JPH06234793A - サケカルシトニンの調製方法 - Google Patents
サケカルシトニンの調製方法Info
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- JPH06234793A JPH06234793A JP5310857A JP31085793A JPH06234793A JP H06234793 A JPH06234793 A JP H06234793A JP 5310857 A JP5310857 A JP 5310857A JP 31085793 A JP31085793 A JP 31085793A JP H06234793 A JPH06234793 A JP H06234793A
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- resin
- salmon calcitonin
- tbu
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 脱保護条件を緩和し、精製過程を単純にし
て、収率コストを低減させることのできるサケカルシト
ニンの調整方法を提供する＞ 【構成】 樹脂上で簡便に保護および固定したサケカル
シトニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサペ
プチドであるフラグメント１を、２システイン間に予め
形成したジスルフィドを用いて簡便に保護したサケカル
シトニン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドで
あるフラグメント２で凝縮し、完全なペプチド骨格であ
るフラグメント６を酸を用いて完全に脱保護したペプチ
ドを樹脂から遊離させる。
て、収率コストを低減させることのできるサケカルシト
ニンの調整方法を提供する＞ 【構成】 樹脂上で簡便に保護および固定したサケカル
シトニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサペ
プチドであるフラグメント１を、２システイン間に予め
形成したジスルフィドを用いて簡便に保護したサケカル
シトニン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドで
あるフラグメント２で凝縮し、完全なペプチド骨格であ
るフラグメント６を酸を用いて完全に脱保護したペプチ
ドを樹脂から遊離させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サケカルシトニンおよ
び酸付加によって生成される薬学的に許容できるすべて
の塩またはその錯体に関する。さらに、本発明は、本発
明によるサケカルシトニンの合成に有用な中間体の調製
方法に関する。
び酸付加によって生成される薬学的に許容できるすべて
の塩またはその錯体に関する。さらに、本発明は、本発
明によるサケカルシトニンの合成に有用な中間体の調製
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】サケカルシトニンは、サケから抽出した
天然ペプチドホルモンであり、ヒトカルシトニンの４０
倍以上の活性作用があり、細胞内および細胞外のカルシ
ウム濃度および分布を調節するように甲状腺の傍濾細胞
によって主に分泌される構造と本質的に類似したホルモ
ンである。ヒトカルシトニンとサケカルシトニンは共
に、老年後および閉経後の骨粗鬆症予防や、パジェット
病罹患者用として利用されている。
天然ペプチドホルモンであり、ヒトカルシトニンの４０
倍以上の活性作用があり、細胞内および細胞外のカルシ
ウム濃度および分布を調節するように甲状腺の傍濾細胞
によって主に分泌される構造と本質的に類似したホルモ
ンである。ヒトカルシトニンとサケカルシトニンは共
に、老年後および閉経後の骨粗鬆症予防や、パジェット
病罹患者用として利用されている。
【０００３】（ヒト、サケ、ウサギ、ブタなどの）カル
シトニンを獲得する多数の方法が過去に記述されてい
る。例えば、さまざまな種から組織を抽出する方法、Ｄ
ＮＡ組換え技術による方法、化学合成する方法などであ
る。
シトニンを獲得する多数の方法が過去に記述されてい
る。例えば、さまざまな種から組織を抽出する方法、Ｄ
ＮＡ組換え技術による方法、化学合成する方法などであ
る。
【０００４】このため、サケカルシトニンはサケの気管
支腺から抽出することができる。しかし、この方法で生
産した活性抽出物の収率が低いので、抽出の代わりとし
て合成する手段を研究するに至っている。
支腺から抽出することができる。しかし、この方法で生
産した活性抽出物の収率が低いので、抽出の代わりとし
て合成する手段を研究するに至っている。
【０００５】化学合成によってカルシトニンを合成する
方法の中で、ペプチド類およびタンパク質類の合成技術
が進歩するのと平行して、溶液および固相に関する化学
的方法論が記述されている。
方法の中で、ペプチド類およびタンパク質類の合成技術
が進歩するのと平行して、溶液および固相に関する化学
的方法論が記述されている。
【０００６】ペプチドを合成する古典的方法を用いてサ
ケカルシトニンを合成する方法が、１９６９年にGuttma
n Sらによって述べられている（helv.Chim.Acta52,1789
-1795）。ペプチド合成の分野における固相合成方法の
革新や、保護基の新たな直交方法や新たな担体の導入
を、収斂合成方法に加えたことにより、カルシトニンの
獲得方法に新たな道が開けてきた。
ケカルシトニンを合成する方法が、１９６９年にGuttma
n Sらによって述べられている（helv.Chim.Acta52,1789
-1795）。ペプチド合成の分野における固相合成方法の
革新や、保護基の新たな直交方法や新たな担体の導入
を、収斂合成方法に加えたことにより、カルシトニンの
獲得方法に新たな道が開けてきた。
【０００７】これまでに、（ヒト、ブタ、ウシ、サケ、
ウサギなどの）カルシトニンを合成するための様々な固
相合成方法が、米国特許第３，９２６，９３８号および
第３，８９１，６１４号の他、Kamber.B,Rinker.B,らの
論文で述べられている。Peptides:Chemistry and Biolo
gy,pp.525-6（Smith J.A,Rivier J.E.編）１９９２年、
ESCOM Science Publishersは、ｔ−ブトキシカルボニル
（Boc）／ベンジル（Bzl）型保護方法（Barnay G.,Merr
ifield R.B.,1980）を扱い、The Peptides（Gross E.,M
einhofer J.編，vol.2,pp.1-284,Academic Press,New Y
ork）は、収斂合成の概要（Pedro et al.,Tetrahedron,
1982,38,1183）と（３２のアミノ酸を１つずつ接続す
る）線状合成方法を扱っている。一般に、Ｂｏｃ／Ｂｚ
ｌ誘導体では、脱保護条件が厳しく、その結果の精製過
程が複雑なため、合成過程において収率コストが高くな
るという欠点がある。
ウサギなどの）カルシトニンを合成するための様々な固
相合成方法が、米国特許第３，９２６，９３８号および
第３，８９１，６１４号の他、Kamber.B,Rinker.B,らの
論文で述べられている。Peptides:Chemistry and Biolo
gy,pp.525-6（Smith J.A,Rivier J.E.編）１９９２年、
ESCOM Science Publishersは、ｔ−ブトキシカルボニル
（Boc）／ベンジル（Bzl）型保護方法（Barnay G.,Merr
ifield R.B.,1980）を扱い、The Peptides（Gross E.,M
einhofer J.編，vol.2,pp.1-284,Academic Press,New Y
ork）は、収斂合成の概要（Pedro et al.,Tetrahedron,
1982,38,1183）と（３２のアミノ酸を１つずつ接続す
る）線状合成方法を扱っている。一般に、Ｂｏｃ／Ｂｚ
ｌ誘導体では、脱保護条件が厳しく、その結果の精製過
程が複雑なため、合成過程において収率コストが高くな
るという欠点がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、脱保護条件を緩和し、精製過程を単純にして、
収率コストを低減させることのできるサケカルシトニン
の調製方法を提供することにある。
目的は、脱保護条件を緩和し、精製過程を単純にして、
収率コストを低減させることのできるサケカルシトニン
の調製方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明によるサケカルシトニンは条件が緩やかであ
るとして知られる方法論を使用して、カルシトニンの固
相合成方法を調査した結果に基づいており、線状合成プ
ロトコルまたは収斂合成プロトコルを伴い、脱保護に緩
やかな条件しか必要としない、すなわち、溶液または固
相における相補的フラクメントの縮合によって、Ｆｍｏ
ｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）／ｔｅｒｔ
−ブチル（ｔ−Ｂｕ）型の保護をすることに基づく。
に、本発明によるサケカルシトニンは条件が緩やかであ
るとして知られる方法論を使用して、カルシトニンの固
相合成方法を調査した結果に基づいており、線状合成プ
ロトコルまたは収斂合成プロトコルを伴い、脱保護に緩
やかな条件しか必要としない、すなわち、溶液または固
相における相補的フラクメントの縮合によって、Ｆｍｏ
ｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）／ｔｅｒｔ
−ブチル（ｔ−Ｂｕ）型の保護をすることに基づく。
【００１０】Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ型保護を用いた固相合
成方法のいくつかを最近の文献に見ることができる。
成方法のいくつかを最近の文献に見ることができる。
【００１１】驚くべきことに、現在では完全なペプチド
の骨格を遊離／脱保護した後、（以下の図１および図
２）フラグメント１および２または３の縮合によって収
斂合成すると、高収率の反応粗原料が得られる。これ
は、精製過程が単純化しただけでなく、上述の他の過程
の収率が増加することも意味する。
の骨格を遊離／脱保護した後、（以下の図１および図
２）フラグメント１および２または３の縮合によって収
斂合成すると、高収率の反応粗原料が得られる。これ
は、精製過程が単純化しただけでなく、上述の他の過程
の収率が増加することも意味する。
【００１２】本発明では、収斂合成方法で結合する保護
基を使用しながら、新たな高分子担体と新たな合成方法
論を用いて、固相合成をする新たな方法を提供すること
にある。
基を使用しながら、新たな高分子担体と新たな合成方法
論を用いて、固相合成をする新たな方法を提供すること
にある。
【００１３】また、特に、本発明の目的はサケカルシト
ニンすなわち３２の逐次的アミノ酸から成るペプチドホ
ルモンを獲得するための方法を、（簡便に機能化した担
体上に）収斂方法で結合した Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ型保
護基による方法論を使用する固相合成に基づき、図１に
すべて従って提供する。
ニンすなわち３２の逐次的アミノ酸から成るペプチドホ
ルモンを獲得するための方法を、（簡便に機能化した担
体上に）収斂方法で結合した Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ型保
護基による方法論を使用する固相合成に基づき、図１に
すべて従って提供する。
【００１４】このため、本発明のサケカルシトニン調製
方法は、高分子担体上で固相合成を行ない、収斂方法で
結合した Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ型の保護基を介在させて、
サケカルシトニンおよびその薬理学的に許容できる酸付
加塩またはその錯体の獲得するためのサケカルシトニン
調製方法において、（ａ）サケカルシトニン配列のカル
ボキサミド末端に対応するドコサペプチドを含み、樹脂
上で簡便に保護し固定したフラグメント１と、
方法は、高分子担体上で固相合成を行ない、収斂方法で
結合した Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ型の保護基を介在させて、
サケカルシトニンおよびその薬理学的に許容できる酸付
加塩またはその錯体の獲得するためのサケカルシトニン
調製方法において、（ａ）サケカルシトニン配列のカル
ボキサミド末端に対応するドコサペプチドを含み、樹脂
上で簡便に保護し固定したフラグメント１と、
【００１５】
【化１５】
【００１６】サケカルシトニン配列のアミノ基末端に対
応するデカペプチドであり、簡便に保護され、２システ
イン間に予め形成したジスルフィド架橋を用いて、
応するデカペプチドであり、簡便に保護され、２システ
イン間に予め形成したジスルフィド架橋を用いて、
【００１７】
【化１６】
【００１８】で表わされるフラグメント２と共に縮合す
るステップと、（ｂ） 生成ペプチド樹脂であり、
るステップと、（ｂ） 生成ペプチド樹脂であり、
【００１９】
【化１７】
【００２０】で表わされるフラグメント６を側鎖の脱保
護と該樹脂の排除を同時に行ない、生成後化学的に純粋
なサケカルシトニンとなるペプチドを獲得するステップ
と、を有する。
護と該樹脂の排除を同時に行ない、生成後化学的に純粋
なサケカルシトニンとなるペプチドを獲得するステップ
と、を有する。
【００２１】樹脂由来のフラグメント６からの排除につ
いてはカルボカチオン金属イオン封鎖剤存在中に酸で処
理することによって実行する。
いてはカルボカチオン金属イオン封鎖剤存在中に酸で処
理することによって実行する。
【００２２】ステップ（ａ）においてフラグメント１
は、Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tB
u)-Cys(trt)-Val-Leu-Gly-OH で表わされるフラグメン
ト３に対応するフラグメント２の前駆物質で選択的に縮
合され、Boc-Cys-(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Cy
s(Trt)-Val-Leu-Gly-Lye(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(t
Bu)-Leu-His(Trt)-Lye(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tB
u)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)
-Gly-Thr(tBu)-Pro-(R)で表わされ、固相中で選択的に
酸化され、樹脂脱保護に処理及び樹脂排除処理後に化学
的に純粋なサケカルシトニンを獲得するフラグメント６
を獲得するように２システイン間でジスルフィド架橋を
形成するフラグメント７に対応するペプチド樹脂を獲得
する。
は、Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tB
u)-Cys(trt)-Val-Leu-Gly-OH で表わされるフラグメン
ト３に対応するフラグメント２の前駆物質で選択的に縮
合され、Boc-Cys-(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Cy
s(Trt)-Val-Leu-Gly-Lye(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(t
Bu)-Leu-His(Trt)-Lye(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tB
u)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)
-Gly-Thr(tBu)-Pro-(R)で表わされ、固相中で選択的に
酸化され、樹脂脱保護に処理及び樹脂排除処理後に化学
的に純粋なサケカルシトニンを獲得するフラグメント６
を獲得するように２システイン間でジスルフィド架橋を
形成するフラグメント７に対応するペプチド樹脂を獲得
する。
【００２３】フラグメント７の酸化によるフラグメント
６の獲得を好ましくはヨウ素を用いて行なう。内標準お
よび架橋基を該樹脂とアミノ酸配列との間に取込むこと
によって、フラグメント１をpMBHA樹脂から獲得した
後、線状合成を残部ごとに２２のアミノ酸が取り込まれ
るまで行なう。
６の獲得を好ましくはヨウ素を用いて行なう。内標準お
よび架橋基を該樹脂とアミノ酸配列との間に取込むこと
によって、フラグメント１をpMBHA樹脂から獲得した
後、線状合成を残部ごとに２２のアミノ酸が取り込まれ
るまで行なう。
【００２４】好ましくはＰＡＬまたはＡＭを架橋基とし
て用い、好ましくはアミノ酸Ｉｌｅを内標準として使用
する。
て用い、好ましくはアミノ酸Ｉｌｅを内標準として使用
する。
【００２５】２２のアミノ酸各々の線状合成中、保護基
Fmocをすべての場合にアミノ基末端に用い、側鎖Lys、Se
r、Thr、Tyr、Arg、Glu、His、GlnおよびAsnに対して請求項１
記載のフラグメント１の式中に前記側鎖に対して示した
保護基を使用する。
Fmocをすべての場合にアミノ基末端に用い、側鎖Lys、Se
r、Thr、Tyr、Arg、Glu、His、GlnおよびAsnに対して請求項１
記載のフラグメント１の式中に前記側鎖に対して示した
保護基を使用する。
【００２６】フラグメント２のpMBHA樹脂からの獲得
を、内標準としてのIle基および架橋基としてのHMPB基
を該樹脂とアミノ酸配列との間に取込むことによって行
ない、残部ごとに線状合成を１０のアミノ酸を取込むま
で行なう一方、最終アミノ酸以外のすべての場合にアミ
ノ基末端に対してFmoc保護基を用い、最終アミノ酸にＢ
ｏｃ基を使用し、側鎖Ser、Thr、CysおよびAsn対して表示
した保護基であり前記側鎖を用いて、Boc-Cys(Acm)-Ser
(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-G
ly-(R)で表わされるフラグメント４を使用することによ
って、システイン残部の２保護基をヨウ素で脱保護化お
よび酸化を同時に行なった後、
を、内標準としてのIle基および架橋基としてのHMPB基
を該樹脂とアミノ酸配列との間に取込むことによって行
ない、残部ごとに線状合成を１０のアミノ酸を取込むま
で行なう一方、最終アミノ酸以外のすべての場合にアミ
ノ基末端に対してFmoc保護基を用い、最終アミノ酸にＢ
ｏｃ基を使用し、側鎖Ser、Thr、CysおよびAsn対して表示
した保護基であり前記側鎖を用いて、Boc-Cys(Acm)-Ser
(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-G
ly-(R)で表わされるフラグメント４を使用することによ
って、システイン残部の２保護基をヨウ素で脱保護化お
よび酸化を同時に行なった後、
【００２７】
【化１８】
【００２８】で表わされるフラグメント５がペプチド−
樹脂結合の切断後フラグメント２を生成することを特徴
とする請求項１記載のサケカルシトニンの調製方法。
樹脂結合の切断後フラグメント２を生成することを特徴
とする請求項１記載のサケカルシトニンの調製方法。
【００２９】フラグメント４のペプチド樹脂結合を切断
し、Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Cys(Tr
t)-Val-Leu-Glyで表わされるフラグメント３を獲得する
ことによって、ヨウ素で酸化させてフラグメント２を生
成する。
し、Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Cys(Tr
t)-Val-Leu-Glyで表わされるフラグメント３を獲得する
ことによって、ヨウ素で酸化させてフラグメント２を生
成する。
【００３０】樹脂上に保護および固定し、Lys(Boc)-Leu
-Ser(tBu)-Gln-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-G
in-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr
(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-
(R)の配列および構造から成り、Boc、tBu、TrtおよびPmc
が表示のアミノ酸残部に対する保護基であり、する保護
基であり、
-Ser(tBu)-Gln-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-G
in-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr
(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-
(R)の配列および構造から成り、Boc、tBu、TrtおよびPmc
が表示のアミノ酸残部に対する保護基であり、する保護
基であり、
【００３１】
【化１９】
【００３２】であることを特徴とするサケカルシトニン
の合成において使用する。
の合成において使用する。
【００３３】樹脂上に保護および固定したBoc-Cys(Acm)
-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-(Trt)-Val-
Leu-Gly(R)で表わされる配列および構造から成るフラグ
メント４であり、Boc、Acm、tBuおよび Trtが表示のアミ
ノ酸残部に対する保護基であり、（Ｒ）は上述で定義し
たものである。
-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-(Trt)-Val-
Leu-Gly(R)で表わされる配列および構造から成るフラグ
メント４であり、Boc、Acm、tBuおよび Trtが表示のアミ
ノ酸残部に対する保護基であり、（Ｒ）は上述で定義し
たものである。
【００３４】樹脂上に保護および固定した
【００３５】
【化２０】
【００３６】で表わされる配列および構造から成り、Bo
cおよびtBuが表示のアミノ酸残部に対する保護基であ
り、（Ｒ）が上述で定義したものである。
cおよびtBuが表示のアミノ酸残部に対する保護基であ
り、（Ｒ）が上述で定義したものである。
【００３７】樹脂上に保護および固定した
【００３８】
【化２１】
【００３９】で表わされる配列および構造から成り、Bo
c、tBu、tRtおよびPmcが表示のアミノ酸残部の保護基であ
り、（Ｒ）が請求項１０で定義したものである。
c、tBu、tRtおよびPmcが表示のアミノ酸残部の保護基であ
り、（Ｒ）が請求項１０で定義したものである。
【００４０】樹脂上に保護および固定した
【００４１】
【化２２】
【００４２】で表わされる配列および構造から成り、Bo
c、Acm、tBu、TrtおよびPmcが表示のアミノ酸残部に対する
保護基であり、（Ｒ）が請求項１０で定義したものであ
る。
c、Acm、tBu、TrtおよびPmcが表示のアミノ酸残部に対する
保護基であり、（Ｒ）が請求項１０で定義したものであ
る。
【００４３】本発明は、新規のペプチドの使用方法であ
り、前記フラグメント１、２、３、４、５、６および７
に対応し、サケカルシトニンの合成に関して、上述に記
載した通りである。
り、前記フラグメント１、２、３、４、５、６および７
に対応し、サケカルシトニンの合成に関して、上述に記
載した通りである。
【００４４】
【実施例】図１は、サケカルシトニン配列のカルボキサ
ミド末端に対応するドコサペプチドであり、樹脂上に簡
便に保護し固定したフラグメント１を、サケカシシトニ
ン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドであり、
簡便に保護し２システイン間に予め形成したジスルフィ
ド架橋を有するフラグメント２とともに縮合した結果を
示す図である。
ミド末端に対応するドコサペプチドであり、樹脂上に簡
便に保護し固定したフラグメント１を、サケカシシトニ
ン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドであり、
簡便に保護し２システイン間に予め形成したジスルフィ
ド架橋を有するフラグメント２とともに縮合した結果を
示す図である。
【００４５】ここで
【００４６】
【化２３】
【００４７】完全なペプチドの骨格（フラグメント６）
が構成されてしまうと、ペプチドは樹脂から排除され、
完全に脱保護され、酸処理によってすでに酸化形になっ
ている。これに続く精製後最終的にに化学的に純粋なサ
ケカルシトニンを獲得する。特に、（図１における）フ
ラグメント１とフラグメント２との縮合によって（従来
の文献に記載されていない）フラグメント６を生じる
が、これは既述の従来の固相合成方法によって実行す
る。縮合が完了すると、ペプチド−樹脂は側鎖を脱保護
する過程と樹脂を排除する過程に同時にかけられるが、
このとき、スカベンジャー存在時に９５％トリフルオロ
酢酸を使用する。生成粗原料を高圧液体クロマトグラフ
ィ−で精製する。同種のフラクションすべてを結合さ
せ、冷凍乾燥させることによって、化学的に純粋なサケ
カルシトニンを獲得することができる。
が構成されてしまうと、ペプチドは樹脂から排除され、
完全に脱保護され、酸処理によってすでに酸化形になっ
ている。これに続く精製後最終的にに化学的に純粋なサ
ケカルシトニンを獲得する。特に、（図１における）フ
ラグメント１とフラグメント２との縮合によって（従来
の文献に記載されていない）フラグメント６を生じる
が、これは既述の従来の固相合成方法によって実行す
る。縮合が完了すると、ペプチド−樹脂は側鎖を脱保護
する過程と樹脂を排除する過程に同時にかけられるが、
このとき、スカベンジャー存在時に９５％トリフルオロ
酢酸を使用する。生成粗原料を高圧液体クロマトグラフ
ィ−で精製する。同種のフラクションすべてを結合さ
せ、冷凍乾燥させることによって、化学的に純粋なサケ
カルシトニンを獲得することができる。
【００４８】図２は本発明による別のサケカルシトニン
獲得方法を示す。（Ｒ）については既に述べた通りであ
る。
獲得方法を示す。（Ｒ）については既に述べた通りであ
る。
【００４９】図２によれば、フラグメント１はフラグメ
ント３を用いて縮合された後、ジスルフィド架橋が２シ
ステイン（フラグメント７）間で固相の選択的酸化反応
によって形成される。最後に、ペプチド構造が（２シス
テイン間のジスルフィド架橋を用いて）酸化形（フラグ
メント６）に完成すると、樹脂からの残留保護基の脱保
護および遊離が実行される。このため、従来の精製後、
化学的に純粋なサケカルシトニンが獲得される。
ント３を用いて縮合された後、ジスルフィド架橋が２シ
ステイン（フラグメント７）間で固相の選択的酸化反応
によって形成される。最後に、ペプチド構造が（２シス
テイン間のジスルフィド架橋を用いて）酸化形（フラグ
メント６）に完成すると、樹脂からの残留保護基の脱保
護および遊離が実行される。このため、従来の精製後、
化学的に純粋なサケカルシトニンが獲得される。
【００５０】別の観点から見れば、上述のように、本発
明はフラグメント１を獲得するための方法の他、フラグ
メント２およびその前駆物質であるフラグメント３の獲
得方法ならびに本発明によるサケカルシトニンの精製す
るために図１および図２で使用したすべてのフラグメン
トを獲得する方法を提供する。
明はフラグメント１を獲得するための方法の他、フラグ
メント２およびその前駆物質であるフラグメント３の獲
得方法ならびに本発明によるサケカルシトニンの精製す
るために図１および図２で使用したすべてのフラグメン
トを獲得する方法を提供する。
【００５１】フラグメント１およびフラグメント２を、
パラメチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）を用い
て開始させ、内標準と架橋基（ハンドル）とをそれぞれ
の配列の樹脂とアミノ酸との間に取り込んで獲得する。
パラメチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）を用い
て開始させ、内標準と架橋基（ハンドル）とをそれぞれ
の配列の樹脂とアミノ酸との間に取り込んで獲得する。
【００５２】フラグメント１を獲得する際には、サケカ
ルシトニンの末端のカルボキシ基終端がカルボキサミド
であるため、取り込まれる架橋基すなわちハンドルは
［１−（９Ｈ−フルオレン９−ｙｌ）−メトキシ−ホル
ムアミド］メチル−３，５−ジメトキシフェノキシ吉草
酸（Fmoc-PAL）（Albericio et al.J.Org.Chem.(199
0)）であるか、または、選択的にｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ
−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）−メトキシ−
ホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェ
ノキシ酢酸（Ｆｏｒｍ−Ａｍ）（Atherton et al.J.Am.
Chem.Soc.,(1975),97,6584）である。架橋取込み後、線
状合成を残部ごとに行ない、これを２２のアミノ酸を取
り込むまで続ける。この際、保護基としてのＦｍｏｃを
すべてのアミノ基末端に対して用いる。側鎖Ｌｙｓ、Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌ
ｎおよびＡｓｎに対するのは、図３に示す保護基であ
る。（Ｒ）は既に述べた通りである。
ルシトニンの末端のカルボキシ基終端がカルボキサミド
であるため、取り込まれる架橋基すなわちハンドルは
［１−（９Ｈ−フルオレン９−ｙｌ）−メトキシ−ホル
ムアミド］メチル−３，５−ジメトキシフェノキシ吉草
酸（Fmoc-PAL）（Albericio et al.J.Org.Chem.(199
0)）であるか、または、選択的にｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ
−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）−メトキシ−
ホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェ
ノキシ酢酸（Ｆｏｒｍ−Ａｍ）（Atherton et al.J.Am.
Chem.Soc.,(1975),97,6584）である。架橋取込み後、線
状合成を残部ごとに行ない、これを２２のアミノ酸を取
り込むまで続ける。この際、保護基としてのＦｍｏｃを
すべてのアミノ基末端に対して用いる。側鎖Ｌｙｓ、Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌ
ｎおよびＡｓｎに対するのは、図３に示す保護基であ
る。（Ｒ）は既に述べた通りである。
【００５３】フラグメント２を獲得するには、末端カル
ボキシ終端がカルボキシ酸でなければならないので、取
り込んだ架橋基すなわちハンドルはリニカーハンドルと
して知られる４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシ
フェノキシ酪酸（HMPB）（Flrsheimer et al）。架橋の
取込み後、線状合成を残部ごとに行ない、これを１０の
アミノ酸が取り込まれるまで行なう。このとき最後のア
ミノ酸を除くすべての場合にアミノ基末端に対して保護
基としてのFmocを使用する。最後のアミノ酸に対しては
Ｂｏｃ基を用いる。側鎖Ser、Thr、Asn、Cysの保護に対し
ては、tBu、TrtまたはAcmをそれぞれ使用し、フラグメン
ト４を獲得する。これは文献未記載のものであり、図４
に示す通りである。
ボキシ終端がカルボキシ酸でなければならないので、取
り込んだ架橋基すなわちハンドルはリニカーハンドルと
して知られる４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシ
フェノキシ酪酸（HMPB）（Flrsheimer et al）。架橋の
取込み後、線状合成を残部ごとに行ない、これを１０の
アミノ酸が取り込まれるまで行なう。このとき最後のア
ミノ酸を除くすべての場合にアミノ基末端に対して保護
基としてのFmocを使用する。最後のアミノ酸に対しては
Ｂｏｃ基を用いる。側鎖Ser、Thr、Asn、Cysの保護に対し
ては、tBu、TrtまたはAcmをそれぞれ使用し、フラグメン
ト４を獲得する。これは文献未記載のものであり、図４
に示す通りである。
【００５４】システイン残部のそれぞれ二つの保護基
（AcmおよびTrt）の脱保護基反応と酸化反応をヨウ素を
用いて行わせると、フラグメント５を生じる。これは文
献未記載のものであり、高収率高純度で得られた。最後
にトリフロロ酢酸のジクロロメタン１％液でペプチド−
樹脂の結合を切って、フラグメント２を得る。
（AcmおよびTrt）の脱保護基反応と酸化反応をヨウ素を
用いて行わせると、フラグメント５を生じる。これは文
献未記載のものであり、高収率高純度で得られた。最後
にトリフロロ酢酸のジクロロメタン１％液でペプチド−
樹脂の結合を切って、フラグメント２を得る。
【００５５】あるいは別法として、図４に戻って、フラ
グメント４のペプチド−樹脂結合を切ってフラグメント
３を得る。これも文献未記載のもので、これをヨウ素で
酸化し、フラグメント２を生成する。
グメント４のペプチド−樹脂結合を切ってフラグメント
３を得る。これも文献未記載のもので、これをヨウ素で
酸化し、フラグメント２を生成する。
【００５６】本明細書で用いる略語を以下に示す。
【００５７】Ａｃｍ：アセトアミドメチル AcOH：酢酸 AM：ｐ−［（Ｒ，Ｓ）−２，４−ジメトキシベンジル］
−フェノキシ酢酸 Arg：Ｌ−アルギニン Asn：Ｌ−アスパラギン Boc：ｔ−ブトキシカルボニル Bzl：ベンジル Cis：シスチン Cys：システイン DCM：ジクロロメタン DMF：Ｎ，Ｎ’− ジメチルフォルムアミド DIEA：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン DIPCDI： ジイソプロピルカルボジイミド DMAP：ジメチルアミノピリジン Fmoc：９−フルオレニルメトキシカルボニル Gln：Ｌ−グルタミン Glu：Ｌ−グルタミン酸 Gly：Ｌ−グリシン HBTU：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロナイド ヘキサフル
オロフォスフェイト His：Ｌ−ヒスチジン HMPB：４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノ
キシ）酪酸 HOBT：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール HPLC：高圧液体クロマトグラフィー Leu：Ｌ−ロイシン Lys：Ｌ−リジン Meb：ｐ−メチルベンジル Mtr：メトキシトリチル MPLC：中圧液体クロマトグラフィー PAL：アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ吉
草酸 pMBHA：パラ−メチルベンツヒドリルアミン Pmc：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６
−スルフォニル Pro：Ｌ−プロリン Ser：Ｌ−セリン tBu：ターシャリーブチル TFA：トリフルオロ酢酸 TFMSA：トリフルオロメタンスルフォン酸 Thr：Ｌ−スレオニン Tos：トシル Trt：トリチル Tyr：Ｌ−チロシン 本発明を以下の例により説明するが、これらに限定され
るものではない。
−フェノキシ酢酸 Arg：Ｌ−アルギニン Asn：Ｌ−アスパラギン Boc：ｔ−ブトキシカルボニル Bzl：ベンジル Cis：シスチン Cys：システイン DCM：ジクロロメタン DMF：Ｎ，Ｎ’− ジメチルフォルムアミド DIEA：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン DIPCDI： ジイソプロピルカルボジイミド DMAP：ジメチルアミノピリジン Fmoc：９−フルオレニルメトキシカルボニル Gln：Ｌ−グルタミン Glu：Ｌ−グルタミン酸 Gly：Ｌ−グリシン HBTU：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロナイド ヘキサフル
オロフォスフェイト His：Ｌ−ヒスチジン HMPB：４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノ
キシ）酪酸 HOBT：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール HPLC：高圧液体クロマトグラフィー Leu：Ｌ−ロイシン Lys：Ｌ−リジン Meb：ｐ−メチルベンジル Mtr：メトキシトリチル MPLC：中圧液体クロマトグラフィー PAL：アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ吉
草酸 pMBHA：パラ−メチルベンツヒドリルアミン Pmc：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６
−スルフォニル Pro：Ｌ−プロリン Ser：Ｌ−セリン tBu：ターシャリーブチル TFA：トリフルオロ酢酸 TFMSA：トリフルオロメタンスルフォン酸 Thr：Ｌ−スレオニン Tos：トシル Trt：トリチル Tyr：Ｌ−チロシン 本発明を以下の例により説明するが、これらに限定され
るものではない。
【００５８】例 １ 内標準の取込み。ＢｏｃＩｌｅ−ｐＭＢＨＡの獲得。
【００５９】１．６５８ｇ（６．９ｍｍｏｌ）のBocIle
を内標準として、４ｇのｐ−メチルベンツヒドリルアア
ミン樹脂、ただし０．６９ｍｍｏｌ／ｇ樹脂、に下記の
合成順序にしたがって結合させる。
を内標準として、４ｇのｐ−メチルベンツヒドリルアア
ミン樹脂、ただし０．６９ｍｍｏｌ／ｇ樹脂、に下記の
合成順序にしたがって結合させる。
【００６０】 ステップ 試薬 回数 時間 １ ＴＦＡ ４０％ １ ２時間 ２ ＴＦＡ ４０％ １ ２０ 〃 ３ ＤＣＭ ５ １ 〃 ４ ＤＩＥＡ ５％ ３ ２ 〃 ５ ＤＣＭ ５ １ 〃 ６ Ｂｏｃ ａａ − ＋ ７ ＨＯＢｔ − ＋ ８ ＤＩＰＣＤＩ − ４０ 〃 ９ ＤＣＭ ５ １ 〃 １０ ニンヒドリンでチェック ＋ならばステップ６へ戻る。−ならば次へ。 １１ ＤＣＭ ５ １ 〃 １２ ＴＦＡ ４０％ １ ２ 〃 １３ ＴＦＡ ４０％ １ ２０ 〃 １４ ＤＣＭ ５ １ 〃 １５ ＤＩＥＡ ５％ ３ ２ 〃 １６ ＤＣＭ ５ １ 〃例 ２ リニカーハンドルの取込み。４（４−ヒドロキシメチル
−３−メトキシフェノキシ）酪酸アミド−Ｉｌｅ−ｐＭ
ＢＨＡの獲得。
−３−メトキシフェノキシ）酪酸アミド−Ｉｌｅ−ｐＭ
ＢＨＡの獲得。
【００６１】次にリニカーハンドル（ＨＭＰＢ）として
も知られる４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフ
ェノキシ）酪酸の取込みを行う。４ｇの樹脂（アミノ
基：０．６９ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）を内標準であらかじめ
機能化させておき、これに１ｇ（４．４１ｍｍｏｌ、
１．５当量）の４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキ
シフェノキシ）酪酸、０．６２ｇ（４．１４ ｍｍｏ
ｌ、１．５当量）のＨＯＢｔ、それに ６４１μｌ
（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）を、ＤＭＦを溶媒に
して反応させる。反応時間は９０時間である。この時間
が経過後、樹脂をＤＭＦで５回洗浄し、カイザー試験を
用いて遊離アミンが無くなっているのを確認する。遊離
アミンを検出した場合は、カップリング反応を繰り返さ
なければならない。 例 ３ 最初のアミノ酸の取込み。Ｆｍｏｃ Ｇｌｙ−リニカー
ハンドル−Ｉｌｅ−ｐＭＢＨＡの獲得。
も知られる４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフ
ェノキシ）酪酸の取込みを行う。４ｇの樹脂（アミノ
基：０．６９ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）を内標準であらかじめ
機能化させておき、これに１ｇ（４．４１ｍｍｏｌ、
１．５当量）の４（４−ヒドロキシメチル−３−メトキ
シフェノキシ）酪酸、０．６２ｇ（４．１４ ｍｍｏ
ｌ、１．５当量）のＨＯＢｔ、それに ６４１μｌ
（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）を、ＤＭＦを溶媒に
して反応させる。反応時間は９０時間である。この時間
が経過後、樹脂をＤＭＦで５回洗浄し、カイザー試験を
用いて遊離アミンが無くなっているのを確認する。遊離
アミンを検出した場合は、カップリング反応を繰り返さ
なければならない。 例 ３ 最初のアミノ酸の取込み。Ｆｍｏｃ Ｇｌｙ−リニカー
ハンドル−Ｉｌｅ−ｐＭＢＨＡの獲得。
【００６２】最初のアミノ酸の取込みは、この場合はグ
リシン、リニカーハンドルとＦｍｏｃＧｌｙ誘導体の間
にエステル状の結合が生成したことを意味する。この種
類の取込みには、樹脂を１６８ｍｇ（０．５当量）のＤ
ＭＡＰおよび２．０９４ｍｌ（５当量）のＤＩＰＣＤＩ
存在下、４．１ｇ（５当量）のＦｍｏｃ ＧｌｙとＤＭ
Ｆ中９０時間反応させる。反応完了後、樹脂をＤＭＦで
５回洗浄する。樹脂の酸加水分解液をアミノ酸分析する
と、Ｉｌｅアミノ酸（内標準）と最初のアミノ酸Ｇｌｙ
の比が出てくる。このようにして樹脂の機能化に関する
真の値が分かる。通常は０．３５−０．６９ｍｍｏｌ／
ｇの範囲にある。
リシン、リニカーハンドルとＦｍｏｃＧｌｙ誘導体の間
にエステル状の結合が生成したことを意味する。この種
類の取込みには、樹脂を１６８ｍｇ（０．５当量）のＤ
ＭＡＰおよび２．０９４ｍｌ（５当量）のＤＩＰＣＤＩ
存在下、４．１ｇ（５当量）のＦｍｏｃ ＧｌｙとＤＭ
Ｆ中９０時間反応させる。反応完了後、樹脂をＤＭＦで
５回洗浄する。樹脂の酸加水分解液をアミノ酸分析する
と、Ｉｌｅアミノ酸（内標準）と最初のアミノ酸Ｇｌｙ
の比が出てくる。このようにして樹脂の機能化に関する
真の値が分かる。通常は０．３５−０．６９ｍｍｏｌ／
ｇの範囲にある。
【００６３】例 ４ 残余のアミノ酸の取込み。BocCys(Acm)-Ser(tBu)-Asn-L
eu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-リニカー
ハンドル-Ile-pMBHA（フラグメント４）の獲得。残余の
アミノ酸の取込みは以下に記す合成方法に従う。
eu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-リニカー
ハンドル-Ile-pMBHA（フラグメント４）の獲得。残余の
アミノ酸の取込みは以下に記す合成方法に従う。
【００６４】 ステップ 試薬 回数 時間 １ ＤＭＦ ５ １時間 ２ ｐｉｐ／ＤＭＦ ２０％ １ １ 〃 ３ ｐｉｐ／ＤＭＦ ２０％ １ ５ 〃 ４ ＤＭＦ ５ １ 〃 ５ Ｆｍｏｃ ａａ − ＋ ６ ＨＯＢｔ − ＋ ７ ＤＩＰＣＤＩ − ４０ 〃 ８ ＤＭＦ ５ １ 〃 ニンヒドリンでチェックし、＋の場合はステップ５に戻
る。−の場合、次のアミノ酸に進み、ステップ１から始
める。
る。−の場合、次のアミノ酸に進み、ステップ１から始
める。
【００６５】完全に保護基を外したペプチド１−１０の
合成純度を評価するには、２０ｍｇのBocCys(Acm)-Ser
(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-G
ly-リニカーハンドル-Ile-pMBHAを９００μｌのＴＦ
Ａ、５０μｌのチオアニソール、３０μｌのＥＤＴ、２
０μｌのアニソールとともに室温で２時間、濾板を備え
た反応器で処理する。濾液は乾燥した冷ジエチルエーテ
ルを入れた管に集める。遊離ペプチドの沈殿が見られ
る。遠心分離後、上澄み液を注ぎだす。ペレットは乾燥
した冷ジエチルエーテルに再懸濁し、スカベンジャー
（ＥＤＴ、チオアニソール、アニソール）を除去する。
この操作を ５回繰り返す。その後、ペレットを乾燥さ
せ、１ｍｌの１０％酢酸溶液に溶解させる。このペプチ
ド溶液４０μｌをＨＰＬＣに注入する。カラムは ２５
×０．４６ｃｍ、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８の５μｍ、Ａ液は
０．０４５％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液は０．０３５％ＴＦＡ
アセトアセトニトリル溶液、Ｂ液を５−８５％勾配で変
化させる。得られたペプチド−樹脂を、塩酸／プロピオ
ン酸混合物を用いて１５０度Ｃで３時間加水分解したも
のをアミノ酸分析にかけると、次の結果を得る。Asp 1.
01(1)、Thr 0.8(1)、Ser 1.6(2),Gly 1.2(1)、Ile 1.5-1
(1)、Leu 1.99(2)、Val 0.89(1)。
合成純度を評価するには、２０ｍｇのBocCys(Acm)-Ser
(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-G
ly-リニカーハンドル-Ile-pMBHAを９００μｌのＴＦ
Ａ、５０μｌのチオアニソール、３０μｌのＥＤＴ、２
０μｌのアニソールとともに室温で２時間、濾板を備え
た反応器で処理する。濾液は乾燥した冷ジエチルエーテ
ルを入れた管に集める。遊離ペプチドの沈殿が見られ
る。遠心分離後、上澄み液を注ぎだす。ペレットは乾燥
した冷ジエチルエーテルに再懸濁し、スカベンジャー
（ＥＤＴ、チオアニソール、アニソール）を除去する。
この操作を ５回繰り返す。その後、ペレットを乾燥さ
せ、１ｍｌの１０％酢酸溶液に溶解させる。このペプチ
ド溶液４０μｌをＨＰＬＣに注入する。カラムは ２５
×０．４６ｃｍ、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８の５μｍ、Ａ液は
０．０４５％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液は０．０３５％ＴＦＡ
アセトアセトニトリル溶液、Ｂ液を５−８５％勾配で変
化させる。得られたペプチド−樹脂を、塩酸／プロピオ
ン酸混合物を用いて１５０度Ｃで３時間加水分解したも
のをアミノ酸分析にかけると、次の結果を得る。Asp 1.
01(1)、Thr 0.8(1)、Ser 1.6(2),Gly 1.2(1)、Ile 1.5-1
(1)、Leu 1.99(2)、Val 0.89(1)。
【００６６】例 ５ ペプチド１−１０を樹脂から切除。BocCys(Acm)-Ser(tB
u)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-
OHまたは
u)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-
OHまたは
【００６７】
【化２４】
【００６８】の獲得 この処理は図４に示すように、酸化工程の前でも後でも
行うことができる。それぞれの場合、後処理が僅かに違
うだけである。酸化の前にペプチド−樹脂の結合をきる
には、Ａ方法、酸化の後で切るにはＢ方法によらなけれ
ばならない。
行うことができる。それぞれの場合、後処理が僅かに違
うだけである。酸化の前にペプチド−樹脂の結合をきる
には、Ａ方法、酸化の後で切るにはＢ方法によらなけれ
ばならない。
【００６９】Ａ方法：ペプチド−樹脂を１％ＴＦＡのＤ
ＣＭ溶液で１５分の間をおいて４−５回処理する。濾液
にヘキサンを加え回転蒸発器で蒸発させる。白色固体を
得る。 Ｂ方法：ペプチド−樹脂 を ＴＦＡの１％ ＤＣＭ
溶液で１５分の間をおいて４−５回処理する。濾過の度
に液が含んでいるＴＦＡ量の２倍量のピリジンで中和す
る。濾液は全部あわせ、回転蒸発器で最初の体積の２０
％になるまで濃縮する。ペプチド濃縮液に冷ジエチルエ
ーテルを加える。得た白色沈殿を遠心分離して取り分け
る。固形分は再度ジエチルエーテルに懸濁し、遠心分離
する。この操作をさらに三回繰り返す。最後に得た固体
を乾燥する。
ＣＭ溶液で１５分の間をおいて４−５回処理する。濾液
にヘキサンを加え回転蒸発器で蒸発させる。白色固体を
得る。 Ｂ方法：ペプチド−樹脂 を ＴＦＡの１％ ＤＣＭ
溶液で１５分の間をおいて４−５回処理する。濾過の度
に液が含んでいるＴＦＡ量の２倍量のピリジンで中和す
る。濾液は全部あわせ、回転蒸発器で最初の体積の２０
％になるまで濃縮する。ペプチド濃縮液に冷ジエチルエ
ーテルを加える。得た白色沈殿を遠心分離して取り分け
る。固形分は再度ジエチルエーテルに懸濁し、遠心分離
する。この操作をさらに三回繰り返す。最後に得た固体
を乾燥する。
【００７０】例 ６ 樹脂上でのジスルフィド架橋の生成
【００７１】
【化２５】
【００７２】樹脂上でBocCys-Ser(tBu)-Asa-Leu-Ser(tB
u)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-樹脂の脱保護基反応と同
時に起きるジスルフィド架橋反応はＤＣＭ／メタノール
／水（６：２．５：０．４２）の混合溶媒中、２当量の
ヨウ素を用い３０分の間隔を二回取って行う。
u)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Gly-樹脂の脱保護基反応と同
時に起きるジスルフィド架橋反応はＤＣＭ／メタノール
／水（６：２．５：０．４２）の混合溶媒中、２当量の
ヨウ素を用い３０分の間隔を二回取って行う。
【００７３】例 ７ 溶液中でのジスルフィド架橋の生成
【００７４】
【化２６】
【００７５】の獲得 ＢｏｃＣｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ
（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨであるペプ
チドの酸化はＤＣＭ／メタノール／水（６：２．５：
０．４２）の混合溶媒中、４当量のヨウ素を用いて１０
分間行う。その後、反応混合物は０．１規定のチオ硫酸
ナトリウムにクロロホルムを加えて洗浄する。有機層は
水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、乾固するまで蒸発
させる。白色固体を得る。
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ
（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨであるペプ
チドの酸化はＤＣＭ／メタノール／水（６：２．５：
０．４２）の混合溶媒中、４当量のヨウ素を用いて１０
分間行う。その後、反応混合物は０．１規定のチオ硫酸
ナトリウムにクロロホルムを加えて洗浄する。有機層は
水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、乾固するまで蒸発
させる。白色固体を得る。
【００７６】例 ８ Boc-Ile-pMBHa上へFmoc AMハンドルの取り込み。ｐ−
［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イ
ル）メトキシ−フォルムアミド］−２，４−ジメトキシ
ベンジル］−フェノキシアセトアミド−ＩｌｅｐＭＢＨ
Ａの獲得 次にｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレン
−９−イル）メトキシ−フォルムアミド］−２，４−ジ
メトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃ−Ａ
Ｍ）の取り込みが来る。４ｇの樹脂（０．６９ｍｍｏｌ
／ｇ樹脂）をあらかじめ内標準で機能化しておく。（例
１のプロトコルにしたがって行う）これに２．２３ｇの
ｐ−フェノキシ酢酸（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当
量）、０．６２ｇのＨＯＢｔ（４．１４ｍｍｏｌ、１．
５当量）と６４１μｌ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当
量）を、ＤＭＦを溶媒にして反応させて行う。反応時間
は９０時間。この時間が経過後、樹脂をＤＣＭで５回洗
浄し、遊離のアミノ酸がないことをカイザー試験で検査
する。もしあれば、カップリング反応を繰り返す。
［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イ
ル）メトキシ−フォルムアミド］−２，４−ジメトキシ
ベンジル］−フェノキシアセトアミド−ＩｌｅｐＭＢＨ
Ａの獲得 次にｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレン
−９−イル）メトキシ−フォルムアミド］−２，４−ジ
メトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃ−Ａ
Ｍ）の取り込みが来る。４ｇの樹脂（０．６９ｍｍｏｌ
／ｇ樹脂）をあらかじめ内標準で機能化しておく。（例
１のプロトコルにしたがって行う）これに２．２３ｇの
ｐ−フェノキシ酢酸（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当
量）、０．６２ｇのＨＯＢｔ（４．１４ｍｍｏｌ、１．
５当量）と６４１μｌ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当
量）を、ＤＭＦを溶媒にして反応させて行う。反応時間
は９０時間。この時間が経過後、樹脂をＤＣＭで５回洗
浄し、遊離のアミノ酸がないことをカイザー試験で検査
する。もしあれば、カップリング反応を繰り返す。
【００７７】例 ９ Boc-IlepMBHAのFmocPalハンドルの取込み。４［１−
（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）−メトキシホルムアミ
ド］３，５−ジメトキシフェノキシ吉草酸−Ｉｌｅ ｐ
ＭＢＨＡの獲得。
（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）−メトキシホルムアミ
ド］３，５−ジメトキシフェノキシ吉草酸−Ｉｌｅ ｐ
ＭＢＨＡの獲得。
【００７８】次に、４［１−（９Ｈ−フルオレン−９−
ｙｌ）メトキシホルムアミド］メチル−３，５−ジメト
キシフェノキシ吉草酸（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ）の取込みを
行なう。これは、１．８９ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、１．
５当量）の４［１−（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）メ
トキシホルムアミド］メチル−３，５−ジメトキシフェ
ノキシ吉草酸、０．６２ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５
当量）のＨＯＢＴおよびＤＭＦ溶媒として用いる ６４
１μｌ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）によって（例
１記載のプロトコルに従った）内標準により予め機能化
させた後、（０．６９ｍｍｏｌ／ｇの）樹脂４ｇを反応
させる。反応時間は９０時間である。反応後、ＤＣＭで
樹脂を５回洗浄してカイザー試験を使用して、遊離アミ
ンがあるか検査する。もしあれば、カップリング反応を
繰り返す。
ｙｌ）メトキシホルムアミド］メチル−３，５−ジメト
キシフェノキシ吉草酸（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ）の取込みを
行なう。これは、１．８９ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、１．
５当量）の４［１−（９Ｈ−フルオレン−９−ｙｌ）メ
トキシホルムアミド］メチル−３，５−ジメトキシフェ
ノキシ吉草酸、０．６２ｇ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５
当量）のＨＯＢＴおよびＤＭＦ溶媒として用いる ６４
１μｌ（４．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）によって（例
１記載のプロトコルに従った）内標準により予め機能化
させた後、（０．６９ｍｍｏｌ／ｇの）樹脂４ｇを反応
させる。反応時間は９０時間である。反応後、ＤＣＭで
樹脂を５回洗浄してカイザー試験を使用して、遊離アミ
ンがあるか検査する。もしあれば、カップリング反応を
繰り返す。
【００７９】例 １０ 残余アミノ酸の取込み。FmocLys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gl
n-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-
Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBU)Asn-Thr
(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHAの
獲得。
n-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-
Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBU)Asn-Thr
(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHAの
獲得。
【００８０】残余アミノ酸の取込みは、以下に示すよう
な合成プログラムに従って実行する。
な合成プログラムに従って実行する。
【００８１】 ステップ 試薬 回数 時間 １ ＤＭＦ ５ １時間 ２ ｐｉｐ／ＤＭＦ ２０％ １ １ 〃 ３ ｐｉｐ／ＤＭＦ ２０％ １ ５ 〃 ４ ＤＭＦ ５ １ 〃 ５ Ｆｍｏｃ ａａ − ＋ ６ ＨＯＢｔ − ＋ ７ ＤＩＰＣＤＩ − ４０ 〃 ８ ＤＭＦ ５ １ 〃 ニンヒドリンで検査し、＋の場合はステップ５に戻り、
−の場合はステップ１に戻り次のアミノ酸を取り込む。
−の場合はステップ１に戻り次のアミノ酸を取り込む。
【００８２】完全に脱保護したヘプチド１１−３２の合
成的精製を評価するには、２０ｍｇのFmocLys(Boc)-Leu
-Ser(tBu)-Gln-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-G
ln-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly
-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pBMHAを用いる。（フラグメント
１は９００μｌのＴＦＡ、５０μｌのチオアニソール、
３０μｌのＥＤＴおよび２０μｌのアニソールで２時間
室温で濾板を備えた反応器で処理した）濾液を乾燥した
ジエチルエーテルで冷却しながら集めた。遊離ペプチド
の沈殿を確認した後、遠心分離後、浮遊物をデカントと
した。ペレットを再び乾燥した冷エーテルで懸濁し、ス
カベンジャー（ＥＤＴ、チオアニソール、アニーソー
ル）を除去する。この操作を５回繰り返す。その後、ペ
レットを乾燥させてから、１０％酢酸溶液１ｍｌに溶解
する。４０ｍｌのペプチド溶液を、Ａ液には水０．０４
５％のＴＦＡ、Ｂ液にはアセトニトリル０．０３５％を
使用し、Ｂ液の勾配を５−８５％にし、Ｖｙｄａｃ Ｃ
１８の１５−２０μｍで、２５ｘ１ｃｍのカラムのＨＰ
ＬＣに注入する。塩酸／アミノ酸混合物を用いて３時間
１５０度Ｃでのペプチド−樹脂の加水分解すると、次の
化合物を生じる。すなわち、Asp 1.06(1)、Thr4.0(4)、Se
r 2.0(2)、Glu 3.01(3)、Gly 2.2(2)、Pro 1.98(2)、Ile 0.
9(1)、Leu 3.0(3)、Tyr 0.8(1)、His 0.92(1)、Lys 0.8(1)、
His 0.92(1)、Lys 1.8(2)、Arg 1.03(1)である。
成的精製を評価するには、２０ｍｇのFmocLys(Boc)-Leu
-Ser(tBu)-Gln-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-G
ln-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly
-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pBMHAを用いる。（フラグメント
１は９００μｌのＴＦＡ、５０μｌのチオアニソール、
３０μｌのＥＤＴおよび２０μｌのアニソールで２時間
室温で濾板を備えた反応器で処理した）濾液を乾燥した
ジエチルエーテルで冷却しながら集めた。遊離ペプチド
の沈殿を確認した後、遠心分離後、浮遊物をデカントと
した。ペレットを再び乾燥した冷エーテルで懸濁し、ス
カベンジャー（ＥＤＴ、チオアニソール、アニーソー
ル）を除去する。この操作を５回繰り返す。その後、ペ
レットを乾燥させてから、１０％酢酸溶液１ｍｌに溶解
する。４０ｍｌのペプチド溶液を、Ａ液には水０．０４
５％のＴＦＡ、Ｂ液にはアセトニトリル０．０３５％を
使用し、Ｂ液の勾配を５−８５％にし、Ｖｙｄａｃ Ｃ
１８の１５−２０μｍで、２５ｘ１ｃｍのカラムのＨＰ
ＬＣに注入する。塩酸／アミノ酸混合物を用いて３時間
１５０度Ｃでのペプチド−樹脂の加水分解すると、次の
化合物を生じる。すなわち、Asp 1.06(1)、Thr4.0(4)、Se
r 2.0(2)、Glu 3.01(3)、Gly 2.2(2)、Pro 1.98(2)、Ile 0.
9(1)、Leu 3.0(3)、Tyr 0.8(1)、His 0.92(1)、Lys 0.8(1)、
His 0.92(1)、Lys 1.8(2)、Arg 1.03(1)である。
【００８３】例 １１ フラグメント１のペプチド−樹脂上へのフラグメント２
の取込み。BocCis-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tB
u)-Cis-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(t
Bu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tB
u)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)
-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHA（フラグメント６の獲
得） １．５８ｇのペプチド−樹脂１１−３２を３分間ピペリ
ジン／ＤＭＦで処理する。この処理をさらに２回繰り返
し、樹脂をＤＭＦで１分間に５回洗浄する。ＤＭＦ中に
溶解した３１５ｍｇ（２．５当量）のＨＢＴＵおよび１
２４ｍｇ（２．５当量）のＨＯＢＴを樹脂に添加する
と、それとともにほぼ同質に形成することが可能にな
る。Ｎ−末端終端および側鎖をすでに形成したジスルフ
ィド架橋で完全に保護した１．０５ｇ（２．５当量）の
ペプチド１−１０を可及的最低量のＤＭＦに溶解し、樹
脂に添加する。最後に２９６μｌ（５当量）のＤＩＥＤ
を添加する。樹脂を十分に振盪させて、同質にする。こ
の反応はオレンジ色を呈する。樹脂のアリコートに対す
る１時間３０分後カイザー試験は、陰性であり、取込み
反応は完全であったと見なすことができる。樹脂を濾過
し、ＤＭＦで繰り返し洗浄した。
の取込み。BocCis-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tB
u)-Cis-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(t
Bu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tB
u)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)
-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-Ile-pMBHA（フラグメント６の獲
得） １．５８ｇのペプチド−樹脂１１−３２を３分間ピペリ
ジン／ＤＭＦで処理する。この処理をさらに２回繰り返
し、樹脂をＤＭＦで１分間に５回洗浄する。ＤＭＦ中に
溶解した３１５ｍｇ（２．５当量）のＨＢＴＵおよび１
２４ｍｇ（２．５当量）のＨＯＢＴを樹脂に添加する
と、それとともにほぼ同質に形成することが可能にな
る。Ｎ−末端終端および側鎖をすでに形成したジスルフ
ィド架橋で完全に保護した１．０５ｇ（２．５当量）の
ペプチド１−１０を可及的最低量のＤＭＦに溶解し、樹
脂に添加する。最後に２９６μｌ（５当量）のＤＩＥＤ
を添加する。樹脂を十分に振盪させて、同質にする。こ
の反応はオレンジ色を呈する。樹脂のアリコートに対す
る１時間３０分後カイザー試験は、陰性であり、取込み
反応は完全であったと見なすことができる。樹脂を濾過
し、ＤＭＦで繰り返し洗浄した。
【００８４】例 １２ 樹脂の切除およびヘプチド １−３２の脱保護。Cis-Se
r-Asn-Leu-Ser-Thr-Cis-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-ArgThr-Asn-Thr
-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2（サケカルシトニ
ン）の獲得。
r-Asn-Leu-Ser-Thr-Cis-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-ArgThr-Asn-Thr
-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2（サケカルシトニ
ン）の獲得。
【００８５】ペプチド−樹脂
【００８６】
【化２７】
【００８７】が完全に乾燥していれば、（９５：３：２
の）ＴＦＡ／ＤＣＭ／アニソールで室温で２時間処理す
る。濾液を１００ｍｌの乾燥した冷ジエチルエーテルに
注入する。獲得した白色沈殿物を遠心分離する。遠心分
離して得た固体をジエチルエーテルで再び懸濁して、さ
らに遠心分離する。この操作をさらに５回繰り返す。最
後に獲得した固体を乾燥させる。これを１０％ＡｃＯＨ
に溶解し、Ａ液には水０．０５％のＴＦＡ、Ｂ液にはア
セトニトリル０．０５％を用いて、Ｂ液の勾配を５−５
６％にし、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８の１５−２０μｍで、２
５ｘ１ｃｍのカラムに調製したＨＰＬＣにかけて精製す
る。
の）ＴＦＡ／ＤＣＭ／アニソールで室温で２時間処理す
る。濾液を１００ｍｌの乾燥した冷ジエチルエーテルに
注入する。獲得した白色沈殿物を遠心分離する。遠心分
離して得た固体をジエチルエーテルで再び懸濁して、さ
らに遠心分離する。この操作をさらに５回繰り返す。最
後に獲得した固体を乾燥させる。これを１０％ＡｃＯＨ
に溶解し、Ａ液には水０．０５％のＴＦＡ、Ｂ液にはア
セトニトリル０．０５％を用いて、Ｂ液の勾配を５−５
６％にし、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８の１５−２０μｍで、２
５ｘ１ｃｍのカラムに調製したＨＰＬＣにかけて精製す
る。
【００８８】
【発明の効果】したがって、本発明によるサケカルシト
ニンは、樹脂上で簡便に保護および固定したサケカルシ
トニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサペプ
チドであるフラグメント１を、２システイン間に予め形
成したジスルフィドを用いて簡便に保護したサケカルシ
トニン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドであ
るフラグメント２で縮合し、完全なペプチド骨格である
フラグメント６を酸を用いて完全に脱保護したペプチド
を樹脂から遊離させることにより、脱保護の条件が緩や
かになり、精製過程が単純になるので、収率コストを低
減できるという効果がある。
ニンは、樹脂上で簡便に保護および固定したサケカルシ
トニン配列末端のカルボキサミドに対応するドコサペプ
チドであるフラグメント１を、２システイン間に予め形
成したジスルフィドを用いて簡便に保護したサケカルシ
トニン配列のアミノ基末端に対応するデカペプチドであ
るフラグメント２で縮合し、完全なペプチド骨格である
フラグメント６を酸を用いて完全に脱保護したペプチド
を樹脂から遊離させることにより、脱保護の条件が緩や
かになり、精製過程が単純になるので、収率コストを低
減できるという効果がある。
【図１】本発明のサケカルシトニンの調製過程を示す流
れ図である。
れ図である。
【図２】本発明のサケカルシトニンの調製過程を示す別
の流れ図である。
の流れ図である。
【図３】フラグメント１の調製過程を示す流れ図であ
る。
る。
【図４】フラグメント２の調製過程を示す流れ図であ
る。
る。
フロントページの続き (72)発明者 ゲンマ ヨダス ファレス スペイン国 08003−バルセロナ アルミ ランテ セルベラ 19
Claims (15)
- 【請求項１】 高分子担体上で固相合成を行ない、収斂
方法で結合したFmoc/tBu型の保護基を介在させて、サケ
カルシトニンおよびその薬理学的に許容できる酸付加塩
またはその錯体の獲得するためのサケカルシトニン調製
方法において、 （ａ）サケカルシトニン配列のカルボキサミド末端に対
応するドコサペプチドを含み、樹脂上で簡便に保護し固
定したフラグメント１と、 【化１】 サケカルシトニン配列のアミノ基末端に対応するデカペ
プチドであり、簡便に保護され、２システイン間に予め
形成したジスルフィド架橋を用いて、 【化２】 で表わされるフラグメント２と共に縮合するステップ
と、 （ｂ） 生成ペプチド樹脂であり、 【化３】 で表わされるフラグメント６を側鎖の脱保護と該樹脂の
排除を同時に行ない、生成後化学的に純粋なサケカルシ
トニンとなるペプチドを獲得するステップと、を有する
ことを特徴とするサケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項２】 樹脂由来のフラグメント６からの排除を
カルボカチオン金属イオン封鎖剤存在中に酸で処理する
ことによって実行することを特徴とする請求項１記載の
サケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項３】 ステップ（ａ）においてフラグメント１
は、 【化４】 で表わされるフラグメント３に対応するフラグメント２
の前駆物質で選択的に縮合され、 【化５】 で表わされ、固相中で選択的に酸化され、樹脂脱保護に
処理及び樹脂排除処理後に化学的に純粋なサケカルシト
ニンを獲得するフラグメント６を獲得するように２シス
テイン間でジスルフィド架橋を形成するフラグメント７
に対応するペプチド樹脂を獲得することを特徴とする請
求項１記載のサケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項４】 フラグメント７の酸化によるフラグメン
ト６の獲得を好ましくはヨウ素を用いて行なうことを特
徴とする請求項３記載のサケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項５】 内標準および架橋基を該樹脂とアミノ酸
配列との間に取込むことによって、フラグメント１をｐ
ＭＢＨＡ樹脂から獲得した後、線状合成を残部ごとに２
２のアミノ酸が取り込まれるまで行なうことを特徴とす
る請求項１または３記載のサケカルシトニンの調製方
法。 - 【請求項６】 好ましくはＰＡＬまたはＡＭを架橋基と
して用い、好ましくはアミノ酸Ｉｌｅを内標準として使
用することを特徴とする請求項５記載のサケカルシトニ
ンの調製方法。 - 【請求項７】 ２２のアミノ酸各々の線状合成中、保護
基Fmocをすべての場合にアミノ基末端に用い、側鎖 Ly
s、Ser、Thr、Tyr、Arg、Glu、His、GlnおよびAsnに対して請求
項１記載のフラグメント１の式中に前記側鎖に対して示
した保護基を使用することを特徴とする請求項５記載の
サケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項８】 フラグメント２のpMBHA樹脂からの獲得
を、内標準としてのIle基および架橋基としてのＨＭＰ
Ｂ基を該樹脂とアミノ酸配列との間に取込むことによっ
て行ない、残部ごとに線状合成を１０のアミノ酸を取込
むまで行なう一方、最終アミノ酸以外のすべての場合に
アミノ基末端に対してFmoc保護基を用い、最終アミノ酸
にBoc基を使用し、側鎖Ser、Thr、CysおよびAsn対して表
示した保護基であり前記側鎖を用いて、 【化６】 で表わされるフラグメント４を使用することによって、
システイン残部の２保護基をヨウ素で脱保護化および酸
化を同時に行なった後、 【化７】 で表わされるフラグメント５がペプチド−樹脂結合の切
断後フラグメント２を生成することを特徴とする請求項
１記載のサケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項９】 フラグメント４のペプチド樹脂結合を切
断し、 【化８】 で表わされるフラグメント３を獲得することによって、
ヨウ素で酸化させてフラグメント２を生成することを特
徴とする請求項１記載のサケカルシトニンの調製方法。 - 【請求項１０】 樹脂上に保護および固定し、 【化９】 の配列および構造から成り、Boc、tBu、TrtおよびPmcが
表示のアミノ酸残部に対する保護基であり、 【化１０】 であることを特徴とするサケカルシトニンの合成におい
て使用する新規のペプチドフラグメント。 - 【請求項１１】 樹脂上に保護および固定した 【化１１】 で表わされる配列および構造から成るフラグメント４で
あり、Boc、Acm、tBuおよびTrtが表示のアミノ酸残部に
対する保護基であり、(R)が請求項１０で定義したもの
であることを特徴とするサケカルシトニンの合成におい
て使用する新規のペプチドフラグメント。 - 【請求項１２】 樹脂上に保護および固定した 【化１２】 で表わされる配列および構造から成り、BocおよびtBuが
表示のアミノ酸残部に対する保護基であり、（Ｒ）が請
求項１０で定義したものであることを特徴とするサケカ
ルシトニンの合成において使用する新規のペプチドフラ
グメント。 - 【請求項１３】 樹脂上に保護および固定した 【化１３】 で表わされる配列および構造から成り、Boc、tBu、tRt
およびPmcが表示のアミノ酸残部の保護基であり、
（Ｒ）が請求項１０で定義したものであることを特徴と
するサケカルシトニンの合成において使用する新規のペ
プチドフラグメント。 - 【請求項１４】 樹脂上に保護および固定した 【化１４】 で表わされる配列および構造から成り、Boc、Acm、tB
u、TrtおよびＰｍｃが表示のアミノ酸残部に対する保護
基であり、（Ｒ）が請求項１０で定義したものであるこ
とを特徴とするサケカルシトニンの合成において使用す
る新規のペプチドフラグメント。 - 【請求項１５】 前記フラグメント１、２、３、４、
５、６および７に対応し、サケカルシトニンの合成に関
し、請求項１乃至請求項９に記載した新規のペプチドの
使用方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES9202510 | 1992-12-10 | ||
| ES09202510A ES2051647B1 (es) | 1992-12-10 | 1992-12-10 | Procedimiento para la preparacion de calcitonina de salmon. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06234793A true JPH06234793A (ja) | 1994-08-23 |
Family
ID=8279077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5310857A Pending JPH06234793A (ja) | 1992-12-10 | 1993-12-10 | サケカルシトニンの調製方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5527881A (ja) |
| EP (1) | EP0606816B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06234793A (ja) |
| DE (1) | DE69325987T2 (ja) |
| ES (1) | ES2051647B1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014162722A (ja) * | 2013-02-21 | 2014-09-08 | Chemical And Biopharmaceutical Labolatories Of Patra Sa | 側鎖結合を介する固相ペプチド合成 |
| US10183966B2 (en) | 2013-02-21 | 2019-01-22 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. | Solid phase peptide synthesis via side chain attachment |
| JP2020138975A (ja) * | 2020-05-18 | 2020-09-03 | ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー． | 側鎖結合を介する固相ペプチド合成 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997017367A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-15 | Theratechnologies Inc. | Method of grf peptides synthesis |
| US5962270A (en) | 1996-02-06 | 1999-10-05 | Bionebraska, Inc. | Recombinant preparation of calcitonin fragments and use thereof in the preparation of calcitonin and related analogs |
| ATE328004T1 (de) * | 1996-02-09 | 2006-06-15 | Hoffmann La Roche | Herstellung eines vip-analogen |
| AU4401097A (en) * | 1997-09-18 | 1999-04-05 | Hyundai Pharm. Ind. Co., Ltd. | Amino acid derivatives |
| AU782304B2 (en) * | 1999-09-02 | 2005-07-14 | Acologix, Inc. | Methods and compositions for reducing serum phosphate levels |
| BRPI0706400A2 (pt) * | 2006-01-17 | 2011-03-29 | Organon Nv | processos para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres c-terminais de substratos de peptìdeo, para a sìntese convergente de um peptìdeo de dois ou mais fragmentos de peptìdeo, para a sìntese enzimática por etapas de um peptìdeo na direção do terminal c, e para a sìntese de peptìdeo |
| CN104177490B (zh) * | 2014-08-25 | 2017-02-08 | 兰州大学 | 片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4159981A (en) * | 1968-08-23 | 1979-07-03 | Ciba-Geigy Corporation | Peptides and process for their manufacture |
| JPS5716977B2 (ja) * | 1972-12-07 | 1982-04-08 | ||
| US3988309A (en) * | 1973-12-27 | 1976-10-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | EEL calcitonin |
| US3926938A (en) * | 1974-08-12 | 1975-12-16 | Armour Pharma | Synthesis of salmon calcitonin |
| US3929758A (en) * | 1974-09-12 | 1975-12-30 | Armour Pharma | Cyclization of cysteine-containing peptides |
| US4318905A (en) * | 1980-06-23 | 1982-03-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Nonapeptide and decapeptide agonists of luteinizing hormone releasing hormone containing heterocyclic amino acid residues |
| US4659804A (en) * | 1984-11-01 | 1987-04-21 | Armour Pharmaceutical Company | (Bis-1,7-S-acetamidomethyl-L-cysteine)salmon calcitonin |
| US4606856A (en) * | 1985-03-18 | 1986-08-19 | Seyler Jay K | [Des-1-amino, 8-glycine]calcitonin |
| US4804742A (en) * | 1985-06-06 | 1989-02-14 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Amide analogs of calcitonin |
| US4644054A (en) * | 1985-10-01 | 1987-02-17 | Kempe Tomas G | Calcitonin analogs with amino acid substituents at position 31 |
| HUT44794A (en) * | 1985-12-04 | 1988-04-28 | Sandoz Ag | Process for production of calcitonine-derivatives and medical preparatives containing such compounds |
| JPH02262595A (ja) * | 1988-02-29 | 1990-10-25 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ポリペプチド誘導体 |
| US5175146A (en) * | 1989-12-05 | 1992-12-29 | Vical, Inc. | Synthetic calcitonin peptides |
| CS89491A3 (en) * | 1990-04-09 | 1992-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Hybrid calcitonin |
-
1992
- 1992-12-10 ES ES09202510A patent/ES2051647B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1993
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Cited By (3)
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