CN109306366A - 一种合成pt141的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成PT141的方法。本发明所述方法先固相合成PT141线性肽；然后将线性肽加入到缓冲液中，采用嗜热杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、A2胰凝蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、Butelase1酶中的一种或两种以上进行环化，获得PT141。本发明改变常规方法采用偶联试剂和活化试剂的环化方式，以全新的酶制剂环化方式应用到PT141的合成中，获得较高纯度和收率的PT141，同时所述方法能够以普通的保护氨基酸和裂解试剂进行合成，应用范围更广，方法更简便，对环境友好。

Description

一种合成PT141的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成PT141的方法。
背景技术
PT141，即布雷默浪丹(Bremelanotide)，是一种alpha-黑素细胞刺激激素类似物，由美国Palatin公司开发的一种治疗性功能障碍的环肽类药物，目前处于临床III期。PT141为人工合成的氮端乙酰化环七肽化合物，C端为羧酸，肽序见式I，Cas：189691-06-3。
Ac-Nle-Cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH
式I
目前，合成PT141方法主要为固相合成法，以Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料进行合成，但是在合成过程中存在保护氨基酸和脱保护试剂昂贵以及采用HF裂解方式对设备要求较高，并且对环境污染也较严重的问题。
中国专利CN101857629A公开了一种合成PT141的方法，其采用了较为普通的保护氨基酸以及TFA切割试剂进行固相合成，虽然避免了上述固相合成工艺的一些缺点，但是整个工艺的收率难以令人满意。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成PT141的方法，使得所述方法能够提高PT141的收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成PT141的方法，包括以下步骤：
步骤1、固相合成PT141线性肽；
步骤2、将线性肽加入到缓冲液中，采用嗜热杆菌蛋白酶(30～175u/mg)、木瓜蛋白酶(1.5～10u/mg)、A2胰凝蛋白酶(1000u/mg)、胰蛋白酶(10000u/mg)、枯草杆菌蛋白酶(1500u/mg)、Butelase 1酶(5000u/mg)中的一种或两种以上进行环化，获得PT141。
本发明在获得PT141线性肽后，改变传统的采用化学试剂进行环化的策略，采用酶制剂进行环化，提高了PT141的收率和纯度。
作为优选，所述缓冲液为pH2-9的PBS缓冲液(磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制)，更优选为pH值5-7的PBS缓冲液；在具体实施方式中，可采用pH值6.0的PBS缓冲液。
作为优选，所述环化在0-100℃进行，更优选为10-35℃；在具体实施方式中，所述环化在30℃进行。
作为优选，所述线性肽与酶的质量比为100:1～1000:1；在具体实实施方式中，所述线性肽与酶的质量比为300:1。
本发明所述PT141线性肽可以按照现有方法进行合成，在本发明中给出如下较优方法：
步骤1.1、固相合成在PT141线性肽所示氨基酸序列的Lys侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上、His侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基，且在PT141线性肽所示氨基酸序列C端偶联有树脂以及在N端乙酰化的PT141线性肽树脂；
步骤1.2、向PT141线性肽树脂加入裂解液脱除树脂以及各氨基酸侧链保护基，获得PT141线性肽。
PT141线性肽(本发明SEQ ID NO:1所示氨基酸序列)以N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
Nle1-Asp2-His3-D-Phe4-Arg5-Trp6-Lys7
在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，Xaa(1)＝Nle(正亮氨酸)；Xaa(4)＝D-Phe，括号中的数字表示SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中氨基酸编号。
更为具体地，所述步骤1.1包括：
步骤1.1.1、将保护的Lys和树脂在偶联试剂及催化剂DMAP作用下进行偶联反应，获得保护的Lys-树脂；然后将剩余保护氨基酸按照PT141线性肽所示氨基酸序列C段到N端的肽序，用偶联试剂进行逐一合成，获得肽树脂1；
步骤1.1.2、对肽树脂1的N端进行乙酰化，获得PT141线性肽树脂。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。其中，本发明所述保护的Lys以及剩余保护氨基酸优选为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Nle-OH。
本发明在固相合成中通过逐一偶联方式合成目的多肽片段，逐一偶联是指以第一个氨基酸为起始，剩余氨基酸按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK(即20％哌啶的DMF溶液，体积比)脱除N端保护基。由于不断有氨基酸偶联，所合成的多肽片段和多肽树脂是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸与之前已经合成的多肽树脂或树脂片段的摩尔比为(2～10)：1。
每个氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
作为优选，所述树脂为wang树脂或2-氯树脂；在本发明具体实施方式中，所述树脂替代度为1.0-3.0mmol/g，优选1.0-2.0mmol/g，更优选1.3-1.5mmol/g；所述树脂替代度不仅指起始树脂的替代度，也指在氨基酸逐一合成过程中各多肽树脂的替代度，如wang树脂或2-氯树脂在起始时替代度为2.2mmol/g，各多肽树脂的替代度为1.4mmol/g。树脂在偶联之前通常进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF。
作为优选，本发明所述偶联试剂采用多种试剂组成的偶联体系，具体为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；在本发明具体实施方式中，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIC:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
作为优选，所述乙酰化采用乙酸酐及吡啶为乙酰化试剂进行乙酰化。
在采用酶制剂环化前，本发明采用优化后的裂解液对PT141线性肽树脂进行裂解，确保PT141线性肽的收率和纯度，所述裂解液为所述裂解液为由TFA、H2O、PhOMe、EDT和苯甲硫醚组成的混合裂解液、由TFA、PhOMe、EDT和苯甲硫醚。组成的混合裂解液或由TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚组成的混合裂解液；在本发明具体实施方式中，所述TFA、H2O、PhOMe、EDT和苯甲硫醚的体积比为90:5:2:2:1；所述TFA、PhOMe、EDT和苯甲硫醚的体积比为95:2.5:2.0:0.5；所述TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚体积比为90:5:4:1。
除此之外，本发明所述方法还包括对合成的PT141进行纯化的步骤，所述纯化可采用反相高压液相色谱法，具体为：
以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，对PT141进行反相高压液相色谱纯化，等浓度洗脱，流速70-80ml/min，检测波长280nm，收集目的峰馏分，浓缩冻干，获得PT141纯品。
其中，所述流动相中0.1％醋酸水溶液/乙腈的比例优选为98:2至50:50，更优选80:20至60:40，最优选70:30。
按照本发明所述方法进行PT141的合成，纯化后的收率可达到30-90％，纯度在99％以上，其中以Butelase 1酶进行环化后的收率最高，可达到80-90％。而采用现有方法收率却仅有30-40％。
由以上技术方案可知，本发明改变常规方法采用偶联试剂和活化试剂的环化方式，以全新的酶制剂环化方式应用到PT141的合成中，获得较高纯度和收率的PT141，同时所述方法能够以普通的保护氨基酸和裂解试剂进行合成，应用范围更广，方法更简便，对环境友好。
附图说明
图1所示为本发明所述方法的流程示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种合成PT141的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明所述方案，本发明大致流程如下：
1、选择树脂；
2、按照Fmoc固相合成策略，依次偶联Fmoc-AA-OH及最后N端乙酰化；
3、裂解去除树脂和保护基，得线性肽粗肽；
4、粗肽采用酶制剂环化得PT141粗肽；
5、PT141粗肽纯化制备得产物PT141。
更为详细的流程可参见图1，图1所示为本发明所述方法中的某一个具体实施方法，其中所使用的试剂、操作等可在本发明核心技术原理范围内进行调整。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：替代度为1.40mmolFmoc-Lys(Boc)-Wang树脂的制备
称取替代度为2.2mmol/g的Wang树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 46.9克(100mmol)、HOBt16.2克(120mmol)、DMAP 1.2克(10mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mLDIC,活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂140克，检测替代度为1.40mmol/g。
实施例2：多肽树脂的制备
称取实施例1制备的替代度为1.40mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂50g于固相反应柱中，加入50mLDMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用50mL DBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤6次。称取110.5g(210mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH和32.8g(210mmol)HOBT用150mL DMF溶解，冰水浴下加入36.4mL(210mmol)DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用150mLDMF洗涤树脂3次，加入150mLDBLK脱保护6min+8min，150mLDMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH。每种氨基酸、HOBT及DIC每次分别投料210mmol。氨基酸偶联结束后，加入100mL醋酸酐和90mL吡啶，反应2小时，进行乙酰化。反应结束后，用DMF洗涤6次，每次100mL，然后用200mL甲醇收缩树脂，抽干，得到多肽树脂82.5克，即Ac-Nle-Asp(OtBu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Wang树脂。
实施例3：线性肽的制备
将实施例2得到的多肽树脂82.5g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝90:5:4:1(V:V)900mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到线性肽57.4克,收率77％(收率计算公式：57.4/(50×1.40×1058)×100％)，纯度87％。
实施例4：线性肽的制备
按照实施例2方法制备多肽树脂，取82.5g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:PhOMe:EDT：苯甲硫醚＝95:2.5:2.0:0.5(V:V)900mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到线性肽50.5克。收率68％(收率计算公式：50.5/(50×1.40×1058)×100％)，纯度85％。
实施例5：线性肽的制备
按照实施例2方法制备多肽树脂，取82.5g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:PhOMe:EDT:苯甲硫醚＝90:5:2:2:1(V:V)900mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到线性肽60.5克。收率82％(收率计算公式：60.5/(50×1.40×1058)×100％))，纯度90％。
实施例6：PT141的制备
将实施例5得到的线性肽60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入嗜热杆菌蛋白酶0.2g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品25.2g，纯度为99.5％，收率42％。收率计算公式(25.2÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例7：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入木瓜蛋白酶0.2g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品19.1g，纯度为99.5％，收率32％。收率计算公式(19.1÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例8：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入A2胰凝蛋白酶0.2g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品26.2g，纯度为99.5％，收率44％。收率计算公式(26.2÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例9：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入胰蛋白酶0.2g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品18.2g，纯度为99.5％，收率31％。收率计算公式(18.2÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例10：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入Butelase 1酶0.20g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品52.0g，纯度为99.5％，收率88％。收率计算公式(52÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例11：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入Butelase 1酶0.20g,25℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品48.0g，纯度为99.5％，收率81％。收率计算公式(48÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例12：PT141的制备
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到1000ml反应瓶中，加入磷酸钠的缓冲液(pH＝6.0)700ml溶解，然后加入Butelase 1酶0.15g,30℃反应。反应结束后，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品51.2g，纯度为99.5％，收率86％。收率计算公式(51.2÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
实施例13：PT141的制备(参照专利CN101857629A的环化方法)
按照实施例5方法制备线性肽，取60.5克加入到20升反应釜中，加入DMF 10升搅拌溶解，浓度大概在6mmol/l，然后加入94克PyBOP和23克DIEA，充分搅拌均匀，静止10分钟左右，让固体都充分溶解后，温度控制在-20℃左右，然后让它静置24小时；反应结束后，常温浓缩除去DMF，然后加入纯化水500mL，直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品22.3g，纯度为99.5％，收率38％。收率计算公式(22.3÷1040)÷(60.5÷1058)×100％
按照上述方法重复两次制备过程，分别得纯品19.7g和21.5g，根据公式计算收率为33.1％和36.2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳翰宇药业股份有限公司
<120> 一种合成PT141的方法
<130> S17P1114
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(7)
<223> Xaa（1）=Nle；Xaa（4）=D-Phe
<400> 1
Xaa Asp His Xaa Arg Trp Lys
1 5

Claims (15)

1.一种合成PT141的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、固相合成PT141线性肽；
步骤2、将线性肽加入到缓冲液中，采用嗜热杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、A2胰凝蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、Butelase 1酶中的一种或两种以上进行环化，获得PT141。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缓冲液为pH2-9的PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述环化为在0-100℃反应。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述线性肽与酶的质量比为100:1～1000:1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1包括：
步骤1.1、固相合成在PT141线性肽所示氨基酸序列的Lys侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上、His侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基，且在PT141线性肽所示氨基酸序列C端偶联有树脂以及在N端乙酰化的PT141线性肽树脂；
步骤1.2、向PT141线性肽树脂加入裂解液脱除树脂以及各氨基酸侧链保护基，获得PT141线性肽。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1.1包括：
步骤1.1.1、将保护的Lys和树脂在偶联试剂及催化剂DMAP作用下进行偶联反应，获得保护的Lys-树脂；然后将剩余保护氨基酸按照PT141线性肽所示氨基酸序列C段到N端的肽序，用偶联试剂进行逐一合成，获得肽树脂1；
步骤1.1.2、对肽树脂1的N端进行乙酰化，获得PT141线性肽树脂。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述保护的Lys以及剩余保护氨基酸为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Nle-OH。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述树脂为wang树脂或2-氯树脂。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，乙酰化采用乙酸酐及吡啶为乙酰化试剂进行乙酰化。
11.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述裂解液为由TFA、H2O、PhOMe、EDT和苯甲硫醚组成的混合裂解液、由TFA、PhOMe、EDT和苯甲硫醚组成的混合裂解液或由TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚组成的混合裂解液。
12.根据权利要求11所述方法，其特征在于，所述TFA、H2O、PhOMe、EDT和苯甲硫醚的体积比为90:5:2:2:1；所述TFA、PhOMe、EDT和苯甲硫醚的体积比为95:2.5:2.0:0.5；所述TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚体积比为90:5:4:1。
13.根据权利要求1-12任意一项所述方法，其特征在于，还包括将PT141进行纯化。
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于，所述将PT141进行纯化为将PT141进行用反相高压液相色谱法纯化。
15.根据权利要求14所述方法，其特征在于，所述将PT141进行用反相高压液相色谱法纯化具体为：
以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，对PT141进行反相高压液相色谱纯化，等浓度洗脱，流速70-80ml/min，检测波长280nm，收集目的峰馏分，浓缩冻干，获得PT141纯品。
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