
    [Gly-Arg-Pro-Arg-Cys] (화합물 13),
    [Gly-Leu-Pro-Arg-Cys] (화합물 14),
    [Gly-Phe-Pro-Arg-Cys] (화합물 15),
    [Gly-Ser-Pro-Arg-Cys] (화합물 16),
    [Gly-Asp-Pro-Arg-Cys] (화합물 17),
    [Gly-Asn-Pro-Arg-Cys] (화합물 18),
    [Gly-Lys-Pro-Arg-Cys] (화합물 19),
    [Gly-Glu-Pro-Arg-Cys] (화합물 20),
    [Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2 (화합물 26),
    [Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]2 (화합물 27),
    [Cys-Gly-Gln-Asn-Arg]2 (화합물 28),
    [Cys-Gly-Gln-Lys-Arg]2 (화합물 29),
    [Cys-Gly-Gln-Asp-Arg]2 (화합물 30),
    [Cys-Gly-Gln-Tyr-Arg]2 (화합물 31),
    [Cys-Gly-Gln-Ser-Arg]2 (화합물 32),
    [Cys-Gly-Gln-Phe-Arg]2 (화합물 33),
    [Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]2 (화합물 34),
    [Gly-Gln-Ile-Arg-Cys]2 (화합물 35),
    [Gly-Met-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 36),
    [Gly-Thr-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 37),
    [Gly-Arg-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 38),
    [Gly-Leu-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 39),
    [Gly-Phe-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 40),
    [Gly-Ser-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 41),
    [Gly-Asp-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 42),
    [Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 43),
    [Gly-Lys-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 44), 및,
    [Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2 (화합물 45)
    이며, 화합물 26 내지 45에 []2는 화합물 1 내지 20의 시스테인 잔기인 티올기(-SH)를 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체를 나타내는 것을 특징으로 하는 콜라겐 합성 촉진용 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물 1 내지 20과 26 내지 45 펩타이드 중 콜라겐 합성능 및 MMP-1저해능이 우수한 각각의 5가지에 지질을 붙인 화합물 21 내지 25와 46 내지 50에 해당하는 펩타이드는

    Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]-CO2H (화합물21),
    Palmitoyl-[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]-CO2H (화합물22),
    Linoleyl-[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]-CO2H (화합물23),
    Linolenyl-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]-CO2H (화합물24),
    Erucyl-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]-CO2H (화합물25),
    Stearyl-[Cys-Gly-Gln-Gly-Arg]2-CO2H (화합물46),
    Palmitoyl-[Cys-Gly-Gln-Pro-Arg]2-CO2H (화합물47),
    Linoleyl-[Cys-Gly-Gln-Leu-Arg]2-CO2H (화합물48),
    Linolenyl-[Gly-Asn-Pro-Arg-Cys]2-CO2H (화합물49),및
    Erucyl-[Gly-Glu-Pro-Arg-Cys]2-CO2H (화합물50)

    으로 화합물 1 내지 20과 26 내지 45에 비해 콜라겐 합성능 및 MMP-1저해능이 비슷한 펩타이드.
  3. 제 1항 내지 2항의 어느 한 항에 따른 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선을 위한 조성물.
  4. 제 1항 내지 2항의 어느 한 항에 따른 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 펩타이드는 약학적 조성물에 0.0001~1.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선을 위한 조성물.
  6. 제 1항 내지 2항의 어느 한 항에 따른 펩타이드에서 1종 이상 선택되는 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선을 위한 화장료 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 펩타이드는 화장료 조성물에 0.0001~1.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물로 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디 제품류, 비누, 오일, 립스틱 및 파운데이션에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부노화 또는 피부주름 예방, 개선을 위한 화장료 조성물.
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