CN117567566B - 一种环六肽-9的液相合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环六肽‑9的液相合成工艺，属于环形肽合成技术领域，本发明通过液相合成的方法制备的环六肽‑9，通过Cbz‑Gly‑Pro‑OH，H‑Gln(Trt)‑OMe·HCl在缩合剂的作用下来间接制备Cyclo(Gly‑Pro‑Gln(Trt)‑Gly‑Pro‑Gln(Trt))，避免了价格高昂的Fmoc保护氨基酸的使用，大幅度降低了生产周期，降低了废液的产生，降低了生产成本，能够解决H‑Gly‑Pro‑Gln(Trt)‑Gly‑Pro‑Gln(Trt)‑OH可以分子内反应，也可以分子间发生反应导致杂质含量较高的问题。
Description
技术领域：
本发明属于环形肽合成技术领域，更具体地涉及一种环六肽-9的液相合成工艺。
背景技术：
环肽类化合物作为一种海洋药物越来越受到科学家们的关注，是因为环肽可以利用不同氨基酸的连接形成新的独特结构并具有优良的生物活性，为新型药物的开发与研究提供重要的指导作用(Y.Lee et al.Peptides 95(2017)94–105；Tapeinou Aetal.Biopolymers,2015,104(5):453-461)。虽然在自然界中分离得到的环肽结构很多，但其产量远远不能满足实际应用，所以人工合成环肽是现在最热的课题之一。
环化肽可以与具有比线性类似物更高的亲和力的靶标结合，环肽通常优于线性肽成员。环化时较高的亲和力可以用熵效应来解释。由于环肽的柔韧性低于溶液中的线性前体，因此靶标结合时的熵损失较低。环肽的显著特性之一是与线性肽相比，它们对酶降解的保护增强。此外，通过其末端氨基酸环化的肽受到保护，免受从末端分解肽的外切肽酶的影响。为了穿过膜的非极性区域，肽的极性基团(例如肽键的氢(H)键供体)需要脱溶剂，这构成了能量屏障。有趣的是，大自然也适应了这一点，因为环化可以促进肽内分子内H键的形成，减少溶剂化，同时掩埋一些极性表面，从而增加膜渗透性的可能性。在线性肽中，分子内H键也是可能的，但在熵上不太受欢迎。
上海上美化妆品股份有限公司的黄虎博士首次提出了环肽在美容肽领域的应用，专利号CN116284256A、申请号202210087176.X披露了环肽在美容肽领域的应用前景及优越性。更具体一点是证明了环六肽-9
(Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln))在皮肤抗皱和紧致方面都具有比线性六肽-9更加杰出的功效，比如环六肽-9能显著促进CollagenⅢ和Integrinβ4的表达，而线性六肽-9对CollagenⅢ和Integrinβ4却没有促进作用；同时环六肽-9具有更低的细胞毒性，更好的皮肤渗透性，在护肤方面也具有很好的功效，在化妆品领域具有巨大的应用前景，所以开发一个可以大量公斤级生产高质量环六肽-9的工艺非常迫切。
现有合成环六肽-9的技术路线(公布号：CN116162135B、公布号：CN116284256A、公布号：CN114790228B)基本上都采用固相合成法合成中间体H-Gl y-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，然后再环合形成Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gl y-Pro-Gln(Trt))，再脱Trt保护基得到环六肽-9。上述专利路线因涉及固相合成，原料成本高，后处理过程比较繁琐，合成周期长，废液量大。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种环六肽-9的液相合成工艺，能够有效的解决现有合成环六肽-9的技术路线因涉及固相合成，原料成本高，后处理过程比较繁琐，合成周期长，废液量大的问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：环六肽-9的液相合成工艺，其特征在于所述环六肽-9的合成工艺包括：
步骤1：中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的合成；
向反应器中，加入成环反应溶剂和H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，再加入缩合剂，滴加碱，在20-25度反应，待反应完后，外温50-55度浓缩反应液得到固体，将固体用乙醇溶解，控制内温0-5度，滴加醋酸丁酯，抽滤，滤饼干燥，得到中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))；
其中，H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：(0.8-1.2)：3；
步骤2：环六肽-9即Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)的合成；
向反应器中，加入反应溶剂、碳正离子捕获剂和中间体
Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，在5-10度，滴入TFA，待反应完后，将反应液滴到乙酸乙酯中，过滤，滤饼干燥后得到环六肽-9。
进一步地，所述环六肽-9的化学式为Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)，结构式为：
进一步地，所述碳正离子捕获剂为TIPS。
进一步地，所述成环反应溶剂为DCM或THF，反应溶剂为DCM或THF。
进一步地，所述步骤1中：所述成环反应溶剂和
H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为(650-750):1；
所述步骤2中反应溶剂和Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的重量比为(1-2):1。
进一步地，所述步骤2中，TFA和反应溶剂的重量比为1:(1-1.2)；乙酸乙酯的量和反应溶剂的比例为(5-6):1。所述碳正离子捕获剂与中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的重量比为(20-35):100。
其中，还包括原料H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成方法：
(1)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
(2)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
(3)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
(4)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
(5)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
(6)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成。
具体地，所述H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成方法包括：
(1)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂，然后依次加入Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln(Trt)-OMe·HCl，温度保持0-5度，加入缩合剂，滴加碱，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-OH的质量比例为(3-4):1；
Cbz-Gly-Pro-OH：H-Gln(Trt)-OMe·HCl：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：(1.2-1.5)：1：3；所述水和第一溶剂的质量比为10:1；
(2)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂，加入Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，调pH至12.0-12.5，在50-55度反应，待反应完后，加入水，调节pH为3.5-4.0，析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的质量比例为1:(0.8-1.2)；
(3)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和催化剂，通入氢气，60-65度，待反应完，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥；
所述第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为(2-3):1；
所述催化剂为钯碳，所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和钯碳的重量比为(80-120):1；
(4)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂、Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和
H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温度保持0-5度，加入缩合剂，滴加碱，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为(3-4):1，所述缩合剂为HBTU或HATU或T3P；
所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：1：1：3，所述第一溶剂和水的比例为1:10。
(5)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温度50-55度，调pH至12.0-12.5之间，待反应完后，加入水，用酸调节pH为3.5-4.0，析出白色固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为(0.5-2):1，水的体积是第二溶剂的5倍；
(6)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，依次加入
Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，催化剂，通入氢气，60-65度，待反应完后，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥后得到
H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH；
所述催化剂为钯碳，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和钯碳的重量比为100:(1.5-2.5)；
所述第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为(2-3):1。
进一步地，所述第一溶剂为DMF或THF或乙腈，所述第二溶剂为乙醇水溶液、甲醇水溶液、THF水溶液；
所述乙醇水溶液中水：乙醇＝1:1；甲醇水溶液中水：甲醇＝1:1；THF水溶液中水：THF＝1:1；所述第三溶剂为甲醇或乙醇。
进一步地，所述缩合剂为HBTU或HATU或T3P；所述碱为NMM或DIPEA。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过液相合成的方法制备的环六肽-9，避免了价格高昂的Fmoc保护氨基酸的使用，大幅度降低了生产周期，降低了废液的产生，降低了生产成本；
(2)本发明创造性地通过Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln(Trt)-OMe·HCl在缩合剂的作用下来间接制备Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，能够解决H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH可以分子内反应，也可以分子间发生反应导致杂质含量较高的问题。
(3)本发明创造性地氨基用Cbz保护，Cbz保护氨基的优势在于活化时不易消旋，或可用多种温和的方法选择性地脱去。羧基用甲酯保护，谷氨酰胺侧链用Trt保护，三者保护基的各自的去除都互不影响，从而提高中间产物的纯度，减轻纯化压力，进而提高总收率。其次谷氨酰胺侧链用Trt保护，增大了谷氨酰胺的脂溶性，降低了H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的水溶性，使H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH能够顺利的从水中析出，副产物能够留在水中，使H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH能够顺利纯化并大大提高目标产物收率,同时加入碳正离子捕获剂，降低了在脱Trt过程中副反应产生，尤其是配合低浓度的H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH从而提高了收率和产物纯度；
(4)本发明创造性地利用环六肽-9中的重复片段Gly-Pro-Gln，设计了关键中间体Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，其中三个保护基各不相同，可以分别脱掉Cbz和甲酯保护基得到两个中间体Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH、H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，然后再把两个中间产物的两个片段接在一块，得到Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，缩短产物制备的步骤，减轻产物合成的压力。
附图说明：
附图1是本发明中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图2是本发明中对比例2中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图3是本发明中对比例3中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图4是本发明中对比例4中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图5是本发明中对比例7中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图6是本发明中对比例10中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图7是本发明中对比例11中环六肽-9的纯度图谱示意图；
附图8是本发明中对比例12中Cbz-Gly-Pro-Gln-OMe的化学反应式；
附图9是本发明中环六肽-9的核磁氢谱示意图；
附图10是本发明中环六肽-9的质谱示意图；
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
为了更好的理解本发明特以具体的实施例进行说明，值得强调的是该实施例的效果与本发明保护范围内的各种实施例，包括各自试剂及试剂的含量配比无实质性差异，均能够实现本发明所描述的效果及解决上述问题，其他组合在此不做累述；
Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))：
一种环六肽-9的液相合成工艺，合成工艺包括：
步骤1：中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的合成；
具体地，向反应器中，加入成环反应溶剂，成环反应溶剂为DCM或THF，其中按照成环反应溶剂和原料H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为650:1至750:1，加入缩合剂，滴加碱NMM或DIEA，滴完，20-25度反应。
其中H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：(0.8-1.2)：3；。
经HPLC检测反应完后，外温50-55度浓缩反应液，将得到的固体用2倍重量的乙醇溶解，控制内温0-5度，滴加是乙醇2倍重量的醋酸丁酯，抽滤，滤饼干燥后重1.32g，收率89.5％。
步骤2：Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)的合成；
具体地，向反应器中，加入反应溶剂，反应溶剂为DCM或THF，再加入碳正离子捕获剂TIPS和Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，在5-10度，滴入TFA，待反应完后，将反应液滴到乙酸乙酯中，过滤，滤饼干燥后得到Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)，即环六肽-9。
其中，反应溶剂与中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的重量比为(1-2):1；
TFA和反应溶剂的重量比为1:(1-1.2)；
乙酸乙酯的量和反应溶剂的比例为(5-6):1。
所有附图中实施例的HPLC纯度检测，均在在同一检测体条件下进行。HPLC检测方法：色谱柱型号：C18 Super 5um 4.6*250mm(W)；进样量：10uL；柱温25度，检测波长：220nm；流量：1ml/min；0-20min-25min-30min乙腈：2％-98％-98％-2％，水和乙腈都含有千分之一的三氟乙酸。
为了更加直观的展现本发明的液态合成工艺优势，特以本发明采用液相合成的方法制备的环六肽-9和相同工艺采用等效替换的方法进行对比，
对比例1：
制备方法同实施例，所不同的是：采用援引的方式CN116162135B，以采用固相合成法合成H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，然后再环合形成Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，再脱Trt得到环六肽-9；
对比例2：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，未添加碳正离子捕获剂；
对比例3：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将碳正离子捕获剂换为乙二硫醇；
对比例4：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将碳正离子捕获剂换为苯甲硫醚；
表1：不同工艺制备环六肽-9产品指标对比
| 合成方法 | 碳正离子捕获剂 | 收率 | 纯度 | 反应周期 | |
| 实施例 | 液相合成法 | TIPS | 97.2％ | 98.6％ | 7d |
| 对比例1 | 固相合成法 | TIPS | 文献没有描述 | 文献没有描述 | 21d |
| 对比例2 | 液相合成法 | - | 60.44％ | 97.6％ | 7d |
| 对比例3 | 液相合成法 | 乙二硫醇 | 80.3％ | 98.4％ | 7d |
| 对比例4 | 液相合成法 | 苯甲硫醚 | 83.44％ | 98.2％ | 7d |
由表1数据可知：
(1)实施例和对比例1:避免了对比文献中固相合成法高昂的Fmoc保护氨基酸的使用，大幅度降低了生产周期，由21天缩短至7天，降低了废液的产生，降低了生产成本。
(2)实施例和对比例2相比，由于反应液中没有碳正离子捕获剂的加入，导致在脱Trt过程中副反应较多，从而降低了收率和产物纯度。
(3)实施例和对比例3和4相比，碳正离子捕获剂TIPS收率高，产品纯度高，其它碳正离子捕获剂如乙二硫醇、苯甲硫醚，会导致产品收率降低，纯度降低。
为了更加直观的展现本发明的缩合剂工艺优势，特以本发明采用液相合成的方法制备的环六肽-9和相同工艺采用等效替换的方法进行对比，
对比例5：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤1中未添加缩合剂；
对比例6：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤1将原料H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH替换成购买的H-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-OH；
对比例7：
制备方法同实施例，所不同的是：成环反应溶剂和
H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例由(650-750):1替换成15:1。
表2：不同工艺制备环六肽-9产品指标对比
由表2数据分析可知：
(1)实施例与对比例5相比；
由于对比例5中反应过程中没有添加缩合剂，导致反应无法进行。
(2)实施例与对比例6相比；
将原料H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH替换成公司现有产品H-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-OH；
由于替换的原料缺少Trt保护基，虽然加入缩合剂，但是原料溶解度极低，侧链酰胺无保护产生的副反应较多，没有继续处理的必要。
(3)实施例与对比例7相比；
对比例7经HPLC检测，反应液成分很杂，没有继续处理的必要，这可能是由于H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH在此条件下会发生严重的副反应，反应液很杂，没有继续处理的必要。
为了更加直观的展现本发明的工艺成环反应溶剂和结晶溶剂的优势，特以本发明采用液相合成的方法制备的环六肽-9和相同工艺采用等效替换的方法进行对比，
对比例8：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将成环反应溶剂替换成DMF；
对比例9：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将成环反应溶剂替换成醋酸；
对比例10：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将步骤2中乙酸乙酯替换成THF；
对比例11：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将步骤2中乙酸乙酯替换成DCM；
表3：不同工艺制备环六肽-9产品指标对比
| 环反应溶剂 | 精制溶剂 | 过滤难度 | 收率 | 纯度 | |
| 实施例 | DCM或THF | 乙酸乙酯 | 易 | 97.2％ | 98.6％ |
| 对比例8 | DMF | 乙酸乙酯 | 易 | 10.3％ | - |
| 对比例9 | 醋酸 | 乙酸乙酯 | - | - | - |
| 对比例10 | DCM或THF | THF | 难 | 71％ | 98.2％ |
| 对比例11 | DCM或THF | DCM | 难 | 90.3％ | 95.6％ |
由表3数据分析可知：
(1)实施例与对比例7相比；
由于环反应溶剂替换成DMF，DMF的沸点较高，在DMF浓缩过程中温度较高，导致了生成的产物被破坏，严重影响了收率和纯度；
(2)实施例与对比例8相比；
由于环反应溶剂替换成醋酸，由于醋酸和原料成盐反应，导致不能缩合成环，最终导致反应不能进行；
(3)实施例与对比例9、10相比，
结晶溶剂乙酸乙酯相对于其他精制溶剂来说，THF做为结晶溶剂抽滤困难，DCM做为结晶溶剂产物纯度相对低。
作为本发明的优选实施方案，
本发明还可以包括原料H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的制备，解决的问题是：固相合成多肽过程中，合成周期长，原料种类多、成本高，后处理过程比较繁琐，废液量大；
所述H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成方法包括：
(1)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂，第一溶剂为DMF或THF或乙腈，然后依次加入Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln(Trt)-OMe·HCl，温度保持0-5度，加入缩合剂，缩合剂为HBTU或HATU或T3P，滴加碱，碱为NMM或DIPEA，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
其中，第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-OH的质量比例为(3-4):1；Cbz-Gly-Pro-OH：H-Gln(Trt)-OMe·HCl：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：(1.2-1.5)：1：3。
(2)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂，加入Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，调pH至12.0-12.5，在50-55度反应，待反应完后，加入水，调节pH为3.5-4.0，析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥；
其中，所述第二溶剂为乙醇水溶液、甲醇水溶液、THF水溶液；
进一步地，乙醇水溶液中水：乙醇＝1:1，甲醇水溶液中水：甲醇＝1:1、THF水溶液中水：THF＝1:1；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的质量比例为1:(0.8-1.2)；
(3)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和催化剂，通入氢气，60-65度，待反应完，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥；
第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为(2-3):1；
所述催化剂为钯碳，所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和钯碳的重量比为(80-120):1；
(4)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂，第一溶剂为DMF或THF或乙腈；然后加入Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温度保持0-5度，加入缩合剂，缩合剂为HBTU或HATU或T3P；滴加碱，碱为NMM或DIPEA；待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为(3-4):1，
所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：1：1：3；
(5)Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温度50-55度，调pH至12.0-12.5之间，待反应完后，加入水，用酸调节pH为3.5-4.0，析出白色固体，抽滤，滤饼干燥；
其中，第二溶剂为乙醇水溶液、甲醇水溶液、THF水溶液；
所述乙醇水溶液中水：乙醇＝1:1，甲醇水溶液中水：甲醇＝1:1，THF水溶液中水：THF＝1:1；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为(0.5-2):1；
(6)H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，第三溶剂为甲醇或乙醇，依次加入Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，催化剂，通入氢气，60-65度，待反应完后，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥后得到
H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH；
所述催化剂为钯碳，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和钯碳的重量比为100:(1.5-2.5)；
所述第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为(2-3):1。
这样，本发明Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe利用不同的原理，分别脱掉不同的保护基得到两个中间产物Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH、H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，然后再把Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH、H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe这两个片段接在一块，得到Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe；
这样充分利用产物本身的特点，利用一种原料获得了两种中间体，并进一步地，利用获得的两种中间体接在一块得到
Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe；缩短产物制备的步骤，
为了更加直观的展现本发明的原料合成的工艺优势，特以本发明采用液相合成的方法制备的环六肽-9和相同工艺采用等效替换的方法进行对比，
对比例12：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，将Gln(Trt)-OMe·HCl换为市购的Gln-OMe·HCl，合成Cbz-Gly-Pro-Gln-OMe，这样去掉Gln(Trt)-OMe·HCl中侧链酰胺的保护基Trt，如下：
表4：不同工艺制备Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和Cbz-Gly-Pro-Gln-OMe的产品指标对比
| 合成方法 | Gln(Trt)-OMe·HCl | 产物收率 | |
| 实施例 | 液相合成法 | 保留侧链酰胺的保护基Trt | 97.2％ |
| 对比例12 | 液相合成法 | 去掉中侧链酰胺的保护基Trt | 16.1％ |
由表3数据分析可知：
(1)实施例和对比例12相比：
实施例和对比例12相比：由于将Gln(Trt)-OMe·HCl换为市购的Gln-OMe·HCl，去掉Gln(Trt)-OMe·HCl中侧链酰胺的保护基Trt，导致产物的水溶性增加，收率大大降低，不利于后处理。
综上所述：
(1)本发明通过液相合成的方法制备的环六肽-9，避免了价格高昂的Fmoc保护氨基酸和树脂的使用，大幅度降低了生产周期，降低了废液的产生，降低了生产成本；
(2)本发明创造性地通过Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln-OMe·HCl在缩合剂的作用下来间接制备Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，能够解决H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH它可以分子内反应，也可以分子间发生反应导致杂质含量较高的问题。
(3)本发明创造性地氨基用Cbz保护，羧基用甲酯保护，谷氨酰胺侧链用Trt保护，三者保护基的各自的去除都互不影响，从而提高中间产物的纯度，减轻纯化压力，进而提高总收率。其次谷氨酰胺侧链用Trt保护，增大了谷氨酰胺的脂溶性，降低了H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的水溶性，使H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH能够顺利的从水中析出，副产物能够留在水中，使H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH能够顺利纯化并大大提高目标产物收率,同时加入碳正离子捕获剂，降低了在脱Trt过程中副反应产生，尤其是配合低浓度的H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH从而提高了收率和产物纯度。
(4)本发明创造性地利用环六肽-9中的重复片段Gly-Pro-Gln，设计了关键中间体Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，其中三个保护基各不相同，可以分别脱掉Cbz和甲酯保护基得到两个中间体Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH、H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，然后再把两个中间产物的两个片段接在一块，得到Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，缩短产物制备的步骤，减轻产物合成的压力。
Claims (7)
1.一种环六肽-9的液相合成工艺，其特征在于所述环六肽-9的合成工艺包括：
步骤1：中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的合成；
向反应器中，加入成环反应溶剂：DCM或THF和H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，所述成环反应溶剂和H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为（650-750）:1，再加入缩合剂，滴加碱，在20-25 ℃反应，待反应完后，外温50-55 ℃浓缩反应液得到固体，将固体用乙醇溶解，控制内温0-5 ℃，滴加醋酸丁酯，抽滤，滤饼干燥，得到中间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))；所述H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的液相合成方法包括：
（1）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂，然后依次加入Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln(Trt)-OMe·HCl，温度保持0-5度，加入缩合剂，滴加碱，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-OH 的质量比例为（3-4）:1；Cbz-Gly-Pro-OH：H-Gln(Trt)-OMe·HCl：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：（1.2-1.5）：1：3；
（2）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
（3）H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
（4）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
（5）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
（6）H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
步骤2：环六肽-9的合成；
向反应器中，加入反应溶剂：DCM或THF、碳正离子捕获剂为TIPS和中
间体Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))，在5-10 ℃，滴入TFA，待反应完后，将反应液滴到乙酸乙酯中，过滤，滤饼干燥后得到环六肽-9。
2.根据权利要求1所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述环六肽-9的化学式为Cyclo(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln)，结构是为：
。
3.根据权利要求1所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述步骤1中：H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：（0.8-1.2）：3；
所述步骤2中反应溶剂和Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的重量比为（1-2）:1。
4.根据权利要求3所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述步骤2中，TFA和反应溶剂的重量比为1:（1-1.2）；乙酸乙酯和反应溶剂的重量比为（5-6）:1，所述碳正离子捕获剂与中间体
Cyclo(Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt))的重量比为（20-35）:100。
5.根据权利要求4所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成方法包括：
（1）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂，并加入Cbz-Gly-Pro-OH，H-Gln(Trt)-OMe·HCl，温 ℃保持0-5 ℃，加入缩合剂，滴加碱，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-OH的质量比例为（3-4）:1；
Cbz-Gly-Pro-OH：H-Gln(Trt)-OMe·HCl：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：（1.2-1.5）：1：3；
（2）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂，加入 Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，调pH至12.0-12.5，在50-55 ℃反应，待反应完后，加入水，调节pH为3.5-4.0，析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的质量比例为1:（0.8-1.2）；
（3）H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和催化剂，通入氢气，60-65℃，待反应完，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥；
第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为（2-3）:1；
所述催化剂为钯碳，所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe和钯碳的重量比为（80-120）:1；
（4）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的合成；
向反应器中，加入第一溶剂、Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温 ℃保持0-5 ℃，加入缩合剂，滴加碱，待反应完后，将反应液滴到水中，析出固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第一溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为（3-4）:1，所述缩合剂为HBTU或HATU或T3P；
所述Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH：H-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe：缩合剂：碱之间的摩尔比例为1：1：1：3；
（5）Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe，温 ℃50-55 ℃，调pH至12.0-12.5之间，待反应完后，加入水，用酸调节pH为3.5-4.0，析出白色固体，抽滤，滤饼干燥；
所述第二溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OMe的重量比例为（0.5-2）:1；
（6）H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的合成；
向反应器中，加入第三溶剂，依次加入Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH，催化剂，通入氢气，60-65 ℃，待反应完后，抽滤反应液，滤液浓缩、干燥后得到H-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH；
所述催化剂为钯碳，Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH和钯碳的重量比为100:（1.5-2.5）；
所述第三溶剂和Cbz-Gly-Pro-Gln(Trt)-Gly-Pro-Gln(Trt)-OH的重量比例为（2-3）:1。
6.根据权利要求5所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述第一溶剂为DMF或THF或乙腈，所述第二溶剂为乙醇水溶液、甲醇水溶液、THF水溶液；
所述乙醇水溶液中水：乙醇=1:1、甲醇水溶液中水：甲醇=1:1、THF水溶液中水：THF=1:1；所述第三溶剂为甲醇或乙醇。
7. 根据权利要求1-6任意一项所述的环六肽-9的合成工艺，其特征在于所述缩合剂为HBTU或HATU或T3P ；所述碱为NMM或DIPEA。
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