CN106928321A - 一种合成Etelcalcetide的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成Etelcalcetide的方法。所述方法液相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的直链七肽；L-Cys进行NCS氯化，使巯基上的氢被氯取代，生成L-Cys(SCl)；直链七肽和L-Cys(SCl)偶联反应生成二硫化物，获得Etelcalcetide；本发明采用全液相方法合成Etelcalcetide，与固相方法比较使用更少的试剂及溶剂，绿色环保，并且不使用价格高昂的树脂，降低了成本。同时以价廉易得的NCS与半胱氨酸形成活性中间体构建二硫键，避免了传统方法转化率低，纯度低的缺点，利于Etelcalcetide的大规模生产。

Description

一种合成Etelcalcetide的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成Etelcalcetide的方法。
背景技术
继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肠吸收不良综合征、Fanconi综合征和肾小管酸中毒、维生素D缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的甲状旁腺激素(PTH)，以提高血钙、血镁和降低血磷的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。
Etelcalcetide是由Kai Pharmaceuticals,Inc.开发的一种新颖的拟钙剂(calcimimetic agent)，能够抑制甲状旁腺激素(PTH)的分泌。继发性甲旁亢(SHPT)是接受透析治疗的慢性肾脏病(CKD)患者中一种常见且严重的代偿失调疾病。目前已知，持续升高的甲状旁腺激素(PTH)与CKD患者的关键临床结局相关。Etelcalcetide可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素(PTH)水平的降低。
Etelcalcetide有3个D构型的精氨酸、2个D构型的丙氨酸、1个D构型的精氨酰胺、1个L构型半胱氨酸与1个D构型半胱氨酸(N段被乙酰基封闭)构成，其中D构型半胱氨酸与L构型半胱氨酸以二硫键连接在一起(N-acetyl-D-cysteinyl-D-alanyl-D-arginyl-D-arginyl-D-arginyl-D-alanyl-D-Argininamide,disulfide with L-cysteine)，其结构如下所示：
专利CN201080045024.9首度报道了该化合物，但是未见该化合物的合成工艺报道。该化合物合成的关键在于二硫键的构建，常规的肽合成中使用的构建二硫键的方法包括空气氧化法，碘/醋酸体系氧化法，双氧水氧化法等，这类方法仅适合于环肽的二硫键的构建，环肽的二硫键往往是分子内的两个巯基通过氧化的方法进行连接，需要通过使用极稀溶液来进行反应，减少分子间反应的发生。但是Etelcalcetide需要进行分子间巯基的氧化反应，若按照常规的二硫键构建方法进行反应，将无法得到理想收率和纯度的最终产物。此外，如果以普通的固相合成方法合成该化合物合成，其中的胍基较为容易脱除而形成降解杂质，纯化难度极大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成Etelcalcetide的方法，使得本发明所述方法能够提高Etelcalcetide及中间产物的收率，提高Etelcalcetide纯度和降低杂质。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成Etelcalcetide的方法，包括以下步骤：
步骤1、液相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的直链七肽；
步骤2、L-Cys进行NCS氯化，使巯基上的氢被氯取代，生成L-Cys(SCl)；
步骤3、将步骤1合成的直链七肽和L-Cys(SCl)偶联反应生成二硫化物，获得Etelcalcetide；
步骤1和步骤2不分先后。
本发明以液相合成方法合成Etelcalcetide主链7肽，并以NCS氯化的方法制备活性中间体L-Cys(SCl)，使用该活性中间体构建二硫键合成Etelcalcetide，保证反应的专一选择性，收率高，杂质少。
其中，作为优选，所述步骤1为：
以保护氨基酸为原料，在偶联体系作用下，液相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的全保护直链七肽，然后裂解脱除各氨基酸的保护基，获得直链七肽。
进一步优选地，步骤1为：
以Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、N-Ac-D-Cys(Trt)-OH保护氨基酸为原料，在氯甲酸异丙酯/DIPEA偶联体系作用下液相合成在SEQ IDNO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的全保护直链七肽N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，然后裂解脱除各氨基酸的保护基，获得直链七肽N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；所述N-Ac-D-Cys(Trt)-OH为N端乙酰化的保护的半胱氨酸。
更优选地，步骤1为：
步骤1.1、将Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的C端酰胺化，获得Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2，然后以Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2为C端，用Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH保护氨基酸在氯甲酸异丙酯/DIPEA偶联体系作用下液相合成SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端第4-7位的全保护多肽A，即Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
以N-Ac-D-Cys(Trt)-OH为N端，用Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH保护氨基酸在DIC/HOSu/DIPEA三试剂偶联体系或HATU/DIPEA双试剂偶联体系作用下液相合成SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端第1-3位的全保护多肽B，即N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤1.2、将全保护多肽A和全保护多肽B用HATU/DIPEA双试剂偶联体系偶联，获得全保护直链七肽N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤1.3、全保护直链七肽裂解脱除各保护氨基酸保护基获得直链七肽N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2。
在本发明优选的液相合成Etelcalcetide主链7肽方案中，首先按照Etelcalcetide主链肽序(本发明SEQ ID NO:1所示氨基酸序列)合成1-3和4-7片段，分别对应全保护多肽B和A，然后再将这2个多肽片段偶联得到全保护直连七肽，以Etelcalcetide主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-D-Cys1-D-Ala2-D-Arg3-D-Arg4-D-Arg5-D-Ala6-D-Arg7-NH2
在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，Xaa表示D型氨基酸，其中Xaa(1)＝D-Cys；Xaa(2，6)＝D-Ala；Xaa(3，4，5)＝D-Arg，括号中的数字表示SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中氨基酸编号。
本发明所述保护基是在多肽合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，Fmoc为氨基酸N端保护基，括号里的Pbf为Arg侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料除非特殊说明均可参照此解释。特别说明的是对于Boc-L-Cys-OtBu保护氨基酸，Boc为其N端保护基，OtBu为其羧酸保护基。
本发明在液相合成中优选通过逐一偶联方式合成目的多肽片段，逐一偶联是指以第一个氨基酸为起始，剩余氨基酸按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选加入哌啶脱除N端Fmoc保护基，用三氟醋酸脱除Boc-L-Cys-OtBu羧酸保护基OtBu。由于不断有氨基酸偶联，所合成的多肽片段是不断变化的，作为优选，每个待偶联的氨基酸原料与之前已经合成的多肽片段的摩尔比、每两个待偶联的氨基酸原料之间的摩尔比以及每两个多肽片段之间的摩尔比接近于1:1，其他适用摩尔比可根据实际反应进行调整。
此外，所述直链七肽C末端的酰胺化可通过对精氨酸的C端进行酰胺化(如和氨水反应)，使其作为C端进行液相合成；而N末端的乙酰化可通过对半胱氨酸的N端进行乙酰化，使其作为N端进行液相合成，也可采用市售的乙酰化半胱氨酸进行合成。
作为优选，本发明步骤2为：
Boc-L-Cys-OtBu进行NCS氯化，使巯基上的氢被氯取代，生成Boc-L-Cys(SCl)-OtBu。
针对Etelcalcetide合成中，其胍基较为容易脱除而形成降解杂质的技术问题，本发明通过降低反应温度来最大程度解决胍基脱除导致收率和纯度降低的问题，故本发明步骤1所述液相合成、步骤2所述NCS氯化、步骤3所述偶联反应均优选在0-10℃中进行，更优先为0℃≤反应温度＜10℃之间。
作为优选，步骤1所述液相合成、步骤2所述NCS氯化、步骤3所述偶联反应均以DMF、DCM或两者的混合物(混合物中两者体积比优选1:1)为溶剂。
作为优选，所述裂解通过加入二氯甲烷和三氟醋酸的混合溶液进行裂解，进一步优选地，二氯甲烷和三氟醋酸的体积比为15:85。
以本发明所述方法合成的Etelcalcetide经HPLC纯化后纯度达到98％以上，收率在62％以上。
由以上技术方案可知，本发明采用全液相方法合成Etelcalcetide，在液相合成过程中，可使用结晶、打浆等简单易行的纯化手段，大大提高了中间体质量。与固相方法比较使用更少的试剂及溶剂，绿色环保，并且不使用价格高昂的树脂，降低了成本。同时以价廉易得的NCS与半胱氨酸形成活性中间体构建二硫键，避免了传统方法转化率低，纯度低的缺点，利于Etelcalcetide的大规模生产。
具体实施方式
本发明公开了一种合成Etelcalcetide的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有保护氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
缩写及英文 含义
NCS N-氯代丁二酰亚胺
Boc 叔丁氧羰基
Etelcalcetide 一种凯伊药品公司开发的新型多肽药物
Cys 半胱氨酸
-OtBu 叔丁酯
MS 质谱
Argininamide 精氨酰胺
Fmoc 芴甲氧羰基
Ac 乙酰基
DIPEA 二异丙基乙基胺
mmol 毫摩尔
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰氯
HPLC 高效液相
Equ. 当量
Kai Pharmaceuticals,Inc. 凯伊药品公司
在本发明液相合成中，各中间产物可通过结晶、柱层析等手段纯化，如乙酸乙酯加热回流溶解后加正己烷冷却析晶、加乙酸乙酯加热回流溶解后冷却析晶(乙酸乙酯打浆)、柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)；而全保护直链七肽可通过乙醇重结晶纯化，直链七肽和终产物可采用乙醚沉淀法。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
1、本发明方法
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(130g,200mmol)加入到1000毫升二氯甲烷中，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(27g,220mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(31g,242mmol,1.21equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料点消失。
200毫升氨水缓慢加入到上述反应液中，保持反应温度低于20℃，继续搅拌2小时，分液，DCM层水洗两遍，无水硫酸钠干燥，移除溶剂后得到白色固体115g(收率88.5％)，HPLC纯度为95.2％。
2、对照方法
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(130g,200mmol)加入到1000毫升二氯甲烷中，反应体系温度控制在30-40℃，加入氯甲酸异丙酯(27g,220mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(31g,242mmol,1.21equ.)，所得混合物保持体系温度30-40℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料点消失。
200毫升氨水缓慢加入到上述反应液中，保持反应温度低于20℃，继续搅拌2小时，分液，DCM层水洗两遍，无水硫酸钠干燥，移除溶剂后得到白色固体112.3g(收率86.4％)，HPLC纯度89.6％。
所得白色固体加入到乙酸乙酯(200mL),室温搅拌1小时，过滤，得白色固体104.8g，HPLC纯度94.8％。
实施例2：Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
Fmoc-D-Ala-OH(4.67g,15mmol)加入到100毫升二氯甲烷中，搅拌10分钟后，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(2.0g,16.5mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(2.33g,18.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料点消失。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2脱除Fmoc保护基,H-D-Arg(Pbf)-NH2(7.0g,16.5mmol)加入二氯甲烷(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度低于10℃继续搅拌10小时，直到原料点消失(TLC)。
反应混合溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，水洗两遍，无水硫酸钠干燥，移除溶剂后得到白色固体11.1g。
将所得白色固体加入到乙酸乙酯(100毫升)中，加热至回流，全部固体溶解，50毫升正己烷缓慢加入到乙酸乙酯溶液中，所得溶液继续回流0.5小时，然后缓慢冷却至室温，大量固体析出，过滤得白色固体8.9g，收率81.0％。纯度95.7％。
2、对照方法
Fmoc-D-Ala-OH(4.67g,15mmol)加入到100毫升二氯甲烷中，搅拌10分钟后，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(2.0g,16.5mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(2.33g,18.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持体系温度30-40℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料点消失。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2脱除Fmoc保护基,H-D-Arg(Pbf)-NH2(7.0g,16.5mmol)加入二氯甲烷(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度30-40℃继续搅拌，直到原料点消失(TLC)。
反应混合溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，水洗两遍，无水硫酸钠干燥，移除溶剂后得到白色固体10.4g。
将所得白色固体加入到乙酸乙酯(100毫升)中，加热至回流，全部固体溶解，50毫升正己烷缓慢加入到乙酸乙酯溶液中，所得溶液继续回流0.5小时，然后缓慢冷却至室温，大量固体析出，过滤得白色固体7.2g，收率65.5％。纯度93.8％。
实施例3：Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
Fmoc-D-Ala-R-Arg(Pbf)-NH2(8.9g 12mmol)加入到二氯甲烷(200毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(5.1g，60mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Ala-R-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。使用稀盐酸洗涤至二氯甲烷溶液呈中性，分液，二氯甲烷液干燥，移除溶剂得油状物H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.3g,收率85.8％)，将油状物用乙酸乙酯/正己烷处理得到纯品。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(6.5g,10mmol)加入到100毫升N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(1.34g,11mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.56g,12.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
油状物(H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2,5.3g,10.3mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度低于10℃继续搅拌10小时，直到原料消失(TLC)。将所得反应液加入到5倍体积的水中，静置过夜。
过滤，将所得白色固体加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加热至回流0.5小时，然后缓慢冷却至室温，过滤得白色固体10.2g，收率87.7％。纯度93.7％。
2、对照方法
Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(8.9g 12mmol)加入到二氯甲烷(200毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(5.1g，60mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。使用稀盐酸洗涤至二氯甲烷溶液呈中性，分液，二氯甲烷液干燥，移除溶剂得油状物H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.4g,收率89.0％)。将油状物用乙酸乙酯/正己烷处理得到纯品。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(6.5g,10mmol)加入到100毫升N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(1.34g,11mmol,1.1equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.56g,12.1mmol,1.21equ.)，所得混合物冰水浴冷却至低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2,5.3g,10.3mmol加入N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度30-40℃继续搅拌10小时以上，直到原料消失(TLC)。将所得反应液加入到5倍体积的水中，静置过夜。
过滤，将所得白色固体加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加热至回流0.5小时，然后缓慢冷却至室温，过滤得白色固体9.1g，收率78.2％。纯度92.6％。
实施例4：Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(全保护多肽A)的合成
Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(10.2g 8.77mmol)加入到二氯甲烷(250毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(4.25g，50mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，移除溶剂得白色固体H-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.31g,收率64.3％)。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(3.6g,5.5mmol)加入到80毫升N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(0.81g,6.6mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.1g,8.3mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
H-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.31g,5.64mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度低于10℃继续搅拌10小时，直到原料消失(TLC)。
500毫升水缓慢加入到上述反应体系中，继续搅拌0.5小时，过滤，将所得白色固体加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加热至回流2.0小时，然后冷却至室温，过滤得白色固体6.14g，收率70.3％。纯度96.7％。
2、对照方法
Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(10.2g,8.77mmol)加入到二氯甲烷(250毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(4.25g，50mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，移除溶剂得H-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.28g,收率64.0％)。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(3.6g,5.5mmol)加入到80毫升N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷却至低于10℃，加入氯甲酸异丙酯(0.81g,6.6mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.1g,8.3mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
H-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(5.31g,5.64mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后将其加入上述反应液中，保持体系温度30-40℃继续搅拌10小时以上，直到原料消失(TLC)。
500毫升水缓慢加入到上述反应体系中，继续搅拌0.5小时，过滤，将所得白色固体加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加热至回流2.0小时，然后冷却至室温，过滤得白色固体5.80g，收率66.4％。纯度95.1％。
实施例5：N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-OH的合成
N-Ac-D-Cys(Trt)-OH(4.06g 10mmol)加入到二氯甲烷(100毫升)中，冰水浴冷却至低于10℃，加入DIC(1.52g,12mmol,1.2equ.)、HOSu(1.80g,12mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.94g,15mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。过滤，减压移除溶剂，得油状物。取对照样品，油状物中加入乙腈(150mL)、DIPEA(1.94g,15mmol,1.5equ.)，搅拌溶解后，H-D-Ala-OH(0.98g,11mmol)加入上述溶液中，另加入80mL水，混合均匀后，保持体系温度低于10℃继续搅拌，与对照样品对照直到原料消失(TLC)。
反应液水洗两次，干燥，移除溶剂后，所得油状物加入到100毫升乙酸乙酯中，加热溶解，正己烷缓慢加入，直到体系有固体析出。冷却至室温后，过滤得到白色固体4.05g,收率84.9％，纯度97.2％。
2、对照方法
N-Ac-D-Cys(Trt)-OH(4.06g 10mmol)加入到二氯甲烷(100毫升)中，冰水浴冷却至低于10℃，加入DIC(1.52g,12mmol,1.2equ.)、HOSu(1.80g,12mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.94g,15mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度30-40℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。过滤，减压移除溶剂，得油状物。取对照样品，油状物中加入乙腈(150mL)、DIPEA(1.94g,15mmol,1.5equ.)，搅拌溶解后，H-D-Ala-OH(0.98g,11mmol)加入上述溶液中，另加入80mL水，混合均匀后，保持体系温度30-40℃继续搅拌，与对照样品对照直到原料消失(TLC)。
反应液水洗两次，干燥，移除溶剂后，所得油状物加入到100毫升乙酸乙酯中，加热溶解，正己烷缓慢加入，直到体系有固体析出。冷却至室温后，过滤得到白色固体3.82g,收率80.1％，纯度95.4％。
实施例6：N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH(全保护多肽B)的合成
1、本发明方法
N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-OH(4.06g 8.5mmol)、H-D-Arg(Pbf)-OH(4.26g,10mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(80毫升)中，冰水浴冷却至低于10℃，加入HATU(3.81g,10mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.64g,12.8mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
反应液加到5倍体积水中，静置过夜，过滤得到白色固体，白色固体加入到乙酸乙酯(200mL)中，加热回流，使用分水器移除残余水分，冷却，静置析晶，过滤得到白色固体5.58g,收率74.2％，纯度98.9％。
2、对照方法
N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-OH(4.06g 8.5mmol)、H-D-Arg(Pbf)-OH(4.26g,10mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(80毫升)中，保持反应温度30-40℃，加入HATU(3.81g,10mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(1.64g,12.8mmol,1.5equ.)，所得混合物保持反应温度30-40℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
反应液加到5倍体积水中，静置过夜，过滤得到白色固体，白色固体加入到乙酸乙酯(200mL)中，加热回流，使用分水器移除残余水分，冷却，静置析晶，过滤得到白色固体5.41g,收率71.9％，纯度98.8％。
实施例7：N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(全保护直链七肽)的合成
1、本发明方法
Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(6.14g 3.86mmol)加入到DMF(80毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(1.62g，19mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。150毫升水缓慢加入到混合液中，过滤，所得固体用100毫升乙酸乙酯打浆，过滤的白色固体H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(4.23g,收率80.3％)。
N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH(2.74g,3.1mmol)、H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(4.23g,3.1mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(100毫升)，冰水浴冷却至低于10℃，加入HATU(1.42g,3.72mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(0.6g,4.65mmol,1.5equ.)，所得混合物保持体系温度低于10℃，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
200毫升水缓慢加入到反应体系中，过滤，所得固体加入到乙醇中，加热回流，搅拌2小时，过滤得白色固体4.63g，收率66.4％，纯度95.1％。
2、对照方法
Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(6.14g 3.86mmol)加入到DMF(80毫升)中，搅拌5分钟后，滴加哌啶(1.62g，19mmol)，反应液继续搅拌直到Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2完全消失(TLC)。150毫升水缓慢加入到混合液中，过滤，所得固体用100毫升乙酸乙酯打浆，过滤的白色固体H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(4.23g,收率80.3％)。
N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH(2.74g,3.1mmol)、H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(4.23g,3.1mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(100毫升)，保持反应温度30-40℃，加入HATU(1.42g,3.72mmol,1.2equ.),搅拌5分钟后，缓慢滴加DIPEA(0.6g,4.65mmol,1.5equ.)，搅拌，TLC监控反应，直到原料消失。
200毫升水缓慢加入到反应体系中，过滤，所得固体加入到乙醇中，加热回流，搅拌2小时，过滤得白色固体4.41g，收率63.2％，纯度94.9％。
实施例8：Boc-L-Cys(SCl)-OtBu的合成
Boc-L-Cys-OtBu(0.56g，2.0mmol)加入到二氯甲烷(20毫升)中，搅拌溶解后，冰水浴冷却，三乙胺(3.1g，3.0mmol有机碱催化反应进行)加入溶液中，然后将NCS(3.0g,2.2mmol)分批加入反应体系中，所得混合液继续保温反应4小时，TLC检测无原料残留，过滤，将滤液移除溶剂，另加N,N-二甲基甲酰胺(20毫升)溶解残余物。
实施例9：N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(直链七肽)的合成
实施例7所得全保护直链七肽N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(4.63g,2.56mmol)加入到二氯甲烷/三氟醋酸(50毫升，15:85)混合溶液中，反应液控温不高于10℃，继续搅拌4小时，将所得反应混合液缓慢加入预冷至0℃的乙醚(500毫升)中，过滤得直链七肽粗品1.86g，HPLC纯度：79.5％收率78.3％。MS:[M+H]+:929。
实施例10：Etelcalcetide的合成
上述实施例9所得直七肽粗品(1.86g，2.0mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)中，搅拌溶解，冰水浴冷却，缓慢加入实施例8制得的样品溶液，混合好的反应液继续保温搅拌6小时，反应液中缓慢加入三氟醋酸(5毫升脱除OtBu保护基)，混合液继续搅拌4小时，然后缓慢加入到500毫升预冷好的乙醚中，混合，静置4小时，离心过滤，得粗肽固体2.03g,HPLC纯度77.2％。粗肽利用HPLC制备纯化，得纯品1.32g，收率62.9％，纯度98.2％，MS:[M+H]+:1049。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种合成Etelcalcetide的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、液相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的直链七肽；
步骤2、L-Cys进行NCS氯化，使巯基上的氢被氯取代，生成L-Cys(SCl)；
步骤3、将步骤1合成的直链七肽和L-Cys(SCl)偶联反应生成二硫化物，获得Etelcalcetide；
步骤1和步骤2不分先后。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1为：
以保护氨基酸为原料，在偶联体系作用下，液相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的全保护直链七肽，然后裂解脱除各氨基酸的保护基，获得直链七肽。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤1为：
以Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、N-Ac-D-Cys(Trt)-OH保护氨基酸为原料，在氯甲酸异丙酯/DIPEA偶联体系作用下液相合成在SEQ IDNO:1所示氨基酸序列上N末端乙酰化、C末端酰胺化的全保护直链七肽N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，然后裂解脱除各氨基酸的保护基，获得直链七肽N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
其中，所述N-Ac-D-Cys(Trt)-OH为N端乙酰化的保护的D型半胱氨酸。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤1为：
步骤1.1、将Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的C端酰胺化，获得Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2，然后以Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2为C端，用Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH保护氨基酸在氯甲酸异丙酯/DIPEA偶联体系作用下液相合成SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端第4-7位的全保护多肽A，即Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
以N-Ac-D-Cys(Trt)-OH为N端，用Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH保护氨基酸在DIC/HOSu/DIPEA三试剂偶联体系或HATU/DIPEA双试剂偶联体系作用下液相合成SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端第1-3位的全保护多肽B，即N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤1.2、将全保护多肽A和全保护多肽B用HATU/DIPEA双试剂偶联体系偶联，获得全保护直链七肽N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤1.3、全保护直链七肽裂解脱除各保护氨基酸保护基获得直链七肽N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：
Boc-L-Cys-OtBu进行NCS氯化，使巯基上的氢被氯取代，生成Boc-L-Cys(SCl)-OtBu。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述液相合成、步骤2所述NCS氯化、步骤3所述偶联反应均在0-10℃中进行。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述液相合成、步骤2所述NCS氯化、步骤3所述偶联反应均以DMF、DCM或两者的混合物为溶剂。
8.据权利要求2-5任意一项所述方法，其特征在于，所述裂解通过加入二氯甲烷和三氟醋酸的混合溶液进行裂解。
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