ES2607954T3 - Agentes terapéuticos para reducir los niveles de hormona paratiroidea - Google Patents

Agentes terapéuticos para reducir los niveles de hormona paratiroidea Download PDF

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Abstract

Un compuesto, que comprende un péptido y un grupo de conjugación, donde el péptido comprende una secuencia aminoacídica que tiene la fórmula: **Fórmula** donde X1 es D-cisteína; X2 es D-arginina, D-alanina, D-valina, D-leucina, D-fenilalanina, D-serina, D-glutamina, D-norleucina o D-norvalina; X3 es D-arginina; X4 es D-arginina o un aminoácido no catiónico, donde X4 no es glicina, porlina o un aminoácido con una cadena lateral ácida; X5 es D-arginina; X6 es D-alanina, D-glicina o D-serina; X7 es D-arginina; donde al menos dos de X2, X3 y X4 son independientemente una subunidad catiónica; y donde el péptido está unido en su extremo N al grupo de conjugación mediante un enlace disulfuro.

Description

DESCRIPCION
Agentes terapeuticos para reducir los niveles de hormona paratiroidea.
5 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Publicacion Provisional de Estados Unidos n.° 61/229.695, presentada el 29 de julio de 2009, y de la Publicacion Provisional de Estados Unidos n.° 61/255.816, presentada el 28 de octubre de 2009, y de la Publicacion Provisional de Estados Unidos n.° 61/313,635, presentada el 12 de marzo de 2010.
10
REFERENCIA A LA LISTA DE SECUENCIAS, TABLA O PROGRAMA INFORMATICO
Se envfa electronicamente una lista de secuencias a traves de EFS en forma de un fichero de texto, creado el 29 de julio de 2010, y denominado "632008017WO00seqlist.txt" (85.400 bytes).
15
CAMPO TECNICO
La materia actual se refiere a compuestos con actividad para disminuir los niveles de la hormona paratiroidea (PTH), a las composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos, y al uso de dichos compuestos y 20 composiciones en los metodos de tratamiento, incluyendo, pero sin limitacion, el tratamiento de la hipercalcemia o hiperparatiroidismo o la modulacion de los niveles de la PTH in vivo.
ANTECEDENTES
25 La homeostasis calcica es el mecanismo mediante el cual el cuerpo mantiene niveles adecuados de calcio. El proceso se regula en gran medida, e implica una interaccion compleja entre la absorcion, transporte, almacenamiento de calcio en los huesos, la deposicion en otros tejidos, y la excrecion. La PTH es un regulador de los niveles de calcio en circulacion, y funciona para aumentar la concentracion de calcio en la sangre al mejorar la liberacion del calcio procedente del hueso a traves del proceso de resorcion osea; aumentando la reabsorcion del 30 calcio procedente de los tubulos renales; y mejorando la absorcion del calcio en el intestino al aumentar la produccion de 1.25-(OH)2 vitamina D, la forma activa de vitamina la D. La PTH tambien estimula la excrecion de fosforo del rinon, y aumenta la liberacion desde el hueso.
La secrecion de la PTH se regula mediante el receptor detector de calcio (CaSR), un receptor acoplado a la protefna 35 G expresado por diversos tipos celulares sobre la superficie de las celulas paratiroideas, que detecta las pequenas fluctuaciones en la concentracion de los iones de calcio extracelular (Ca2+) y responde alterando la secrecion de la PTH. La activacion del CaSR mediante Ca2+ inhibe la secrecion de la PTH de segundos a minutos a traves de la inhibicion del transporte vesicular, y este proceso se puede modular mediante la fosforilacion de la protefna cinasa C (PKC) del receptor. El CaSR tambien se expresa sobre los osteoblastos y en el rinon, donde regula la excrecion 40 renal de Ca2+.
Ademas, la PTH regula la homeostasis de fosforo, la PTH estimula al receptor 1 de la hormona paratiroidea (PTHR1) o las membranas de las celulas tanto apicales (membrana de celulas en cepillo) como basolaterales en el tracto GI. La estimulacion del PTHR1 conduce a un aumento en la excrecion urinaria de fosfato (Pi) como una consecuencia 45 de la reduccion por la internalizacion del co-transportador renal de Na+/fosfato (NaPi-IIa) sobre la membrana de las celulas en cepillo.
La PTH tambien se implica en la regulacion de los osteoblastos y osteoclastos en el hueso. La PTH aumenta el Ca2+ en circulacion al aumentar la resorcion osea y la reabsorcion renal de calcio. La PTH estimula a que los osteoblastos 50 produzcan el ligando RANK (RANKL), que se une al receptor RANK y activa los osteoclastos, conduciendo a un aumento en la resorcion osea y un aumento en el Ca2+ serico. La osteoprotegerina (OPG) es un receptor simulado para el RANKL que bloquea la resorcion osea. La osteoporosis se provoca por un desequilibrio entre los procesos de la resorcion osea mediante los osteoclastos y la formacion de hueso por los osteoblastos.
55 El cuerpo humano contiene aproximadamente 1 kg de calcio, el 99 % del cual reside en el hueso. En condiciones normales, el ion de calcio en circulacion (Ca2+) se mantiene estrechamente a un nivel de aproximadamente 9 a 10 mg/dl (es decir, 2,25-2,5 mmol/1; ~600 mg). Aproximadamente 1 g del calcio elemental (Ca2+) se ingiere diariamente. De esta cantidad, se absorben aproximadamente 200 mg/dfa, y se excretan 800 mg/dfa. Ademas, se liberan aproximadamente 500 mg/dfa mediante la resorcion osea o se depositan en el hueso. Aproximadamente 10 g de
Ca2+ se filtran a traves del rinon al dfa, apareciendo aproximadamente 200 mg en la orina, y el resto que se reabsorbera.
La hipercalcemia es un nivel elevado de calcio en la sangre. La hipercalcemia aguda puede dar como resultado 5 sfntomas gastrointestinales (anorexia, nauseas, vomitos); renales (poliuria, polidipsia), neuro-musculares (depresion, confusion, estupor, coma) y cardiacos (bradicardia, auriculo-ventricular de primer grado). La hipercalcemia cronica tambien se asocia a sfntomas gastrointestinales (dispepsia, estrenimiento, pancreatitis); renales (nefrolitiasis, nefrocalcinosis); neuromusculares (debilidad) y cardiacos (bloqueo por hipertension, sensibilidad por digitales). Pueden dar como resultado frecuencias cardiacas anormales, y los hallazgos EKG de un intervalo QT corto y una 10 onda T extendida sugieren hipercalcemia. La hipercalcemia puede ser asintomatica, presentandose los sfntomas mas comunmente a niveles altos de calcio (12,0 mg/dl o 3 mmol/l). La hipercalcemia grave (por encima de 15-16 mg/dl o 3,75-4 mmol/l) se considera una emergencia medica: a estos niveles, puede producirse un coma y un fallo cardiaco.
15 La hipercalcemia con frecuencia se provoca por el hiperparatiroidismo, que conduce a una resorcion osea en exceso y niveles elevados de calcio serico. En el hiperparatiroidismo esporadico primario, se sobre-produce la PTH mediante un adenoma paratiroideo individual; de manera menos comun, se pueden provocar adenomas multiples o hiperplasia difusa de la glandula paratiroides. La secrecion aumentada de la PTH conduce a un aumento neto en la resorcion osea, con la liberacion de Ca2+ y fosfato (Pi). La PTH tambien mejora la reabsorcion renal de Ca2+ e inhibe 20 la reabsorcion de fosfato (Pi), dando como resultado un aumento neto en el calcio serico y una disminucion en el fosfato.
El hiperparatiroidismo secundario se presenta cuando una disminucion en los niveles en circulacion del nivel de Ca2+ estimula la secrecion de la PTH. Una causa del hiperparatiroidismo secundario es la insuficiencia renal cronica 25 (tambien denominada como enfermedad renal cronica o CKD), tal como en la enfermedad renal poliqufstica o pielonefritis cronica o fallo renal cronico, tal como en pacientes con hemodialisis (tambien denominada como enfermedad renal en etapa terminal o ESRD). Se puede producir PTH en exceso en respuesta a la hipocalcemia resultante de la baja ingestion de calcio, trastornos GI, insuficiencia renal, deficiencia de vitamina D, e hipercalciuria renal. El hiperparatiroidismo terciario se puede presentar despues de un largo periodo de hiperparatiroidismo 30 secundario e hipercalcemia.
La neoplasia es una causa comun de la hipercalcemia no producida por la PTH. La hipercalcemia de neoplasia, es una complicacion poco comun aunque grave del cancer, que afecta entre el 10 % y el 20 % de pacientes con cancer, y se puede presentar tanto con tumores solidos como con leucemia. La afeccion tiene una abrupta aparicion y tiene 35 un pronostico muy deficiente, con una supervivencia media de solo seis semanas. Los factores de crecimiento (GF) regular la produccion de la protefna relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) en celulas tumorales. Las celulas tumorales se pueden estimular mediante el GF autocrino para aumentar la produccion de la PTHrP, lo que conduce a una resorcion osea mejorada. Las celulas tumorales metastaticas para el hueso tambien pueden secretar la PTHrP, que puede resorber hueso y liberar GF adicional que a su vez actua de una forma paracrina para mejorar 40 adicionalmente la produccion de PTHrP. El documento US 2009/023652 desvela peptidos moduladores de calcio policationicos para el tratamiento de hiperparatiroidismo y trastornos hipercalcemicos.
Por consiguiente, se desean compuestos con actividad para, por ejemplo, modular los niveles de la PTH y/o los niveles de calcio in vivo.
45
BREVE RESUMEN
En un aspecto, se proporciona un compuesto, que comprende un peptido y un grupo de conjugacion, donde el peptido comprende una secuencia aminoacfdica que tiene la formula 50
imagen1
donde X1 es D-cistefna; X2 es D-arginina, D-alanina, D-valina, D-leucina, D-fenilalanina, D-serina, D-glutamina, D- norleucina o D-norvalina; X3 es D-arginina; X4 es D-arginina o un aminoacido no cationico, donde X4 no es glicina, 55 porlina o un aminoacido con una cadena lateral acida; X5 es D-arginina; X6 es D-alanina, D-glicina o D-serina; X7 es D-arginina; y donde el peptido esta unido en su extremo N al grupo de conjugacion mediante un enlace disulfuro.
En otra realizacion, la subunidad X1 se modifica qufmicamente para comprender un grupo acetilo, un grupo benzoflo,
un grupo butilo, u otro aminoacido, tal como beta-alanina acetilada.
En otra realizacion mas, el resto tiol de la X1 D-cistefna se une por un enlace covalente a un segundo resto tiol.
5 En otra realizacion, la secuencia continua de los residuos aminoacfdicos se une a un compuesto para facilitar el transporte a traves de la membrana celular. En otra realizacion, la secuencia contigua de los residuos aminoacfdicos se une a un compuesto que mejora la administracion de la secuencia en o a traves de una o mas capas de tejido.
En otra realizacion, la secuencia contigua de los residuos aminoacfdicos esta contenida dentro de una secuencia de 10 residuos aminoacfdicos de 8-50 residuos aminoacfdicos, 8-40 residuos aminoacfdicos, 8-30 residuos aminoacfdicos u 8-20 residuos aminoacfdicos de longitud. En otra realizacion mas, la secuencia contigua de los residuos aminoacfdicos esta contenida dentro de una secuencia de residuos aminoacfdicos de 8-19 residuos aminoacfdicos, 8-18 residuos aminoacfdicos, 8-17 residuos aminoacfdicos, 8-16 residuos aminoacfdicos, 8-15 residuos aminoacfdicos, 8-14 residuos aminoacfdicos, 8-13 residuos aminoacfdicos, 8-12 residuos aminoacfdicos, 8-11 15 residuos aminoacfdicos, 8-10 residuos aminoacfdicos, u 8-9 residuos aminoacfdicos de longitud.
En otra realizacion, la secuencia contigua en cualquiera de los compuestos descritos se une covalente me nte a traves del residuo de cistefna en la subunidad X1 a una segunda secuencia contigua. Por ejemplo, la segunda secuencia contigua puede ser identica a la secuencia contigua (para formar un dfmero), o pueden no ser identicas, 20 como podrfa ser el caso cuando se une a una porcion que facilite la transferencia de la secuencia contigua a traves de una membrana celular.
En otro aspecto, se proporciona un compuesto que esta comprendido por un peptido que comprende la secuencia carrrar (SEQ ID NO:2) y un grupo de conjugacion, dicho peptido unido por un enlace disulfuro.
25
En una realizacion, el peptido esta qufmicamente modificado en el extremo N, el extremo C, o ambos.
En otra realizacion, el extremo N del peptido esta qufmicamente modificado por acetilacion y el extremo C esta qufmicamente modificado por amidacion.
30
En otra realizacion, el compuesto es Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3).
En otro aspecto, se contempla una composicion que comprende un compuesto como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece hiperparatiroidismo secundario (SHPT) o un 35 trastorno hipercalcemico, donde se proporciona un compuesto como se describe en el presente documento al sujeto. En diversas realizaciones, el sujeto puede padecer una enfermedad renal cronica u otra afeccion.
En una realizacion, la composicion comprende un compuesto como se define en el presente documento para su uso en la disminucion de los niveles de hormona paratiroidea en un sujeto. En una realizacion, el descenso de la 40 concentracion de hormona paratiroidea es un descenso de la concentracion de hormona paratiroidea en sangre o plasma en un sujeto tratado con el compuesto con respecto a la concentracion de hormona paratiroidea en sangre o plasma en el sujeto antes del tratamiento. En otra realizacion, el descenso de la concentracion de hormona paratiroidea se consigue en la ausencia de una respuesta de histamina.
45 En otro aspecto, se proporciona un regimen de tratamiento, comprendiendo el regimen proporcionar un compuesto de acuerdo con cualquiera de los descritos en el presente documento, en combinacion con un segundo agente.
En una realizacion, la composicion comprende adicionalmente un segundo agente terapeutico que es vitamina D, un analogo de vitamina D o clorhidrato de cinacalcet.
50
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion del tiempo, en horas, en ratas con insuficiencia renal aguda (modelo 1 K1 C), donde a las ratas se les dosifico Ac-crrrr- 55 NH2 (SEQ ID NO:4, rombos), Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5, cuadrados de color negro), Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, triangulos), Ac-crrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:7, cuadrados de color blanco), o control de solucion salina (sfmbolos x);
la figura 2A es un grafico de la concentracion de IP1, en nM, en funcion de la concentracion de compuesto de Ac- carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26, cuadrados) y Ac-arrrar-NH2 (SEQ ID NO:29, triangulos), como una medida de la
capacidad del compuesto para activar el CaSR humano en un ensayo celular in vitro cuando el CaSR humano se expresa como una lfnea celular HEK-293 transfectada estable;
la figura 2B muestra la reduccion de la concentracion de PTH tras la administracion in vivo de peptidos identificados 5 como SEQ ID NO:26 (Ac-carrrar-NH2) (cuadrados) y como SEQ ID NO:29 (Ac-arrrar-NH2) (rombos), donde los peptidos se administran como un bolo IV a ratas Sprague Dawley normales a dosis de 9 mg/kg para la SEQ ID nO:29 y a 0,5 mg/kg para SEQ ID NO:26. Se uso un bolo intravenoso (IV) de solucion salina como control (lfnea discontinua). Los niveles de PTH en plasma se evaluaron antes de la dosificacion y 1, 2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion. Los resultados se presentan como media del grupo ± desviacion estandar (DE), y la PTH se muestra 10 como el porcentaje del valor pre-dosis inicial;
la figura 3 es un grafico de barras que compara la liberacion de histamina tras la administracion de un bolo IV de diversos compuestos en ratas Sprague Dawley normales, donde los compuestos Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4), Ac- crrrrr-NH2 (sEq ID NO:5), Ac-crrrrrr-NH2 (SeQ ID NO:6) y Ac-crrrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:41) se dosificaron en una 15 dosis de bolo IV equimolar de 2,1 pmol/kg, y la histamina en plasma se midio antes de la dosificacion (pre-dosis), 5, 15 y 30 minutos despues de la dosificacion;
la figura 4 es un grafico de barras que compara la liberacion de histamina tras la administracion de un bolo IV de dos compuestos en ratas Sprague Dawley normales, donde los compuestos Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3, barras 20 sombreadas) y Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, barras de color blanco) se dosificaron a 3 mg/kg, y la histamina en plasma se midio antes de la dosificacion (tiempo cero) y 5, 15 y 30 minutos despues de la dosificacion;
la figura 5 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion del tiempo, en horas, en ratas normales dosificadas con 0,5 mg/kg por un bolo IV de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, 25 rombos), Ac-carrrrr-NH2(SEQ ID NO:8, cuadrados), Ac-crarrrr-NH2 (SEQ ID NO:9, triangulos), Ac-crrarrr-NH2 (SEQ ID NO:10, sfmbolos x), Ac-crrrarr-NH2 (SEQ ID NO: 11, sfmbolos *), Ac-crrrrar-NH2 (SEQ ID NO:12, cfrculos) o Ac- crrrrra-NH2 (SEQ ID NO:13, sfmbolos +);
las figuras 6A-6B son graficos del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en 30 funcion del tiempo, en horas, en ratas sanas dosificadas con 0,5 mg/kg por bolo IV de Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26, rombos de color blanco), Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25, cuadrados de color blanco), Ac-caarrrr-NH2 (SEQ ID NO:22, triangulos), Ac-crraarr-NH2 (SEQ ID nO:17, cuadrados de color negro), Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID No:3, rombos figura 6B), Ac-craarrr-NH2 (sEq ID NO:24, sfmbolos x en la figura 6A); Ac-c(C)rrarar-NH2 (SEQ ID NO:28, sfmbolos x, figura 6B);
35
la figura 7 muestra el descenso en el nivel de hormona paratiroideas en la sangre en funcion del tiempo, para el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) administrado como un bolo IV a ratas Sprague Dawley normales a dosis de 1 mg/kg (rombos), 0,5 mg/kg (cuadrados), 0,3 mg/kg (triangulos), y 0,1 mg/kg (sfmbolos x). Se uso un bolo intravenoso (IV) de solucion salina (cfrculos) como control. Los niveles de PTH en plasma se evaluaron antes de la 40 dosificacion y 1,2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion;
la figura 8 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion del tiempo, en horas, en ratas con insuficiencia renal aguda (modelo 1K1C), en ratas con el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda, donde las ratas se dosificaron a traves de un bolo IV con el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 45 (SEQ ID NO:3) a dosis de 3 mg/kg (rombos), 1 mg/kg (triangulos), 0,5 mg/kg (cuadrados) y 0,3 mg/kg (sfmbolos x), o solucion salina (cuadrados); la lfnea discontinua en la figura 8 indica el nivel de PTH inicial previo a la dosificacion;
la figura 9 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion del tiempo, en horas, en ratas dosificadas por via intravenosa con una solucion salina (sfmbolos x) o con los 50 compuestos Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, rombos de color blanco), y Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26, cuadrados de color blanco) a 1 mg/kg a traves de una infusion IV de 30 minutos, donde los niveles de PTH en plasma se evaluaron antes de la dosificacion, 16 horas y 24 horas despues de la dosificacion;
la figura 10 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion 55 del tiempo, en horas, en ratas con insuficiencia renal aguda (modelo 1K1C), donde las ratas se dosificaron a traves de bolo IV con los compuestos Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3, cuadrados, sfmbolos *) y Ac-c(Ac-C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:146, triangulos, rombos) a dosis de 0,3 mg/kg (cuadrados, triangulos) y 0,5 mg/kg (*, rombos);
la figura 11 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion
del tiempo, en horas, en ratas tratadas a traves de administracion transdermica facilitada por microporos de Ac- crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, dos animales, cuadrados y triangulos) o con solucion salina a traves de la administracion transdermica (rombos);
5 la figura 12 es un grafico del nivel de hormona paratiroidea, como porcentaje del valor pre-dosis inicial, en funcion del tiempo, en horas, en ratas tratadas a traves de administracion transdermica facilitada por microporos de Ac- c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3);
la figura 13 es un grafico de la PTH media (como porcentaje del valor inicial) durante y tras una infusion IV de 6 10 horas de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) en ratas Sprague-Dawley normales, donde el compuesto se infundio a velocidades de 1 pg/kg/h (cuadrados), 3 pg/kg/h (cfrculos), y 10 pg/kg/h (triangulos);
la figura 14A muestra la PTH (como un porcentaje del valor inicial) durante y tras la infusion IV de 6 horas de Ac- c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) en el modelo de rata 1K1C de insuficiencia renal aguda, donde las ratas se 15 infundieron por via intravenosa a velocidades de dosis de 30 pg/kg/h (rombos) y 100 pg/kg/h (cuadrados);
la figura 14B es un grafico de barras que muestra el calcio serico, en mg/dl, para las ratas del modelo 1K1C tratadas como en la figura 14A.
La materia objeto actual se puede comprender mas facilmente haciendo referencia a la siguiente descripcion 20 detallada de las realizaciones preferidas y los ejemplos incluidos en el presente documento.
DESCRIPCION DETALLADA
I. Definiciones 25
Dentro de esta solicitud, a menos que se indique otra cosa, las definiciones de los terminos e ilustracion de las tecnicas de esta solicitud se pueden encontrar en cualquiera de las referencias ya conocidas tales como: Sambrook,
J. , y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel, D., ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); "Guide to
30 Protein Purification" en Deutshcer, M.P., ed., Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1989); Innis, y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, CA (1990); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed., Alan Liss, inc. Nueva York, NY (1987); Murray, E.J., ed., Gene Transfer and Expression Protocols, pags. 109-128, The Humana Press Inc., Clifton, NJ y Lewin, B., Genes VI, Oxford University Press, Nueva York (1997).
35
Como se usa en el presente documento, la forma singular "uno", "una", y "el", incluyen referencias en plural a menos que se indique otra cosa. Por ejemplo, "un" peptido modulador incluye uno o mas peptidos moduladores.
Como se usa en el presente documento, un compuesto tiene "actividad para disminuir el nivel de la hormona 40 paratiroidea" o la "actividad de reduccion de PTH" cuando el compuesto, tras la administracion a un sujeto, disminuye la hormona paratiroidea (PTH) en plasma con relacion a la concentracion de la PTH en plasma antes de la administracion del compuesto, en una realizacion, la disminucion en el nivel de la PTH es al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 95 % menor una hora despues de la administracion del compuesto que el nivel de la PTH antes de la administracion del compuesto.
45
Como se usa en el presente documento, "ausencia de una respuesta de histamina" o "falta de una respuesta histamfnica" se refiere a una dosis de un compuesto que produce un aumento de menos de 15 veces, 14 veces, 13 veces, 12 veces, 11 veces, 10 veces, 9 veces, 8 veces, 7 veces, 6 veces, 5 veces, 4 veces, o 3 veces de la histamina, medida in vitro en un ensayo como se describe en el presente documento, donde el cambio de veces se 50 determina en base a los niveles de histamina antes de la incubacion con el compuesto y despues de 15 minutos de incubacion con el compuesto.
Como se usa en el presente documento, "aminoacido" se refiere a aminoacidos naturales y no naturales. Los veinte aminoacidos de origen natural (L-isomeros) se designan mediante el codigo de tres letras con el prefijo "L-" (excepto 55 para glicina que es aquiral) o mediante el codigo de una letra en mayusculas: alanina ("L-Ala" o "A"), arginina ("L- Arg" o "R"), asparagina ("L-Asn" o "N"), acido aspartico ("L-Asp" o "D"), cistefna ("L-Cys" o "C"), glutamina ("L-Gln" o "Q"), acido glutamico ("L-Glu" o "E"), glicina ("Gly" o "G"), histidina ("L-His" o "H"), isoleucina ("L-Ile" o "I"), leucina ("L-Leu" o "L"), lisina ("L-Lys" o "K"), metionina ("L-Met" o "M"), fenilalanina ("L-Phe" o "F"), prolina ("L-Pro" o "P"), serina ("L-Ser" o "S"), treonina ("L-Thr" o "T"), triptofano ("L-Trp" o "W"), tirosina ("L-Tyr" o "Y") y valina ("L-Val" o
"V"). L-norleucina y L-norvalina se pueden representar como (NLeu) y (NVal), respectivamente. Los diecinueve aminoacidos de origen natural que son quirales tienen un D-isomero correspondiente que se designa por el codigo de tres letras con el prefijo "D-" o mediante el codigo de una letra en minusculas: alanina ("D-Ala" o "a"), arginina ("D- Arg" o "r"), asparagina ("D-Asn" o "a"), acido aspartico ("D-Asp" o "d"), cistefna ("D-Cys" o "c"), glutamina ("D-Gin" o 5 "q"), acido glutamico ("D-Glu" o "e"), histidina ("D-His" o "h"), isoleucina ("D-Ile" o "i"), leucina ("D-Leu" o "I"), lisina ("D-Lys" o "k"), metionina ("D-Met" o "m"), fenilalanina ("D-Phe" o "f'), prolina ("D-Pro" o "p"), serina ("D-Ser" o "s"), treonina ("D-Thr" o "t"), triptofano ("D-Trp" o "w"), tirosina ("D-Tyr" o "y") y valina ("D-Val" o "v"), D-norleucina y D- norvalina se pueden representar como (dNLeu) y (dNVal), respectivamente. Aunque con frecuencia se utiliza un "residuo de aminoacido" con referencia a una subunidad monomerica de un peptido, polipeptido o protefna y el 10 "aminoacido" con frecuencia se utiliza con referencia a una molecula libre, el uso de estos terminos en la tecnica se superpone y varfa. Las expresiones "aminoacido" y "residuo de aminoacidos" se utilizan indistintamente y pueden hacer referencia a una molecula libre de una subunidad monomerica de un peptido, polipeptido o protefna, dependiendo del contexto.
15 Para determinar la "homologfa" porcentual o "identidad" porcentual de dos secuencias de aminoacidos, las secuencias se alinean para fines de comparacion optima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en las secuencias de un polipeptido para una alineacion optima con el otro polipeptido). Los residuos de aminoacidos en las posiciones correspondientes de aminoacidos despues se comparan. Cuando se ocupa una posicion en una secuencia por el mismo residuo de aminoacidos que la posicion correspondiente en la otra secuencia, entonces las 20 moleculas son identicas en esa posicion. Como se usa en el presente documento, "homologfa" de aminoacidos o de acido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoacidos o acido nucleico. Por consiguiente, el porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad de secuencia = numeros de posiciones identicas/numeros totales de las posiciones x 100). El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de polipeptidos se puede 25 determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way, Carlsbad, CA 92008). Para determinar el porcentaje de identidad de dos polipeptidos se utilizan una penalidad de abertura vacfa de 10 y una penalidad de extension vacfa de 0,1. Todos los otros parametros se ajustan en los ajustes por omision.
Un "aminoacido cationico" significa un residuo aminoacfdico que tenga una carga neta positiva a pH fisiologico (7,4), 30 como sea el caso, por ejemplo, en los residuos de aminoacidos, donde la cadena lateral, o "grupo R", contiene un grupo funcional amino u otro grupo funcional que pueda aceptar un proton para cargarse positivamente a pH fisiologico, tal como una porcion de guanidina o imidazol. Los residuos de aminoacidos cationicos incluyen: arginina, lisina, histidina, acido 2,3-diaminopropionico (Dap), acido 2,4-diaminobutirico (Dab), ornitina, y homoarginina.
35 Una "subunidad cationica" significa una subunidad que tiene una carga neta positiva a pH fisiologico (7,4).
Como se usa en el presente documento, las "sustituciones conservadoras de aminoacidos" son sustituciones que no dan como resultado un cambio significativo en la actividad o estructura terciaria de un polipeptido o protefna seleccionado. Estas sustituciones tfpicamente implican reemplazar un residuo aminoacfdico seleccionado con un 40 residuo aminoacfdico diferente que tenga similares propiedades ffsico-qufmicas. Se conocen por los expertos en la tecnica agrupamientos de aminoacidos y residuos aminoacfdicos mediante propiedades ffsico-qufmicas. Por ejemplo, entre los aminoacidos de origen natural, se han definido en la tecnica familias de residuos aminoacfdicos que tienen cadenas laterales similares, e incluyendo cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no 45 cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistefna), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta- ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
50 Como se usa en el presente documento, "reticulacion qufmica" se refiere a la union covalente de dos o mas moleculas.
Un peptido o fragmento de peptido se "deriva de" un peptido o polipeptido precursor si tiene una secuencia de aminoacidos que sea identica u homologa al menos a una secuencia contigua de cinco residuos de aminoacidos, 55 mas preferiblemente ocho residuos de aminoacidos, del peptido o polipeptido precursor.
Como se usa en el presente documento, el termino "hiperparatiroidismo" se refiere a hiperparatiroidismo primario, secundario y terciario, a menos que se indique otra cosa.
El termino "intradermico" significa que en los metodos de tratamiento descritos en el presente documento se aplica a la piel una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto calcimimetico para administrar el compuesto a las capas de la piel por debajo del estrato corneo, y de esta forma conseguir un efecto terapeutico deseado.
5 Como se usa en el presente documento, un polipeptido "aislado" o "purificado" o una porcion biologicamente activa del mismo esta libre de parte del material celular cuando se produce mediante tecnicas de ADN recombinante, o cuando se sintetizan los precursores qufmicos u otros productos qufmicos. La expresion "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipeptidos en las que el polipeptido se separa de parte de los componentes celulares de las celulas en las que se produce de forma natural o recombinante. Cuando el polipeptido 10 o porcion biologicamente activa del mismo se produce de forma recombinante, preferiblemente tambien esta sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, mas preferiblemente menos de aproximadamente el 10 %, y mucho mas preferiblemente menos de aproximadamente el 5 % del volumen de la preparacion de polipeptidos. La expresion "sustancialmente libre de precursores qufmicos u otros productos qufmicos" incluye preparaciones de polipeptidos en las cuales el polipeptido 15 se separa de los precursores qufmicos u otros productos qufmicos que estan implicados en la sfntesis del polipeptido. En una realizacion, la expresion "sustancialmente libre de precursores qufmicos u otros productos qufmicos" incluye las preparaciones de un polipeptido que tengan menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de los precursores qufmicos u otros productos qufmicos, preferiblemente menos de aproximadamente el 20 % de precursores qufmicos u otros productos qufmicos, mas preferiblemente menos de aproximadamente el 15 % de 20 precursores qufmicos u otros productos qufmicos, aun mas preferiblemente menos de aproximadamente el 10 % de precursores qufmicos u otros productos qufmicos, y mucho mas preferiblemente menos de aproximadamente el 5 % de precursores qufmicos u otros productos qufmicos. En realizaciones preferidas, los polipeptidos aislados, o las porciones biologicamente activas de los mismos, carecen de polipeptidos contaminantes procedentes del mismo organismo del que se deriva el polipeptido dominio.
25
Como se usa en el presente documento, "macromolecula" se refiere a una molecula, tal como un peptido, polipeptido, protefna o acido nucleico, que tfpicamente tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 900 Daltons.
30 Un "aminoacido no cationico" significa un residuo aminoacfdico que no tiene carga o tiene una carga neta negativa a pH fisiologico (7,4), como es el caso, por ejemplo, en los residuos de aminoacidos, donde la cadena lateral, o "grupo R", es neutro (polar neutro y no polar neutro) y acido. Los aminoacidos no cationicos incluyen aquellos residuos con un grupo R que sea una porcion de alquilo o aromatica de hidrocarburo (por ejemplo, valina, alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina); un grupo polar R, neutro (asparagina, cistefna, glutamina, serina, treonina, triptofano, 35 tirosina); o un grupo no polar R, neutro (glicina, metionina, prolina, valina, isoleucina). Los aminoacidos no cationicos con un grupo R acido incluyen acido aspartico y acido glutamico.
Un "polfmero" se refiere a una cadena lineal de dos o mas subunidades identicas o no identicas unidas mediante enlaces covalentes.
40
Como se usa en el presente documento, "peptido" y "polipeptido" se refieren a cualquier polfmero constituido de una cadena de residuos de aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos, independientemente de su tamano. Aunque, "protefna" con frecuencia se utiliza con referencia a polipeptidos relativamente largos, y "peptido" con frecuencia se utiliza con referencia a polipeptidos pequenos, el uso de estos terminos en la tecnica, se superpone y varfa. Por lo 45 tanto, por simplicidad, el termino "peptido" se utilizara en el presente documento, aunque en algunos casos en la tecnica pueda hacer referencia al mismo polfmero como un "polipeptido". A menos que se indique otra cosa, la secuencia para un peptido se proporciona en el orden del termino amino con respecto al termino carboxilo.
Un "grupo que contiene tiol" o "resto que contiene tiol", como se usan en el presente documento, significa un grupo 50 funcional que comprende un enlace de azufre-hidrogeno (-SH), y que es capaz de reaccionar con otro tiol en condiciones fisiologicas para formar un enlace disulfuro. Un tiol que es capaz de formar un enlace disulfuro con otro tiol se denomina en el presente documento como un "tiol reactivo". En una realizacion preferida, el grupo que contiene tiol tiene menos de 6 atomos lejos de la estructura del compuesto. En una realizacion mas preferida, el grupo que contiene tiol tiene la estructura (-SH-CH2CH2-C(O)-O-)-.
55
Como se usa en el presente documento, "molecula pequena" se refiere a una molecula distinta a una macromolecula, tal como una molecula organica, y tfpicamente tiene un peso molecular de menos de 1000 daltons.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" se refiere a un sujeto humano o un sujeto animal.
Una "subunidad" significa una unidad monomerica que se une a mas de una unidad monomerica diferente para formar un compuesto polimerico, donde una subunidad es el patron de repeticion mas corto de elementos en el compuesto polimerico. Las subunidades ilustrativas son aminoacidos, que cuando se enlazan forman un compuesto 5 polimerico tal como los denominados en la tecnica como un peptido, un polipeptido o una protefna.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapeuticamente eficaz" es una cantidad requerida para producir un efecto terapeutico deseado. Por ejemplo, en los metodos para reducir el calcio serico en sujetos hipercalcemicos, una cantidad terapeuticamente eficaz es la cantidad requerida para reducir los niveles de calcio 10 serico en al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o el 25 %. El calcio se puede medir como calcio total o como calcio ionizado. A modo de otro ejemplo, en los metodos para disminuir la PTH in vivo, una cantidad terapeuticamente eficaz es la cantidad requerida para reducir los niveles de la PTH en al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o el 25 %.
15
Como se usa en el presente documento, el termino "transdermico" significa que en los metodos de tratamiento descritos en el presente documento, se aplica una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente calcimimetico a la piel para administrar el compuesto a la circulacion sistemica y de esta forma alcanzar un efecto terapeutico deseado.
20 II. Compuestos
En un aspecto, se proporciona un compuesto que comprende la secuencia de las subunidades X1 - X2 - X3 - X4-X5 - X6 - X7, donde X1 es D-cistefna; X2 es D-arginina, D-alanina, D-valina, D-leucina, D-fenilalanina, D-serina, D- glutamina, D-norleucina o D-norvalina; X3 es D-arginina; X4 es D-arginina o un aminoacido no cationico, donde X4
25 no es glicina, porlina o un aminoacido con una cadena lateral acida; X5 es D-arginina; X6 es D-alanina, D-glicina o D-
serina; X7 es D-arginina; donde al menos dos de X2, X3 y X4 son independientemente una subunidad cationica; y donde el peptido esta unido en su extremo N al grupo de conjugacion mediante un enlace disulfuro. Los compuestos tienen actividad para disminuir los niveles de la hormona paratiroidea (PTH) y/o disminuir los niveles de calcio en la sangre de un sujeto. Una disminucion en los niveles de hormonas paratiroidea, como se ilustrara mas adelante, 30 significa una disminucion de la concentracion de la PTH en plasma o sangre en un sujeto con relacion a la
concentracion de la PTH en plasma o sangre antes del tratamiento con el compuesto. En una realizacion, el
compuesto consigue una reduccion en los peptidos, aunque un experto en la tecnica apreciara que los compuestos no peptfdicos que tienen la actividad deseada se pueden disenar en base a los estudios de la relacion estructura- actividad descritos en el presente documento.
35
Como se usa en el presente documento, la hormona paratiroidea o PTH es un peptido de 84 aminoacidos producido por la glandula paratiroides y sus productos de descomposicion. Ademas de la PTH de longitud completa (que consiste en los residuos 1-84 y algunas veces se denomina como PTH "intacta" o "bioactiva"), en la sangre estan presentes diversos fragmentos de la PTH generados mediante proteolisis y otras rutas del metabolismo. La region 140 34 amino-terminal de la molecula de PTH intacta esta activa biologicamente. Esta region de la molecula contiene la secuencia de aminoacidos que permite que la PTH se una a los receptores de la hormona paratiroidea en tejidos diana.
La region media y 35-84 carboxi-terminal de la molecula de PTH intacta se cree que sera biologicamente inerte, 45 aunque posee reactividad inmunologica. La PTH 7-84 se piensa que ejerce efectos que son opuestos a aquellos de la PTH 1-84. Diversos ensayos se han desarrollado para medir los niveles de la PTH, incluyendo diversos productos de descomposicion y se revisan por Souberbielle y col., Kidney International, 77: 93-100 (2010). En una realizacion, un compuesto que tiene actividad para disminuir el nivel de la PTH como se define en el presente documento se deduce utilizando un metodo de cuantificacion de la PTH validada que detecte la forma bioactiva intacta de la PTH 50 (1-84), y se conocen en la tecnica los kits disponibles en el mercado (por ejemplo, vease el ejemplo 3 en el presente documento).
En un primer estudio, los compuestos que contienen 4 a 7 sub-unidades cationicas (por ejemplo, arginina) se generaron y se ensayaron para determinar su capacidad para disminuir la PTH en comparacion con los valores de 55 PTH de valor inicial y animales tratados con solucion salina. Especfficamente, se establecio un modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda para utilizarse en la caracterizacion de la actividad de reduccion de la PTH en un entorno de disfuncion renal. El modelo 1K1C se describe en el Ejemplo 1A, y los compuestos sintetizados para ensayo inclufan (i) Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4), (ii) Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5), (iii) Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), (iv) Ac- crrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:7) y (v) control de solucion salina.
Como se describe en el Ejemplo 1 B, los compuestos identificados como SEQ ID: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7 se administraron cada uno mediante una infusion IV de 30 minutos a animales modelo 1K1C. La figura 1 muestra la reduccion en los niveles PTH en plasma como un porcentaje del nivel de pre-dosificacion (valor inicial).
5 Los cuatro compuestos dosificados a 3 mg/kg produjeron una cafda significativa en la PTH en plasma, aunque las diferencias en la potencia y duracion de la reduccion de la PTH sugieren una relacion entre la carga positiva neta y la actividad para disminuir la PTH. Por ejemplo, el compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6; triangulos) con seis subunidades cationicas (arginina) tuvo un aumento de la eficacia, asf como la duracion de la accion en comparacion con los compuestos Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4; rombos) y Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5: cuadrados), que contenfan 10 cuatro y cinco subunidades cationicas (arginina), respectivamente. Sorprendentemente, el compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6; triangulos) con seis subunidades cationicas (arginina) tuvo un aumento de la duracion de accion en comparacion con el compuesto Ac-crrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:7, cuadrados de color blanco) con siete residuos cationicos (arginina), lo que sugiere que la actividad o potencia de los compuestos no se correlaciona simplemente con el aumento de la carga cationica del compuesto. Es decir, el compuesto Ac-crrrrrrr-NH2(SEQ ID NO:7) con siete 15 subunidades cationicas (residuos de arginina) produjo una cafda inicial similar en la PTH como los compuestos con menos residuos cationicos, aunque a lo largo de las 24 horas despues de la dosificacion fue menos eficaz que Ac- rrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) y Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5). Estos ultimos dos compuestos produjeron una reduccion media de la PTH de ~40 % y 60 % en el punto de tiempo de 24 horas, respectivamente. Tanto el grado de reduccion de la PTH como la duracion de la PTH son criterios importantes para obtener un beneficio terapeutico optimo para 20 pacientes que necesitan del tratamiento. Se debe observar que los compuestos en este estudio se administraron a la misma dosis de mg/kg pero, debido a diferencias en el peso molecular, realmente se dosifico un numero diferente de moles de cada compuesto. Por lo tanto, Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) fue significativamente mas potente que Ac- crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4) y Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5) en una base por moles.
25 Se realizaron estudios adicionales para explorar la relacion de estructura-actividad de los compuestos. El compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se modifico mediante el reemplazo secuencial de un residuo de arginina con un residuo de alanina en cada una de las posiciones subunitarias X2-X7. Los compuestos se caracterizaron en un ensayo del receptor para deteccion de calcio (CaSR) humano in vitro, descrito en el Ejemplo 2, donde se utilizaron celulas HEK 293 que expresan el receptor deteccion de calcio humano para medir la actividad de los compuestos 30 ilustrativos. Sin desear quedar ligado por la teorfa, se piensa que el mecanismo mediante el cual los compuestos descritos disminuyen la PTH in vivo, es a traves de la activacion del CaSR, que se expresa en la glandula paratiroides y controla la secrecion de la PTH. La activacion del CaSR conduce a un aumento en el calcio intracelular y el inositol-3-fosfato (IP3) y la acumulacion posterior de inositol-fosfato-1 (IP1). Por consiguiente, en este ensayo in vitro, se determino la concentracion eficaz maxima media del compuesto para reducir la generacion de IP1 35 en un 50 % (EC50). Los mismos compuestos tambien se ensayaron in vivo para determinar su actividad de reduccion de la PTH, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los numeros en la columna titulada "% de AUC de PTH (1-4 h) de control de solucion salina" de la Tabla 1 definen la actividad como la reduccion en el area bajo la curva (AUC) de PTH durante 4 horas como un porcentaje del AUC de PTH derivada de las ratas de control tratadas con solucion salina. Por ejemplo, un AUC (compuesto tratado)/AUC (control de solucion salina) x 40 100 que es igual a 0 podrfa ser indicativa de un compuesto de reduccion de PTH bastante activo que suprime completamente la PTH (a un nivel indetectable) durante 4 horas despues de una administracion IV individual de ratas normales anestesiadas con isoflurano (IF). Por el contrario, un valor de AUC (compuesto tratado)/AUC (control de solucion salina) x 100 que es igual o mayor que 100 podrfa ser indicativo de un compuesto inactivo.
45 Tabla 1
Actividad in vitro e in vivo de compuestos eiemplares
SEQ ID NO.
Estructura* Actividad in vivo en ratas normales** EC50 in vitro (uM)
% de reduccion de PTH del valor inicial 1 hora despues de la admin. IV de 0,5 mg/kg de compuesto
0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC de PTH de control de solucion salina
SEQ ID NO:6
Ac-crrrrrr- NH2 4 0 0,5
SEQ ID NO:8
Ac-carrrrr- NH2 0 0 1,1
SEQ ID SEQ ID NO:9
Ac-crarrrr- NH2 0 7 1,0
SEQ ID NO:10
Ac-crrarrr- NH2 0 0 1,1
SEQ ID NO:11
Ac-crrrarr- NH2 9 45 5,9
SEQ ID NO:12
Ac-crrrrar- NH2 3 3 0,45
SEQ ID NO:13
Ac-crrrrra- NH2 4 28 1,1
Solucion salina 128 100 ND
*La fuente en negrita indica sustituciones de D-alanina de aminoacidos cationicos (D-arginina) en la SEQ ID NO:6. **Reduccion de la PTH despues de la administracion IV de 0,5 mg/kg en ratas normales anestesiadas con isoflurano - la PTH se midio 1, 2, 3 y 4 horas despues de la administracion y se calculo el AUC acumulativa. Los datos de la PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*100.
En la Tabla 1, los compuestos Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), Ac-carrrrr-NH2 (SEQ ID NO:8) y Ac-crrarrr-NH2 (SEQ ID NO:10) fueron muy potentes, como resulta evidente por la disminucion en la PTH porcentual a menos del limite de deteccion o esencialmente cero segun se mide in vivo despues de una administracion IV individual en ratas 5 normales. La sustitucion del residuo cationico (arginina) en las posiciones 2, 3, 4 o 7 de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) dio como resultado en una perdida de aproximadamente dos veces la potencia in vitro. La sustitucion en la posicion 5 para producir el compuesto Ac-crrrarr-NH2 (SEQ ID NO:11) produjo una reduccion de 5-10 veces en la potencia in vitro, aunque la reduccion AUC de la PTH porcentual in vivo del 45 % podrfa ser suficientemente activa para una terapia clfnica. Sorprendentemente, la sustitucion del residuo de arginina cationica en la posicion 6 con el 10 residuo no cargado (alanina) realmente mejoro la potencia. Los datos ilustran que los residuos cationicos y no cargados en diferentes posiciones no son todos iguales y hay cambios en la actividad como resultado del cambio en la estructura del compuesto.
Para evaluar adicionalmente el efecto de cambio en la actividad como una funcion de cambio en la estructura del 15 compuesto, se genero otra serie de analogos de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) que contenfan dobles sustituciones de aminoacidos, donde dos residuos cationicos (arginina) se reemplazaron por residuos no cargados (alanina), y se ensayaron para determinar la potencia. En la Tabla 2 se muestran los datos. Es importante observar que esta serie de compuestos tiene la misma carga neta cationica que la SEQ ID NO:4 (cuatro residuos cationicos), sorprendentemente todavfa algunos muy activos (SEQ ID NO:26) con muy bajo % de AUC de la PTH del control con 20 solucion salina mientras que otros son inactivos (por ejemplo, la SEQ ID NO:14). Inesperadamente, esto sugiere que la posicion de cambios, asf como la carga cationica total pueden influir en la potencia de los compuestos para la reduccion de la PTH. Los datos mostrados en la Tabla 2 son consistentes con los datos mostrados en la Tabla 1, lo que sugiere que los residuos cationicos de la SEQ ID NO:6 son esenciales en las posiciones 5 y 7, aunque no se requieren en la posicion 6, para la actividad de reduccion de la PTH.
25
Tabla 2
Actividad in vivo de los compuestos eiemplares
Actividad in vivo en ratas normales**
SEQ ID
Estructura del % de reduccion de PTH del valor inicial 1 hora 0,5 mg/kg de bolo IV % de
NO.
Compuesto* despues de la administracion IV de 0,5 mg/kg AUC de PTH de control de
del compuesto solucion salina*
Solucion Salina
Solucion salina 128 100
SEQ ID NO:14
Ac-crrarra-NH2 86 130
SEQ ID NO:15
Ac-cararrr-NH2 75 116
SEQ ID NO:16
Ac-carrarr-NH2 118 105
SEQ ID NQ:17
Ac-crraarr-NH2 39 102
SEQ ID NO:18
Ac-crararr-NH2 72 87
SEQ ID NO:19
Ac-carrrra-NH2 29 72
SEQ ID NO:20
Ac-crarrra-NH2 45 69
SEQ ID NO:2i
Ac-crrraar-NH2 36 50
SEQ ID NO:22
Ac-caarrrr-NH2 24 48
SEQ ID NO:23
Ac-crarrar-NH2 0 43
SEQ ID NO:24
Ac-craarrr-NH2 8 9
SEQ ID NO:25
Ac-crrarar-NH2 4 6
SEQ ID NO:26
Ac-carrrar-NH2 0 i
SEQ ID NO:27
Ac-c(C)arrrar-NH2 2 8
SEQ ID NO:28
Ac-c(C)rrarar-NH2 0 i6
*La fuente en negrita indica sustituciones de D-alanina de aminoacidos cationicos (D-arginina) en Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) **Reduccion de la PTH despues de la administracion IV de 0,5 mg/kg en ratas normales anestesiadas con isoflurano - la PTH se midio i, 2, 3 y 4 horas despues de la administracion y se calculo el AUC acumulativa. Los datos de la PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*i00.
Los datos en la Tabla 2 ilustran los cambios estructurales que influyen en la actividad. En una realizacion, el compuesto es Ac-caarrrr-NH2 (SEQ ID NO:22) y en otra realizacion, el compuesto es Ac-craarrr-NH2 (SEQ ID NO:24).
5
Se realizaron estudios adicionales de la relacion estructura-actividad utilizando el ensayo celular in vitro en celulas HEK 293 que expresan el receptor de deteccion de calcio humano, como se describe en el Ejemplo 4. Se determino la capacidad de los peptidos Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) y Ac-arrrar-NH2 (SEQ ID NO:29) para activar el CaSR humano mediante la medicion de la acumulacion de monofosfato de inositol (IPi), que es un reflejo de la produccion 10 de IP3. La produccion de IP3 es un mensajero secundario de senalizacion celular importante y su produccion es una consecuencia aguas abajo directa de la activacion de CaSR. La acumulacion de IPi despues de la produccion de IP3 se puede obtener mediante el tratamiento de las celulas utilizadas en el ensayo con cloruro de litio (LiCh) que inhibe la enzima que convierte IPi en inositol. En los estudios descritos en el Ejemplo 4, se midio la acumulacion de IPi en presencia de los compuestos ilustrativos Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) y Ac-arrrar-NH2 (SEQ ID NO:29). 15 Los resultados se muestran en la figura 2A.
La concentracion del IPi se indica como nM a lo largo del eje Y y las concentraciones del compuesto de la SEQ ID NO:26 o la SEQ ID NO:29 se indican como M a lo largo del eje X. La ausencia del residuo de D-cistefna N-terminal de la SEQ ID NO:29 redujo drasticamente la capacidad del compuesto para activar el CaSR en comparacion con la 20 SEQ ID NO:26. Es decir, la eliminacion del residuo de cistefna N-terminal redujo significativamente la potencia del compuesto, ya que los peptidos Ac-carrrar-NH (SEQ ID NO:26) y Ac-arrrar-NH2 (SEQ ID NO:29) difieren unicamente en la presencia o ausencia de la D-cistefna N-terminal.
La contribucion del grupo que contiene tiol en la subunidad Xi del compuesto (por ejemplo, en ciertas realizaciones 25 donde el compuesto es un peptido en el residuo N-terminal), tambien se investigo en un estudio in vivo. La actividad para disminuir la PTH de los peptidos identificados como la SEQ ID NO:26 (Ac-carrrar-NH2) y como la SEQ ID NO:29 (Ac-arrrar-NH2) se evaluo in vivo de acuerdo con los procedimientos en el Ejemplo 4. Los niveles de la PTH en plasma se valoraron antes de la dosificacion y i, 2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion. Los resultados se muestran en la figura 2B. Como se observa, una dosis de 0,5 mg/kg del peptido Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) 30 (cuadrados) disminuyo la concentracion en sangre de la PTH a un nivel no detectable hasta 4 horas despues de la dosificacion. Por el contrario, el peptido que carece de un residuo N-terminal con un grupo que contiene tiol, Ac- arrrar-NH2 (SEQ ID NO:29), rombos, no redujo la concentracion de la PTH, ni siquiera a una dosis sustancialmente mayor (es decir, 9 mg/kg).
35 La relacion estructura-actividad del grupo que contiene tiol en la subunidad Xi del compuesto se analizo
adicionalmente preparando compuestos con subunidades X1 diferentes. Los compuestos, mostrados en la Tabla 3, se ensayaron in vivo en ratas normales para determinar la actividad para reducir la PTH.
Tabla 3
Actividad in vivo de compuestos eiemplares
SEQ ID NO.
Estructura del Actividad in vivo en ratas normales* 0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC
Compuesto
de PTH de control de solucion salina**
Solucion Salina
Solucion salina 100
SEQ ID NO:6
Ac-crrrrrr-NH2 3
SEQ ID NO:30
Ac-bAla-crrrrrr-NH2 0
SEQ ID NO:31
Mpa-rrrrrr-NH2 2
SEQ ID NO:32
Ac-dHcy-rrrrrr-NH 2 21
SEQ ID NO:33
Ac-d Pen-rrrrrr-NH 2 9
*La fuente en negrita indica la sustitucion respectiva del residuo que contiene tiol (D-cistefna) en Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6). **Reduccion de PTH tras 0,5 mg/kg de administracion IV en ratas normales anestesiadas con isoflurano - PTH se
midio 1, 2, 3 y 4 horas tras la administracion y se calculo el AUC acumulada acuerdo con la siguiente formula: AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*100.
. Los datos de PTH se calcularon de
5
Los datos en la Tabla 3 ilustran que se puede variar la subunidad X1 que contiene tiol. Se ensayaron los compuestos con lo siguiente en el residuo N-terminal -D-cistefna (cys), D-peniciliamina (dPen), d-homocistefna (dHcy) y acido mercaptopropionico (Mpa). Ademas, un aminoacido natural o no natural, tal como beta alanina, se puede conjugar para el residuo que contiene tiol N-terminal. Los datos ilustran que los compuestos cationicos tales como Ac-crrrrrr- 10 NH2 (SEQ ID NO:6) que contienen diferentes grupos que contienen tiol en la subunidad Xi reducen eficazmente la PTH in vivo. La sustitucion del residuo de cistefna N-terminal con metionina, que no contiene un grupo tiol, dio como resultado un compuesto con muy baja actividad de reduccion de PTH in vivo (datos no mostrados).
En base a los estudios anteriores, los compuestos de la secuencia contigua de las subunidades Xi - X2 - X3 - X4 - 15 X5 - X5 - X7, donde Xi es una subunidad que comprende un grupo que contiene tiol, tienen actividad para disminuir los niveles de la hormona paratiroidea. En una realizacion, el grupo que contiene tiol en la subunidad X se selecciona del grupo que consiste en los residuos de aminoacidos que contienen tiol y las porciones que contienen tiol organico. En otra realizacion, el grupo que contiene tiol es capaz de reaccionar con otro grupo tiol a pH y temperatura fisiologicos. En ciertas realizaciones donde el residuo que contiene tiol es un residuo de aminoacido, la 20 subunidad X puede ser una cualquiera de cistefna, glutation, acido mercapto-propionico, cistefna N-acetilada y cistefna PEGilada. En realizaciones donde el grupo que contiene tiol es una subunidad de un residuo que no es de aminoacidos, tal como una pequena molecula organica con un grupo que contiene tiol, la subunidad X1 puede ser un resto tiol-alquilo, o tioacilo, tales como los residuos de 3-mercaptopropilo o 3-mercaptopropionilo. En una realizacion, el tiol no es homocistefna.
25
Por consiguiente, y en otra realizacion, los compuestos descritos en el presente documento tienen "actividad clfnica para disminuir el nivel de la hormona paratiroidea", lo que significa que el compuesto, tras su administracion a un sujeto, disminuye la hormona paratiroidea en plasma segun se mide mediante el area bajo la curva de la PTH acumulada (AUC de la PTH) durante 4 horas despues de la administracion en comparacion con el AUC de la PTH 30 de un sujeto de control tratado con el vehfculo correspondiente. Las concentraciones de la PTH en plasma se miden utilizando, por ejemplo, un kit ELISA disponible en el mercado que detecta la PTH 1-84 intacta bioactiva (vease el Ejemplo 3 para un kit especffico). El compuesto con actividad clfnica para disminuir el nivel de la hormona paratiroidea reduce el AUC de la PTH en al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 5o %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % en comparacion con el AUC de PTH de un sujeto de control tratado con el vehfculo correspondiente.
35
Los estudios anteriores, y otros descritos mas adelante, ilustran realizaciones adicionales de los compuestos descritos en el presente documento, donde la subunidad X1 en algunas realizaciones se puede modificar qufmicamente, tal como mediante modificacion qufmica para incluir un grupo acetilo, un grupo benzoflo, un grupo bencilo, un grupo butilo, un aminoacido natural o no natural tal como beta-alanina acetilada, o se une mediante un 40 enlace covalente a otro resto tiol. Los productos terapeuticos peptfdicos pueden ser vulnerables al ataque por peptidasas. Las exopeptidasas tfpicamente son enzimas no especfficas que escinden los residuos de aminoacidos de los terminos amino o carboxi de un peptido o protefna. Las endopeptidasas, que se escinden dentro de una secuencia de aminoacidos, tambien pueden ser no especfficas; sin embargo las endopeptidasas con frecuencia reconocen las secuencias amino particulares (sitios de reconocimiento) y escinden el peptido en o cerca de esos
sitios. Por consiguiente, se contemplan las modificaciones al compuesto para protegerlo de la degradacion proteolftica.
Un metodo para proteger un peptido de la degradacion proteolftica implica modificar qufmicamente, o "proteger", los 5 extremos amino y/o carboxi de los peptidos. Como se usa en el presente documento, los terminos "modificado qufmicamente" o "protegidos" se utilizan de forma intercambiable para hacer referencia a la introduccion de un grupo de bloqueo a un extremo o ambos extremos del compuesto a traves de una modificacion covalente. Los grupos de bloqueo adecuados sirven para proteger los extremos de los peptidos sin disminuir la actividad biologica de los peptidos. Cualquier residuo situado en los extremos amino o carboxi, o ambos, de los compuestos descritos, 10 incluyendo las subunidades que contienen tiol, se puede modificar qufmicamente.
En una realizacion preferida, el extremo amino del compuesto se modifica qufmicamente mediante acetilacion, para proporcionar un peptido de N-acetilo (que se puede representar como "Ac-" en una estructura o formula en el presente documento). En una realizacion preferida, el extremo carboxi de los peptidos descritos, se modifica 15 qufmicamente mediante amidacion para proporcionar una carboxamida primaria en el extremo C (que se puede representar como "-NH2" en una secuencia peptfdica, estructura, o formula en el presente documento). En una realizacion preferida, tanto el extremo amino como el extremo carboxi se modifican qufmicamente mediante acetilacion y amidacion, respectivamente. Sin embargo, son posibles otros grupos de proteccion. Por ejemplo, el extremo amino se puede proteger mediante acilacion con grupos tales como un grupo acetilo, un grupo benzoflo, o 20 con aminoacidos naturales o no naturales, tales como beta-alanina protegida con un grupo acetilo, o mediante alquilacion con grupos tales como un grupo bencilo o un grupo butilo, o mediante sulfonilacion para formar sulfonamidas. De forma similar, el extremo carboxi se puede esterificar, o convertir en una amida secundaria, y una sulfonamida de acilo, o similar. En algunas realizaciones, el extremo amino o el extremo carboxi pueden comprender un sitio para la union de un resto polietilenglicol (PEG), es decir, los extremos amino o carboxi se pueden modificar 25 qufmicamente mediante reaccion con un PEG funcionalizado adecuadamente.
La proteccion de los peptidos de las endopeptidasas tfpicamente implica la identificacion y eliminacion de un sitio de reconocimiento de endopeptidasa de un peptido. Los sitios de reconocimiento de proteasa se conocen bien por los expertos en la tecnica. Por lo tanto, es posible identificar un sitio de reconocimiento potencial de endoproteasa y 30 despues eliminar ese sitio alterando la secuencia de aminoacidos dentro del sitio de reconocimiento. Los residuos en la secuencia de reconocimiento se pueden mover o eliminar para destruir el sitio de reconocimiento. Preferiblemente, se realiza una sustitucion conservadora con uno o mas de los aminoacidos que comprenden un sitio de reconocimiento de proteasa identificado.
35 A. Estudios adicionales de la relacion estructura-actividad
Se realizaron estudios adicionales de la actividad estructural, para evaluar adicionalmente el efecto de las propiedades de cada subunidad en el compuesto o su actividad terapeutica. Estos estudios se describiran ahora haciendo referencia al Ejemplo 5.
40
Se preparo una serie de compuestos que tenfan un residuo de L-aminoacido sustituido por un residuo de D- aminoacido en base a la estructura de reduccion de PTH Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3). Los compuestos se administraron a sujetos y se valoraron los niveles de PTH en plasma antes de la dosificacion y 1, 2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion, como se describe en el Ejemplo 5, y se calculo el AUC como la suma de los valores de 45 concentracion de la PTH en los puntos de tiempo de 1, 2, 3 y 4 horas, normalizados por las AUC para el control con solucion salina en los mismos puntos del tiempo, multiplicados por 100. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Efecto de la sustitucion de L-aminoacidos en la potencia
Nombre del
Estructura Actividad in vivo en ratas normales 0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC
Compuesto
de PTH* de control de solucion salina
SEQ ID NO:3
Ac-c(C)arrrar-NH2 8
SEQ ID NO:34
Ac-C(C)arrrar-NH2 17
SEQ ID NO:35
Ac-c(C)Arrrar-NH2 68
SEQ ID NO:36
Ac-c(C)aRrrar-NH2 87
SEQ ID NO:37
Ac-c(C)arRrar-NH2 182
SEQ ID NO:38
Ac-c(C)arrRar-NH2 130
SEQ ID NO:39
Ac-c(C)arrrAr-NH2 129
SEQ ID NO:40
Ac-c(C)arrraR-NH2
142
Solucion Salina
100
*Reduccion de PTH tras 0,5 mg/kg de administracion IV en ratas normales anestesiadas con isoflurano - PTH se midio 1, 2, 3 y 4 horas tras la administracion y se calculo el AUC acumulada. Los datos de PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula: AUCcorm tratado/AUCcontrol de solucion salina*100__________________________________
Los compuestos ilustrativos mostrados en la Tabla 4 se modificaron qufmicamente, tanto en el extremo N como en el extremo C, segun se indica por las designaciones Ac y NH2. La secuencia de siete subunidades carrrar (SEQ ID NO:3), donde todas las estructuras eran residuos de D-aminoacidos, se modifico reemplazando una subunidad en 5 un tiempo con un L-aminoacido. La subunidad X1 era un residuo D-Cys (o un residuo L-Cys en la SEQ ID NO:34) conjugado a traves de un enlace disulfuro con un residuo L-Cys, segun se indica mediante la designacion entre parentesis (C). Los datos in vivo de la disminucion de la PTH en la Tabla 4 muestran que la quiralidad de Arg y Ala afectan la actividad de los compuestos. En una realizacion, se contempla un compuesto de la secuencia X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7, donde al menos las subunidades identificadas como X4 y X7 son subunidades de residuos de D- 10 aminoacidos. En otra realizacion, las subunidades identificadas como X4, X5, X6 y X7 son subunidades de residuos de D-aminoacidos. En una realizacion preferida, las subunidades identificadas como X3, X4, X5, X6 y X7 son subunidades de residuos de D-aminoacidos. En realizaciones mucho mas preferidas, las subunidades identificadas como X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son subunidades de residuos de D-aminoacidos, y todas las subunidades X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son subunidades de residuos de D-aminoacidos.
15
En otros estudios, tambien se descubrio que la sustitucion de un peptido que tiene todos los L-aminoacidos con todos los D-aminoacidos no redujo la actividad in vitro de los peptidos probados; de hecho, los peptidos compuestos totalmente por los D-aminoacidos parecieron mejorar la potencia para la activacion del CaSR. Tambien se mostro que algunos de los residuos cationicos (arginina), en las posiciones especfficas con relacion al residuo de cistefna, 20 se podfan sustituir con residuos no cargados (alanina) con mfnimo efecto sobre la actividad hacia el CaSR.
Para caracterizar adicionalmente la relacion entre la estructura y la actividad contra el CaSR, se ensayaron una diversidad de peptidos cationicos con diferentes numeros (4 a 8) de los residuos de arginina (cada uno de los cuales contenfa una cistefna N-terminal) utilizando el ensayo de celulas in vitro HEK-293. Se descubrio una correlacion 25 directa entre el numero de subunidades cationicas y la potencia del compuesto, donde la potencia resulta evidente por la capacidad para activar el CaSR. La reduccion del numero de subunidades cationicas (por ejemplo, arginina) de 5 a 4 dio como resultado en el mayor desplazamiento en la potencia (>10 veces) lo que sugiere que puede haber un punto de inflexion de actividad entre los compuestos que tengan estas cargas netas, de que una subunidad cationica en la subunidad X5 se prefiera para la actividad. Por consiguiente, se contemplan los compuestos de la 30 estructura X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7, donde X5 es una unidad cationica. En ciertas realizaciones, X1 es una subunidad que comprende un grupo tiol que es capaz de reaccionar con otro grupo tiol en condiciones fisiologicas (un "tiol reactivo", lo que significa que un tiol reacciona con otro tiol (por ejemplo, cistefna con cistefna) en condiciones fisiologicas de pH 7,4 y temperatura corporal).
35 De forma inesperada, Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) con seis residuos cationicos, cuando se evaluo in vivo, mostro una mayor y mas prolongada actividad que Ac-crrrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:41), que tiene ocho residuos cationicos. Esto contrasta con la observacion de que la SEQ ID NO:41 era mas potente en la activacion del CaSR en este en ensayo celular in vitro. Sin desear quedar ligado por la teorfa, se cree que el rendimiento superior de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) in vivo puede ser el resultado de las mejores propiedades farmacocineticas de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ 40 ID NO:6), debido a que se espera que Ac-crrrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6441 se absorba en las celulas en virtud de su caracterfstica de penetracion celular, y se elimine asf de la proximidad a la porcion activa de la CaSR.
Para explorar adicionalmente la relacion de estructura-actividad de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), se reemplazan algunos de los residuos cationicos (arginina) con residuos no cargados (alanina). Se descubrio que el reemplazo de 45 los residuos cationicos (arginina) en las posiciones subunitarias X2 y X4 dio como resultado un compuesto (SEQ ID NO:15) que tuvo una potencia reducida significativamente in nitro para activar el CaSR. Por el contrario, el reemplazo de los residuos cationicos (arginina) en las posiciones subunitarias X2 y X6 dio como resultado un compuesto (SEQ ID NO:26) que conservo mucha de la potencia observada con Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6). Estos resultados sugieren que la posicion de los residuos cargados en el compuesto contribuye a la potencia y, en algunas 50 realizaciones, puede superar la contribucion de la carga positiva total del peptido. Tambien parece que los residuos cationicos (arginina) en ciertas posiciones, tales como la posicion subunitaria X5, contribuyen desproporcionalmente a la potencia.
Se descubrio que la presencia de una cistefna N-terminal mejora notablemente la potencia de los peptidos para
activar el CaSR. El CaSR es un receptor acoplado a la protefna de la 7-transmembrana G con un mayor dominio extracelular que funciona como un receptor homodimerico. Existen 18 residuos de cistefna en el dominio extracelular, algunos de los cuales se han mostrado mediante polimorfismo o analisis mutacional que son importantes para la actividad del receptor. Han de apreciarse particularmente las cistefnas 129 y 131 de la region de 5 Bucle Asa 2 del dominio extracelular. Se piensa que las cistefnas 129 y 131 forman un enlace disulfuro intermolecular entre los dos monomeros del complejo de receptores, que esta en una configuracion cerrada o inhibida. La mutacion de la cistefna 129 activa el CaSR, como lo hace un numero de otras mutaciones, incluyendo una supresion total de la region de Bucle 2. La potencia mejorada proporcionada por el residuo de cistefna N- terminal en los compuestos descritos puede ser resultado de una interaccion especffica con uno o mas residuos de 10 cistefna en el dominio extracelular del CaSR.
Para valorar adicionalmente el efecto de la quiralidad de las sustituciones de aminoacidos en la actividad de CaSR in vitro, se genero una serie de analogos de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) que contenfan sustituciones de L- aminoacido o de aminoacido aquiral (glicina) en diversas posiciones y se ensayaron para determinar la potencia 15 contra el CaSR. Los analogos ensayados inclufan Ac-cGrrrGr-NH2, (SEQ ID nO:42), (ii) Ac-cArrrAr-NH2 (SEQ ID NO:43), y (iii) Ac-CaRrRaR-NH2 (SEQ ID NO:44). Todos los analogos anteriores tuvieron significativamente menor potencia que Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), que varfa de una diferencia de 10 veces para la SEQ ID NO:44 (la mas potente de los tres analogos) y una diferencia de mas de 2000 veces para la SEQ ID NO:43 (la menos potente de los tres analogos). Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26), en el que los residuos de D-aminoacido cationico (residuos de D- 20 arginina) en las posiciones 2 y 6 de la SEQ ID NO:6 se reemplazaron mediante los residuos de D-aminoacido no cargados (residuos de D-arginina), el cambio en la actividad fue mucho menor (diferencia de ~3 veces). Por lo tanto, sorprendentemente, se descubrio que la interrupcion de todos residuos de D-aminoacidos de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) con dos o mas residuos de L-aminoacidos dio como resultado en una reduccion significativa de la potencia. Tambien fue sorprendente que la potencia disminuyo mas de 80 veces cuando la interrupcion del residuo fue un 25 residuo de aminoacidos aquiral no cargado (residuo de glicina) en comparacion a cuando fue un residuo de L- aminoacidos no cargados (residuo de L-alanina).
Tambien fue sorprendente que el reemplazo de los dos residuos de D-aminoacidos no cargados (residuos de D- alanina) de Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID No:26) con sus homologos L-(SEQ ID NO:43), dio como resultado una 30 disminucion de mas de 600 veces en la potencia, mientras que reemplazarlos con un residuo de aminoacidos aquirales no cargados (residuo de glicina) (SEQ ID NO:42) dio como resultado en una reduccion de menos de 8 veces en la potencia, y que el reemplazo de tres residuos de D-aminoacidos cationicos (residuos de D-arginina) de Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) con sus homologos L- (SEQ ID NO:44), dio como resultado en una diferencia menor a 4 veces en la potencia.
35
La actividad de una diversidad de peptidos y conjugados se ensayo contra el CaSR humano. Estos estudios se realizaron midiendo la produccion de IP1 en celulas HEK293 que expresan el CaSR humano. Los valores EC50 se muestran en la Tabla 5. Cada peptido se ensayo en ocho concentraciones diferentes, por duplicado, para establecer una curva de dosis-respuesta. El ajuste de la curva se realizo utilizando GraphPad Prism. En la Tabla 5, y a lo largo 40 de toda la memoria descriptiva, los residuos proporcionados en mayusculas son L-aminoacidos, mientras que las letras minusculas indican D-aminoacidos. "Ac" indica un grupo protector de acetilo, "NH2" indica un grupo protector de amida, "Ac-bAla" es una beta-alanina acetilada, "GSH" indica glutation reducido, "GS" indica glutation oxidado, "PEG" se refiere a polietilenglicol, "PEG2" y "PEG5" se refieren a restos de polietilenglicol de 2 kDa y 5 kDa, respectivamente, y "Mpa" se refiere a acido mercaptopropionico. Un grupo encerrado entre parentesis indica que el 45 grupo o resto esta unido a la cadena lateral de la subunidad anterior o residuo aminoacfdico.
Tabla 5
Valores de ECrq para peptidos cationicos en ensayo de CaSR in _ vitro
Nombre del Compuesto
Estructura
EC50 (uM)
(SEQ ID NO:45) (SEQ ID NO:47)
CHDAPIGYD
Ac-CYGRKKRRQRRR-NH2
21
(SEQ ID NQ:46) (SEQ ID NO:47)
CPDYHDAGI ! Ac-CYGRKKRRQRRR-NH, 21
(SEQ ID NO:47)
Ac-CYGRKKRRQRRR-NH2 4,5
(SEQ ID NO:48)
Ac-YGRKKRRQRRR-NH2 16
(SEQ ID NO:41)
Ac-crrrrrrrr-NH2 0,3
(SEQ ID NO:6)
Ac-crrrrrr-NH2 0,5
(SEQ ID NO:15)
Ac-cararrr-NH2 13
(SEQ ID NO:26)
Ac-carrrar-NH2 1,6
(SEQ ID NO:4)
Ac-crrrr-NH2 16
(SEQ ID NO:5)
Ac-crrrrr-NH2 2,5
(SEQ ID NO:7)
Ac-crrrrrrr-NH2 0,6
(SEQ ID NO:49)
Ac-caraarrr-NH2 1000
(SEQ ID NO:8)
Ac-carrrrr-NH2 1,1
(SEQ ID NO:9)
Ac-crarrrr-NH2 1
(SEQ ID NO:10)
Ac-crrarrr-NH2 1,1
(SEQ ID NO:50)
Ac-cyq rkkrrq rrr-N H 2 2
(SEQ ID NO:51)
HjN-crrrrrr-NH'j 1 H2N-crrrrrr-NH2 0,44
(SEQ ID NO:3)
Ac-c(C)arrrar-NH2 10
(SEQ ID NO:52)
Ac-carrrar-NH2 1 Ac-carrrar-NH2 0,7
(SEQ ID NO:30)
Ac-bAla-crrrrrr-NH2 1
(SEQ ID NO:53)
Ac-c(GS)rrrrrr-NH2 7,8
(SEQ ID NO:54)
GS-crrrrrr -
(SEQ ID NO:55)
Ac-c(Ac-C)arrrar-NH2 21
Nombre del compuesto
Estructura EC50 ((pM)
(SEQ ID NO:56)
Ac-c(Mpa)arrrar-NH2 21
(SEQ ID NO:57)
Ac-c(PEG2-C)arrrar-NH2 2,3
(SEQ ID NO:58)
Ac-c(PEG5-C)rrrrrr-NH2 0,58
(SEQ ID NO:59)
Ac-c(PEG2-C)rrrrrr-NH2 0,02
(SEQ ID NO:34)
Ac-C(C)arrrar-NH2 2,5
(SEQ ID NO:60)
c(C)arrrar-NH2 3,1
(SEQ ID NO:61)
Ac-bAla-c(C)arrrar-NH2 2,6
(SEQ ID NO:62)
bAla-c(C)arrrar -
(SEQ ID NO:42)
Ac-cGrrrGr-NH2 12
(SEQ ID NO:63)
Ac-cGrrrGr -
(SEQ ID NO:64)
Ac-cArrrAr -
(SEQ ID NO:43)
Ac-cArrrAr-NH2 >1000
(SEQ ID NO:44)
Ac-CaRrRaR-NH2 5,6
(SEQ ID NO:65)
Ac-cvrrrvr-NH2 35
(SEQ ID NO:66)
Ac-cvrrrvr -
(SEQ ID NO:67)
Ac-Crrrrrr-NH2 6,2
(SEQ ID NO:68)
Ac-carrrer-NH2 62
(SEQ ID NO:69)
Ac-cerrrar-NH2 31
(SEQ ID NO:72)
Ac-cakrrar-NH2 35
(SEQ ID NO:73)
Ac-carkrar-NH2 31
(SEQ ID NO:74)
Ac-carrrar-OH 31
(SEQ ID NO:11)
Ac-crrrarr-NH2 5,9
(SEQ ID NO:12)
Ac-crrrrar-NH2 0,45
(SEQ ID NO:13)
Ac-crrrrra-NH2 1,1
(SEQ ID NO:75)
Ac-CARRRAR-NH2 58
(SEQ ID NO:76)
Ac-caarrrrrr-NH2 4,5
(SEQ ID NO:77)
Ac-caaarrrrrr-NH2 4,6
(SEQ ID NO:78)
Ac-carararar-NH2 5,3
(SEQ ID NO:29)
Ac-arrrar-NH2 >1000
(SEQ ID NO:79)
Ac-carrrarar-NH2 13
(SEQ ID NO:80)
crrrrrr-NH2 1,1
(SEQ ID NO:32)
Ac-dHcy rrrrrr-NH2 2
(SEQ ID NO:81)
Ac-c(Berizoyl)rrrrrr-NH 2 3,6
(SEQ ID NO:82)
Ac-c(acetyl)rrrrrr-NH 2 4,1
En otro estudio de la relacion estructura-actividad, la contribucion de los aminoacidos no cationicos a la potencia de los peptidos se evaluo preparando una serie de peptidos con diversos residuos de D-aminoacidos o glicina (Tabla 6) o con aminoacidos no naturales estericamente impedidos (Tabla 7), sustituidos en diversas posiciones en el peptido 5 Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) y en el peptido Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:153). Los peptidos se administraron como un bolo IV a ratas Sprague Dawley normales, a una dosis de 0,5 mg/kg. Se utilizo como un control un bolo intravenoso (IV) de solucion salina. Los niveles de la PTH en plasma se evaluaron antes de la dosificacion a 1, 2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion. Los resultados se muestran en las tablas a continuacion, e indican que: 1) un aminoacido pequeno tal como alanina, glicina o serina se prefiere en la posicion 6 en el peptido Ac-carrrar-NH2 10 (SEQ ID NO:26), y 2) la alanina en la posicion 2 en Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) es mucho mas permisiva para las sustituciones y se puede sustituir con aminoacidos naturales hidrofobos (por ejemplo, D-Val, D-Leu), aromaticos (por ejemplo, D-Phe) , o polares (por ejemplo, D-Ser, D-Gln), asf como aminoacidos hidrofobos voluminosos no naturales (por ejemplo, dNle, dNva), pero no los acidos, y que 3) el residuo de alanina en la posicion 4 del peptido Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25) tambien es muy permisivo para las sustituciones y se puede adaptar a la mayorfa 15 de tipos de aminoacidos naturales (asf como tambien aminoacidos hidrofobos voluminosos no naturales (por ejemplo DNle, dNva) aunque no es permisivo para los aminoacidos que afectan a la conformacion secundaria, concretamente, glicina o prolina o los aminoacidos con cadena lateral acida.
Tabla 6
Actividad de los compuestos peptfdicos eiemplares
SEQ ID NO.
Estructura del Compuesto* Actividad in vivo en ratas normales** 0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC de PTH de control de solucion salina
Solucion Salina
Solucion Salina
100
SEQ ID NO:83
Ac-carrrfr-NH2 177
SEQ ID NO:84
Ac-carrrir-NH2 161
SEQ ID NO:85
Ac-carrrlr-NH2 140
SEQ ID NO:68
Ac-carrrer-NH2 81
SEQ ID NO:87
Ac-carrrvr-NH2 79
SEQ ID NO:88
Ac-carrrpr-NH2 76
SEQ ID NO:89
Ac-carrrhr-NH2 48
SEQ ID NO:90
Ac-carrrqr-NH2 41
SEQ ID NO:91
Ac-carrrtr-NH2 18
SEQ ID NO:92
Ac-carrrsr-NH2 6
SEQ ID NO:93
Ac-carrrGr-NH2 5
SEQ ID NO:94
Ac-cerrrar-NH2 103
SEQ ID NO:95
Ac-cGrrrar-NH2 45
SEQ ID NO:96
Ac-cirrrar-NH2 33
SEQ ID NO:97
Ac-cprrrar-NH2 30
SEQ ID NO:98
Ac-clrrrar-NH2 26
SEQ ID NO:99
Ac-cqrrrar-NH2 24
SEQ ID NO:100
Ac-ctrrrar-NH2 23
SEQ ID NO:101
Ac-cvrrrar-NH2 19
SEQ ID NO:102
Ac-csrrrar-NH2 13
SEQ ID NO:103
Ac-chrrrar-NH2 1
SEQ ID NO:104
Ac-cfrrrar-NH2 0
SEQ ID NO:105
Ac-crrGrar-NH2 69
SEQ ID NO:106
Ac-crrprar-NH2 68
SEQ ID NO:107
Ac-crrerar-NH2 56
SEQ ID NO:108
Ac-crrtrar-NH2 13
SEQ ID NO:109
Ac-crrhrar-NH2 9
SEQ ID NO:110
Ac-crrfrar-NH2 6
SEQ ID NO:111
Ac-crrsrar-NH2 4
SEQ ID NO:112
Ac-crrqrar-NH2 4
SEQ ID NO:113
Ac-crrvrar-NH2 3
SEQ ID NO:114
Ac-crrlrar-NH2 1
SEQ ID NO:115
Ac-crrirar-NH2 0
*La fuente en negrita indica una sustitucion respectiva de residuos de alanina en Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:6) o Ac-warar-NH2 (SEQ ID NO:25). ** Reduccion de PTH tras 0,5 mg/kg de administracion IV en ratas normales anestesiadas con isoflurano - PTH se midio 1, 2, 3 y 4 horas tras la administracion y se calculo el AUC acumulada, Los datos de PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula: AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*100.
Tabla 7
Actividad de los compuestos peptidicos ejemplares
SEQ ID NO.
Estructura del Compuesto* Actividad in vivo en ratas normales* 0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC de PTH de control de solucion salina**
Solucion Salina
Solucion Salina
100
SEQ ID NO:116
Ac-crr-Sar-rar-NH2 141
SEQ ID NO:117
Ac-carrr-Sar-r-NH2 111
SEQ ID NO:118
Ac-c-Nma-rrr-Nma-r-NH 2 105
SEQ ID NO:119
Ac-crrar-Nma-r-NH2 101
SEQ ID NO:120
Ac-c-Ai b-rrr-Ai b-r-NH2 94
SEQ ID NO:121
Ac-crr-Nma-rar-NH2 86
SEQ ID NO:122
Ac-carrr-Nma-r-NH2 74
SEQ ID NO:123
Ac-c-Aib-rrrar-NH2 70
SEQ ID NO:124
Ac-carrr-Aib-r-NH2 68
SEQ ID NO:125
Ac-c-Sar-rrr-Sar-r-NH2 65
SEQ ID NO:126
Ac-crrar-Sar-r-NH2 62
SEQ ID NO:127
Ac-c-Nma-rrrar-NH 2 56
SEQ ID NO:128
Ac-c-Sar-rrrar-NH2 50
SEQ ID NO:129
Ac-carrr-Nle-r-NH2 64
SEQ ID NO:130
Ac-c-d Nle-rrr-d Nle-r-NH 2 54
SEQ ID NO:131
Ac-carrr-dNva-r-NH 2 54
SEQ ID NO:132
Ac-c-dNva-rrr-dNva-r-NH 2 27
SEQ ID NO:133
Ac-crrar-dNle-r-NH2 26
SEQ ID NO:134
Ac-c-dNle-rrrar-NH2 10
SEQ ID NO:135
Ac-crrar-dNva-r-NH 2 8
SEQ ID NO:136
Ac-c-dNva-rrrar-NH 2 7
SEQ ID NO:137
Ac-crr-dNva-rar-NH2 3
SEQ ID NO:138
Ac-crr-dNle-rar-NH2 3
*La fuente en negrita indica una sustitucion respectiva de residuos de alanina en Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) o Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25). Sar = el aminoacido no natural Sarcosina, Nma = N-metil alanina; AiB = aminoacido isobutirico; dNva = D-Norvalina; dNle = D-Norleucina **Reduccion de PTH tras 0,5 mg/kg de administracion IV en ratas normales anestesiadas con isoflurano - PTH se midio 1, 2, 3 y 4 horas tras la administracion y se calculo el AUC acumulada. Los datos de PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula: AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*100.
_________________Tabla 8_________________
Actividad de los compuestos peptidicos ejemplares
SEQ ID NO.
Estructura del Compuesto* Actividad in vivo en ratas normales** 0,5 mg/kg de bolo IV % de AUC de PTH de control de solucion salina
Solucion Salina
Solucion Salina
100
SEO ID NO:97
Ac-c(C)arrrar-NH2 8
SEO ID NO:101
Ac-c(GS)rrrrrr-NH2 12
SEQ ID NO:139
Ac-c(dHcy)arrrar-NH2 32
SEQ ID NO:140
Ac-c(Mpa)arrrar-NH2 25
SEQ ID NO:141
Ac-c( Ac-C )arrrar-NH2 38
SEQ ID NO:142
Ac-c(c)arrrar-NH2 0
SEQ ID NO: 143***
Ac-c(C-PEG20)rrrrrr-NH2 25
SEQ ID NO:144****
Ac-c(C-PEG40)rrrrr-NH2 15
SEQ ID NO:145
CEEEEEE 1 Ac-crrrrrr-NH2 40
SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:26
prpcppp V L.L.L L.U.L i Ac-carrrar-NH2 42
SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:25
Ac-crrarar-NH2 | Ac-crrarar-NH2 2
SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:26
Ac-carrrar-NH2 1 Ac-carrrar-NH2 1
*La fuente en negrita mostrada entre parentesis indica los grupos de conjugacion que contienen tiol respectivos. GS = glutation oxidado; dHcy = D-homocistefna; Mpa = Acido mercaptopropionico; PEG = polietilenglicol. ** Reduccion de PTH tras 0,5 mg/kg de administracion IV en ratas normales anestesiadas con isoflurano - PTH se midio 1, 2, 3 y 4 horas tras la administracion y se calculo el AUC acumulada. Los datos de PTH se calcularon de acuerdo con la siguiente formula: AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina*100. ***El compuesto se dosifico a 10 mg/kg (~ molaridad equivalente a un peptido no PEGilado de 0,5 mg/kg) ***El compuesto se dosifico a 20 mg/kg (~ molaridad equivalente a un peptido no PEGilado de 0,5 mg/kg)
B. Respuesta a histamina y estudios de la relacion estructura-actividad
En la bibliograffa se han indicado compuestos policationicos para provocar la liberacion de la amina histamina 5 biogenica activa. Vease, Church y col., J. Immunol., 128(5): 2116-2121 (1982); Lagunoff y col., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23: 331-51 (1983). Se cree que la liberacion de histamina es el resultado de la activacion de mastocitos y basofilos que se produce de una forma dependiente de Gai. Vease, Aridor y col., J. Cell Biol., 111(3): 909-17 (1990). La reduccion o eliminacion de esta reaccion fisiologica es deseable, entre otros, para mejorar el margen terapeutico de los calcimimeticos de peptidos cationicos para el tratamiento de SHPT.
10
Se realizaron estudios para evaluar la liberacion de histamina inducida tras la administracion in vivo de los compuestos descritos en el presente documento. En un primer estudio, descrito en el Ejemplo 6, se utilizo una dosificacion mediante bolo IV o infusion en ratas Sprague Dawley normales para evaluar la liberacion de histamina asociada a diversos compuestos. Para evaluar el efecto de la carga neta positiva sobre la liberacion de histamina 15 asociada a un compuesto, se generaron y se ensayaron peptidos que contenfan de 4 a 7 residuos cationicos (arginina) para determinar su capacidad para provocar la liberacion de histamina in vivo, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Los peptidos ensayaos inclufan (i) Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4), (ii) Ac-crrrrr- NH2 (SEQ ID NO:5), (iii) Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) y (iv) Ac-crrrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:41).
Como se muestra en la figura 3, cuando un numero equivalente de moles de cada peptido se administro mediante bolo IV a ratas normales, la SEQ ID NO:41 (8 residuos de arginina) exhibio la mayor induccion de histamina. Otros compuestos con menos residuos Arg, incluyendo la SEQ ID NO:6 (6 residuos de arginina), la SEQ ID NO:5 (5 5 residuos de arginina), y la SEQ ID NO:4 (4 residuos de arginina), tambien produjeron un maximo en el nivel de histamina, aunque a un menor grado en comparacion con la SEQ ID NO:41, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:4, que generaron respuestas mas leves en su actividad de liberacion de histamina (~2-3 veces superior al valor inicial). La SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:4 fueron, sin embargo, menos potentes que la SEQ ID NO:6 con respecto a la disminucion de la PTH en plasma.
10
Debido a que la actividad de reduccion de PTH de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se acompano por la falta de una respuesta histamfnica, se realizaron evaluaciones adicionales en base a Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) para evaluar si fue posible o no disminuir adicionalmente la respuesta histamfnica sin sacrificar la actividad de reduccion de PTH. Como se mostrara en los datos a continuacion, la sustitucion de los residuos cationicos (arginina) en Ac-crrrrrr-NH2 15 (SEQ ID NO:6) con residuos no cationicos (alanina) se realizo para producir una serie de analogos con una carga neta reducida total y una densidad de carga reducida. De estos analogos, tanto CA-cararrr-NH2 (SEQ ID NO:15) como Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) se asociaron a la falta de una respuesta histamfnica cuando se administraron a ratas mediante bolo IV. De manera importante, estos dos peptidos conservaron sus propiedades calcimimeticas potentes y fueron capaces de reducir la secrecion de la PTH tanto en ratas normales como en ratas con disfuncion 20 renal.
El compuesto Ac-crrrrrr-NH2 identificado como la SEQ ID NO:6 (2,1 pmol/kg = 2,3 mg/kg) provoco una respuesta histamfnica observable de aproximadamente 2-3 veces sobre la del valor inicial en comparacion con 6-9 veces con la SEQ ID NO:41 cuando se dosifico mediante bolo IV (administrado en menos de 1 minuto) en ratas normales. La 25 liberacion de histamina provocada por Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) llego a un maximo a los 5 minutos despues de la dosificacion y regreso a los niveles iniciales 15 minutos despues (figura 3). Una reduccion adicional en el numero de subunidades cargadas para 5 y 4 residuos de arginina por peptido (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:4, respectivamente) redujo adicionalmente la respuesta histamfnica en comparacion con los peptidos de oligo-arginina mas largos; sin embargo, se observo un aumento de 2-3 veces en la histamina sobre el valor inicial 5 minutos 30 despues de la dosificacion en bolo IV (figura 3). Estos resultados sugieren una relacion entre la carga neta del peptido y la liberacion asociada de histamina. Tambien se aprecia que los peptidos ricos en arginina con menos de 7 argininas estan bastante limitados en su capacidad para entrar en las celulas, lo que sugiere que la penetracion celular no se requiere para provocar una liberacion de histamina.
35 La liberacion de histamina asociada a los compuestos de reduccion de la PTH Ac-crrrrn-NH2(SEQ ID NO:6) y Ac- c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se evaluo in vivo. El compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID nO:3) tiene la siguiente estructura:
C
!
Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO: 3)
40
Esta estructura conjugado se representa en el presente documento como Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO.273 donde el residuo L-Cys unido al residuo que contiene tiol en la subunidad X1 del compuesto (aquf, un residuo D-Cys) a traves de un enlace disulfuro Cys-Cys, se coloca entre parentesis en la formula. Esta notacion se utiliza a lo largo del documento para designar que el resto entre parentesis esta unido a un segundo grupo que contiene tiol. Con 45 respecto a Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) tiene dos residuos cationicos (arginina) sustituidos con residuos no cargados (alanina) en las posiciones subunitarias X2 y X6. Ademas, el residuo D-Cys en la posicion X1 esta conjugado a un residuo L-Cys.
Estos dos compuestos se administraron a ratas anestesiadas con isoflurano (Sprague Dawley) a 3 mg/kg mediante 50 bolo intravenoso (IV) (administrado en menos de 1 minuto). Se extrajo sangre antes de la dosificacion y 5, 15 y 30 minutos despues de la dosificacion. Se midio la concentracion de histamina, y el cambio de veces en la concentracion de histamina en sangre con relacion a la concentracion de histamina en sangre previa a la dosis se muestra en la figura. 4. El compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, barras de color blanco) indujo una respuesta histamfnica, observada en el punto de datos 5 minutos despues de la dosificacion donde se observo un aumento de 55 7 veces en el nivel de histamina. El compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3, con barras sombreadas) no indujo
una respuesta histamfnica evidente, como se observa por los puntos de datos a los 5, 10 y 15 minutos despues de la dosificacion donde el nivel de histamina no se aumento con relacion al nivel de histamina de pre-dosificacion (tiempo cero).
10
Induccion de histamina in vitro en mastocitos
peritoneales de rata de compuestos peptfdicos eiemplares
SEQ ID NO.
Secuencia del Compuesto *Cambio en veces de histamina in vitro de no tratado a 10 uM*
Solucion Salina
Solucion Salina
1,0
SEQ ID NO:6
Ac-crrrrrr-NH2 11,5
SEQ ID NO:8
Ac-carrrrr-NH2 6,6
SEQ ID NO:9
Ac-crarrrr-NH2 6,8
SEQ ID NO;10
Ac-crrarrr-NH2 5,3
SEQ ID NO:11
Ac-crrrarr-NH2 5,0
SEQ ID NO:12
Ac-crrrrar-NH2 5,0
SEQ ID NO:13
Ac-crrrrra-NH2 4,1
SEQ ID NO:15
Ac-cararrr-NH2 2,5
SEQ ID NO:22
Ac-caarrrr-NH2 1,2
SEQ ID NO:17
Ac-crraarr-NH2 1,3
SEQ ID NO:146
Ac-crrrraa-NH2 1,9
SEQ ID NO:26
Ac-carrrar-NH2 1,4
SEQ ID NO:3
Ac-c(C)arrrar-NH2 0,6
SEQ ID NO:16
Ac-carrarr-NH2 1,4
SEQ ID NO:19
Ac-carrrra-NH2 1,3
SEQ ID NO:23
Ac-crarrar-NH2 1,5
SEQ ID NO:18
Ac-crararr-NH2 1,4
SEQ ID NO:20
Ac-crarrra-NH2 1,1
SEQ ID NO:25
Ac-crrarar-NH2 1,2
SEQ ID NO:14
Ac-crrarra-NH2 1,6
SEQ ID NO:130
Ac-c-dNle-rrr-dNle-r-NH2 9,2
SEQ ID NO:132
Ac-c-d Nva-rrr-d Nva-r-NH2 4,1
SEQ ID NO:28
Ac-c(C)rrarar-NH2 0,7
SEQ ID NO:24
Ac-craarrr-NH2 1,0
SEQ ID NO:21
Ac-crrraar-NH2 1,0
SEQ ID NO:134
Ac-c-dNle-rrrar-NH2 2,2
SEQ ID NO:129
Ac-carrr-dNle-r-NH2 2,6
SEQ ID NO:136
Ac-c-d Nva-rrrar-NH2 2,1
SEQ ID NO:131
Ac-carrr-d Nva-r-NH 2 1,8
SEQ ID NO:133
Ac-crrar-dNle-r-NH2 4,3
SEQ ID NO:135
Ac-crrar-dNva-r-NH2 1,1
SEQ ID NO:95
Ac-cGrrrar-NH2 1,5
SEQ ID NO:99
Ac-cqrrrar-NH2 1,9
Para evaluar adicionalmente la relacion entre la estructura del compuesto y la liberacion de histamina, se preparo una serie de compuestos y se evaluo para su capacidad para provocar la induccion de histamina en un ensayo in vitro utilizando mastocitos peritoneales de rata. En este ensayo, los compuestos se incuban en 10 pM durante 15 minutos a 37 °C con celulas aisladas del lavado peritoneal de ratas SD. Despues de la incubacion, el medio celular se recoge y se determina el nivel de histamina. Los datos se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
imagen2
Ac-crrarar-NH2
SEQ ID NO:25
| Ac-carrrar-NH2 9,3
SEQ ID NO:149
Ac-crrarGr-NH2 1,6
SEQ ID NO:150
Ac-crrarqr-NH2 1,6
SEQ ID NO:151
Ac-crrarhr-NH2 2,5
SEQ ID NO:152
Ac-crrarir-NH2 4,1
SEQ ID NO:153
Ac-ca(DAP)rrar-NH2 1,6
SEQ ID
Ac-ca(dHar)(dHar)(dHar)ar- 2,7
NO:154
NH2
*Metodo expuesto en el Ejemplo 7 Abreviaturas: Vease el Ejemplo 7
Para evaluar adicionalmente la relacion entre la estructura del compuesto y la liberacion de histamina, se preparo una serie de compuestos evaluados para determinar su capacidad para provocar la induccion de histamina en ensayos in vivo. Los datos se muestran en la Tabla 10.
5
Tabla 10
Induccion de histamina in vivo de compuestos peptfdicos eiemplares
SEQ ID NO.
Estructura del Compuesto * Respuesta histamfnica in vivo Cambio en veces a partir de niveles previos a la dosis 5' despues de la inyeccion de 2 mg/kg de bolo IV
Solucion Salina
Solucion Salina 1,0
SEQ ID NO:6
Ac-crrrrrr-NH2 2,7
SEQ ID NO:26
Ac-carrrar-NH2 1,0
SEQ ID NO:25
Ac-crrarar-NH2 0,9
SEQ ID NO:15
Ac-cararrr-NH2 1,0
SEQ ID NO:18
Ac-crararr-NH2 1,1
SEQ ID NO:20
Ac-crarrra-NH2 1,0
SEQ ID NO:19
Ac-carrrra-NH2 0,9
SEQ ID NO:23
Ac-crarrar-NH2 0,8
SEQ ID NO:18
Ac-crararr-NH2 1,0
SEQ ID NO:27
Ac-c(C)arrrar-NH2 0,9
SEQ ID NO:28
Ac-c(C)rrarar-NH2 0,9
*Metodo expuesto en el Ejemplo 7.
Por consiguiente, y como se puede apreciar en vista de los datos de la PTH y los datos de histamina descritos anteriormente en el presente documento, en una realizacion, se contempla un compuesto que tiene actividad para
disminuir el nivel de la PTH en un sujeto en ausencia de una respuesta histamfnica. En ciertas realizaciones, la ausencia de una respuesta histamfnica significa una dosis del compuesto que produce un aumento en histamina menor a 10 veces, mas preferiblemente 8 veces, aun mas preferiblemente 5 veces, e incluso mas preferiblemente 3 veces, medido in vitro en un ensayo como se describe en el presente documento, donde el cambio de veces se 5 determina en base a los niveles de histamina antes de la incubacion con el compuesto y despues de 15 minutos de la incubacion con el compuesto. En una realizacion especifica, la respuesta histamfnica se determina en un ensayo in vitro utilizando mastocitos peritoneales de rata aislados del lavado peritoneal de ratas Sprague Dawley normales, y donde el cambio de veces se determina en base a los niveles de histamina antes de la incubacion con el compuesto y despues de 15 minutos de la incubacion con el compuesto. En los estudios realizados en el presente 10 documento, se realizo la evaluacion in vitro de la liberacion de histamina utilizando mastocitos peritoneales aislados de rata, aislados mediante lavado peritoneal utilizando HBSS frfo + HEPES 25 mM pH 7,4 que contenfa heparina (5 u/ml). Las celulas se lavaron dos veces en tampon de estimulacion (HBSS + HEPES 25 mM, pH 7,4) y se incubaron con 10 pM del compuesto en tampon de estimulacion (HBSS + HEPES 25 mM, pH 7,4) durante 15 minutos en una placa de 96 pocillos (106/pocillo) a 37 °C. El sobrenadante celular se analizo para determinar la histamina utilizando 15 el kit de histamina de EIA (Cayman # 589651).
En otra realizacion, se contempla un compuesto que tiene una actividad para disminuir el nivel de la PTH en un sujeto en ausencia de una respuesta histamfnica clfnica. Como se usa en el presente documento, la ausencia de una "respuesta histamfnica clfnica" significa que una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto segun se 20 describe en el presente documento se administra al sujeto sin producir un aumento clfnicamente adverso en la histamina en plasma o sangre segun se mide 5-10 minutos despues de terminar la dosificacion o durante el curso del tratamiento. Por ejemplo, cuando un compuesto requerido para producir un efecto terapeutico deseado se administra a un sujeto mediante bolo (como se usa en el presente documento, "bolo" significa administrado durante un minuto o menos) produjo un aumento en la histamina en plasma o sangre 5-10 minutos despues de terminar la 25 dosificacion que es menor de 15 veces, 10 veces, 9 veces, 8 veces, 7 veces, 6 veces, 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces por encima de los niveles de la pre-dosis.
Como se puede apreciar a partir de los estudios descritos anteriormente, en una realizacion de la divulgacion, el compuesto comprende una secuencia de 3 a 35 residuos de aminoacidos, donde esta presente en la secuencia una 30 pluralidad de subunidades de residuos de aminoacidos cargados positivamente. En algunas realizaciones de la divulgacion, los compuestos descritos comprenden de 5 a 25 subunidades, y en una realizacion preferida, cada subunidad es un residuo de aminoacido. En otras realizaciones de la divulgacion, los compuestos descritos comprenden de 6 a 12 subunidades. Todavfa en otras realizaciones de la divulgacion, los compuestos descritos comprenden de 3 a 9 subunidades de aminoacidos. En realizaciones alternativas de la divulgacion, los compuestos 35 descritos comprenden 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 subunidades.
Las subunidades de los compuestos descritos, en una realizacion, se seleccionan independientemente de aminoacidos naturales o no naturales, o sus analogos, y pueden tener cualquier configuracion L- o D- (excepto para 40 glicina que es aquiral). Glicina, los residuos alifaticos alanina, valina, leucina, o isoleucina, prolina, los residuos hidroxilo, serina y treonina, los residuos acidos acido aspartico y acido glutamico, los residuos amida, asparagina, y glutamina, los residuos basicos lisina y arginina, histidina, los residuos aromaticos fenilalanina, tirosina y triptofano, y los residuos que contienen azufre, metionina y cistefna, se contemplan todos para su uso en los compuestos descritos. El numero de subunidades cargadas positivamente, y su densidad pueden afectar la potencia del 45 compuesto para reducir la PTH. En algunas realizaciones, las subunidades cargadas positivamente se separan mediante una o mas de otras subunidades ("subunidades de separacion"). En una realizacion, las subunidades de separacion son residuos de alanina. En algunas realizaciones, la quiralidad de la subunidad de separacion afecta la potencia del compuesto.
50 Los residuos de aminoacidos cargados positivamente de los compuestos descritos pueden ser un residuo natural o no natural especffico, o un analogo del mismo, que tenga cualquiera de la configuracion L- o D- (por ejemplo, L- arginina) que se repite en la secuencia, o puede ser una diversidad de residuos naturales o no naturales, o analogos de los mismos, que tengan cualquier configuracion L- o D-. En algunas realizaciones, el compuesto es un peptido que consta de 3 a 20 residuos de aminoacidos cargados positivamente, 6 a 12 residuos de aminoacidos cargados 55 positivamente, 3 a 9 residuos de aminoacidos cargados positivamente. En algunas realizaciones, los peptidos comprenden 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos de aminoacidos cargados positivamente.
En algunas realizaciones, los residuos de aminoacidos cargados positivamente se seleccionan independientemente
de aminoacidos naturales. En algunas realizaciones, los residuos de aminoacidos cargados positivamente se seleccionan independientemente de aminoacidos naturales y/o no naturales. En algunas realizaciones, los residuos de aminoacidos cargados positivamente se seleccionan independientemente del grupo que consiste en arginina, lisina, histidina, acido 2,3-diaminopropionico (Dap), acido 2,4-diaminobutfrico (Dab), ornitina y homoarginina. En una 5 realizacion preferida, los residuos de aminoacidos cargados positivamente son residuos de arginina.
En algunas realizaciones, el compuesto es un peptido y es una cadena o ramificacion de un peptido contiguo individual. En otras realizaciones, el compuesto es un peptido que esta ramificado. Aun en otras realizaciones, el peptido se conjuga con uno o mas restos que contienen tiol (cada uno, un "grupo de conjugacion que contiene tiol" o 10 un "grupo de conjugacion"). En una realizacion preferida, y como se ilustra simplemente, el compuesto peptfdico se conjuga con un grupo de conjugacion Cys, a traves de un enlace disulfuro (-S-S-), (por ejemplo, -Cys-Cys-). Como se usa en el presente documento, el termino "compuesto" pretende incluir tanto estos peptidos como estos conjugados.
15 Los compuestos comprenden tfpicamente uno o mas estos de tiol, preferiblemente uno o mas restos de tiol reactivo. Las subunidades que tienen un grupo tiol incluyen compuestos que no son de aminoacido que tienen un grupo tiol y los aminoacidos con un grupo tiol. El grupo tiol de la subunidad que contiene tiol puede estar en una forma conjugada (por ejemplo, a traves de un enlace disulfuro con un grupo de conjugacion) o en una forma sin conjugar (es decir, como un tiol reducido). En una realizacion preferida, cuando el grupo tiol esta en una forma no conjugada o 20 una forma conjugada, es capaz de formar un enlace disulfuro con un grupo que contiene tiol. El residuo que contiene tiol se puede ubicar en cualquier posicion a lo largo de la cadena peptfdica, incluyendo el extremo amino, el extremo carboxi, o alguna otra posicion. En una realizacion preferida, el residuo que contiene tiol o la subunidad se pueden ubicar en el extremo amino. En otras realizaciones, el residuo tiol o la subunidad se pueden ubicar en el extremo carboxi o dentro de la secuencia peptfdica.
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Algunos ejemplos representativos de residuos que contienen tiol incluyen, sin limitacion, cistefna, acido mercaptopropionico, homo-cistefna, y penicilamina. Cuando el residuo que contiene tiol contiene un centro quiral, puede estar presente en la configuracion L- o D-. En una realizacion preferida, el residuo que contiene tiol es cistefna.
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En algunas realizaciones, la reticulacion entre la subunidad que contiene tiol en la posicion Xi en el compuesto y el grupo de conjugacion que contiene tiol se pueden escindir y/o intercambiar con otros grupos de conjugacion que contienen tiol tales como cistefna (por ejemplo, mediante reduccion del enlace disulfuro) in vivo para producir una forma biologicamente activa del compuesto. De esta forma, el conjugado puede funcionar como una pro-farmaco del 35 compuesto. Un grupo de conjugacion tambien se puede utilizar para modificar las propiedades fisicoqufmicas, farmacocineticas y/o farmacodinamicas de los compuestos descritos (por ejemplo, la conjugacion a traves de un enlace disulfuro a un resto PEGilado grande para mejorar la farmacocinetica).
En algunas realizaciones, el compuesto es un peptido que consta de la secuencia aminoacfdica (Xaai)-(Xaa2)-(Xaa3)- 40 (Xaa4)-(Xaa5)-(Xaa6)-(Xaa7)-(SEQ ID NO:155), donde (Xaai) es un residuo aminoacfdico que contiene tiol, (Xaa2) es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa5) es un residuo aminoacfdico cationico, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede modificarse en el extremo N, el extremo C, o ambos. En una realizacion preferida, el peptido esta modificado tanto en el extremo N como el extremo C por acetilacion y amidacion, 45 respectivamente.
En algunas realizaciones, un peptido comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(Xaa2-(Xaa3-(Xaa4)-(Xaa5)-(Xaa6)- (Xaa7) (SEQ ID NO: 156), donde (Xaa2) es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa5) se selecciona del grupo que consiste en D-Arg, L-Arg. 50 D-Lys y L-Lys, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal.
En algunas realizaciones, un peptido comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa5)- 55 (Xaa6)-(Xaa7) (SEQ ID NO:157), donde (Xaa2), (Xaa3) y (Xaa4) son, independientemente, cualquier residuo aminoacfdico (pero en una realizacion preferida se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en D- Ala, D-Val, D-Leu, D-NorVal y D-NorLeu), (Xaa5) y (Xaa7) son, independientemente, cualquier residuo aminoacfdico cationico (pero en una realizacion preferida se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en D-Arg, L-Arg, D-Lys y L-Lys), (Xaa6) es un residuo aminoacfdico no cationico (en una realizacion preferida, seleccionado del
grupo que consiste en D-Ala, D-Val, D-Leu, D-NorVal y D-NorLeu). El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal.
5 En algunas realizaciones, un peptido comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa5)- (Xaa6)-(Xaa7) (SEQ ID NO:158), donde (Xaa2) es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa5) se selecciona del grupo que consiste en D-Arg, L-Arg, D-Lys y L-Lys, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto 10 una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal.
En algunas realizaciones, un peptido comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(D-Ala)-(Xaa3)-(Xaa4)-(D-Arg)- (D-Ala)-(Xaa7) (SEQ ID NO:l59), donde (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico cationico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico cationico. El peptido puede tener una 15 proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal.
En algunas realizaciones, un peptido comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(Xaa2)-(Xaa3)-(D-Ala)-(D-Arg)- (D-Ala)-(Xaa7) (SEQ ID NO:160), donde (Xaa2), (Xaa3) y (Xaa7) son, independientemente, cualquier residuo 20 aminoacfdico cationico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal.
Otra realizacion es un peptido calcimimetico, que comprende una secuencia de aminoacidos unida a los enlaces peptfdicos, donde la secuencia comprende de 5 a 10 residuos de aminoacido, y donde la secuencia comprende un 25 extremo amino, un extremo carboxi, al menos un residuo que contiene tiol y de 3 a 9 residuos cargados positivamente. En una realizacion, al menos un residuo que contiene tiol es un residuo de cistefna. En otro aspecto, el residuo de cistefna se coloca en el extremo amino del peptido, en cierta realizacion, el residuo de cistefna es un residuo L-Cys, un residuo D-Cys, o un residuo L- o D-homoCys. En otras realizaciones, los residuos de aminoacido del peptido son D-aminoacidos o L-aminoacidos.
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Tambien se abarcan dentro del alcance de los compuestos reivindicados las moleculas peptidomimeticas que comprenden aproximadamente siete subunidades, donde al menos una subunidad contiene un resto tiol, de preferencia un resto tiol reactivo, y otras subunidades son una pluralidad de subunidades no cationicas, y de 1 a 4 subunidades cargadas positivamente. Estas moleculas peptidomimeticas pueden comprender enlaces no peptfdicos 35 entre dos o mas de las subunidades. Las diversas caracterfsticas de los compuestos analizados anteriormente se aplican en general a la molecula peptidomimetica. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, las subunidades utilizadas para construir las moleculas pueden ser aminoacidos de origen natural, o residuos con cadenas laterales no naturales, los extremos de los modulos pueden estar protegidos o sin proteger de la forma analizada anteriormente. De manera similar, los residuos de aminoacidos de la molecula pueden ser los residuos de 40 L- o D-aminoacidos. Tambien como se ha analizado anteriormente, los residuos que contienen tiol pueden estar en una forma reducida u oxidada con cualquiera de los restos que contienen tiol analizados anteriormente.
Se han desarrollado muchas estructuras peptidomimeticas y los metodos para su sfntesis (Babine, R. E.; Bender, S. L., Chem. Rev., 97:1359, 1997; Hanessian, S.; y col., Tetrahedron, 53:12789, 1997; Fletcher, M. D.; Cambell, M. C., 45 Chem. Rev., 98:763, 1998); Peptidomimetics Protocols; Kazmierski W.M., Ed.; Methods in Molecular Medicine Series, Vol. 23; Humana Press, Inc.; Totowa, N.J. (1999).
Conjugados
50 En algunas realizaciones, el compuesto se reticula qufmicamente a un grupo de conjugacion que contiene tiol a traves de un enlace disulfuro entre el tiol del compuesto y un tiol del grupo de conjugacion. El grupo de conjugacion que contiene tiol puede ser una molecula pequena, tal como cistefna, o una macromolecula, tal como un polipeptido que contiene un residuo de cistefna. Los ejemplos de grupos de conjugacion que contienen tiol adecuados incluyen tiol modificado con cistefna, glutation, tioalquilo, restos tales como tiobencilo, acido mercaptopropionico, cistefna N- 55 acetilada, cisteamida, N-acetilcisteamida, homocistefna, penicilamina y poli(etilenglicol) (PEG) (denominados como "PEGilado") tales como cistefna PEGilada o una duplicacion del compuesto (es decir, para formar un homodfmero unido mediante un enlace disulfuro). En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol es cistefna. Otros homologos de cistefna tambien se contemplan para su uso como grupos de conjugacion que contienen tiol, ya sea solos o que consten de un grupo de conjugacion mayor. De forma similar, los estereoisomeros
de cistefna, homocistefna, y cisteamida son adecuados para su uso como restos que contienen tiol. Los grupos de conjugacion se pueden utilizar para mejorar la estabilidad qufmica y, por lo tanto, la semivida de un producto farmaceutico. En ciertas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol y el peptido son iguales (es decir, el conjugado es un dfmero), que mostro inesperadamente muy buena estabilidad qufmica en comparacion con el grupo 5 de conjugacion heterologo tal como cistefna. Sin desear quedar ligado a la teorfa, presumiblemente, cuando el grupo de conjugacion que contiene tiol y el peptido son iguales, entonces cualquier desproporcion (por ejemplo, la mezcla del grupo de conjugacion) reconstituira el compuesto dimerico original. Por el contrario, la desproporcion de un compuesto con un grupo de conjugacion heterologo tal como cistefna puede conducir a la formacion de homo- dfmeros del peptido mas cistefna (cistefna - homodfmero de cistefna), mas el compuesto precursor residual. Un 10 homodfmero del peptido (es decir, el grupo de conjugacion y el peptido son iguales) se convertira en una forma conjugada de cistefna del peptido in vivo debido a la alta concentracion de la cistefna reducida en la circulacion sistemica.
En algunas realizaciones, las ensenanzas incluyen un conjugado de disulfuro de un grupo de conjugacion que 15 contiene tiol y un peptido que comprende la secuencia aminoacfdica (Xaai)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa5)-(Xaa6)-(Xaa7) (SEQ ID NO:155), donde (Xaai) es un residuo aminoacfdico con un resto que contiene tiol, (Xaa2) es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa5) es un residuo aminoacfdico cationico, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, 20 el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal. En una realizacion preferida, el
grupo de conjugacion que contiene tiol se selecciona del grupo que consiste en D-Cys, L-Cys, un peptido que
contiene D-Cys, y un peptido que contiene L-Cys. Cuando el grupo de conjugacion que contiene tiol es un aminoacido o un peptido, puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol tiene tanto una proteccion N-terminal como una 25 proteccion C-terminal. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol es un peptido que
comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:155. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que
contiene tiol y el peptido son iguales (es decir, el conjugado es un dfmero).
En algunas realizaciones, las ensenanzas incluyen un conjugado de un grupo de conjugacion que contiene tiol y un 30 peptido que comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa5)-(Xaa6)-(Xaa7) (SEQ ID nO:156), donde (Xaa2 es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaas) se selecciona del grupo que consiste en D-Arg, L-Arg, D-Lys y L-Lys, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N- terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N- 35 terminal como una proteccion C-terminal. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol se selecciona del grupo que consiste en D-Cys, L-Cys, un peptido que contiene D-Cys, y un peptido que contiene L- Cys. Cuando el grupo de conjugacion que contiene tiol es un aminoacido o un peptido, puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal. En algunas realizaciones, el grupo de 40 conjugacion que contiene tiol es un peptido que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:156. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol y el peptido son iguales (es decir, el conjugado es un dfmero).
En algunas realizaciones, las ensenanzas incluyen un conjugado de un grupo de conjugacion que contiene tiol y un 45 peptido que comprende la secuencia aminoacfdica (L-Cys)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa5)-(Xaa6)-(Xaa7) (SEQ ID NO:183), donde (Xaa2) es un residuo aminoacfdico no cationico, (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaas) se selecciona del grupo que consiste en D-Arg, L-Arg, D-Lys y L-Lys, (Xaa6) es un residuo no cationico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal 50 como una proteccion C-terminal. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol se selecciona del grupo que consiste en D-Cys, L-Cys, un peptido que contiene D-Cys, y un peptido que contiene L- Cys. Cuando el grupo de conjugacion que contiene tiol es un aminoacido o un peptido, puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal. En algunas realizaciones, el grupo de 55 conjugacion que contiene tiol es un peptido que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:183. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol y el peptido son iguales (es decir, el conjugado es un dfmero).
En algunas realizaciones, las ensenanzas incluyen un conjugado de un grupo de conjugacion que contiene tiol y un
peptido que comprende la secuencia aminoacfdica (D-Cys)-(D-Ala)-(Xaa3)-(Xaa4)-(D-Arg)-(D-Ala)-(Xaa7) (SEQ ID NO:161), donde (Xaa3) es cualquier residuo aminoacfdico, (Xaa4) es cualquier residuo aminoacfdico, y (Xaa7) es cualquier residuo aminoacfdico. El peptido puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el peptido tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C- 5 terminal. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol se selecciona del grupo que consiste en D-Cys, L-Cys, un peptido que contiene D-Cys, y un peptido que contiene L-Cys. Cuando el grupo de conjugacion que contiene tiol es un aminoacido o un peptido, puede tener una proteccion N-terminal, una proteccion C-terminal, o ambas. En una realizacion preferida, el grupo de conjugacion que contiene tiol tiene tanto una proteccion N-terminal como una proteccion C-terminal. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol es un peptido 10 que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:161. En algunas realizaciones, el grupo de conjugacion que contiene tiol y el peptido son iguales (es decir, el conjugado es un dfmero).
III. Metodos de uso
15 En un aspecto, se contempla un metodo de uso para prevenir, tratar o mejorar el hiperparatiroidismo, enfermedad osea y/u otros trastornos hipercalcemicos mediante la administracion de los compuestos descritos en el presente documento. Como se ha ilustrado anteriormente, los compuestos tienen actividad para disminuir los niveles de la PTH y/o calcio en un tejido o tejidos diana, o en un sujeto. En ciertas realizaciones, los compuestos descritos son capaces de disminuir los niveles de la PTH y/o calcio cuando se administra una cantidad terapeuticamente eficaz del 20 compuesto a un sujeto que necesita tal tratamiento. El metodo de uso se describira ahora haciendo referencia a los Ejemplos 3 y 8-11.
Con referencia de nuevo al Ejemplo 3, y como se ha analizado anteriormente con respecto a la Tabla 1, se administro la serie de compuestos donde un residuo cationico (arginina) se reemplazo secuencialmente con un 25 residuo no cationico (alanina) a las ratas. La figura 5 muestra el perfil temporal de cada capacidad del compuesto para reducir la PTH en sangre y la duracion de accion de los compuestos variables. En la figura 5, los compuestos Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, rombos), Ac-carrrrr-NH2 (SEQ ID nO:8, cuadrados) y Ac-crrarrr-NH2 (SEQ ID NO:10, sfmbolos x) y Ac-crrrrar-NH2 (SEQ ID NO:12, cfrculos) son potentes in vivo, como resulta evidente por la disminucion en la PTH porcentual del valor inicial pre-dosis a esencialmente cero, y proporcionaron una duracion de potencia, 30 donde la concentracion en sangre de la PTH permanecio disminuida durante al menos cuatro horas. Los compuestos Ac-crarrrr-NH2 (SEQ ID NO:9, triangulos), Ac-crrrarr-NH2 (SEQ ID NO:11, sfmbolos *) y Ac-crrrrra-NH2 (SEQ ID NO:13, sfmbolos +) disminuyeron la PTH porcentual del valor inicial durante aproximadamente 2-3 horas, y posteriormente, la concentracion en sangre de la PTH comenzo a aumentar. La sustitucion del residuo cationico (arginina) en las posiciones subunitarias 5 o 7 de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) afecto a la duracion de la actividad 35 de reduccion de la PTH.
Tambien se evaluo el perfil de reduccion de la PTH para una serie de compuestos que contienen dobles sustituciones de aminoacidos. Los compuestos seleccionados expuestos en la Tabla 2, anteriormente, se administraron a ratas normales mediante bolo IV a una dosis de 0,5 mg/kg y se evaluo la reduccion en la PTH con 40 relacion al nivel en sangre de la PTH de la pre-dosis. Los datos se muestran en las figuras 6A, 6B, donde el compuesto se identifica como se indica a continuacion: Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26, rombos de color blanco), Ac- crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25, cuadrados de color blanco), Ac-caarrrr-NH2 (SEQ ID NO:22, triangulos), Ac-crraarr-NH2 (SEQ ID NO:17, cfrculos), Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3, rombos figura 6B), Ac-c(C)rrarar-NH2 (SEQ ID NO:28, sfmbolos x, figura 6B).
45
Se realizo otro estudio para evaluar adicionalmente la potencia del compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3). El compuesto se administro por via intravenosa a ratas normales, como se detalla en el Ejemplo 2, a dosis de 1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,3 mg/kg, y 0,1 mg/kg. Los niveles de la PTH en plasma se evaluaron antes de la dosificacion y durante 4 horas despues de esto. La figura 7 muestra los resultados, donde la concentracion en sangre de la PTH se 50 muestra como porcentaje del valor de pre-dosis de valor inicial. Se observo una reduccion de la PTH relacionada con la dosis despues de una unica administracion en bolo IV con la mayor dosis de 1 mg/kg (rombos) que tuvo la mayor reduccion en la PTH, seguida de 0,5 mg/kg (cuadrados), 0,3 mg/kg (triangulos), y 0,1 mg/kg (sfmbolos x). El control con solucion salina se muestra por los sfmbolos de cfrculos. Como se observa, el peptido cuando se administra a una dosis terapeuticamente eficaz alcanza una reduccion en la PTH de mas del 50 % con relacion a la concentracion 55 de la PTH antes de la dosificacion ("valor inicial"). Especfficamente, el peptido al administrarse a dosis mayores de 0,1 mg/kg redujo la concentracion de la PTH a menos del 90 % de la concentracion de la PTH a valor inicial 1 hora despues de la administracion IV. Estas dosis del peptido identificado como la SEQ ID NO:3 tambien consiguieron un area bajo la curva (AUC) de menos del 50 %, el AUC calculada como la suma de los valores de concentracion de la PTH en los puntos de tiempo 1, 2, 3 y 4 horas, normalizado por el AUC para el control con solucion salina en los
mismos puntos de tiempo, multiplicado por 100.
Tambien se ensayo el mismo compuesto en sujetos (ratas) con insuficiencia renal. En este estudio, el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda se utilizo para evaluar el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) con el fin de 5 caracterizar su actividad de reduccion de la PTH en un entorno de disfuncion renal. El modelo se describe en el Ejemplo 1A. El compuesto se administro por via intravenosa como un bolo a animales comprometidos renalmente (ratas) a dosis de 3 mg/kg (n = 2), 1 mg/kg (n = 5), 0,5 mg/kg (n = 6) y 0,3 mg/kg (n = 5). Un grupo control de animales se dosifico con solucion salina. Los niveles de la PTH en plasma se evaluaron antes de la dosificacion y varias horas despues de esto. La figura 8 muestra los resultados, donde los animales tratados con solucion salina 10 (cuadrados) tuvieron una concentracion aumentada de la PTH con relacion al nivel de la PTH de partida. A diversas dosis de la SEQ ID NO:3, se observo un efecto dependiente de la dosis sobre la duracion y grado de reduccion de la PTH. Los animales tratados con la menor dosis de 0,3 mg/kg (sfmbolos x) que exhibieron una PTH reducida en el primer punto de tiempo y un aumento en la PTH entre las horas 1-24 despues de la dosificacion. Los niveles de dosis de 3 mg/kg (rombos), 1 mg/kg (triangulos) y 0,5 mg/kg (cuadrados) proporcionaron una concentracion reducida 15 en sangre de la PTH durante mas de 15 horas, y para la dosis mayor, durante mas de 24 horas.
En otro estudio para evaluar el efecto de las subunidades cationicas de sustitucion con subunidades no cargadas, como se ilustra mediante los residuos de aminoacidos de alanina, en el contexto de un sujeto con insuficiencia renal, se genero y se ensayo un analogo de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) para determinar su capacidad para disminuir la 20 PTH en animales modelo 1K1C despues de una administracion intravenosa individual de 1 mg/kg. En el analogo ensayado Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26), las subunidades cationicas en las posiciones X2 y X6 de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se sustituyeron con aminoacidos no cargados.
Como se muestra en la figura 9, Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26, cuadrados de color blanco) muestra una actividad 25 que es equivalente a Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6, rombos de color blanco) en la dosis ensayada (1 mg/kg) con una duracion de accion extendida similar durante 24 horas. Se descubrio que el analogo de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) con las sustituciones subunitarias no cargadas conservaba la actividad y puede, de hecho, tenia una potencia in vivo y duracion de accion superior a la del compuesto identificado como la SEQ ID NO:6. En el compuesto, Ac- carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26), los residuos D-Arg en las posiciones X2 y X6 se sustituyeron con residuos D-ala con 30 relacion al compuesto identificado como la SEQ ID NO:6.
De manera significativa, como se ha analizado anteriormente, la administracion del compuesto Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26) no se acompano de la liberacion de histamina, un efecto secundario no deseado que se observa con Ac- crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) y otros compuestos similares al administrarse a dosis mayores (> 1 mg/kg) mediante bolo 35 IV. La atenuacion marcada de la liberacion de histamina con el compuesto identificado como la SEQ ID NO:26 aumenta el margen terapeutico entre la actividad para deseada para disminucion de la PTH y la actividad no deseada para inducir histamina despues de la administracion mediante bolo IV.Por consiguiente, en una realizacion preferida, se proporcionan compuestos que tienen actividad para reducir la concentracion de la PTH in vivo en ausencia de una respuesta histaminica. Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona un compuesto que 40 tiene actividad para disminuir la PTH donde el compuesto, al administrarse f a un sujeto, humano o de otra manera, disminuye el nivel de la PTH a menos del 50 % del nivel de pre-dosis en un termino de una hora despues de la dosificacion. En una realizacion especifica, un compuesto que tiene una actividad significativa para disminuir la PTH se refiere a un compuesto que cuando se administra a una rata normal disminuye el nivel de la PTH a menos del 50 % del nivel de pre-dosis en un termino de una hora despues de la dosificacion mediante bolo IV.
45
En otro estudio, detallado en el Ejemplo 8, se proporcionan compuestos en la forma de un conjugado, donde la subunidad que contiene tiol en la posicion X1 se unio a traves de un enlace disulfuro a un residuo de L-Cys. Estos compuestos tienen las siguientes estructuras:
C
i
Ac-carrrar-NHz (SEQ ID NO: 3)
Ac-C
I
Ac-carrrar~NH2 (SEQ ID NO:141)
En la notacion utilizada en el presente documento, el compuesto que se une al resto que contiene tiol en la
subunidad X1 se identifica entre parentesis, donde en estos conjugados ilustrativos el compuesto L-Cys que se indica (C) se enlaza al resto que contiene tiol en la subunidad X1: Ac-c(C)arrrar-NH2(SEQ ID NO:3) y Ac-c(Ac- C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:141). Estos compuestos se administraron a traves de un bolo IV a animales con insuficiencia renal aguda (modelo 1K1C) a dosis de 0,3 y 0,5 mg/kg, y los resultados se muestran en la figura 10. El 5 compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se representa mediante cuadrados (0,3 mg/kg, n = 5) y sfmbolos * (0,5 mg/kg, n = 6) y el compuesto Ac-c(Ac-C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:141) mediante triangulos (0,3 mg/kg, n = 8) y rombos (0,5 mg/kg, n = 7). Esta respuesta a la dosis in vivo con la SEQ ID NO:3 muestra una reduccion dependiente de la dosis en la PTH muy similar a Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6).
10 En algunos de los estudios in vivo descritos en el presente documento, los compuestos, incluyendo los compuestos en la forma conjugada donde el tiol en la subunidad X1 se reticula a traves de un enlace disulfuro en otra subunidad, se administraron como una infusion IV de 30 minutos. Sin embargo, se debe apreciar que infusiones mas cortas (por ejemplo, <5 minutos) o la administracion mediante bolo IV tfpicamente producen una reduccion farmacodinamica comparable de la PTH como una infusion de 30 minutos mas larga. La administracion en bolo subcutaneo tambien 15 demostro ser una ruta de administracion eficaz que genero una cafda inicial mas pequena en la PTH, pero mostro una reduccion sostenida en la PTH similar al perfil observado por la via IV. Como se muestra en la figura 11, el compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), tambien se administro por administracion transdermica facilitada por microporos (por ejemplo, microporacion del estrato corneo), y demostro una reduccion de la PTH en plasma durante las varias horas que se superviso. El compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), tambien se administro mediante la 20 via transdermica despues de la microporacion, dando como resultado una reduccion de la PTH en plasma durante varias horas. La administracion transdermica de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) proporciona una opcion de adicion para la administracion clfnica de los compuestos descritos.
Para evaluar el efecto de la via de administracion sobre la actividad de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) en el contexto 25 de un sujeto con insuficiencia renal, se administro a las ratas en el modelo 1K1C 1 mg/kg del peptido como una bolo subcutaneo (SC), o una infusion IV de 30 minutos. Ambas rutas de administracion redujeron eficazmente los niveles de la PTH en plasma durante mas de 24 horas. Cuando se administro Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) por infusion IV, los niveles de la PTH cayeron rapidamente en un 80-90 % del valor inicial. A las 16 horas despues de la dosificacion, los niveles de la PTH habfan comenzado a aumentar aunque todavfa se redujeron en un ~80 % del valor inicial. 30 Cuando Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se administro mediante bolo SC, los niveles de la PTH exhibieron una cafda inicial mas moderada a -40 % del valor inicial, aunque exhibieron una duracion similar de reduccion como cuando se suministro el peptido mediante la via IV. Veinticuatro horas despues de la dosificacion, los niveles de la PTH en los animales dosificados por cualquier ruta habfan rebotado parcialmente, aunque ambos exhibieron niveles reducidos de la PTH que fueron ~40-60 % a partir del valor inicial. Los resultados mostraron que esta ruta de administracion 35 proporciona un perfil similar con respecto a la eficacia y duracion de la reduccion de la PTH como la administracion IV, proporcionando asf una trayectoria alternativa para la dosificacion clfnica (datos no mostrados).
Por consiguiente, en una realizacion preferida, un sujeto que tiene hiperparatiroidismo secundario (SHPT) se trata utilizando los compuestos descritos para reducir los niveles de la PTH en plasma y/o calcio. Los pacientes con SHPT 40 sin tratar con hiperparatiroidismo moderadamente severo con frecuencia tienen niveles de la PTH intactos en circulacion de valor inicial > 300 pg/ml, y niveles que pueden exceder los 600 pg/ml. En una realizacion preferida, la disminucion en los niveles de la PTH se mide como una disminucion en la PTH intacta por debajo de los niveles iniciales de pre-tratamiento. En otra realizacion, la disminucion deseada en la PTH es llevar los niveles de la PTH en plasma a las directrices generalmente reconocidas establecidas por la National Kidney Foundation u otros expertos 45 en el tratamiento de trastornos renales e insuficiencia renal.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de uso para tratar el hiperparatiroidismo, la hipercalcemia y/o enfermedad osea, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto descrito. En otra realizacion, el sujeto se puede tratar con un compuesto descrito en combinacion con uno o mas de otros 50 agentes terapeuticamente eficaces.
En otro aspecto, el compuesto descrito se administra en una cantidad eficaz para reducir la PTH o el efecto de la PTH. En algunas realizaciones, la reduccion de la PTH en plasma es de al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 % o 30 % por debajo de los 55 niveles iniciales de pre-tratamiento durante al menos 10 horas despues de la administracion del compuesto descrito. En realizaciones especfficas, la reduccion de la PTH en plasma es de al menos el 20 % 10 horas despues de la administracion. En realizaciones preferidas, la reduccion de la PTH en plasma es del 15 al 40 %, preferiblemente del 20 al 50 %, mas preferiblemente del 30 al 70 % por debajo de los niveles iniciales de pre-tratamiento durante al menos 48 horas despues de la administracion del compuesto descrito.
En otro aspecto, el compuesto descrito se administra en una cantidad eficaz para disminuir el calcio serico o el efecto del calcio. En algunas realizaciones, la reduccion en el calcio serico es de al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o 25 % por debajo de 5 los niveles de pre-tratamiento durante al menos 10 horas despues de la administracion del peptido policationico. En algunas realizaciones preferidas, la reduccion en el calcio serico es de al menos el 5 % a las 10 horas despues de la administracion. En algunas realizaciones preferidas, la reduccion en el calcio serico es del 5 al 10 %, preferiblemente del 5 al 20 % por debajo de los niveles de pre-tratamiento durante al menos 48 horas despues de la administracion del compuesto descrito.
10
En otro aspecto, se proporciona un metodo de uso para tratar el hiperparatiroidismo y/o la hipercalcemia en un sujeto que necesita el mismo, que comprende: administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto descrito, donde se reduce la PTH y/o el calcio.
15 En base a la relacion entre el calcio serico, el metabolismo oseo y la PTH, se cree que los compuestos descritos son beneficiosos para el tratamiento de diversas formas de enfermedad osea y/o hipercalcemia ademas del hiperparatiroidismo. Los compuestos descritos pueden tener ventajas en comparacion con los agentes terapeuticos actuales, debido a que se pueden administrar por via parenteral y pueden no estar asociados a efectos adversos gastrointestinales, no se metabolizan por el citocromo P450 y pueden dar como resultado reducciones mas eficaces 20 en la PTH y calcio en plasma.
Como se ha analizado anteriormente, los metodos descritos se pueden utilizar solos o en combinacion con uno o mas de otros agentes terapeuticamente eficaces. Dichos otros agentes terapeuticamente eficaces incluyen, pero sin limitacion, el tratamiento con agentes de bifosfonato antirresortivos, tales como, alendronato y risedronato; 25 bloqueadores de integrina, tales como antagonistas avp3, estrogenos conjugados utilizados en la terapia de reemplazo hormonal, tales como PREMPRO™, PREMARIN™ y ENDOMeTrION™; moduladores del receptor selectivo de estrogenos (SERM), tales como raloxifeno, droloxifeno, CP-336.156 (Pfizer) y lasofoxifeno; inhibidores de catepsina K, terapia con vitamina D, analogos de vitamina D, tales como ZEMPLAR™ (paricalcitol); CALCIJEX® (calcitriol), HECToRoL® (doxercalciferol), ONE-ALPHA® (alfacalcidol) y los analogos en el desarrollo de 30 Cytochroma conocidos como CTA-018, CTAP201 y CTAP101; otros calcimimeticos tales como Sensipar® (cinacalcet), inhibidores de la familia de transportadores de fosfato sodio-dependiente de tipo II, SLC34 (incluyendo las dos isoformas renales NaPi-IIa y NaPi-IIc, y el transportador NaPi-IIb intestinal); fosfatoninas (incluyendo FGF-23, sFRP4, MEPE o FGF-7); tratamiento con PTH a dosis baja (con o sin estrogeno); calcitonina, inhibidores del ligando RANK, anticuerpos contra el ligando RANK, osteoprotegrina; antagonistas de adensosina; e inhibidores de bomba 35 protonica de ATP.
En una realizacion, se administra un compuesto descrito a una dosis suficiente para disminuir los niveles tanto de la PTH con del calcio en suero. En otra realizacion, un compuesto descrito se administra a una dosis suficiente para disminuir la PTH sin afectar significativamente a los niveles de calcio en suero. En una realizacion adicional, se 40 administra un compuesto descrito a una dosis suficiente para aumentar la PTH sin afectar significativamente los niveles de calcio en suero.
Formulaciones
45 Se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto descrito y al menos un excipiente o vehfculo farmaceuticamente aceptable. Los metodos para preparar estas composiciones farmaceuticas tfpicamente comprenden la etapa de asociar un compuesto descrito con un vehfculo y, opcionalmente, uno o mas ingredientes secundarios. Los compuestos descritos y/o las composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos se pueden formular en forma de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante metodos convencionales 50 conocidos por los expertos en la tecnica. Tfpicamente, las formulaciones se preparan asociando uniforme e fntimamente un compuesto descrito con vehfculos lfquidos, o vehfculos solidos divididos finamente, o ambos, y despues, si es necesario, conformando el producto.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion adecuadas para administracion parenteral comprenden 55 uno o mas compuestos descritos en combinacion con uno o mas soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotonicas, esteriles, farmaceuticamente aceptables, o polvos esteriles que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de utilizarse, que pueden contener azucares, alcoholes, aminoacidos, antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, solutos que convierten la formulacion en isotonica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspension o espesantes.
Los ejemplos de vehfculos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres organicos 5 inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano requerido de partfcula en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones farmaceuticas tambien pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes 10 humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersion. La prevencion de la accion de los microorganismos con los compuestos descritos se puede asegurar mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenol-sorbico, y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes para controlar la tonicidad, tales como azucares, cloruro de sodio, y similares, en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable se puede obtener mediante la inclusion de 15 agentes que retarden la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de un farmaco, es conveniente disminuir la absorcion del farmaco a partir de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo que tenga deficiente solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del farmaco 20 entonces depende de su velocidad de disolucion la cual, a su vez, puede depender del tamano del cristal y la forma cristalina. Como alternativa, la absorcion retardada de una forma de farmaco administrado por via parenteral se lleva a cabo al disolver o suspender el farmaco en un vehfculo oleoso.
Por ejemplo, un compuesto descrito se puede suministrar a un ser humano en una forma de solucion que se produce 25 al reconstituir una forma solida del farmaco con lfquido. Esta solucion se puede diluir adicionalmente con un fluido de infusion tal como agua para inyeccion, inyeccion de cloruro de sodio al 0,9 %, inyeccion de dextrosa al 5 % e inyeccion de Ringer tratada con lactato. Se prefiere que las soluciones reconstituidas y diluidas se utilicen en 4-6 horas para el suministro de una potencia maxima. Como alternativa, un compuesto descrito se puede administrar a un ser humano en forma de comprimido o capsula.
30
Las formas de deposito inyectables se hacen formando matrices microencapsuladas de los compuestos descritos en polfmeros biodegradables tales como polilactido-poliglicolido. Dependiendo de la proporcion del farmaco con respecto al polfmero, y la naturaleza del polfmero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberacion del farmaco. Los ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhfdridos). Las 35 formulaciones inyectables de deposito tambien se preparan atrapando el farmaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con el tejido corporal.
Cuando los compuestos descritos se administran como productos farmaceuticos, a seres humanos y animales, los mismos se pueden administrar solos o como una composicion farmaceutica que contenga, por ejemplo, del 0,1 al 40 99 % (mas preferiblemente del 10 al 30 %) del principio activo en combinacion con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica puede contener 0,2-25 %, preferiblemente 0,5-5 % o 0,5-2 %, del principio activo. Estos compuestos se pueden administrar a seres humanos y otros animales para terapia mediante cualquier via de administracion adecuada, incluyendo, por ejemplo, inyeccion subcutanea, deposito subcutaneo, inyeccion intravenosa, infusion intravenosa o subcutanea. Estos compuestos se pueden administrar 45 rapidamente (en <1 minuto) como un bolo o mas lentamente durante un perfodo de tiempo prolongado (mas de varios minutos, horas o dfas). Estos compuestos se pueden administrar a diario o a lo largo de de multiples dfas, continua o intermitentemente. En una realizacion, los compuestos se pueden administrar por via transdermica (por ejemplo, utilizando un parche, microagujas, microporos, pomadas, microchorro o nanochorro).
50 Sin importar la via de administracion seleccionada, los compuestos descritos, que se pueden utilizar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas, se formulan en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante metodos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica.
Los niveles reales de dosificacion de los principios activos en las composiciones farmaceuticas se pueden variar 55 para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un paciente particular, composicion, y modo de administracion, sin que sea toxico para el paciente.
El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto descrito particular empleado, o el ester, sal o amida del mismo, la via de administracion, el tiempo de
administracion, la velocidad de excrecion o metabolismo del compuesto particular que se empleara, la velocidad y grado de absorcion, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinacion con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, condicion, salud general e historial medico anterior del paciente que se trata, y factores similares ya conocidos en las tecnicas medicas.
5
Un medico o veterinario con experiencia en la tecnica puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica requerida. Por ejemplo, el medico o el veterinario puede comenzar con dosis de los compuestos descritos empleados en la composicion farmaceutica a niveles menores de los requeridos para alcanzar el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se alcance el efecto deseado.
10
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto descrito sera aquella cantidad del compuesto que sea la menor dosis eficaz para producir un efecto terapeutico. Tal dosis eficaz en general dependera de los factores que se han descrito anteriormente. En general, las dosis intravenosas, intramusculares, transdermicas, intracerebroventricular y subcutaneas de los compuestos descritos para un paciente, cuando se utilicen para los 15 efectos indicados, variaran de entre aproximadamente 1 pg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En otras realizaciones, la dosis variara entre aproximadamente 5 pg a aproximadamente 2,5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En realizaciones adicionales, la dosis variara entre aproximadamente 5 pg a aproximadamente 1 pg por kilogramo de peso corporal por hora.
20 Si se desea, la dosis diaria eficaz de un compuesto descrito se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas sub-dosis administradas por separado a intervalos adecuados a todo lo largo del dfa, opcionalmente, en formas unitarias de dosificacion. En una realizacion, el compuesto descrito se administra como una sola dosis al dfa. En realizaciones adicionales, el compuesto se administra continuamente, tal como a traves de la via intravenosa u otras. En otras realizaciones, el compuesto se administra con menos frecuencia de la diaria, tal como cada 2-3 dfas, 25 junto con tratamiento de dialisis, semanalmente o con menor frecuencia.
El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular seres humanos y otros mamfferos tales como equinos, ganado vacuno, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general.
30
Los compuestos descritos se pueden administrar tal cual o en mezclas con vehfculos farmaceuticamente aceptables, y tambien se pueden administrar junto con agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucosidos y glicopeptidos. Por lo tanto, la terapia conjuntiva incluye la administracion secuencial, simultanea y por separado del compuesto activo de tal forma que los efectos terapeuticos de la primera administrada no 35 desaparezcan por completo cuando se administre la posterior.
Rutas de administracion para los compuestos desvelados
Estos compuestos se pueden administrar a seres humanos y otros animales para terapia mediante cualquier via de 40 administracion adecuada. Como se usa en el presente documento, el termino "ruta" de administracion pretende incluir, pero sin limitacion, inyeccion subcutanea, deposito subcutaneo, inyeccion intravenosa, infusion intravenosa o subcutanea, inyeccion intraocular, inyeccion intradermica, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, administracion intratraqueal, administracion intraadiposal, administracion intraarticular, administracion intratecal, administracion epidural, inhalacion, administracion intranasal, administracion sublingual, administracion bucal, 45 administracion rectal, administracion vaginal, administracion intracisternal y administracion topica, administracion transdermica, o administracion a traves de administracion local (por ejemplo, mediante cateter o endoprotesis).
La administracion transdermica del farmaco al cuerpo es un metodo deseable y conveniente para la administracion sistemico de las sustancias biologicamente activas a un sujeto, y, en particular para la administracion de sustancias 50 que tengan una biodisponibilidad oral deficiente, tales como protefnas y peptidos. La ruta de administracion transdermica ha sido particularmente exitosa con pequenos compuestos lipofilos (por ejemplo, de menos de aproximadamente 1.000 daltons) tales como, escopolamina y nicotina, que pueden penetrar la capa externa del estrato corneo de la piel, que sirve como una barrera eficaz para la entrada de sustancias en el cuerpo. Debajo del estrato corneo se encuentra la epidermis viable, que no contiene vasos sangufneos, pero tiene algunos nervios. 55 Todavfa mas profundo se encuentra la dermis, que contiene vasos sangufneos, vasos linfaticos y nervios. Los farmacos que cruzan la barrera del estrato corneo se pueden difundir en general a los capilares en la dermis para su absorcion y distribucion sistemica.
Los avances tecnologicos en la administracion transdermica se han enfocado en abordar la necesidad en la tecnica
de administrar compuestos de alto peso molecular, hidrofilos, tales como protefnas y peptidos, a traves de la piel. Un enfoque implica la alteracion del estrato corneo utilizando metodos qufmicos o ffsicos para reducir la barrera planteada por el estrato corneo. La tecnologfa de microporacion cutanea, que implica la creacion de trayectorias de transporte de dimension micronica (microporos) en la piel (en particular, los microporos en el estrato corneo), 5 utilizando una tecnica mfnimamente invasiva, es un enfoque mas reciente. Las tecnicas para crear microporos en la piel (estrato corneo) incluyen microporacion termica o ablacion, matrices de microagujas, fonoforesis, ablacion por laser y ablacion por radiofrecuencia (Prausnitz y Langer (2008) Nat. Biotechnology 11: 1261-68; Arora y col., lnt. J. Pharmaceutics, 364: 227 (2008); Nanda y col., Current Drug Delivery, 3: 233 (2006); Meidan y col. American J. Therapeutic. 11: 312 (2004)).
10
Como se ha apreciado anteriormente, la secrecion de la PTH se regula mediante el CaSR que se expresa sobre la superficie celular de las celulas paratiroideas. Por lo tanto, con el fin de activar el CaSR, el agente o compuesto debe administrarse a las celulas paratiroideas. La administracion transdermica de agentes calcimimeticos debe conseguir la administracion a traves del estrato corneo y proporcionar una exposicion sistemica hasta llegar a la celula 15 paratiroidea. Hasta la fecha, la tecnica no ha demostrado si un compuesto calcimimetico se puede administrar o no por via transdermica en una cantidad suficiente para beneficio terapeutico y, en particular en una cantidad suficiente para disminuir la PTH y/o el tratamiento, atenuacion, disminucion y/o alivio de la hipercalcemia.
Ademas de los calcimimeticos, los analogos de vitamina D3 1,25-(OH)2 son los tratamientos utilizados mas 20 comunmente para pacientes con hiperparatiroidismo asociada a enfermedad renal cronica y enfermedad renal en etapa terminal. Los analogos de vitamina D actuan facilitando la absorcion intestinal del calcio dietetico, y reducen los niveles de la PTH inhibiendo la sfntesis y secrecion de la PTH. Aunque se ha utilizado terapeuticamente la administracion intravenosa y oral de vitamina D, hasta la fecha, la tecnica no ha demostrado si los analogos de vitamina D, tales como ZEMPLAR™ (paricalcitol), CALC IJ EX® (calcitriol), ONE-ALPHA® (alfacalcidol) y 25 HECTOROL® (doxercalciferol) se pueden administrar o no por via transdermica en una cantidad suficiente para un beneficio terapeutico y, en particular en una cantidad suficiente para disminuir la hormona paratiroidea (PTH). Ademas, la tecnica no ha demostrado si la co-administracion mediante administracion transdermica de un agente calcimimetico en combinacion con un analogo de vitamina D (ya sea como formulaciones por separado o como una co-formulacion) en cantidades suficientes para beneficio terapeutico, y en particular en cantidades suficientes para 30 disminuir la PTH proporcionan un tratamiento eficaz para pacientes que padecen de hiperparatiroidismo.
Los agentes calcimimeticos se pueden administrar a traves del estrato corneo, y/u otras capas de la epidermis, para administracion local o sistemica, para disminuir la hormona paratiroidea (PTH) y/o tratar la hipercalcemia. En una realizacion, el agente calcimimetico se administra a traves de microporacion. Se contempla una cualquiera de varias 35 tecnicas para microporacion, y se describen varias brevemente.
La microporacion se puede alcanzar por medios mecanicos y/o fuerzas de impulsion externa, para romper el estrato corneo para suministrar los agentes calcimimeticos descritos en el presente documento a traves de la superficie de la piel y en las capas cutaneas subyacentes y/o el torrente sangufneo.
40
En una primera realizacion, la tecnica microporacion es la ablacion del estrato corneo en una region especffica de la piel utilizando una luz laser pulsada de longitud de onda, longitud de pulsos, energfa de pulsos, numero de pulsos, y velocidad de repeticion de pulsos suficiente para separar el estrato corneo sin danar significativamente la epidermis subyacente. El agente calcimimetico se aplica entonces a la region de ablacion. Otra tecnica de microporacion por 45 ablacion laser, denominada como ondas de estres inducido por laser (LISW), implica ondas unipolares y compresibles, de banda ancha, generadas por laseres con pulsos de alta potencia. Las LISW interactuan con los tejidos para descomponer los lfpidos en el estrato corneo, creando canales intercelulares transitorios dentro del estrato corneo. Estos canales, o microporos, en el estrato corneo permiten la entrada del agente calcimimetico.
50 La sonoforesis o fonoforesis es otra tecnica de microporacion que utiliza energfa de ultrasonido. El ultrasonido es una onda sonica que posee frecuencias superiores a 20 KHz. El ultrasonido se puede aplicar continuamente o por pulsos, y se aplica a diversas variaciones de frecuencia e intensidad (Nanda y col., Current Drug Delivery, 3: 233 (2006)).
55 Otra tecnica de microporacion implica el uso de una matriz de microagujas. La matriz de microagujas, al aplicarse a la region cutanea en un sujeto perfora el estrato corneo y no penetran a una profundidad que estimule significativamente los nervios ni perfore los capilares. Por lo tanto, el paciente siente ninguna o una minima incomodidad o dolor tras la aplicacion de la matriz de microagujas para la generacion de microporos a traves de los cuales se administra el agente calcimimetico.
Se contemplan las matrices de microagujas que constan de microagujas huecas o solidas, donde el agente se puede recubrir la superficie externa de las agujas o suministrarse desde el interior de las agujas huecas. Se describen ejemplos de matrices de microagujas, por ejemplo, en Nanda y col., Current Drug Delivery, 3: 233 (2006) y Meidan y 5 col. American J. Therapeutic, 11: 312 (2004). Las matrices de microagujas de primera generacion constaban de microagujas de silicio, solidas, que se recubrfan externamente con un agente terapeutico. Cuando la micromatriz de agujas se presionaba contra la piel y se retiraba despues de aproximadamente 10 segundos, la permeacion del agente sobre las agujas en el cuerpo se consegufa facilmente. Las matrices de microagujas de segunda generacion constaban de microagujas de silicio solido o hueco, policarbonato, titanio u otro polfmero adecuado, y se recubrfan o 10 rellenaban con una solucion del compuesto terapeutico. Las generaciones mas recientes de matrices de microagujas se preparan a partir de polfmeros biodegradables, donde las puntas de las agujas se recubren con un agente terapeutico que permanece en el estrato corneo y se disuelven lentamente.
Las microagujas se pueden construir a partir de una diversidad de materiales, incluyendo metales, ceramicas, 15 semiconductores, organicos, polfmeros, y compuestos. Los materiales de construccion ilustrativos incluyen acero inoxidable de grado farmaceutico, oro, titanio, nfquel, hierro, estano, cromo, cobre, paladio, platino, aleaciones de estos u otros metales, silicio, dioxido de silicio, y polfmeros. Los polfmeros biodegradables representativos incluyen, polfmeros de hidroxiacidos tales como, acido lactico y polilactido de acido glicolico, poliglicolido, polilactido-co- glicolido, y copolfmeros con poli(etilenglicol), polianhfdridos, poli(orto)esteres, poliuretanos, poli(acido butfrico), 20 poli(acido valerico), y poli (lactido-co-caprolactona). Los polfmeros no biodegradables representativos incluyen policarbonato, poliester, y poliacrilamidas.
Las microagujas pueden tener puntas rectas o afiladas. En una realizacion, el diametro de la microaguja es mayor en el extremo de la base de la microaguja y se afila hasta una punta en el extremo distal de la base. La microaguja 25 tambien se puede fabricar para que tenga una punta que incluya tanto una porcion recta (no ahusada) como una porcion afilada. Las agujas pueden no tener tampoco un extremo afilado en absoluto, es decir, pueden ser simplemente cilindros con puntas romas o planas. Una microaguja hueca que tiene un diametro practicamente uniforme, pero que no esta afilada con respecto a un punto, se denomina en el presente documento como un "microtubo". Como se usa en el presente documento, el termino "microaguja" incluye tanto microtubos como agujas 30 afiladas, a menos que se indique otra cosa.
La electroporacion es otra tecnica para crear microporos en la piel. Este enfoque utiliza la aplicacion de pulsos electricos largos de alta tension de microsegundos o milisegundos para crear poros transitorios, permeables dentro del estrato corneo.
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Otras tecnicas de microporacion incluyen el uso de ondas de radio para crear microcanales en la piel. La ablacion termica es otro enfoque mas para conseguir la administracion de compuestos de mayor peso molecular por via transdermica.
40 Los solicitantes han descubierto que se pueden administrar terapeuticamente bajas dosis de agentes calcimimeticos durante un perfodo prolongado de tiempo para tratar la SHPT. Esto difiere notablemente de los requisitos actuales de dosis de otros calcimimeticos (por ejemplo, clorhidrato de cinacalcet).
La administracion transdermica de los compuestos descritos en el presente documento se demostro en los estudios 45 descritos en los Ejemplos 9-10. En un primer estudio, el compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se administro por via transdermica a ratas en las que se realizaron microporos en una pequena zona de la piel mediante 5 pases de un rodillo dermico de 1,0 mm a presion moderada. Una solucion de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ iD NO:6) o solucion salina se puso sobre el area de la piel con microporo. Se extrajo sangre durante un periodo de 4 horas y se analizo el plasma para los niveles de la PTH mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 11, donde se muestra la 50 PTH en plasma como un porcentaje del valor inicial pre-dosis para el animal tratado con solucion salina (rombos) y los dos animales tratados con el compuesto de ensayo (cuadrados, triangulos). Estos datos indican que el compuesto Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) se puede suministrar sistemicamente en cantidades suficientes por via transdermica (en este caso, administracion transdermica facilitada por microporos) utilizando un rodillo dermico para reducir eficaz y significativamente los niveles de la PTH del valor inicial durante ~4 horas que duraron los estudios. 55 Se debe observar que Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) ha mostrado reducir eficazmente los niveles de la PTH del valor inicial en el modelo de rata 1K1C de insuficiencia renal aguda al administrarse mediante infusion corta IV, asf como en ratas normales (datos no mostrados).
En otro estudio, descrito en el Ejemplo 10, el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se administro por via
transdermica facilitada por microporos a ratas normales utilizando un parche transdermico. Se puso un sistema de parches transdermicos que contenfan solucion al 10 % (en peso) de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) en solucion salina sobre el area con microporos y se dejo en el lugar durante ~30 horas. Se realizaron extracciones de sangre de las ratas periodicamente durante las 30 horas y se analizaron las muestras de plasma para determinar los niveles de 5 PTH mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 12. Sorprendentemente, estos datos demuestran que la administracion transdermica facilitada por microporos puede conseguir una administracion sostenida suficiente de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) para producir una reduccion significativa y extendida en la PTH durante >30 horas en ratas con funcion renal normal. Estos datos demuestran que la administracion transdermica facilitada por microporacion del conjugado Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) utilizando un parche puede conseguir suficiente 10 exposicion en la sangre del peptido durante el curso de tratamiento para producir una reduccion significativa y sostenida en la PTH a partir del valor inicial durante >30 horas. Estos datos demuestran que la administracion por parche transdermico en una base diaria o mayor podrfa permitir el tratamiento de pacientes tanto con dialisis como sin hemodialisis que necesitan el tratamiento. Por ejemplo, CKD (fase 4), el hiperparatiroidismo primario y el hiperparatiroidismo secundario (SHPT) en pacientes con trasplante renales que no se trataron tfpicamente con 15 farmacos IV, pero que se podrfan tratar facilmente mediante un parche transdermico diariamente a traves de microporacion facilito la administracion transdermica.
Se realizo otro estudio para evaluar adicionalmente la via de administracion de los compuestos. Como se describe en el Ejemplo 11, el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se administro mediante infusion IV a dosis muy 20 baja a ratas normales y a ratas con insuficiencia renal para identificar la menor dosis necesaria a administrar por infusion, sistema de parches transdermicos u otros medios de administracion sostenida para conseguir una reduccion significativa de la PTH. Ratas sanas se infundieron por via intravenosa durante seis horas con dosis muy bajas (1 pg/kg/h, 3 pg/kg/h, y 10 pg/kg/h) de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3). Se extrajeron muestras sangufneas antes de la dosificacion (pre) y a las 2 horas, 4 horas, 6 horas (justo antes de terminar la infusion; EOI) y 8 horas (2 25 horas despues de la EOI) despues del inicio de la infusion y se analizo el plasma para determinar los niveles de la PTH mediante ELISA. Sorprendentemente, los datos mostrados en la figura 13 demuestran que la infusion de dosis muy bajas de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) (1 pg/kg/h (cuadrados), 3 pg/kg/h (cfrculos), y 10 pg/kg/h (triangulos)) durante 6 horas son eficaces para producir una reduccion significativa en la PTH a partir del valor inicial a traves del transcurso de la infusion. Estos datos indican que dosis bajas administradas continuamente podrfan ser 30 tan eficaces como (o incluso mas eficaces que) la administracion de dosis mucho mayores en forma de un bolo individual.
El efecto de disminucion de la PTH se evaluo adicionalmente en el modelo de rata 1K1C de insuficiencia renal aguda. A las ratas del modelo 1K1C se les administro por infusion intravenosa dosis bajas de Ac-c(C)arrrar-NH2 35 (SEQ ID NO:3) (30 pg/kg/h y 100 pg/kg/h) durante 6 horas. Se extrajeron muestras sangufneas antes de la dosificacion (Pre), y a las 2 horas, 4 horas, 6 horas (justo antes del termino de la infusion; EOI), 8 horas (2 horas antes de la EOI) y 24 horas despues del inicio de la infusion y se analizo el plasma para determinar los niveles de la PTH mediante ELISA. Los datos mostrados en el figura 14A demuestran que la infusion IV de dosis bajas de Ac- c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) reducen significativamente la PTH de los niveles del valor inicial en el modelo 1K1C, 40 un modelo de insuficiencia renal donde se pueden observar niveles de la PTH de valor inicial que van de 400 a >1100 pg/ml. Sorprendentemente, 6 horas de una infusion IV de dosis baja (rombos, 30 pg/kg/h y cuadrados, 100 pg/kg/h) de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) fueron capaces de reducir la PTH inicial durante ~24 horas. Consistente con esta drastica reduccion de la PTH en el modelo de rata 1K1C, la figura 14B muestra una grafica de barras que representa los datos de calcio serico en esta insuficiencia renal aguda, y muestra una reduccion 45 correspondiente en el calcio serico despues de una infusion IV de dosis baja de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3). Estos datos demuestran que Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) es un compuesto calcimimetico muy potente que es capaz de reducir la PTH y el calcio despues de la infusion o administracion de dosis bajas (por ejemplo, mediante suministro transdermico) durante el curso de ~24 horas. Estos datos apoyan adicionalmente la conclusion de que la administracion sostenida de dosis bajas de un agente calcimimetico mediante infusion IV o mediante administracion 50 transdermica facilitada por microporos puede ser un tratamiento eficaz para pacientes en una base diaria o menos frecuente.
Terapia de combinacion
55 Como se ha descrito anteriormente, los metodos de uso se pueden utilizar en solitario o en combinacion con otros enfoques para el tratamiento de la hipercalcemia y/o la enfermedad osea. Estos otros procedimientos incluyen, pero sin limitacion, tratamiento con agentes tales como agentes de bisfosfonato, bloqueantes de integrina, terapia de reemplazo hormonal, moduladores del receptor selectivo de estrogenos, inhibidores de la catepsina K, terapia con vitamina D, analogos de vitamina D, tales como ZEMPLAR™ (paricalcitol), CALCIJEX® (calcitriol), ONE-ALPHA®
(alfacalcidol) y HECTOROL® (doxercalciferol), agentes antiinflamatorios, terapia de la PTH a dosis baja (con o sin estrogenos), calcimimeticos, aglutinantes de fosfato, calcitonina, inhibidores del ligando RANK, anticuerpos contra el ligando RANK, osteoprotegrina, antagonistas de adensosina e inhibidores de bomba protonica con ATP.
5 En una realizacion, una terapia de combinacion utiliza vitamina D o un analogo de vitamina D en combinacion con un agente calcimimetico. La vitamina D facilita la absorcion del calcio y funciona para mantener los niveles sangufneos normales de calcio y fosforoso. La PTH funciona para mejorar la absorcion de calcio en el intestino aumentando la produccion de vitamina D 1,25-(OH)2, la forma activa de la vitamina D. La PTH tambien estimula la excrecion de fosforo del rinon, y aumenta la liberacion del hueso.
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Como se ha analizado anteriormente, el hiperparatiroidismo secundario se caracteriza por una elevacion en la hormona paratiroidea (PTH) asociada a niveles inadecuados de la hormona con vitamina D activa. Puede usarse vitamina D o un analogo de vitamina D para reducir los niveles elevados de la PTH en el tratamiento de hiperparatiroidismo secundario. En una realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que 15 comprende un agente calcimimetico y un analogo de vitamina D.
En una realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende un agente calcimimetico y ZEMPLAR™ (paricalcitol). Paricalcitol es un analogo sintetico de calcitriol, la forma metabolicamente activa de la vitamina D. La dosis inicial recomendada de Zemplar se basa en los niveles iniciales de la hormona paratiroidea 20 intacta (iPTH). Si el nivel inicial de la iPTH es menor o igual a 500 pg/ml, la dosis diaria es 1 pg y la dosis "tres veces a la semana" (que se administrara con un dfa de por medio) es 2 pg. Si la iPTH inicial es mayor de 500 pg/ml, la dosis diaria es 2 pg, y la dosis "tres veces a la semana" (que se administrara con un dfa de por medio) es 4 pg. Despues de esto, la dosificacion se debe individualizar y basarse en los niveles de la iPTH en plasma serico, con la supervision del calcio serico y el fosforo serico. Paricalcitol se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 25 5.246.925 y la Patente de Estados Unidos n.° 5.587.497.
En otra realizacion, la invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende un agente calcimimetico y CALCIJEX® (calcitriol). El calcitriol es la forma metabolicamente activa de la vitamina D. La dosificacion inicial recomendada para CALCIJEX® (oral) es 0,25 p/dfa. Esta cantidad se puede aumentar en 0,25 pg/dfa a intervalos de 30 4 a 8 semanas. Los niveles normales o solo ligeramente reducidos de calcio pueden responder a dosificaciones de 0,25 pg cada dos dfas. Para pacientes con dialisis, la dosis inicial recomendada para CALCIJEX® (IV) es 0,02 pg/kg (1 a 2 pg) 3 veces/semana, cada dos dfas. Esta cantidad se puede aumentar en 0,5 a 1 pg, cada 2 a 4 semanas. Calcitriol se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.051.567 y la Patente de Estados Unidos n.° 6.265.392, y la Patente de Estados Unidos n.° 6.274.169.
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En una realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un agente calcimimetico y HECTOROL® (doxercalciferol). Doxercarciferol es un analogo sintetico de la vitamina D que experimenta activacion metabolica in vivo para formar 1a,25-dihidroxivitamina D2, una forma biologicamente activa de la vitamina D de origen natural. La dosis inicial recomendada de HECTOROL® es 10 pg administrada tres veces a la semana en 40 dialisis (aproximadamente cada dos dfas). La dosis inicial se debe ajustar, segun se requiera, para disminuir la iPTH en sangre en el intervalo de 150 a 300 pg/ml. La dosis se puede aumentar a intervalos de 8 semanas en 2,5 pg si la iPTH no disminuye en un 50 % y no puede alcanzar el intervalo diana. La dosis maxima recomendada de HECTOROL es 20 pg administrada tres veces a la semana en dialisis para un total de 60 pg a la semana. Doxercalciferol se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.602.116 y la Patente de Estados Unidos n.° 45 5.861.386 y la Patente de Estados Unidos n.° 5.869.473 y la Patente de Estados Unidos n.° 6.903.083.
La combinacion particular de terapias (productos terapeuticos o procedimientos) para emplear en un regimen de combinacion debera tomar en cuenta la compatibilidad de los productos terapeuticos y/o los procedimientos deseados y el efecto terapeutico deseado a conseguir. Tambien se debe apreciar que las terapias empleadas 50 pueden conseguir un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invencion se puede administrar concurrentemente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno), o se pueden conseguir diferentes efectos (por ejemplo, el control de cualesquiera efectos adversos). Como se usa en el presente documento, los agentes terapeuticos adicionales, que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad, o afeccion, particular se conocen como "adecuados para la enfermedad, o afeccion, que se trata".
Un tratamiento de combinacion de la presente invencion como se define en el presente documento se puede conseguir por medio de la administracion simultanea, secuencial o por separado de los componentes individuales de dicho tratamiento.
Los compuestos o las composiciones farmaceuticamente aceptables de los mismos tambien se pueden incorporar en composiciones para recubrir dispositivos medicos implantables, polfmeros bio-erosionables, bombas implantables, y supositorios. Por consiguiente, en otro aspecto de la divulgacion, se contempla una composicion 5 para recubrir un dispositivo implantable que comprende un compuesto descrito como se ha descrito en general anteriormente, y un vehfculo adecuado para recubrir el dispositivo implantable. Aun en otro aspecto de la divulgacion, se incluye un dispositivo implantable recubierto con una composicion que comprende un compuesto como se ha descrito en general anteriormente, y un vehfculo adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable.
10 Los recubrimientos adecuados y la preparacion general de los dispositivos implantables recubiertos se describen en las Patentes de Estados Unidos n.° 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los recubrimientos son materiales polimericos tfpicamente biocompatibles tales como polfmero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, acido polilactico, acetato etilenvinflico, y mezclas de los mismos. Los recubrimientos opcionalmente se pueden recubrir adicionalmente mediante un revestimiento adecuado de fluorosilicona, polisacaridos, 15 polietilenglicol, fosfolfpidos o combinaciones de los mismos para impartir caracterfsticas de liberacion controlada en la composicion.
Marcadores clfnicos potenciales para determinar la eficacia del tratamiento
20 La determinacion de la eficacia de un metodo de tratamiento descrito se puede determinar mediante una diversidad de metodos.
Los niveles normales de calcio serico estan en el intervalo de 8,8 mg/dl a 10,4 mg/dl (2,2 mmol/l a 2,6 mmol/l). En ciertos casos, la eficacia del tratamiento se puede determinar mediante la medicion de los marcadores sericos y 25 urinarios relacionados con el calcio, incluyendo, pero sin limitacion, calcio serico total y ionizado, albumina, PTH en plasma, PTHrP, fosfato, vitamina D y magnesio.
En otros casos, la eficacia se puede determinar mediante la medicion de la densidad mineral osea (DMO), o mediante la medicion de marcadores bioqufmicos para la formacion de hueso y/o resorcion osea en suero u orina. 30 Los marcadores potenciales de formacion osea incluyen, pero sin limitacion, fosfatasa alcalina total, fosfatasa alcalina osea, osteocalcina, osteocalcina sub-carboxilada, propeptido de procolageno tipo I C-terminal, y propeptido de procolageno tipo I N-terminal. Los marcadores potenciales de resorcion osea incluyen, pero sin limitacion, hidroxiprolina, hidroxilisina, hidroxilisina de glicosil-galactosilo, hidroxilisina de galactosilo, piridinolina, desoxipiridinolina, telopeptido reticulante N-terminal del colageno tipo I, telopeptido reticulante C-terminal del 35 colageno tipo I, telopeptido reticulante C-terminal del colageno tipo I, generado mediante por MMP, sialoprotefna osea, fosfatasa de acido y fosfatasa de acido resistente a tartrato.
En otros casos, la eficacia se puede determinar mediante la reduccion porcentual en la PTH con relacion a un nivel de pre-dosificacion (valor inicial) y/o consiguiendo un nivel deseable de la PTH como se acepta en general como 40 beneficioso para los pacientes (por ejemplo, las directrices establecidas por la National Kidney Foundation). Todavfa en otros casos, la eficacia se puede determinar mediante la medicion de la reduccion en la hiperplasia de la glandula paratiroides asociada a una enfermedad de hiperparatiroidismo.
Se espera que cuando se administre un metodo de tratamiento descrito a un sujeto que necesite el mismo, el 45 metodo de tratamiento producira un efecto, segun se mide mediante, por ejemplo, uno o mas de: calcio serico total, calcio serico ionizado, calcio total en sangre, calcio ionizado en sangre, albumina, PTH en plasma, PTH en sangre, PTHrP, fosfato, vitamina D, magnesio, densidad mineral osea (DMO), fosfatasa alcalina total, fosfatasa alcalina osea, osteocalcina, osteocalcina sub-carboxilada, propeptido de procolageno tipo I C-terminal, propeptido de procolageno tipo I N-terminal, hidroxiprolina, hidroxilisina, hidroxilisina glicosil-galactosilo, hidroxilisina galactosilo, 50 piridinolina, desoxipiridinolina, telopeptido reticulante N-terminal de colageno tipo I, telopeptido reticulante C-terminal de colageno tipo I generado por MMP, sialoprotefna osea, fosfatasa de acido y fosfatasa de acido resistente a tartrato. Los efectos incluyen el tratamiento profilactico, asf como el tratamiento de una enfermedad existente.
Una molecula biologicamente eficaz se puede enlazar funcionalmente a un peptido descrito con un enlace covalente 55 o una interaccion no covalente. En realizaciones especfficas, las moleculas biologicamente eficaces enlazadas funcionalmente pueden alterar la farmacocinetica de los compuestos descritos en virtud de conferir propiedades al compuesto como parte de una molecula enlazada. Algunas de las propiedades que las moleculas biologicamente eficaces pueden conferir a los compuestos descritos incluyen, pero sin limitacion: administracion de un compuesto a una ubicacion discreta dentro del cuerpo; concentracion de la actividad de un compuesto en una ubicacion deseada
en el cuerpo y reduccion de sus efectos en otro sitio; reducir los efectos secundarios del tratamiento con un compuesto; cambiar la permeabilidad de un compuesto; cambiar la biodisponibilidad o la velocidad de administracion al cuerpo de un compuesto; cambiar la duracion del efecto del tratamiento con un compuesto; alterar la estabilidad qufmica in vitro del compuesto; alterar la estabilidad in vivo del compuesto, semivida, depuracion, absorcion, 5 distribucion y/o excrecion; alterar la velocidad de la aparicion y la disminucion de los efectos de un compuesto; proporcionar una accion permisiva al permitir que un compuesto tenga un efecto.
En un aspecto adicional, el compuesto descrito se puede conjugar con polietilenglicol (PEG). El PEG seleccionado puede ser de cualquier peso molecular conveniente, y puede ser lineal o ramificado, y se puede conjugar 10 opcionalmente a traves de un enlazador. El peso molecular medio del PEG variara preferiblemente entre aproximadamente 2 kiloDalton (kDa) a aproximadamente 100 kDa, mas preferiblemente entre aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 40 kDa. Como alternativa, el resto PEG usado puede ser de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 kDa.
15 Los compuestos descritos se pueden conjugar con PEG a traves de un residuo de aminoacido adecuado ubicado en cualquier posicion en los compuestos. Los compuestos descritos opcionalmente pueden contener un residuo de aminoacido adicional con el que se conjuga el PEG, incluyendo por ejemplo, un residuo adicional que contiene amina, tal como lisina.
20 Se conoce en la tecnica que los peptidos PEGilados aumentan la semivida en suero del peptido conjugado. Se conocen en la tecnica una diversidad de metodos para la formacion de los peptidos PEGilados. Por ejemplo, el resto PEG se puede enlazar al extremo amino, el extremo carboxi o a traves de una cadena lateral del peptido revindicado, opcionalmente a traves de la presencia de un grupo de union. En otras realizaciones, el resto PEG se puede enlazar al azufre de un aminoacido que contiene tiol, tal como cistefna, o se puede acoplar a la cadena lateral 25 de un aminoacido que contiene amina, tal como lisina.
Los grupos PEG en general se uniran al compuesto descrito mediante acilacion o alquilacion a traves de un grupo reactivo en el resto PEG (por ejemplo, un aldehfdo, amina, oxima, hidrazina tiol, ester, o un grupo de acido carboxflico), a un grupo reactivo en el compuesto descrito (por ejemplo, un aldehfdo, amina, oxima, hidrazina, ester, 30 acido o grupo tiol), que se pueden ubicar en el extremo amino, el extremo carboxi, o una posicion de cadena lateral del compuesto descrito. Un enfoque para la preparacion de la PEGilacion de peptidos sinteticos consiste en combinar a traves de un enlace conjugado en solucion, un peptido y un resto PEG, teniendo cada uno un grupo funcional que es reactivo el uno hacia el otro. Los peptidos se pueden preparar facilmente utilizando una solucion convencional o tecnicas de sfntesis en fase solida. La conjugacion del peptido y el PEG tfpicamente se realiza en 35 fase acuosa y se puede supervisar mediante HPLC en fase inversa. Los peptidos PEGilados se pueden purificar y caracterizar facilmente, utilizando tecnicas estandar conocidas por un experto en la tecnica.
Una o mas subunidades individuales de los compuestos descritos tambien se pueden modificar con diversos agentes derivatizantes conocidos por reaccionar con cadenas laterales especificas o residuos terminales. Por 40 ejemplo, los residuos de lisinilo y los residuos de amino terminales se pueden hacer reaccionar con anhfdrido succfnico u otros anhfdridos de acido carboxflico similares que invierten la carga del residuo lisinilo o amino. Otros reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, imidoesteres, tales como picolinimidato de metilo; piridoxal; fosfato de piridoxal; cloroborohidruro; acido trinitrobencensulfonico; O-metilisourea; 2,4,-pentandiona; y reaccion catalizada con transaminasa con glioxalato. Los residuos de arginilo se pueden modificar mediante una reaccion con agentes 45 convencionales, tales como fenilglioxal, 2,3-butandiona, 1,2-ciclohexandiona, y ninhidrina.
Ademas, los compuestos descritos se pueden modificar para que incluyan residuos no cationicos que proporcionen residuos inmunogenos utiles para el desarrollo de anticuerpos para mediciones ELISA bioanalfticas, asf como para evaluar la inmunogenicidad. Por ejemplo, los compuestos descritos se pueden modificar mediante la incorporacion 50 de residuos de tirosina y/o glicina. Las modificaciones especificas de residuos de tirosilo son de particular interes para introducir etiquetas espectrales en los residuos de tirosilo. Los ejemplos no limitantes incluyen la reaccion con compuestos de diazonio aromatico o tetranitrometano. Mas comunmente, se utilizan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar derivados de O-acetiltirosilo y 3-nitro, respectivamente.
55 Kits que comprenden los compuestos desvelados
La divulgacion tambien proporciona kits para realizar los regfmenes terapeuticos de la divulgacion. Dichos kits comprenden cantidades eficaces de los compuestos descritos que tienen actividad como un modulador de CaSR, en forma farmaceuticamente aceptable, en solitario o en combinacion con otros agentes, en forma farmaceuticamente
aceptable. Las formas farmaceuticas preferidas incluyen los compuestos descritos en combinacion con una solucion salina esteril, solucion de dextrosa, solucion tamponada, agua esteril, u otro fluido esteril farmaceuticamente aceptable. Como alternativa, la composicion puede incluir un agente antimicrobiano o bacteriostatico. Como alternativa, la composicion se puede liofilizar o desecar. En este caso, el kit puede comprender ademas una solucion 5 farmaceuticamente aceptable, preferiblemente esteril, para formar una solucion con fines de inyeccion. En otra realizacion de la divulgacion, el kit puede comprender ademas una aguja o jeringa, preferiblemente envasada de forma esteril, para inyectar la composicion. En otras realizaciones de la divulgacion, el kit puede comprender ademas un medio de instrucciones para administrar la composicion a un sujeto. El medio de instrucciones puede ser una insercion escrita, una cinta de audio, una cinta audiovisual, o cualquier otro medio para dar instrucciones sobre la 10 administracion de la composicion a un sujeto.
En una realizacion de la divulgacion, el kit comprende (i) un primer recipiente que contiene un compuesto descrito que tiene actividad como un modulador de CaSR; y (ii) medios de instrucciones para su uso. En otra realizacion de la divulgacion, el kit comprende (i) un primer recipiente que contiene un compuesto como se describe en el presente 15 documento, y (ii) un segundo recipiente que contiene un vehfculo farmaceuticamente aceptable para dilucion o reconstitucion.
En otra realizacion de la divulgacion, el kit comprende (i) un primer recipiente que contiene un compuesto descrito que tiene actividad como un modulador del CaSR; (ii) un segundo recipiente que contiene un agente anticalcemico; y 20 (iii) los medios de instrucciones para su uso.
En una realizacion, el agente anticalcemico es un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes de bisfosfonato, agentes terapeuticos para reemplazo hormonal, terapia con vitamina D, analogos de vitamina D, tales como ZEMPLAR™(paricalcitol); CALC IJ EX® (calcitriol), ONE-ALPHA® (alfacalcidol) y HECTOROL®
25 (doxercalciferol), PTH a baja dosis (con o sin estrogeno), y calcitonina.
En aspectos relacionados de la divulgacion, la divulgacion proporciona los artfculos de fabricacion que comprenden el contenido de los kits que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, la divulgacion proporciona un artfculo de fabricacion que comprende una cantidad eficaz de un peptido descrito, en solitario o en combinacion con otros 30 agentes, y los medios de instrucciones que indican el uso para el tratamiento de las enfermedades descritas en el presente documento.
EJEMPLOS
35 Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, los compuestos y metodos descritos en el presente documento. Se pueden realizar diversas modificaciones por el experto sin apartarse del verdadero espfritu y alcance de la materia descrita en el presente documento.
Ejemplo 1
40
Compuestos cationicos con actividad para disminuir la PTH Modelo de insuficiencia renal
45 Un modelo de rata de insuficiencia renal aguda (tambien denominado como el modelo 1K1C) se desarrollo para simular la patologfa del SHPT asociado a una enfermedad renal en etapa terminal. El modelo tiene caracterfsticas patologicas del hiperparatiroidismo asociado a una falta de funcion renal, en especial la elevacion significativa de la PTH en plasma y la reduccion en el calcio serico. El desarrollo de este modelo permitio la caracterizacion adicional de los compuestos descritos en el contexto de un sujeto con disfuncion renal y la PTH elevada. Los niveles de la 50 PTH de valor inicial tfpicos en este modelo eran una media de ~450 pg/ml.
El modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda implico la eliminacion de un rinon seguido de la exposicion del rinon restante a 45 minutos de isquemia y 48 horas de reperfusion. El consiguiente dano por isquemia/reperfusion (I/R) al rinon restante dio como resultado una necrosis significativa e insuficiencia renal. Los niveles de creatinina en suero 55 se elevaron durante mas de 24-48 horas despues del ataque por I/R (datos no mostrados). Tambien debido a la disociacion renal resultante, los niveles totales de la PTH se aumentaron drasticamente a partir de los niveles de lesion por pre-I/R de ~100 pg/ml. 48 horas posteriores a I/R, los niveles de la PTH en plasma se elevaron a ~450 pg/ml (aumento de ~5 veces) y en algunos casos fueron tan altos como ~1200 pg/ml. Este aumento reproducible en la creatinina y la PTH en suero proporciono un modelo robusto que imita la fisiologfa observada en pacientes con
ESRD.
Se ensayo clorhidrato de cinacalcet (SENSIPAR®), un agente calcimimetico aprobado que se utiliza para disminuir la PTH para el tratamiento del SHPT, en el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda. La administracion oral de 5 cinacalcet a 30 mg/kg disminuyo significativamente la PTH en aproximadamente el 50 % hasta 6 horas. Este resultado es consistente con los datos preclfnicos publicados para cinacalcet (Nemeth y col., J. Pharmacol. Exp. Then, 308(2): 627-35 (2004)) y valida que el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda es un modelo adecuado para evaluar la actividad de los calcimimeticos para esta indicacion.
10 El protocolo utilizado en este estudio es como se indica a continuacion. Se adquirieron ratas macho Sprague Dawley en Charles River Laboratories (Hollister, CA; peso de adquisicion solicitado 250-275 g). Para estudios con artfculos de ensayo, los animales se canularon previamente en las venas femoral y yugular para la administracion del farmaco y extracciones de sangre, respectivamente. Los animales se mantuvieron en un entorno con temperatura controlada con un ciclo constante de l2 horas de luz/12 de horas oscuridad y con acceso libre a alimento y agua en todo 15 momento. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de IACUC.
Se indujo anestesia general y se mantuvo mediante inyeccion intraperitoneal (IP) de pentobarbital sodico (5,2 %, 0,4 ml/rata). Para los animales que recibieron 45 minutos de isquemia renal, se administro una inyeccion IP adicional de 20 pentobarbital sodico (5,2 %, 0,1 ml/rata) para mantener el plano anestesico. El muestreo sangufneo para las mediciones de la PTH despues de la administracion de los compuestos en ratas normales se realizo bajo anestesia continua de isoflurano.
Para todo el procedimiento se utilizo una tecnica limpia, aseptica. Despues de que se anestesiaron las ratas, se 25 rasuro el abdomen con maquinilla electrica antes de la operacion y la piel se limpio con una solucion de alcohol al 70 %.
Para los estudios de desarrollo del modelo, la vena femoral izquierda se canulo con un tubo PE-10 para la extraccion de sangre. Ambos rinones se expusieron a traves de una laparotomfa. Se realizo una nefrectomfa derecha despues 30 de que se ligaron el pedfculo renal derecho y la uretra con suturas dobles de seda 2-0. Despues de la confirmacion de la falta de hemorragia en el pedfculo derecho, se secciono cuidadosamente la arteria renal izquierda y se sujeto con un microclip vascular para inducir isquemia global renal izquierda. La isquemia renal se confirmo mediante la observacion de un cambio de color global blanco-gris (blanqueo). La incision abdominal se cubrio temporalmente con gasa para ayudar a mantener la temperatura de los organos abdominales. Despues de 45 minutos, el perfodo 35 designado de la isquemia, el clip se retiro y el flujo de la arteria renal izquierda se considero restaurado tras la observacion de una restauracion global de color rojo. La incision abdominal se cerro en capas con suturas de seda 2-0. Despues, el animal se recupero de la anestesia. Los parametros fisiologicos incluyendo la temperatura corporal (36-37,5 °C) y el peso corporal se midieron a todo lo largo del procedimiento. La temperatura corporal se controlo y se mantuvo utilizando un sistema de retroalimentacion con sonda rectal y almohadillas con calor.
40
Aproximadamente 48 horas despues de la cirugfa 1K1C (lesion por I/R), los animales se dosificaron con diversos compuestos para medir los efectos de la PTH y el calcio en plasma. En la mayorfa de los casos, los artfculos de ensayo se administraron mediante infusion IV (tiempo de infusion 5, 10 o 30 minutos) aunque en algunos estudios los compuestos se administraron mediante bolo IV o inyeccion de bolo subcutaneo (SC). Para la administracion del 45 farmaco y las extracciones de sangre, los animales se anestesiaron con isoflurano.
Se recolectaron periodicamente muestras sangufneas a todo lo largo del curso del estudio. Las muestras sericas se analizaron para los niveles de calcio y las muestras del plasma se analizaron para la PTH. Debido a la variacion de los valores de la PTH de valor inicial para ratas individuales, todos los datos se normalizaron a los niveles de pre- 50 dosificacion (valor inicial). La creatinina serica se midio utilizando un kit disponible comercialmente de BioAssay Systems (Hayward, Ca), catalogo #DICT-500. Los analisis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B. Compuestos de ensayo en modelo de insuficiencia renal 55
Se prepararon compuestos con las siguientes secuencias para el ensayo en el modelo de insuficiencia renal: Ac- crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4), n = 4, Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5), n = 4, Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6), n = 7, Ac-crrrrrrr- NH2 (SEQ ID NO:7), n = 4, y control de solucion salina, n = 2. Los peptidos se administraron a los animales a una dosis de 3 mg/kg mediante una infusion IV de 30 minutos. Antes de la dosificacion, se extrajo una muestra de sangre
para determinar el valor inicial, la concentracion en plasma de la PTH pre-dosificacion. Los resultados se muestran en la figura 1 como se indica a continuacion: Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4, rombos), Ac-crrrrr-NH2 (SEQ ID NO:5, cuadrados), Ac-crrrrrr-NH2(SEQ ID NO:6, triangulos), y Ac-crrrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:7, cuadrados de color blanco).
5 Ejemplo 2
Ensayo celular in vitro en HEK-293 que expresa el receptor detector de calcio humano
Se sembraron celulas 293T de rinon embrionario humano (HEK) en un matraz T25 a 2 millones de celulas por 10 matraz y se dejaron incubar a 37 °C en CO2 al 5 % durante una noche. El dfa despues, estas celulas se transfectaron con el receptor CaSR humano utilizando un reactivo de transfeccion con lipofectamina 2000, 24 horas despues de la transfeccion, las celulas se sembraron en placas de 384 pocillos a 8.000 celulas/pocillo. Los ensayos se llevaron a cabo 48 horas despues del transfeccion. En algunos casos, se determinaron los valores de EC50 al medir la produccion de monofosfato de inositol en las celulas HEK293, transfectadas de forma estable con el 15 receptor detector de calcio humano (vease la Tabla 1).
El medio de cultivo celular se aspiro de los pocillos y se reemplazo con 28 pl de tampon de estimulacion 1x (Hepes 10 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 0,5 mM, KCl 4,2 mM, NaCl 146 mM, glucosa 5,5 mM, LiCl 50 mM pH 7,4). Las celulas se incubaron con los compuestos a diversas concentraciones (1 mM o 300 pM como la mayor y ademas diluciones 20 en serie 1/2 log) a 37 °C durante 1,5 horas antes de terminar la reaccion. La produccion de IP1 se determino en las celulas utilizando el kit Cisbio IP-One (621 PAPEC) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la incubacion con el compuesto se termino al anadir secuencialmente IP1 marcado con D2 y anti-IP1 marcado con criptato en tampon de lisis y al incubar adicionalmente a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las placas se leyeron a 620 nm y 668 nm con excitacion de 314 nm. Como control negativo se utilizaron 293 celulas no 25 transfectadas.
Se determino la proporcion de fluorescencia a 668 nm y 620 nm. Se calcularon las concentraciones de IP1 a partir de curvas estandar (generadas con Graph Pad Prism ver. 4) utilizando concentraciones conocidas de los estandares IP1. Se calcularon los EC50 en base a los valores de la proporcion fluorescente OD(668 nm)/(OD620 nm) utilizando 30 un ajuste de curva de regresion no lineal adecuada en el software Prism.
Los peptidos y conjugados se prepararon mediante qufmica en fase solida a una escala de 0,25 mmol en un sintetizador automatico ABI. El acoplamiento secuencial de los Fmoc-aminoacidos (4 equiv., Anaspec) para la resina Rink-amida (NovaBiochem) se realizo utilizando activacion HBTU/DIEA. El peptido ensamblado se escindio con un 35 coctel de TFA (fenol (5 %), tritsopropilsilano (2,5 %) y agua (2,5 %); 10 ml por gramo de resina) y se aislo mediante precipitacion con dietileter. Despues de la purificacion mediante HPLC C18, el producto final se aislo en la forma de sal de TFA mediante la liofilizacion de fracciones adecuadas, y se caracterizo mediante HPLC (pureza >95 %) y LC- MS (PM confirmado).
40 Ejemplo 3
Administracion in vivo de los compuestos con subunidades cationicas
Los peptidos se administraron por via intravenosa a una dosis de 0,5 mg/kg en ratas normales Sprague Dawley 45 anestesiadas con isoflurano. Un grupo control de ratas se trato con una solucion salina. Se extrajo sangre antes de la dosificacion y cada hora durante 4 horas. Las ratas se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante todo el estudio. La concentracion de la PTH en plasma se midio mediante ELISA, detectando la PTH 1-84 intacta bioactiva (numero de catalogo 60-2700 Immutopics International), y el area bajo la curva acumulativa para la AUC se calculo para los puntos de datos inclusivos de 1-4 horas. La reduccion porcentual de la PTH se calculo de acuerdo con la
50 siguiente formula: AUCcomp. tratado/AUCcontrol de solucion salina 10°.
Ejemplo 4
Estudios de la relacion estructura-actividad: Actividad in vivo 55
Los peptidos probados identificados en el presente documento como la SEQ ID NO:26 (Ac-carrrar-NH2) y como la SEQ ID NO:29 (Ac-arrrar-NH2) se ensayaron in vitro utilizando las celulas transfectadas HEK293 CaSR, de acuerdo con el procedimiento en el Ejemplo 2. Los peptidos tambien se ensayaron in vivo, mediante administracion como un bolo IV a ratas normales Sprague Dawley a dosis de 9 mg/kg para la SEQ ID NO:29 y a 0,5 mg/kg para la SEQ ID
NO:26. Como un control se utilizo un bolo intravenoso (IV) de solucion salina. Los niveles de la PTH en plasma (K2EDTA) se valoraron antes de la dosificacion y 1, 2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion. Las ratas se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante todo el estudio. Los resultados se muestran en las figuras 2A-2B, se presentan como promedio de grupo ± desviacion estandar (DE). En la figura 2B, la PTH se muestra como el 5 porcentaje del valor pre-dosis del valor inicial.
Ejemplo 5
Estudios de la relacion estructura-actividad: Subunidades de D y L-aminoacidos
10
Se preparo una serie de compuestos que tenfan un residuo de L-aminoacido sustituido por un residuo de D- aminoacido. Los compuestos se administraron como un bolo IV a ratas normales Sprague Dawley a una dosis de 0,5 mg/kg. Como un control se utilizo un bolo intravenoso (IV) de solucion salina. Los niveles de la PTH en plasma (K2EDTA) se valoraron antes de la dosificacion al, 1,2, 3 y 4 horas despues de la dosificacion, y se calculo la AUC 15 como se ha descrito anteriormente. Las ratas se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante todo el estudio. Los resultados se muestran en la Tabla 4 anterior.
Ejemplo 6
20 Estudios de la relacion estructura-actividad: Liberacion de histamina
Para evaluar la carga neta positiva sobre la liberacion de histamina asociada a un compuesto, se generaron peptidos que contenfan de 4 a 7 residuos cationicos (arginina) y se ensayaron para determinar su capacidad para provocar la liberacion de histamina in vivo. Los peptidos probados incluyeron (i) Ac-crrrr-NH2 (SEQ ID NO:4), (ii) Ac-crrrrr-NH2 25 (SEQ ID NO:5), (iii) Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) y (iv) Ac-crrrrrrrr-NH2; SEQ ID NO:41).
Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley (Charles River) pre-canuladas en las venas femoral y yugular para la infusion del farmaco y extracciones de sangre, respectivamente. Todos los tratamientos con el farmaco IV se realizaron bajo anestesia (isoflurano). Los animales se dosificaron mediante un empuje IV de 1 minuto en un 30 volumen total de 0,5 ml. Se extrajeron muestras de sangre 5, 15 y 30 minutos despues del bolo IV para generar muestras en plasma (K2EDTA) para analisis de histamina. Durante los 30 minutos de los estudios de infusion IV, se extrajo una muestra al termino de la infusion. En algunos casos, se utilizaron ratas en el modelo 1K1C de isquemia renal aguda.
35 Se inyecto un volumen igual de solucion salina despues de cada extraccion de sangre para reemplazar el volumen perdido. Se extrajeron aproximadamente 0,2 ml de sangre en cada punto de tiempo utilizando jeringas pre- recubiertas con eDtA para facilitar la recoleccion de suero.
Los ELISA para histamina se realizaron en plasma diluido utilizando el kit para inmunoensayo de la enzima de 40 histamina (EiA) (Cat #A05890, SPI-BIO, Montigny le Bretonneux, Francia). El kit de EIA de histamina es un inmunoensayo de enzimas competitivo amplificado por derivacion que detecta la histamina en una variacion de 40 pg/ml hasta 5.500 pg/ml. Las muestras se analizaron por duplicado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Los peptidos liofilizados (sales de TFA) se pesaron y la masa registrada se ajusto para el contenido de peptido. Las 45 soluciones se prepararon al disolver el material en solucion salina normal para generar la concentracion deseada de peptidos. En algunos casos, la molaridad del peptido se ajusto para permitir una comparacion entre peptidos. Los peptidos se administraron mediante bolo IV a una dosis equivalente sobre una base por mol como la SEQ ID NO:41 (es decir, 0,7 pmol/rata) mediante un bolo IV de 1 minuto y se midio la histamina en plasma antes de la dosificacion (pre-dosis), 5, 15 y 30 minutos despues de la dosificacion. Los datos se presentan como promedios de grupo (n = 2) 50 ± DE. La liberacion de histamina se muestra como un cambio de veces de los niveles de pre-dosis (valor inicial). Los resultados se muestran en el figura 3. Los datos se presentan como promedios de grupo (n = 2) ± DE.
Ejemplo 7
55 Estudios de la relacion estructura-actividad: Liberacion de histamina
Para la evaluacion in vitro de la liberacion de histamina, se aislaron mastocitos perifoneales de ratas aisladas realizando un lavado peritoneal utilizando HBSS frfo + HEPES 25 mm pH 7,4 que contenfa heparina (5 u/ml). Las
celulas se lavaron dos veces en tampon de estimulacion (HBSS + HEPES 25 mM pH 7,4) y se incubaron con 10 pM del compuesto en tampon de estimulacion (HBSS + HEPES 25 mM pH 7,4) durante 15 minutos en una placa de 96 pocillos (106/pocillo) a 37 °C. El sobrenadante celular se analizo para determinar la histamina utilizando el kit de EIA (Cayman #589651). Los datos se muestran en la Tabla 10.
5
Para la evaluacion in vivo de la liberacion de histamina, los compuestos se dosificaron en ratas normales anestesiadas con isoflurano a 2 mg/kg mediante bolo IV (administrado durante menos de un minuto). La histamina en plasma se midio 5 minutos despues de la administracion del compuesto (Cayman para histamina EIA #589651). Los datos se muestran en la Tabla 11.
10
Las abreviaturas utilizadas en el presente documento, y en particular en las Tablas 10-11, se resumen aquf.
Ahx
acido 6-aminohexanoico
Aib
acido 2-aminoisobutfrico
bAla
beta-alanina (acido 3-aminopropionico)
dHcy
D-homocistefna
dNIe
D-norleucina
dNva
D-norvalina
dPen
D-penicilamina
EG
separador de etilenglicol, H2N-(CH2CH2-O)4-CH2-CO2H
Hcy
homocistefna
Mpa
acido 3-mercaptopropionico o acido mercaptopropionico
Nma
N-metilalanina
PEG
poli(etilenglicol)
Sar
Sarcosina (N-metilglicina)
dHar
D-homoarginina
GS
Glutation (coniugado)
DAP
acido 1,3-diaminopropionico
Ejemplo 8
15
Estudios de la relacion estructura-actividad: Actividad in vivo
En el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se preparo para comparacion con el compuesto Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26). En el compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2(SEQ ID NO:3) la subunidad que contiene tiol en la posicion X1 20 se conjugo a traves de un enlace disulfuro a un residuo L-Cys. Los dos compuestos se administraron a traves del bolo IV a animales con el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda a dosis de 0,3 y 0,5 mg/kg. Los niveles en plasma de la PTH se evaluaron antes de la dosificacion y periodicamente durante 24 horas despues de la dosificacion. Los resultados se muestran en la figura 10, donde los datos mostrados son los promedios de grupo ± SEM donde en funcion del tiempo, en horas, en ratas con el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda, el 25 compuesto Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) se representa por cuadrados (0,3 mg/kg, n = 5) y los sfmbolos * (0,5 mg/kg, n = 6) y el compuesto Ac-c(Ac-C)arrrar-NH2 (SEQ ID No:141) por triangulos (0,3 mg/kg, n = 8) y rombos (0,5 mg/kg, n = 7).
Ejemplo 9
30
Suministro transdermico facilitado por microporos de agentes calcimimeticos
Para evaluar la administracion sistemica de un agente calcimimetico, se administro por via transdermica Ac-crrrrrr- NH2 (SEQ ID NO:6) a ratas CD sin pelo utilizando un deposito. Se aplico Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) como una 35 solucion al 10 % en solucion salina a una zona de aproximadamente 1 cm2 sobre la espalda de las ratas sin pelo CD® a las que se les practico microporacion con 5 pasos de un rodillo dermico de 1,0 mm a presion moderada. Se pego una camara de poliestireno (D.I. 9,5 mm) sobre la zona de la piel con microporos para crear un deposito para farmacos en el que se aplicaron Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) o una solucion salina. Se administro una solucion al 10 % de Ac-crrrrrr-NH2 (SEQ ID NO:6) en la camara del deposito en dos ratas, se administro una solucion salina en 40 solitario en la camara del deposito en una rata. Los depositos se cubrieron con cinta para evitar la evaporacion. Se realizaron extracciones de sangre durante un periodo de 4 horas y el plasma se analizo para los niveles de la PTH mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 11.
Ejemplo 10
Administracion sostenida de agentes calcimimeticos mediante parche transdermico facilitado por microporo 5
Para evaluar adicionalmente la administracion sistemica de un agente calcimimetico, se administro por via transdermica Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) a ratas normales utilizando un parche transdermico. Ratas normales se trataron con una disposicion de microaguja y un sistema de parches transdermicos. Un area pequena de pelo en la espalda de ratas Sprague Dawley (~350 g) se rasuro utilizando maquinillas y en una zona de la piel se practico 10 microporacion utilizando una matriz de 14 x 14 (~1 cm2) de microagujas (~0,5 mm). Un sistema de parches transdermicos que contenfan una solucion al 10 % (en peso) de Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) en solucion salina se coloco sobre el area con microporos y se dejo en el lugar durante ~30 horas. Se tomaron extracciones de sangre de las ratas periodicamente durante las 30 horas y se analizaron las muestras de plasma para los niveles de la PTH mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 12.
15
Ejemplo 11
Infusion de agentes calcimimeticos
20 Para evaluar adicionalmente el efecto de disminucion de la PTH del compuesto calcimimetico, se administro Ac- c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:3) mediante infusion IV a dosis muy bajas a ratas normales y a ratas con insuficiencia renal para identificar la menor dosis necesaria a administrar mediante infusion, sistema de parches transdermicos u otros medios de administracion sostenida para conseguir una reduccion significativa de la PTH. A ratas macho normales Sprague-Dawley (250-300 g) se les infundio por via intravenosa durante 6 horas Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ 25 ID NO:3) a velocidades de dosis de 1 pg/kg/h, 3 pg/kg/h y 10 pg/kg/h. Se extrajeron muestras de sangre antes de la dosificacion, en 2 horas, 4 horas, 6 horas (justo antes del final de la infusion; EOI) y 8 horas (2 horas despues de la EOI) y el plasma se analizo para determinar los niveles de la PTH mediante ELISA. Los datos se muestran en la figura 13, donde las ratas tratadas con 1 pg/kg/h (cuadrados), 3 pg/kg/h (rombos), y 10 pg/kg/h (triangulos) durante 6 horas fueron capaces de producir una reduccion significativa en la PTH a partir del valor inicial durante el transcurso 30 de la infusion.
Se realizo un estudio similar en ratas con el modelo 1K1C de insuficiencia renal aguda. A las ratas del modelo 1K1C se les infundio por via intravenosa Ac-c(C)arrrar-NH2 (SEQ ID NO:273 a velocidades de dosis de 30 pg/kg/h y 100 pg/kg/h durante 6 horas. Se extrajeron muestras sangufneas para dosificacion (Pre), en 2 horas, 4 horas, 6 horas 35 (justo antes del termino de la infusion; EOI), 8 horas (2 horas despues de la EOI) y 24 horas y el plasma se analizo para determinar los niveles de la PTH mediante ELISA. Los datos se muestran en la figura 14A (30 pg/kg/h, rombos, y 100 pg/kg/h, cuadrados), y el calcio serico para los animales se muestra en la figura 14B.
LISTA DE SECUENCIAS
40
<110> Karim, Felix Baruch, Amos Maclean, Derek
45 <120> Agentes terapeuticos para reducir los niveles de hormona paratiroidea
<130> 63200.8017.WO00
<140> Aun no asignado 50 <141 > Presentado con la presente
<150> US 61/229.695 <151> 2009-07-29
55 <150> US 61/255.816 <151> 2009-10-28
<160> 183
5
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1 <211>7 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> peptido sintetico
15
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(7)
<223> Xaa = cualquier aminoacido como se define en la memoria descriptiva presentada con la presente
20
<400> 1
xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa
1 S
25 <210>2 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
35 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
40 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
45 <223> Xaa = D-Arg
<400> 2
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210>3 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
30
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
40
<400> 3
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa 1 5
45 <210>4 <211> 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico 5 <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(5)
<223> Xaa = D-Arg
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (5)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400>4
xaa Xaa xaa Xaa Xaa
1 5
<210>5 30 <211> 6 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
40 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)..(6)
50 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)
<223> Amidacion C-terminal
5
<400>5
Xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa i 5
10 <210>6 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 20 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD...RES 25 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (2)..(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 35 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 6
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 40 1 '
<210>7 <211>8 <212> PRT
45 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
5
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
10
<220>
<221> VARIANT <222> (2)..(8)
<223> xaa = D-Arg
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)
<223> Amidacion C-terminal 20 <400>7
xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa 1 5
<210>8 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
30 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
35 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
40 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)..(2)
45 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(7)
50 <223> xaa = D-Arg
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 5 <400>8
xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa 1 5
<210>9 10 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
20 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
25 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)..(2)
30 <223> xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (3)..(3)
35 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(7)
40 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
45 <223> Amidacion C-terminal <400> 9
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
I 5
<210> 10 <211>7 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
10 <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
25 <220>
<221> VARIANT <222> (4)..(4)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 10
xaa xaa xaa Xdd xaa xaa xaa
I 5
40 <210> 11 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
5 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(4), (6)...(7)
10 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (5)..(5)
15 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
20 <223> Amidacion C-terminal <400> 11
xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa Xaa
1 5
25
<210> 12 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
35 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
40 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
45 <221 > VARIANT <222> (2)...(5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
50 <221 > VARIANT <222> (6)..(6)
<223> Xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES 5 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 12
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
10
<210> 13 <211>7 <212> PRT
15 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
20 <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
25 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
30 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(6)
<223> Xaa = D-Arg <221> VARIANT 35 <222> (7)..(7)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 13
<210> 14 <211>7 <212> PRT
xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa
1 5
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
5
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (6)
<223> Xaa = D-Arg
20
<220>
<221> VARIANT <222> (4), (7)
<223> Xaa = D-Ala
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
30
<400> 14
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 1 5
35 <210> 15 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 40 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 45 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 50 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (4)
<223> Xaa = D-Ala
5
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (5) (6), (7)
<223> Xaa = D-Arg
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
15
<400> 15
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 $
20 <210> 16 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 25 <220>
<223> peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 30 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 35 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 40 <222> (2), (5)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 45 <222> (3), (4), (6), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 50 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 16
xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa
1 5
5 <210> 17 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 15 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 25 <222> (2), (3), (6), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (4), (5)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES 35 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 17
40
<210> 18 <211>7 <212> PRT
45 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<220>
5 <221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
10 <221 > VARIANT <222> (2), (4), (6), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
15 <221 > VARIANT <222> (3), (5)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
20 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 18
25
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa I 5
<210> 19 <211>7 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
35
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (7)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
5 <221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 19
10
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 20 <211>7 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
20
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> xaa = D-Cys
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
30
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (4), (5), (6)
<223> Xaa = D-Arg
35
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (7)
<223> Xaa = D-Ala
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
45
<400> 20
xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa 1 5
50 <210> 21 <211>7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
10 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
15 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (4), (7)
20 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (5), (6)
25 <223> xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
30 <223> Amidacion C-terminal <400> 21
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
35
<210> 22 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
45 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> xaa = D-Cys
<220>
50 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 5 <222> (2)...(3)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (4)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 15 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 22
Xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa 1 5
20
<210> 23 <211>7 <212> PRT
25 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
30 <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
35 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
40 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
45 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<400> 23
5
Xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa
1 5
<210> 24 <211>7 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
15
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (5), (6), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4)
<223> Xaa = D-Ala
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 40
<400> 24
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa 1 5
45 <210> 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 50 <220>
<223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
5 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
10 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
15 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (4), (6)
20 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
25 <223> Amidacion C-terminal <400> 25
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa 1 5
30
<210> 26 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
35
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
40 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
45 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
50 <221 > VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
5 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
10 <223> Amidacion C-terminal <400> 26
xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa
1 5
15
<210> 27 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
30 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
35 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2), (6)
<223> xaa = D-Ala
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
<220>
50 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 27
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 28 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
15 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
20 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
25 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys <220>
30 <221 > VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
35 <221 > VARIANT <222> (4), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
40 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 28
xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa 1 S
<210> 29 <211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1), (5)
10 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
15 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (4), (6)
20 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
25 <223> Amidacion C-terminal <400> 29
xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
30
<210> 30 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
35
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
40 <221 > VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = bAla
<220>
45 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
50 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> xaa = D-Cys <220>
<221> VARIANT 5 <222> (3)...(8)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 10 <222> (8)
<223> Amidacion C-terminal <400> no
Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa
<210> 31 <211> 7 <212> PRT
20 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
25 <220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1) ^
<223> Xaa = Acido 3-mercaptopropionico
30 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
35 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 40 <400> 31
xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa I S
<210> 32 45 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
50 <223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Homocisteina
5
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
10
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 32
xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa 1 5
25 <210> 33 <211> aa <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Peptido sintetico
35
<220>
<221> VARIANT <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-penicilamina
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 45 <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 50 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 33
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 15 <222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> DISULFID 25 <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro intercatenario Cys-Cys <220>
<221> VARIANT 30 <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 35 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 34
45
<210> 35 <211>7 <212> PRT
50 <213> Secuencia artificial
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
5 <221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
10 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys <220>
15 <221 > VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
20 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
25 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 35
30
Cys xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa
1 5
<210> 36 <211> 7 35 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> peptido sintetico 40
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
45
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
50
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys
5 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
10 <220>
<221> VARIANT <222> (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 36
Xaa xaa Arg xaa xaa Xaa Xaa
1 5
25 <210> 37 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Peptido sintetico
35
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
5
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
10
<400> 37
xaa xaa Xaa Arg xaa xaa Xaa
1 5
15 <210> 38 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys
<220>
<221> VARIANT 40 <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 45 <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 50 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 38
xaa xaa xaa xaa Arq Xaa xaa
3. 5
<210> 39 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
15 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
20 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
25 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys <220>
30 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
35 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
40 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
xaa Xaa xaa xaa xaa Ala xaa
X 5
45
<210> 40 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
5 <221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
10 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
15 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace disulfuro Cys-Cys a Cys <220>
20 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
25 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
30 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 40
35
xaa xaa xaa xaa xaa xaa Arg
1 5
<210> 41 <211> 9 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> peptido sintetico 45
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
50
<220>
<221> MOD RES
<222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
5 <221> VARIANT <222> (2)...(9)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
10 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 41
15
Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa I 5
<210> 42 <211>7 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg 40
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
45
<400> 42
xaa Gly xaa xaa xaa Gly xaa I 5
<211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 10 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 20 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 25 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 43
xaa Ala xaa xaa Xaa Ala xaa 1 5
30
<210> 44 <211>7 <212> PRT
35 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Arg
50 <220>
<221> VARIANT
<222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
5 <221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 44
10
Cvs xaa Arg xaa Arg xaa Arg
<210> 45 <211> 9 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
20
<400> 45
Cys His asp Ala Pro lie Gly Tyr Asp
15 '
25 <210> 46 <211> 9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 46
35
Cys Pro Asp Tyr His Asp Ala Gly lie
i 5
<210> 47 <211> 12 <212> PRT
40 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
45 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12)
5 <223> Amidacion C-terminal
<400> 47
Cys ryr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10
10
<210> 48 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
20 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
25 <221 > MOD_RES <222> (11)..(11)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 48
30
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5 10
<210> 49 <211> 8 35 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 40
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
45
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (4), (5)
5 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (6), (7), (8)
10 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)
15 <223> Amidacion C-terminal <400> 49
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
20
<210> 50 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Tyr <220>
45 <221 > VARIANT <222> (3)
<223> Xaa = D-Gly <220>
50 <221 > VARIANT
<222> (4), (7), (8), (10), (11), (12)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (5), (6)
5 <223> Xaa = D-Lys
<220>
<221> VARIANT <222> (9)
10 <223> Xaa = D-Gln <220>
<221> MOD_RES <222> (12)
15 <223> Amidacion C-terminal <400> 50
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 15 10
20
<210> 51 <211> aa <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 51
50
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 52 <211> 7 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
10 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
25 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 52
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 53 40 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
50 <223> Xaa = D-Cys <220>
5 <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a Glutation
10 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 20 <400> 53
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 S
<210> 54 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
30 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
35 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
40 <223> Disulfuro Cys-Cys unido a Glutation <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
45 <223> Xaa = D-Arg
<400> 54
xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 55
<211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 10 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a Glutation acetilado
<220>
<221> VARIANT 25 <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 35 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 55
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
<210> 56 <211> 7 <212> PRT
45 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
<220>
<221> MOD_RES 5 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> DISULFID 10 <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a acido 3-mercaptopropi6nico <220>
<221> VARIANT 15 <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 20 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 25 <222> (7)
<223> Amidaci6n C-terminal <400> 56
30
<210> 57 <211>7 <212> PRT
35 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
40 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
45 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 S
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a polietilenglicol
<220>
<221> VARIANT 5 <222> (2), (6)
<223> xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 15 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 57
20
<210> 58 <211>7 <212> PRT
25 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
30 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
35 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
40 <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a polietilenglicol
45 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<223> Xaa = D-Arg <220>
<221> MOD_RES 5 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 58
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 IT
<210> 59 <211>7 <212> PRT
15 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
20 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
25 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
30 <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a polietilenglicol
35 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 45 <400> 59
Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa
1 5
<210> 60 50 <211> 7 <212> PRT
<220>
<223> Peptido sintetico
5
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a Cys
20
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
25
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 60
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa
1 5
40 <210> 61 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)
<223> Xaa = bala
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Cys
10
<220>
<221> DISULFID <222> (2)..(2)
<223> Disulfuro Cys-Cys unido a Cys
15
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (7)
<223> Xaa = D-Ala
20
<220>
<221> VARIANT <222> (4), (5), (6), (8)
<223> Xaa = D-Arg 25
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
30
<400> 61
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 1 5
35 <210> 62 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 40 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 45 <222> (1)
<223> Xaa = bAla
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (2)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> DISULFID <222> (2)..(2)
5 <223> Disulfuro Cys-Cys unido a Cys <220>
<221> VARIANT <222> (3), (7)
10 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (4), (5), (6), (8)
15 <223> Xaa = D-Arg <400> 62
Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
20 <210> 63 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Peptido sintetico
30
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 40 <222> (3), (4), (5), (7) <223> Xaa = D-Arg
<400> 63
Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly xaa 45 1 '
<210> 64 <211>7 <212> PRT
50 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
5 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
20 <400> 64
X33 Ala xaa Xaa Xaa Ala Xaa
I 5
<210> 65 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
30 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
35 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
40 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
45 <223> Xaa = D-val
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
50 <223> Xaa = D-Arg
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 5 <400> 65
Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 66 10 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
20 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
25 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
30 <223> Xaa = D-val
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
35 <223> Xaa = D-Arg
<400> 66
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
I 5
40
<210> 67 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
45
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
50 <221 > VARIANT
<222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
5 <221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
10 <221 > VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
15 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 67
20
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa 1 5
<210> 68 <211> 7 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
30
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
40
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
45
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Glu 5 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 10 <400> 68
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 69 15 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
20 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
25 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
30 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
35 <223> Xaa = D-Glu <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
40 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
45 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
50 <223> Amidacion C-terminal
Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
5 <210> 70 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 15 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 25 <222> (2), 6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (3), (4), (5)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 35 <222> (7)
<223> Xaa = D-Lys
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 70
<210> 71 <211> 7 <212> PRT
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
I 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
5
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Glu
20
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
25
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 71
Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa
X 5
40 <210> 72 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
10
<220>
<221> VARIANT <222> (3)
<223> Xaa = D-Lys
15
<220>
<221> VARIANT <222> (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
25
<400> 72
Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa 1 S
30 <210> 73 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Peptido sintetico
40
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
45
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
5 <223> xaa = D-Lys <220>
<221> VARIANT <222> (3), (5), (7)
10 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
15 <223> Amidacion C-terminal <400> 73
xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa
1 5
20
<210> 74 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
50 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 75 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
15 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
20 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400> 75
Cys Ala Arg Arg Arg Ala Arg
1 5
<210> 76 30 <211> 9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
40 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3)
50 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(9)
5 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (9)
10 <223> Amidacion C-terminal <400> 76
xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa
1 5
15
<210> 77 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa == D-Cys <220>
30 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
35 <221 > VARIANT <222> (2), (3), (4)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
40 <221 > VARIANT <222> (5)...(10)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > MOD_RES <222> (10)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 77
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 78 <211>9 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (4), (6), (8)
<223> xaa = D-Ala
25
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (5), (7), (9)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (9)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 78
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
40 <210> 79 <211> 9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 5 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (2), (6), (8)
<223> xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 15 <222> (3), (4), (5), (7), (9) <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (9)
<223> Amidacion C-terminal <400> 79
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 25 ■=
<210> 80 <211>7 <212> PRT
30 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
35 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> xaa = D-Arg
45 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 50 <400> 80
Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa 1 S
<210> 81 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace intercatenario Cys-Cys con benzoilo
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 81
Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa
1 5
40 <210> 82 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
5 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
10 <223> Enlace intercatenario Cys-Cys con acetilo <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
15 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
20 <223> Amidacion C-terminal <400> 82
xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa 1 5
25
<210> 83 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
35 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
40 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
45 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<223> Xaa = D-Arg <220>
<221> VARIANT 5 <222> (6)
<223> xaa = D-Phe
<220>
<221> MOD_RES 10 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 83
15
<210> 84 <211> 7 <212> PRT
20 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
25 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> xaa = D-Ala
40 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
45 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> xaa = D-Ile
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 84
5
xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 85 <211>7 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
15
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
30
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
35
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Leu
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 85
xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
.1 5
<210> 86 <211 > 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 5
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
10 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
15 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
20 <221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
25 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
30 <221> VARIANT <222> (5)
<223> Xaa = D-Lys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal,
<400> 86 40
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
1 5
<210> 87 45 <211>7 <212> PRT
<21B> Secuencia artificial <220>
50 <223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
5
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
10
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
15
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
20
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Val
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
30
<400> 87
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa
1 5
35 <210> 88 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Peptido sintetico
45
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
5
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
10
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> xaa = D-Pro 15
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 88
Xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa
1 5
25 <210> 89 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Peptido sintetico
35
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (3), (4), (5), (7) <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
5 <223> Xaa = D-His <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
10 <223> Amidacion C-terminal <400> 89
xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
15
<210> 90 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
30 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
35 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
40 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Gln <220>
50 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 90
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 91 <211>7 <212> PRT
10 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
15 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
35 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Thr
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 45 <400> 91
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 92 50 <211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
10 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
15 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
20 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
25 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
30 <223> Xaa = D-Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
35 <223> Amidacion C-terminal <400> 92
Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa 1 5
40
<210> 93 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
45
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
50 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES 5 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (2)
<223> xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 15 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 93
25
<210> 94 <211> 7 <212> PRT
30 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
35 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Gle
50 <220>
<221> VARIANT
xaa xaa xaa xaa xaa Gly Xaa
1 5
<220>
5 <221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
10 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 94
15
Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 95 <211>7 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg 40
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
45
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 95
xaa Gly xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 96 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion terminal
20
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ile
25
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
40
<400> 96
xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa
1 S
45 <210> 97 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
5 <221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
10 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
15 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Pro <220>
20 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
<220>
25 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
30 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal,
<400> 97
35
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 98 <211>7 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 45
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
50
5 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Leu
10 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
15 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400> 98
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 5
<210> 99 30 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
40 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
50 <223> Xaa = D-Gln
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
5
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
15
<400> 99
xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa
l 5
20 <210> 100 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Peptido sintetico
30
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
40
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Thr
<220>
<221> VARIANT 45 <222> (3), (4), (5), (7) <223> xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES 5 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 100
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
10
<210> 101 <211> 7 <212> PRT
15 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
20 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
25 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
30 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Val
35 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
40 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
45 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 50 <400> 101
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 102 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ser
25
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
40
<400> 102
xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
45 <210> 103 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
5 <221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
10 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
15 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-His
<220>
20 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
25 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
30 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 103
35
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 104 <211> 7 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 45
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
50
5 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Phe
10 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
15 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400> 104
xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa
1 5
<210> 105 30 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
40 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
50 <223> Xaa = D-Arg
5 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 10 <400> 105
xaa Xaa xaa Gly xaa xaa Xaa
:l s
<210> 106 15 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
20 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
25 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
30 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
35 <223> xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
40 <223> Xaa = D-Pro <220>
<221> VARIANT <222> (6)
45 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
50 <223> Amidacion C-terminal
<400> 106
Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
5 <210> 107 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Peptido sintetico
15
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 25 <222> (2), (3), (5), (7) <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (4)
<223> Xaa = D-Glu
35
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 107
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 S
45
<210> 108 <211>7 <212> PRT
50 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> peptido sintetico
5 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
20 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Thr
25 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 108
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa
1 5
<210> 109 40 <211 > 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
50 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
10
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-His
15
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
25
<400> 109
xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa
1 5
30 <210> 110 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Peptido sintetico
40
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
45
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (2), (3), (5), (7) <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
5 <223> Xaa = D-Phe <220>
<221> VARIANT <222> (6)
10 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
15 <223> Amidacion C-terminal <400> 110
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa
1 5
20
<210> 111 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (4)
<223> xaa = D-Ser
<220>
50 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES 5 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 111
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa 1 5
10
<210> 112 <211>7 <212> PRT
15 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
20 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
25 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
30 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
35 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> xaa = D-Gln
40 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
45 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 50 <400> 112
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa I S
<210> 113 <211>7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
25
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Val
30
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
40
<400> 113
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
45 <210> 114 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 50 <220>
<223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT 5 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 10 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 15 <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 20 <222> (4)
<223> Xaa = D-Leu
25
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 114
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
35
<210> 115 <211>7 <212> PRT
40 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
45 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
<222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
5 <221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
10 <221 > VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Ile
<220>
15 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
20 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 115
25
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 S
<210> 116 <211>7 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
35
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)
<223> Xaa = N-metilglicina (sarcosina)
<220>
5 <221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
10 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 116
15
xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa
1 5
<210> 117 <211>7 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
40
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
45
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = N-metilglicina (sarcosina)
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 5 <400> 117
xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 5
<210> 118 10 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
20 <223> xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
25 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
30 <223> Xaa = N-metilalanina (Nma) <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
35 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
40 <223> Amidacion C-terminal <400> 118
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
45
<210> 119 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
5 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
20 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Ala
25 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = N-metilalanina (Nma)
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 119
xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa 1 5
<210> 120 40 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
50 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = acido 2-aminoisobutirico (Aib)
10
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 120
xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa
l 5
25 <210> 121 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 35 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 45 <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (4)
<223> Xaa = M-metilalanina (Nma)
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
5 <223> xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
10 <223> Amidacion C-terminal <400> 121
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa 1 5
15
<210> 122 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
30 <221 > MOD...RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
35 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
40 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = N-metilalanina (Nma)
<220>
50 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 122
xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa 1 5
<210> 123 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
15 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
20 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
25 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = acido 2-aminoisobutirico (Aib)
<220>
30 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
35 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
40 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 123
45
Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 124 <211> 7 50 <212> PRT
<220>
<223> Peptido sintetico
5
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
20
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
25
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = acido 2-aminoisobutirico (Aib)
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
35
<400> 124
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
40 <210> 125 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 50 <222> (1)
<220>
<221> MOD_RES 5 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (2), (6)
<223> Xaa = N-metilglicina (sarcosina) <220>
<221> VARIANT 15 <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 125
xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa
1 S
25
<210> 126 <211>7 <212> PRT
30 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
35 <220>
<221> VARIANT Cys
<220>
40 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
45 <221 > VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
50 <221 > VARIANT
<222> (4)
<223> xaa = D-Ala
<220>
5 <221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = N-metilglicina (sarcosina)
<220>
10 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 126
15
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 127 <211>7 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = N-metilalanina (Nma) 40
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
45
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
50
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 5 <400> 127
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 S
<210> 128 10 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
20 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
25 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
30 <223> Xaa = N-metilglicina (sarcosina) <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
35 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
40 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
45 <223> Amidacion C-terminal <400> 128
xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 129 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
10 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
15 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
20 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
25 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
<220>
30 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = Norleucina (NLeu)
<220>
35 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 129
40
xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 5
<210> 130 <211> 7 45 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys 5 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
10 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Norleucina (dNLeu)
15 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400> 130
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 131 30 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
40 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
50 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
5 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
10 <223> Xaa = D-Norvalina (dNval) <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
15 <223> Amidacion C-terminal <400> 131
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 S
20
<210> 132 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
35 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Norvalina (dNval)
<220>
45 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<223> Amidacion C-terminal
<400> 132
5 xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa 1 5
<210> 133 <211>7 <212> PRT
10 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
15 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
35 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Norleucina (dNLeu)
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 45 <400> 133
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 S
<210> 134 50 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
5 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
15 <220>
<221> VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = D-Norleucina (dNLeu)
20 <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
25 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 134
Xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa
1 5
<210> 135 40 <211 > 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
50 <223> Xaa = D-Cys <220>
5 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> xaa = D-Arg
10 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Ala
15 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Norvalina (dNVal)
20 <220>
<221> M0D_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 25 <400> 135
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa
1 5
<210> 136 30 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
40 <223> xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
45 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2)
50 <223> Xaa = D-Norvalina (dNVal) <220>
5 <220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
10 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 15 <400> 136
xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa
1 5
<210> 137 20 <211 > 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
25 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
30 <223> xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
35 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
40 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
45 <223> Xaa = D-Norvalina (dNVal) <220>
<221> VARIANT <222> (6)
50 <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
5
<400> 137
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
10 <210> 138 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Peptido sintetico
20
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> VARIANT 30 <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 35 <222> (4)
<223> Xaa = D-Norleucina (dNLeu)
40
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> M0D_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 138
<210> 139 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace con D-homocisteina (dHcy)
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
30
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
35
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
40
<400> 139
xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 1 5
45 <210> 140 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
50 <223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
5 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
10 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
15 <223> Enlace con acido 3-mercaptopropi6nico (Mpa) <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
20 <223> Xaa = D-Ala <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
25
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidaci6n C-terminal
30
<400> 140
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
35 <210> 141 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 40 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
45 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
50 <223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace con L-cisteina acetilada
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
10
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 141
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 1 S
25 <210> 142 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 35 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
<220>
<221> DISULFID 45 <222> (1)..(1)
<223> Enlace con D-cisteina
<220>
<221> VARIANT 50 <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
5 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
10 <223> Amidacion C-terminal <400> 142
xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa
1 5
15
<210> 143 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> peptido sintetico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
30 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal <220>
35 <221 > DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace con polietilenglicol <220>
40 <221 > VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
45 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 143
<210> 144 <211> 7 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 10 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20 <220>
<221> DISULFID <222> (1)..(1)
<223> Enlace con polietilenglicol
25 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(7)
<223> Xaa = D-Arg
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 144
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 145 40 <211> aa <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <400> 145
cys Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 146 <211> 7 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
10 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
15 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
20 <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(5)
<223> Xaa = D-Arg
25 <220>
<221> VARIANT <222> (6), (7)
<223> Xaa = D-Ala
30 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 35 <400> 146
xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa
i 5
<210> 147 40 <211 > 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
50 <223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
5
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = D-Ala
10
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Lys
15
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
20
<400> 147
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa 1 5
25 <210> 148 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT 35 <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<220>
<221> MOD_RES 40 <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
VARIANT
<222> (2), (4), (6)
<223> Xaa = D-Ala 45
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<400> 148
5
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 149 <211>7 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 15 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
20 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
30 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> xaa = D-Ala
35 <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal 40 <400> 149
xaa Xaa xaa xaa xaa Gly xaa
I 5
<210> 150 45 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
50 <223> Peptido sintetico
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
5 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
10 <223> Acetilacion N-terminal <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
15 <223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (4)
20 <223> xaa = D-Ala <220>
<221> VARIANT <222> (6)
25 <223> Xaa = D-Gln <220>
<221> MOD_RES <222> (7)
30 <223> Amidacion C-terminal <400> 150
xaa xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa
1 5
35
<210> 151 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
45 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
50 <221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<220>
<221> VARIANT 5 <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
<221> VARIANT 10 <222> (4)
<223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> VARIANT 15 <222> (6)
<223> Xaa = D-His
<220>
<221> MOD_RES 20 <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal <400> 151
Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
25
<210> 152 <211> 7 <212> PRT
30 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
35 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
40 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
45 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg
<220>
5 <221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ile
<220>
10 <221 > MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 152
15
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 153 <211>6 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
25
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
30
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
35
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (5)
<223> Xaa = D-Ala
40
<220>
<221> DISULFID <222> (2)..(2)
<223> Enlace con acido 1,3-diaminopropionico (DAP)
45
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (6)
<223> Xaa = D-Arg
50
<221> MOD_RES <222> (6)
<223> Amidacion C-terminal 5 <400> 153
xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa
1 5
<210> 154 10 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
20
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> Acetilacion N-terminal
25
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> xaa = D-Ala
30
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (5)
<223> Xaa = D-Homoarginina
35
<220>
<221> VARIANT <222> (7)
<223> Xaa = D-Arg
40
<220>
<221> MOD_RES <222> (7)
<223> Amidacion C-terminal
<400> 154
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 155 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
10 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico que contiene tiol <220>
15 <221 > VARIANT <222> (2)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico <220>
20 <221 > VARIANT <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico <220>
25 <221 > VARIANT <222> (5)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico cationico <220>
30 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> xaa = un residuo aminoacidico no cationico
<400> 155
35
xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa I 5
<210> 156 <211> 7 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 45 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
<222> (2)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico <220>
5 <221> VARIANT <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico <220>
10 <221 > VARIANT <222> (5)
<223> Xaa = D-Arg, L-Arg, D-Lys o L-Lys <220>
15 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico <400> 156
20
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 157 <211>7 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
30
<220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> xaa = D-Cys
35
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (4)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico 40
<220>
<221> VARIANT <222> (5), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico cationico
45
<220>
<221> VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa 1 5
<210> 158 5 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
10 <223> Peptido sintetico <220>
<221> VARIANT <222> (1)
15 <223> Xaa = D-Cys <220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
20 <223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico <220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (7)
25 <223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico <220>
<221> VARIANT <222> (5)
30 <223> Xaa = D-Arg, L-Arg, D-Lys o L-Lys <400> 158
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
35
<210> 159 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
45 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys <220>
50 <221 > VARIANT
<220>
5 <221> VARIANT <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoaddico cationico <220>
10 <221 > VARIANT <222> (5)
<223> xaa = D-Arg
<220>
15 <221 > VARIANT <222> (6)
<223> Xaa = D-Ala <400> 159
Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa
1 5
20
<210> 160 <211>7 <212> PRT
25 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico
30 <220>
<221> VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = D-Cys
35 <220>
<221> VARIANT <222> (2), (3), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoaddico cationico
40 <220>
<221> VARIANT <222> (4)
<223> Xaa = D-Ala
45 <220>
<221> VARIANT <222> (5)
<223> Xaa = D-Arg
<400> 160
5
xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa
1 5
<210> 162 <211>8 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
15
<400> 162
His Asp Ala Pro lie Gly Tyr Asp 1 5
20 <210> 163 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 163
30
Cys His Asp Ala Pro lie Gly Tyr Asp
I 5
<210> 164 <211> 11 35 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 40
<400> 164
imagen3
166
<211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 5 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 165
10
<210> 166 <211> 11 <212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 20 <400> 166
Cys Ser Phe Asn ser Tyr Glu Leu Gly Ser Leu 15 10
<210> 167 25 <211> 9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
30 <223> Peptido sintetico <400> 167
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg
1 5 10
35
<210> 168 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Peptido sintetico
<400> 168
Cys Pro Asp Tyr His Asp Ala Gly lie
1 5
Cys Glu Ala val ser Leu Lys Pro Thr
1 5
<210> 169 <211>8 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
10
<400> 169
Glu Ser val Ser Leu Lys Pro Thr
1 S
15 <210> 170 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 170
25
Cys Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arq Gin Lys Asn val 1 5 10'
<210> 171 <211> 6 <212> PRT
30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 35 <400> 171
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg
1 S
<210> 172 40 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
45 <223> Peptido sintetico
<400> 172
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg
1 5
5 <210> 173 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 173
15
Tyr Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg
15 10
<210> 174 <211> 12 <212> PRT
20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 25 <400> 174
imagen4
<210> 175 30 <211> 4 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
35 <223> Peptido sintetico <400> 175
Cys Arg Arg Arg 1 '
40
<210> 176 <211> 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 5 <400> 176
Cys Arg Arq Arg Arg
1 ' ' S
<210> 177 10 <211>8 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
15 <223> Peptido sintetico <400> 177
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
20
<210> 178 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Peptido sintetico
<400> 178
30
cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
<210> 179 <211> 10 35 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Peptido sintetico 40
<400> 179
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
15 10
<211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 5 <220>
<223> Peptido sintetico <400> 180
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
10
<210> 181 <211> 12 <212> PRT
15 <213> Secuencia artificial <220>
<223> Peptido sintetico 20 <400> 180
Cys Arg Arg Arg Arg Arcs Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 S 10'
<210> 182 25 <211 > 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
30 <223> Peptido sintetico <400> 182
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
35
<210> 183 <211>7 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
45 <221 > VARIANT <222> (1)
<223> Xaa = L-Cys
<220>
<221> VARIANT <222> (2), (6)
<223> Xaa = un residuo aminoacidico no cationico
5
<220>
<221> VARIANT <222> (3), (4), (7)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoacidico
10
<220>
<221> VARIANT <222> (5)
<223> Xaa = D-Arg, L-Arg, D-Lys o L-Lys
15
<400> 183
xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa
X 5

Claims (10)

1. Un compuesto, que comprende un peptido y un grupo de conjugacion, donde el peptido comprende
una secuencia aminoaddica que tiene la formula:
imagen1
donde
10 Xi es D-cistema;
X2 es D-arginina, D-alanina, D-valina, D-leucina, D-fenilalanina, D-serina, D-glutamina, D-norleucina o D-norvalina;
X3 es D-arginina;
X4 es D-arginina o un aminoacido no cationico, donde X4 no es glicina, porlina o un aminoacido con una cadena lateral acida;
15 X5 es D-arginina;
X6 es D-alanina, D-glicina o D-serina;
X7 es D-arginina;
donde al menos dos de X2, X3 y X4 son independientemente una subunidad cationica; y 20 donde el peptido esta unido en su extremo N al grupo de conjugacion mediante un enlace disulfuro.
2. El compuesto de la reivindicacion 1, donde el compuesto comprende Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25)
o Ac-carrrar-NH2 (SEQ ID NO:26).
25 3. El compuesto de la reivindicacion 1, donde el peptido tiene de 8 a 11, de 8 a 10 o de 8 a 9
aminoacidos de largo.
4. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el grupo de conjugacion se selecciona entre L-cistema, D-cistema, homocistema, glutation, cistema pegilada o un polipeptido
30 que contiene un residuo cistema.
5. El compuesto de la reivindicacion 4, donde el grupo de conjugacion es cistema, donde la cistema es una cistema N-acetilada.
35 6. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, donde el polipeptido que contiene un residuo
cistema tiene la misma secuencia que el peptido.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el compuesto comprende:
Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25)
40
Ac-crrarar-NH2 (SEQ ID NO:25)
o
imagen2
45 8. Un compuesto que consiste en un peptido que comprende la secuencia carrrar (SEQ ID NO:2) y un
grupo de conjugacion, dicho peptido unido por un enlace disulfuro.
9. El compuesto de la reivindicacion 8, donde el peptido esta qufmicamente modificado en el extremo N, el extremo C, o ambos.
10. El compuesto de la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, donde el compuesto es Ac-c(C)arrrar-NH2 5 (SEQ ID NO:3).
11. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el compuesto es Ac- c(C)rrarar-NH2 (SEQ ID NO:28).
10 12. Una composicion que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece hiperparatiroidismo secundario
(SHPT) o un trastorno hipercalcemico.
13. Una composicion que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las
15 reivindicaciones 1 a 11, para su uso en la disminucion de los niveles de hormona paratiroidea en un sujeto.
14. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 12 o 13, que comprende adicionalmente un segundo agente terapeutico que es vitamina D, un analogo de vitamina D o clorhidrato de cinacalcet.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008067199A2 (en) * 2006-11-16 2008-06-05 Kai Pharmaceuticals, Inc. Polycationic calcium modulator peptides for the treatment of hyperparathyroidism and hypercalcemic disorders
PL3192520T3 (pl) 2009-07-29 2019-08-30 Kai Pharmaceuticals, Inc. Środki lecznicze do zmniejszania poziomów parathormonu
EP2543660A4 (en) 2010-03-04 2014-04-30 Ajinomoto Kk PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC ACTIVE AGAINST DIABETES OR ADIPOSITAS
CN102781910B (zh) 2010-03-04 2015-03-11 味之素株式会社 烷基胺衍生物
WO2011118843A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 味の素株式会社 グルタミン酸エステル誘導体又はその塩
EP2554165A4 (en) 2010-04-02 2014-04-30 Ajinomoto Kk PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR DIABETES OR OBESITY
BR112013031539A2 (pt) * 2011-06-08 2019-07-30 Kai Pharmaceuticals Inc agentes terapêuticos para regular fósforo sérico
AU2012335009B2 (en) * 2011-11-10 2017-08-31 Kai Pharmaceuticals, Inc. Calcimimetics and methods for their use
JP2015514771A (ja) * 2012-04-17 2015-05-21 ブラウン ユニバーシティ 神経保護性組成物および使用方法
US20200354428A9 (en) 2013-06-23 2020-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Analogues of parathyroid hormone (1-34) that function as agonists of the parathyroid hormone receptor-1 and display modified activity profiles
CA2916222C (en) 2013-06-28 2021-05-18 Amgen Inc. Stable liquid formulation of amg 416 (etelcalcetide)
DK3126373T3 (da) * 2014-04-03 2020-05-04 Amgen Inc Fremgangsmåde til fremstilling af amg 416
CN105504012A (zh) * 2014-09-30 2016-04-20 深圳翰宇药业股份有限公司 一种多肽的制备方法
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
EP3274360B1 (en) * 2015-03-26 2020-05-06 Amgen Inc. Solution phase method for preparing etelcalcetide
US9336841B1 (en) * 2015-04-16 2016-05-10 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Pipeline register with data alignment therein
CN106928320B (zh) 2015-12-31 2021-01-15 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成Etelcalcetide的方法
CN106928321B (zh) * 2015-12-31 2019-07-26 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成Etelcalcetide的方法
WO2018044468A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation COMBINATION OF LOW DOSE 2-METHYLENE-19-NOR-(20S)-1α, 25-DIHYDROXYVITAMIN D3 AND CALCIMIMETICS TO TREAT SECONDARY HYPERPARATHYROIDISM
US20200261549A1 (en) * 2017-11-07 2020-08-20 Alphacore Pharma Llc Methods of treating and protecting against cardiac disease, cardiovascular disease and related conditions and symptoms
WO2019124411A1 (ja) 2017-12-20 2019-06-27 Ｅａファーマ株式会社 維持透析下の二次性副甲状腺機能亢進症の予防または治療用医薬組成物
KR20210124958A (ko) * 2018-11-02 2021-10-15 앰퍼샌드 바이오파마슈티컬스, 인코포레이티드 국소적으로 적용되는 완충제(buffers)를 사용하는 양이온 과부하 및 전해질 불균형의 위험 가능성 관리를 위한 제형 및 방법
US20220142958A1 (en) 2019-04-03 2022-05-12 Ea Pharma Co., Ltd. Medicinal composition having excellent stability
KR20220110789A (ko) * 2019-12-09 2022-08-09 베이징 투오 지에 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드 칼슘 감지 수용체 효능제 화합물 및 이의 응용
US20230223125A1 (en) * 2020-05-04 2023-07-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Artificial intelligence-based systems and methods for dosing of pharmacologic agents
WO2022052471A1 (zh) * 2020-09-10 2022-03-17 陕西麦科奥特科技有限公司 双特异性融合多肽化合物
US11359134B2 (en) 2020-10-19 2022-06-14 Saudi Arabian Oil Company Treatment fluids and methods for recovering hydrocarbons from a subterranean formation
CN117500820A (zh) * 2021-06-08 2024-02-02 北京拓界生物医药科技有限公司 钙敏感受体激动剂化合物的盐酸盐及药物组合物和其应用
EP4353248A1 (en) * 2021-06-08 2024-04-17 Beijing Tuo Jie Biopharmaceutical Co. Ltd. Calcium-sensing receptor agonist composition and application thereof

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602116A (en) 1988-08-02 1997-02-11 Bone Care International, Inc. Method for treating and preventing secondary hyperparathyroidism
US5869473A (en) 1988-08-02 1999-02-09 Bone Care International, Inc. Method for treating and preventing hyperparathyroidism
CA1333616C (en) 1989-03-09 1994-12-20 Hector F. Deluca 19-nor-vitamin d compounds
US5246925A (en) 1989-03-09 1993-09-21 Wisconsin Alumni Research Foundation 19-nor-vitamin D compounds for use in treating hyperparathyroidism
US5304121A (en) 1990-12-28 1994-04-19 Boston Scientific Corporation Drug delivery system making use of a hydrogel polymer coating
AU9131091A (en) 1990-11-07 1992-06-11 Scripps Research Institute, The Peptides that inhibit platelet binding of adhesion molecules
US6031003A (en) 1991-08-23 2000-02-29 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcium receptor-active molecules
US5814603A (en) * 1992-06-12 1998-09-29 Affymax Technologies N.V. Compounds with PTH activity
US5886026A (en) 1993-07-19 1999-03-23 Angiotech Pharmaceuticals Inc. Anti-angiogenic compositions and methods of use
CA2145214A1 (en) 1995-02-28 1996-08-29 Rick E. Preddie Agents for pre-symptomatic diagnosis, prevention and cure huntington's disease (hd) in humans
US6099562A (en) 1996-06-13 2000-08-08 Schneider (Usa) Inc. Drug coating with topcoat
US5688489A (en) 1995-09-15 1997-11-18 Resolution Pharmaceuticals, Inc. Non-receptor mediated imaging agents
DE69734157T2 (de) 1996-07-31 2006-07-13 The General Hospital Corp., Boston Parathyroidhormon-verwandthe peptidanaloge
US5895368A (en) 1996-09-23 1999-04-20 Medisystems Technology Corporation Blood set priming method and apparatus
WO1998017299A1 (en) 1996-10-18 1998-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isozyme-specific activators of protein kinase c, methods and compositions
WO1998033812A1 (en) 1997-02-05 1998-08-06 Brigham And Women's Hospital, Inc. Mast cell protease peptide inhibitors
UA62967C2 (en) * 1997-05-14 2004-01-15 Aventis Pharm Prod Inc Peptide analogs of parathyroid hormons
GB2341390B (en) * 1997-05-21 2000-11-08 Univ Leland Stanford Junior Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6258774B1 (en) 1998-03-19 2001-07-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Carrier for in vivo delivery of a therapeutic agent
US7399489B2 (en) 1999-01-14 2008-07-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Exendin analog formulations
JP2000336099A (ja) 1999-05-27 2000-12-05 Sekisui Chem Co Ltd ペプチド及びｃ型肝炎抗体検出用試薬
US6051567A (en) 1999-08-02 2000-04-18 Abbott Laboratories Low oxygen content compositions of 1α, 25-dihydroxycholecalciferol
US6274169B1 (en) 1999-08-02 2001-08-14 Abbott Laboratories Low oxygen content compostions of 1α, 25-dihydroxycholecalciferol
US20020068342A1 (en) * 2000-02-09 2002-06-06 Rami Khosravi Novel nucleic acid and amino acid sequences and novel variants of alternative splicing
JP2004504295A (ja) 2000-07-18 2004-02-12 ボーン　ケア　インターナショナル　インコーポレイテッド 安定化１α−ヒドロキシビタミンＤ
DE10041126A1 (de) * 2000-08-22 2002-04-04 Aventis Res & Tech Gmbh & Co DNA-bindende Peptiddomänen und ein Verfahren zur Bereitstellung solcher Domänen
US20080249016A1 (en) * 2000-09-18 2008-10-09 Sanos Bioscience A/S Use of GLP-2 in a combination treatment for bone-related disorders
US20020168354A1 (en) 2000-11-10 2002-11-14 Daria Mochly-Rosen psiepsilonRack peptide composition and method for protection against tissue damage due to ischemia
CA2434643C (en) 2001-01-18 2013-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides for activation and inhibition of.delta.pkc
US20030091640A1 (en) 2001-02-08 2003-05-15 Srinivasan Ramanathan Enhanced oral and transcompartmental delivery of therapeutic or diagnostic agents
US20030036627A1 (en) 2001-02-16 2003-02-20 Montelaro Ronald C. Virus derived antimicrobial peptides
CA2439178C (en) 2001-02-23 2013-06-04 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
US6790833B2 (en) * 2001-08-08 2004-09-14 The Research Foundation Of The State University Of New York Antifungal and antibacterial agents
WO2003013543A1 (en) 2001-08-08 2003-02-20 Genomed, Llc Treatment or prevention of acute renal failure
US7060023B2 (en) 2001-09-25 2006-06-13 The Foundry Inc. Pericardium reinforcing devices and methods of using them
JP2005287302A (ja) 2002-04-03 2005-10-20 Haruhiko Fujiwara ポリペプチドの架橋方法
US20040018976A1 (en) 2002-05-14 2004-01-29 Feder John N. Polynucleotide encoding novel human G-protein coupled receptors, and splice variants thereof
ATE377023T1 (de) 2003-11-05 2007-11-15 Pevion Biotech Ltd Zusammensetzungen, die von melittin abgeleitet sind und peptide enthalten, und verfahren zur potenzierung von immunreaktionen gegen target- antigene
KR20070004571A (ko) 2003-12-11 2007-01-09 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 단백질 키나제 ｃ의 동종효소-특이적 길항제
WO2005072340A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 Compugen Ltd. Novel polynucleotides encoding polypeptides and methods using same
US20060052303A1 (en) * 2004-07-27 2006-03-09 Sampath Kuber T Use of thyrotropin for regeneration of bone
US7265092B2 (en) * 2004-09-30 2007-09-04 Kai Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulation
DE102005013846A1 (de) 2005-03-24 2006-10-05 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
KR100687932B1 (ko) * 2005-08-09 2007-02-27 삼성전자주식회사 영상표시장치 및 영상표시방법
WO2007027510A2 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 Acologix, Inc. Regulation of mineral and skeletal metabolism
WO2008067199A2 (en) * 2006-11-16 2008-06-05 Kai Pharmaceuticals, Inc. Polycationic calcium modulator peptides for the treatment of hyperparathyroidism and hypercalcemic disorders
KR101775929B1 (ko) 2007-01-19 2017-09-07 카이 파마슈티컬즈 안정성 및 전달 효율을 증가시키기 위한 펩타이드 조성물의 변형
EP2197495A2 (en) 2007-10-02 2010-06-23 MDRNA, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
US8716437B2 (en) 2007-12-07 2014-05-06 Steven A. Goldstein Identification of toxin ligands
US20090318351A1 (en) * 2008-03-12 2009-12-24 Kevin Grimes Method of treating acute st-elevation myocardial infarction with a delta pkc antagonist
PL3192520T3 (pl) 2009-07-29 2019-08-30 Kai Pharmaceuticals, Inc. Środki lecznicze do zmniejszania poziomów parathormonu
BR112013031539A2 (pt) 2011-06-08 2019-07-30 Kai Pharmaceuticals Inc agentes terapêuticos para regular fósforo sérico
AU2012335009B2 (en) 2011-11-10 2017-08-31 Kai Pharmaceuticals, Inc. Calcimimetics and methods for their use

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