CN102711789A

CN102711789A - 用于降低甲状旁腺激素水平的治疗剂

Info

Publication number: CN102711789A
Application number: CN2010800450249A
Authority: CN
Inventors: F·凯林; A·巴鲁奇; D·麦利恩; K·达斯; Q·殷
Original assignee: Kai Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Kai Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: IL217749A; ES2729051T3; US20120178688A1; SG178143A1; PL3192520T3; SI2459208T1; EP4154900A1; US20160159860A1; LUC00008I2; US9701712B2; HK1167108A1; LTPA2017007I1; FR17C1009I2; WO2011014707A2; LUC00008I1; HUS1700008I1; ZA201200726B; HUE030960T2; LT2459208T; US20130150297A1

Abstract

本发明阐述具有降低甲状旁腺激素水平的活性的化合物。在一个实施方案中，所述化合物由亚单位的邻接序列X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇组成，其中X₁亚单位包含含巯基部分，X₂-X₇亚单位上的电荷分布提供所期需活性。亦阐述使用所述化合物治疗甲状旁腺功能亢进、骨病和/或高血钙病症的方法，具体而言，提供用于降低血浆PTH和血清钙的方法。所述化合物可用于治疗具有例如以下疾病的受试者：原发性、继发性或三发性甲状旁腺功能亢进；恶性肿瘤的高钙血症；转移性骨病；或骨质疏松症。

Description

用于降低甲状旁腺激素水平的治疗剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年7月29日提交的美国临时申请号61/229,695和于2009年10月28日提交的美国临时申请号61/255,816和于2010年3月12日提交的美国临时申请号61/313,635的权益。这些申请中的每一个通过引用以其整体并入本文。

对序列表、表格或计算机程序的引用

经由EFS以文本文件形式电子呈提2010年7月29日生成并命名为″632008017WO00seqlist.txt″(85,400个字节)的序列表，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明主题涉及具有降低甲状旁腺激素(PTH)水平活性的化合物，涉及包含所述化合物的药物组合物，并涉及所述化合物和组合物在治疗方法中的用途，所述治疗包括但不限于治疗高钙血症或甲状旁腺功能亢进或调节体内PTH水平。

背景

钙稳态是身体通过其维持适当钙水平的机制。该过程受到高度调节，涉及钙吸收、转运、在骨中储存、在其它组织中沉积和排泄之间的复杂的相互作用。PTH为循环钙水平的调节剂，起着通过如下来增加血液中钙的浓度的作用：提高通过骨吸收过程自骨的钙释放；增加从肾小管再吸收钙；并通过增加1，25-(OH)₂维生素D(其为维生素D的活性形式)产生来提高肠道的钙吸收。PTH亦刺激自肾脏的磷排泄，并增加自骨的释放。

PTH分泌受到甲状旁腺细胞表面上的钙感受受体(calcium sensingreceptor，CaSR)的调节，CaSR为由若干细胞类型表达的G-蛋白偶联受体，其检测细胞外钙离子(Ca²⁺)浓度的小波动，通过改变PTH分泌进行响应。CaSR经由Ca²⁺的激活通过抑制囊胞输送在数秒到数分钟内抑制PTH分泌，该过程可受受体的蛋白激酶C(PKC)磷酸化作用的调节。亦在成骨细胞上和在肾脏中表达CaSR，在肾脏中CaSR调节肾Ca²⁺排泄。

另外，PTH调节磷稳态。PTH刺激在GI道的细胞的顶膜(刷状缘膜)和基底外侧膜二者上的甲状旁腺激素受体1(PTHR1)。PTHR1刺激导致增加磷酸盐(Pi)尿排泄，因为降低了肾Na⁺/磷酸盐(NaPi-IIa)协同转运蛋白在刷状缘膜的内化。

PTH亦参与骨中的成骨细胞和破骨细胞的调节。PTH通过增加钙的骨吸收和肾再吸收来提高循环Ca²⁺。PTH刺激成骨细胞产生RANK配体(RANKL)，所述配体与RANK受体结合，并激活破骨细胞，这导致骨吸收增加和血清Ca²⁺增加。护骨蛋白(OPG)为阻断骨吸收的RANKL的诱饵受体。骨质疏松症由经由破骨细胞的骨吸收过程和经由成骨细胞的骨形成过程之间的不平衡引起。

人体含有大约1kg钙，其中99％位于骨中。在正常条件下，循环钙离子(Ca²⁺)严格保持在约9-10mg/dL(即2.25-2.5mmol/L；约600mg)水平。每日摄取大约1g元素钙(Ca²⁺)。在该量中，大约吸收200mg/天，排泄800mg/天。另外，通过骨吸收释放大约500mg/天，或大约500mg/天沉积在骨中。每天约10g的Ca²⁺通过肾脏滤过，其中约200mg出现在尿中，其余的被重吸收。

高钙血症为血液中高钙水平。急性高钙血症可导致胃肠症状(厌食、恶心、呕吐)、肾症状(多尿、烦渴)、神经肌肉症状(抑郁、意识错乱、木僵、昏迷)和心脏症状(心动过缓、一级房室(first degreeatrio-ventricular))。慢性高钙血症亦与胃肠症状(消化不良、便秘、胰腺炎)、肾症状(肾石病、肾钙质沉着)、神经肌肉症状(衰弱)和心脏症状(高血压阻滞(hypertension block)、毛地黄敏感性)有关。可出现异常心律，短QT间隔和宽T波的EKG结果提示高钙血症。高钙血症可无症状的，其中症状更通常在高钙水平(12.0mg/dL或3mmol/l)出现。严重高钙血症(高于15-16mg/dL或3.75-4mmol/l)被认为是医疗急诊：在这些水平，可发生昏迷和心脏停搏。

高钙血症常常由甲状旁腺功能亢进引起，甲状旁腺功能亢进导致过量的骨吸收和高水平的血清钙。在原发性散发性甲状旁腺功能亢进中，PTH由单发性甲状旁腺腺瘤过度产生；较不常见的是，多发性腺瘤或弥散性甲状旁腺增生可为病因。增加PTH分泌导致净增加骨吸收，且释放Ca²⁺和磷酸盐(Pi)。PTH亦提高Ca²⁺的肾再吸收，并抑制磷酸盐(Pi)的再吸收，这导致血清钙净增加和磷酸盐降低。

当Ca²⁺水平的循环水平的降低刺激PTH分泌时发生继发性甲状旁腺功能亢进。继发性甲状旁腺功能亢进的一个起因是慢性肾机能不全(亦称为慢性肾病或CKD)，例如肾多囊性疾病或慢性肾盂肾炎中的慢性肾机能不全，或慢性肾衰竭，例如血液透析患者中的慢性肾衰竭(亦称为末期肾病或ESRD)。可因响应低血钙症而产生过量的PTH，所述低血钙症因低钙摄取、GI病症、肾机能不全、维生素D缺乏症和肾高钙尿症而产生。在长期继发性甲状旁腺功能亢进和高钙血症后可发生三发性甲状旁腺功能亢进。

恶性肿瘤(Malignancy)为非PTH介导的高钙血症的常见起因。恶性肿瘤的高钙血症是癌症的不常见但严重的并发症，其影响10％-20％的癌症患者，既可在实体瘤又可在白血病中发生。所述病况突然爆发，预后极差，生存中值仅为6周。生长因子(GF)调节肿瘤细胞中甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)的产生。肿瘤细胞可受到自分泌的GF的刺激以提高PTHrP的产生，这导致骨吸收增加。转移到骨的肿瘤细胞亦可分泌PTHrP，PTHrP可再吸收骨，并释放另外的GF，GF进而以旁分泌方式起作用以进一步提高PTHrP产生。

因此，期需具有例如体内调节PTH水平和/或钙水平活性的化合物。

简述

在一个方面，提供包含下式的化合物：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇，

其中X₁为包含含巯基的基团的亚单位；X₅为阳离子亚单位；X₆为非阳离子亚单位；X₇为阳离子亚单位；X₂、X₃和X₄中的至少一个(优选两个)独立为阳离子亚单位；其中所述化合物具有降低甲状旁腺激素浓度的活性。在一个实施方案中，甲状旁腺激素浓度的降低为用所述化合物治疗的受试者的血液或血浆甲状旁腺激素的浓度，相对于治疗之前的受试者的血液或血浆甲状旁腺激素浓度降低。在另一实施方案中，在缺乏组胺反应的情况下实现甲状旁腺激素浓度的降低。

在另一实施方案中，X₃和X₄为非阳离子的，而X₁、X₅、X₆和X₇为阳离子的。

在一个实施方案中，X₁亚单位为含巯基的氨基酸残基。在另一实施方案中，X₁亚单位的巯基为有机含巯基部分。

在另一实施方案中，当X₁亚单位为含巯基的氨基酸残基时，其选自L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、谷胱甘肽、n-乙酰化半胱氨酸、高半胱氨酸和PEG化半胱氨酸。

在又一实施方案中，有机含巯基部分选自巯基-烷基或硫代酰基部分，例如3-巯基丙基或3-巯基丙酰基、巯基丙酸、巯基乙酸、硫代苄基或硫代丙基。在再一实施方案中，有机含巯基部分为巯基丙酸。

在再一实施方案中，X₁亚单位经化学修饰以包含乙酰基、苯甲酰基、丁基或另一种氨基酸例如乙酰化β-丙氨酸。

在又一实施方案中，当X₁亚单位包含巯基部分时，通过共价键让X₁亚单位与第二巯基部分连接。

在另一实施方案中，式X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇由氨基酸残基的邻接序列(本文指定为(X_aa1)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)SEQ ID NO：1)或有机化合物亚单位(非氨基酸残基)的序列组成。

在另一实施方案中，氨基酸残基的邻接序列为L-氨基酸残基的邻接序列、D-氨基酸残基的邻接序列、L-氨基酸残基和D-氨基酸残基混合物的邻接序列或氨基酸残基和非天然氨基酸残基混合物的邻接序列。

在另一实施方案中，氨基酸残基的邻接序列与促进跨越细胞膜转运的化合物连接。在另一实施方案中，氨基酸残基的邻接序列与化合物连接，所述化合物增强该序列递送入一个或多个组织层或增强该序列跨越一个或多个组织层递送。

在另一实施方案中，氨基酸残基的邻接序列包含在8-50个氨基酸残基、8-40个氨基酸残基、8-30个氨基酸残基或8-20个氨基酸残基长的氨基酸残基序列中。在又一实施方案中，氨基酸残基的邻接序列包含在以下长度的氨基酸残基序列中：8-19个氨基酸残基、8-18个氨基酸残基、8-17个氨基酸残基、8-16个氨基酸残基、8-15个氨基酸残基、8-14个氨基酸残基、8-13个氨基酸残基、8-12个氨基酸残基、8-11个氨基酸残基、8-10个氨基酸残基或8-9个氨基酸残基。

在另一实施方案中，X₃亚单位为阳离子氨基酸残基。

在另一实施方案中，X₂亚单位为非阳离子氨基酸残基，在另一实施方案中，X₄亚单位为非阳离子氨基酸残基。在一个实施方案中，非阳离子氨基酸残基为D-氨基酸。

在另一实施方案中，X₃和X₄为阳离子D-氨基酸残基。

在另一实施方案中，X₅亚单位为D-氨基酸残基。

在另一方面，任何所述化合物中的邻接序列经由X₁亚单位中的含巯基的基团与第二个邻接序列共价连接。例如，第二邻接序列可与所述邻接序列相同(以形成二聚体)，或可不相同，如当与促进邻接序列跨越细胞膜转运的部分连接时的情况。

在另一方面，提供包含肽carrrar(SEQ ID NO：2)的缀合物，其中所述肽在其N-末端残基与Cys残基缀合。

在一个实施方案中，肽在N-末端、C-末端或二端被化学修饰。

在另一实施方案中，肽的N-末端通过乙酰化化学修饰，C-末端通过酰胺化化学修饰。

在另一实施方案中，缀合物为Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)。

在另一方面，考虑在受试者中治疗继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)的方法，其中将本文所述化合物提供给受试者。在不同实施方案中，受试者可罹患慢性肾病或其它病况。

在另一方面，考虑降低受试者甲状旁腺激素的方法，其中将本文所述化合物提供给受试者。

在另一方面，提供治疗方案，所述方案包括提供与第二作用剂组合的本文所述的任一种化合物。

在一个实施方案中，第二治疗剂为维生素D、维生素D类似物或盐酸西那卡塞。

在本文所述任何方面或实施方案中，考虑从权利要求范围中单独删除或移除任一个或多个序列。在某些实施方案中，由SEQ ID NO：162-182中任一个或多个确认的肽，单独或以任意组合从要求保护的化合物、组合物和方法中被排除。

附图简述

图1为急性肾机能不全大鼠(1K1C模型)中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，其中给予大鼠以下药物：Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4，菱形)、Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5、实心正方形)、Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6，三角形)、Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7，空心正方形)或盐水对照(x记号)；

图2A为作为Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26，正方形)和Ac-arrrar-NH₂(SEQ ID NO：29，三角形)化合物浓度的函数的IP₁浓度(nM)的图表，其为当在稳定转染的HEK-293细胞系中表达人CaSR时所述化合物在体外细胞测定中激活人CaSR的能力的衡量；

图2B显示体内给予鉴定为SEQ ID NO：26(Ac-carrrar-NH₂)(正方形)和SEQ ID NO：29(Ac-arrrar-NH₂)(菱形)的肽时PTH浓度的降低，其中肽以SEQ ID NO：299mg/kg和SEQ ID NO：260.5mg/kg的剂量作为IV推注给予正常Sprague Dawley大鼠。用盐水的静脉(IV)推注作为对照(虚线)。在给药前和给药后1、2、3和4小时评估血浆PTH水平。结果表示为组平均值±标准偏差(SD)，PTH表示为给药前基线值的百分比；

图3为比较在正常Sprague Dawley大鼠中IV推注给予各种化合物后的组胺释放的柱状图，其中以2.1μmol/kg的等摩尔的IV推注剂量给予化合物Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)、Ac-crrrrr-NH₂(SEQ IDNO：5)、Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和Ac-crrrrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：41)，在给药之前(给药前)、给药后5、15和30分钟测量血浆组胺；

图4为比较在正常Sprague Dawley大鼠中IV推注给予两种化合物后的组胺释放的柱状图，其中以3mg/kg给予化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3，网纹柱状图)和Ac-crrrrrr-NH₂(SEQID NO：6，空心柱状图)，在给药前(零时间)、给药后5、15和30分钟测量血浆组胺；

图5为在正常大鼠中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，所述大鼠通过IV推注给予0.5mg/kg以下药物：Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6，菱形)、Ac-carrrrr-NH₂(SEQ ID NO：8，正方形)、Ac-crarrrr-NH₂(SEQ IDNO：9，三角形)、Ac-crrarrr-NH₂(SEQ ID NO：10，x记号)、Ac-crrrarr-NH₂(SEQ ID NO：11，*记号)、Ac-crrrrar-NH₂(SEQ IDNO：12，圆形)或Ac-crrrrra-NH₂(SEQ ID NO：13，+记号)；

图6A-6B为在健康大鼠中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，所述大鼠通过IV推注给予0.5mg/kg以下药物：Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26，空心菱形)、Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：25，空心正方形)、Ac-caarrrr-NH₂(SEQ ID NO：22，三角形)、Ac-crraarr-NH₂(SEQ ID NO：17，实心正方形)、Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3，图6B菱形)、Ac-craarrr-NH₂(SEQ ID NO：24，图6A中的x记号)；Ac-c(C)rrarar-NH₂(SEQ IDNO：28，x记号，图6B)；

图7显示对于化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)，作为时间的函数的血液中的甲状旁腺激素水平的降低，所述化合物作为IV推注以以下剂量给予至正常Sprague Dawley大鼠：1mg/kg(菱形)、0.5mg/kg(正方形)、0.3mg/kg(三角形)和0.1mg/kg(x记号)。用盐水的静脉(IV)推注(圆形)作为对照。在给药前和给药后1、2、3和4小时评估血浆PTH水平。

图8为在急性肾机能不全大鼠(1K1C模型)、急性肾机能不全1K1C模型大鼠中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，其中大鼠经由IV推注给予以下剂量的化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)或者盐水(正方形)：3mg/kg(菱形)、1mg/kg(三角形)、0.5mg/kg(正方形)和0.3mg/kg(x记号)；图8中的虚线表示给药前的基线PTH水平；

图9为大鼠中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，所述大鼠静脉内用盐水(x记号)或经由30分钟IV输注以1mg/kg用化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6，空心菱形)和Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26，空心正方形)给药，其中在给药前、给药后16小时和24小时评估血浆PTH水平；

图10为在急性肾机能不全大鼠(1K1C模型)中作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表，其中大鼠经由IV推注以0.3mg/kg(正方形，三角形)和0.5mg/kg(*，菱形)的剂量给予化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3，正方形，*记号)和Ac-c(Ac-C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：146，三角形，菱形)；

图11为在经由微孔促进的透皮递送Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6，两只动物，正方形和三角形)治疗或经由透皮递送用盐水(菱形)治疗的大鼠中，作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表；

图12为在经由微孔促进的透皮递送Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ IDNO：3)治疗的大鼠中，作为以小时计的时间的函数的以给药前基线值的百分比表示的甲状旁腺激素水平的图表；

图13为在正常Sprague-Dawley大鼠中6小时IV输注Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)期间及之后的平均PTH(作为基线的百分比)的图表，其中化合物以1μg/kg/小时(正方形)、3μg/kg/小时(圆形)和10μg/kg/小时(三角形)速率输注；

图14A显示在急性肾机能不全1K1C大鼠模型中6小时IV输注Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)期间及之后的PTH(作为基线的百分比)，其中以30μg/kg/小时(菱形)和100μg/kg/小时(正方形)给药速率静脉内输注大鼠；

图14B为显示如在图14A中治疗的1K1C模型大鼠中以mg/dL计的血清钙的柱状图。

通过参考以下本文包括的优选实施方案和实施例的详细说明，可更易于理解本发明主题。

详细说明

I.定义

在本申请中，除非另外指出，否则本申请的术语定义和技术阐明可参考任何若干著名参考书，例如：Sambrook，J.，等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Goeddel，D.编辑，Gene Expression Technology，Methods inEnzymology，185，Academic Press，San Diego，CA(1991)；“Guide toProtein Purification”载于Deutshcer，M.P.编辑，Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA(1989)；Innis，等，PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Freshney，R.I.，Culture of Animal Cell：A Manual of BasicTechnique，第2版，Alan Liss，Inc.New York，NY(1987)；Murray，E.J.编辑，Gene Transfer and Expression Protocols，第109-128页，TheHumana Press Inc.；Clifton，NJ和Lewin，B.，Genes VI，OxfordUniversity Press，New York(1997)。

除非另外指出，否则本文所用单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数提及物。例如，“一种”调节剂肽包括一种或多种调节剂肽。

如本文所用的，在以下情况时，化合物具有“降低甲状旁腺激素水平的活性”或“降低PTH的活性”：化合物当给予受试者时相对于给予化合物之前的血浆PTH浓度降低血浆甲状旁腺激素(PTH)。在一个实施方案中，PTH水平的降低为在给予化合物后1小时比给予化合物之前的PTH水平低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

本文所用“不存在组胺反应”或“缺乏组胺反应”，意指产生在本文所述测定中在体外测量的小于15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍或3倍的组胺增加的化合物量，其中倍数变化基于与化合物孵育之前和与化合物孵育15分钟后的组胺水平来测定。

本文所用“氨基酸”是指天然和非天然氨基酸。通过含前缀“L-”(非手性的甘氨酸除外)的三字母代码或通过大写字母的一字母代码来指明二十种天然存在的氨基酸(L-异构体)：丙氨酸(“L-Ala”或“A”)、精氨酸(“L-Arg”或“R”)、天冬酰胺(“L-Asn”或“N”)、天冬氨酸(“L-Asp”或“D”)、半胱氨酸(“L-Cys”或“C”)、谷氨酰胺(“L-Gln”或“Q”)、谷氨酸(“L-Glu”或“E”)、甘氨酸(“Gly”或“G”)、组氨酸(“L-His”或“H”)、异亮氨酸(“L-Ile”或“I”)、亮氨酸(“L-Leu”或“L”)、赖氨酸(“L-Lys”或“K”)、甲硫氨酸(“L-Met”或“M”)、苯丙氨酸(“L-Phe”或“F”)、脯氨酸(“L-Pro”或“P”)、丝氨酸(“L-Ser”或“S”)、苏氨酸(“L-Thr”或“T”)、色氨酸(“L-Trp”或“W”)、酪氨酸(“L-Tyr”或“Y”)和缬氨酸(“L-Val”或“V”)。L-正亮氨酸和L-正缬氨酸可分别表示为(NLeu)和(NVal)。十九种天然存在的手性氨基酸具有相应的D-异构体，其通过含前缀“D-”的三字母代码或通过小写字母的一字母代码来指明：丙氨酸(“D-Ala”或“a”)、精氨酸(“D-Arg”或“r”)、天冬酰胺(“D-Asn”或“a”)、天冬氨酸(“D-Asp”或“d”)、半胱氨酸(“D-Cys”或“c”)、谷氨酰胺(“D-Gln”或“q”)、谷氨酸(“D-Glu”或“e”)、组氨酸(“D-His”或“h”)、异亮氨酸(“D-Ile”或“i”)、亮氨酸(“D-Leu”或“l”)、赖氨酸(“D-Lys”或“k”)、甲硫氨酸(“D-Met”或“m”)、苯丙氨酸(“D-Phe”或“f”)、脯氨酸(“D-Pro”或“p”)、丝氨酸(“D-Ser”或“s”)、苏氨酸(“D-Thr”或“t”)、色氨酸(“D-Trp”或“w”)、酪氨酸(“D-Tyr”或“y”)和缬氨酸(“D-Val”或“v”)。D-正亮氨酸和D-正缬氨酸可分别表示为(dNLeu)和(dNVal)。尽管通常关于肽、多肽或蛋白质单体亚单位使用“氨基酸残基”，通常关于游离分子使用“氨基酸”，但本领域中这些术语的使用重叠并变化。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”可互换使用，视上下文而定可指游离分子或肽、多肽或蛋白质的单体亚单位。

为了测定两个氨基酸序列的“同源性”百分比或“同一性”百分比，为最佳比较目的比对所述序列(例如为了与另一多肽的最佳比对可将空位引入一个多肽的序列中)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的位置被与另一序列中相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置同一。本文所用氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”。因此，两个序列之间的序列同一性百分比为所述序列共有的同一位置数目的函数(即序列同一性百分比＝同一位置的数目/总位置数目x 100)。可用Vector NTI软件包(InvitrogenCorporation，5791 Van Allen Way，Carlsbad，CA 92008)测定两个多肽序列之间的序列同一性百分比。用空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1来测定两个多肽同一性的百分比。所有其它参数设置为缺省设置。

“阳离子氨基酸”意指在生理pH(7.4)下具有净正电荷的氨基酸残基，如例如在以下氨基酸残基中的情况，在所述氨基酸残基中侧链或“R基团”含有胺官能团或在生理pH下可接受质子而带正电荷的其它官能团(例如胍或咪唑部分)。阳离子氨基酸残基包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、2，3-二氨基丙酸(Dap)、2，4-二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸和高精氨酸。

“阳离子亚单位”意指在生理pH(7.4)下具有净正电荷的亚单位。

本文所用“保守氨基酸取代”是不导致所选择的多肽或蛋白质的活性或三级结构显著改变的取代。所述取代通常涉及用具有相似物理化学性质的不同氨基酸残基置换所选择的氨基酸残基。根据物理化学性质来对氨基酸及氨基酸残基的分组为本领域技术人员所知。例如，在天然存在的氨基酸中，本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

本文所用“化学交联”，是指两个或更多个分子共价键合。

若肽或肽片段具有与母体肽或多肽的至少5个氨基酸残基、更优选8个氨基酸残基的邻接序列同一或同源的氨基酸序列，则所述肽或肽片段“源自”所述母体肽或多肽。

除非另外指出，否则本文所用术语“甲状旁腺功能亢进”是指原发性、继发性和三发性甲状旁腺功能亢进。

术语“皮内”意指在本文所述治疗方法中，将治疗有效量的拟钙化合物(calcimimetic compound)施用至皮肤以将所述化合物递送到角质层下的皮肤层，由此达到所期需的治疗效果。

本文所用“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分，当通过重组DNA技术产生时不含某些细胞材料，或当化学合成时不含化学前体或其它化学药品。表述“基本上不含细胞材料”包括这样的多肽制备物，其中所述多肽与天然或重组产生它的细胞的某些细胞组分分离。当多肽或其生物学活性部分为重组产生时，其亦优选基本上不含培养基，即培养基占多肽制备物体积的小于约20％、更优选小于约10％和最优选小于约5％。表述“基本上不含化学前体或其它化学药品”包括这样的多肽制备物，其中所述多肽与化学前体或在多肽合成中涉及的其它化学药品分开。在一个实施方案中，表述“基本上不含化学前体或其它化学药品”包括这样的多肽制备物，其具有小于约30％(干重)的化学前体或其它化学药品，优选小于约20％的化学前体或其它化学药品，更优选小于约15％的化学前体或其它化学药品，甚至更优选小于约10％的化学前体或其它化学药品，最优选小于约5％的化学前体或其它化学药品。在优选实施方案中，分离的多肽或其生物学活性部分没有来自结构域多肽所来源的同一生物体的污染多肽。

本文所用“大分子”是指诸如肽、多肽、蛋白质或核酸等分子，其通常具有大于约900道尔顿的分子量。

“非阳离子氨基酸”意指在生理pH(7.4)下不带电荷或带净负电荷的氨基酸残基，如例如在以下氨基酸残基中的情况，在所述氨基酸残基中侧链或“R基团”为中性(中性极性和中性非极性)和酸性的。非阳离子氨基酸包括这样的残基：其具有作为烃烷基或芳族部分的R基团(例如缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)；中性极性R基团(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸)；或中性非极性R基团(甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)。具酸性R基团的非阳离子氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

“聚合物”是指通过共价键连接的两个或更多个相同或不同亚单位的线性链。

本文所用“肽”和“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基链构成的任何聚合物，而不管其大小。尽管通常关于相对大的多肽使用“蛋白质”，通常关于小多肽使用“肽”，但这些术语的使用在本领域重叠并变化。因此，为简单起见，本文将使用术语“肽”，但在一些情况下本领域可将同一聚合物称为“多肽”。除非另外指出，否则肽序列以从氨基末端到羧基末端的次序给出。

本文所用“含巯基的基团”或“含巯基部分”意指包含硫-氢键(-SH)且在生理条件下能够与另一巯基反应形成二硫键的官能团。能够与另一巯基形成二硫键的巯基本文称为“活性巯基”。在优选实施方案中，含巯基的基团离化合物骨架少于6个原子。在更优选实施方案中，含巯基的基团具有结构(-SH-CH₂-CH₂-C(O)-O-)-。

本文所用“小分子”是指大分子以外的分子，例如有机分子，其通常具有小于1000道尔顿的分子量。

本文所用“受试者”是指人受试者或动物受试者。

“亚单位”意指单体单位，其与不止一个其它单体单位连接以形成多聚化合物，其中亚单位是多聚化合物中要素的最短重复模式。例示性亚单位为氨基酸，其当连接时形成聚合物化合物，例如本领域称为肽、多肽或蛋白质的聚合物化合物。

本文所用“治疗有效量”，是产生所期需治疗效果所需的量。例如，在用于降低高血钙受试者血清钙的方法中，治疗有效量为将血清钙水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或25％所需的量。钙可作为总钙或作为离子化钙测量。举另一个实例，在用于降低体内PTH的方法中，治疗有效量为降低PTH水平至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或25％所需的量。

本文所用术语“透皮”，意即在本文所述治疗方法中，将治疗有效量的拟钙剂施用至皮肤以将所述化合物递送到全身循环，由此达到所期需治疗效果。

除非另外规定，否则本文提及的所有文件都通过引用以其整体结合。

II.化合物

在一方面，提供包含亚单位的序列X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇的化合物，其中X₁为包含巯基的亚单位；X₅为阳离子亚单位；X₆为非阳离子亚单位；X₇为阳离子亚单位；X₂、X₃和X₄中的至少两个独立为阳离子亚单位。化合物具有降低受试者血液中的甲状旁腺激素(PTH)水平和/或钙水平的活性。如以下所阐明，甲状旁腺激素水平的降低，意指相对于用化合物治疗前的血浆或血液PTH浓度，受试者血浆或血液PTH浓度的降低。在一个实施方案中，相对于给药前的血浆PTH，化合物达到在给药后1小时内降低血浆PTH浓度至少50％。所述化合物通过肽例示，但技术人员了解的是，可基于本文所述结构-活性研究设计具有所期需活性的非肽化合物。

本文所用甲状旁腺激素或PTH是由甲状旁腺产生的84个氨基酸的肽及其分解产物。除了全长PTH(其由残基1-84组成，有时称为“完整”的“生物活性”PTH)，血液中存在由蛋白水解及其它代谢途径产生的各种PTH片段。完整PTH分子的氨基末端1-34的区域具有生物活性。分子的该区域含有使PTH能够与靶标组织中的甲状旁腺激素受体结合的氨基酸序列。认为完整PTH分子的中间和羧基末端35-84的区域无生物学活性，但具有免疫学反应性。认为PTH 7-84发挥与1-84PTH相反的作用。业已开发了不同测定来测量PTH水平(包括各种分解产物)，这些测定由Souberbielle等，Kidney International，77：93-100(2010)综述，该文献通过引用并入本文。在一个实施方案中，用验证过的检测PTH(1-84)的完整生物活性形式的PTH定量方法确定本文定义的具有降低PTH水平活性的化合物，市售试剂盒已为本领域所知(例如参见本文实施例3)。

在第一个研究中，产生了含有4-7个阳离子(例如精氨酸)亚单位的化合物，并与基线PTH值和盐水治疗的动物相比测试其降低PTH的能力。具体而言，建立急性肾机能不全1K1C模型，用于在肾功能障碍环境中表征降低PTH的活性。在实施例1A中阐述了1K1C模型，合成用于测试的化合物包括：(i)Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)、(ii)Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)、(iii)Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)、(iv)Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7)和(v)盐水对照。

如实施例1B所述，通过30分钟IV输注将鉴定为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的化合物各自给予1K1C模型动物。图1显示作为给药前(基线)水平的百分比的血浆PTH水平的降低。以3mg/kg给予的所有四种化合物导致血浆PTH显著降低，但PTH降低的效价及持续时间的差异提示净正电荷和降低PTH的活性之间的关系。例如，具有6个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6；三角形)，与分别含有4个和5个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4；菱形)和Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5；正方形)相比，具有提高的功效以及增加的作用持续时间。令人惊讶的是，与具有7个阳离子(精氨酸)残基的化合物Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7，空心正方形)相比，具有6个阳离子(精氨酸)亚单位的化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6；三角形)具有增加的作用持续时间，这表明化合物的活性或效价不仅仅与化合物的阳离子电荷的增加有关。也就是说，具有7个阳离子亚单位(精氨酸残基)的化合物Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7)，产生与具有更少阳离子残基的化合物相似的初始PTH降低，但在给药后24小时内，效价不如Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)。这些后两种化合物在24小时时间点，分别产生约40％和60％的平均PTH降低。PTH降低的程度和PTH持续时间二者都是获得对需要治疗的患者最佳治疗益处的重要标准。应该注意，在本研究中以相同mg/kg剂量给予化合物，但是，由于分子量不同，实际上给予不同摩尔数量的每一种化合物。因此，在每摩尔基础上，Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)比Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)和Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)明显更有效。

为了探索化合物的结构-活性关系，进行了进一步研究。通过在每一X₂-X₇亚单位位置用丙氨酸残基序贯置换精氨酸残基，来修饰化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)。在实施例2所述的体外人钙感受受体(CaSR)测定中表征化合物，其中用表达人钙感受受体的HEK 293细胞来测量例示性化合物的活性。不希望受理论的束缚，认为所述化合物体内降低PTH的机理是通过激活CaSR来进行的，CaSR在甲状旁腺中表达并控制PTH分泌。激活CaSR导致细胞内钙和肌醇-3-磷酸(IP3)的增加，并随后聚积肌醇-磷酸-1(IP₁)。因此，在该体外测定中，测定化合物降低IP₁产生达50％的半数最大有效浓度(EC₅₀)。如实施例3所述，亦在体内检测同一化合物以测定其降低PTH的活性。结果示于表1中。表1中标题为“盐水对照的PTH AUC(1-4小时)％”的栏目中的数值，定义活性为作为得自盐水治疗的对照大鼠PTH AUC的百分比的在4小时内PTH的曲线下面积(AUC)的降低。例如，等于0的AUC(化合物治疗的)/AUC(盐水对照)*100，表示高活性的降低PTH的化合物，其在单次IV给予异氟烷(IF)麻醉的正常大鼠后完全抑制PTH(到不能检测的水平)持续4小时。与此相反，等于或大于100的AUC(化合物治疗的)/AUC(盐水对照)*100的值，表示无活性的化合物。

表1

例示性化合物的体外和体内活性

^*粗体字体表示阳离子氨基酸(SEQ ID NO：6中的D-精氨酸)的D-丙氨酸取代

^**在异氟烷麻醉的正常大鼠中0.5mg/kg IV给予后的PTH降低--在给予后1、2、3和4小时测量PTH，并计算累积AUC。按照下式计算PTH数据：AUC_{化合物治疗的}/AUC_盐水对照*100。

在表1中，化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)、Ac-carrrrr-NH₂(SEQ ID NO：8)和Ac-crrarrr-NH₂(SEQ ID NO：10)非常有效，如由PTH百分比降低到低于检测限或基本上为0(如在正常大鼠中单次IV给予后体内所测量的)所证明。Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的2、3、4或7位阳离子(精氨酸)残基的取代导致体外效价减少至大约1/2。产生化合物Ac-crrrarr-NH₂(SEQ ID NO：11)的5位取代导致体外效价降低至1/5-1/10，但体内PTH AUC百分比降低45％可能对于临床治疗足够活性。令人惊讶的是，在6位用不带电荷的(丙氨酸)残基取代阳离子精氨酸残基实际上改进效价。数据表明不同位置的阳离子及不带电荷的残基并不全都对等，因化合物结构的变化所致活性也有变化。

为了进一步评估作为化合物结构的变化的函数的活性的变化，产生含有双氨基酸取代(其中两个阳离子(精氨酸)残基被不带电荷的(丙氨酸)残基置换)的另一系列的Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)类似物，并检测其效价。数据示于表2中。值得注意的是，该系列化合物具有与SEQ ID NO：4(四个阳离子残基)相同的净阳离子电荷，但令人惊讶的是一些极有活性(SEQ ID NO：26)和极低的盐水对照PTH AUC％，而其它的无活性(例如SEQ ID NO：14)。出乎意料之外的是，这表明电荷位置以及总阳离子电荷可影响化合物对PTH降低的效价。示于表2中的数据与示于表1中的数据一致，这表明对于降低PTH的活性，SEQ IDNO：6的阳离子残基在5和7位必不可少，但在6位并不需要。

表2

例示性化合物的体内活性

^*粗体字体表示Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)中阳离子氨基酸(D-精氨酸)各自的D-丙氨酸取代

^**在异氟烷(isofluorine)麻醉的正常大鼠中0.5mg/kg IV给予后的PTH降低--在给予后1、2、3和4小时测量PTH，并计算累积AUC。按照下式计算PTH数据：AUC_{化合物治疗的}/AUC_盐水对照*100。

表2中的数据阐明了影响活性的结构变化。在一个实施方案中，化合物为Ac-caarrrr-NH₂(SEQ ID NO：22)，在另一实施方案中，化合物为Ac-craarrr-NH₂(SEQ ID NO：24)。

在表达人钙感受受体的HEK 293细胞中用体外细胞测定进一步进行结构-活性关系研究，其如实施例4所述。通过测量肌醇单磷酸(IP₁)的聚积来确定肽Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)和Ac-arrrar-NH₂(SEQID NO：29)激活人CaSR的能力，肌醇一磷酸(IP₁)反映IP₃的产生。IP₃产生是重要的细胞信号转导的第二信使，其产生是CaSR激活的直接下游结果。通过用氯化锂(LiCl₂)处理测定中所用的细胞，可获得IP₃产生后的IP₁聚积，氯化锂抑制将IP₁转化为肌醇的酶。在实施例4所述研究中，在例示性化合物Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)和Ac-arrrar-NH₂(SEQ ID NO：29)存在下测量IP₁聚积。结果示于图2A中。

IP₁浓度以nM沿Y-轴报告，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：29化合物浓度以M沿X-轴报告。来自SEQ ID NO：29的N-末端D-半胱氨酸残基的缺失，与SEQ ID NO：26相比急剧降低化合物激活CaSR的能力。也就是说，N-末端半胱氨酸残基的消除显著降低化合物的效价，因为肽Ac-carrrar-NH(SEQ ID NO：26)和Ac-arrrar-NH₂(SEQ ID NO：29)仅在存在或缺乏N-末端D-半胱氨酸上不同。

在体内研究中同样研究了化合物X₁亚单位中含巯基的基团的贡献(例如在其中化合物为在N-末端残基上的肽的某些实施方案中)。按照实施例4中的程序，体内评价鉴定为SEQ ID NO：26(Ac-carrrar-NH₂)和SEQ ID NO：29(Ac-arrrar-NH₂)的肽降低PTH的活性。在给药前和给药后1、2、3和4小时评估血浆PTH水平。结果示于图2B中。如所见，在给药后，0.5mg/kg剂量的肽Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)(正方形)降低PTH血液浓度到不可检测水平达至多4小时。与此相反，缺乏具有含巯基的基团的N-末端残基的肽Ac-arrrar-NH₂(SEQ IDNO：29)(菱形)，即使是在基本上较高剂量(即9mg/kg)下也不降低PTH浓度。

通过用不同的X₁亚单位制备化合物，来进一步分析化合物X₁亚单位中的含巯基的基团的结构-活性关系。体内检测了表3中所示化合物在正常大鼠中降低PTH的活性。

表3

例示性化合物的体内活性

^*粗体字体表示Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)中含巯基的残基(D-半胱氨酸)各自的取代。

表3中的数据阐明含巯基的X₁亚单位可变化。检测了含以下N-末端残基的化合物：D-半胱氨酸(cys)、D-青霉胺(dPen)、d-高半胱氨酸(dHcy)和巯基丙酸(Mpa)。另外，可让天然或非天然氨基酸例如β丙氨酸与N-末端含巯基的残基缀合。数据阐明在X₁亚单位中含有不同含巯基的基团的阳离子化合物例如Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)，在体内有效降低PTH。用不含巯基的甲硫氨酸取代N-末端半胱氨酸残基，导致产生具有极差体内降低PTH的活性的化合物(数据未显示)。

基于以上研究，亚单位X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇的邻接序列的化合物具有降低甲状旁腺激素水平的活性，其中X₁为包含含巯基的基团的亚单位。在一个实施方案中，X₁亚单位上的含巯基的基团选自含巯基的氨基酸残基和有机含巯基部分。在另一实施方案中，含巯基的基团在生理pH和温度下能够与另一巯基反应。在其中含巯基的残基为氨基酸残基的某些实施方案中，X₁亚单位可为半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基-丙酸、n-乙酰化半胱氨酸和PEG化半胱氨酸中的任何一种。在其中含巯基的基团在非氨基酸残基亚单位(例如具有含巯基的基团的有机小分子)上的实施方案中，X₁亚单位可为巯基-烷基或硫代酰基部分，例如3-巯基丙基或3-巯基丙酰基残基。在一个实施方案中，硫醇不是高半胱氨酸。

因此，在另一实施方案中，本文所述化合物具有“降低甲状旁腺激素水平的临床活性”，其意指化合物在给予受试者后降低血浆甲状旁腺激素，其通过与相应溶媒治疗的对照受试者的PTH AUC相比，在给予后4小时内的累积PTH曲线下面积(PTH AUC)来测定。用例如检测生物活性完整的PTH 1-84的市购ELISA试剂盒(具体试剂盒参见实施例3)测量血浆PTH浓度。具有降低甲状旁腺激素水平的临床活性的化合物与相应溶媒治疗的对照受试者相比，降低PTH AUC至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。

以上研究和以下所述其它研究，阐明本文所述化合物的另外的实施方案，其中一些实施方案中的X₁亚单位可经化学修饰，例如通过化学修饰以包含乙酰基、苯甲酰基、苯甲基、丁基、天然或非天然氨基酸(例如乙酰化-β-丙氨酸)，或通过共价键与另一巯基部分连接。肽治疗剂可易于受到肽酶的攻击。外肽酶通常为从肽或蛋白质的氨基或羧基末端切割氨基酸残基的非特异性酶。在氨基酸序列内切割的内肽酶亦可为非特异性的；然而，内肽酶经常识别特定氨基序列(识别位点)，并在或靠近那些位点处切割肽。因此，考虑对化合物进行修饰以保护其免受蛋白水解降解。

保护肽免受蛋白水解降解的一种方法涉及化学修饰，或给肽的氨基和/或羧基末端“封端(capping)”。本文所用术语“化学修饰的”或“封端的”可互换使用，是指经由共价修饰给化合物的一个末端或两个末端引入保护基团。合适的保护基团起着给肽末端封端但不降低肽的生物活性的作用。可化学修饰位于所述化合物的氨基或羧基末端或者两者的任何残基，包括含巯基的亚单位。

在优选实施方案中，通过乙酰化化学修饰化合物的氨基末端，来产生N-乙酰基肽(其在本文结构或式中可表示为“Ac-”)。在优选实施方案中，通过酰胺化化学修饰所述肽的羧基末端以在C-末端产生伯羧酰胺(其在本文肽序列、结构或式中可表示为“-NH₂”)。在优选实施方案中，分别通过乙酰化和酰胺化化学修饰氨基末端和羧基末端两端。然而，其它封端基团是可能的。例如，氨基末端可通过用诸如乙酰基、苯甲酰基等基团进行酰化来封端，或用天然或非天然氨基酸例如用乙酰基封端的β-丙氨酸来封端，或通过用诸如苯甲基或丁基等基团进行烷化来封端，或通过磺酰化以形成磺酰胺来封端。类似地，羧基末端可被酯化或转化为仲酰胺和酰基磺酰胺等等。在一些实施方案中，氨基末端或羧基末端可包含用于连接聚乙二醇(PEG)部分的位点，即氨基或羧基末端可通过与适宜地官能化PEG反应来进行化学修饰。

保护肽免受内肽酶作用通常涉及鉴别并从肽消除内肽酶识别位点。蛋白酶识别位点为本领域普通技术人员所熟知。因此，鉴定可能的内切蛋白酶识别位点并随后通过改变识别位点内的氨基酸序列来消除该位点是可能的。可移动或移走识别序列中的残基以破坏识别位点。优选用包含经鉴定的蛋白酶识别位点的一种或多种氨基酸来进行保守取代。

A.另外的结构-活性关系研究

进行了另外的结构活性研究，以进一步评估化合物中的每一个亚单位的性质对其治疗活性的影响。现在参考实施例5来阐述这些研究。

基于降低PTH的支架Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)来制备具有L-氨基酸残基取代D-氨基酸残基的系列化合物。如实施例5所述，将所述化合物给予受试者，在给药前和给药后1、2、3和4小时评估血浆PTH水平，计算AUC为1、2、3和4小时时间点的PTH浓度值的总和，所述PTH浓度值根据同一时间点的盐水对照的AUC来标准化并乘以100而得到。结果示于表4中。

表4

L-氨基酸取代对效价的影响

^*在异氟烷麻醉的正常大鼠中0.5mg/kg IV给予后的PTH降低--在给予后1、2、3和4小时测量PTH，并计算累积AUC。按照下式计算PTH数据：AUC_{化合物治疗的}/AUC_盐水对照*100。

表4中所示例示性化合物在N-末端和C-末端两端经化学修饰，如由Ac和NH₂标示所指出。通过一次用一个L-氨基酸置换一个亚单位来修饰7个亚单位的序列carrrar(SEQ ID NO：3)，其中所有亚单位都为D-氨基酸残基。X₁亚单位为经由二硫键与L-Cys残基缀合的D-Cys残基(或SEQ ID NO：34中的L-Cys残基)，如圆括号标示(C)所指出。表4中的体内降低PTH的数据显示Arg和Ala的手性影响化合物的活性。在一个实施方案中，考虑序列为X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇的化合物，其中至少确定为X₄和X₇的亚单位为D-氨基酸残基亚单位。在另一实施方案中，确定为X₄、X₅、X₆和X₇的亚单位为D-氨基酸残基亚单位。在优选实施方案中，确定为X₃、X₄、X₅、X₆和X₇的亚单位为D-氨基酸残基亚单位。在最优选实施方案中，确定为X₂、X₃、X₄、X₅、X₆和X₇的亚单位为D-氨基酸残基亚单位，和亚单位X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆和X₇全部为D-氨基酸残基亚单位。

在其它研究中，亦发现具有用所有D-氨基酸取代所有L-氨基酸的肽不降低所测肽的体外活性；实际上，完全由D-氨基酸组成的肽似乎提高激活CaSR的效价。亦显示在相对于半胱氨酸残基的特定位置，一些阳离子(精氨酸)残基可用对针对CaSR的活性影响最小的不带电荷的(丙氨酸)残基取代。

为了进一步表征结构和针对CaSR的活性之间的关系，用HEK-293体外细胞测定来测试多种具有不同数目(4-8个)精氨酸残基的阳离子肽(所有的都含有N-末端半胱氨酸)。发现阳离子亚单位数目和化合物效价之间的直接关系，其中由激活CaSR的能力来表明效价。将阳离子(例如精氨酸)亚单位数目从5个减到4个导致效价最大改变(＞10倍)，这提示在具有这些净电荷的化合物之间可能有活性拐点，亚单位X₅处的阳离子亚单位对于活性为优选的。因此，预期结构为X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇的化合物，其中X₅为阳离子亚单位。在某些实施方案中，X₁为包含在生理条件下能够与另一巯基反应的巯基(“活性巯基”，其意指在pH 7.4和体温的生理条件下与另一巯基(例如半胱氨酸与半胱氨酸)反应的巯基)的亚单位。

令人意外的是，当在体内评估具6个阳离子残基的Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)时，其表现出比具有8个阳离子残基的Ac-crrrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：41)更高和更长时间的活性。这与在该体外细胞测定中SEQ ID NO：41在激活CaSR方面更有效这一观察形成对照。不希望受理论的束缚，认为Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的体内优异表现可能由Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的较好的药代动力学性质造成，因为由于其细胞渗透特性，预期Ac-crrrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6441被吸收到细胞中，并由此离开CaSR的活性部分的附近。

为了进一步探索Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的结构-活性关系，用不带电荷的(丙氨酸)残基置换一些阳离子(精氨酸)残基。发现在X₂和X₄亚单位位置置换阳离子(精氨酸)残基，产生体外激活CaSR的效价显著降低的化合物(SEQ ID NO：15)。相比之下，在X₂和X₆亚单位位置置换阳离子(精氨酸)残基，产生保持用Ac-crrrrrr-NH₂(SEQID NO：6)观察到的效价的大部分的化合物(SEQ ID NO：26)。这些结果表明化合物中带电荷残基的位置有利于效价，在一些实施方案中，可超过肽的总正电荷的贡献。亦显示某些位置例如X₅亚单位位置的阳离子(精氨酸)残基对效价的贡献不匀称。

发现N-末端半胱氨酸的存在显著提高肽激活CaSR的效价。CaSR为7-跨膜G-蛋白质偶联受体，其具有作为同型二聚体受体起作用的大的胞外域。胞外域有18个半胱氨酸残基，其中一些通过多态性或突变分析显示对受体活性重要。尤其要注意的是胞外域的环2区的半胱氨酸129和131。认为半胱氨酸129和131在受体复合体的两个单体间形成分子间二硫键，所述受体复合体呈封闭的或受抑制的构型。半胱氨酸129的突变激活CaSR，包括环2区的全部缺失在内的多种其它突变也是这样。在所述化合物中由N-末端半胱氨酸残基提供的提高的效价，可因与CaSR的胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基的特异性相互作用而产生。

为了进一步评估氨基酸取代手性对体外CaSR活性的影响，产生含在不同位置的L-氨基酸或非手性氨基酸(甘氨酸)取代的一系列Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的类似物，并测定其针对CaSR的效价。测试类似物包括Ac-cGrrrGr-NH₂(SEQ ID NO：42)、(ii)Ac-cArrrAr-NH₂(SEQ ID NO：43)和(iii)Ac-CaRrRaR-NH₂(SEQ IDNO：44)。所有前述类似物具有比Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)显著低的效价，在SEQ ID NO：44(3种类似物中最有效的)的10倍差异和SEQ ID NO：43(3种类似物中最不有效的)的超过2000倍差异的范围内变化。其中SEQ ID NO：6的2和6位阳离子D-氨基酸残基(D-精氨酸残基)被不带电荷的D-氨基酸残基(D-精氨酸残基)置换的Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)的活性变化少得多(约3倍差异)。因此，令人惊讶地发现，用两个或更多个L-氨基酸残基打断Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的全部D-氨基酸残基，导致效价显著降低。同样令人惊讶的是，当打断残基为不带电荷的非手性氨基酸残基(甘氨酸残基)时，与当其为不带电荷的L-氨基酸残基(L-丙氨酸残基)时相比，效价降低超过80倍。

同样令人惊讶的是，用其L-对应物置换Ac-carrrar-NH₂(SEQ IDNO：26)的两个不带电荷的D-氨基酸残基(D-丙氨酸残基)(SEQ IDNO：43)，导致效价大于600倍的降低，而用不带电荷的非手性氨基酸残基(甘氨酸残基)置换它们(SEQ ID NO：42)，导致效价低于8倍的降低；用其L-对应物置换Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)的三个阳离子D-氨基酸残基(D-精氨酸残基)(SEQ ID NO：44)，导致效价小于4倍的差异。

检测多种肽和缀合物针对人CaSR的活性。通过测量表达人CaSR的HEK293细胞中的IP₁产生来进行这些研究。EC₅₀值示于表5中。以8种不同浓度一式二份来检测每一种肽，以建立剂量反应曲线。用GraphPad Prism进行曲线拟合。在表5及整个说明书中，以大写字母提供的残基为L-氨基酸，而小写字母表示D-氨基酸。“Ac”表示乙酰基封端基团，“NH₂”表示酰胺封端基团，“Ac-bAla”为乙酰化β-丙氨酸，“GSH”表示还原型谷胱甘肽，“GS”表示氧化型谷胱甘肽，“PEG”是指聚乙二醇，“PEG2”和“PEG5”分别是指2kDa和5kDa的聚乙二醇部分，“Mpa”是指巯基丙酸。圆括号括入的基团表示基团或部分与前面的亚单位或氨基酸残基的侧链连接。

表5

CaSR体外测定中阳离子肽的EC ₅₀ 值

在结构活性关系的另一研究中，通过制备具有在肽Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)和肽Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：153)的不同位置取代的不同D-氨基酸残基或甘氨酸(表6)或空间受阻的非天然氨基酸(表7)的系列肽，来评估非阳离子氨基酸对肽效价的贡献。将肽作为IV推注以0.5mg/kg剂量给予正常Sprague Dawley大鼠。用盐水的静脉(IV)推注作为对照。评估给药前和给药后1、2、3和4小时的血浆PTH水平。结果示于下表中，并表明：1)在Ac-carrrar-NH₂肽(SEQ ID NO：26)的6位优选小氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和2)Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)2位的丙氨酸对取代更容许得多，可用疏水(例如D-Val、D-Leu)、芳族(例如D-Phe)或极性(例如D-Ser、D-Gln)天然氨基酸以及非天然大疏水氨基酸(例如dNle、dNva)但非酸性氨基酸取代；和3)Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：25)肽的4位的丙氨酸残基亦对取代非常容许，可容纳大多数类型的天然氨基酸(以及非天然大疏水氨基酸(例如dNle、dNva)，但不容许影响二级构象的氨基酸，即甘氨酸或脯氨酸或具酸性侧链的氨基酸。

表6

例示性肽化合物的活性

^*粗体字体表示Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：6)或Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：25)中的丙氨酸残基各自的取代

^**在异氟烷麻醉的正常大鼠中0.5mg/kg IV给予后的PTH降低--在给予后1、2、3和4小时测量PTH，并计算累积AUC。按照下式计算PTH数据：AUC_{化合物治疗的}/AU_{C盐水对照}*100。

表7

例示性肽化合物的活性

^*粗体字体表示Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)或Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：25)中的丙氨酸残基的各自取代。Sar＝非天然氨基酸肌氨酸；Nma＝N-甲基丙氨酸；AiB＝氨基异丁酸；dNva＝D-正缬氨酸；dNle＝D-正亮氨酸

表8

例示性肽化合物活性

^*圆括号中显示的粗体字体表示各自的含巯基缀合基团。GS＝氧化型谷胱甘肽；dHcy＝D-高半胱氨酸；Mpa＝巯基丙酸；PEG＝聚乙二醇。

^***以10mg/kg给予化合物(约0.5mg/kg非PEG化肽当量摩尔浓度)

^****以20mg/kg给予化合物(约0.5mg/kg非PEG化肽当量摩尔浓度)

B.组胺反应和结构-活性关系研究

文献中业已报道聚阳离子化合物引发活性生物胺组胺的释放。参见Church等，J.Immunol.，128(5)：2116-2121(1982)；Lagunoff等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，23：331-51(1983)。认为组胺释放为以Gαi依赖方式发生的肥大细胞和嗜碱细胞激活的结果。参见Aridor等，J.CellBiol.，111(3)：909-17(1990)。期需降低或消除该生理反应，尤其用于改进治疗SHPT的阳离子肽拟钙剂(calcimimetics)的治疗边缘(therapeuticmargin)。

进行研究以评估体内给予本文所述化合物后诱导的组胺释放。在实施例6所述的首次研究中，使用通过IV推注或输注正常SpragueDawley大鼠的给药来评估与不同化合物有关的组胺释放。为了评估净正电荷对与化合物相关的组胺释放的影响，产生含有4-7个阳离子(精氨酸)残基的肽，并按照实施例6所述程序体内测试其引发组胺释放的能力。测试的肽包括：(i)Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)、(ii)Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)、(iii)Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和(iv)Ac-crrrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：41)。

如图3所示，当通过IV推注给予正常大鼠等摩尔数量的每种肽时，SEQ ID NO：41(8个精氨酸残基)表现出最大的组胺诱导。具较少的Arg残基的其它化合物，包括SEQ ID NO：6(6个精氨酸残基)、SEQID NO：5(5个精氨酸残基)和SEQ ID NO：4(4个精氨酸残基)，亦产生组胺水平的尖峰，但与SEQ ID NO：41相比程较小。SEQ ID NO：6、SEQID NO：5和SEQ ID NO：4在其组胺释放活性方面产生较微的反应(约基线的2-3倍高)。然而，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4关于降低血浆PTH方面比SEQ ID NO：6效价低。

因为Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的降低PTH的活性伴随组胺反应缺乏，为了评估其是否仍有可能进一步降低组胺反应而不牺牲降低PTH的活性，以Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)为基础进行了另外的评估。如以下数据所示，在Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)中用非阳离子(丙氨酸)残基取代阳离子(精氨酸)残基，以产生具有总体降低的净电荷和降低的电荷密度的系列类似物。在这些类似物中，Ac-cararrr-NH₂(SEQ ID NO：15)和Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)二者当通过IV推注给予大鼠时，都与缺乏组胺反应有关。重要的是，这两种肽保留其有效的拟钙性质，在正常大鼠和肾功能不全大鼠中都能够降低PTH分泌。

当通过IV推注(在不到1分钟内给予)在正常大鼠中给药时，鉴定为SEQ ID NO：6(2.1μmole/kg＝2.3mg/kg)的化合物Ac-crrrrrr-NH₂引发可观察到的约基线的2-3倍的组胺反应，对比于SEQ ID NO：41的6-9倍。由Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)引发的组胺释放在给药后5分钟出现峰值，随后15分钟回到基线水平(图3)。进一步将带电荷的亚单位数目降低到每个肽5和4个精氨酸残基(分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4)，与较长的寡-精氨酸肽相比进一步降低组胺反应；然而，在IV推注给药后5分钟仍观察到组胺在基线上的2-3倍增加(图3)。这些结果提示肽净电荷和相关组胺释放之间的关系。亦注意到具有小于7个精氨酸的富精氨酸肽，在其进入细胞的能力方面受到很大限制，这表明引发组胺释放不需要细胞渗透。

在体内评估与降低PTH的化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)相关的组胺释放。化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)具有以下结构：

该缀合物结构在本文中表示为Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：273，其中经由Cys-Cys二硫键与化合物X₁亚单位中的含巯基残基(此处为D-Cys残基)连接的L-Cys残基，置于式中的圆括号中。始终使用该标记法来表示圆括号部分与第二含巯基的基团连接。相对于Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)，化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)具有在X₂和X₆亚单位位置用不带电荷的(丙氨酸)残基取代的两个阳离子(精氨酸)残基。另外，X₁位置的D-Cys残基与L-Cys残基缀合。

将这两种化合物以3mg/kg通过静脉(IV)推注(在不到1分钟内给予)给予异氟烷麻醉的大鼠(Sprague Dawley)。给药前和给药后5、15和30分钟抽取血液。测量组胺浓度，相对于给药前血液组胺浓度的血液组胺浓度倍数变化示于图4中。化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6，空心条)诱导组胺反应，其在给药后5分钟的数据点处观察到，其中观察到组胺水平的7倍增加。如通过给药后5、10和15分钟的数据点观察到，化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3，网格条)不诱导明显的组胺反应，其中组胺水平相对于给药前(时间0)的组胺水平未增加。

为了进一步评估化合物结构和组胺释放之间的关系，制备系列化合物，并在体外测定中用大鼠腹膜肥大细胞评估其引发组胺诱导的能力。在该测定中，让10μM化合物与分离自SD大鼠腹腔灌洗的细胞在37℃孵育15分钟。孵育后收集细胞培养基并测定组胺。数据示于表9中。

表9

例示性肽化合物在大鼠腹膜肥大细胞中的体外组胺诱导

^*实施例7中提出的方法

缩写：参见实施例7

为了进一步评估化合物结构和组胺释放之间的关系，制备了系列化合物，并在体内测定中评估其引发组胺诱导的能力。数据示于表10中。

表10

例示性肽化合物的体内组胺诱导

^*实施例7中提出的方法

因此且如可鉴于PTH数据和本文上述组胺数据所理解，在一个实施方案中，考虑具有在缺乏组胺反应的情况下于受试者中降低PTH水平的活性的化合物。在某些实施方案中，缺乏组胺反应意指如在本文所述的测定中在体外所测量的，产生小于10倍、更优选8倍、又更优选5倍和甚至更优选3倍组胺增加的化合物的剂量，其中倍数变化基于与化合物孵育前和与化合物孵育后15分钟的组胺水平来测定。在特定实施方案中，在体外测定中用分离自正常Sprague Dawley大鼠的腹腔灌洗的大鼠腹膜肥大细胞来测定组胺反应，其中倍数变化基于与化合物孵育前和与化合物孵育后15分钟的组胺水平来测定。在本文进行的研究中，用分离的大鼠腹膜肥大细胞进行组胺释放的体外评估，所述大鼠腹膜肥大细胞用含有肝素(5u/mL)的冷HBSS+25mMHEPES pH 7.4通过腹腔灌洗分离。用刺激缓冲液(HBSS+25mMHEPES pH 7.4)洗涤细胞两次，在96-孔板(10⁶/孔)中于37℃与刺激缓冲液(HBSS+25mM HEPES pH 7.4)中的10μM化合物孵育15分钟。用组胺EIA试剂盒(Cayman#589651)分析细胞上清液中的组胺。

在另一实施方案中，考虑具有在缺乏临床组胺反应的情况下于受试者中降低PTH水平的活性的化合物。本文所用的缺乏“临床组胺反应”意指将治疗有效量的本文所述化合物给予受试者而在血浆或血液组胺中不产生临床有害的增加，如在完成给药后5-10分钟或在疗程内测量的。例如，当将需要产生所期需疗效的化合物通过推注(本文所用“推注”意指在1分钟或更短时间内给予)给予受试者时，其在完成给药后5-10分钟产生的血浆或血液组胺增加小于给药前水平的15倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍。

如可从上述研究所了解，在一个实施方案中，化合物包含3-35个氨基酸残基的序列，其中很多带正电荷的氨基酸残基亚单位存在于序列中。在一些实施方案中，所述化合物包含5-25个亚单位，在优选实施方案中，每一亚单位为氨基酸残基。在其它实施方案中，所述化合物包含6-12个亚单位。还是在其它实施方案中，所述化合物包含3-9个氨基酸亚单位。在备选实施方案中，所述化合物包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个亚单位。

在一个实施方案中，所述化合物的亚单位独立选自天然或非天然氨基酸或其类似物，可具有L-或D-构型(非手性的甘氨酸除外)。预期以下氨基酸都用于所述化合物中：甘氨酸；脂族残基丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸、脯氨酸；羟基残基丝氨酸和苏氨酸；酸性残基天冬氨酸和谷氨酸；酰胺残基天冬酰胺和谷氨酰胺；碱性残基赖氨酸和精氨酸、组氨酸；芳族残基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；和含硫残基甲硫氨酸和半胱氨酸。带正电荷的亚单位的数目及其密度可影响化合物降低PTH的效价。在一些实施方案中，带正电荷的亚单位被一个或多个其它亚单位(“间隔亚单位”)隔开。在一个实施方案中，间隔亚单位为丙氨酸残基。在一些实施方案中，间隔亚单位的手性影响化合物的效价。

所述化合物的带正电荷的氨基酸残基可为在序列中重复的具有L-或D-构型(例如L-精氨酸)的一种特殊的天然或非天然残基或其类似物；或可为具有L-或D-构型的多种天然或非天然残基或其类似物。在一些实施方案中，化合物为由3-20个带正电荷的氨基酸残基、6-12个带正电荷的氨基酸残基、3-9个带正电荷的氨基酸残基组成的肽。在一些实施方案中，所述肽包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带正电荷的氨基酸残基。

在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基独立选自天然氨基酸。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基独立选自天然和/或非天然氨基酸。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基独立选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、2，3-二氨基丙酸(Dap)、2，4-二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸和高精氨酸。在优选实施方案中，带正电荷的氨基酸残基为精氨酸残基。

在一些实施方案中，化合物为肽并为单一连续的肽链。在其它实施方案中，化合物为分支的肽。还是在其它实施方案中，所述肽与一个或多个含巯基部分(每一个为“含巯基的缀合基团”或“缀合基团”)缀合。在优选实施方案中(仅作为为阐明的)，肽化合物经由(-S-S-)二硫键(例如-Cys-Cys-)与Cys缀合基团缀合。本文所用术语“化合物”意欲包括所述肽和所述缀合物二者。

化合物通常包含一个或多个巯基部分，优选一个或多个活性巯基部分。具有巯基的亚单位包括具有巯基的非氨基酸化合物和具有巯基的氨基酸。含巯基的亚单位的巯基可呈缀合形式(例如经由二硫键与缀合基团缀合)或呈非缀合形式(即作为还原巯基)。在优选实施方案中，当巯基呈非缀合形式或缀合形式时，其能够与含巯基的基团形成二硫键。含巯基的残基可沿肽链位于任何位置，包括氨基末端、羧基末端或一些其它位置。在优选实施方案中，含巯基的残基或亚单位可位于氨基末端。在其它实施方案中，含巯基的残基或亚单位可位于羧基末端或肽序列内。

含巯基的残基的一些代表性实例包括但不限于半胱氨酸、巯基丙酸、高半胱氨酸和青霉胺。当含巯基的残基含有手性中心时，其可以L-或D-构型存在。在优选实施方案中，含巯基的残基为半胱氨酸。

在一些实施方案中，化合物的X₁位置处的含巯基的亚单位与含巯基的缀合基团之间的交联在体内可裂解和/或可与其它含巯基的缀合基团例如半胱氨酸(例如通过二硫键的还原)交换以产生化合物的生物学活性形式。因此，缀合物可作为化合物的前药起作用。亦可用缀合基团来改变所述化合物的物理化学、药代动力学和/或药效学性质(例如经由二硫键与大的PEG化部分缀合以提高药代动力学)。

在一些实施方案中，化合物为由氨基酸序列(X_aa1)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：155)组成的肽，其中(X_aa1)为含巯基的氨基酸残基，(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)为阳离子氨基酸残基，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。可在N-末端、C-末端或两个末端修饰肽。在优选实施方案中，分别通过乙酰化和酰胺化在N-末端和C-末端两端修饰肽。

在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：156)，其中(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)选自D-Arg、L-Arg、D-Lys和L-Lys，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽(cap)、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，所述肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。

在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：157)，其中(X_aa2)、(X_aa3)和(X_aa4)独立为任何氨基酸残基(但在优选实施方案中独立选自D-Ala、D-Val、D-Leu、D-NorVal和D-NorLeu)，(X_aa5)和(X_aa7)独立为任何阳离子氨基酸残基(但在优选实施方案中独立选自D-Arg、L-Arg、D-Lys和L-Lys)，(X_aa6)为非阳离子氨基酸残基(在优选实施方案中，选自D-Ala、D-Val、D-Leu、D-NorVal和D-NorLeu)。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，所述肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。

在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：158)，其中(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)选自D-Arg、L-Arg、D-Lys和L-Lys，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，所述肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。

在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(D-Ala)-(X_aa3)-(X_aa4)-(D-Arg)-(D-Ala)-(X_aa7)(SEQ IDNO：159)，其中(X_aa3)为任何阳离子氨基酸残基，(X_aa4)为任何阳离子氨基酸残基，(X_aa7)为任何阳离子氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，所述肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。

在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(D-Ala)-(D-Arg)-(D-Ala)-(X_aa7)(SEQ IDNO：160)，其中(X_aa2)、(X_aa3)和(X_aa7)独立为任何阳离子氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，所述肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。

另一实施方案为拟钙肽(calcimimetic peptide)，其包含由肽键连接的氨基酸序列，其中所述序列包含5-10个氨基酸残基，其中所述序列包含氨基末端、羧基末端、至少一个含巯基的残基和3-9个带正电荷的残基。在一个实施方案中，所述至少一个含巯基的残基为半胱氨酸残基。在另一方面，所述半胱氨酸残基位于肽的氨基末端。在某个实施方案中，所述半胱氨酸残基为L-Cys残基、D-Cys残基或者L-或D-高半胱氨酸残基。在其它实施方案中，肽的氨基酸残基为D-氨基酸或L-氨基酸。

亦包括在所要求保护的化合物的范围内的为包含大约7个亚单位的肽模拟物分子，其中至少一个亚单位含有巯基部分，优选活性巯基部分，其余亚单位为多个非阳离子亚单位和1-4个带正电荷的亚单位。所述肽模拟物分子可包含两个或更多个亚单位之间的非肽键。上述化合物的各种特征通常适用于肽模拟物分子。例如，如上所述，用于构建分子的亚单位可为天然存在的氨基酸或具有非天然侧链的残基，分子末端可以以上述方式封端或不封端。类似地，所述分子的氨基酸残基可为L-或D-氨基酸残基。亦如上所述，含巯基的残基可呈具有任何上述含巯基部分的还原或氧化形式。

开发了很多肽模拟物框架及用于其合成的方法(Babine，R.E.；Bender，S.L.，Chem.Rev.，97：1359，1997；Hanessian，S.等，Tetrahedron，53：12789，1997；Fletcher，M.D.；Cambell，M.C.，Chem.Rev.，98：763，1998)；Peptidomimetics Protocols；KazmierskiW.M.编辑；Methods in Molecular Medicine Series，第23卷；HumanaPress，Inc.；Totowa，N.J.(1999)。

缀合物

在一些实施方案中，化合物经由化合物的巯基与来自缀合基团的巯基之间的二硫键与含巯基的缀合基团化学交联。含巯基的缀合基团可为小分子(例如半胱氨酸)或大分子(例如含有半胱氨酸残基的多肽)。合适的含巯基缀合基团实例包括半胱氨酸、谷胱甘肽、硫代烷基、诸如硫代苄基等部分、巯基丙酸、N-乙酰化半胱氨酸、半胱胺(cysteamide)、N-乙酰基半胱胺(N-acetylcysteamide)、高半胱氨酸、青霉胺和聚(乙二醇)(PEG)修饰的(称为“PEG化”)硫醇例如PEG化半胱氨酸或化合物重复(即，以形成通过二硫键连接的同型二聚体)。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团为半胱氨酸。亦考虑其它半胱氨酸同系物单独或包含在较大的缀合基团中作为含巯基的缀合基团使用。类似地，半胱氨酸、高半胱氨酸和半胱胺的立体异构体适于用作含巯基部分。可将缀合基团用于改进化学稳定性并由此改进药物产品的贮存期。在某些实施方案中，含巯基的缀合基团和肽是一样的(即缀合物为二聚体)，与杂合缀合基团例如半胱氨酸比较，其出人意料之外地表现出极好的化学稳定性。不受理论的束缚，可能是当含巯基的缀合基团和肽相同时，任何不均匀(例如缀合基团的不规则性)将重新构成最初的二聚体化合物。与此相反，具杂合缀合基团例如半胱氨酸的化合物的不均匀可导致形成肽的同型二聚体加胱氨酸(半胱氨酸-半胱氨酸同型二聚体)加残余母体化合物。由于体循环中的还原半胱氨酸的高浓度，肽的同型二聚体(即缀合基团和肽相同)将在体内转化为肽的半胱氨酸缀合形式。

在一些实施方案中，教导包括含巯基的缀合基团和肽的二硫化物缀合物，所述肽包含氨基酸序列(X_aa1)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：155)，其中(X_aa1)为具含巯基部分的氨基酸残基，(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)为阳离子氨基酸残基，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团选自D-Cys、L-Cys、含有D-Cys的肽和含有L-Cys的肽。当含巯基的缀合基团为氨基酸或肽时，其可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团具有N-末端帽和C-末端帽二者。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团本身为包含氨基酸序列SEQ IDNO：155的肽。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团和肽是一样的(即缀合物为二聚体)。

在一些实施方案中，教导包括含巯基的缀合基团和肽的缀合物，所述肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：156)，其中(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)选自D-Arg、L-Arg、D-Lys和L-Lys，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团选自D-Cys、L-Cys、含有D-Cys的肽和含有L-Cys的肽。当含巯基的缀合基团为氨基酸或肽时，其可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团具有N-末端帽和C-末端帽二者。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团本身为包含氨基酸序列SEQ ID NO：156的肽。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团和肽是一样的(即缀合物为二聚体)。

在一些实施方案中，教导包括含巯基的缀合基团和肽的缀合物，所述肽包含氨基酸序列(L-Cys)-(X_aa2)-(X_aa3)-(X_aa4)-(X_aa5)-(X_aa6)-(X_aa7)(SEQ ID NO：183)，其中(X_aa2)为非阳离子氨基酸残基，(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa5)选自D-Arg、L-Arg、D-Lys和L-Lys，(X_aa6)为非阳离子残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团选自D-Cys、L-Cys、含有D-Cys的肽和含有L-Cys的肽。当含巯基的缀合基团为氨基酸或肽时，其可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团具有N-末端帽和C-末端帽二者。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团本身为包含氨基酸序列SEQ ID NO：183的肽。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团和肽是一样的(即缀合物为二聚体)。

在一些实施方案中，教导包括含巯基的缀合基团和肽的缀合物，所述肽包含氨基酸序列(D-Cys)-(D-Ala)-(X_aa3)-(X_aa4)-(D-Arg)-(D-Ala)-(X_aa7)(SEQ IDNO：161)，其中(X_aa3)为任何氨基酸残基，(X_aa4)为任何氨基酸残基，(X_aa7)为任何氨基酸残基。肽可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，肽具有N-末端帽和C-末端帽二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团选自D-Cys、L-Cys、含有D-Cys的肽和含有L-Cys的肽。当含巯基的缀合基团为氨基酸或肽时，其可具有N-末端帽、C-末端帽或二者。在优选实施方案中，含巯基的缀合基团具有N-末端帽和C-末端帽二者。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团本身为包含氨基酸序列SEQ ID NO：161的肽。在一些实施方案中，含巯基的缀合基团和肽是一样的(即缀合物为二聚体)。

III.使用方法

在一方面，考虑通过给予本文所述化合物预防、治疗或改善甲状旁腺功能亢进、骨病和/或其它高血钙病症的方法。如上所述，化合物具有在一个或多个靶标组织或受试者中降低PTH和/或钙水平的活性。在某些实施方案中，当将治疗有效量的化合物给予需要所述治疗的受试者时所述化合物能够降低PTH和/或钙水平。现在将参考实施例3及8-11阐述使用方法。

再次参考实施例3和如上关于表1所述，将其中用非阳离子残基(丙氨酸)序贯置换阳离子(精氨酸)残基的系列化合物给予大鼠。图5显示每种化合物降低血液PTH的能力的时间曲线和不同化合物的作用持续时间。在图5中，化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6，菱形)、Ac-carrrrr-NH₂(SEQ ID NO：8，正方形)和Ac-crrarrr-NH₂(SEQ IDNO：10，x记号)和Ac-crrrrar-NH₂(SEQ ID NO：12，圆形)在体内有效，如由将给药前基线的PTH百分比降低到基本为零并提供效价作用时间所证明，其中PTH血液浓度维持降低至少4小时。化合物Ac-crarrrr-NH₂(SEQ ID NO：9，三角形)、Ac-crrrarr-NH₂(SEQ IDNO：11，*记号)和Ac-crrrrra-NH₂(SEQ ID NO：13，+记号)降低基线的PTH百分比达约2-3小时，此后PTH血液浓度开始增加。在Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的5或7位亚单位的阳离子(精氨酸)残基取代对降低PTH的活性的持续时间有影响。

亦评估含有双氨基酸取代的系列化合物的PTH降低概况。以0.5mg/kg剂量通过IV推注将上表2中提出的所选择的化合物给予正常大鼠，评估相对于给药前PTH血液水平的PTH的降低。数据示于图6A-6B中，其中化合物鉴定为定如下：Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26，空心菱形)、Ac-crrarar-NH₂(SEQ ID NO：25，空心正方形)、Ac-caarrrr-NH₂(SEQ ID NO：22，三角形)、Ac-crraarr-NH₂(SEQ IDNO：17，圆形)、Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3，菱形，图6B)、Ac-c(C)rrarar-NH₂(SEQ ID NO：28，x记号，图6B)。

进行另一研究以进一步评估化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ IDNO：3)的效价。将化合物以1mg/kg、0.5mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg剂量静脉内给予正常大鼠，其如实施例2所详述。评估给药前和此后4小时的血浆PTH水平。图7显示结果，其中将PTH血液浓度显示为给药前基线值的百分比。在单次IV推注给药后观察到剂量相关的PTH降低，且1mg/kg的最高剂量(菱形)具有最大的PTH降低，接着是0.5mg/kg(正方形)、0.3mg/kg(三角形)和0.1mg/kg(x记号)。由圆形记号来显示盐水对照。如所观察到的，当以治疗有效剂量给予时，肽实现相对于给药前(“基线”)的PTH浓度大于50％的PTH降低。具体地，当以大于0.1mg/kg的剂量给予时，肽在IV给予后1小时降低PTH浓度到小于基线PTH浓度的90％。鉴定为SEQ ID NO：3的肽的这些剂量亦达到小于50％的曲线下面积(AUC)，AUC计算为1、2、3和4小时时间点的PTH浓度值的总和，PTH浓度值根据相同时间点的盐水对照的AUC来标准化并乘以100而得到。

在肾机能不全的受试者(大鼠)中亦测试了同样的化合物。在该研究中，用急性肾机能不全的1K1C模型来评估化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)，以在肾功能不全环境中表征其降低PTH的活性。模型在实施例1A中描述。化合物以3mg/kg(n＝2)、1mg/kg(n＝5)、0.5mg/kg(n＝6)和0.3mg/kg(n＝5)静脉内推注给予肾损害的动物(大鼠)。用盐水给予动物对照组。评估给药前和此后几小时的血浆PTH水平。图8显示结果，其中盐水治疗的动物(正方形)具有相对于开始的PTH水平增加的PTH浓度。在各种剂量的SEQ ID NO：3下，观察到PTH降低的作用时间及程度方面的剂量依赖效应。用0.3mg/kg最低剂量(x记号)治疗的动物在最早时间点表现出降低的PTH，给药后1-24小时之间表现出PTH增加。3mg/kg(菱形)、1mg/kg(三角形)和0.5mg/kg(正方形)的剂量水平提供降低的PTH血液浓度达超过15小时，对于最高剂量，达超过24小时。

在于肾机能不全受试者背景中评估用不带电荷的亚单位(其通过丙氨酸氨基酸残基来例示)取代阳离子亚单位的作用的另一研究中，产生Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)类似物，并测试其在1K1C模型动物中单次静脉内给予1mg/kg后降低PTH的能力。在测试的类似物Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)中，Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)的X₂和X₆位置的阳离子亚单位被不带电荷的氨基酸取代。

如图9所示，Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26，空心正方形)在测试剂量(1mg/kg)下显示等于Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6，空心菱形)的活性，具有相似的在24小时内的延长的作用持续时间。发现具有不带电荷的亚单位取代的Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)类似物保留活性，并可实际上具有优于鉴定为SEQ ID NO：6的化合物的体内效价和作用持续时间。在化合物Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)中，相对于鉴定为SEQ ID NO：6的化合物，X₂和X₆位置的D-Arg残基被D-Ala残基取代。

有重大意义的是，如上所述，给予化合物Ac-carrrar-NH₂(SEQID NO：26)不伴随组胺释放，组胺释放是当通过IV推注给予较高剂量(＞1mg/kg)Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和其它相似化合物时观察到的不想要的副作用。鉴定为SEQ ID NO：26的化合物的组胺释放的显著减少，增加了通过IV推注给予后所期需的降低PTH的活性和不想要的组胺诱导活性之间的治疗边缘。因此，在优选实施方案中，提供在缺乏组胺反应时具有在体内降低PTH浓度的活性的化合物。因此，在一个实施方案中，提供具有降低PTH的活性的化合物，其中所述化合物当给予受试者、人或其它方面时，在给药后1小时内降低PTH水平到低于给药前水平的50％。在特定实施方案中，具有降低PTH的显著活性的化合物，意指当将其给予正常大鼠时在通过IV推注给药后1小时内降低PTH水平到低于给药前水平的50％的化合物。

在实施例8所详述的另一研究中，化合物呈缀合物形式，其中X₁位置的含巯基的亚单位通过二硫键与L-Cys残基连接。这些化合物具有以下结构：

在本文所用记号中，与X₁亚单位的含巯基部分连接的化合物用圆括号来标识，其中在这些例示性缀合物中，标示为(C)的化合物L-Cys与X₁亚单位中的含巯基部分连接：Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ IDNO：3)和Ac-c(Ac-C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：141)。这些化合物以0.3和0.5mg/kg的剂量经由IV推注给予急性肾机能不全(1K1C模型)的动物，结果示于图10中。化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)由正方形(0.3mg/kg，n＝5)和*记号(0.5mg/kg，n＝6)来表示，化合物Ac-c(Ac-C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：141)由三角形(0.3mg/kg，n＝8)和菱形(0.5mg/kg，n＝7)来表示。SEQ ID NO：3的这种体内剂量反应表现出与Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)极为相似的PTH剂量依赖性降低。

在本文所述的一些体内研究中，按照30分钟IV输注给予化合物，包括呈缀合物形式的化合物，其中X₁亚单位中的巯基经由二硫键与另一亚单位交联。然而，应该注意，较短的输注(例如＜5分钟)或通过IV推注的递送通常产生与较长的30-分钟输注类似的PTH药效降低。亦证明皮下推注给药为有效的递送途径，其产生较小的PTH初始降低，但表现出与由IV途径观察到的概况相似的PTH持续降低。如图11所示，亦通过微孔促进(例如角质层微穿孔(microporation))透皮递送给予化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)，监测到血浆PTH降低达数小时。亦在微穿孔后通过透皮途径给予化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6)，导致血浆PTH降低达数小时。透皮递送Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6)为临床递送所述化合物提供了另外的选择。

为了在肾机能不全受试者情境中评估给药途径对Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)活性的影响，将1mg/kg肽按照皮下(SC)推注或30分钟IV输注给予1K1C模型大鼠。两种给药途径都有效降低血浆PTH水平超过24小时。当通过IV输注递送Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)时，PTH水平自基线迅速下降80-90％。给药后16小时时，PTH水平开始上升，但其仍自基线降低约80％。当通过SC推注递送Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)时，PTH水平表现出更温和的初始降低，到约基线的40％，但表现出与通过IV途径递送肽时相似的降低持续时间。给药后24小时，通过任何一种途径给药的动物的PTH水平都部分反弹，但二者都仍表现出自基线约40-60％PTH水平降低。结果显示该给药途径提供与IV给予关于PTH降低的功效和持续时间相似的概况，由此提供临床给药的备选途径(数据未显示)。

因此，在优选实施方案中，用所述化合物治疗具有继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)的受试者，以降低血浆PTH水平和/或钙。未治疗的具中度严重性甲状旁腺功能亢进的SHPT患者通常具有基线循环完整PTH水平(＞300pg/ml)和可超过600pg/mL的水平。在优选实施方案中，将PTH水平的降低测量为完整PTH降低到低于治疗前的基线水平。在另一实施方案中，所期需的PTH降低是使血浆PTH水平进入通常公认的准则，所述准则由国家肾脏基金会(National KidneyFoundation)或治疗肾病和肾机能不全方面的其它专家建立。

在另一方面，提供用于治疗甲状旁腺功能亢进、高钙血症和/或骨病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的所述化合物。在另一实施方案中，可用所述化合物与一种或多种其它治疗有效的物质联合治疗受试者。

在另一方面，以有效降低PTH或PTH作用的量给予所述化合物。在一些实施方案中，血浆PTH的降低为低于治疗前基线水平至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％达给予所述化合物后的至少10小时。在特定实施方案中，在给予后10小时时血浆PTH降低至少20％。在优选实施方案中，血浆PTH的降低为低于治疗前基线水平15-40％、优选20-50％、更优选30-70％达给予所述化合物后的至少48小时。

在另一方面，以有效降低血清钙或钙作用的量给予所述化合物。在一些实施方案中，血清钙的降低为低于治疗前水平至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或25％达给予聚阳离子肽后的至少10小时。在一些优选实施方案中，在给予后10小时时血清钙降低至少5％。在一些优选实施方案中，血清钙的降低为低于治疗前水平5-10％、优选5-20％达给予所述化合物后的至少48小时。

在另一方面，提供了用于在有需要的受试者中治疗甲状旁腺功能亢进和/或高钙血症的方法，所述方法包括：给予治疗有效量的所述化合物，藉此降低PTH和/或钙。

基于血清钙、骨代谢和PTH之间的关系，认为除了甲状旁腺功能亢进外，所述化合物还有益于治疗各种形式的骨病和/或高钙血症。所述化合物与现行治疗剂比较可具有优势，因为其可胃肠外给予，可不与胃肠道有害作用相关，不被细胞色素P450代谢，并且可导致更有效的血浆PTH和钙降低。

如上所述，所述方法可单独使用，或与一种或多种其它治疗有效的物质联合使用。所述其它治疗有效的物质包括但不限于用以下药物的治疗：抗再吸收二膦酸盐物质，例如阿仑膦酸盐和利塞磷酸盐；整联蛋白阻滞剂，例如α_vβ₃拮抗剂；用于激素替代疗法中的缀合雌激素，例如PREMPRO^TM、PREMARIN^TM和ENDOMETRION^TM；选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如雷洛昔芬、屈洛昔芬、CP-336、156(Pfizer)和拉索昔芬；组织蛋白酶K抑制剂；维生素D疗法；维生素D类似物，例如ZEMPLAR^TM(帕立骨化醇)、CALCIJEX

(骨化三醇)、HECTOROL

(度骨化醇)、ONE-ALPHA

(阿法骨化醇)和来自Cytochroma的开发中的称为CTA-018、CTAP201和CTAP101的类似物；其它拟钙剂，例如Sensipar

(西那卡塞)；II型钠依赖的磷酸盐转运蛋白家族SLC34(包括两种肾同工型NaPi-IIa和NaPi-IIc以及肠NaPi-IIb转运蛋白)的抑制剂；磷调素(phosphatonin)(包括FGF-23、sFRP4、MEPE或FGF-7)；低剂量PTH治疗(用或不用雌激素)；降钙素；RANK配体抑制剂；抗RANK配体抗体、护骨蛋白；腺苷(adensosine)拮抗剂；和ATP质子泵抑制剂。

在一个实施方案中，以足以降低PTH和血清钙水平二者的剂量给予所述化合物。在另一实施方案中，以足以降低PTH而不显著影响血清钙水平的剂量给予所述化合物。在又一实施方案中，以足以增加PTH而不显著影响血清钙水平的剂量给予所述化合物。

制剂

提供包含所述化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。制备所述药物组合物的方法通常包括让所述化合物与载体和任选一种或多种辅助成分结合的步骤。可通过本领域技术人员已知的常规方法将所述化合物和/或包含所述化合物的药物组合物调配为药学上可接受的剂型。通常通过让所述化合物与液体载体或细碎的固体载体或二者均匀紧密地结合然后若需要的话使产品成形来制备制剂。

适于胃肠外给予的本发明药物组合物包含与以下一种或多种药学上可接受的物质组合的一种或多种所述化合物：无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、混悬液或乳液；或可在临用前重构成为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，其可含有糖、醇、氨基酸、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、让制剂与预期受体的血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。

可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体实例包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过以下方法来保持合适的流动性：利用包衣材料，例如卵磷脂；在分散体情况下保持所需的粒度；和使用表面活性剂。

这些药物组合物亦可含有辅助剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含不同抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，来确保防止微生物对所述化合物的作用。亦可期需将控制张力的物质，例如糖、氯化钠等包含在组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来获得注射药物形式的延长吸收。

在某些情况下，为了延长药物的作用，期需减慢药物自皮下或肌内注射的吸收。这可通过使用具有差的水溶性的晶体或无定形材料的液体混悬剂来实现。于是药物的吸收速率视其溶解速率而定，溶解速率又可视晶体大小和晶体形式而定。或者，通过让药物溶解或悬浮于油性溶媒中来实现胃肠外给予的药物形式的延迟吸收。

例如，可以以溶液形式将所述化合物递送给人，通过让药物的固体形式与液体重构来制备所述溶液形式。可进一步用输注流体稀释该溶液，所述输注流体为例如注射用水、0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液和乳酸盐林格氏注射液。为了递送最大效价，优选在4-6小时内使用重构和稀释的溶液。或者，可以以片剂或胶囊剂形式将所述化合物递送给人。

通过让所述化合物在可生物降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微胶囊化基质来制备可注射长效制剂形式。可根据药物与聚合物比率及所采用的特定聚合物的特性来控制药物的释放速率。其它生物可降解聚合物实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。亦通过将药物俘获入与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备长效注射制剂。

当将所述化合物作为药物给予人及动物时，其可单独给予或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有例如0.1-99％(更优选10-30％)的与药学上可接受的载体组合的活性成分。在其它实施方案中，药物组合物可含有0.2-25％、优选0.5-5％或0.5-2％的活性成分。可通过任何合适的给药途径将这些化合物给予人和其它动物用于治疗，所述给药途径包括例如皮下注射、皮下长效制剂(subcutaneous depot)、静脉注射、静脉或皮下输注。这些化合物可作为推注快速给予(＜1分钟内)，或经延长时间(经若干分钟、小时或天)更缓慢给予。这些化合物可每日一次或经多天连续或间歇递送。在一个实施方案中，化合物可透皮给予(例如用贴剂、显微针、微孔、软膏剂、microjet或nanojet)。

不管所选择的给药途径怎样，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可以以合适水合形式使用的所述化合物和/或药物组合物调配为药学上可接受的剂型。

可改变药物组合物中实际的活性成分剂量水平，以便获得对特定患者、组合物和给药方式达到所期需的治疗响应而对患者无毒的有效的活性成分量。

所选择的剂量水平将视多种因素而定，所述因素包括所采用的具体所述化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所采用的特定化合物的排泄或代谢速率、吸收速率和程度、治疗持续时间、与所采用的特定化合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前病史及在医学领域众所周知的类似因素。

具有本领域一般技能的医生或兽医可易于确定所需药物组合物的有效量并开出其处方。例如，医生或兽医可以以低于为了达到所期需治疗效果所需的水平开始给予在药物组合物中采用的所述化合物，并逐渐增加剂量直到达到所期需效果。

一般而言，所述化合物的合适日剂量为对产生治疗效果有效的最低剂量的化合物的量。所述有效剂量通常视上述因素而定。通常，当用于所示作用时，所述化合物对患者的静脉内、肌内、透皮、脑室内和皮下剂量介于约1μg-约5mg/千克体重/小时。在其它实施方案中，剂量将介于约5μg-约2.5mg/千克体重/小时。在另外实施方案中，剂量将介于约5μg-约1mg/千克体重/小时。

若需要，可任选以单位剂型，按照在全天以合适间隔分开给予的2、3、4、5、6个或更多个亚剂量给予所述化合物的有效日剂量。在一个实施方案中，按照每天1个剂量给予所述化合物。在另外的实施方案中，通过静脉内或其它途径连续给予化合物。在其它实施方案中，以低于每日一次的频率给予化合物，例如每2-3天一次，与透析治疗联合时每周一次或更低频率。

接受该治疗的受试者为有需要的任何动物，包括灵长类特别是人和其它哺乳动物，例如马、牛、猪和绵羊；和禽类和一般宠物。

可给予所述化合物本身或与药学上可接受载体混合给予，亦可与抗微生物剂联合给予，所述抗微生物药物为例如青霉素类、头孢菌素类、糖苷类和糖肽。因此，联合治疗包括以随后给予时前一次给予化合物的治疗效果还没有完全消失的方式序贯、同时和分开给予活性化合物。

用于揭示的化合物的给药途径

可通过任何合适给药途径将这些化合物给予人和其它动物用于治疗。本文所用术语给药“途径”意欲包括但不限于：皮下注射、皮下长效制剂、静脉注射、静脉或皮下输注、眼内注射、皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、气管内给予、脂肪内给予、动脉内给予、鞘内给予、硬脑膜外给予、吸入、鼻内给予、舌下给予、含服给予、直肠给予、阴道给予、脑池内给予和局部给予、透皮给予或经由局部递送(例如通过导管或支架)给予。

将药物透皮递送给身体是用于将生物活性物质全身递送给受试者，尤其用于递送口服生物利用度差的物质(例如蛋白质和肽)的期需和方便的方法。透皮递送途径对于小的(例如小于约1,000道尔顿)亲脂性化合物例如东莨菪碱和烟碱尤其成功，所述化合物可渗透皮肤的角质层外层，该层作为物质进入身体的有效屏障起作用。角质层下面是有活力的表皮，其不含有血管，但具有一些神经。更深的是真皮，其含有血管、淋巴系统和神经。跨越角质层屏障的药物通常可扩散到真皮的毛细血管用于吸收和全身分布。

透皮递送方面的技术进步集中在满足本领域递送亲水的高分子量化合物例如蛋白质和肽跨越皮肤的需要。一种方法涉及用化学或物理方法破坏角质层以降低角质层造成的障碍。皮肤微穿孔技术是更近期的方法，其涉及用极微侵入性技术在皮肤中产生微米大小的转运途径(微孔)(具体而言，是角质层中的微孔)。在皮肤(角质层)产生微孔的技术包括热微穿孔或消融、显微针阵列、超声透入疗法、激光消融和射频消融(Prausnitz和Langer(2008)Nat.Biotechnology 11：1261-68；Arora等，Int.J.Pharmaceutics，364：227(2008)；Nanda等，Current DrugDelivery，3：233(2006)；Meidan等American J.Therapeutics，11：312(2004))。

如上所述，通过在甲状旁腺细胞的细胞表面表达的CaSR来调节PTH分泌。因此，为了激活CaSR，必须将作用剂或化合物递送到甲状旁腺细胞。透皮递送拟钙剂必须达到跨越角质层递送，并提供全身暴露以到达甲状旁腺细胞。迄今为止，本领域尚未证明拟钙化合物是否可以对治疗益处足够的量，尤其是以对降低PTH和/或治疗、减轻、减弱和/或解除高钙血症足够的量来透皮递送。

除了拟钙剂外，1，25-(OH)₂维生素D₃类似物是最常用于与慢性肾脏疾病和末期肾病有关的甲状旁腺功能亢进患者的治疗。维生素D类似物通过促进肠道吸收饮食钙并通过抑制PTH合成和分泌来降低PTH水平起作用。尽管静脉内和口服递送维生素D直到今天仍在治疗上使用，但本领域尚未证明维生素D类似物例如ZEMPLAR^TM(帕立骨化醇)、CALCIJEX

(骨化三醇)、ONE-ALPHA

(阿法骨化醇)和HECTOROL

(度骨化醇)，是否可以对治疗益处足够的量，尤其对降低甲状旁腺激素(PTH)足够的量透皮递送。另外，本领域尚未证明通过与维生素D类似物联合透皮递送拟钙剂的共同给药(作为单独制剂或作为共同制剂)是否以对治疗益处足够的量，尤其以对降低PTH并为罹患甲状旁腺功能亢进的患者提供有效治疗足够的量进行。

为了降低甲状旁腺激素(PTH)和/或治疗高钙血症，可跨越角质层和/或表皮的其它层给予拟钙剂用于局部或全身递送。在一个实施方案中，经由微穿孔递送拟钙剂。考虑用于微穿孔的多种技术的任何一种，并简述了几种。

可通过机械手段和/或外部驱动力破坏角质层来完成微穿孔，以将本文所述拟钙剂递送穿过皮肤表面并进入下层皮肤层和/或血流中。

在第一实施方案中，微穿孔技术为在皮肤的特定区域消融角质层，其使用具有足以消融角质层而不显著破坏下层表皮的波长、脉冲宽度、脉冲能量、脉冲数和脉冲重复率的脉冲激光。然后将拟钙剂施用到消融区。称为激光诱导应力波(LISW)的另一种激光消融微穿孔技术，涉及由高能脉冲激光产生的宽带、单极和可压缩波。LISW与组织相互作用而破坏角质层的脂质，在角质层内瞬时产生细胞间通道。角质层中的这些通道或微孔允许拟钙剂进入。

超声促渗或超声透入疗法为利用超声能量的另一种微穿孔技术。超声为具有高于20KHz频率的声音。可连续或脉冲施用超声，并以不同频率和强度范围施用(Nanda等，Current Drug Delivery，3：233(2006))。

另一微穿孔技术涉及使用显微针阵列。显微针阵列当施于受试者皮肤区域时刺穿角质层，不渗入显著刺激神经或刺穿毛细血管的深度。因此，当将显微针阵列施用于产生通过其递送拟钙剂的微孔时，患者感觉不到或感觉到极微不适或疼痛。

考虑由空心或实心显微针组成的显微针阵列，其中可将拟钙剂包被在针的外表面，或从空心针的内部分发。显微针阵列的实例阐述于例如Nanda等，Current Drug Delivery，3：233(2006)和Meidan等American J.Therapeutics，11：312(2004)。第一代显微针阵列由实心硅显微针组成，其用治疗剂在外面包被。当针的微阵列压向皮肤并在约10秒后撤离皮肤时，易于实现针上的作用剂渗透进入体内。第二代显微针阵列由实心或空心硅显微针、聚碳酸酯、钛或其它合适的聚合物组成，其用治疗化合物溶液包被或填充。更新代次的显微针阵列由可生物降解的聚合物制备，其中用治疗剂包被的针尖保留在角质层并缓慢溶解。

可用多种材料建造显微针，包括金属、陶瓷、半导体、有机物、聚合物和复合材料。建造的例示性材料包括药品级的不锈钢、金、钛、镍、铁、锡、铬、铜、钯、铂、其合金或其它金属、硅、二氧化硅和聚合物。代表性生物可降解聚合物包括：羟酸聚合物，例如乳酸和乙醇酸聚交酯、聚乙醇酸交酯、丙交酯-乙交酯共聚物；和与聚(乙二醇)的共聚物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和丙交酯-己内酯)共聚物。代表性非生物可降解聚合物包括聚碳酸酯、聚酯和聚丙酰酰胺。

显微针可具有直轴或锥形轴。在一个实施方案中，显微针直径在显微针底部端最大，在底部远端逐渐变细为点。亦可将显微针制造为具有包括直的(非锥形的)部分和锥形部分二者的轴。针亦可根本没有锥形末端，即其可简单为具有钝尖或扁平尖的圆柱。具有大体上均一直径但不逐渐变细为点的空心显微针本文称为“微型管”。除非另外指出，否则本文所用术语“显微针”包括微型管和锥形的针。

电穿孔为用于在皮肤中产生微孔的另一种技术。该方法利用微秒或毫秒长的高压电脉冲施用，以在角质层内产生瞬时可渗透孔。

其它微穿孔技术包括使用无线电波在皮肤中产生微通道。热消融为实现较大分子量化合物透皮递送的再一种方法。

申请者发现低剂量的拟钙剂可在治疗上经延长的时间给予以治疗SHPT。这与其它拟钙剂(例如盐酸西那卡塞)目前的剂量要求显著不同。

在实施例9-10所述研究中显示了本文所述化合物的透皮递送。在第一个研究中，将化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)透皮给予大鼠，其中通过1.0mm derma roller在温和压力下通过5次来使小面积皮肤微穿孔。将Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)或盐水的溶液置于微穿孔的皮肤区上。在4小时内进行血液抽取，通过ELISA来分析血浆的PTH水平。结果示于图11中，其中血浆PTH对于盐水治疗的动物(菱形)和两只用测试化合物治疗的动物(正方形，三角形)表示为给药前基线的百分比。这些数据表明化合物Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)可用derma roller通过透皮途径(在该情况下为微孔促进透皮递送)以足够的量全身递送，以便有效并显著使PTH水平从基线降低达研究的约4小时。应该注意，显示当通过短时IV输注给予时，Ac-crrrrrr-NH₂(SEQID NO：6)在急性肾机能不全1K1C大鼠模型中以及在正常大鼠中(数据未显示)使PTH水平从基线有效降低。

在实施例10所述的另一研究中，用透皮贴剂将化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)通过微孔促进透皮递送给予正常大鼠。将含有在盐水中的Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)的10％溶液(重量)的透皮贴剂系统置于微穿孔区上，原地留置约30小时。在30小时内定期从大鼠进行血液抽取，通过ELISA来分析血浆样品的PTH水平。结果示于图12中。令人惊讶的是，这些数据显示微孔促进透皮递送可实现充足的Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)持续递送，以在正常肾功能的大鼠中产生显著和延长的PTH降低达＞30小时。这些数据显示使用贴剂的微穿孔促进透皮递送缀合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)，在治疗期间内可实现肽的足够血液暴露，以产生明显和持续的PTH自基线的降低达＞30小时。这些数据证明以每日为基础或更长时间的透皮贴剂递送能够治疗需要治疗的透析和非血液透析两种患者。例如，通常不用IV药物治疗的肾移植患者的CKD(第4阶段)、原发性甲状旁腺功能亢进和继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)，可容易地通过经由微穿孔促进透皮递送的每日透皮贴剂治疗。

进行另一研究以进一步评估化合物的给药途径。如实施例11中所述，通过极低剂量IV输注将化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)给予正常大鼠和肾机能不全的大鼠，以确定为达到显著PTH降低而需要通过输注、透皮贴剂系统或其它持续递送手段给予的最低剂量。以极低剂量(1μg/kg/小时、3μg/kg/小时和10μg/kg/小时)的Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)给健康大鼠进行静脉内输注6小时。在给药之前(给药前)和开始输注后2小时、4小时、6小时(正好是在结束输注之前；EOI)和8小时(EOI后2小时)采取血液样品，通过ELISA来分析血浆的PTH水平。令人惊讶的是，示于图13中的数据证明输注6小时极低剂量的Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)(1μg/kg/小时(正方形)、3μg/kg/小时(圆形)和10μg/kg/小时(三角形))，在输注过程内有效引起PTH从基线的显著降低。这些数据表明连续递送的低剂量可与按照单次推注的大得多的剂量递送同样有效(或甚至更有效)。

在急性肾机能不全的大鼠1K1C模型中进一步评估降低PTH的作用。用低剂量Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)(30μg/kg/小时和100μg/kg/小时)静脉内输注1K1C模型大鼠6小时。在给药之前(给药前)和开始输注后2小时、4小时、6小时(正好是在结束输注之前；EOI)和8小时(EOI后2小时)和24小时采取血液样品，通过ELISA来分析血浆的PTH水平。示于图14A中的数据证明低剂量的Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)IV输注使1K1C模型(肾机能不全模型)中的PTH自基线水平显著降低，其中可观察到从400到＞1100pg/mL的基线PTH水平。令人惊讶的是，6小时的低剂量IV输注(菱形，30μg/kg/小时和正方形，100μg/kg/小时)Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ IDNO：3)，能够从基线降低PTH达约24小时。与1K1C大鼠模型中这种急剧的PTH降低一致，图14B显示对该急性肾机能不全中的血清钙数据作图的柱状图，并显示在低剂量IV输注Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQID NO：3)后血清钙的相应降低。这些数据证明Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQID NO：3)为极有效的拟钙化合物，其在低剂量输注或递送(例如通过透皮递送)后在约24小时时期内能够降低PTH和钙。这些数据进一步支持这样的结论，即通过IV输注或通过微孔促进透皮递送的拟钙剂的低剂量持续递送，可基于每日一次或更低的频率有效治疗患者。

联合疗法

如上所述，所述使用方法可单独使用，或与用于治疗高钙血症和/或骨病的其它方法联合使用。所述其它方法包括但不限于用以下作用剂的治疗：例如二膦酸盐作用剂、整联蛋白阻滞剂、激素替代疗法、选择性雌激素受体调节剂、组织蛋白酶K抑制剂、维生素D疗法、维生素D类似物例如ZEMPLAR^TM(帕立骨化醇)、CALCIJEX(骨化三醇)、ONE-ALPHA

(阿法骨化醇)和HECTOROL

(度骨化醇)、抗炎剂、低剂量PTH治疗(用或不用雌激素)、拟钙剂、磷酸盐结合剂、降钙素、RANK配体抑制剂、抗RANK配体抗体、护骨蛋白、腺苷拮抗剂和ATP质子泵抑制剂。

在一个实施方案中，联合疗法使用维生素D或维生素D类似物与拟钙剂组合。维生素D有助于钙吸收，起维持正常血液钙和磷水平的作用。PTH通过增加1，25-(OH)₂维生素D(维生素D的活性形式)的产生而发挥提高肠钙吸收的作用。PTH亦刺激磷从肾脏排泄并增加从骨释放。

如上所述，继发性甲状旁腺功能亢进特征为与不适当的活性维生素D激素水平相关的甲状旁腺激素(PTH)升高。在治疗继发性甲状旁腺功能亢进(hyperparathryoidism)中可使用维生素D或维生素D类似物来降低升高的PTH水平。在一个实施方案中，本发明包括包含拟钙剂和维生素D类似物的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明包括包含拟钙剂和ZEMPLAR^TM(帕立骨化醇)的药物组合物。帕立骨化醇为骨化三醇(维生素D的代谢活性形式)的合成类似物。推荐的Zemplar初始剂量基于基线完整甲状旁腺激素(iPTH)水平。若基线iPTH水平低于或等于500pg/mL，则每日剂量为1μg，“每周三次”剂量(不超过每隔一天给予一次)为2μg。若基线iPTH大于500pg/mL，则每日剂量为2μg，“每周三次”剂量(不超过每隔一天给予一次)为4μg。此后，给药必须个体化，并基于血清血浆iPTH水平，且监测血清钙和血清磷。帕立骨化醇阐述于美国专利号5,246,925和美国专利号5,587,497中。

在另一实施方案中，本发明包括包含拟钙剂和CALCIJEX

(骨化三醇)的药物组合物。骨化三醇是维生素D的代谢活性形式。推荐的CALCIJEX

(口服)初始剂量为0.25μg/天。该量可以以4到8周间隔增加0.25μg/天。正常或仅稍微降低的钙水平可响应隔一天0.25μg的剂量。对于透析患者，推荐的CALCIJEX(IV)初始剂量为0.02μg/kg(1-2μg)，3次/周，隔一天一次。每2-4周可将该量增加0.5-1μg。骨化三醇阐述于美国专利号6,051,567和美国专利号6,265,392和美国专利号6,274,169中。

在一个实施方案中，提供包含拟钙剂和HECTOROL

(度骨化醇)的药物组合物。度骨化醇为维生素D的合成类似物，其在体内经历代谢激活形成1α，25-二羟基维生素D₂，其天然存在的维生素D的生物学活性形式。推荐的HECTOROL

初始剂量为10μg，透析时每周给予3次(大约隔一天一次)。应该根据需要调整初始剂量，以便降低血液iPTH到150-300pg/mL范围。若iPTH不降低50％并且不能达到目标范围，则可以以8周间隔增加剂量2.5μg。HECTOROL的最大推荐剂量为20μg，透析时每周给予3次，每周共给予60μg。度骨化醇阐述于美国专利号5,602,116和美国专利号5,861,386和美国专利号5,869,473和美国专利号6,903,083中。

待在联合方案中采用的疗法(治疗或程序)的具体联合应考虑到所期需治疗和/或程序的相容性及要达到的期需治疗效果。亦应该了解采用的疗法可对同一种病症实现期需效果(例如发明化合物可与用于治疗同一种病症的另一作用剂同时给予)，或它们可实现不同的作用(例如控制任何不利作用)。本文所用通常给予以治疗或预防特定疾病或病况的另外治疗剂称为“适合待治疗的疾病或病况”。

本文定义的本发明联合治疗可通过同时、序贯或分开给予所述治疗的单个组分来实现。

亦可将化合物或其药学上可接受的组合物纳入到组合物中用于包被可植入医疗装置、生物可侵蚀聚合物、可植入泵和栓剂。因此，在另一方面，考虑用于包被可植入装置的组合物，其包含通常如上所述的所述化合物和适于包被可植入装置的载体。在再一方面，包括用组合物包被的可植入装置，所述组合物包含通常如上所述的化合物和适于包被所述可植入装置的载体。

合适包衣和包被的可植入装置的一般制备阐述于美国专利号6,099,562、5,886,026和5,304,121中。包衣通常为生物相容的聚合材料，例如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯乙酸乙烯酯及其混合物。包衣可任选进一步被合适的外涂层覆盖以赋予组合物控释特性，所述外涂层为氟硅氧烷、多糖、聚乙二醇、磷脂或其组合。

用于测定治疗功效的潜在临床标记

可通过多种方法来测定所述治疗方法的效能。

正常血清钙水平在8.8mg/dL-10.4mg/dL(2.2mmol/L-2.6mmol/L)范围内。在某些情况下，可通过测量与钙相关的血清和尿标记来测定治疗功效，所述标记包括但不限于总血清钙和离子化血清钙、白蛋白、血浆PTH、PTHrP、磷酸盐、维生素D和镁。

在其它情况下，可通过测量骨矿物质密度(BMD)或通过测量血清或尿中骨形成和/或骨吸收的生物化学标记来测定功效。可能的骨形成标记包括但不限于：总碱性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、骨钙蛋白、羧化不全骨钙蛋白、C-末端前胶原I型前肽和N-末端前胶原I型前肽。可能的骨吸收标记包括但不限于：羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、糖基-半乳糖基羟基赖氨酸、半乳糖基羟基赖氨酸、吡啶诺林、脱氧吡啶诺林、I型胶原的N-末端交联端肽、I型胶原的C-末端交联端肽、由MMP产生的I型胶原的C-末端交联端肽、骨唾液蛋白、酸性磷酸酶和酒石酸盐耐受的酸性磷酸酶。

在其它情况下，可通过相对于给药前(基线)水平的PTH降低百分比和/或通过达到所期需的PTH水平来测定功效，所述期需的PTH水平如通常公认为对患者有益的(例如由国家肾脏基金会建立的准则)。又在其它情况下，可通过测量与甲状旁腺功能亢进疾病有关的甲状旁腺增生的减少来测定功效。

预期当将所述治疗方法给予有需要的受试者时，治疗方法将产生效果，其通过例如一种或多种以下标记所测量：总血清钙、离子化血清钙、总血液钙、离子化血液钙、白蛋白、血浆PTH、血液PTH、PTHrP、磷酸盐、维生素D、镁、骨矿物质密度(BMD)、总碱性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、骨钙蛋白、羧化不全骨钙蛋白、C-末端前胶原I型前肽、N-末端前胶原I型前肽、羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、糖基-半乳糖基羟基赖氨酸、半乳糖基羟基赖氨酸、吡啶诺林、脱氧吡啶诺林、I型胶原的N-末端交联端肽、I型胶原的C-末端交联端肽、由MMP产生的I型胶原的C-末端交联端肽、骨唾液蛋白、酸性磷酸酶和酒石酸盐耐受的酸性磷酸酶。效果包括预防性治疗以及对已有疾病的治疗。

可用共价键或非共价作用将生物学有效分子与所述肽可操作地连接。在特定实施方案中，可操作地连接的生物学有效分子可根据将特性赋予作为连接分子的部分的化合物来改变所述化合物的药代动力学。生物学有效分子可赋予所述化合物的一些特性包括但不限于：将化合物递送到身体内的不连续的部位；将化合物活性集中到身体的期需部位并降低其在其它部位的作用；降低用化合物治疗的副作用；改变化合物的渗透性；改变化合物的生物利用度或递送到身体的速率；改变用化合物治疗的作用时间长度；改变化合物的体外化学稳定性；改变化合物的体内稳定性、半衰期、清除、吸收、分布和/或排泄；改变化合物作用的开始速率和衰退速率；通过使化合物有作用来提供容许的作用。

在另外方面，所述化合物可与聚乙二醇(PEG)缀合。所选择的PEG可具有任何适宜的分子量，可为线性或分支的，可任选通过接头缀合。PEG的平均分子量将优选介于约2千道尔顿(kDa)-约100kDa，更优选约5kDa-约40kDa。或者，所用PEG部分可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kDa。

所述化合物可通过位于化合物任何位置的合适氨基酸残基与PEG缀合。所述化合物可任选含有缀合PEG的另外氨基酸残基，包括例如含另外胺的残基，例如赖氨酸。

本领域已知PEG化肽增加缀合肽的血清半衰期。本领域已知用于形成PEG化肽的多种方法。例如，可让PEG部分任选通过存在连接基团与氨基末端、羧基末端或通过要求保护的肽的侧链连接。在其它实施方案中，PEG部分可与含巯基氨基酸例如半胱氨酸的硫连接，或可与含胺氨基酸例如赖氨酸的侧链偶联。

通常通过PEG部分的活性基团(例如醛、胺、肟、肼、巯基、酯或羧酸基团)与所述化合物的活性基团(例如醛、胺、肟、肼、酯、酸或巯基基团)的酰化作用或烷化作用，让PEG基团与所述化合物连接，所述活性基团可位于所述化合物的氨基末端、羧基末端或侧链位置。用于制备PEG化合成肽的一种方法包括使肽和PEG部分在溶液中通过缀合连接而结合，所述肽和PEG部分各自荷有对彼此互相起反应的官能团。用常规溶液或固相合成技术可易于制备肽。肽和PEG的缀合通常在水相中进行，可通过反相HPLC来监测。PEG化肽可易于用本领域技术人员所知的标准技术来纯化并表征。

亦可用已知与特定侧链或末端残基反应的各种衍生剂来修饰所述化合物的一个或多个单独亚单位。例如，赖氨酰(lysinyl)残基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或逆转赖氨酰或氨基残基上的电荷的其它相似羧酸酐反应。其它合适的试剂包括例如亚氨酸酯例如甲基吡啶亚胺甲酯；吡哆醛；吡哆醛磷酸；硼氢化氯(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4，-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。可通过与常规作用剂例如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己烷二酮和茚三酮作用，来修饰精氨酰残基。

另外，可修饰所述化合物以包括提供免疫原残基的非阳离子残基，所述免疫原残基用于为生物分析ELISA测量开发抗体以及评估免疫原性。例如，可通过纳入酪氨酸和/或甘氨酸残基来修饰所述化合物。酪氨酰残基的特定修饰对于将光谱标记引入酪氨酰残基尤其令人关注。非限制性实例包括与芳族重氮化合物或四硝基甲烷的反应。最常见的是将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰和3-硝基衍生物。

包含所揭示化合物的试剂盒

本发明亦提供用于实施本发明治疗方案的试剂盒。所述试剂盒包括治疗有效量的单独或与呈药学上可接受形式的其它作用剂组合的呈药学上可接受形式的所述化合物，其具有作为CaSR调节剂的活性。优选药学形式包括与无菌盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液、无菌水或其它药学上可接受的无菌流体组合的所述化合物。或者，组合物可包含抗微生物剂或抑菌剂。或者，可将组合物冻干或干燥。在这种情况下，试剂盒可进一步包括药学上可接受的溶液(优选无菌的)，以形成用于注射目的的溶液。在另一实施方案中，试剂盒可进一步包括针或注射器(优选以无菌形式包装)用于注射组合物。在其它实施方案中，试剂盒进一步包括用于将组合物给予受试者的说明手段。说明手段可为书面插页、录音磁带、视听磁带或指导将组合物给予受试者的任何其它手段。

在一个实施方案中，试剂盒包括：(i)含有具有作为CaSR调节剂的活性的所述化合物的第一容器；和(ii)使用说明手段。在另一实施方案中，试剂盒包括：(i)含有本文所述化合物的第一容器；和(ii)含有用于稀释或重构的药学上可接受溶媒的第二容器。

在另一实施方案中，试剂盒包括：(i)含有具有作为CaSR调节剂的活性的所述化合物的第一容器；(ii)含有抗血钙剂(anticalcemicagent)的第二容器；和(iii)使用说明手段。

在一个实施方案中，抗血钙剂为选自以下的作用剂：二膦酸盐作用剂、激素替代治疗剂、维生素D疗法、维生素D类似物例如ZEMPLAR^TM(帕立骨化醇)、CALCIJEX(骨化三醇)、ONE-ALPHA

(阿法骨化醇)和HECTOROL

(度骨化醇)、低剂量PTH(含或不含雌激素)和降钙素。

在相关方面，本发明提供包含上述试剂盒内容物的制品。例如，本发明提供包含有效量的单独或与其它作用剂组合的所述肽和说明手段的制品，所述说明手段指出对于治疗本文所述疾病的应用。

实施例

提供以下实施例来阐明而非限制本文所述化合物和方法。可由技术人员进行多种修改，而不背离本文所述主题的真实精神和范围。

实施例1

具有降低PTH的活性的阳离子化合物

肾机能不全模型

开发大鼠急性肾机能不全模型(亦称为1K1C模型)来模拟与末期肾病有关的SHPT病理学。所述模型展现与肾功能缺乏有关的甲状旁腺功能亢进的病理特点，特别是血浆PTH的显著升高和血清钙的降低。开发该模型允许进一步在肾功能不全和PTH升高的受试者情境中表征所述化合物。该模型中典型的基线PTH水平平均约450pg/mL。

急性肾机能不全1K1C模型涉及摘除一个肾，接着让其余肾缺血45分钟并再灌注48小时。接着发生的对其余肾的缺血/再灌注(I/R)损伤导致明显坏死和肾衰竭。在I/R损伤后血清肌酸酐水平升高达超过24-48小时(数据未显示)。亦由于因而发生的肾功能不全，总PTH水平从约100pg/mL的I/R损伤前水平急剧升高。I/R后48小时时，血浆PTH水平升高到约450pg/mL(约增加至5倍)，在某些情况下达到高至约1200pg/mL。血清肌酸酐和PTH的这种可再现增加提供模拟在ESRD患者中观察到的生理学的稳健的模型。

盐酸西那卡塞(SENSIPAR

)是批准用于降低PTH以治疗SHPT的拟钙剂，将其在急性肾机能不全的1K1C模型中测试。以30mg/kg口服给予西那卡塞，长达6小时显著降低PTH大约50％。该结果与公开的西那卡塞的临床前数据一致(Nemeth等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，308(2)：627-35(2004))，确证了急性肾机能不全的1K1C模型为用于评估拟钙剂对该适应症的活性的合适模型。

用于该研究的方案如下。雄性Sprague Dawley大鼠购自CharlesRiver实验室(Hollister，CA；要求的购买重量250-275g)。为了用测试制品研究，将导管预先插入动物的股静脉和颈静脉，分别用于给药和抽血。让动物呆在控温环境中，恒定12小时光/12小时暗周期，全部时间自由采食和饮水。动物的所有试验程序都按照IACUC指南进行。

通过腹膜内(IP)注射戊巴比妥钠(5.2％，0.4mL/大鼠)来诱导并保持全身麻醉。对于接受45分钟肾缺血的动物，再次IP注射戊巴比妥钠(5.2％，0.1mL/大鼠)以维持麻醉水平。将化合物给予正常大鼠后在连续异氟烷麻醉下采取血样用于PTH测量。

在整个程序中使用洁净无菌技术。大鼠麻醉后，在手术前用电动剪毛机剃掉腹部的毛，用70％酒精溶液清洁皮肤。

对于模型开发研究，用PE-10管插入左边股静脉用于抽血。经由剖腹手术暴露两个肾脏。在用双重2-0丝缝线结扎右肾蒂和输尿管后，进行右肾切除术。在证实右肾蒂不出血后，小心解剖左肾动脉，用微血管夹夹紧诱导左肾全面缺血。通过观察整体灰白色变化(漂白)来确认肾缺血。用纱布暂时盖上腹部切口，以帮助维持腹部器官温度。45分钟的标明缺血期后，移走夹子，在观察整体恢复为红色后认为左肾动脉流恢复了。用2-0丝缝线分层缝合腹部切口。然后让动物从麻醉中恢复。在整个程序中测量包括体温(36-37.5℃)和体重在内的生理学参数。用热垫直肠探测器反馈系统监测并保持体温。

在1K1C手术(I/R损伤)后大约48小时，用各种化合物给药动物来测量对血浆PTH和钙的影响。在大部分情况下，通过IV输注(输注时间5、10或30分钟)给予测试制品，但某些研究化合物通过IV推注或皮下(SC)推注注射给予。为了给予药物和抽取血液，用异氟烷麻醉动物。

在整个研究期间定期采取血液样品。分析血清样品的钙水平，分析血浆样品的PTH。由于个体大鼠的基线PTH值有变化，将所有数据标准化为给药前(基线)水平。用来自BioAssay Systems(Hayward，Ca)，目录号DICT-500的市购试剂盒测量血清肌酸酐。按照厂商使用说明进行分析。

B.在肾机能不全模型中测试化合物

制备具有以下序列的化合物用于在肾机能不全模型中测试：Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)，n＝4；Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)，n＝4；Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)，n＝7；Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7)，n＝4；和盐水对照，n＝2。以3mg/kg的剂量通过30分钟IV输注将肽给予动物。给药前抽取血液样品以测定基线，即给药前的PTH血浆浓度。结果示于图1中如下：Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4，菱形)、Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5，正方形)、Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6，三角形)和Ac-crrrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：7，空心正方形)。

实施例2

在表达人钙感受受体的HEK-293中的体外细胞测定

将人胚肾(HEK)293T细胞以每瓶2百万个细胞接种到T25烧瓶中，使其在37℃于5％CO₂过夜孵育。此后利用lipofectamine 2000转染试剂用人CaSR受体转染这些细胞，转染后24小时将细胞以8,000个细胞/孔接种到384孔板。转染后48小时进行测定。在某些情况下，通过在用人钙感受受体稳定转染的HEK293细胞中测量肌醇单磷酸的产生来测定EC₅₀值(见表1)。

从孔中吸取细胞培养基，并用28μL的1X刺激缓冲液(Hepes 10mM、CaCl2 1mM、MgCl2 0.5mM、KCl 4.2mM、NaCl 146mM、葡萄糖5.5mM、LiCl 50mM pH 7.4)更换。让细胞与各种浓度的化合物(1mM或300μM为最高浓度，另外的进行1/2对数系列稀释)在37℃孵育1.5小时，然后终止反应。用Cisbio IP-One Tb试剂盒(621PAPEC)按照厂商说明测定细胞中的IP₁产生。简言之，通过序贯加入裂解缓冲液中的D2标记的-IP₁和穴状化合物标记的抗-IP₁，并进一步在室温孵育60分钟，来终止与化合物的孵育。利用314nm激发在620nm和668nm处读板。将未转染的293细胞用作阴性对照。

测定668nm和620nm处的荧光比率。从利用IP₁标准品的已知浓度的标准曲线(用GraphPad Prism第4版产生)计算IP₁浓度。基于荧光比率OD(668nm)/(OD620nm)值在Prism软件中用非线性回归曲线拟合计算EC₅₀。

在ABI自动合成仪上通过固相化学以0.25mmol规模制备肽和缀合物。用HBTU/DIEA激活完成Fmoc-氨基酸(4当量，Anaspec)与Rink-酰胺树脂(NovaBiochem)的序贯偶联。用TFA混合物(苯酚(5％)、三异丙基硅烷(2.5％)和水(2.5％)；每克树脂10mL)裂解组装的肽，通过用乙醚沉淀来分离。通过C₁₈HPLC纯化后，通过冻干合适流分以TFA盐形式分离最终产品，由HPLC(＞95％纯度)和LC-MS(确认的MW)来表征。

实施例3

体内给予具有阳离子亚单位的化合物

以0.5mg/kg剂量将肽静脉内给予异氟烷麻醉的正常SpragueDawley大鼠。用盐水治疗对照组大鼠。给药前和每小时持续4小时抽取血液。在整个研究中保持大鼠在异氟烷麻醉下。通过检测生物活性完整PTH 1-84的ELISA(Immutopics International目录号60-2700)测量血浆中的PTH浓度，计算包括1-4小时的数据点的AUC曲线下累积面积。按照下式计算PTH降低百分比：AUC_{化合物治疗的}/AUC_盐水对照*100。

实施例4

结构-活性关系研究：体内活性

用HEK293 CaSR转染细胞按照实施例2的程序在体外测定本文鉴定为SEQ ID NO：26(Ac-carrrar-NH₂)和SEQ ID NO：29(Ac-arrrar-NH₂)的测试肽。亦在体内测定肽，其通过按照IV推注给予正常Sprague Dawley大鼠9mg/kg剂量的SEQ ID NO：29和0.5mg/kg剂量的SEQ ID NO：26来进行。用静脉(IV)推注盐水作为对照。评估给药前和给药后1、2、3和4小时的血浆(K₂EDTA)PTH水平。在整个研究中大鼠保持在异氟烷麻醉下。结果示于图2A-2B中，其表示为组平均值±标准偏差(SD)。在图2B中，PTH表示为给药前基线值的百分比。

实施例5

结构-活性关系研究：D-和L-氨基酸亚单位

制备了具有L-氨基酸残基取代D-氨基酸残基的系列化合物。以0.5mg/kg剂量按照IV推注将化合物给予正常Sprague Dawley大鼠。静脉(IV)推注盐水用作对照。评估给药前和给药后1、2、3和4小时的血浆(K₂EDTA)PTH水平，如上所述计算AUC。在整个研究中大鼠保持在异氟烷麻醉下。结果示于上表4中。

实施例6

结构-活性关系研究：组胺释放

为了评估净正电荷对与化合物相关的组胺释放的影响，产生含有4-7个阳离子(精氨酸)残基的肽，并在体内测定其引发组胺释放的能力。测试肽包括：(i)Ac-crrrr-NH₂(SEQ ID NO：4)、(ii)Ac-crrrrr-NH₂(SEQ ID NO：5)、(iii)Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)和(iv)Ac-crrrrrrrr-NH₂；SEQ ID NO：41)。

获得在股静脉和颈静脉预插管分别用于药物输注和抽血的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River)。所有IV药物治疗在麻醉(异氟烷)下进行。通过1分钟IV推注0.5mL总体积来为动物给药。在IV推注后5、15和30分钟采取血液样品，得到用于组胺分析的血浆(K₂EDTA)样品。对于30分钟的IV输注研究，在输注结束时采取样品。在某些情况下，使用急性肾缺血的1K1C模型大鼠。

在每次抽取血液后注射等体积的盐水以代替失去的体积。在每一时间点用预包被EDTA的注射器抽取大约0.2mL血液以有利于血清采集。

用组胺酶免疫测定(EIA)试剂盒(目录号A05890，SPI-BIO，Montigny le Bretonneux，France)对稀释的血浆进行组胺ELISA。组胺EIA试剂盒是衍生化扩增的竞争性酶免疫测定，其检测40pg/mL-5,500pg/mL范围内的组胺。按照厂商方案一式二份分析样品。

称重冻干的肽(TFA盐)，调整肽含量的记录质量。通过将物质溶解于正常盐水中产生期需肽浓度来制备溶液。在某些情况下，调整肽的摩尔浓度以使可进行肽间比较。通过IV推注以每摩尔基准的当量剂量给予肽，其如通过1分钟IV推注给予的SEQ ID NO：41(即0.7微摩尔/大鼠)；测量给药之前(给药前)、给药后5、15和30分钟的血浆组胺。数据表示为组平均值(n＝2)±SD。组胺释放表示为给药前(基线)水平的倍数变化。结果示于图3中。数据表示为组平均值(n＝2)±SD。

实施例7

结构-活性关系研究：组胺释放

为了体外评估组胺释放，通过用含有肝素(5u/mL)的冷HBSS+25mM HEPES pH 7.4实施腹膜灌洗来分离孤立的大鼠腹膜肥大细胞。将细胞用刺激缓冲液(HBSS+25mM HEPES pH 7.4)洗涤两次，在96-孔板(10⁶/孔)中与刺激缓冲液(HBSS+25mM HEPES pH 7.4)中的10μM化合物于37℃孵育15分钟。用组胺EIA试剂盒(Cayman#589651)分析细胞上清液的组胺。数据示于表10中。

为了体内评估组胺释放，通过IV推注(在不到1分钟内给予)以2mg/kg将化合物给予异氟烷麻醉的正常大鼠。给予化合物后5分钟测量血浆组胺(Cayman组胺EIA#589651)。数据示于表11中。

本文尤其是表10-11中所用缩写概述于此。

Ahx	6-氨基己酸
		Aib	2-氨基异丁酸

bAla	β-丙氨酸(3-氨基丙酸)
		dHcy	D-高半胱氨酸
dNle	D-正亮氨酸
		dNva	D-正缬氨酸
dPen	D-青霉胺
		EG	乙二醇间隔基，H2N-(CH2CH2-O)4-CH2-CO2H
Hcy	高半胱氨酸
		Mpa	3-巯基丙酸或巯基丙酸
Nma	N-甲基丙氨酸
		PEG	聚(乙二醇)
Sar	肌氨酸(N-甲基甘氨酸)
		dHar	D-高精氨酸
GS	谷胱甘肽(缀合的)
		DAP	1，3-二氨基丙酸

实施例8

结构-活性关系研究：体内活性

制备化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)用于与化合物Ac-carrrar-NH₂(SEQ ID NO：26)比较。在化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)中，X₁位置的含巯基的亚单位经由二硫键与L-Cys残基缀合。以0.3和0.5mg/kg剂量经由IV推注将两种化合物给予急性肾机能不全的1K1C模型动物。给药前和给药后24小时定期评估血浆PTH水平。结果示于图10中，其中所示数据为组平均值±SEM，其作为以小时计的时间的函数，在急性肾机能不全的1K1C模型大鼠中，化合物Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)由正方形(0.3mg/kg，n＝5)和*记号(0.5mg/kg，n＝6)代表，化合物Ac-c(Ac-C)arrrar-NH₂(SEQ IDNO：141)由三角形(0.3mg/kg，n＝8)和菱形(0.5mg/kg，n＝7)代表。

实施例9

微孔促进透皮递送拟钙剂

为了评估拟钙剂的全身递送，用贮库将Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ IDNO：6)透皮给予CD无毛大鼠。将Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)作为在盐水中的10％溶液施于CD

无毛大鼠背部的大约1cm²面积，对该大鼠通过1.0mm Derma Roller在温和压力下通过5次来微穿孔。在微穿孔的皮肤区粘贴聚苯乙烯室(I.D.9.5mm)，以形成其中存有Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)溶液或盐水溶液的药物贮库。在两只大鼠上的贮库室中给予10％的Ac-crrrrrr-NH₂(SEQ ID NO：6)溶液，1只大鼠上的贮库室中只给予盐水溶液。用带子覆盖贮库以防止蒸发。在4小时时期内抽取血液，通过ELISA来分析血浆PTH水平。结果示于图11中。

实施例10

通过微孔促进透皮贴剂持续递送拟钙剂

为了进一步评估全身递送拟钙剂，用透皮贴剂将Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)透皮给予正常大鼠。用显微针阵列和透皮贴剂系统治疗正常大鼠。用剪毛机修剪Sprague Dawley大鼠(约350g)背上的小面积皮毛，用14x14显微针(约0.5mm)阵列(约1cm²)使皮肤区微穿孔。将含有在盐水中的10％(重量)Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)溶液的透皮贴剂系统置于微穿孔区域并原地留置约30小时。在30小时内定期从大鼠进行血液抽取，通过ELISA来分析血浆样品的PTH水平。结果示于图12中。

实施例11

拟钙剂输注

为了进一步评估拟钙化合物降低PTH的作用，通过极低剂量IV输注将Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)给予正常大鼠和肾机能不全大鼠，以确定为达到显著PTH降低而需要通过输注、透皮贴剂系统或其它持续递送手段给予的最低剂量。以1μg/kg/小时、3μg/kg/小时和10μg/kg/小时给药速率为正常Sprague-Dawley雄性大鼠(250-300g)静脉内输注6小时Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：3)。在给药前和2小时、4小时、6小(正好是在结束输注之前；EOI)和8小时(EOI后2小时)时采取血液样品，通过ELISA来分析血浆PTH水平。数据示于图13中，其中用1μg/kg/小时(正方形)、3μg/kg/小时(菱形)和10μg/kg/小时(三角形)持续6小时治疗的大鼠，显著在输注过程中产生PTH自基线的显著降低。

在急性肾机能不全的1K1C模型大鼠中进行相似的研究。用Ac-c(C)arrrar-NH₂(SEQ ID NO：273)以30μg/kg/小时和100μg/kg/小时给药速率为1K1C模型大鼠静脉内输注6小时。在给药之前(给药前)和2小时、4小时、6小时(正好是在结束输注之前；EOI)、8小时(EOI后2小时)和24小时采取血液样品，通过ELISA来分析血浆的PTH水平。数据示于图14A(30μg/kg/小时，菱形；和100μg/kg/小时，正方形)中，动物的血清钙示于图14B中。