JPH06336496A - 環状ヘキサペプチド及びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法 - Google Patents
環状ヘキサペプチド及びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法Info
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- JPH06336496A JPH06336496A JP5126434A JP12643493A JPH06336496A JP H06336496 A JPH06336496 A JP H06336496A JP 5126434 A JP5126434 A JP 5126434A JP 12643493 A JP12643493 A JP 12643493A JP H06336496 A JPH06336496 A JP H06336496A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】αアミノ基はＦｍｏｃ基で保護され、βカルボ
キシル基はＢｚｌ基で保護されたＡｓｐを、そのＡｓｐ
のαカルボキシル基を介して樹脂に結合させてアスパラ
ギン酸結合樹脂とし、ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えて
Ｆｍｏｃ基を外したのち、順次、Fmoc-Ser(tBu)-ODhb
t、Fmoc-Asp-OtBu／Bop、Fmoc-Ala-OPfp、Fmoc-Lys(Bo
c)-OPfp及びFmoc-Gly-OPfpを加えてペプチ鎖の伸長さ
せ、アルカリ液を加えてＣ末端アスパラギン酸のＢｚｌ
基を外し、ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えてＮ末端アミ
ノ酸のＦｍｏｃ基を外し、縮合剤を加えてＮ末端アミノ
基とＣ末端カルボキシル基とを縮合させ、酸を加えてペ
プチドを樹脂から切り離すとともに、ペプチド側鎖の保
護基を外し、液相から回収する。 【効果】cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) は新規
ペプチドである。また配列中に、アスパラギン酸やグル
タミン酸のような一分子内に２個のカルボキシル基含有
アミノ酸をもつ環状ペプチドが、温和な条件で、短時間
に製造できる。
キシル基はＢｚｌ基で保護されたＡｓｐを、そのＡｓｐ
のαカルボキシル基を介して樹脂に結合させてアスパラ
ギン酸結合樹脂とし、ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えて
Ｆｍｏｃ基を外したのち、順次、Fmoc-Ser(tBu)-ODhb
t、Fmoc-Asp-OtBu／Bop、Fmoc-Ala-OPfp、Fmoc-Lys(Bo
c)-OPfp及びFmoc-Gly-OPfpを加えてペプチ鎖の伸長さ
せ、アルカリ液を加えてＣ末端アスパラギン酸のＢｚｌ
基を外し、ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えてＮ末端アミ
ノ酸のＦｍｏｃ基を外し、縮合剤を加えてＮ末端アミノ
基とＣ末端カルボキシル基とを縮合させ、酸を加えてペ
プチドを樹脂から切り離すとともに、ペプチド側鎖の保
護基を外し、液相から回収する。 【効果】cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) は新規
ペプチドである。また配列中に、アスパラギン酸やグル
タミン酸のような一分子内に２個のカルボキシル基含有
アミノ酸をもつ環状ペプチドが、温和な条件で、短時間
に製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、環状ヘキサペプチド及
びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法に関す
る。
びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】各種アレルギー疾患の予防及び治療のた
めのペプチド類がいくつか提案されている。例えば、特
開平３−２９１２９９号公報に開示されたペプチドは、
H-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH で表されるペプチド
で、IgE抗体のFc領域の部分ペプチドに類似する、アミ
ノ酸残基６個からなるヘキサペプチドである。
めのペプチド類がいくつか提案されている。例えば、特
開平３−２９１２９９号公報に開示されたペプチドは、
H-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH で表されるペプチド
で、IgE抗体のFc領域の部分ペプチドに類似する、アミ
ノ酸残基６個からなるヘキサペプチドである。
【０００３】一方、環状ペプチドの従来の一般的な製造
方法は、目的とする環状ペプチドに対応する鎖状ペプチ
ドを液相又は固相で先ず合成し、その後これを液相で縮
合・環化させる方法である。この方法は縮合・環化させ
る際、分子間の縮合反応による二量体、三量体等の副生
を防ぎ、分子内の縮合反応を促進するため、反応は高度
な希釈条件下で行う必要がある（矢島治明監修、続医薬
品の開発、第14巻、ペプチド合成、廣川書店、p.259-27
8、1991年)。
方法は、目的とする環状ペプチドに対応する鎖状ペプチ
ドを液相又は固相で先ず合成し、その後これを液相で縮
合・環化させる方法である。この方法は縮合・環化させ
る際、分子間の縮合反応による二量体、三量体等の副生
を防ぎ、分子内の縮合反応を促進するため、反応は高度
な希釈条件下で行う必要がある（矢島治明監修、続医薬
品の開発、第14巻、ペプチド合成、廣川書店、p.259-27
8、1991年)。
【０００４】上記の環状ペプチドの製造方法とは異な
り、固相で鎖状ペプチドを合成し、引き続き固相でペプ
チドを環化させて環状ペプチドを得る試みもいくつかな
されている。例えば、ペプチド結合のみからなる単環性
の環状ペプチドの合成等〔Sklyarov et al.:Zh. Obshc
h. Khim.,39, 2714(1969))、Isied et al.:J. Am. Che
m.Soc., 104, 2632(1982)、Rovero et al.:Tetrahedro
n. Lett., 32, 2639(1991)、Plave et al.:Int. J. Pep
tide Protein Res., 35, 510(1990)〕である。これらの
例では、アミノ酸のαアミノ基の保護基として、いずれ
もｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル(Boc)基が用いられて
いる。
り、固相で鎖状ペプチドを合成し、引き続き固相でペプ
チドを環化させて環状ペプチドを得る試みもいくつかな
されている。例えば、ペプチド結合のみからなる単環性
の環状ペプチドの合成等〔Sklyarov et al.:Zh. Obshc
h. Khim.,39, 2714(1969))、Isied et al.:J. Am. Che
m.Soc., 104, 2632(1982)、Rovero et al.:Tetrahedro
n. Lett., 32, 2639(1991)、Plave et al.:Int. J. Pep
tide Protein Res., 35, 510(1990)〕である。これらの
例では、アミノ酸のαアミノ基の保護基として、いずれ
もｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル(Boc)基が用いられて
いる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、特開平３−２
９１２９９号公報に開示されたヘキサペプチド（H-Ala-
Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH）は、生体内で例えばアミノペ
プチダーゼＭのような酵素により分解されやすく、ま
た、潮解性を有するため保存安定性に問題がある。
９１２９９号公報に開示されたヘキサペプチド（H-Ala-
Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH）は、生体内で例えばアミノペ
プチダーゼＭのような酵素により分解されやすく、ま
た、潮解性を有するため保存安定性に問題がある。
【０００６】また、鎖状ペプチドを液相又は固相で合成
し、その後これを液相で縮合・環化させる環状ペプチド
の製造方法では、高度な希釈条件下（通常、ｍｍｏｌ／
ｌのレベル）で反応させねばならないので、反応に長時
間を要するうえ、最適な希釈条件設定のための予備検討
が必要である。
し、その後これを液相で縮合・環化させる環状ペプチド
の製造方法では、高度な希釈条件下（通常、ｍｍｏｌ／
ｌのレベル）で反応させねばならないので、反応に長時
間を要するうえ、最適な希釈条件設定のための予備検討
が必要である。
【０００７】また、アミノ酸のαアミノ基の保護基とし
てＢｏｃ基を用い、固相で鎖状ペプチドを合成したの
ち、引き続き固相でペプチドを縮合させ環状ペプチドを
製造する方法では、反応条件が比較的過酷なため副反応
が起こりやすく（例えば、配列中にＡｓｐを含有するペ
プチドの合成では転位反応が生じやすい。）、純度の高
い目的物を収率よく得ることは難しい。
てＢｏｃ基を用い、固相で鎖状ペプチドを合成したの
ち、引き続き固相でペプチドを縮合させ環状ペプチドを
製造する方法では、反応条件が比較的過酷なため副反応
が起こりやすく（例えば、配列中にＡｓｐを含有するペ
プチドの合成では転位反応が生じやすい。）、純度の高
い目的物を収率よく得ることは難しい。
【０００８】本発明は、抗アレルギー作用等の薬理活性
をそのまま保持し、かつ保存安定性に優れ、生体内で酵
素分解を受けにくい環状ヘキサペプチドを提供し、また
環状ヘキサペプチドをはじめとする種々の環状ペプチド
を、高度な希釈を要せず、温和な条件下、短時間に、製
造する方法を提供するものである。
をそのまま保持し、かつ保存安定性に優れ、生体内で酵
素分解を受けにくい環状ヘキサペプチドを提供し、また
環状ヘキサペプチドをはじめとする種々の環状ペプチド
を、高度な希釈を要せず、温和な条件下、短時間に、製
造する方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らはヘキサペプ
チド（H-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH）の種々の化学類
縁体を合成し、それらの理化学的性状を検討した結果、
上記ヘキサペプチド配列中のα−アスパラギン酸の一又
は二をβ−アスパラギン酸に置換すると、ペプチドの化
学的及び生化学的安定性が高まること、またそれを環状
化して環状ペプチドとすると安定性が更に高まることを
見出した。
チド（H-Ala-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-OH）の種々の化学類
縁体を合成し、それらの理化学的性状を検討した結果、
上記ヘキサペプチド配列中のα−アスパラギン酸の一又
は二をβ−アスパラギン酸に置換すると、ペプチドの化
学的及び生化学的安定性が高まること、またそれを環状
化して環状ペプチドとすると安定性が更に高まることを
見出した。
【００１０】また、本発明者らは、環状ペプチドの製造
方法を種々検討したところ、アスパラギン酸やグルタミ
ン酸等のような一分子に２個のカルボキシル基を有する
二カルボン酸含有アミノ酸の、側鎖又は主鎖のどちらか
一方のカルボキシル基をベンジル（Ｂｚｌ）基で保護
し、他方のカルボキシル基はそれを介して樹脂に結合さ
せ、かつそのアミノ酸のアミノ基は９−フルオレニルメ
トキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護した二カルボン
酸含有アミノ酸結合樹脂を用い、これを出発物質とし
て、目的の環状ペプチドのアミノ酸配列に従ってアミノ
酸をＦｍｏｃ法で順次伸長させて樹脂に結合された鎖状
ペプチドを合成し、引き続いて樹脂上で、出発物質に用
いた二カルボン酸含有アミノ酸の保護基のＢｚｌ基のみ
を選択的に外したのち、その遊離のカルボキシル基を活
性点として、ペプチドのＮ末端アミノ基と縮合・環化さ
せ、酸で処理して樹脂からペプチドを外すと、容易に環
状ペプチドを製造できることを見出し、本発明を完成し
た。
方法を種々検討したところ、アスパラギン酸やグルタミ
ン酸等のような一分子に２個のカルボキシル基を有する
二カルボン酸含有アミノ酸の、側鎖又は主鎖のどちらか
一方のカルボキシル基をベンジル（Ｂｚｌ）基で保護
し、他方のカルボキシル基はそれを介して樹脂に結合さ
せ、かつそのアミノ酸のアミノ基は９−フルオレニルメ
トキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護した二カルボン
酸含有アミノ酸結合樹脂を用い、これを出発物質とし
て、目的の環状ペプチドのアミノ酸配列に従ってアミノ
酸をＦｍｏｃ法で順次伸長させて樹脂に結合された鎖状
ペプチドを合成し、引き続いて樹脂上で、出発物質に用
いた二カルボン酸含有アミノ酸の保護基のＢｚｌ基のみ
を選択的に外したのち、その遊離のカルボキシル基を活
性点として、ペプチドのＮ末端アミノ基と縮合・環化さ
せ、酸で処理して樹脂からペプチドを外すと、容易に環
状ペプチドを製造できることを見出し、本発明を完成し
た。
【００１１】すなわち、本発明は、下記の（１）〜
（３）に関するものである。 （１）式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチド。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ）
（３）に関するものである。 （１）式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチド。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ）
【００１２】（２）次の（ａ）〜（ｇ）を、順に行うこ
とを特徴とする、式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチ
ドの製造方法。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ） （ａ）αアミノ基は９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル（Fmoc）基で保護され、βカルボキシル基はベンジル
（Bzl）基で保護されたアスパラギン酸（Asp）を、αカ
ルボキシル基を介して樹脂に結合させて、Asp結合樹脂
とし、これに、（ｂ）有機塩基を加え、Ｆｍｏｃ基を外
し、（ｃ）次の〜を、の順、又は
の順で行い、 Fmoc-Ser(tBu)-ODhbtを加え反応させる； Fmoc-Asp-OtBu及びベンゾトリアゾール−１−イルオ
キシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフル
オロホスホナート（Ｂｏｐ）を加え反応させ； Fmoc-Ala-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Lys(Boc)-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Gly-OPfpを加え反応させる； （ｄ）次のイ）及びロ）を任意の順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中のＡ
ｓｐのＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｅ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチド中のＮ
末端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有ア
ミノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｆ）酸
を加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側
鎖の保護基を外し、（ｇ）液相から回収する。
とを特徴とする、式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチ
ドの製造方法。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ） （ａ）αアミノ基は９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル（Fmoc）基で保護され、βカルボキシル基はベンジル
（Bzl）基で保護されたアスパラギン酸（Asp）を、αカ
ルボキシル基を介して樹脂に結合させて、Asp結合樹脂
とし、これに、（ｂ）有機塩基を加え、Ｆｍｏｃ基を外
し、（ｃ）次の〜を、の順、又は
の順で行い、 Fmoc-Ser(tBu)-ODhbtを加え反応させる； Fmoc-Asp-OtBu及びベンゾトリアゾール−１−イルオ
キシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフル
オロホスホナート（Ｂｏｐ）を加え反応させ； Fmoc-Ala-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Lys(Boc)-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Gly-OPfpを加え反応させる； （ｄ）次のイ）及びロ）を任意の順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中のＡ
ｓｐのＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｅ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチド中のＮ
末端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有ア
ミノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｆ）酸
を加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側
鎖の保護基を外し、（ｇ）液相から回収する。
【００１３】（３）次の（ａ）〜（ｈ）を、順に行うこ
とを特徴とする、分子内に二カルボン酸含有アミノ酸を
含む環状ペプチドの製造方法。 （ａ）２個のカルボキシル基を有する第１のアミノ酸で
あって、そのαアミノ基は９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護され、２個のカルボキシ
ル基のうち一方のカルボキシル基はベンジル(Ｂｚｌ)基
で保護され、他方のカルボキシル基は樹脂との結合の反
応基として使われる二カルボン酸含有アミノ酸を、樹脂
と反応させて、二カルボン酸含有アミノ酸（第１）結合
樹脂とし、これに、（ｂ）有機塩基を加え、Ｆｍｏｃ基
を外し、（ｃ）側鎖の官能基はＢｚｌ基以外の保護基で
保護され、かつαアミノ基はＦｍｏｃ基で保護された第
２のアミノ酸（その活性エステルを含む）を加え、二カ
ルボン酸含有アミノ酸（第１）のαアミノ基と反応さ
せ、（ｄ）上記（ｂ）及び（ｃ）と同じ操作を繰り返し
て、目的の環状ペプチドのアミノ酸配列に従い、順次、
第３、第４、……、第ｎアミノ酸を縮合させて、樹脂に
結合しかつ目的のアミノ酸配列をもった鎖状のペプチド
とし、（ｅ）次のイ）及びロ）を任意の順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中の二
カルボン酸含有アミノ酸のＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｆ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチドのＮ末
端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有アミ
ノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｇ）酸を
加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側鎖
の保護基を外し、（ｈ）液相から回収する。
とを特徴とする、分子内に二カルボン酸含有アミノ酸を
含む環状ペプチドの製造方法。 （ａ）２個のカルボキシル基を有する第１のアミノ酸で
あって、そのαアミノ基は９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護され、２個のカルボキシ
ル基のうち一方のカルボキシル基はベンジル(Ｂｚｌ)基
で保護され、他方のカルボキシル基は樹脂との結合の反
応基として使われる二カルボン酸含有アミノ酸を、樹脂
と反応させて、二カルボン酸含有アミノ酸（第１）結合
樹脂とし、これに、（ｂ）有機塩基を加え、Ｆｍｏｃ基
を外し、（ｃ）側鎖の官能基はＢｚｌ基以外の保護基で
保護され、かつαアミノ基はＦｍｏｃ基で保護された第
２のアミノ酸（その活性エステルを含む）を加え、二カ
ルボン酸含有アミノ酸（第１）のαアミノ基と反応さ
せ、（ｄ）上記（ｂ）及び（ｃ）と同じ操作を繰り返し
て、目的の環状ペプチドのアミノ酸配列に従い、順次、
第３、第４、……、第ｎアミノ酸を縮合させて、樹脂に
結合しかつ目的のアミノ酸配列をもった鎖状のペプチド
とし、（ｅ）次のイ）及びロ）を任意の順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中の二
カルボン酸含有アミノ酸のＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｆ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチドのＮ末
端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有アミ
ノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｇ）酸を
加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側鎖
の保護基を外し、（ｈ）液相から回収する。
【００１４】なお、本明細書中で用いた略号は以下の意
味を示す。 Ａｌａ：アラニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 βＡｓｐ：βアスパラギン酸 Ｇｌｙ：グリシン Ｌｙｓ：リジン Ｓｅｒ：セリン Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル Ｂｚｌ：ベンジル Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル Ｐｆｐ：ペンタフルオロフェニル Ｄｈｂｔ：３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３
−ベンゾトリアジン−３−イル ＨＯＢｔ：１ーヒドロキシベンゾトリアゾール Ｂｏｐ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスホ
ナート ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ＤＰＰＡ：ジフェニルホスホリルアジド ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
味を示す。 Ａｌａ：アラニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 βＡｓｐ：βアスパラギン酸 Ｇｌｙ：グリシン Ｌｙｓ：リジン Ｓｅｒ：セリン Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル Ｂｚｌ：ベンジル Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル Ｐｆｐ：ペンタフルオロフェニル Ｄｈｂｔ：３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３
−ベンゾトリアジン−３−イル ＨＯＢｔ：１ーヒドロキシベンゾトリアゾール Ｂｏｐ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスホ
ナート ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ＤＰＰＡ：ジフェニルホスホリルアジド ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
【００１５】ペプチドは慣用の表し方に従い、Ｎ末端を
左側に、Ｃ末端を右側に示している。また、アミノ酸又
はペプチド中のアミノ酸残基は、グリシンを除き特に明
記しない限りＬ体である。ただし、本発明では、原料の
アミノ酸はＬ体、Ｄ体又はＤＬ体を問わず、いずれも使
用できる。使用した原料のアミノ酸の立体構造に依存し
て、そのアミノ酸を含む環状ペプチドが得られる。
左側に、Ｃ末端を右側に示している。また、アミノ酸又
はペプチド中のアミノ酸残基は、グリシンを除き特に明
記しない限りＬ体である。ただし、本発明では、原料の
アミノ酸はＬ体、Ｄ体又はＤＬ体を問わず、いずれも使
用できる。使用した原料のアミノ酸の立体構造に依存し
て、そのアミノ酸を含む環状ペプチドが得られる。
【００１６】本発明の環状ペプチドの製造方法によって
製造できる環状ペプチドは、通常、環内にアスパラギン
酸やグルタミン酸等のいわゆる「酸性アミノ酸」を一又
は二以上含む環状ペプチドであるが、一分子中に２個の
カルボキシル基を有するアミノ酸であれば非天然アミノ
酸であっても、それを含むペプチドは同様に製造でき
る。
製造できる環状ペプチドは、通常、環内にアスパラギン
酸やグルタミン酸等のいわゆる「酸性アミノ酸」を一又
は二以上含む環状ペプチドであるが、一分子中に２個の
カルボキシル基を有するアミノ酸であれば非天然アミノ
酸であっても、それを含むペプチドは同様に製造でき
る。
【００１７】本発明における、「２個のカルボキシル基
を有するアミノ酸」は、上記のように天然のアミノ酸で
はアスパラギン酸やグルタミン酸等のいわゆる酸性アミ
ノ酸が代表的なものであるが、一分子中に２個のカルボ
キシル基を有するアミノ酸であれば、アスパラギン酸又
はグルタミン酸に限ることなく非天然のアミノ酸であっ
てもよい。
を有するアミノ酸」は、上記のように天然のアミノ酸で
はアスパラギン酸やグルタミン酸等のいわゆる酸性アミ
ノ酸が代表的なものであるが、一分子中に２個のカルボ
キシル基を有するアミノ酸であれば、アスパラギン酸又
はグルタミン酸に限ることなく非天然のアミノ酸であっ
てもよい。
【００１８】環内にアスパラギン酸やグルタミン酸等の
「２個のカルボキシル基を有するアミノ酸」を一個含む
環状ペプチドを製造する場合は、そのアミノ酸のアミノ
基をＦｍｏｃ基で保護し、一方のカルボキシル基をＢｚ
ｌ基で保護し、他方のカルボキシル基を使って樹脂と結
合させ、このアミノ酸をペプチド（環状ペプチドに対応
する鎖状ペプチド）のＣ端１番目のアミノ酸として、目
的のアミノ酸配列に従い、順次、Ｎ端に向かってそれぞ
れのアミノ酸を縮合・伸長させていけばよい。
「２個のカルボキシル基を有するアミノ酸」を一個含む
環状ペプチドを製造する場合は、そのアミノ酸のアミノ
基をＦｍｏｃ基で保護し、一方のカルボキシル基をＢｚ
ｌ基で保護し、他方のカルボキシル基を使って樹脂と結
合させ、このアミノ酸をペプチド（環状ペプチドに対応
する鎖状ペプチド）のＣ端１番目のアミノ酸として、目
的のアミノ酸配列に従い、順次、Ｎ端に向かってそれぞ
れのアミノ酸を縮合・伸長させていけばよい。
【００１９】環内にアスパラギン酸やグルタミン酸等の
「２個のカルボキシル基を有するアミノ酸」をｎ個含む
環状ペプチドを製造する場合は、ｎ個の「２個のカルボ
キシル基を有するアミノ酸」のうち、どのアミノ酸を初
めに樹脂に結合させるかにより、アミノ酸を縮合・伸長
させる方法はｎ通りある。どの方法を採っても最終的に
得られる環状ペプチドは同じである。
「２個のカルボキシル基を有するアミノ酸」をｎ個含む
環状ペプチドを製造する場合は、ｎ個の「２個のカルボ
キシル基を有するアミノ酸」のうち、どのアミノ酸を初
めに樹脂に結合させるかにより、アミノ酸を縮合・伸長
させる方法はｎ通りある。どの方法を採っても最終的に
得られる環状ペプチドは同じである。
【００２０】本発明で用いる樹脂としては、Ｎｌｅハン
ドル樹脂、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノ
キシ酢酸樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹
脂、臭素化Ｗａｎｇ樹脂、ポリアクリルアミド樹脂等の
Ｆｍｏｃ法で使用できる樹脂を用いることができる。こ
れらは遊離ペプチド合成用又は側鎖保護基保存型ペプチ
ド合成用のいずれでもよい。また、本発明で用いる樹脂
は、目的とするペプチドのアミノ酸配列により、予めア
ミノ酸又はペプチドを結合させた樹脂であってもよい。
このようなアミノ酸又はペプチド結合樹脂を用いれば、
最終的に得られるペプチドはσ形をした一部鎖状の環状
ペプチドである。
ドル樹脂、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノ
キシ酢酸樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹
脂、臭素化Ｗａｎｇ樹脂、ポリアクリルアミド樹脂等の
Ｆｍｏｃ法で使用できる樹脂を用いることができる。こ
れらは遊離ペプチド合成用又は側鎖保護基保存型ペプチ
ド合成用のいずれでもよい。また、本発明で用いる樹脂
は、目的とするペプチドのアミノ酸配列により、予めア
ミノ酸又はペプチドを結合させた樹脂であってもよい。
このようなアミノ酸又はペプチド結合樹脂を用いれば、
最終的に得られるペプチドはσ形をした一部鎖状の環状
ペプチドである。
【００２１】２個のカルボキシル基を有するアミノ酸で
あって、そのアミノ基はＦｍｏｃ基で保護され、２個の
カルボキシル基のうち一方のカルボキシル基はＢｚｌ基
で保護され、他方のカルボキシル基は樹脂との結合の反
応基として使われる二カルボン酸含有アミノ酸を、樹脂
と結合させて二カルボン酸含有アミノ酸結合樹脂とする
には、次のようにして行うことができる。
あって、そのアミノ基はＦｍｏｃ基で保護され、２個の
カルボキシル基のうち一方のカルボキシル基はＢｚｌ基
で保護され、他方のカルボキシル基は樹脂との結合の反
応基として使われる二カルボン酸含有アミノ酸を、樹脂
と結合させて二カルボン酸含有アミノ酸結合樹脂とする
には、次のようにして行うことができる。
【００２２】２個のカルボキシル基を有するアミノ酸が
アスパラギン酸である場合、Fmoc-Asp(OBzl)-OHをジク
ロロメタンに溶解し、これにジシクロヘキシルカルボジ
イミドを加えて室温で数時間反応させ、対称酸無水物を
生成させる。この対称酸無水物をＤＭＦに溶解し、４−
ジメチルアミノピリジンを加えて、PepSyn ＫＨ樹脂
（ミリジェン／バイオサーチ社製）等のポリアクリルア
ミド樹脂と混合する。室温で数時間撹はん後、樹脂をろ
別し、ＤＭＦ、ジクロロメタン等で洗浄し、乾燥する。
アスパラギン酸である場合、Fmoc-Asp(OBzl)-OHをジク
ロロメタンに溶解し、これにジシクロヘキシルカルボジ
イミドを加えて室温で数時間反応させ、対称酸無水物を
生成させる。この対称酸無水物をＤＭＦに溶解し、４−
ジメチルアミノピリジンを加えて、PepSyn ＫＨ樹脂
（ミリジェン／バイオサーチ社製）等のポリアクリルア
ミド樹脂と混合する。室温で数時間撹はん後、樹脂をろ
別し、ＤＭＦ、ジクロロメタン等で洗浄し、乾燥する。
【００２３】２個のカルボキシル基を有するアミノ酸が
グルタミン酸である場合は、Fmoc-Asp(OBzl)-OHの代わ
りにFmoc-Glu(OBzl)-OHを用い、上記と同様に行うこと
ができる。なお、ここで用いるFmoc-Asp(OBzl)-OHやFmo
c-Glu(OBzl)-OHは、それぞれH-Asp(OBzl)-OHやH-Glu(OB
zl)-OH にＦｍｏｃ化剤(Fmoc-ClやFmoc-スクシンイミド
等）を反応させて得ることができる。Fmoc-Asp(OBzl)-O
Hは市販品も入手できる。
グルタミン酸である場合は、Fmoc-Asp(OBzl)-OHの代わ
りにFmoc-Glu(OBzl)-OHを用い、上記と同様に行うこと
ができる。なお、ここで用いるFmoc-Asp(OBzl)-OHやFmo
c-Glu(OBzl)-OHは、それぞれH-Asp(OBzl)-OHやH-Glu(OB
zl)-OH にＦｍｏｃ化剤(Fmoc-ClやFmoc-スクシンイミド
等）を反応させて得ることができる。Fmoc-Asp(OBzl)-O
Hは市販品も入手できる。
【００２４】アミノ酸の側鎖の官能基（水酸基、カルボ
キシル基、アミノ基等）を保護するＢｚｌ以外の保護基
としては、ｔＢｕ基、Ｂｏｃ基、ラダマンチル基等があ
る。
キシル基、アミノ基等）を保護するＢｚｌ以外の保護基
としては、ｔＢｕ基、Ｂｏｃ基、ラダマンチル基等があ
る。
【００２５】樹脂に結合させたままで、目的のアミノ酸
配列をもったペプチド（目的の環状ペプチドに対応する
鎖状ペプチド）を得るためのペプチド鎖の伸長は、側鎖
の官能基がＢｚｌ基以外の保護基で保護され、アミノ基
はＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸（カルボン酸は遊離
形）又はその活性エステルを、アミノ酸配列に従って選
んで、順次、これを反応させて行う。基本的には、通常
用いられる固相Ｆｍｏｃ法のプロトコールに従えばよ
い。アミノ酸が前者、すなわちカルボン酸遊離形アミノ
酸を用いる場合は、縮合反応を促進するために、Ｎ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジ
フェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、Ｂｏｐ等の縮
合剤を用いる。アミノ酸が後者、すなわち活性エステル
を用いる場合は、それぞれのアミノ酸のペンタフルオロ
フェニル（Ｐｆｐ）エステルや３，４−ジヒドロ−４−
オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル（Ｄ
ｈｂｔ）エステル等を用い、縮合させる。
配列をもったペプチド（目的の環状ペプチドに対応する
鎖状ペプチド）を得るためのペプチド鎖の伸長は、側鎖
の官能基がＢｚｌ基以外の保護基で保護され、アミノ基
はＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸（カルボン酸は遊離
形）又はその活性エステルを、アミノ酸配列に従って選
んで、順次、これを反応させて行う。基本的には、通常
用いられる固相Ｆｍｏｃ法のプロトコールに従えばよ
い。アミノ酸が前者、すなわちカルボン酸遊離形アミノ
酸を用いる場合は、縮合反応を促進するために、Ｎ，
Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジ
フェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、Ｂｏｐ等の縮
合剤を用いる。アミノ酸が後者、すなわち活性エステル
を用いる場合は、それぞれのアミノ酸のペンタフルオロ
フェニル（Ｐｆｐ）エステルや３，４−ジヒドロ−４−
オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル（Ｄ
ｈｂｔ）エステル等を用い、縮合させる。
【００２６】樹脂上に合成されたペプチドから、樹脂に
結合する二カルボン酸含有アミノ酸のＢｚｌ基（保護
基）のみを外すにために用いるアルカリ液は、最終濃度
で０．００１〜０．０３Ｎの水酸化ナトリウム溶液又は
水酸化カリウム溶液がよい。これらの希アルカリ液はＢ
ｚｌ基を外すが、tert-Butyl基等の保護基は外さない。
結合する二カルボン酸含有アミノ酸のＢｚｌ基（保護
基）のみを外すにために用いるアルカリ液は、最終濃度
で０．００１〜０．０３Ｎの水酸化ナトリウム溶液又は
水酸化カリウム溶液がよい。これらの希アルカリ液はＢ
ｚｌ基を外すが、tert-Butyl基等の保護基は外さない。
【００２７】Ｎ末端アミノ酸のＦｍｏｃ基を外すための
有機塩基としては、ピペリジン、ジエチルアミン等があ
り、好ましくはピペリジンである。上記のアルカリ処理
による脱Ｂｚｌ基と有機塩基処理による脱Ｆｍｏｃ基の
順序はどちらが先であってもよい。
有機塩基としては、ピペリジン、ジエチルアミン等があ
り、好ましくはピペリジンである。上記のアルカリ処理
による脱Ｂｚｌ基と有機塩基処理による脱Ｆｍｏｃ基の
順序はどちらが先であってもよい。
【００２８】Ｎ末端アミノ酸のアミノ基と樹脂に結合さ
せた二カルボン酸含有アミノ酸のカルボキシル基を縮合
・環化させる縮合剤としては、Ｂｏｐ、ＤＣＣ、ＤＰＰ
Ａ等があり、これらの中では、収率の良さ、副生ウレア
のない点、反応の早さ等の理由により、Ｂｏｐが好まし
い。
せた二カルボン酸含有アミノ酸のカルボキシル基を縮合
・環化させる縮合剤としては、Ｂｏｐ、ＤＣＣ、ＤＰＰ
Ａ等があり、これらの中では、収率の良さ、副生ウレア
のない点、反応の早さ等の理由により、Ｂｏｐが好まし
い。
【００２９】目的のアミノ酸配列に従いそれぞれのアミ
ノ酸を縮合させたあと（すなわち、ペプチド鎖の伸長反
応のあと）、あるいは有機塩基を加えてＮ末端アミノ基
を保護するＦｍｏｃ基を外したあと、あるいはアルカリ
液を加えて樹脂に結合した二カルボン酸含有アミノ酸の
Ｂｚｌ基を外したあと、あるいは縮合剤を加えてＮ末端
アミノ酸のアミノ基と樹脂に結合する二カルボン酸含有
アミノ酸のカルボキシル基の縮合・環化をさせたあと
は、洗浄液で樹脂を洗浄する。用いる洗浄液としては、
ＤＭＦ、ジクロロメタン等がある。
ノ酸を縮合させたあと（すなわち、ペプチド鎖の伸長反
応のあと）、あるいは有機塩基を加えてＮ末端アミノ基
を保護するＦｍｏｃ基を外したあと、あるいはアルカリ
液を加えて樹脂に結合した二カルボン酸含有アミノ酸の
Ｂｚｌ基を外したあと、あるいは縮合剤を加えてＮ末端
アミノ酸のアミノ基と樹脂に結合する二カルボン酸含有
アミノ酸のカルボキシル基の縮合・環化をさせたあと
は、洗浄液で樹脂を洗浄する。用いる洗浄液としては、
ＤＭＦ、ジクロロメタン等がある。
【００３０】ペプチドを樹脂から切り離すとともに、ペ
プチド側鎖の保護基を外すための酸としては、アニソー
ル、フェノールもしくはチオアニソール等のカチオン捕
捉剤含有のＴＦＡ、トリフルオロメタンスルホン酸含有
のＴＦＡ、トリメチルシリルブロマイド含有のＴＦＡ、
トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸含有の
ＴＦＡ又はそれらを含まないＴＦＡ等がある。
プチド側鎖の保護基を外すための酸としては、アニソー
ル、フェノールもしくはチオアニソール等のカチオン捕
捉剤含有のＴＦＡ、トリフルオロメタンスルホン酸含有
のＴＦＡ、トリメチルシリルブロマイド含有のＴＦＡ、
トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸含有の
ＴＦＡ又はそれらを含まないＴＦＡ等がある。
【００３１】樹脂から切断した後の環状ペプチドの回収
は、慣用の手段、例えば逆相高速液体クロマトグラフィ
ー等により行うことができる。
は、慣用の手段、例えば逆相高速液体クロマトグラフィ
ー等により行うことができる。
【００３２】本発明の環状ヘキサペプチド又は環状ペプ
チドは、その塩も含まれる。塩としては、塩酸塩、臭化
水素塩等の無機塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ−トルエン
スルホン酸塩、トリメタンスルホン酸塩、トリメチルシ
リルトリフルオロメタンスルホン酸塩、トリフルオロメ
タンスルホン酸塩等の有機塩等がある。これらの塩は相
当する酸を製造工程中または最終段階で加えて、調製す
ることができ、またイオン交換樹脂を用い、薬学的に許
容される塩に変換することもできる。薬学的に許容され
る塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、りん酸塩等の無機
塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、乳
酸塩等の有機塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカ
リ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ
土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
チドは、その塩も含まれる。塩としては、塩酸塩、臭化
水素塩等の無機塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ−トルエン
スルホン酸塩、トリメタンスルホン酸塩、トリメチルシ
リルトリフルオロメタンスルホン酸塩、トリフルオロメ
タンスルホン酸塩等の有機塩等がある。これらの塩は相
当する酸を製造工程中または最終段階で加えて、調製す
ることができ、またイオン交換樹脂を用い、薬学的に許
容される塩に変換することもできる。薬学的に許容され
る塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、りん酸塩等の無機
塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、乳
酸塩等の有機塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカ
リ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ
土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００３３】
実施例１ （１）Ａｓｐ結合樹脂の調製 Fmoc-Asp(OBzl)-OH（ミリジェン／バイオサーチ社製）
１．０７ｇ（２．４mmol）をジクロロメタン２６ｍｌに
溶かし、撹拌しながら室温で、ジクロロメタンに溶かし
たＤＣＣ（０．２５ｇ＝１．２ｍｍｏｌ）を摘下した。
１．５時間撹拌後、氷冷し、析出するウレアを濾別し
た。濾液を減圧で濃縮・乾固して得られた酸無水物をＤ
ＭＦに溶解して０．１Ｍ溶液とし、これにPepSyn KH
（ミリジェン／バイオサーチ社製）２．１４ｇ（０．２
ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン２４ｍｇ（０．
２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で約２時間ゆっくり撹拌し
た。反応終了後、樹脂をＤＭＦ、次いでジクロロメタン
で数回洗浄し、デシケーター中で乾燥した。得られたFm
oc-Asp(OBzl)-PepSyn KH 樹脂の置換容量は0.04meq／g
であった。
１．０７ｇ（２．４mmol）をジクロロメタン２６ｍｌに
溶かし、撹拌しながら室温で、ジクロロメタンに溶かし
たＤＣＣ（０．２５ｇ＝１．２ｍｍｏｌ）を摘下した。
１．５時間撹拌後、氷冷し、析出するウレアを濾別し
た。濾液を減圧で濃縮・乾固して得られた酸無水物をＤ
ＭＦに溶解して０．１Ｍ溶液とし、これにPepSyn KH
（ミリジェン／バイオサーチ社製）２．１４ｇ（０．２
ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン２４ｍｇ（０．
２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で約２時間ゆっくり撹拌し
た。反応終了後、樹脂をＤＭＦ、次いでジクロロメタン
で数回洗浄し、デシケーター中で乾燥した。得られたFm
oc-Asp(OBzl)-PepSyn KH 樹脂の置換容量は0.04meq／g
であった。
【００３４】なお、Ａｓｐ結合樹脂の置換容量は、樹脂
中のＦｍｏｃ量により求めた。すなわち、樹脂の一部を
秤りとり、これにピペリジン／ジクロロメタン溶液を流
してＦｍｏｃ基を遊離させ、メタノールで一定容量（１
０ｍｌ）とし、波長３０１ｎｍの吸光度を測定し、次式
により計算した。 Ａｓｐ結合樹脂の置換容量（meq/g）＝（Ａ301nm／７８
００）×（１０／樹脂の秤取量）
中のＦｍｏｃ量により求めた。すなわち、樹脂の一部を
秤りとり、これにピペリジン／ジクロロメタン溶液を流
してＦｍｏｃ基を遊離させ、メタノールで一定容量（１
０ｍｌ）とし、波長３０１ｎｍの吸光度を測定し、次式
により計算した。 Ａｓｐ結合樹脂の置換容量（meq/g）＝（Ａ301nm／７８
００）×（１０／樹脂の秤取量）
【００３５】（２）cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAs
p)の合成 ペプチド合成装置として全自動ペプチドシンセサイザー
9050型（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用い、Ａｓ
ｐ結合樹脂は上記（１）で得たFmoc-Asp(Bzl)-PepSyn K
H(0.04meq／g)２.２ｇを使用した。Ａｓｐ結合樹脂に樹
脂に２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を流し、ＤＭＦで洗
浄後、順次 Fmoc-Ser(tBu)-ODhbt、Fmoc-Asp-OtBu/Bo
p、Fmoc-Ala-OPfp、Fmoc-Lys(Boc)-OPfp及びFmoc-Gly-O
Pfpをそれぞれ0.4mmol 反応させた。なお、それぞれの
アミノ酸/Bop又はその活性エステルによる縮合反応のあ
いだには、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液による脱Ｆｍ
ｏｃ基及びＤＭＦによる洗浄操作がはいっている。ペプ
チド鎖の伸張反応が全て終了した後、樹脂をＤＭＦ次い
でジクロロメタンにより洗浄した。樹脂をデシケーター
中で乾燥し、これをメタノール２０ｍｌに浸し、１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液９５μlを加え、室温で２時間撹は
んした後、ＤＭＦで洗浄した。樹脂に２０％ピペリジン
／ＤＭＦ溶液を流し、ＤＭＦで洗浄後、これをＢｏｐ３
８ｍｇ、ＨＯＢｔ１２ｍｇ及びＮＭＭ１４μｌのＤＭＦ
溶液とともに混合し、室温で３０分間反応させた。
p)の合成 ペプチド合成装置として全自動ペプチドシンセサイザー
9050型（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用い、Ａｓ
ｐ結合樹脂は上記（１）で得たFmoc-Asp(Bzl)-PepSyn K
H(0.04meq／g)２.２ｇを使用した。Ａｓｐ結合樹脂に樹
脂に２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を流し、ＤＭＦで洗
浄後、順次 Fmoc-Ser(tBu)-ODhbt、Fmoc-Asp-OtBu/Bo
p、Fmoc-Ala-OPfp、Fmoc-Lys(Boc)-OPfp及びFmoc-Gly-O
Pfpをそれぞれ0.4mmol 反応させた。なお、それぞれの
アミノ酸/Bop又はその活性エステルによる縮合反応のあ
いだには、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液による脱Ｆｍ
ｏｃ基及びＤＭＦによる洗浄操作がはいっている。ペプ
チド鎖の伸張反応が全て終了した後、樹脂をＤＭＦ次い
でジクロロメタンにより洗浄した。樹脂をデシケーター
中で乾燥し、これをメタノール２０ｍｌに浸し、１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液９５μlを加え、室温で２時間撹は
んした後、ＤＭＦで洗浄した。樹脂に２０％ピペリジン
／ＤＭＦ溶液を流し、ＤＭＦで洗浄後、これをＢｏｐ３
８ｍｇ、ＨＯＢｔ１２ｍｇ及びＮＭＭ１４μｌのＤＭＦ
溶液とともに混合し、室温で３０分間反応させた。
【００３６】反応終了後、樹脂にＴＦＡ／フェノール
（容量比９５／５）溶液を流して、樹脂からペプチドを
脱離するとともに、側鎖の保護基を外した。粗収量３ｍ
ｇで目的の環状ペプチドを得た。得られたペプチドを逆
相高速液体クロマトグラフィー（カラム：マイクロボン
ダスフェアー５μＣ１８−１００Å、径３．９ｍｍ×長
さ１５ｃｍ、ウォーターズ社製）で、リニアグラジェン
ト溶出した〔溶離液Ａ液（０．１％ＴＦＡ／水）とＢ液
（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル〕の９９：１から３
０：７０への３０分リニアグラジェント溶出〕。図１に
そのクロマトグラム（測定波長：２３０ｎｍ）を示す。
保持時間約１０分の主ピークをとり、これを６Ｍ塩酸に
より１５０℃で１時間加水分解し、ＰＩＣＯ−ＴＡＧア
ミノ酸分析機（ウォーターズ社製）でアミノ酸の組成分
析を行った（表１）。結果はアミノ酸配列から予想され
る理論値とおおむね一致した。
（容量比９５／５）溶液を流して、樹脂からペプチドを
脱離するとともに、側鎖の保護基を外した。粗収量３ｍ
ｇで目的の環状ペプチドを得た。得られたペプチドを逆
相高速液体クロマトグラフィー（カラム：マイクロボン
ダスフェアー５μＣ１８−１００Å、径３．９ｍｍ×長
さ１５ｃｍ、ウォーターズ社製）で、リニアグラジェン
ト溶出した〔溶離液Ａ液（０．１％ＴＦＡ／水）とＢ液
（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル〕の９９：１から３
０：７０への３０分リニアグラジェント溶出〕。図１に
そのクロマトグラム（測定波長：２３０ｎｍ）を示す。
保持時間約１０分の主ピークをとり、これを６Ｍ塩酸に
より１５０℃で１時間加水分解し、ＰＩＣＯ−ＴＡＧア
ミノ酸分析機（ウォーターズ社製）でアミノ酸の組成分
析を行った（表１）。結果はアミノ酸配列から予想され
る理論値とおおむね一致した。
【００３７】
【表１】 表１ 環状ペプチドのアミノ酸組成分析 ────────────────────────────── アミノ酸 組成比(カッコ内は理論値) ────────────────────────────── Ａｌａ １．３ （１） Ａｓｐ ２．３ （２） Ｓｅｒ ０．９９ （１） Ｇｌｙ ０．７７ （１） Ｌｙｓ １．０ （１） ──────────────────────────────
【００３８】
【発明の効果】請求項１の環状ヘキサペプチドは、新規
なペプチドで、抗アレルギー作用等の薬理活性を保持
し、保存安定性に優れ、生体内で酵素分解を受けにく
い。請求項２の環状ヘキサペプチドの製造方法により、
請求項１の環状ヘキサペプチドを製造できる。請求項３
の環状ペプチドの製造方法により、アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のような一分子内に２個のカルボキシル基を
含有するアミノ酸を配列中に有する環状ペプチドを、温
和な条件で、短時間に製造できる。
なペプチドで、抗アレルギー作用等の薬理活性を保持
し、保存安定性に優れ、生体内で酵素分解を受けにく
い。請求項２の環状ヘキサペプチドの製造方法により、
請求項１の環状ヘキサペプチドを製造できる。請求項３
の環状ペプチドの製造方法により、アスパラギン酸やグ
ルタミン酸のような一分子内に２個のカルボキシル基を
含有するアミノ酸を配列中に有する環状ペプチドを、温
和な条件で、短時間に製造できる。
【００３９】
配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：βAsp 存在位置：２，４
【図１】cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp)の粗精製
物の逆相高速液体クロマトグラムである。
物の逆相高速液体クロマトグラムである。
Claims (3)
- 【請求項１】式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチド。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ）
- 【請求項２】（ａ）αアミノ基は９−フルオレニルメト
キシカルボニル（Fmoc）基で保護され、βカルボキシル
基はベンジル（Bzl）基で保護されたアスパラギン酸（A
sp）を、αカルボキシル基を介して樹脂に結合させて、
Asp結合樹脂とし、これに、（ｂ）有機塩基を加え、Ｆ
ｍｏｃ基を外し、（ｃ）次の〜を、の
順、又はの順で行い、 Fmoc-Ser(tBu)-ODhbtを加え反応させる； Fmoc-Asp-OtBu及びベンゾトリアゾール−１−イルオ
キシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフル
オロホスホナート（Ｂｏｐ）を加え反応させ； Fmoc-Ala-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Lys(Boc)-OPfpを加え反応させる； Fmoc-Gly-OPfpを加え反応させる； （ｄ）次のイ）及びロ）を任意の順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中のＡ
ｓｐのＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｅ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチド中のＮ
末端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有ア
ミノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｆ）酸
を加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側
鎖の保護基を外し、（ｇ）液相から回収する、ことを特
徴とする、式（Ｉ）で表される環状ヘキサペプチドの製
造方法。 cyclo(Gly-Lys-Ala-βAsp-Ser-βAsp) （Ｉ） - 【請求項３】（ａ）２個のカルボキシル基を有する第１
のアミノ酸であって、そのαアミノ基は９−フルオレニ
ルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護され、２個
のカルボキシル基のうち一方のカルボキシル基はベンジ
ル(Ｂｚｌ)基で保護され、他方のカルボキシル基は樹脂
との結合の反応基として使われる二カルボン酸含有アミ
ノ酸を、樹脂と反応させて、二カルボン酸含有アミノ酸
（第１）結合樹脂とし、これに、（ｂ）有機塩基を加
え、Ｆｍｏｃ基を外し、（ｃ）側鎖の官能基はＢｚｌ基
以外の保護基で保護され、かつαアミノ基はＦｍｏｃ基
で保護された第２のアミノ酸（その活性エステルを含
む）を加え、二カルボン酸含有アミノ酸（第１）のαア
ミノ基と反応させ、（ｄ）上記（ｂ）及び（ｃ）と同じ
操作を繰り返して、目的の環状ペプチドのアミノ酸配列
に従い、順次、第３、第４、……、第ｎアミノ酸を縮合
させて、樹脂に結合しかつ目的のアミノ酸配列をもった
鎖状のペプチドとし、（ｅ）次のイ）及びロ）を任意の
順序で行い、 イ）アルカリ液を加え、樹脂に結合したペプチド中の二
カルボン酸含有アミノ酸のＢｚｌ基を外す； ロ）有機塩基を加え、樹脂に結合したペプチド中のＮ末
端アミノ酸のFmoc基を外す； （ｆ）縮合剤を加えて、樹脂に結合したペプチドのＮ末
端アミノ基と、そのペプチド中の二カルボン酸含有アミ
ノ酸のカルボキシル基とを縮合・環化させ、（ｇ）酸を
加え、ペプチドを樹脂から外すとともに、ペプチド側鎖
の保護基を外し、（ｈ）液相から回収する、ことを特徴
とする、分子内に二カルボン酸含有アミノ酸を含む環状
ペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5126434A JPH06336496A (ja) | 1993-05-28 | 1993-05-28 | 環状ヘキサペプチド及びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5126434A JPH06336496A (ja) | 1993-05-28 | 1993-05-28 | 環状ヘキサペプチド及びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06336496A true JPH06336496A (ja) | 1994-12-06 |
Family
ID=14935105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5126434A Pending JPH06336496A (ja) | 1993-05-28 | 1993-05-28 | 環状ヘキサペプチド及びその製造方法、並びに環状ペプチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06336496A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000055182A1 (fr) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Sankyo Company, Limited | Methode de synthese d'un peptide |
| JP2014217322A (ja) * | 2013-05-08 | 2014-11-20 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | 固相レジンを用いた環状ペプチド化合物の製造方法 |
| CN107602669A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-19 | 中国工程物理研究院核物理与化学研究所 | 均环肽Cyclo‑(Ala)4的制备方法 |
| CN116284256A (zh) * | 2022-01-25 | 2023-06-23 | 上海中翊日化有限公司 | 一种六肽-9环肽及其应用 |
-
1993
- 1993-05-28 JP JP5126434A patent/JPH06336496A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000055182A1 (fr) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Sankyo Company, Limited | Methode de synthese d'un peptide |
| JP2014217322A (ja) * | 2013-05-08 | 2014-11-20 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | 固相レジンを用いた環状ペプチド化合物の製造方法 |
| CN107602669A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-19 | 中国工程物理研究院核物理与化学研究所 | 均环肽Cyclo‑(Ala)4的制备方法 |
| CN116284256A (zh) * | 2022-01-25 | 2023-06-23 | 上海中翊日化有限公司 | 一种六肽-9环肽及其应用 |
| CN116284256B (zh) * | 2022-01-25 | 2024-02-06 | 上海中翊日化有限公司 | 一种六肽-9环肽及其应用 |
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