CN107827956B - 一种活性环八肽Reniochalistatin E及其类似物的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种活性环八肽Reniochalistatin E及其类似物的合成方法。本发明的环八肽的全合成方法采用的是多肽固相合成法，大大缩减了合成时间和纯化工序；为防止色氨酸吲哚氮上的氢可能引起连接率降低和副产物的增多，采用吲哚上带碳酰叔丁基(Boc)保护的色氨酸为原料，最后环合结束后再用高体积比的TFA/DCM溶液脱Boc保护获得最终产物。与传统的缩合试剂和环合试剂，本发明采用的缩合试剂DEPBT和DIEA、环合试剂PyBOP大大减少反应过程引起的消旋和对使用者身体的毒性危害。本发明的合成工艺简单，原料成本低，反应条件温和，纯度高，易于产业化，具有广阔的市场前景。

Description

一种活性环八肽Reniochalistatin E及其类似物的合成方法
技术领域
本发明涉及一个具有广泛抗肿瘤活性化合物，具体讲是一种活性环八肽Reniochalistatin E及其类似物的合成方法。
背景技术
海洋药物越来越受到科学家们关注，特别是其中的环肽，环肽在生物体内具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗菌以及酶抑制的活性(Tripathi A,Puddick J.J.Nat Prod,2010,73(11)1810-1814)，因为在自然界分离获得的环肽量非常少，远远不能满足实际应用，所以人工合成多肽成为现在最热的课题之一。
Reniochalistatin E是从我国南海西沙永兴岛采集的海绵Reniochalinastalagmitis中分离得到的一种新型环八肽，它对多种癌细胞株系都表现出非常好的活性，如人多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226(IC50＝2.4μM)，人胃癌细胞MGC-803(IC50＝0.1μM)，急髓白血病M3细胞株HL-60(IC50＝0.2μM)，人肝癌细胞HepG2(IC50＝0.4μM)和子宫颈癌细胞株HeLa(IC50＝0.5μM)。(Kai-Xuan Zhan，Hou-Wen Lin，J.Nat Prod 2014,77,2678-2684)正因为其对于广泛的癌细胞都有抑制作用，该化合物可能成为新型的海洋药物。但由于从自然界分离提取的量非常少，所以用合成的方法代替提取分离它的前景非常可观和可行。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种活性环八肽Reniochalistatin E及其类似物的合成方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
Reniochalistatin E是一个天然环八肽，环(脯氨酰-异亮氨酰-脯氨酰-异亮氨酰-缬氨酰-脯氨酰-色氨酰-亮氨酰)【英文缩写表达cyclo-(Pro-Ile-Pro-Ile-Val-Pro-Trp-Leu)】，分子式为C49H73N9O8，白色固体。
本发明的环八肽的全合成方法采用的是多肽固相合成法，为防止色氨酸吲哚氮上的氢可能引起连接率降低和副产物的增多，采用吲哚上带碳酰叔丁基(Boc)保护的色氨酸为原料，最后环合结束后再用高体积比的TFA/DCM溶液脱Boc保护获得最终产物。首先以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，将带Fmoc氨基保护基的氨基酸的羧基一端与树脂链接得以固定，用哌啶/DMF溶液脱去氨基上Fmoc的保护，与下一个经3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)/二异丙基乙胺(DIEA)活化过的氨基酸反应，从而获得二肽-树脂复合物、三肽-树脂复合物，以此类推，最后得到八肽-树脂复合物。接着用TFA的DCM溶液切断树脂，获得色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽，经环合试剂PyBOP环合得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽，最后用高体积比的TFA/DCM溶液，除去色氨酸吲哚上的Boc保护基得到最终产物环八肽Reniochalistatin E。
本发明的化合物参见下式：
Figure BDA0001453751210000021
这种活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，具体包括如下步骤：
(1)Fmoc-Pro-resin：将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)连接到已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂上，得到带Fmoc保护基的脯氨酸-树脂复合物Fmoc-Pro-resin；
(2)树脂封闭：用甲醇和DIEA把2-氯三苯甲基氯树脂上残余的反应位点封闭；
(3)Fmoc-Ile-Pro-resin：将步骤(2)的Fmoc-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的二肽-树脂复合物Fmoc-Ile-Pro-resin；
(4)Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(3)的Fmoc-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的三肽-树脂复合物Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin；
(5)Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(4)的Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的四肽-树脂复合物Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(6)Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(5)的Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基缬氨酸(Fmoc-Val-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的五肽-树脂复合物Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(7)Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(6)的Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的六肽-树脂复合物Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(8)Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(7)的Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基色氨酸(叔丁基碳酰)[Fmoc-Trp(Boc)-OH]进行连接，得到Fmoc保护基的七肽-树脂复合物Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(9)Fmoc-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin：将步骤(8)的Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)进行连接，得到Fmoc保护基的八肽-树脂复合物Fmoc-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(10)树脂切割：将步骤(9)的Fmoc-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin先作脱除Fmoc的处理后，再用2％的TFA/DCM溶液切断树脂，获得色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽NH2-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-OH；
(11)环合线性肽：将步骤(10)的线性八肽以环合试剂环合，得到色氨酸吲哚上带Boc保护的环八肽；
(12)脱除Boc的保护：将步骤(11)的环八肽在高体积比的TFA/DCM溶液处理后，经分离纯化获得最终产物环八肽Reniochalistatin E。
上述合成方法中，步骤(1)中所述将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)连接到已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂上的具体操作步骤为：将Fmoc-Pro-OH溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入至已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂中，再向其中加入二异丙基乙胺(DIEA)调节pH＝7～8(优选为7.4)，通入氮气，在摇床上反应3～5小时(优选为4h)。
所述的已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂是通过将2-氯三苯甲基氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀活化，然后将液体抽干得到的。
上述合成方法中，步骤(2)中所述树脂封闭的具体操作步骤为：用DIEA/MeOH(1：9)的溶液，加入已经连接了第一个氨基酸的树脂中，反应30～60min(优选为60min)。
上述合成方法中，步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)中所述的脱除Fmoc的处理的具体操作步骤为：向反应器中加入20％(体积分数)哌啶/DMF溶液，反应10～15min，抽去反应液，分别用DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；仍用该方法重复操作1～2次，将复合物洗净，抽干洗涤液；
上述合成方法中，步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的缩合试剂为DEPBT和DIEA；
优选的，所述的DEPBT和DIEA的摩尔比为1：1。
优选的，所述的氨基酸与2-氯三苯甲基氯树脂的负载量的摩尔比为3：1。
上述合成方法中，步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的经缩合试剂活化过的是指在缩合试剂DEPBT和DIEA的存在下相应的待活化氨基酸进行活化，其具体操作步骤为：将芴甲氧羰酰基保护的待活化氨基酸和DEPBT溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入DIEA，室温(25～29℃)下活化3～5min；
上述合成方法中，步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的连接的条件为氮气环境下摇床反应3～5小时。
上述合成方法中，步骤(10)中所述的用2％的TFA/DCM溶液切断树脂是指在体积分数为2％的三氟乙酸/二氯甲烷(TFA/DCM)溶液中将连接在树脂上的线性肽切下，其具体操作步骤为：将体积分数为2％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液加入到经脱除Fmoc的处理后的色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽-树脂复合物的反应器中，通入氮气，摇床反应30～60min后，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽。
上述合成方法中，步骤(11)中所述的环合线性肽的具体操作步骤为：将色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽溶于二氯甲烷中，氮气保护下，再向其中加入环合试剂PyBOP，用DIEA调节pH至7～8，室温下搅拌反应，反应24～48小时，减压蒸除溶剂，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽。
上述合成方法中，步骤(12)中所述的高体积比的TFA/DCM溶液优选为50％的TFA/DCM溶液。
上述合成方法中，步骤(12)中所述的脱除Boc的保护的具体操作步骤为：将色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽溶于体积分数为50％的TFA/DCM溶液，氮气保护下，反应1～2小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到目标环八肽Reniochalistatin E。
这种活性环八肽Reniochalistatin E的类似物也可按照上述合成方法得到。
所述的类似物优选为与Reniochalistatin E的氨基酸组成相同的类似物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)相对于传统液相合成法，本发明采用的固相合成法大大缩减了合成时间和纯化工序，合成工艺简单，原料成本低，反应条件温和，纯度高，易于产业化，具有广阔的市场前景。
(2)与传统的缩合试剂和环合试剂，本发明采用的缩合试剂DEPBT和DIEA、环合试剂PyBOP大大减少反应过程引起的消旋和对使用者身体的毒性危害。
(3)并得出最优时间和反应条件(温度和试剂用量)，让每一步反应或者最大的产率和最短的时间。
附图说明
图1是环八肽的合成具体流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
环八肽Reniochalistatin E的合成具体流程图，如图1所示。
实施例1：芴甲氧羰酰基脯氨酸的树脂复合物(Fmoc-Pro-resin)
取1.00g的2-氯三苯甲基氯树脂(负载量0.985mmol/g)于100mL的多肽合成管中，加入20mL的DCM溶胀30分钟。抽干滤液，向其加入0.84g(3mmol)的Fmoc-Pro-OH溶解于20mLDCM中，用调节pH＝7～8，通入氮气，在摇床上反应4小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-resin。
实施例2：树脂上残余位点封闭
将20mL体积比为10％DIEA/MeOH溶液加入实施例1中，在摇床上反应1小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液。
实施例3：带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Pro-resin)
Ⅰ、向实施例2加入10mL的20％哌啶/DMF溶液，反应10～15分钟，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液。
重复一次步骤Ⅰ。
Ⅱ、称取1.06g(3mmol)的Fmoc-Ile-OH和0.90g(3mmol)的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL(3mmol)的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ处理过的实施例2中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Ile-Pro-resin。
实施例4：带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin)
称取0.84g(3mmol)的Fmoc-Pro-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例3中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例5：带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin)
称取1.06g(3mmol)的Fmoc-Ile-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例4中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例6：带保护线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin)
称0.85g(3mmol)的Fmoc-Val-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例5中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例7：带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin)
称取0.84g(3mmol)的Fmoc-Pro-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例6中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例8：带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Trp(Boc)Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin)
称取1.32g(3mmol)的Fmoc-Trp(Boc)-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例7中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Trp(Boc)Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例9：带保护的线性八肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Trp(Boc)Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin)
称取1.06g(3mmol)的Fmoc-Leu-OH和0.90g的DEPBT于50mL的三角锥形瓶中，加入15mL的DMF溶解后，再加入0.52mL的DIEA，室温活化3～5分钟后，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例8中，通入氮气，摇床上反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Leu-Trp(Boc)Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin。
实施例10：树脂切割
取20mL体积比为2％的TFA/DCM溶液，加入经步骤Ⅰ脱保护处理过的实施例9中，通入氮气，摇床上反应45分钟，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽。
实施例11：肽链环合
将100mg的实施例10中的色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽溶解于1L的DCM中，在氮气下，加入150mg(3mmol)的环合试剂PyBOP，用DIEA调节pH＝7～8，室温下反应24小时，减压旋干，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽。
实施例12：脱除色氨酸吲哚上Boc的保护
将实施例11中的色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽于50mL的圆底烧瓶，加入20mL的50％TFA/DCM溶液，通入氮气，反应1小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物纯化，得到目标环八肽Reniochalistatin E，环合产率81％，纯度99％以上。1HNMR(DMSO-d6)δ10.87–10.72(m,1H),8.60(t,J＝9.1Hz,1H),8.04(dd,J＝20.8,9.2Hz,1H),7.92–7.77(m,1H),7.66–7.56(m,1H),7.56–7.45(m,1H),7.39–7.27(m,2H),7.02(ddt,J＝31.1,15.6,8.2Hz,3H),4.97(s,1H),4.50(d,J＝7.9Hz,1H),4.40(d,J＝8.6Hz,1H),4.25(d,J＝8.3Hz,1H),4.14(t,J＝8.5Hz,2H),3.67(t,J＝10.6Hz,2H),3.23(s,1H),3.06(d,J＝18.9Hz,2H),2.89(d,J＝11.6Hz,1H),2.42–1.15(m,26H),0.86(tq,J＝26.9,8.6,8.1Hz,24H)13CNMR(DMSO-d6)δ172.43,172.13,171.35,170.63,170.52,170.25,170.14,168.61,136.34,127.67,124.19,121.36,118.87,118.18,110.68,110.06,72.72,60.96,60.72,60.57,57.18,55.75,54.75,49.06,34.64,33.03,29.84,29.48,25.48,25.13,24.98,24.66,23.93,23.73,23.52,21.41,21.29,20.05,19.20,19.08,18.82,16.82,15.87,15.71,14.92,11.99,10.42,9.69,9.03.
得到环八肽Reniochalistatin E的结构式如下所示：
Figure BDA0001453751210000081
本发明的其他类似物的全合成过程与以上实施相同并能得到类似的结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将Fmoc-Pro-OH连接到已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂上，得到带Fmoc保护基的脯氨酸-树脂复合物Fmoc-Pro-resin；
(2)树脂封闭：用甲醇和DIEA把2-氯三苯甲基氯树脂上残余的反应位点封闭；
(3)将步骤(2)的Fmoc-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Ile-OH进行连接，得到Fmoc保护基的二肽-树脂复合物Fmoc-Ile-Pro-resin；
(4)将步骤(3)的Fmoc-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Pro-OH进行连接，得到Fmoc保护基的三肽-树脂复合物Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin；
(5)将步骤(4)的Fmoc-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Ile-OH进行连接，得到Fmoc保护基的四肽-树脂复合物Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(6)将步骤(5)的Fmoc-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Val-OH进行连接，得到Fmoc保护基的五肽-树脂复合物Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(7)将步骤(6)的Fmoc-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Pro-OH进行连接，得到Fmoc保护基的六肽-树脂复合物Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(8)将步骤(7)的Fmoc-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Trp(Boc)-OH进行连接，得到Fmoc保护基的七肽-树脂复合物Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(9)将步骤(8)的Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin作脱除Fmoc的处理，与经缩合试剂活化过的Fmoc-Leu-OH进行连接，得到Fmoc保护基的八肽-树脂复合物Fmoc-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin；
(10)将步骤(9)的Fmoc-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-resin先作脱除Fmoc的处理后，再用2％的TFA/DCM溶液切断树脂，获得色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽NH2-Leu-Trp(Boc)-Pro-Val-Ile-Pro-Ile-Pro-OH；
(11)环合线性肽：将步骤(10)的色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽溶于二氯甲烷中，氮气保护下，再向其中加入环合试剂PyBOP，用DIEA调节pH至7～8，室温下搅拌反应，反应24～48小时，减压蒸除溶剂，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽；
(12)脱除Boc的保护：将步骤(11)的环八肽在体积分数为50％的TFA/DCM溶液处理后，经分离纯化获得最终产物环八肽Reniochalistatin E；
所述的环八肽Reniochalistatin E，其化学名称为：环(脯氨酰-异亮氨酰-脯氨酰-异亮氨酰-缬氨酰-脯氨酰-色氨酰-亮氨酰)；英文缩写表达式为：cyclo-(Pro-Ile-Pro-Ile-Val-Pro-Trp-Leu)，分子式为C49H73N9O8，结构式如下所示：
Figure FDA0002382465650000021
步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的缩合试剂为3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和二异丙基乙胺；所述的3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮和二异丙基乙胺的摩尔比为1：1；
步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的经缩合试剂活化过的是指在缩合试剂DEPBT和DIEA的存在下相应的待活化氨基酸进行活化，其具体操作步骤为：将芴甲氧羰酰基保护的待活化氨基酸和DEPBT溶于N,N-二甲基甲酰胺，再加入DIEA，室温下活化3～5min；
步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)中所述的连接的条件为氮气环境下摇床反应3～5小时。
2.根据权利要求1所述的活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述将Fmoc-Pro-OH连接到已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂上的具体操作步骤为：将Fmoc-Pro-OH溶于DCM中，然后加入至已经活化好的2-氯三苯甲基氯树脂中，再向其中加入DIEA调节pH＝7～8，通入氮气，在摇床上反应3～5小时。
3.根据权利要求1所述的活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，其特征在于：
步骤(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)中所述的脱除Fmoc的处理的具体操作步骤为：向反应器中加入20％哌啶/DMF溶液，反应10～15min，抽去反应液，分别用DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；仍用该方法重复操作1～2次，将复合物洗净，抽干洗涤液。
4.根据权利要求1所述的活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，其特征在于：
步骤(10)中所述的用2％的TFA/DCM溶液切断树脂是指在体积分数为2％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液中将连接在树脂上的线性肽切下，其具体操作步骤为：将体积分数为2％的三氟乙酸/二氯甲烷溶液加入到经脱除Fmoc的处理后的色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽-树脂复合物的反应器中，通入氮气，摇床反应30～60min后，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到色氨酸吲哚上带Boc保护基的线性八肽。
5.根据权利要求1所述的活性环八肽Reniochalistatin E的合成方法，其特征在于：
步骤(12)中所述的脱除Boc的保护的具体操作步骤为：将色氨酸吲哚上带Boc保护基的环八肽溶于体积分数为50％的TFA/DCM溶液，氮气保护下，反应1～2小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到目标环八肽Reniochalistatin E。
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