ES2248853T3 - Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea. - Google Patents

Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea.

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ES2248853T3 ES97935197T ES97935197T ES2248853T3 ES 2248853 T3 ES2248853 T3 ES 2248853T3 ES 97935197 T ES97935197 T ES 97935197T ES 97935197 T ES97935197 T ES 97935197T ES 2248853 T3 ES2248853 T3 ES 2248853T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS ANALOGOS DE PTHRP, TRANSFORMADOS EN AGONISTAS O ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE PTH-2, MEDIANTE LA SUSTITUCION DE UNO O MAS RESIDUOS AMINOACIDOS DE PTHRP POR EL CORRESPONDIENTE RESIDUO O RESIDUOS DE PTH. SE DESCRIBE ASIMISMO UN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DE DIVERSAS ENFERMEDADES ASOCIADAS CON UNA FUNCION ALTERADA DEL RECEPTOR PTH-2, UTILIZANDO DICHOS ANALOGOS DE PTHRP.

Description

Nuevos análogos del péptido relacionado con la hormona paratiroidea.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se relaciona con nuevos análogos del péptido (PTHrP) relacionado con la hormona paratiroidea. En particular, la invención se relaciona con análogos del PTHrP que tienen una o más sustituciones e aminoácidos que le confieren propiedades de antagonista o de antagonista del receptor PTH-2 al análogo.
Descripción del arte relacionado
La hormona paratiroidea (PTH) es un regulador principal de la homeostasis del calcio cuyas células objetivo principales se encuentran en el hueso y en el riñón. La regulación de la concentración de calcio es necesaria para el normal funcionamiento de los sistemas gastrointestinal, esquelético, neurológico, neuromuscular, y cardiovascular. La síntesis y liberación de la PTH se controlan principalmente por medio del nivel de calcio en el suero; un nivel bajo estimula y un nivel alto suprime tanto la síntesis como la liberación. La PTH, a su vez, mantiene el nivel de calcio en el suero promoviendo directa o indirectamente la entrada de calcio en la sangre en tres sitios de intercambio del mismo: intestino, hueso, y riñón. La PTH contribuye ala absorción gastrointestinal neta de calcio, favoreciendo la síntesis renal de la forma activa de la vitamina D. La PTH promueve la reabsorción del calcio por el hueso inhibiendo a los osteoblastos e, indirectamente, estimulando la diferenciación de las células que reabsorben el hueso, los osteoclastos. También media al menos tres principales efectos sobre el riñón: la estimulación de la reabsorción tubular de calcio, el mejoramiento del despeje de fosfato, y la promoción de un incremento en la enzima que completa la síntesis de la forma activa de la vitamina D. La PTH ejerce estos efectos principalmente a través de la activación mediada por el receptor de la adenilato ciclasa, aunque también se ha reportado la activación mediada por el receptor de la fosfolipasa C por la PTH (Hruska y colaboradores, J. Clin. Invest. 79:230 (1987)).
La interrupción de la homeostasis del calcio puede producir muchos desordenes clínicos (por ejemplo., enfermedad severa de los huesos, anemia, deterioro renal, ulceras, miopatía, y neuropatía) y usualmente es el resultado de condiciones que producen una alteración en el nivel de la hormona paratimida. La hipercalcemia es una condición que se caracteriza por una elevación en el nivel de calcio en suero. A menudo se la asocia con hiperparatiroidismo primario en el cual ocurre un exceso de la producción de la PTH como resultado de una lesión (por ejemplo., adenoma, hiperplasia, o carcinoma) de las glándulas paratiroideas. Otro tipo de hipercalcemia, la hipercalcemia humoral maligna (HHM) es el síndrome paraneoplástico más común. Parece que resulta en la mayoría de las instancias por la producción de los tumores (por ejemplo, carcinomas espinales, renales, ováricos, o de vejiga) de una nueva clase de hormona proteínica que comparte homología de aminoácidos con la PTH. Estas proteínas relacionadas con la PTH (PTHrP) parece que imitan ciertas de las acciones renales y esqueletales de la PTH y se cree que interactúan con el receptor de la PTH en estos tejidos. La PTHrP se encuentra normalmente en bajos niveles en muchos tejidos, incluidos los queratinocitos, de cerebro, de pituitaria, paratiroideos, de la corteza adrenal, la medula, hígado fetal, de células como osteoblastos, y de tejidos mamarios para lactancia. En muchas hipercalcemias humorales malignas HHM, el PTHrP se encuentra en el sistema circulatorio en altos niveles, produciendo así los altos niveles de calcio asociados con la
HHM.
Los perfiles farmacológicos de la PTH y del PTHrP son casi idénticos en la mayoría de los sistemas de ensayo in vitro, y los elevados niveles en sangre de la PTH (esto es, hiperparatiroidismo primario) o el PTHrP (esto es, HHM) tienen efectos comparables sobre la homeostasis iónica mineral (Broadus, A.E. & Stewart, A.F., "Parathyroid hormone-related protein: Structure, processing and physiological actions," in Basic and Clinical Concepts, Bilzikian, J.P. y colaboradores, eds., Raven Press, New York (1994), pgs. 259-294; Kronenberg, H.M. y colaboradores, "Parathyroid hormone: Biosynthesis, secretion, chemistry and action," in Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G.R. & Martin, T.J., eds., Springer-Verlag, Heidelberg (1993), pgs. 185-201). La similitud en la actividad biológica de los dos ligandos puede explicarse por su interacción con un receptor común, el receptor del PTH/PTHrP, que se expresa abundantemente en los huesos y el riñón (Urena, P. y colaboradores, Endocrinology 134:451-456 (1994)).
El enlazamiento ya sea de la PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36) radiomarcados con el receptor del PTH/PTHrP, es inhibido competitivamente por cualquier ligando no marcado (Jiippner, H. y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:8557-8560 (1988); Nissenson, R.A. y colaboradores, J.Biol. Chem. 263:12866-12871 (1988)). De este modo, los sitios de reconocimiento para los dos ligandos en el receptor del PTH/PTHrP, probablemente se superpongan. Tanto en la PTH como en el PTHrP, la región 15-34 contiene los determinantes principales para el enlazamiento al receptor del PTH/PTHrP. Aunque estas regiones muestran solamente una mínima homología de secuencia (únicamente 3 identidades de aminoácidos), cada péptido 15-34 puede bloquear el enlazamiento tanto de la PTH-(1-34) como del PTHrP-(1-34) al receptor del PTH/PTHrP (Nussbaum, S. R. y colaboradores, J. Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980); Caulfield, M.P. y colaboradores, Endocrinology 127:83-87 (1990); Abou-Samra, A.-B. y colaboradores, Endocrinology 125:2215-2217 (1989)). Además, se requiere la porción amino-terminal de cada ligando para que haya bioactividad, y estas probablemente interactúen con los receptores del PTH/PTHrP en formas similares, ya que 8 de 13 de estos residuos son idénticos en la PTH y en el PTHrP.
El receptor del PTH/PTHrP es un miembro de una familia distinta de receptores acoplados a la proteína G (Jüppner. H. y colaboradores, Science 254:1024- 1026 (1991); Abou-Samra, A.B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89:2732- 2736 1992)) que incluye receptores para otras hormonas péptidos tales como la secretina (Ishihara, T. y colaboradores, EMBO J. 10:1635-1641 (1991)), calcitonina (Lin, H.Y. y colaboradores, Science 254:1022-1024 (1991)) y glucagón (Jelinek, L.J. y colaboradores, Science 259:1614-1616 (1993)). El uso de oligonucleótidos degenerados correspondientes a las regiones conservadas de la familia de receptores de la PTH/secretina/calcitonina, Usdin y colaboradores han identificado un nuevo cADN receptor derivado de cerebro de rata y de humano que estaba más cercanamente relacionado al receptor de las PTH/PTHrP (51% de identidad total de secuencia de aminoácidos) (Usdin, T. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)). Este nuevo receptor, el receptor PTH-2, respondió eficientemente, en forma potente, y específicamente a la PTH-(1-34), pero de manera interesante, no respondió a todas las PTHrP. Id. Esta observación implicó que las diferencias estructurales en los ligandos de la PTH y del PTHrP determinó la selectividad para la interacción con el receptor de la PTH-2. El receptor de la PTH-2 se encontró predominantemente en el cerebro y en el páncreas. Id.
Ya que el receptor de la PTH-2 se encontró en el cerebro y en el páncreas, es probable que tenga un papel fisiológico en el funcionamiento normal de esos órganos. Las enfermedades asociadas con disfunción cerebral y pancreática, pueden explicarse en realidad por medio de la acción alterada del receptor de la PTH-2. Tales enfermedades pueden tratarse entonces con un antagonista selectivo del receptor de la PTH-2. Otros antagonistas que están disponibles no son selectivos y por eso no son deseables, ya que antagonizarían con el receptor del PTH/PTHrP, lo cual tendría consecuencias negativas en términos de la regulación del calcio y de la función de esqueleto.
Por lo tanto, existe la necesidad en el estado de la técnica por el desarrollo de los agonistas y antagonistas selectivos del receptor de la PTH-2: (1) para ayudar a aclarar más el papel biológico del receptor de la PTH-2; (2) para mapear los sitios específicos de interacción ligando-receptor; y (3) como composiciones nuevas potencialmente terapéuticas que pueden ser utilizadas en el tratamiento de desordenes asociados con la acción alterada o mutación genética del receptor de la PTH-2.
Resumen de la invención
Para empezar a definir los residuos involucrados en la especificidad del ligandos del receptor de la PTH-2, los inventores estudiaron la interacción de diferentes ligandos híbridos del PTH/PTHrP y de otros análogos relacionados con el péptido, con el receptor de la PTH-2 humana. Los resultados mostraron que dos sitios en la PTH y en el PTHrP cuentan completamente para las diferentes fuerzas que exhibieron los dos ligandos con los receptores de la PTH-2; el residuo 5 (His en el PTHrP e Ile en la PTH) determinaron la capacidad de señalización, mientras que el residuo 23 (Phe en el PTHrP y Trp en la PTH) determinaron la afinidad de enlazamiento. Cambiando estos dos residuos del PTHrP (esto es, el residuo 5 y el 23) por los correspondientes residuos de la PTH, los inventores fueron capaces de convertir el PTHrP en un ligando que se enlaza ávidamente al receptor de la PTH-2, y estimula potencial y completamente la formación de cAMP. El cambio del residuo 23 únicamente produjo [Trp^{23}]hPTHrP-(1-36), que era un antagonista para el receptor de la PTH-2, pero un agonista completo para el receptor del PTH/PTHrP. Por lo tanto, los inventores concluyeron que los residuos 5 y 23 en la PTH y en el PTHrP juegan un papel clave en las interacciones de señalización y enlazamiento, respectivamente, con el receptor de la PTH-2.
De esta forma, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que es un potente agonista del receptor de la PTH-2, así como un potente agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos se altera en los residuos aminoácidos 5 y 23. En una modalidad preferida, el análogo del PTHrP se altera en los residuos 5 y 23 de los residuos correspondientes de la PTH. Más preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP que tiene una sustitución de aminoácidos de histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 con las siguientes modificaciones: [Ile5, Trp23]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que es un potente antagonista selectivo del receptor de la PTH-2, así como un agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos se altera en el residuo aminoácido 23. En una modalidad preferida, el análogo se altera en el residuo 23 del PTHrP por el correspondiente residuo de la PTH. Más preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP que tienen una única sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 con la siguiente modificación: [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con aún otro aspecto adicional de la invención, Se provee el uso de un análogo del PTHrP de acuerdo con la invención, suficiente para inhibir la activación del receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar un desorden médico que resulta de la acción excesiva o alterada del receptor de la PTH-2. En una modalidad preferida, el análogo utilizado del PTHrP tiene una única sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con aún un aspecto adicional de la invención, se provee el uso de un análogo del PTHrP de acuerdo con la invención, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y de la PTH-2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoporosis. En una modalidad preferida, el análogo utilizado del PTHrP tiene una sustitución de aminoácido de histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Ile5, Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
Además, cualquier otra sustitución de aminoácidos en las posiciones 5 y/o 23, que no destruyan la habilidad del análogo del PTHrP para antagonizar o agonizar al receptor de la PTH-2 (como se determina por los ensayos conocidos por el operario capacitado y que se discuten más abajo), están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 describe los perfiles de enlazamiento del ligando y de señalización del cAMP de los receptores de las PTH-PTHrP y PTH-2. Las células COS-7 transfectadas con los receptores del PTH/PTHrP humano (Figuras 1A y 1C) o los receptores de la PTH-2 humana (Figuras 1B y 1D) fueron evaluados para la inhibición de enlazamiento del radioligando (Figuras 1A y 1B), o la acumulación de cAMP inducida por el ligando (Figuras 1C y 1D). Los estudios de enlazamiento se llevaron acabo a temperatura ambiente (RT) por 2 horas. Se utilizó ^{125}I-[NleTyr^{8,21}, Tyr^{34}] rPTH-(1-34)NH_{2} (100.000 CPM/pozo) como radioligando y se utilizaron diferentes cantidades de [Tyr^{34}] hPTH-(1-34)NH_{2} no marcado (\bullet) o [Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2} (\sqbullet) como ligandos competidores. Los símbolos se indican en la clave de la figura. La cantidad máxima de trazador que se enlaza específicamente a los receptores del PTH/PTHrP y PTH-2 en ausencia de competidor (B_{0}) fue de \sim25% y \sim5% de la radioactividad total añadida, respectivamente. Para los ensayos de estimulación de cAMP, se trataron las células con ligandos por 1 hora a temperatura ambiente en presencia de IBMX. Lo símbolos en las Figuras 1C y 1D son los mismos que en las Figuras 1A y 1B. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de 3-10 experimentos, cada uno realizado por duplicado.
La Figura 2 describe un análisis de Scatchard del enlazamiento de la PTH-(1-34) a los receptores del PTH/PTHrP o del PTH-2. Las células COS-7 transfectadas con AND de plásmido (200 ng/pozo) que codifican tanto al receptor del PTH/PTHrP humano (Figura 2A) como al receptor de la PTH-2 humana (Figura 2B) fueron evaluadas en estudios de enlazamiento por competición llevados acabo por seis horas a 4ºC. El radioligando fue ^{125}I-[NleTyr^{8,21}, Tyr^{34}]rPTH-(1-34)amida (100.000 CPM/pozo), como trazador, y el ligando competidor fue el mismo péptido no marcado. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de cuatro experimentos, cada uno realizado por duplicado. Los recuadros muestran las gráficas de Scatchard de los puntos de los datos individuales de las porciones lineales de cada experimento. Las constantes de disociación media (kds) y los valores de Bmax, como receptores/célula, derivadas de estos experimentos se muestran más arriba de la sección s. El análisis estadístico indicó que las densidades superficiales de los dos receptores, pero no los valores de Kd, difieren significativamente (valores p = 0.0003, y 0.14, respectivamente, de acuerdo a la prueba t de Student).
La Figura 3 describe las estructuras primarias de la PTH, el PTHrP y de los ligandos híbridos (SEQ ID NOS:1-7). Se muestran las regiones biológicamente activas de la PTH, el PTHrP, y de los ligandos híbridos del PTH/PTHrP usados en este estudio. Las secuencias correspondientes a el PTHrP están sombreadas. Todos los péptidos contenían la modificación carboxi-terminal de la tirosina-amida, y correspondientes por lo demás a la secuencia de la PTH humana nativa o del PTHrP humana.
La Figura 4 describe los efectos de las sustituciones en la posición 23 sobre las propiedades de enlazamiento de los fragmentos carboxi-terminales de la PTH-(15-34) y del PTHrP-(15-36). Se muestran las propiedades enlazantes de las PTH-(15-34) o PTHrP-(15-36) sustituidas o no sustituidas a las células COS-7 que expresan ya sea a los receptores del PTH/PTHrP (Figura 4A) o a los receptores de la PTH-2 (Figura 4B). Los estudios de enlazamiento competitivo se realizaron a temperatura ambiente por 2 horas con ^{125}I-[NleTyr^{8,21}, Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2} (100.000 CPM/pozo) como radioligando. Los ligandos competidores no marcados utilizados se indican en la clave de la figura, cuya estructura se basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humano y en la tirosina-amida contenida como residuo carboxi-terminal. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de 3 ó 4 experimentos, cada uno realizado por duplicado.
La Figura 5 describe los efectos de las sustituciones en las posiciones 5 y 23 sobre el enlazamiento de la PTH-(1-34) y del PTHrP-(1-36) a los receptores del PTH/PTHrP y la PTH-2. Se muestra el enlazamiento de los análogos sustituidos o no sustituidos de la PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36) a las células COS-7 expresando tanto a los receptores del PTH/PTHrP (Figuras 5A y 5C) como a los receptores de la PTH-2 (Figuras 5B y 5D). Los estudios de enlazamiento competitivo (RT/2h) se realizaron con ^{125}I-[NleTyr^{8,21}, Tyr^{34}]rPTH-(1-34)amida (100.000 CPM/pozo) como radioligando. Los ligandos análogos no marcados del PTHrP (Figuras 5A y 5B) y de la PTH (Figuras 5C y 5D), usados como competidores, se indican en las claves de la figura; la estructura de cada una se basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humanos y en la tirosina-amida contenida como residuo carboxi-terminal. Las curvas de enlazamiento de [Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2} y [Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} de las Figuras 1A y B se muestran nuevamente para comparación. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de 3-10 experimentos, cada uno realizado por duplicado.
La Figura 6 describe los efectos de las sustituciones en las posiciones 5 y 23 sobre la señalización del cAMP por medio de la PTH-(1-34) y del PTHrP-(1-36) con los receptores del PTH/PTHrP y de la PTH-2. Se muestran las facultades de los análogos de los péptidos sustituidos y no sustituidos de la PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36) para estimular la formación de cAMP en células COS-7 que expresan ya sea a los receptores del PTH/PTHrP (Figuras 6A y 6C) o al receptor de la PTH-2 (Figuras 6B y 6D). Las células fueron tratadas con la cantidad indicada de péptido por 1 hora a temperatura ambiente en presencia de IBMX. Los ligandos análogos utilizados del PTHrP (Figuras 6A y 6B) y de la PTH (Figuras 6C y 6D) se indican en las claves de la figura; cada una se basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humanos y contenían tirosina-amida como residuo carboxi-terminal. Las curvas de [Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}, y [Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} de las Figuras 1C y 1D se muestran nuevamente aquí para comparación. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de 3-5 experimentos, cada uno realizado por duplicado.
La Figura 7 describe el antagonismo en la formación de cAMP inducido por PTH-(1-34) en células COS-7 que expresan a los receptores del PTH/PTHrP o de la PTH-2. Las células COS-7 que expresan ya sea a los receptores del PTH/PTHrP o de la PTH-2 fueron tratados con dosis variables de [Leu^{11},D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2} o [Trp^{23},Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36), más una dosis estimuladora cercana al máximo del agonista, [Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} (1 nM), y luego se incubaron en presencia de IBMX por 30 minutos a temperatura ambiente. Los niveles intracelulares resultantes de cAMP se expresan como el porcentaje de los niveles de cAMP en células tratadas solamente con [Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} (1 nM), que fueron de 167\pm17 y 70\pm8 pmoles/pozo para el receptor del PTH/PTHrP y el receptor de la PTH-2, respectivamente. Los niveles correspondientes de cAMP basal en células no tratadas con péptido fueron de 8.4 \pm 0.3 y 9.0 \pm 11.7 pmoles/pozo, respectivamente. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de dos experimentos, cada uno realizado por duplicado.
Es importante observar que estos ligandos híbridos, así como los [H5]PTH-(1-34), que compitieron muy pobremente por enlazarse al receptor del PTH/PTHrP, estimularon aún eficientemente la formación de cAMP (Tabla 1). Los inventores han encontrado que el péptido híbrido 5 radioiodado se enlaza eficientemente al receptor del PTH/PTHrP en las células COS-7 (\sim8% de enlazamiento específico de la radioactividad añadida). Parece por lo tanto que estos ligandos alterados se enlazan al receptor del PTH/PTHrP, pero en un sitio que no se sobrepone completamente con aquel utilizado por ^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}.
TABLA 1 Propiedades de enlazamiento del receptor de los análogos de la PTH y el PTHrP
Las células COS-7 transfectadas con plásmidos que codifican al receptor del PTH/PTHrP humano o el receptor de la PTH-2 humana fueron evaluadas en estudios de enlazamiento por competición que utilizaron [Nie^{8,21}, Y^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2} como radioligando y los ligandos indicados no marcados como competidores. Los ensayos fueron realizados por 2 horas a temperatura ambiente. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de los valores de IC_{50} obtenidos a partir del número de experimentos indicados (n).
IC_{50} (nM) de enlazamiento
Receptor de las Receptor de la
Ligando PTH/PTHrP PTH-2
(n) (n)
[Nle8,21, Y34]rPTH-(1-34)NH2 58\pm4 5 11\pm2 5
[Y34] hPTH-(1-34)NH2 39\pm4 7 16\pm4 7
[Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 285\pm47 10 2.140\pm250 10
Híbrido-1
\hskip1,5cm hPTHrP-(1-14)/[Y34]hPTH-(15-34)NH2 7.900\pm370 4 6063\pm96 4
Híbrido-5
\hskip1,5cm hPTHrP-(1-18)/[Y34]hPTH-(19-34)NH2 4.970\pm1.560 4 500\pm62 4
Híbrido-4
\hskip1,5cm hPTHrP-(1-21)/[Y34]hPTH-(22-34)NH2 19\pm6 4 11\pm3 4
Híbrido-3
\hskip1,5cm hPTHrP-(1-23)/[Y34]hPTH-(24-34)NH2 1.000\pm471 4 6.050\pm990 4
Híbrido-2
\hskip1,5cm hPTH-(1-14)/[Y34]hPTHrP-(15-34)NH2 497\pm144 4 750\pm210 4
[Y36]hPTHrP-(15-36)NH2 >10.000 4 4.970\pm970 4
[W23, Y36] hPTHrP-(15-36)NH2 >10.000 4 370\pm100 4
[E22, W23, Y36]hPTHrP-(15-36)NH2 >10.000 4 137\pm36 4
[Y34]hPTH-(15-34)NH2 >10.000 3 624\pm116 3
[F23, Y34] hPTH-(15-34)NH2 >10.000 4 >10.000 4
[W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 47\pm8 5 30\pm7 5
[15, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 41\pm11 6 695\pm171 6
[15, W23, Y36] hPTHrP-(1-36)NH2 16\pm3 5 10\pm1 5
[F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 95\pm11 4 453\pm53 4
[H5, Y34]hPTH-(1-34)NH2 5.100\pm1.000 4 249\pm18 4
[H5, F23, Y34] hPTH-(1-34)NH2 >10.000 3 >10.000 3
Descripción detallada de las modalidades preferidas
Previamente, los presentes inventores habían preparado una serie de ligandos híbridos del PTH/PTHrP con el propósito de investigar si los dominios homólogos de la PTH y del PTHrP podían ser intercambiados (Gardella, T.J. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:6584-6588 (1995)). Los presentes inventores han utilizado ahora estos ligandos híbridos y análogos derivados de péptido para regiones del mapa de PTH y PTHrP que contribuyen a la selectividad del ligando del receptor de la PTH-2. Estos esfuerzos han conducido a la identificación de dos residuos en los ligandos que juegan papeles principales en la determinación de la eficiencia de enlazamiento y en las interacciones de señalización con el receptor de la PTH-2.
La presente invención provee un nuevo análogo del PTHrP que es un potente agonista receptor de la PTH-2, así como un potente agonista receptor del PTH/PTHrP. En una modalidad preferida, se altera al análogo del PTHrP en los residuos 5 y 23 de los residuos correspondientes de la PTH. Más preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP que tienen una sustitución de aminoácidos de histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Ile^{5}, Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con otro aspecto de al presente invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que es un potente antagonista selectivo del receptor de la PTH-2. En una modalidad preferida, el análogo se altera en el residuo 23 del PTHrP del residuo correspondiente de la PTH. Más preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP que tienen una única sustitución de aminoácido de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
Además, cualquier otra sustitución de aminoácidos de una naturaleza, que no destruya la habilidad del análogo del PTHrP para antagonizar o agonizar al receptor de la PTH-2 (como se determina por ensayos conocidos por aquellos operarios calificados y que es discutido más adelante), están incluidos en el alcance de la presente invención. El siguiente Ejemplo es ilustrativo, y no pretende ser limitante.
Materiales y Métodos Péptidos y Reactivos
La preparación y caracterización inicial de los ligandos híbridos del PTH/PTHrP fue descrita previamente (Gardella, T.J. et al., J. Biol. Chem. 270:6584-6588 (1995)). [Nle^{8,21}, Tyr^{34}]rat(r)PTH(1-34)NH_{2} fue adquirido a Bachem Fine Chemicals (Tomance, CA). El antagonista, [Leu^{11},D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2}, fue adquirido a Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Todos los otros péptidos fueron preparados en el centro para síntesis de biopolímeros del Hospital General de Massachusetts (Boston, MA) utilizando química en fase sólida y grupos protectores F-moc. Se preparó ^{125}I-[Nle^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2} por yodación con cloramina-T, y se purificó por HPLC (Shigeno, C. y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:3872-3878 (1988)). [^{125}I]-Na (2,000 Ci/mmol) se adquirido a DuPont/New England Nuclear (Boston, MA). El medio modificado de águila de Dulbecco (DMEM), la mezcla de EGTA/tripsina y 100x antibiótico (10,000 unidades/ml de penicilina G y 10 mg/ml de estreptomicina) era de GIBCO; el suero fetal bovino (FBS) era de Hyclone Laboratories (Logan, UT).
Transfección de AND de células COS-7
Los cADN que codifican al receptor del PTH/PTHrP humano (Schipani, E. y colaboradores, Endocrinology 132:2157-2165 (1993)) y al receptor de la PTH-2 humana (Usdin, T. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)) fueron transportados sobre vectores de expresión pcADN-1 y pcADNI/Amp (InVitrogen, San Diego, CA), respectivamente. Las células COS-7 se cultivaron y transfectaron como se describió previamente (Lee, C. y colaboradores, Mol. Endocrinol. 9:1269-1278 (1995)). Las células se transfectaron en placas de 24 pozos utilizando ADN de plásmido (200 ng/pozo) purificado por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio/bromuro de etidio. Los ensayos de enlazamiento del ligando y de acumulación de cAMP fueron realizados tres días después de la transfección, en cuyo momento la densidad celular alcanzó 500.000 \pm 100.000 células/pozo.
Enlazamiento receptor-radioligando
Las reacciones de enlazamiento se realizaron como se describió previamente. Id. Cada pozo ( volumen final: 300 ml) contenía 26 fmoles de ^{125}I-[Nle^{8,21},Tyr^{34}]rPTH(1-34)NH_{2} (100.000 CPM) y diferentes cantidades (0.4-300 pmoles) de un ligando competidor no marcado, ambos diluidos en buffer de enlazamiento (Tris-HCI 50 mM, pH 7,7, NaCl 100 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, suero de caballo al 5% inactivado por calor, suero fetal bovino al 0.5% inactivado por calor). Las incubaciones se hicieron a temperatura ambiente por 2 horas, excepto para los experimentos que involucran el análisis Scatchard, que fueron realizados a 4ºC por 6 horas. Al final de la reacción de enlazamiento, se enjuagaron las células 3 veces con 0.5 ml de buffer de enlazamiento, se lisaron con 0.5 ml de NaOH 5 M, y se hizo recuento del lisado completo. El enlazamiento no específico del trazador (NSB), determinado en pozos que contenían 1 \muM de [NleTyr^{8,21}, Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}, fue \sim1% del total contadores añadidos. El enlazamiento específico máximo (B_{0}) se calculó como el enlace de reactividad total a las células en ausencia de ligando de la PTH no marcada, menos NSB. Los valores de IC_{50} (la dosis del ligando competidor que resultó en una inhibición del 50% del enlazante ^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}) se determinaron a partir de las gráficas de log(B/B_{0}-B) vs. log[competidor]. Para el análisis de Scatchard, los estudios de enlazamiento de competición homóloga que se realizaron utilizaron ^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2} (26 fmoles/pozo) y cantidades variables (1.2-300 pmoles) del mismo ligando no marcado. Los estimados del número de receptores/célula derivados a partir de estos estudios asumieron una única clase de sitios de enlazamiento y una eficiencia de transfección del 20% (Abou-Samra, A.B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci (USA) 89:2732-2736 (1992)).
AMP cíclico intracelular
Las células transfectadas COS-7 se enjuagaron con 500 ml de buffer de enlazamiento. Se añadieron entonces 200 ml de buffer IBMX (DMEM conteniendo IBMX 2 mM, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, Hepes-NaOH 35 mM, pH 7.4) y 100 ml de buffer de enlazamiento o buffer de enlazamiento conteniendo diferentes cantidades de un análogo de la PTH o del PTHrP. Las placas se incubaron por 60 minutos a temperatura ambiente. El buffer fue retirado entonces y las células fueron lisadas colocando las placas sobre hielo seco en polvo y añadiendo 0.5 ml de HCl 50 mM. El lisado ácido se diluyó 1/30 en dH2O, y se analizó una alícuota (5-50 ml) por su contenido de cAMP por medio de un radioinmunoensayo. Los valores de EC_{50} (la dosis de ligando que dio como resultado una respuesta máxima del 50% (Emax) obtenida para ese ligando con el receptor relevante) se determinaron a partir de las gráficas de log(E/Emax-E) vs. log[ligando], donde E es la respuesta medida de cAMP en la dosis de ligando correspondiente. Para el estudio de los antagonistas, se aplicó el péptido inhibidor [Leu^{11}, D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2} o el [Trp^{23},Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2} a las células COS-7 en 100 \mul de buffer de enlazamiento, dos minutos antes de la adición del buffer IBMX que contenía una dosis estimuladora cercana a la máxima (1.5 nM) del péptido agonista [Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2}. Las células se incubaron entonces por 30 minutos a temperatura ambiente, y el cAMP intracelular resultante fue medido por medio de RIA. Los datos se analizaron utilizando el software AssayZap (Elsevier Science Publishers BV, Cambridge, Reino Unido).
Resultados
Las respuestas de enlazamiento y señalización de cAMP obtenidas para las PTH-(1-34) ([Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2}) y PTHrP-(1-36) ([Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}) en células COS-7 que expresan a los receptores del PTH/PTHrP y la PTH-2 humanas se muestran en la Figura 1. Con el receptor del PTH/PTHrP, tanto las PTH-(1-34) como PTHrP-(1-36) inhibieron completamente el enlazamiento del radioligando, ^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}, aunque la PTH-(1-34) fue 4.8 veces más potente que el PTHrP-(1-36) (las IC_{50} = 39 y 285 nM, respectivamente, p<0.001; Figura 1A y Tabla 1). Con las células que expresan al receptor de la PTH-2, PTH-(1-34) se enlaza con una afinidad aparentemente alta, mientras que el PTHrP-(1-36) se enlaza pobremente con una potencia que fue más de 100 veces más débil que aquella de la PTH-(1-34) (Figura 1B y Tabla 1).
Tanto la PTH-(1-34) como el PTHrP-(1-36) fueron agonistas totales y potentes de la producción de cAMP en células COS-7 que expresan al receptor del PTH/PTHrP (Figura 1C y Tabla 2). En contraste, solamente la PTH-(1-34) fue un potente agonista con el receptor de la PTH-2, mientras que el PTHrP-(1-36) fue casi inactiva (Figura 1D). Estos resultados confirman las actividades de estimulación de cAMP marcadamente diferentes de la PTH y del PTHrP con el receptor de la PTH-2 (Usdin, T. y colaboradores, J. Biol. Chem.270:15455-15458 (1995)), y demuestran que al menos parte del defecto de señalización que tiene el PTHrP con este receptor puede ser atribuido a las débiles interacciones de enlazamiento.
Los análisis de Scatchard de los datos de competición de enlazamiento indicaron que el receptor de la PTH-2 se expresó sobre la superficie de las células COS-7 hasta niveles que fueron 5 veces menores que el nivel de expresión alcanzados por el receptor del PTH/PTHrP (Figuras 2A y 2B). Esta diferencia en los niveles de expresión es probable que explique las menores respuestas de cAMP comparadas con el receptor del PTH/PTHrP (Figura 1). Aunque, la razón para la menor expresión del receptor de la PTH-2 no es clara hasta el momento, la expresión fue completamente adecuada por comparación de las interacciones de diferentes análogos de la PTH y del PTHrP con este
receptor.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 2 Propiedades de enlazamiento del receptor de los análogos de la PTH y el PTHrP
Las células COS-7 transfectadas con plásmidos que codifican al receptor del PTH/PTHrP humano o el receptor de la PTH-2 humana fueron estimuladas con el ligando indicado por 1 h a temperatura ambiente, y los niveles resultantes de cAMP intracelular fueron cuantificados por RIA. Los valores máximos indican el nivel más alto de cAMP que se logró para cada ligando con cada receptor. Los valores basales medios de cAMP (no restados) fueron 4,6 \pm 0,2 y 5,4 \pm 0,3 pmoles/pozo para los receptores del PTH/PTHrP y la PTH-2, respectivamente. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de los valores obtenidos a partir del número de experimentos indicado (n).
Acumulación de cAMP
Receptor del PTH/PTHrP Receptor de la PTH-2
EC50 Máximo EC50 Máximo
Ligando (nM) (pmoles/pozo) (nM) (pmoles/pozo)
(n) (n)
[Y34]hPTH-(1-34)NH2 0,46\pm0,18 113\pm13 5 0,6\pm0,1 81\pm5 5
[Y36] hPTHrP-(1-36)NH2 0,32\pm0,04 103\pm10 5 >1000 11\pm1 5
[15, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 0,26\pm0,08 112\pm9 3 7,0\pm2,1 80\pm5 3
[W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 0,26\pm0,05 123\pm14 4 >1000 12\pm1 4
[15, W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 0,21\pm0,06 109\pm10 4 0,5\pm0,3 65\pm7 4
[H5, Y34]hPTH-(1-34)NH2 0,93\pm0,37 116\pm19 3 >1000 10\pm1 3
[F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 0,23\pm0,02 104\pm16 4 7,6\pm2,2 50\pm8 4
[H5, F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 1,18\pm0,29 110\pm19 3 >1000 7,1\pm0,9 3
Híbrido-1
[Y34]hPTHrP-(1-14)/hPTH-(15-34)NH2 0,23\pm0,04 140\pm17 3 >1000 5,3\pm0,6 3
Híbrido-5
[Y34]hPTHrP-(1-18)/hPTH-(19-34)NH2 0,43\pm0,16 133\pm14 3 >1000 6,2\pm0,4 3
Híbrido-4
[Y34]hPTHrP-(1-21)/hPTH-(22-34)NH2 0,27\pm0,06 107\pm17 4 >1000 6,7\pm0,6 4
Híbrido-3
[Y34]hPTHrP-(1-23)/hPTH-(24-34)NH2 0,42\pm0,13 95\pm9 4 >1000 11\pm1 4
Híbrido-2
[Y34]hPTHrP-(1-14)/hPTH-(15-34)NH2 0,74\pm0,37 123\pm28 3 2,1\pm0,5 58\pm12 3
Ligandos híbridos del PTH/PTHrP
Para localizar las regiones de la PTH y del PTHrP responsables por la diferencia en las afinidades de enlazamiento aparentes de los dos ligandos con el receptor de la PTH-2, los inventores evaluaron la serie de los análogos híbridos del PTH/PTHrP mostrados en la Figura 3 (SEQ ID NOS: 3-7). Algunos de los ligandos híbridos (esto es, híbridos 1 y 5) no fueron altamente informativos, porque a diferencia de cada ligando principal, ellos compitieron pobremente por enlazarse aún al receptor del PTH/PTHrP, indicando que estos análogos fueron diferentes de cada ligando principal. En forma similar, la débil eficacia de enlazamiento para estos ligandos híbridos fue observada previamente en estudios con células de osteosarcoma de rata (ROS 17/2.8). Aquellos resultados fueron interpretados como alteraciones en la estructura del ligando causada por incompatibilidad entre los residuos en la porción 1-14 amino-terminal del PTHrP, y la región 15-34 de la PTH (Gardella, T.J. et al., J. Biol. Chem. 270: 6584-6588 (1995)). Para los estudios actuales sobre el receptor de la PTH-2, los análogos más informativos fueron el híbrido-3 y el híbrido-4. El enlace del híbrido-4, y de las PTHrP-(1-21)/PTH-(22-34) al receptor de la PTH-2 con gran eficacia (IC_{50} = 11 nM), similar a la de la PTH-(1-34) (Tabla 1). Extendiendo la secuencia del PTHrP en dos residuos produjo al híbrido-3, y las PTHrP-(1-23)/PTH-(24-34), que compitieron pobremente por enlazarse al receptor del PTH/PTHrP (IC_{50} = 1.000 nM), y por enlazarse con eficacia aún menor al receptor de la PTH-2 (IC_{50} \sim 6.000 nM). En este sentido, el perfil de enlazamiento del híbrido-3 se parece a aquel del PTHrP-(1-36).
Sustituciones en las posiciones 22 y 23
Comparando las estructuras y las propiedades de enlazamiento de los híbridos 3 y 4 condujo a los inventores a la hipótesis de que los residuos divergentes en las posiciones 22 y/o 23 contribuyen a que el receptor de la PTH-2 se enlace selectivamente. Para probar inicialmente el papel de los residuos 22 y 23 en el enlazamiento del receptor, se prepararon fragmentos más cortos del PTHrP-(15-36) en los cuales Phe-22 y/o Phe-23 fueron reemplazados por los correspondientes residuos Glu y Trp de la PTH. El péptido principal no sustituido, del PTHrP-(15-36), compitió débilmente por enlazarse al receptor de la PTH-2 (Figura 4B). La eficacia del enlazamiento mejoró considerablemente con la sustitución combinada de Glu-22 y Trp-23 por Glu y Trp. La mayor parte de esta mejora podría ser justificada por la sustitución única de Trp por Phe-23 (Tabla 1, Figura 4B). El enlazamiento ya sea de los fragmentos no sustituidos o de los sustituidos del PTHrP-(15-36) al receptor de las PTH/PTHrP, podría no ser detectado en estos ensayos de competición (Figura 4A).
Se introdujo la modificación de Phe-23 por Trp en el PTHrP-(1-36) de longitud completa, donde se encontró que mejora la eficiencia de enlazamiento para el receptor de la PTH-2 en 17 veces, comparado al enlazamiento del PTHrP-(1-36) por si misma (Figura 5B; Tabla 1). El cambio recíproco de Trp 23 por Phe en la PTH-(1-34) condujo a una reducción de 28 veces en la eficiencia de enlazamiento para el receptor de la PTH-2, comparado con la PTH-(1-34) no sustituida (Figura 5D y Tabla 1). De manera interesante, los residuos divergentes en la posición 23 podrían contar también para algunas de las diferencias en las afinidades aparentes de enlazamiento que la PTH y el PTHrP exhibieron por el receptor del PTH/PTHrP. De este modo, [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) se enlaza al receptor del PTH/PTHrP con una afinidad 6 veces más fuerte de lo que lo hizo el PTHrP-(1- 36) (Figura 5A; Tabla 1), y [Phe^{23}]PTH-(1-34) se enlaza a este receptor con una afinidad 2-3 veces menor d lo que lo hizo la PTH-(1-34) (Figura 5C; Tabla 1). El efecto de estos cambios en la posición 23 sobre el enlazamiento al receptor del PTH/PTHrP podría ser predicho a partir de las propiedades de enlazamiento que el híbrido-3 y el híbrido-4 mostraron con este receptor (Tabla 1).
Efectos de los residuos 5 y 23 sobre el señalización de cAMP
Las sustituciones anteriores en la posición 23 en la PTH o en el PTHrP tuvieron un efecto my pequeño o no lo tuvieron, sobre el señalización de cAMP por medio del receptor de la PTH-2; [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) era aún inactiva y [Phe^{23}]PTH-(1-34) era casi un agonista completo (Figuras 6B y 6D; Tabla 2). La alta eficiencia del híbrido-2, las PTH-(1-14)/PTHrP-(15-34), en estimular la producción de cAMP con el receptor de la PTH-2, comparado con la débil actividad del híbrido-1, las PTHrP-(1-14)/PTH-(15-34) (Tabla 2), sugirió que los residuos con la secuencia 1-14 de la PTH y del PTHrP estaban involucrados en la modulación de las propiedades de señalización de los dos ligandos con este receptor.
Los estudios previos de enlazamiento en células ROS 17/2.8 revelaron que la posición 5 (Ile en la PTH y His en el PTHrP) era un sitio divergente en la región 1-14 que podría afectar dramáticamente la interacción ligando-receptor (Gardella, T.J. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:6584-6588 (1995)). Por lo tanto, se probaron los efectos de las sustituciones recíprocas en la posición 5 sobre las interacciones de señalización con el receptor de la PTH-2. Sorprendentemente, [Ile^{5}]PTHrP-(1-36) se convirtió en un agonista completo con el receptor de la PTH-2, promoviendo la misma respuesta máxima de cAMP que aquella lograda por la PTH-(1-34) (Figura 6B y Tabla 2). Sin embargo, la EC_{50} de la respuesta de la [Ile^{5}]PTHrP-(1-36) fue hasta 12 veces más alta que aquella de la PTH-(1-34) (Los EC_{50} = 7 y 0.6 nM, respectivamente). Por lo tanto, los inventores combinaron la sustitución de la Ile-5 con la modificación Trp 23 para mejoramiento de la afinidad. El análogo resultante, [Ile^{5},Trp^{23}]PTHrP-(1-36), fue tan potente y eficaz como la PTH-(1-34)
en ambos enlazamientos y en la producción de cAMP con el receptor de la PTH-2 (Figura 6B, Tablas 1 y 2).
La observación de que [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) (histidina en la posición 5) enlaza al receptor de la PTH-2 sin estimular la producción de cAMP, sugiere que este análogo podría funcionar como antagonista del receptor de la PTH-2. La Figura 7 muestra que este análogo fue en realidad al menos tan potente como [Leu^{11}, D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2}, un antagonista muy potente del antagonista del receptor del PTH/PTHrP (Nutt y colaboradores, Endocrinology 127:491-493 (1990)), en la inhibición de la actividad inducida de la PTH-(1-34) sobre el receptor de la PTH-2. Con el receptor del PTH/PTHrP, [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) no fue un antagonista, sino que más bien aumentó la respuesta del agonista al PTH-(1-34).
Discusión
Los estudios discutidos antes demuestran que la falla del PTHrP para enlazarse eficientemente y activar al receptor de la PTH-2 puede ser atribuida a dos residuos, fenilalanina en la posición 23 e histidina en la posición 5. En la PTH, que es completamente eficaz con el receptor de la PTH-2, estos residuos son reemplazados por triptófano y por isoleucina, respectivamente. Intercambiando los residuos 5 y 23 del PTHrP con los correspondientes residuos de isoleucina y de triptófano de la PTH, y del PTHrP podría convertirse en un eficiente y completo agonista del receptor de la PTH-2.
La histidina en la posición 5 en del PTHrP bloqueó la activación del receptor de la PTH-2. En estudios previos de enlazamiento por competición en las células ROS 17/2.8, el residuo 5 fue identificado como un determinante importante para la interacción con el receptor del PTH/PTHrP receptor (Gardella, T.J. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:6584-6588 (1995)). Estos primeros estudios sugieren que este residuo estaba involucrado en interacciones intramoleculares putativas entre las porciones 1-14 con las porciones 15-34 del ligando. La evidencia para esto incluye la capacidad de la sustitución de la His en posición 5 con la Ile en esa misma posición en el PTHrP para "remediar" los efectos perjudiciales que las sustituciones carboxiterminales (esto es, en las posiciones 19, 21 y 24) tenían sobre la eficiencia del enlazamiento. Parece ahora que el papel completo del residuo 5 en el ligando en la PTH y en el PTHrP es más complejo, ya que los datos actuales indican que este residuo modula fuertemente las interacciones de señalización con el receptor de la PTH-2 receptor.
El enlazamiento débil del PTHrP al receptor de la PTH-2 puede ser atribuido al residuo de fenilalanina en la posición 23; reemplazando este residuo por el correspondiente triptófano de la PTH mejoró el enlazamiento al receptor de la PTH-2 71 veces. La sustitución del Trp por Phe en la posición 23 podría explicar también el enlazamiento seis veces más débil que el PTHrP-(1-36) exhibió por el receptor del PTH/PTHrP, comparado con la PTH-(1-34) (Tabla 1). Tal enlazamiento más débil del PTHrP fue observado en los primeros estudios con el receptor del PTH/PTHrP humano clonado expresado en las células COS-7, aunque, se observaron eficiencias de enlazamiento casi equivalentes con el receptor del PTH/PTHrP clonado de rata (Schipani, E. y colaboradores, Endocrinology 132:2157-2165 (1993)). Los primeros estudios con el receptor del PTH/PTHrP endógenas a las células ROS 17/2.8 también encontraron una eficiencia de enlazamiento comparable para los dos ligandos (Jüppner, H. y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:8557- 8560 (1988); Nissenson, R.A. y colaboradores, J. BioL Chem. 263:12866-12871 (1988)). Por lo tanto, puede esperarse que los receptores del PTH/PTHrP de rata y humano, y el receptor de la PTH-2 humana, difieran cada uno en el sitio o en los
sitios en que reconocen al residuo 23 en el ligando. De esta forma, con ambos receptores, la modificación del triptófano en el Trp 23 en el PTHrP mejoró la afinidad de enlazamiento del análogo hasta cerca de aquel de la PTH-(1-34).
Los efectos sobre la actividad de una variedad de modificaciones en la posición 23 en la PTH han sido investigados previamente en los receptores del PTH/PTHrP. Rosenblatt y colaboradores encontraron que la adición de un grupo voluminoso orto- nitrofenilsulfenilo al nitrógeno del indol de la Trp 23 tuvo poco o ningún efecto sobre la bioactividad (Rosenblatt, M. & Potts, J.T., Endo. Res. Comm. 4: 115-133 (1977)), ni tampoco lo hizo una sustitución de naftilalanina en este sitio (Nakamoto, C. y colaboradores, Biochemistry 34:10546-10552 (1995)). Sin embargo, la metilación de la columna vertebral nitrogenada en Phe 23, o, la sustitución de D-Trp por Trp 23, redujo severamente la afinidad de enlazamiento del receptor (Caulfield, M.P. & Rosenblatt, M.,T.E.M. Jan/Feb: 164-168 (1990)). El análisis mutacional de los residuos 23-34 de la PTH-(1-84) mostró que la sustitución de la cisteína del Trp 23 redujo la bioactividad en más de 10 veces, mientras que la sustitución de la leucina redujo la actividad en un 50% (Gardella, T.J. et al., "Scanning mutagenesis of the 23-25 region of parathyroid hormone reveals important determinants of receptor binding", in Calcium Regulating Hormones and Bone Metabolism; Basic and Clinical Aspects, Vol. 11, Cohn, D.V. y colaboradores, eds., Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam (1992), pgs. 218-222). Los estudios por RMN sobre los análogos de la PTH (Barden, J.A. & Kemp, B.E., Biochemistry 32:7126-7132 (1993); Marx, U. Y colaboradores, J. Biol. Chem.270:15194-15202 (1995); Klaus, W. y colaboradores, Biochemistry 30:6936-6942 (1991); Bundi, A. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 91:201-208 (1978)) y de los análogos del PTHrP (Barden, J.A. & Kemp, B.E., Eur. J. Biochem. 184: 379-394 (1989); Ray, F.R. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 211:205-211 (1993)) sugieren que el residuo aromático en esta posición en cada ligando está involucrado en las interacciones hidrófobas intramoleculares. El residuo 23 puede, por lo tanto, ser importante para mantener la estructura del ligando, así como modular las interacciones de enlazamiento del receptor.
Debido a que el análogo del PTHrP-(1-36) que contiene la modificación Trp 23 exhibió una alta afinidad de enlazamiento por el receptor de la PTH-2 sin tener una actividad agonista detectable, lo evaluamos como un antagonista potencial del receptor de la PTH-2. Este análogo fue al menos tan eficiente como [Leu^{11}, D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2}, un antagonista previamente caracterizado del receptor del PTH/PTHrP en la inhibición de la acción del agonista de la PTH-(1-34) sobre el receptor de la PTH-2; sin embargo, a diferencia del análogo del antagonista truncado en forma aminoterminal, sin embargo, [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) fue un agonista eficiente y completo con el receptor del PTH/PTHrP (Figuras 6A y 7A). Debido a que este nuevo análogo parece ser un antagonista selectivo para el receptor de la PTH-2, podría ser potencialmente útil para los estudios in vivo dirigidos a una elucidación adicional del papel fisiológico del receptor de la PTH-2 receptor.
La PTHrP se expresa en muchos tejidos fetales y adultos y es un morfógeno vital de desarrollo, una función que probablemente sea mediada por el receptor da las PTH/PTHrP (Karaplis, A.C. y colaboradores, Genes & Dev. 8:277-289 (1994)). Es interesante que la fenilalanina se preserve en la posición 23 en todos los ligandos nativos del PTHrP, a pesar de las implicaciones de la invención de que el triptófano en este sitio, como se lo encuentra en todos los ligandos nativos de la PTH, es completamente compatible con el enlazamiento al receptor del PTH/PTHrP receptor. Puede ser que la fenilalanina haya sido seleccionada para la posición 23 en el PTHrP, debido a su habilidad para inhibir el enlazamiento al receptor de la PTH-2. Igualmente, el residuo de histidina conservado en la posición 5 en el PTHrP puede haber sido seleccionado debido a que bloquea las interacciones de señalización con el receptor de la PTH-2. Juntos, estos dos residuos que se conservaron en el PTHrP asegurarían de este modo que las interacciones productivas con el receptor de la PTH-2 no ocurrirían.
En resumen, los presentes inventores han identificado dos sitios en la PTH y en el PTHrP que cuentan para la selectividad del ligando del receptor de la PTH-2. Los inventores están construyendo ahora quimeras entre los receptores de la PTH-2 y del PTH/PTHrP, como una aproximación hacia la identificación de los sitios receptores afines involucrados en esta selectividad del ligando por los dos ligandos. Los perfiles funcionales de tales quimeras de receptor que interactúan con los ligandos modificados de la PTH y del PTHrP ayudarían a refinar y a restringir los modelos de los complejos formados entre estos ligandos de péptidos y sus receptores acoplados a la proteína G.
Uso Terapéutico
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la invención, se provee un método para tratar un desorden medico que resulta de una acción alterada o excesiva del receptor de la PTH-2, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo del PTHrP, suficiente para inhibir la activación del receptor de la PTH-2 de dicho paciente. En una modalidad preferida, el análogo del PTHrP utilizado en el método tiene una sustitución sencilla de aminoácido de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
En esta modalidad, un paciente que se sospecha que tiene un desorden resultante de la acción alterada del receptor de la PTH-2, puede ser tratado utilizando los análogos del péptido de la invención que mostraron ser antagonistas selectivos del receptor de la PTH-2. Tales antagonistas incluyen a los compuestos de la invención que se ha determinado que (por medio de los ensayos descritos aquí) interfieren con la activación celular mediada por el receptor de la PTH-2 o de otros análogos que tienen propiedades similares.
Para administrar al antagonista, se utiliza el péptido apropiado en la elaboración de un medicamento, generalmente formulado en un vehículo apropiado o excipiente tal como, por ejemplo, suero fisiológico, y administrado en forma intravenosa, intramuscular, subcutánea, u oralmente, en una dosificación que provea la adecuada inhibición del enlazamiento de la PTH al receptor de la PTH-2. La dosificación típica sería de 1 ng a 10 mg del anticuerpo o péptido por kg de peso corporal por día.
De acuerdo aún con un aspecto adicional de la invención, se provee un método para tratar la osteoporosis, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo del PTHrP, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y al receptor de la PTH-2 de dicho paciente. En una modalidad preferida, el análogo del PTHrP utilizado en el método tiene una sustitución aminoácida de histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Ile^{5}, Trp^{23}]PTHrP-(1-36). Pueden utilizarse dosificaciones y formas de administración similares a las descritas anteriormente para el antagonista del PTHrP, para la administración de un agonista del PTHrP, por ejemplo, para el tratamiento de condiciones tales como la osteoporosis.
Por "agonista" se desea un ligandos capaz de mejorar o de potenciar una respuesta celular mediada por el receptor de la PTH-2 receptor. Por "antagonista" se desea un ligandos capaz de inhibir una respuesta celular mediada por el receptor de la PTH-2. Si cualquier candidato "agonista" o "antagonista" de la presente invención puede mejorar o inhibir tal respuesta celular, es algo que puede determinarse utilizando ensayos de enlazamiento o una respuesta celular ligando/receptor de una proteína conocida en el estado de la técnica, que incluya lo descrito en otra parte en esta solicitud.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: The General Hospital Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
Fruit Street
\vskip0.500000\baselineskip
Boston, MA 02114
\vskip0.500000\baselineskip
Estados Unidos de Norte América
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Análogos del Péptido Relacionado con la Hormona Paratiroidea
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Sterne, Kessler, Goldstein and Fox P.L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1100 New York Avenue, N.W., Suite 600
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: DC
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de Norte América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 20005
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA EN QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/13360
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-JULIO-1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/025.471
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-JULIO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Golstein, Jorge A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 29.021
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: 0609.431PC01/JAG/KRM
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE LOS MEDIOS DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (202) 371-2600
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Teléfax: (202) 371-2540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn}
\sac{Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His}
\sac{Thr Ala Glu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Leu Asn}
\sac{Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu His Thr}
\sac{Tyr}

Claims (12)

1. Un análogo de péptido (PTHrP) relacionado con la hormona paratiroidea que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que es un agonista del receptor de la hormona paratiroidea (PTH)-2, así como un agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos está alterada en los residuos aminoácidos 5 y 23.
2. El análogo del péptido PTHrP de la reivindicación 1, en donde dicha alteración en el residuo aminoácido 5 del PTHrP comprende una sustitución de aminoácidos de histidina por isoleucina, y dicha alteración en el residuo aminoácido 23 del PTHrP comprende una sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano.
3. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 con las siguientes modificaciones: [Ile^{5}, Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
4. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que es un antagonista selectivo del receptor de la PTH-2, así como un agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos está alterada en el residuo aminoácido 23.
5. El análogo del PTHrP de la reivindicación 4, en donde dicha alteración en el residuo aminoácido 23 del PTHrP comprende una sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano.
6. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 con las siguientes modificaciones: [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
7. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 4, suficiente para inhibir la activación del receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una acción alterada o excesiva del receptor de la PTH-2.
8. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 5, suficiente para inhibir la activación del receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una acción alterada o excesiva del receptor de la PTH-2.
9. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 6, suficiente para inhibir la activación del receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una acción alterada o excesiva del receptor de la PTH-2.
10. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 1, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar la osteoporosis.
11. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 2, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar la osteoporosis.
12. El uso del análogo del PTHrP de la reivindicación 3, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para tratar la osteoporosis.
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