CN116284256A

CN116284256A - 一种六肽-9环肽及其应用

Info

Publication number: CN116284256A
Application number: CN202211550144.5A
Authority: CN
Inventors: 李小静; 黄虎; 李维; 胡新成; 陶侃
Original assignee: Shanghai Zhongyi Daily Chemical Co ltd
Current assignee: Shanghai Zhongyi Daily Chemical Co ltd
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN117143200A; CN116162135A; CN116172894A; CN116284256B; CN116162135B

Abstract

本发明提供了一种六肽‑9环肽及其应用，通过对六肽‑9直链肽进行环化，合成一种全新结构的六肽‑9环肽(CHP‑9)，并对其进行结构鉴定和功效研究，发现在皮肤抗皱和紧致方面都具有比六肽‑9直链肽更加杰出的功效，比如六肽‑9环肽能显著促进CollagenⅢ和Integrinβ4的表达，而六肽‑9直链肽(HEX‑9)对CollagenⅢ和Integrinβ4却没有促进作用；同时六肽‑9环肽具有更低的细胞毒性，更好的皮肤渗透性，在美容护肤方面也具有很好的功效，在化妆品及医美紧致抗衰等领域具有巨大的应用前景。

Description

一种六肽-9环肽及其应用

本申请主张中国在先申请，申请号：202210087176.X，申请日2022年1月25日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。

技术领域

本发明属于护肤品原料技术领域，涉及一种六肽-9环肽及其应用。

背景技术

多肽是多次荣获诺贝尔奖的核心抗衰成分，基本组成单元是氨基酸，氨基酸按照特定序列脱水缩合形成，本质与蛋白质相同。常见美容肽一般都是2～10个氨基酸组成的短肽，其机理明确一般作用于皮肤某个微观受体(通常称为靶点)，具有抗皱、美白、保湿、抗氧化、修复等不同功效，多肽有比较高的生物活性，一般只需要添加几到几百个ppm即可有显著效果。然而，多肽的直链结构决定了其亲水性更强，不易在皮肤上透皮吸收。同时，多肽类分子是许多蛋白酶水解的底物，大部分多肽类会在血液以及组织中被蛋白酶降解失活，失去功效性，因此多肽类原料的生物利用度很低，以至于其在实际应用中受到很大限制。

为了减弱或避免蛋白酶对多肽类分子的降解，必须要利用化学方法或其他方法对多肽分子进行修饰改造，以提高多肽的代谢稳定性。目前，增强多肽分子代谢稳定性的主要方法包括非天然氨基酸修饰、伪肽化策略、逆肽策略、环化策略以及高级脂肪酸修饰、蛋白融合策略、聚乙二醇修饰等。其中，由于环状结构导致的构象变化限制，环肽类化合物一般具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性。大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性。其次，氨基酸组成特点决定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性。环肽类化合物很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控，这些特点都非常有利于药物开发过程。

同时，目前市场常见的美容肽功效上的多肽一般比较单一，如六肽-9是一种由六个氨基酸组成的胶原蛋白肽，在人体的胶原蛋白Ⅳ和ⅩⅦ(两种关键基膜胶原蛋白)的结构中同时存在，具有显著的抗皱修复功效。目前研究得出其主要机理通路是促进促进真皮层成纤维细胞合成胶原蛋白，补充胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ和ⅩⅦ型的含量等。另一方面，六肽-9作为小分子直链肽，也存在稳定性低、易降解、失活、透皮吸收率差等问题。

通过环化改性可提升多肽的空间结构复杂性、增加比表面积，提供更多与靶点接触可能性，以期得到功效更加多样性、多肽原料更高的利用率，扩大六肽-9在美容护肤领域应用前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种六肽-9环肽及其应用，通过对六肽-9直链肽进行环化，合成一种全新结构的六肽-9环肽(CHP-9)，并对其进行结构鉴定和功效研究，发现在皮肤抗皱和紧致方面都具有比六肽-9直链肽更加杰出的功效，比如六肽-9环肽能显著促进CollagenⅢ和Integrinβ4的表达，而六肽-9直链肽(HEX-9)对CollagenⅢ和Integrinβ4却没有促进作用；同时六肽-9环肽具有更低的细胞毒性，更好的皮肤渗透性，在护肤方面也具有很好的功效，在化妆品领域具有巨大的应用前景。

一方面，本发明提供了一种六肽-9环肽(CHP-9)，所述六肽-9环肽具有如式(1)所示的结构式：

中文名称：3,3'-(5,8,11,16,19,22-六氧代乙酰水杨酸-1H,5H-二吡咯[1,2-a:1'，2'-j][1,4,7,10,13,16]六氮杂环十八烯-9,20-二酰基)二丙酰胺；

英文名称：

3,3'-(5,8,11,16,19,22-hexaoxoicosahydro-1H,5H-dipyrrolo[1,2-a:1',2'

j][1,4,7,10,13,16]hexaazacyclooctadecine-9,20-diyl)dipropanamide

分子式：C₂₄H₃₆N₈O₈

所述六肽-9环肽(CHP-9)通过在六肽-9上形成酰胺键环化而制得，所述六肽-9直链肽(HEX-9)的结构式如式(2)所示：

所述六肽-9环肽(CHP-9)的制备方法为：先合成链状的六肽-9直链肽(HEX-9)，再通过成环反应制得六肽-9环肽。

本发明经大量研究证明，环化后的六肽-9环肽，与原直链结构的六肽-9直链肽相比，更具稳定性，亲和性，更高的安全耐受性，而且不仅没有丢失原有功效，还新增了很多新的功效，在抗衰领域具有更强的应用潜能，在皮肤抗皱和紧致方面都具有比六肽-9直链肽更加杰出的功效，可以更好地应用于化妆品领域，可用于制备护肤的爽肤水、面膜、精华、乳液、膏霜、冻干粉等，前景广阔。

另外，本发明提供的六肽-9环肽还可以与其他具有护肤功效的活性成分(如抗衰老、抗皱、保湿等等)进行复配，凡是采用本发明提供的六肽-9环肽与其他活性成分进行复配的产品，也都在本发明的保护范围内。

另一方面，本发明提供了如上所述的六肽-9环肽用于制备促进皮肤紧致的制剂的用途。

进一步地，所述六肽-9环肽通过促进Integrinβ4基因表达来促进皮肤紧致。

Integrinα6、Integrinβ4是整合素，是由α(120～185kD)和β(90～110kD)两个亚单位形成的异二聚体，α6β4是与半桥粒蛋白相联系的一种基底细胞特异性整合素，α6β4将基底细胞与其下方的基底膜带连接起来。层粘连蛋白332(Laminin 332)，也叫做层连蛋白5(Laminin 5)，是基底膜的主要组成蛋白，对上皮细胞与基底膜之间的稳定结合起重要作用，其通过受体介导，具有促进上皮细胞粘附，细胞迁移和扩散的功能。层粘连蛋白332是由3个α链、3个β链和2个γ链构成。活性物作用后，检测层粘连蛋白332的含量有助于评价待测活性物的紧致抗皱作用。因此，可以通过给药后检测成Integrinα6、Integrinβ4和Laminin5基因表达的变化，评估待测样品的紧致功效。

本发明经研究证明，环化后的六肽-9环肽(CHP-9)具有明显的促进基因Integrinβ4表达的作用，而原直链肽HEX-9则无相应作用，证明环化后的CHP-9对促进皮肤紧致具有更好的效果。

进一步地，所述六肽-9环肽的用量为0.01％～20.0％。

再一方面，本发明提供了如上所述的六肽-9环肽用于制备促进Integrinβ4基因表达的制剂的用途。

进一步地，所述六肽-9环肽的用量为0.01％～20.0％。

再一方面，本发明提供了如上所述的六肽-9环肽用于制备促进CollagenⅢ表达的制剂的用途。

胶原蛋白主要是由存在于皮肤真皮层的成纤维细胞产生的，是支撑皮肤的重要元素，其中CollagenⅠ为胶原Ⅰ，胶原蛋白约占皮肤真皮层80％的比重，使得皮肤饱满充盈，促进CollagenⅠ含量的增加，可以达到一定抵抗皱纹产生的作用。Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)也是真皮细胞外基质的一种主要成分，占真皮胶原的10％，与胶原Ⅰ共同组装成胶原纤维，胶原纤维在皮肤的韧性方面发挥重要作用，在皮肤抗衰抗皱领域已逐渐成为关键性靶点。

本发明经研究证明，环化后CHP-9在CollagenⅢ上有显著性，而原直链HEX-9无相关作用，证明环化后的CHP-9对促进皮肤抗皱具有更好的效果。

同时还发现，CHP-9在CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、CollagenXⅦ基因表达上具有浓度依赖性，CHP-9在高浓度下促进CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达效果更强。因此，在关注细胞毒性的前提下，护肤品中采用高浓度的CHP-9是有需求的。

进一步地，所述六肽-9环肽的用量为0.01％～20.0％。

再一方面，本发明提供了如上所述的六肽-9环肽用于制备具有低细胞毒性、高皮肤渗透率的护肤制剂的用途。

相比直链肽HEX-9，六肽-9环肽的细胞毒性更低，因此可以在护肤品中采用更高浓度的六肽-9环肽来提高护肤效果。

相比直链肽HEX-9，六肽-9环肽还具有更好的皮肤渗透率，研究证明，六肽-9环肽(CHP-9)使用24h后渗透效果是原直链HEX-9的3.11倍，证明环化是有益的，可达到增强透皮吸收效果。

进一步地，所述的护肤制剂为促进皮肤紧致的制剂，或促进皮肤抗皱的制剂。

进一步地，所述六肽-9环肽通过促进CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ中的任意一种或多种的表达来促进皮肤抗皱。

本发明的有益效果为：

1)成功合成一种全新结构的六肽-9环肽(CHP-9)，该环肽不仅没有丢失原直链肽功效，反而还新增了更多的护肤功效；

2)发现六肽-9环肽(CHP-9)具有明显的促进基因Integrinβ4表达的作用，而原直链肽HEX-9则无相应作用，证明环化后的CHP-9对促进皮肤紧致具有更好的效果；

3)发现六肽-9环肽(CHP-9)具有明显的促进CollagenⅢ表达的作用，而原直链HEX-9则无相应作用，证明环化后的CHP-9对促进皮肤抗皱具有更好的效果；

4)发现相比直链肽HEX-9，六肽-9环肽的细胞毒性更低，可以在护肤品中采用更高浓度的六肽-9环肽来提高护肤效果；

5)发现相比直链肽HEX-9，六肽-9环肽还具有更好的皮肤渗透率，使用24h后渗透效果是原直链HEX-9的3.11倍。

附图说明

图1为实施例1制备的六肽-9环肽的高效液相色谱图；

图2为实施例2中的样品的红外吸收光谱图；

图3为实施例2中的样品的核磁共振氢谱；

图4为实施例2中的样品的核磁共振碳谱；

图5为实施例2中的样品的质谱图；

图6为实施例3中的直链六肽-9在不同浓度情况下的细胞活力变化趋势图；

图7为实施例3中的直链六肽-9在不同浓度情况下的细胞形态学图；

图8为实施例3中的六肽-9环肽(CHP-9)在不同浓度情况下的细胞活力变化趋势图；

图9为实施例3中的六肽-9环肽(CHP-9)在不同浓度情况下的细胞形态学图；

图10为实施例4中的各样品的CollagenΙ基因表达量柱状图；

图11为实施例4中的各样品的CollagenⅢ基因表达量柱状图；

图12为实施例4中的各样品的CollagenⅣ基因表达量柱状图；

图13为实施例4中的各样品的CollagenⅦ基因表达量柱状图；

图14为实施例4中的各样品的Collagen XⅦ基因表达量柱状图；

图15为实施例5中的各样品的对基因Integrinα6、Integrinβ4、Laminin 5基因含量变化趋势柱状图；

图16为实施例6中的扩散池工作示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用，本发明的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合。

实施例1：六肽-9环肽的制备

下述实施例中，实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体制备过程为：

本实施例依次采用氨基酸原料Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH进行线性肽的连接，然后切割得到全保护切割得到线性肽H-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-OH，再将线性肽H-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-OH通过环化得到关环产品Cyclo(Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro)，最后再次切割得到粗品肽Cyclo(Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)。

切割得到粗品以后，经过纯化冻干得到成品Cyclo(Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)，也就是六肽-9环肽(CHP-9)，纯度99.2％。

步骤1：取Fmoc-Gly-OH(4.46g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待用；

步骤2：取Fmoc-Pro-OH(5.06g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，甲醇65mL洗涤2次，DCM溶液65mL洗涤2次，甲醇65mL洗涤2次；

步骤3：取Fmoc-Gln(Trt)-OH、HOBt(2.03g，15mmol)于100mL烧杯中，降温至4℃，加入DMF溶液25mL，DIC(2.3mL，15mmol)静置反应20分钟，并将100mL烧杯中溶液加入到125mL固相合成反应器中，搅拌反应1.5小时，反应完成；树脂用DMF溶液洗涤三次，每次65mL；洗涤完成后，进行下一步反应；加入20％Pip/DMF溶液65mL，搅拌反应30min，抽滤，除去托保护液，然后用DMF溶液65mL洗涤6次，抽干待进行下一步；

步骤4：真空干燥，加入1％的TFA/DCM溶液200mL，30℃条件下搅拌反应30分钟，过滤，除去树脂，得到滤液；滤液抽干得到全保护多肽H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH；

步骤5：将全保护多肽用二氯甲烷(DCM)1.4L溶解，加入DIC(1.54mL，10mmol)，HOBt(1.35g，10mmol)，DIEA(1.74mL，10mmol)，在30℃条件下搅拌反应14小时，形成Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，浓缩除去DCM，进行下一步；

步骤6：将Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))用TFA/TIS/H₂O＝90/5/5(70mL)切割2.5小时，将切割液加入到700mL叔丁基甲醚(4℃)溶液中，析出白色固体，离心，得到白色固体粗肽；将白色固体粗肽在真空干燥下干燥得到粗肽粉末Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)；经过反相C18制备色谱纯化，冻干后得到精品Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)(高效液相色谱如图1所示)，其化学结构即式1：

实施例2：六肽-9环肽的结构鉴定

本实施例对实施例1制备的六肽-9环肽进行化合物结构确证，具体分析过程和结果为：

通过对样品(按照实施例1提供的方法制备)的结构通过多种分析表征方法(元素分析、红外吸收光谱、核磁共振谱、质谱)进行了化学结构确证。

所用样品信息见表1：

表1、样品信息

1、元素分析

仪器型号：vario MICRO cube元素分析仪(Elementar Analysensysteme GmbH德国)；测试条件：燃烧温度：1000℃，氦气流量：140mL/min；测试数据、解析：样品的元素分析测试结果：

表2、样品的元素分析数据表

解析及结论：经计算，测试值与理论值一致，样品的分子式为C₂₄H₃₆N₈O₈。

2、红外吸收光谱

仪器型号：NICOLET iS50 FT-IR傅里叶红外光谱仪；样品的红外光谱图见附图(图2)，样品的红外光谱吸收峰数据及归属见表3。

表3、样品的红外光谱吸收峰数据及归属

吸收峰(cm^-1)	强度	振动类型	基团	备注
					3357	强	υ_N-H	-NH-,-NH₂	胺基
2881,2928,2950,2976	强	υ_C-H	-CH₂-,-CH-	亚甲基、次甲基
					1655	强	υ_C＝O	-NH-C＝O	酰胺吸收带Ⅰ
1522	强	δ_N-H	-NH-C＝O	酰胺吸收带Ⅱ
					1243	强	υ_C-N	-NH-C＝O	酰胺吸收带Ⅲ

解析及结论：

1)3357cm^-1为胺基的伸缩振动，表明分子内存在胺基；

2)2881cm^-1、2928cm^-1、2950cm^-1、2976cm^-1为烷基(亚甲基、次甲基)的伸缩振动，表明分子中存在烷基；

3)1655cm^-1为酰胺羰基伸缩振动，1522cm^-1为酰胺胺基变形振动，1243cm^-1为酰胺碳氮伸缩振动，表明分子内存在酰胺；

红外光谱分析结果表明，样品中存在胺基、烷基(亚甲基、次甲基)、酰胺等基团，与样品结构相符。

4、核磁共振波谱(NMR)

4.1核磁共振氢谱(¹H NMR)

仪器型号：Bruker DMX-500核磁共振仪；测定条件：溶剂：D₂O(氘代水)；样品的核磁共振氢谱见图3，样品的1H NMR图谱数据及归属见表4。

表4、样品的¹H NMR图谱数据及归属

4.2核磁共振碳谱(¹³C NMR)

仪器型号：Bruker DMX-500核磁共振仪；测定条件：溶剂：D₂O(氘代水)；样品的核磁共振碳谱(图4)，样品的¹³C NMR数据及归属见表5。

表5、样品的¹³C NMR数据及归属

5、质谱

仪器型号：Agilent 6460；测试条件：ESI源；测试图谱：样品的质谱图见附图(图5)。测试数据及解析：分子式：C₂₄H₃₆N₈O₈，分子量：12.01×24+1.008×36+14.01×8+16.00×8＝564.60；解析及结论：M/Z＝565.20为样品的[M+H]^+-离子峰。质谱分析表明其离子峰符合样品分子量。

6、综合解析

本品经元素分析和质谱确认，样品分子组成为C₂₄H₃₆N₈O₈，分子量564.60，不饱和度为10。红外光谱显示样品中存在胺基、烷基(亚甲基、次甲基)、酰胺等基团；¹H NMR和¹³C NMR图谱将相关的碳和氢进行了归属。质谱分析表明其离子峰符合样品分子量。综合以上信息，样品的结构为：式(1)

实施例3：六肽-9环肽的细胞毒性检测

本实施例基于UVA辐照成纤维细胞，通过检测基于成纤维细胞，开展细胞毒性检测，确定样品在成纤维细胞上的安全给药浓度。

本实施例所用细胞为成纤维细胞，通过市售途径获得。主要试剂：DMEM培养液(Gibco)、PBS(索莱宝)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、RNAiso Plus(Takara)、反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)(Takara)、SYBR Premix Ex Taq^TM II荧光染料(Takara)、无菌ddH₂O(Takara)、TGF-β1(Peprotech)。主要设备CO₂培养箱(Thermo，150I)、超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1F)、恒温箱(泰斯特)、普通PCR仪(博日)、荧光定量PCR仪(BioRad，CFX-96)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)、UVA辐照仪(飞利浦)。

实验过程：样品组表面添加相应浓度的样品工作液，将样品均匀分布于模型表面，置于培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育24h。孵育结束后，用无菌PBS溶液清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。

细胞毒性检测的过程如下：

1)细胞接种：成纤维细胞按8×10³个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。

3)配液：分别按测试浓度0.0938、0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12％配制不同浓度的样品工作液。

4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。

6)细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力(％)＝(样品孔OD-调零孔OD/溶剂对照孔OD-调零孔OD)×100％。

直链六肽-9在不同浓度情况下的细胞活力见图6，细胞形态学图见图7；六肽-9环肽(CHP-9)在不同浓度情况下的细胞活力见图8，细胞形态学图见图9。

由图6～9可以看出：根据MTT和形态学结果，样品HEX-9基于成纤维细胞，在1.5％的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性，而样品CHP-9基于成纤维细胞，在3％的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。得出环化后CHP-9细胞毒性明显低于原直链HEX-9，证明环化是有益的，可以显著降低细胞毒性。

另外，由于本发明提供的六肽-9环肽CHP-9可以制备成制剂进行皮肤上使用，皮肤对CHP-9的耐受程度非常高，因此还可以在更高浓度下使用，最高可达到20％。

实施例4：六肽-9环肽的体外抗皱功效测试

胶原蛋白主要是由存在于皮肤真皮层的成纤维细胞产生的，是支撑皮肤的重要元素，其中CollagenⅠ为胶原Ⅰ，胶原蛋白约占皮肤真皮层80％的比重，使得皮肤饱满充盈，促进CollagenⅠ含量的增加，可以达到一定抵抗皱纹产生的作用。Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)也是真皮细胞外基质的一种主要成分，占真皮胶原的10％，与胶原Ⅰ共同组装成胶原纤维，胶原纤维在皮肤的韧性方面发挥重要作用。Ⅳ型胶原蛋白(CollagenⅣ)、Ⅶ型胶原蛋白(CollagenⅦ)、XⅦ型胶原蛋白(Collagen XⅦ)三种胶原是半桥粒基底膜带复合体的主要成分，真表皮连接处的关键蛋白。UV照射的离体皮肤很明显的能够看出真表皮连接处Ⅳ、Ⅶ及XⅦ型的减少，因此可以通过检验上述CollagenⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、XⅦ的变化来评价待测活性物的抗光老化、抗皱功效。

本实施例基于UVA辐照成纤维细胞，通过检测样品作用后CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达情况，评价待测样品的抗皱功效。

本实施例所用本测试所用细胞为成纤维细胞，通过市售途径获得。主要试剂：DMEM培养液(Gibco)、PBS(索莱宝)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、RNAiso Plus(Takara)、反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)(Takara)、SYBR Premix Ex Taq^TM II荧光染料(Takara)、无菌ddH₂O(Takara)、TGF-β1(Peprotech)。主要设备CO₂培养箱(Thermo，150I)、超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1F)、恒温箱(泰斯特)、普通PCR仪(博日)、荧光定量PCR仪(BioRad，CFX-96)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)、UVA辐照仪(飞利浦)。

实验过程：样品组表面添加相应浓度的样品工作液，将样品均匀分布于模型表面，置于CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育24h。孵育结束后，用无菌PBS溶液清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。

抗皱功效测试的过程如下：

1)细胞接种：按4×10⁴个/孔的接种密度接种成纤维细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

2)配液：根据测试方案(表6)分别配制受试物工作液。

表6、实验设计

3)给药：根据测试方案，待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

4)UVA辐照：根据测试方案，对需要辐照的组别进行UVA辐照，辐照剂量为30J/cm²。辐照结束后，置于培养箱(37℃、5％CO₂)中继续培养24h。

5)收集细胞：培养24h后，收集细胞上清后，1mL/孔PBS清洗两次，每孔加入1mLRNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。

6)基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。

7)结果统计分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，各组间采用t-test统计分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

基于测试方法，对成纤维细胞进行RNAiso Plus处理后收样，依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR操作，检测结果应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

实验结果见图10～14，其中图10为各样品的CollagenΙ基因表达量柱状图，图11为CollagenⅢ基因表达量柱状图；图12为CollagenⅣ基因表达量柱状图；图13为CollagenⅦ基因表达量柱状图；图14为Collagen XⅦ基因表达量柱状图。

由图10可见，与BC组相比，NC组CollagenΙ基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组CollagenΙ基因的表达明显上调，说明本次测试阳性对照有效。

与NC组相比，样品HEX-9-1％、HEX-9-0.5％、CHP-9-3％、CHP-9-2％的CollagenΙ基因表达均明显上调，上调率分别为26.41％、18.59％、63.85％、31.01％。样品CHP-9-1％、CHP-9-0.5％的CollagenΙ基因表达无显著变化。说明环肽CHP-9与直链肽HEX-9都能有效促进CollagenΙ基因的表达。由于CHP-9的细胞毒性更低，可以采用3％的高浓度，能更有利于促进CollagenΙ基因的表达。

由图11可见，与BC组相比，NC组CollagenⅢ基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组CollagenⅢ基因的表达明显上调，说明本次测试阳性对照有效。

与NC组相比，样品CHP-9-3％、CHP-9-2％的CollagenⅢ基因表达均明显上调，上调率分别为56.42％、31.45％。而样品HEX-9-1％、HEX-9-0.5％、CHP-9-1％、CHP-9-0.5％的CollagenⅢ基因表达均无显著变化。说明直链肽HEX-9并不能促进CollagenⅢ基因表达上调，而将其环化成CHP-9后，却能明显促进CollagenⅢ基因表达上调，可见环化后在促进CollagenⅢ基因表达上调方面具有明显效果。

由图12可见，与BC组相比，NC组CollagenⅣ基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组CollagenⅣ基因的表达明显上调，说明本次测试阳性对照有效。

与NC组相比，样品HEX-9-1％、HEX-9-0.5％、CHP-9-3％、CHP-9-2％、CHP-9-1％、CHP-9-0.5％的CollagenⅣ基因表达均明显上调，上调率分别为122.85％、112.65％、244.61％、163.86％、87.49％、92.19％。说明环肽CHP-9与直链肽HEX-9都能有效促进CollagenⅣ基因的表达。由于CHP-9的细胞毒性更低，可以采用3％的高浓度，能更有利于促进CollagenⅣ基因的表达。

由图13可见，与BC组相比，NC组CollagenⅦ基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组CollagenⅦ基因的表达明显上调，说明本次测试阳性对照有效。

与NC组相比，样品HEX-9-1％、HEX-9-0.5％、CHP-9-3％、CHP-9-2％、CHP-9-1％、CHP-9-0.5％的CollagenⅦ基因表达均明显上调，上调率分别为198.92％、186.07％、298.72％、196.98％、160.90％、102.77％。说明环肽CHP-9与直链肽HEX-9都能有效促进CollagenⅦ基因的表达。由于CHP-9的细胞毒性更低，可以采用3％的高浓度，能更有利于促进CollagenⅦ基因的表达。

由图14可见，与BC组相比，NC组Collagen XⅦ基因的表达明显下调，说明本次测试刺激条件有效；与NC组相比，PC组Collagen XⅦ基因的表达明显上调，说明本次测试阳性对照有效；与NC组相比，样品HEX-9-1％、HEX-9-0.5％、CHP-9-3％、CHP-9-2％、CHP-9-1％、CHP-9-0.5％的Collagen XⅦ基因表达均明显上调，上调率分别为97.08％、86.39％、76.15％、72.91％、64.45％、45.42％。说明环肽CHP-9与直链肽HEX-9都能有效促进CollagenⅦ基因的表达，但环肽CHP-9促进CollagenⅦ基因表达的效果不如直链肽HEX-9。

综合图10～14可以看出，基于成纤维细胞，与对照组相比，样品HEX-9在0.5％和1％浓度下的CollagenΙ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达均明显上调，说明样品在该浓度下通过上调CollagenΙ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因的表达，发挥抗皱功效。

样品CHP-9在2％和3％浓度下的CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达均明显上调，说明样品在该浓度下通过上调CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因的表达，发挥抗皱功效。

样品CHP-9在0.5％和1％浓度下的CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达均明显上调，说明样品在该浓度下通过上调CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因的表达，发挥抗皱功效。

同时还可以看出，环化后CHP-9在CollagenⅢ上有显著性，而原直链HEX-9无相关作用，证明环化是有益的。另外，CHP-9在CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达上具有浓度依赖性，CHP-9在高浓度下促进CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ基因表达效果更强。

实施例5：六肽-9环肽的体外紧致功效测试

本实施例基于成纤维细胞，通过检测Integrinβ4基因表达的变化，评价待测样品的紧致功效。

Integrinα6、Integrinβ4是整合素，是由α(120～185kD)和β(90～110kD)两个亚单位形成的异二聚体，α6β4是与半桥粒蛋白相联系的一种基底细胞特异性整合素，α6β4将基底细胞与其下方的基底膜带连接起来。因此，可以通过给药后检测成纤维细胞Integrinβ4基因表达的变化，评估待测样品的紧致功效。

本次测试所用模型为3D表皮皮肤模型

成纤维细胞，由广东博溪生物科技有限公司提供。

主要试剂：EpiGrowth培养液(博溪生物)、WY14643(Sigma)、FLG抗体(Abcam)、SLS(Sigma)DMEM培养液(Gibco)。主要设备：CO₂培养箱(Thermo，150I)、超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-1F)、酶标仪(BioTek，Epoch)、荧光显微镜(Leica，DM2500)。

测试方法：

1)细胞接种：按2.2×10⁵个/孔的接种密度接种成纤维细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

2)配液：根据测试分组(表7)分别配制受试物工作液。

表7、测试分组方案

3)给药：根据测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

4)收集细胞：培养24h后，收集细胞上清，1mL/孔PBS清洗两次，每孔加入1mLRNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。

5)基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。

6)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。

测试结果如图15所示，基于成纤维细胞，与BC相比，样品CHP-9在1％浓度下，对基因Integrinβ4的表达有显著上调作用；样品HEX-9在1％浓度下，对基因Integrinβ4的表达无明显上调作用。与1％的样品HEX-9相比，样品CHP-9在1％浓度下，对基因Integrinβ4的表达有显著上调作用。

可见，环化后费CHP-9具有明显促进基因Integrinβ4表达的作用，而原直链HEX-9则无相应作用，证明环化是有益的。

实施例6：六肽-9环肽的体外渗透能力测试

目前，多肽的功效测试数据大都来自于体外细胞或离体皮肤实验，忽视了多肽透皮效率的问题。多肽一般都是水溶性的，和所有水溶性的分子一样，水溶性多肽透皮能力较为一般，效率并不高，测试显示，透皮量通常低于1％。因此，化妆品在应用水溶性多肽时，要想得到较好的实际效果，必须高剂量添加，成本高，且因为水溶性多肽透皮量少，皮肤清洁或出汗都会造成其流失，因此抗皱作用的时间并不持久。测试显示，视皮肤类型，通常维持4-6小时后，抗皱效果会逐步衰退。在这一方面，增加透皮能力是可以发展的方向。

本实施例基于Franzcell扩散池分析含有游离氨基的多肽在体外的透皮吸收作用，以人工膜为研究模型，采用定量检测方法检测接收液中目标物含量以计算累积渗透量、渗透速率、扩散百分比，进行待测样品的透皮吸收作用定量，分析含有游离氨基的多肽体外透皮吸收作用。

本测试基于人工膜体系，通过高效液相法测定不同时间点接收液中样品的浓度，评价样品的皮肤渗透行为。

测试体系：人工膜；材料和设备：TK-12D型药物透皮吸收Franz扩散池(扩散池工作示意图见图16)，恒温磁力搅拌器。实验方案见表8。

表8、体外渗透能力测试方案

操作过程：

(1)首先将人工膜固定于Franz扩散池的供给室和接收室之间，皮肤角质层面向供给室，真皮层一侧朝向接收室；

(2)向接收室中加入接收液7.0mL，将人工膜绷紧固定好后，通过取样器向接收室中添加1.0mL接收液(PBS)，排净空气，使皮肤真皮层面与接收液紧密接触；

(3)向供给室中人工膜表面加入样品，有效渗透面积S约为1.77cm2。将样品添加至人工膜表面，将样品自人工膜中心部位辐射状向边缘均匀涂开。每种样品3个重复与平行(三个重复采用独立供体特定部位的皮肤)；

(4)渗透：开启电磁搅拌器以300rpm的速度搅拌，保持(32±1)℃恒温水浴，并确保水浴夹层无气泡；

(5)分别取1、2h、4h、8h、24h时间点的样液，采用取样器通过取样管抽取接收液2.0mL，然后将其置于2mL EP管中，另外每次取样后均补加等量的接收液。

①累积渗透量Q计算公式如下：Q＝[Cn×V+∑Ci×V0]/S(i＝1···n-1)，注：Q：累积渗透量；S：有效扩散面积；V：接收室中接收液体积；V0：每次取样的体积；Ci：第1次至上次取样时接收液中药物浓度；Cn：第n个取样点测得的样品浓度；②扩散百分率P＝Pt/Po*100％，注：Pt接收池中样品含量，Po为释放池中样品的理论含量。检测结果见表9。

表9、样品不同时间的透皮渗透率测试结果

由表9可以看出，环化后CHP-9在24h后渗透效果是原直链HEX-9的3.11倍，证明环化是有益的，可达到增强透皮吸收效果。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了说明，后续还将进行工艺、配方及应用方面的进一步研究，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种六肽-9环肽，其特征在于，具有如式(1)所示的结构式：

2.如权利要求1所述的六肽-9环肽用于制备促进皮肤紧致的制剂的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述六肽-9环肽通过促进Integrinβ4基因表达来促进皮肤紧致。

4.如权利要求1所述的六肽-9环肽用于制备促进Integrinβ4基因表达的制剂的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述六肽-9环肽的用量为0.01％～20.0％。

6.如权利要求1所述的六肽-9环肽用于制备促进CollagenⅢ表达的制剂的用途。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述六肽-9环肽的用量为0.01％～20.0％。

8.如权利要求1所述的六肽-9环肽用于制备具有低细胞毒性、高皮肤渗透率的护肤制剂的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的护肤制剂为促进皮肤紧致的制剂，或促进皮肤抗皱的制剂。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述六肽-9环肽通过促进CollagenΙ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、CollagenⅦ、Collagen XⅦ中的任意一种或多种的表达来促进皮肤抗皱。