RU2203286C2 - Аналоги паратиреоидного гормона для лечения остеопороза - Google Patents
Аналоги паратиреоидного гормона для лечения остеопороза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2203286C2 RU2203286C2 RU99104132/14A RU99104132A RU2203286C2 RU 2203286 C2 RU2203286 C2 RU 2203286C2 RU 99104132/14 A RU99104132/14 A RU 99104132/14A RU 99104132 A RU99104132 A RU 99104132A RU 2203286 C2 RU2203286 C2 RU 2203286C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lys
- leu
- seq
- hpth
- analogue
- Prior art date
Links
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 title claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 11
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 title description 42
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 title description 42
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 title description 42
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 title description 42
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 2
- RRBGTUQJDFBWNN-MUGJNUQGSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O RRBGTUQJDFBWNN-MUGJNUQGSA-N 0.000 claims 1
- JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JQSIGLHQNSZZRL-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 39
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 17
- -1 biochemistry Substances 0.000 abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 12
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 abstract description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 abstract description 7
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001300 stimulation of adenylate cyclase Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 50
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 36
- OXZNHYPGOAWYLT-FISSOZIDSA-N ostabolin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(C)C)C1C=NC=N1 OXZNHYPGOAWYLT-FISSOZIDSA-N 0.000 description 30
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 25
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 22
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 14
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 13
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 11
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 8
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 7
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 7
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 6
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 6
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 3
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- RRBCHMCWWOHRQL-UMXFMPSGSA-N parathyroid hormone (1-34)amide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CN=CN1 RRBCHMCWWOHRQL-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZNYKKCADEQAZKA-FXQIFTODSA-N Asn-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ZNYKKCADEQAZKA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N Glu-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DYFJZDDQPNIPAB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- WVYJNPCWJYBHJG-YVNDNENWSA-N Glu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WVYJNPCWJYBHJG-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N Glu-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZYLJULGXQDNXDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- POMXSEDNUXYPGK-IHRRRGAJSA-N Leu-Met-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N POMXSEDNUXYPGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N Lys-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940116901 diethyldithiocarbamate Drugs 0.000 description 2
- LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N diethyldithiocarbamic acid Chemical compound CCN(CC)C(S)=S LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical class 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- OCLLVJCYGMCLJG-CYBMUJFWSA-N (2r)-2-azaniumyl-2-naphthalen-1-ylpropanoate Chemical compound C1=CC=C2C([C@@](N)(C(O)=O)C)=CC=CC2=C1 OCLLVJCYGMCLJG-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobutanoic acid Natural products CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKQQPCDQZZTLSE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-naphthalen-1-ylpropanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CC=CC2=C1 BKQQPCDQZZTLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 206010065369 Burnout syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N L-homocitrulline Chemical compound NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000137850 Marrubium vulgare Species 0.000 description 1
- 125000000534 N(2)-L-lysino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005250 Spontaneous Fractures Diseases 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N Val-His-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000123 anti-resoprtive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000000367 exoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004560 pineal gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000001685 postmenopausal osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008060 renal absorption Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
- A61P5/20—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of PTH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Measurement Of Radiation (AREA)
- Display Devices Of Pinball Game Machines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к аналогам паратиреоидного гормона человека, проявляющим активность в восстановлении кости. Описанные пептиды представляют собой производные hPTH-(l-31), которые циклизованы, например, посредством образования лактамов либо между Glu22 и Lys26, либо между Lys26 и Asp30. Кроме того, природный Lys27 может быть замещен либо Leu, либо другими гидрофобными остатками, такими, как Ile, норлейцин, Met, Val, Ala, Trp или Phe. Аналоги проявляют повышенную активность в восстановлении кости посредством стимуляции аденилатциклазы и имеют повышенную биологическую доступность. 3 с. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 28 ил.
Description
Область изобретения
Данное изобретение относится к аналогам паратиреоидного гормона (паратгормона) человека, который, как обнаружено, является эффективным при лечении остеопороза.
Данное изобретение относится к аналогам паратиреоидного гормона (паратгормона) человека, который, как обнаружено, является эффективным при лечении остеопороза.
Предпосылки изобретения
Остеопороз является основной причиной нетрудоспособности у пожилых, в частности, у пожилых женщин. Недавно поняли, что паратгормон человека (hРТН) и некоторые его аналоги являются стимуляторами костного роста, что является полезным при лечении остеопороза. Остеопороз представляет собой прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению общей костной массы и повышенной хрупкости кости. Это часто приводит к спонтанным переломам костей, несущих нагрузку, а также к физическому и психическому истощению, характерному для обездвиживающих повреждений. Постклимактерический остеопороз вызывается исчезновением эстрогенов, которое запускает механизм ускорения костного обмена десятилетней длительности с повышенной несбалансированностью между резорбцией старой кости и образованием новой кости. Это приводит к утончению, повышенной пористости и истощению трабекул костей, несущих нагрузку. Остеопороз часто сочетается с гипертиреозом, гиперпаратиреозом, синдромом Кушинга и применением некоторых стероидных лекарственных средств. Исторически лечебные средства включали в себя повышение содержания кальция в диете, эстрогенную терапию и повышенные дозы витамина D, но главным образом с такими агентами, как антирезорбтивы, которые ингибируют резорбцию костей остеокластами.
Остеопороз является основной причиной нетрудоспособности у пожилых, в частности, у пожилых женщин. Недавно поняли, что паратгормон человека (hРТН) и некоторые его аналоги являются стимуляторами костного роста, что является полезным при лечении остеопороза. Остеопороз представляет собой прогрессирующее заболевание, которое приводит к снижению общей костной массы и повышенной хрупкости кости. Это часто приводит к спонтанным переломам костей, несущих нагрузку, а также к физическому и психическому истощению, характерному для обездвиживающих повреждений. Постклимактерический остеопороз вызывается исчезновением эстрогенов, которое запускает механизм ускорения костного обмена десятилетней длительности с повышенной несбалансированностью между резорбцией старой кости и образованием новой кости. Это приводит к утончению, повышенной пористости и истощению трабекул костей, несущих нагрузку. Остеопороз часто сочетается с гипертиреозом, гиперпаратиреозом, синдромом Кушинга и применением некоторых стероидных лекарственных средств. Исторически лечебные средства включали в себя повышение содержания кальция в диете, эстрогенную терапию и повышенные дозы витамина D, но главным образом с такими агентами, как антирезорбтивы, которые ингибируют резорбцию костей остеокластами.
Паратгормон (РТН) продуцируется паращитовидной железой и является главным регулятором уровней кальция в крови. РТН представляет собой полипептид, и можно получить синтетические полипептиды с помощью способа, описанного Erickson и Merrifield (The Proteins, изд. Neurath et al., Academic Press, New York, 1976, page 257) и модифицированного способом Hodges et al. (1988) (Peptide Research 1, 19) или способом Atherton, E. и Sheppard, R.C. (Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989).
Когда уровень сывороточного кальция снижается ниже нормального, паращитовидная железа высвобождает РТН, и уровень кальция повышается в результате резорбции костного кальция, повышения поглощения кальция из кишечника и повышения почечной реабсорбции кальция из образующейся мочи в почечных канальцах. Хотя непрерывно вливаемые низкие уровни РТН могут удалять кальций из кости, те же низкие дозы при интермиттирующей инъекции могут фактически способствовать костному росту.
Tregear (Патент США 4086196) описал аналоги РТН человека и заявил, что от 27 до 34 первых аминокислот являются наиболее эффективными с точки зрения стимуляции аденилатциклазы в клеточном анализе in vitro. Rosenblatt в Патенте США 4771124 описал свойство аналогов hРТН, в которых Тrр23 замещен аминокислотами фенилаланином, лейцином, норлейцином, валином, тирозином, β-нафтилаланином или α-нафтилаланином, как антагонистов РТН. У данных модифицированных аналогов hРТН удалены также 2 и 6 N-концевые аминокислоты, в результате чего теряется большая часть агонистических активностей при использовании для лечения остеопороза. Данные аналоги были разработаны в качестве ингибиторов РТН и пептида, родственного РТН. Аналоги были заявлены как возможно полезные при лечении гиперкальцемии, связанной с некоторыми опухолями.
Pang et al. , WО 93/06845, опубликована 15 апреля 1993, описал аналоги hPTH, которые несут замены Arg25, Lys26, Lys27 различными аминокислотами, включая аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин. Они заявлены без подтверждающих данных испытаний на животном или человеке как являющиеся эффективными при лечении остеопороза с минимальными воздействиями на кровяное давление и гладкую мускулатуру.
РТН действует через активацию двух систем вторичных мессенджеров - аденилатциклазы (АС), активируемой Gs-белком, и фосфолипазы Cβ, активируемой Gq-белком. Последняя приводит к стимуляции активности мембраносвязанной протеинкиназы Cs (PKC). Показано, что для активности РКС требуются остатки РТН с 29 по 32 (Jouishomme et al. (1994) J. Bone Mineral Res. 9 (1179-1189). Установлено, что увеличение костного роста, то есть тот эффект, который является полезным при лечении остеопороза, связан со способностью пептидной последовательности повышать активность АС. Показано, что нативная последовательность РТН обладает всеми этими активностями. Последовательность hPTH-(1-34) типично представлена как (А):
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe-OH (SEQ ID 22) A
Следующий линейный аналог, hPTH-(1-31)-NH2, данные для которого включены в табл. 1 ниже, обладает только АС-стимулирующей активностью, и показано, что он является полностью активным в восстановлении разрежения кости на модели овариэктомированной крысы (Rixon, R.H. et al. (1994) J. Bone Mineral Res. 9, 1179-1189; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue Int. 58, 81-87; Willick et al., Патент США 5556940, опубликован 17 сентября 1996):
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val-NH2 В
Вышеуказанная молекула В может иметь свободное карбоксильное окончание вместо изображенного амидного окончания.
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe-OH (SEQ ID 22) A
Следующий линейный аналог, hPTH-(1-31)-NH2, данные для которого включены в табл. 1 ниже, обладает только АС-стимулирующей активностью, и показано, что он является полностью активным в восстановлении разрежения кости на модели овариэктомированной крысы (Rixon, R.H. et al. (1994) J. Bone Mineral Res. 9, 1179-1189; Whitfield et al. (1996), Calcified Tissue Int. 58, 81-87; Willick et al., Патент США 5556940, опубликован 17 сентября 1996):
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val-NH2 В
Вышеуказанная молекула В может иметь свободное карбоксильное окончание вместо изображенного амидного окончания.
Задачей настоящего изобретения является создание новых аналогов РТН с большей метаболической стабильностью, повышенной активностью в восстановлении кости, повышенной АС активностью и минимальными клиническими побочными эффектами.
Краткая сущность изобретения
По одному аспекту изобретения предлагается паратгормон человека hРТН и его фармацевтически приемлемые соли, имеющие аминокислотную последовательность
R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID 23),
где
R=водород,
R1=Ser,
R2=Met или Nle,
R3=His или водорастворимая аминокислота,
R4=Leu или водорастворимая аминокислота,
R5=Asn или водорастворимая аминокислота,
R6=Ser или водорастворимая аминокислота,
R7=Met или NIe,
R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asp,
R9=Arg,
R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp,
R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, NIe, Ile или Туг,
R12=Gln,
R13=Asp, Cys или Lys,
X=OH, NH2 и
Y= X, Val-X, или Val-His-Asn-Phe-X (SEQ ID 24), циклизованную как между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Asp.
По одному аспекту изобретения предлагается паратгормон человека hРТН и его фармацевтически приемлемые соли, имеющие аминокислотную последовательность
R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID 23),
где
R=водород,
R1=Ser,
R2=Met или Nle,
R3=His или водорастворимая аминокислота,
R4=Leu или водорастворимая аминокислота,
R5=Asn или водорастворимая аминокислота,
R6=Ser или водорастворимая аминокислота,
R7=Met или NIe,
R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asp,
R9=Arg,
R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp,
R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, NIe, Ile или Туг,
R12=Gln,
R13=Asp, Cys или Lys,
X=OH, NH2 и
Y= X, Val-X, или Val-His-Asn-Phe-X (SEQ ID 24), циклизованную как между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Asp.
Примеры солей включают в себя соли неорганических кислот, соли органических кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, винная кислота и лимонная кислота, соли неорганических оснований, таких как натрий и аммоний, и соли органических оснований, таких как триэтиламин, этиламин и метиламин.
По другому признаку настоящего изобретения циклизация осуществляется путем образования лактамов, заключающегося в связывании боковых цепей выбранных аминокислотных пар, как например между природными остатками 22 и 26, либо 26 и 30. Предполагаются также другие типы циклизаций, такие как образование дисульфидного мостика, например между Суs содержащими аналогами Cys22-Cys26 и Cys26-Cys30.
Обнаружили также, что замены различных аминокислот являются эффективными. Lys27 может быть заменен Leu либо различными другими естественно встречающимися гидрофобными или полярными остатками. Другим фактором является то, насколько хорошо данный остаток соответствует рецептору. Аlа не является таким гидрофобным, как Leu. Lys и Туr, как правило, считаются полярными, но тем не менее имеют гидрофобные взаимодействия с рецептором. Lys, например, может складываться таким образом, что его гидрофобная часть взаимодействует с другими гидрофобными остатками в рецепторе, a NH2 доступна для растворителя. Такие замены включают в себя орнитин, цитруллин, α-аминомасляную кислоту, аланин, норлейцин, изолейцин и тирозин, либо любую нормальную или разветвленную α-амино алифатическую кислоту, имеющую от 2 до 10 атомов углерода в боковой цепи, любой такой аналог, имеющий полярную или заряженную группу на конце алифатической цепи. Примеры полярных или заряженных групп включают в себя: амино, карбоксил, ацетамидо, гуанидо и уреидо. Хотя оказывается, что Leu27 является лучшей заменой, также оказывается, что многие другие замены в положении 27 сохраняют почти полную активность и также могут обладать желаемыми свойствами, такими как повышенная протеолитическая стабильность или водорастворимость, и ожидается, что Il, норлейцин, Met и орнитин являются наиболее активными.
Данная замена приводит к стабилизации α-спирали в рецептор-связывающем районе гормона. Это подтверждено исследованием спектра циркулярного дихроизма лактамных аналогов по сравнению со спектром циркулярного дихроизма линейной молекулы [Leu27]-hPTH-(1-31)-NH2. Спектры циркулярного дихроизма являются высоко чувствительными к присутствию α-спиральной вторичной структуры, и эта методика использована, чтобы продемонстрировать наличие α-спирали в фрагментах hPTH (Neugebauer et al. (1991) Biochemistry 31, 2056-2063). Кроме того, показана стабилизация α-спирали при образовании вышеупомянутых лактамов в hPTH-(20-34)-NH2 (Neugebauer et al. (1994) Int. J. Protein Peptide Res. 43, 555-562). Существует потенциальная амфифильная α-спираль между остатками 21 и 31 hPTH-(1-31)-NH2, и представлены данные, показывающие, что гидрофобная поверхность этой спирали взаимодействует с рецептором РТН (Neugebauer, W. (1995) et al. Biochemistry 34, 8835-8842; Gardella, T.J. et al. (1993), Endocrinology 132, 2024-2030).
Обнаружено, что наиболее эффективная циклизация включает в себя образование лактама, например либо между остатками Glu22 и Lys26, либо между Lys26 и Asp30. Возможны также другие циклизации, как например между Lys27 и Asp30, хотя обнаружено, что данный лактам оказывает некоторое дестабилизирующее воздействие на α-спираль.
Более конкретно, исследования связывания с рецептором фрагментов РТН выявили главный связывающий район между остатками 14-341. Авторы изобретения предположили, что остатки 17-29 α-спирали также связываются с рецептором РТН, и что амфифильная часть данной α-спирали связывается своей гидрофобной поверхностью с рецептором2. Данная модель согласуется с результатами исследования аналогов рецептор-связывающего района3.
ЯМР исследования показали, что даже модельный пептид, который является высоко спиральным, как обнаружено с помощью CD, также образует множество неспиральных конформаций. Таким образом, структуру рецептор-связанного пептидного гормона, такого как РТН, нельзя достоверно предположить исходя из его свободной структуры в растворе. Ограниченные аналоги пептидных гормонов использовали, чтобы лимитировать количество конформационных состояний, доступных для пептида8. Исследование последовательности hPTH выявляет 3 возможных солевых мостика между остатками 17-29, которые могут либо стабилизировать, либо дестабилизировать α-спираль. Эти мостики находятся между Glu22 и Lys26 и между Lys26 и Asp30, и ожидается, что оба они стабилизируют α-спираль, а также между Lys27 и Asp30, и ожидается, что они дестабилизируют α-спираль4. Образование лактама между данными парами остатков должно ограничивать конформации, доступные для hPTH в этом спиральном районе. Кроме того, два из этих лактамов, Glu22 - Lys26 и Lys26 - Asp30, для которых ожидается, что они стабилизируют α-спиральную структуру, локализованы на полярной стороне амфифильной части α-спирали. Для третьего, Lys27 - Asp30, ожидается, что он по меньшей мере частично дестабилизирует α-спираль и включает в себя остаток Lys27, который находится на гидрофобной поверхности амфифильной спирали. Циклизация, как, например, между положениями 25 и 29, также может происходить, если Lys и Оrn замещают Аrg в положении 25, и если Gln29 заменен Glu или Asp.
Замена Leu на Lys27 имеет результатом более гидрофобный остаток на гидрофобной поверхности амфифильной спирали. Это приводит к повышенной активности, стимулирующей аденилатциклазу, в клеточной линии ROS. Специалистам следует учитывать, что другие такие замены, обсуждаемые выше, вероятно должны приводить к аналогам с такими же или повышенными активностями.
Ожидается, что комбинированный эффект замены и образования лактама стабилизирует α-спираль, повышает биологическую активность и защищает данный район молекулы от протеолитического расщепления. Наличие амида на С-конце является предпочтительным в том смысле, что, кроме того, ожидается, что это защищает пептид от экзопротеолитического расщепления, хотя некоторые пептидазы могут гидролизовать их (Leslie, F.M. and Goldstein, A. (1982) Neuropeptides 2, 185-196).
Обнаружено также, что возможно успешно осуществлять и другие аминокислотные замены. Конкретно, авторы заменили чувствительный к окислению остаток Met в положениях 8, 18 естественно встречающимся гидрофобным остатком NIe, как описано в Japanese Patent publication 61-24598. Следует также ожидать, что другие такие гидрофобные остатки, как Leu, Ile, Val, Phe и Тrр будут также пригодны, как описано в Патенте США 5393869, Nakagawa et al.
Обратные лактамы также предполагаются. Например, авторы изобретения показали эффективность переключения Lys22-Glu26. Поэтому следует ожидать, что подобные переключения, как между лактамами 26-30 и 27-30, можно успешно осуществлять.
Другая замена в предпочтительном 22-26 лактамном сайте, в дополнение к вышеупомянутой Cys-Cys, то есть Asp22-Orn26, была сделана, чтобы проиллюстрировать, что возможно успешно получать различные размеры циклизации/кольца.
В Патенте США 5393869, Nakagawa et al., и Патенте США 5434246, Fukuda et al. сообщалось о некоторых замещенных аналогах hРТН, обладающих существенной АС активностью и, возможно, обладающих повышенными стабильностями к протеолитической атаке, в частности
1. Ser-1 на Aib (α-аминоизомасляная кислота).
1. Ser-1 на Aib (α-аминоизомасляная кислота).
2. Lys-27 на Gln (сообщалось, что обладает 2,5х АС активностью).
3. Остатки 14, 15, 16, 17 на Lys, в целом или частично (сообщалось, что намного повышает активность - до 8х. Это может быть связано с повышением водорастворимости. Ожидается, что in vivo они являются более лабильными к трипсиноподобным ферментам). Авторы заявляют, что данный тетрапептид (остатки 14-17, включительно) является таким, что в нем есть по меньшей мере одна водорастворимая аминокислота. Например, His-14 или Lys-14; Leu-15, Lys-15 или Arg-15; Asn-16, Orn-16, Hci (гомоцитруллин)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, Dlys-16, Ser-16 или Gly-16; и 17-Ser, 17-Lys, 17-Asp или 17-Arg. Может включать также Glu, например.
4. Arg 25 на His для минимизации протеазной атаки. Поскольку описываемые в данном изобретении лактамы, в частности с Leu или другой гидрофобной аминокислотой в положении 27, могут стать до некоторой степени нерастворимыми, а также трудно растворимыми, следует ожидать, что те же замены могут быть пригодны для описываемых лактамов.
Специалистам следует также учитывать, что, хотя циклические 1-31 h-РТН могут являться предпочтительными, следует ожидать исходя из представленных здесь данных, что циклические фрагменты в пределах от 1-30 до 1-37 также будут эффективны. В частности, в литературе не имеется данных, что наличие дополнительных аминокислот вплоть до 37 влияет на биологические свойства гормона, в частности представлены включенные здесь данные, подтверждающие 1-34.
Лактамы по изобретению можно получить с помощью известных методик, описанных ниже, и можно применять их для стимуляции костного роста, для восстановления кости и для того, чтобы способствовать заживлению кости при различных обстоятельствах, как например при лечении остеопороза и обычных переломов.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показана структура природного РТН человека, остатки 1-31 (SEQ ID :1).
На фиг. 1 показана структура природного РТН человека, остатки 1-31 (SEQ ID :1).
На фиг. 2 показана структура [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :3).
На фиг. 3 показана структура [Leu27]цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :4).
На фиг. 4 показаны активности аналогов по изобретению в стимуляции аденилатциклазы клеток ROS 17/2.
На фиг.5 показаны репрезентативные гистологические срезы костей, полученные по окончании 8 недель после OVX, иллюстрирующие различные способности hРТН-(1-31)-NН2 и его лактамных производных предотвращать разрежение кости и стимулировать костный рост у овариэктомированных (OVX) крыс Sprague-Dawley.
На фиг. 6 показан объем губчатой кости контрольных животных и животных, которых лечили hРТН, для крыс с исходно тяжелым истощением кости. Лечение животных начинали через 9 недель после OVX. [Leu27]циклo[Glu22-Lys26]hPTH-(1-31)-NH2 являлся наиболее эффективным из фрагментов, восстанавливая кости до объемов нормальных контрольных крыс.
На фиг.7 показана толщина трабекул бедренных костей крыс для нормальных, овариэктомированных (OVX), ложно-овариэктомированных животных и животных, которых лечили hPTH-(1-31)-NH2, [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hРТН-(1-31)-NH2 и [Leu27]цикло(Lуs26-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NH2.
На фиг. 8 показано максимальное понижение кровяного давления и время до максимального понижения кровяного давления при добавлении 0,8 нмоль/100 г дозы hPTH-(1-31)-NH2, [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 или [Leu27] цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2. Пептиды вводили либо подкожно (незаштрихованная полоса), либо внутривенно (заштрихованная полоса).
На фиг.9 показана структура [Leu27]-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :5).
На фиг.10 показана структура цикло(Lys27-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :6).
На фиг. 11 показана структура [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-30)-NH2 (SEQ ID :7).
На фиг.12 показаны активности, стимулирующие аденилатциклазу, различных аналогов по изобретению.
На фиг. 13 показаны гипотензивные действия hPTH-(1-31)-NH2 и hРТН-(1-30)-NH2 и их циклических аналогов.
Фиг. 14 представляет собой график, иллюстрирующий воздействие различных дозировок линейного hPTH-(1-31)-NH2 на костный рост.
На фиг. 15 показана структура [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-OH (SEQ ID :8).
На фиг. 16 показана структура [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-34)-NH2 (SEQ ID :9).
На фиг. 17 показана структура [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-34)-OH (SEQ ID :10).
На фиг. 18 показана структура [Ala27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :11).
На фиг. 19 показана структура [NIe27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID : 12).
На фиг.20 показана структура [NIe8,18; Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :13).
На фиг.21 показана структура цикло(Glu22-Lys26)- hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID : 14).
На фиг. 22 показана структура [Ile27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID : 15).
На фиг. 23 показана структура [Tyr27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :16).
На фиг.24 показана структура α-aцeтил-[Leu27]циклo(Glu22-Lys26)- hРТН-(1-31)-NH2 (SEQ ID :17).
На фиг. 25 показана структура [Leu27]цикло(Lys22-Glu26)- hРТН-(1-31)-NН2 (SEQ ID :18).
На фиг. 26 показана структура [Leu27]цикло(Аsр22-Оrn26)- hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :19).
На фиг. 27 показана структура [Cys22; Cys26; Leu27] цикло(Сys22-Cys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (SEQ ID :20).
На фиг. 28 показана структура [Cys26; Cys30; Leu27] цикло(Cys26-Cys30)-hРТН-(1-31)-NН2 (SEQ ID :21).
Получение аналогов гормона
Методика твердофазного пептидного синтеза, разработанная R.B.Merrifield ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology 32, 221-296, 1969), включенная здесь путем ссылки, широко и успешно применяется для синтеза полипептидов, таких как паратгормон. Стратегия основана на наличии карбоксил-терминальной аминокислоты пептида, присоединенной к твердому носителю. Последующие аминокислоты затем добавляют в большом избытке. N-концевую α-аминогруппу защищают таким образом, что данную защитную группу можно удалить без удаления пептида с твердого носителя. В химический процесс, используемый здесь, включена модификация исходного способа по Меррифилду, на который ссылаются как на Fmoc-подход. Группу Fmoc (фторенилметоксикарбонил) можно удалить с использованием мягких щелочных условий, которые оставляют щелочестабильные защитные группы боковой цепи и связь с носителем незатронутыми. Данная методика описана Е. Atherton и R.C. Sheppard ("Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N.Y.), включенная здесь путем ссылки.
Методика твердофазного пептидного синтеза, разработанная R.B.Merrifield ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology 32, 221-296, 1969), включенная здесь путем ссылки, широко и успешно применяется для синтеза полипептидов, таких как паратгормон. Стратегия основана на наличии карбоксил-терминальной аминокислоты пептида, присоединенной к твердому носителю. Последующие аминокислоты затем добавляют в большом избытке. N-концевую α-аминогруппу защищают таким образом, что данную защитную группу можно удалить без удаления пептида с твердого носителя. В химический процесс, используемый здесь, включена модификация исходного способа по Меррифилду, на который ссылаются как на Fmoc-подход. Группу Fmoc (фторенилметоксикарбонил) можно удалить с использованием мягких щелочных условий, которые оставляют щелочестабильные защитные группы боковой цепи и связь с носителем незатронутыми. Данная методика описана Е. Atherton и R.C. Sheppard ("Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N.Y.), включенная здесь путем ссылки.
Пример 1
Синтез и очистка линейных hРТН-(1-31)-амидных аналогов
α-аминогруппы аминокислот защищали с использованием 9-фторенил-метоксикарбонила (Fmoc) в процессе связывания. Связывания осуществляли с использованием смеси гидроксибензотриазола (HOBt), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторбората (TBTU) и диизопропилэтиламина (DIPEA). Использовали 4-кратный избыток активированных аминокислот при двойном связывании при добавлении остатков Asn, Gln, His, Val и Ile. Время связывания для добавлений Аrg и Gly увеличивали от 30 до 60 мин. Связывание первого остатка (Val31) с носителем (Tentagel* R, Rapp Polymere, Tubingen, Germany) осуществляли вручную. Все другие стадии осуществляли на автоматическом синтезаторе пептидов PerSeptive Biosystems* Model 9050 Plus. Защиты боковых цепей представляли собой следующее: Аrg (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил); Glu, Asp и Ser (трет-бутил); His, Gln и Asn (тритил); Тrр (трет-бутоксикарбонил).
Синтез и очистка линейных hРТН-(1-31)-амидных аналогов
α-аминогруппы аминокислот защищали с использованием 9-фторенил-метоксикарбонила (Fmoc) в процессе связывания. Связывания осуществляли с использованием смеси гидроксибензотриазола (HOBt), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторбората (TBTU) и диизопропилэтиламина (DIPEA). Использовали 4-кратный избыток активированных аминокислот при двойном связывании при добавлении остатков Asn, Gln, His, Val и Ile. Время связывания для добавлений Аrg и Gly увеличивали от 30 до 60 мин. Связывание первого остатка (Val31) с носителем (Tentagel* R, Rapp Polymere, Tubingen, Germany) осуществляли вручную. Все другие стадии осуществляли на автоматическом синтезаторе пептидов PerSeptive Biosystems* Model 9050 Plus. Защиты боковых цепей представляли собой следующее: Аrg (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил); Glu, Asp и Ser (трет-бутил); His, Gln и Asn (тритил); Тrр (трет-бутоксикарбонил).
После удаления Fmoc с N-концевого Ser содержащую пептид смолу промывали DCM, затем отщепляли пептид от смолы посредством встряхивания с 7,5 мл реагента К (6,19 мл TFA, 0,38 мл каждого из: воды, 90% фенол/воды и тиоанизола, и 0,19 мл 1,2-этандитиола) в течение 4 ч при 20oС. Отщепленную пептидную смесь отделяли посредством фильтрования и осаждали посредством добавления к трет-бутил-метилэфиру. Осадок собирали посредством центрифугирования, дважды промывали трет-бутил-метилэфиром, затем высушивали посредством вакуумного центрифугирования.
Сырой продукт растворяли в 14 мл 15% ацетонитрила/вода, 0,1% TFA и подвергали хроматографии на колонке Vydac* C18 (10 мкм, 1х25 см). Продукт элюировали 1%/мин градиентом ацетонитрила (14-40%) в 0,1% TFA в воде. Чистоту конечного продукта оценивали посредством аналитической ВЭЖХ на колонке Vydac* C18 (10 мкм, 0,4х25 см) и посредством анализа молекулярной массы на масс-спектрометре с ионизацией электроразбрызгиванием (VG Quattro). Данные для полученного таким образом hPTH-(1-31)-NH2 приводятся в табл. 1 ниже.
Пример 2
Синтез и очистка циклических аналогов
[Leu27] циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Данный пептид синтезировали, как описано в примере 1, с замещением Lys-Alloc и Glu-OAII в положениях 26 и 22, соответственно. После добавления Fmoc-Ser17 пептид-содержащую смолу удаляли из колонки в реакционный флакон (Minivial*, Applied Science), суспендировали в 1,7 мл раствора тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,24 ммоль), 5% уксусной кислоты и 2,5% N-метилморфолина (NMM) в дихлорметане (DCM) в атмосфере аргона, затем встряхивали при 20oС в течение 6 ч для удаления аллил- и аллок-защитных групп (Sole, N.A. et al. (1993) в Peptides: Chemistry, Structure and Biology, изд. Smith, J. and Hodges, R., ESCOM pp. 93-94), что включено здесь путем ссылки. Пептид-содержащую смолу затем промывали с использованием 0,5% диэтилдитиокарбамата (DEDT), 0,5% NMM в DMF (50 мл), затем DMF (50 мл) и DCM (50 мл). Пептид (0,06 ммоль) циклизовали посредством встряхивания с 0,06 ммоль 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt)/0,12 ммоля NMM в 2 мл DMF в течение 14 ч при 20oС (Carpino, L.A. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398). Пептид-содержащую смолу фильтровали, затем промывали один раз DMF, снова заполняли ею колонку и промывали DMF, пока пузыри не удалялись из суспензии. Оставшийся синтез осуществляли, как в примере 1, за исключением того, что N-концевую Fmoc группу не удаляли. Fmoc-пептид отщепляли от смолы с использованием реагента К, как описано выше. ВЭЖХ осуществляли как в примере 1 с удалением группы Fmoc перед проведением конечной ВЭЖХ.
Синтез и очистка циклических аналогов
[Leu27] циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Данный пептид синтезировали, как описано в примере 1, с замещением Lys-Alloc и Glu-OAII в положениях 26 и 22, соответственно. После добавления Fmoc-Ser17 пептид-содержащую смолу удаляли из колонки в реакционный флакон (Minivial*, Applied Science), суспендировали в 1,7 мл раствора тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (0,24 ммоль), 5% уксусной кислоты и 2,5% N-метилморфолина (NMM) в дихлорметане (DCM) в атмосфере аргона, затем встряхивали при 20oС в течение 6 ч для удаления аллил- и аллок-защитных групп (Sole, N.A. et al. (1993) в Peptides: Chemistry, Structure and Biology, изд. Smith, J. and Hodges, R., ESCOM pp. 93-94), что включено здесь путем ссылки. Пептид-содержащую смолу затем промывали с использованием 0,5% диэтилдитиокарбамата (DEDT), 0,5% NMM в DMF (50 мл), затем DMF (50 мл) и DCM (50 мл). Пептид (0,06 ммоль) циклизовали посредством встряхивания с 0,06 ммоль 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt)/0,12 ммоля NMM в 2 мл DMF в течение 14 ч при 20oС (Carpino, L.A. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398). Пептид-содержащую смолу фильтровали, затем промывали один раз DMF, снова заполняли ею колонку и промывали DMF, пока пузыри не удалялись из суспензии. Оставшийся синтез осуществляли, как в примере 1, за исключением того, что N-концевую Fmoc группу не удаляли. Fmoc-пептид отщепляли от смолы с использованием реагента К, как описано выше. ВЭЖХ осуществляли как в примере 1 с удалением группы Fmoc перед проведением конечной ВЭЖХ.
Аналог [Lеu27] цикло(Lуs26-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NH2 получали аналогичным способом.
Пример 3
Аденилатциклазные анализы
Способность аналогов hPTH связываться с рецепторами и активировать сигнальный механизм, связанный с аденилатциклазой, определяли на компетентной к дифференцировке, остеобластоподобной клеточной линии ROS 17/2 остеосаркомы крысы (ROS). Известно, что данная активность тесно связана со способностью аналога к восстановлению костной массы у овариэктомированной крысы. Активность, стимулирующую аденилатциклазу, оценивали с помощью предварительного мечения клеточного пула АТФ [3Н]-аденином и последующего измерения количества [3H]-циклического АМФ, продуцируемого из [3H]-АТФ в течение первых 10 мин экспозиции с конкретным аналогом. Данная методика основывалась на методике, описанной Whitfield et al. (J. Cellular Physiology 150, 299-303, 1992), включенной здесь путем ссылки.
Аденилатциклазные анализы
Способность аналогов hPTH связываться с рецепторами и активировать сигнальный механизм, связанный с аденилатциклазой, определяли на компетентной к дифференцировке, остеобластоподобной клеточной линии ROS 17/2 остеосаркомы крысы (ROS). Известно, что данная активность тесно связана со способностью аналога к восстановлению костной массы у овариэктомированной крысы. Активность, стимулирующую аденилатциклазу, оценивали с помощью предварительного мечения клеточного пула АТФ [3Н]-аденином и последующего измерения количества [3H]-циклического АМФ, продуцируемого из [3H]-АТФ в течение первых 10 мин экспозиции с конкретным аналогом. Данная методика основывалась на методике, описанной Whitfield et al. (J. Cellular Physiology 150, 299-303, 1992), включенной здесь путем ссылки.
Результаты по аденилатциклазе отражены в табл. 2 ниже в виде концентрации, необходимой для проявления половины максимального увеличения АС активности. Эти данные также изображены на фиг.4. На фиг.4 закрашенные кружки показывают стимулирующую аденилатциклазу активность, hPTH-(1-31)-NH2, а активности [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 и [Leu27]цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)NH2 показаны с помощью незакрашенных и закрашенных треугольников, соответственно.
Пример 4
Определение анаболических активностей аналогов hРТН с использованием модели овариэктомированной крысы
Дозировки:
Дозы были основаны на данных доза-ответ по hРТН-(1-31)-NН2. Костеобразующую эффективность hPTH-(1-31)-NH2 тестировали с использованием нескольких доз (0,8, 0,6, 0,4 и 0,2 нмоль/100 г массы тела) и регенеративной модели, или модели скорее для оценки лечения, чем профилактики.11 Овариэктомированных крыс 3-месячного возраста оставляли на 9 недель, чтобы дать по большей части не пластинчатой бедренной губчатой кости тяжело истощиться, прежде чем начинать ежесуточные инъекции в течение 6 недель. К концу 9-й недели они теряли примерно 75% костной массы бедренной губчатой кости. На фиг. 14 показано зависимое от дозы увеличение средней толщины трабекул, вызванное отложением костных пластинок, которое было получено в результате 36 инъекций 4 различных доз фрагмента. Фрагмент также был способен стимулировать рост губчатой кости у крыс значительно более старшего возраста. Таким образом, 36 инъекций дозы среднего диапазона 0,6 нмоль/100 г массы тела hРТН-(1-31)-NН2 были способны значительно увеличить среднюю толщину трабекул по сравнению с обычной исходной величиной предварительно истощенной (9 недель после OVX) бедренной губчатой кости крыс в возрасте 1 года, и были так же эффективны, как hРТН-(1-84). Соответственно, в дальнейших опытах использовали дозировку 0,6 нмоль/100 г массы тела.
Определение анаболических активностей аналогов hРТН с использованием модели овариэктомированной крысы
Дозировки:
Дозы были основаны на данных доза-ответ по hРТН-(1-31)-NН2. Костеобразующую эффективность hPTH-(1-31)-NH2 тестировали с использованием нескольких доз (0,8, 0,6, 0,4 и 0,2 нмоль/100 г массы тела) и регенеративной модели, или модели скорее для оценки лечения, чем профилактики.11 Овариэктомированных крыс 3-месячного возраста оставляли на 9 недель, чтобы дать по большей части не пластинчатой бедренной губчатой кости тяжело истощиться, прежде чем начинать ежесуточные инъекции в течение 6 недель. К концу 9-й недели они теряли примерно 75% костной массы бедренной губчатой кости. На фиг. 14 показано зависимое от дозы увеличение средней толщины трабекул, вызванное отложением костных пластинок, которое было получено в результате 36 инъекций 4 различных доз фрагмента. Фрагмент также был способен стимулировать рост губчатой кости у крыс значительно более старшего возраста. Таким образом, 36 инъекций дозы среднего диапазона 0,6 нмоль/100 г массы тела hРТН-(1-31)-NН2 были способны значительно увеличить среднюю толщину трабекул по сравнению с обычной исходной величиной предварительно истощенной (9 недель после OVX) бедренной губчатой кости крыс в возрасте 1 года, и были так же эффективны, как hРТН-(1-84). Соответственно, в дальнейших опытах использовали дозировку 0,6 нмоль/100 г массы тела.
Полное описание протокола дано Rixon et al. (J. Bone & Mineral Research 9, 1179-1189, 1984) и Whitfield et al. (Calcif. Tissue Int. 58, 81-87, 1996), включенных здесь путем ссылки. Нормальных, ложно-OVX (овариэктомированных) и OVX крыс Sprague-Dawley (3-месячного возраста: 255-260 г) получали от Charles River Laboratories (St. Constant, QC). Крыс случайным образом разделяли на группы по 8 животных при получении. Крысы получали свободный доступ к пище и воде. Незапланированных смертей не было. Животные получали по 6 подкожных инъекций за неделю по одному разу в сутки, начиная с конца второй недели после OVX и заканчивая в конце 8-й недели после OVX (то есть, 36 инъекций). Восемь ложно-OVX и 8 OVX контрольных крыс получали 36 инъекций растворителя (0,15 М NaCl содержащий 0,001 н. HCl), тогда как 8 OVX крыс получали 0,6 нмоль фрагмента в растворителе/100 г массы тела. В конце 8-й недели после OVX бедренные кости извлекали, выделяли, очищали, разрезали пополам в среднем диафизе и проксимальную половину отбрасывали. После удаления эпифиза каждую половину бедренной кости расщепляли по длине на две части и вымывали костный мозг.
Костеобразующие эффективности фрагментов оценивали исходя из изменений в средней толщине (площадь/периметр) трабекулы в дистальных половинах бедренных костей из животных, которых лечили по-разному. Чтобы измерить среднюю толщину трабекулы, две деминерализованные половины бедренных костей от каждой крысы дегидратировали и заключали в парафин. Получали продольные срезы 10 мкм из средней плоскости каждой 'кости, а затем окрашивали их быстродействующим красителем Сандерсона для костной ткани (Surgipath Medical Industries, Inc. , Winnipeg, MB, Canada). Среднюю толщину трабекулы измеряли с использованием системы визуализации М4 и программного обеспечения для морфометрии кости от Imaging Research Inc. (St. Catherines, ON, Canada).
Репрезентативные гистологические срезы костей, полученные в конце 8 недель после OVX, показаны на фиг. 5. Далее результаты представлены в виде диаграммы на фиг.7. Столбики показывают величины толщины трабекул нормальных, овариэктомированных (OVX), ложно-OVX, hPTH-(1-31)-NH2, [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)- hPTH-(1-31)-NH2 и [Leu27]цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2. [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)- hPTH-(1-31)-NH2 проявляет особенно высокую активность по сравнению с линейным аналогом, hPTH-(1-31)-NH2. Показано, что данный линейный аналог является полностью активным при восстановлении кости, но использует только один путь передачи клеточного сигнала (АС-активированный). Таким образом, ожидается, что данные циклические аналоги, как и их линейный аналог, обладают меньшими нежелательными клиническими побочными эффектами, чем их более длинные двойники, такие как hPTH-(1-34) или hPTH-(1-84), которые активируют оба механизма передачи клеточного сигнала.
Пример 5
Восстановление кости с помощью аналогов hРТН у крыс с тяжелым истощением губчатой кости
В данном втором примере восстановления кости сравниваются способности лактамных фрагментов восстанавливать тяжело истощенную губчатую кость. В данном эксперименте 6-недельную программу инъекций по одному разу в сутки 0,6 нмоль пептида/100 г массы тела молодым половозрелым крысам задерживали до конца 9-й недели после OVX. В это время 75% их губчатой кости было разрежено. Как видно на фиг.6, наиболее эффективным из фрагментов был [Leu27] циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Он восстанавливал объем губчатой кости до объемов кости нормальных контрольных крыс.
Восстановление кости с помощью аналогов hРТН у крыс с тяжелым истощением губчатой кости
В данном втором примере восстановления кости сравниваются способности лактамных фрагментов восстанавливать тяжело истощенную губчатую кость. В данном эксперименте 6-недельную программу инъекций по одному разу в сутки 0,6 нмоль пептида/100 г массы тела молодым половозрелым крысам задерживали до конца 9-й недели после OVX. В это время 75% их губчатой кости было разрежено. Как видно на фиг.6, наиболее эффективным из фрагментов был [Leu27] циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Он восстанавливал объем губчатой кости до объемов кости нормальных контрольных крыс.
Пример 6
Гипотензивные эффекты аналогов hPTH
Самок крыс Sprague-Dawley (массой свыше 290 г) анестезировали с использованием инъецируемого внутрибрюшинно пентобарбитала натрия (65 мг/кг массы тела). За ректальной температурой следили с использованием термистора YS1402 (Yellow Springs Instrument Co., Inc. Yellow Springs, ОН) и поддерживали ее между 36,0 и 38,5oC в течение всего эксперимента. За ушной температурой также следили с использованием кожухового термистора YSI. Хвостовую артерию обнажали, канюлировали с использованием катетера Jelco 25-glV (Johnson and Johnson Medical Inc. , Arlington, TX) и соединяли с датчиком давления Статама, сигналы с которого регистрировали пальцевым методом с использованием Biopac Systems MP100 Monitor (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Canada). Для внутривенной инъекции РТН или одного из его фрагментов обнажали также бедренную вену. После операции крысе давали возможность стабилизироваться в течение 8 мин, после чего РТН или один из его фрагментов (растворенный в подкисленном физиологическом растворе, содержащем 0,001 н. HCl) инъецировали в бедренную вену или под кожу живота. Данные собирали в течение 12 мин после внутривенной инъекции или в течение 22 мин после подкожной инъекции. На фиг.8 показано максимальное понижение кровяного давления и время до максимального понижения при добавлении дозы в 0,8 нмоль/100 г [Leu27] цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 или [Leu27] цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 для введения посредством либо подкожного (незаштрихованная полоса), либо внутривенного (заштрихованная полоса) пути введения. Аналог [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 проявляет повышенную биологическую доступность по сравнению с [Leu27]цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2. На это указывает значительно более короткое время, требующееся для понижения кровяного давления до минимума после подкожной инъекции. Оба циклических аналога проявляют повышенные гипотензивные эффекты при подкожной инъекции по сравнению с hРТН-(1-31)-NH2. Таким образом, ожидается, что каждый циклический лактамный аналог при подкожной инъекции обладает более желательными свойствами, чем линейный двойник. Эти свойства включают в себя большую биологическую доступность, являющуюся результатом повышенной устойчивости к протеазам и/или повышенной способности к транспортировке из липидного окружения. Последнее может быть связано со стабилизацией амфифильной спирали около С-конца гормона.
Гипотензивные эффекты аналогов hPTH
Самок крыс Sprague-Dawley (массой свыше 290 г) анестезировали с использованием инъецируемого внутрибрюшинно пентобарбитала натрия (65 мг/кг массы тела). За ректальной температурой следили с использованием термистора YS1402 (Yellow Springs Instrument Co., Inc. Yellow Springs, ОН) и поддерживали ее между 36,0 и 38,5oC в течение всего эксперимента. За ушной температурой также следили с использованием кожухового термистора YSI. Хвостовую артерию обнажали, канюлировали с использованием катетера Jelco 25-glV (Johnson and Johnson Medical Inc. , Arlington, TX) и соединяли с датчиком давления Статама, сигналы с которого регистрировали пальцевым методом с использованием Biopac Systems MP100 Monitor (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Canada). Для внутривенной инъекции РТН или одного из его фрагментов обнажали также бедренную вену. После операции крысе давали возможность стабилизироваться в течение 8 мин, после чего РТН или один из его фрагментов (растворенный в подкисленном физиологическом растворе, содержащем 0,001 н. HCl) инъецировали в бедренную вену или под кожу живота. Данные собирали в течение 12 мин после внутривенной инъекции или в течение 22 мин после подкожной инъекции. На фиг.8 показано максимальное понижение кровяного давления и время до максимального понижения при добавлении дозы в 0,8 нмоль/100 г [Leu27] цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 или [Leu27] цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 для введения посредством либо подкожного (незаштрихованная полоса), либо внутривенного (заштрихованная полоса) пути введения. Аналог [Leu27]циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 проявляет повышенную биологическую доступность по сравнению с [Leu27]цикло(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2. На это указывает значительно более короткое время, требующееся для понижения кровяного давления до минимума после подкожной инъекции. Оба циклических аналога проявляют повышенные гипотензивные эффекты при подкожной инъекции по сравнению с hРТН-(1-31)-NH2. Таким образом, ожидается, что каждый циклический лактамный аналог при подкожной инъекции обладает более желательными свойствами, чем линейный двойник. Эти свойства включают в себя большую биологическую доступность, являющуюся результатом повышенной устойчивости к протеазам и/или повышенной способности к транспортировке из липидного окружения. Последнее может быть связано со стабилизацией амфифильной спирали около С-конца гормона.
Дальнейшие результаты:
С целью получения данных результатов пептиды обозначали следующим образом:
hPTH-(1-31)-NH2 (1); [Leu27] -hPTH-(1-31)-NH2 (2) (фиг.9); [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (3) (фиг.2); [Lеu27]цикло(Lуs26-Аsр30)-hPTH-(1-31)-NH2 (4); цикло(Lуs27-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NН2 (5) (фиг.10); hРТН-(1-30)-NH2 (6); [Leu27] - hPTH-(1-30)-NH2 (7); [Leu27] цикло(Glu22-Lys26)-hРТН-(1-30)-NH2 (8).
С целью получения данных результатов пептиды обозначали следующим образом:
hPTH-(1-31)-NH2 (1); [Leu27] -hPTH-(1-31)-NH2 (2) (фиг.9); [Leu27]цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 (3) (фиг.2); [Lеu27]цикло(Lуs26-Аsр30)-hPTH-(1-31)-NH2 (4); цикло(Lуs27-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NН2 (5) (фиг.10); hРТН-(1-30)-NH2 (6); [Leu27] - hPTH-(1-30)-NH2 (7); [Leu27] цикло(Glu22-Lys26)-hРТН-(1-30)-NH2 (8).
Аденилатциклазные активности. Ранее авторы изобретения сообщали, что [Leu27]-hPTH-(1-34)-NH2 является более активным в стимуляции АС активности в клеточной линии ROS, чем hPTH-(1-34)-NH2.5 Авторы изобретения также обнаружили, что пептид 2 (EC50 11,5±5,2 нМ) является более активным, чем нативная последовательность 1 (ЕС50 19,9±3,9 нМ) (фиг.12). Изображены пептиды 1 (•); 2 (□); 3 (Δ); 4 ; 5 (О). Образование лактама между Glu22 и Lys26 (3) индуцировало еще большую АС-стимулирующую активность с величинами EC50 3,3±0,3 нМ (фиг.12). Таким образом, чистый эффект этой циклизации и замены Lys27 на Leu состоит примерно в 6-кратном повышении активности. Напротив, образование лактама либо между Lys26 и Аsр30 (4), либо между Lys27 и Аsр30 (5) приводило к потере стимуляции аденилатциклазы по сравнению с их исходными линейными последовательностями. Таким образом, лактам 26-30 (4) обладает немного меньшей активностью, чем его линейная форма, с EC50 17,0±3,3 нМ по сравнению с 11,5±5,2 нМ для (2). Образование лактама 27-30 (5) более заметно снижает активность исходного линейного пептида, обладая EC50 40,3±4,4 нМ по сравнению с 19±3,9 нМ для (1).
Авторы изобретения ранее сообщали, что hPTH-(1-30)-NH2 (6) обладает АС-стимулирующей активностью (EC50, 20 нМ), близкой к таковой для аналога 1. В настоящее время авторы изобретения обнаружили, что [Lеu27]-hРТН-(1-30)NH2 (7) и цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-30)-NH2 (8) (фиг.11) обладают АС-стимулирующей активностью, близкой к активности пептида 6.
Гипотензивные эффекты:
На фиг.13 показано гипотензивное действие линейных (6 и 7) и циклических лактамных аналогов (3 и 8). Показано максимальное понижение кровяного давления (сверху), полученное при инъецировании крысе 0,8 нмоль аналога/100 г массы тела, и время, затраченное на достижение максимального понижения кровяного давления (ниже). Аналоги (слева направо пептиды 8, 7, 6, 3) инъецировали либо внутривенно (темный столбик), либо подкожно (незакрашенный столбик). Удаление Val31 привело к тому, что все аналоги 6, 7 и 8 обладали значительно (р<0,05) сниженной скоростью транспорта пептидов, инъецированных подкожно, в сосудистую систему (фиг.13). Действительные значения общего понижения кровяного давления для пептидов 6 и 8, тем не менее, отличались незначительно (р>0,05) от таковых для других аналогов при введении либо подкожно, либо внутривенно, за исключением пептида 5.
На фиг.13 показано гипотензивное действие линейных (6 и 7) и циклических лактамных аналогов (3 и 8). Показано максимальное понижение кровяного давления (сверху), полученное при инъецировании крысе 0,8 нмоль аналога/100 г массы тела, и время, затраченное на достижение максимального понижения кровяного давления (ниже). Аналоги (слева направо пептиды 8, 7, 6, 3) инъецировали либо внутривенно (темный столбик), либо подкожно (незакрашенный столбик). Удаление Val31 привело к тому, что все аналоги 6, 7 и 8 обладали значительно (р<0,05) сниженной скоростью транспорта пептидов, инъецированных подкожно, в сосудистую систему (фиг.13). Действительные значения общего понижения кровяного давления для пептидов 6 и 8, тем не менее, отличались незначительно (р>0,05) от таковых для других аналогов при введении либо подкожно, либо внутривенно, за исключением пептида 5.
АНАЛИЗ. СВЯЗЫВАЮЩИЙ ГИПОТЕНЗИВНЫЙ ЭФФЕКТ С ОСТЕОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Как описано в примере 6 и проиллюстрировано на фиг.8, быстрый гипотензивный эффект, наблюдаемый после подкожной инъекции аналогов hPTH, коррелирует с остеогенной активностью. Соответственно, данный анализ является полезным для скриннинга подходящих аналогов hPTH на остеогенный эффект и для того, чтобы элиминировать негипотензивные конструкции без необходимости жертвовать подопытными лабораторными животными.
Как описано в примере 6 и проиллюстрировано на фиг.8, быстрый гипотензивный эффект, наблюдаемый после подкожной инъекции аналогов hPTH, коррелирует с остеогенной активностью. Соответственно, данный анализ является полезным для скриннинга подходящих аналогов hPTH на остеогенный эффект и для того, чтобы элиминировать негипотензивные конструкции без необходимости жертвовать подопытными лабораторными животными.
Основываясь на истории вопроса, авторы изобретения использовали уникальный набор остеогенных и неостеогенных AC-, AC/PLC- или PLC-активирующих фрагментов РТН, чтобы определенно доказать, что только стимуляция АС снижает кровяное давление, и чтобы сравнить гипотензивные действия данных фрагментов при их подкожной или внутривенной инъекции самкам крыс. Авторы изобретения показали, что гипотензивный ответ запускается только АС- или AC/PLC-стимулирующими фрагментами, и что имеет место относительно низкий гипотензивный ответ на подкожную инъекцию и незначительно более высокий ответ на внутривенную инъекцию, что коррелирует с остеогенными активностями hPTH-(1-31)-NH2, hPTH-(1-34) и hPTH-(1-84) у OVX крыс, но не коррелирует для hPTH-(1-30)-NH2, который стимулирует АС и снижает кровяное давление, но не стимулирует костеобразование.
Конкретно, hPTH-(1-84) и его фрагменты hРТН-(1-34), hPTH-(1-31)-NH2 и hPTH-(1-30)-NH2 снижали давление в хвостовой артерии у анестезированной самки крыс Sprague-Dawley на 42,4-67,1% в течение примерно 1 мин после инъекции в бедренную вену, но снижали давление только на величину от 8,5 до 36,2% в течение от 2 до 19 мин после подкожной инъекции. hРТН-(1-84) и hPTH-(1-34) стимулируют как аденилатциклазу, так и фосфолипазу С в их клетках-мишенях, но гипотензивное действие должно было специфически стимулироваться активацией аденилатциклазы, поскольку hPTH-(1-30)-NH2 и hPTH-(1-31)-NH2, которые могут стимулировать только аденилатциклазу, обладали значительным гипотензивным эффектом при внутривенной инъекции, тогда как hРТН-(7-84), который может стимулировать только фосфолипазу С, не обладал значительным гипотензивным эффектом при внутривенной инъекции. Поскольку остеогенное действие РТН также опосредовано стимуляцией аденилатциклазы, ожидалось, что гипотензивный ответ можно использовать для скрининга новых конструкций РТН на возможную остеогенность. В действительности, остеогенная активность инъецированных подкожно hРТН-(1-31)-NН2, hРТН-(1-34) и hРТН-(1-84) тесно коррелировала с их гипотензивной активностью, причем hРТН-(1-34) обладал намного большей гипотензивной активностью, значительно большей, чем две другие молекулы. hPTH-(1-31)-NH2 и hРТН-(1-84) обладали остеогенной и гипотензивной активностью в равной степени. Однако данная корреляция нарушалась hРТН-(1-30)-NН2, который стимулирует АС почти так же сильно, как hРТН-(1-31)-NН2 и hРТН-(1-34), и снижает кровяное давление в той же степени, как и hРТН-(1-31)-NH2, но не стимулирует костеобразование. Тем не менее, способность к значительному снижению артериального давления является общим свойством остеогенных РТН и РТН фрагментов и является, следовательно, быстро определяемым предварительным индикатором биологической активности РТН фрагментов in vivo.
Более конкретно, как hРТН-(1-34), так и hPTH-(1-31)-NH2 обладали максимальной гипотензивной активностью при 0,8 нмоль/100 г массы тела.
Данный гипотензивный ответ сопровождался временным (20-30 мин) покраснением ушей и лап у крыс, что можно считать полезным визуальным качественным маркером.
Хотя АС- или AC/PLC-стимулирующие фрагменты, инъецированные внутривенно, были сильно гипотензивными, внутривенная инъекция 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(7-84), который способен стимулировать только PLC, только очень медленно (9,8±2,0 мин) и очень слабо снижала давление в хвостовой артерии на 3,28±1,0 мм рт. ст. по сравнению с быстрым (0,9±0,08 мин) снижением на 43,2±5,8 мм рт.ст., которое вызывается AC/PLC-стимулирующим hРТН-(1-84) или в равной степени быстрым снижением на 51,6±3,3 мм рт.ст., которое вызывается АС-стимулирующим hРТН-(1-31)-NН2.
Одна подкожная инъекция АС- или AC/PLC-стимулирующего фрагмента вызывала намного более медленное и меньшее снижение давления в хвостовой артерии, чем внутривенная инъекция той же дозы. Например, 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(1-34), инъецированного подкожно, снижали давление только на 27,9±3,6 мм рт.ст. по сравнению с 50,9±5,6 мм рт.ст. при внутривенной инъекции. Та же доза hРТН-(1-31)-NН2, инъецированная подкожно, снижала кровяное давление только на 11,1 ±1,6 мм рт.ст. по сравнению с 51,6±3,3 мм рт.ст. при инъекции внутривенно.
Не наблюдалось значительного различия между быстрыми и значительными снижениями давления в хвостовой артерии, вызванными внутривенно инъецированными hPTH-(1-84), hРТН-(1-34) и hPTH-(1-31)-NH2, однако, hРТН-(1-34) был по меньшей мере в два раза более эффективным (Р<0,01), чем две другие молекулы, при подкожной инъекции.
Одним из факторов, которые влияют на гипотензивное действие и остеогенность подкожно инъецированного РТН или РТН фрагмента, является его способность к перемещению от сайта инъекции к его мишеням, прежде всего в сосудистой сети, а затем в костях, без его инактивации. Данная способность отражается во времени, которое требуется для понижения давления в хвостовой артерии до минимальной величины после инъекции. Укорочение молекулы РТН с С-конца с 84 по 31 остаток элиминировало ее способность стимулировать PLC без ослабления способности стимулировать АС и в девять раз уменьшало время, требующееся, чтобы давление в хвостовой артерии достигло своего минимума. Удаление еще одного остатка с образованием hРТН-(1-30)-NН2 значительно увеличивало время, требующееся, чтобы кровяное давление снизилось до своего минимума, с 2,0±0,31 мин в случае hРТН-(1-31)-NН2, до 13,8±2,3 мин. Однако, важно отметить, что hРТН-(1-31)-NН2 требовалось не больше времени для снижения кровяного давления, чем hРТН-(1-84).
Использование в настоящем исследовании hPTH-(1-31)-NH2, первой конструкции РТН, способной стимулировать АС так же сильно, как hРТН-(1-34), без активации PLC и стимуляции активности мембраносвязанной РКС, в настоящее время представило самое прямое доказательство, что гипотензивное действие РТН тесно связано с активацией АС. Следовательно, хотя внутривенная инъекция 0,8 нмоль/100 г массы тела hРТН-(7-84), который способен стимулировать только PLC/PKC, не влияла значительно на давление в хвостовой артерии, внутривенная инъекция той же дозы hРТН-(1-31)-NН2 снижала давление в той же степени, как и hРТН-(1-34).
Поскольку АС также опосредует РТН-индуцированную стимуляцию кортикального и трабекулярного костеобразования у OVX крыс, оказывается, что запуск гипотензивного ответа у интактных самок крыс является простым, быстро измеряемым индикатором возможной остеогенности конструкций РТН. С другой стороны, неспособность снижать артериальное давление должна приводить к исключению фрагмента из дальнейшей оценки, избегая, таким образом, ненужного, длительного и дорогостоящего теста на остеогенность у OVX крыс. Гипотензивные ответы на внутривенную инъекцию РТН не коррелировали с остеогенностью. Однако, намного меньшие гипотензивные ответы на подкожно инъецированные hPTH-(1-31)NH2, hРТН-(1-34) и hРТН-(1-84) соответствовали остеогенностям данных молекул, причем hРТН-(1-34) обладал самым сильным гипотензивным и остеогенным действием, а две другие молекулы являлись равными по эффективности друг другу, но менее эффективными, чем hРТН-(1-34), в снижении кровяного давления и стимуляции костеобразования. Но данная корреляция нарушалась hPTH-(1-30)-NH2, который стимулирует АС почти так же сильно, как hРТН-(1-31)-NН2 и hРТН-(1-34), и снижает кровяное давление в той же степени, как и hРТН-(1-31)NН2, но не стимулирует костеобразование.11 Причина данного отсутствия остеогенности неизвестна. Она не может быть связана только с тем, что hРТН-(1-30)-NН2, инъецированному подкожно, требуется больше времени, чтобы снизить кровяное давление, поскольку hРТН-(1-84), инъецированному подкожно, требуется то же время, чтобы снизить кровяное давление, но тем не менее он обладает сильной остеогенностью. Очевидно, что остеогенный ответ зависит от сочетания многих различных факторов, которые обеспечивают доставку достаточно активного гормона или фрагмента гормона от сайта инъекции к зрелым остеобластам-мишеням, экспрессирующим рецептор РТН. Неспособность АС-стимулирующего, снижающего кровяное давление hРТН-(1-30)-NН2 стимулировать костеобразование может являться результатом сочетания большей нестабильности, незначительно более высокой ЕС50, необходимой для стимуляции АС, то есть 20 нМ вместо 16 нМ, как необходимо для hРТН-(1-31)-NН2 и hРТН-(1-34), и длительного времени, необходимого для поступления в кровообращение из сайта инъекции.
Несмотря на неспособность hРТН-(1-30)-NН2 проявлять остеогенность, способность к значительному снижению артериального давления тем не менее является общим свойством остеогенных РТН и, следовательно, представляет собой быстро определяемый индикатор возможной биологической активности фрагментов РТН in vivo. Из этого следует, что гипотензивный ответ также должен служить эффективным индикатором способности остеогенной РТН конструкции достигать своих мишеней после введения посредством перорального пути введения или других неинъекционных путей введения.
Дискомфорт и другие возможные последствия гипотензивного ответа на каждую инъекцию могут ограничивать готовность пациентов с остеопорозом согласиться на долговременное лечение РТН или РТН фрагментом. К счастью, в настоящее время для стимуляции костеобразования применяют интермиттирующие подкожные инъекции РТН, и все эти молекулы обладают намного меньшей гипотензивной активностью, если их инъецируют подкожно, чем если их инъецируют внутривенно. Как авторы изобретения также доказали ранее6'7, hPTH-(1-31)-NH2 должен обладать дополнительным преимуществом в стимуляции АС без стимуляции PLC и любых возможных Са2+- и РКС-опосредованных побочных эффектов, которые она может запускать.
Пример 7
Цикло(Lуs27-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NH2 (5). Синтез осуществляли способом, аналогичным способу синтеза [Leu27] -циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Продукт обладал чистотой, оцененной как >95%, и молекулярной массой 3700,64 (±0,38) (ожидаемая М+1=3700,14). Для подтверждения положения лактама определили последовательность пептида.
Цикло(Lуs27-Аsр30)-hРТН-(1-31)-NH2 (5). Синтез осуществляли способом, аналогичным способу синтеза [Leu27] -циклo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Продукт обладал чистотой, оцененной как >95%, и молекулярной массой 3700,64 (±0,38) (ожидаемая М+1=3700,14). Для подтверждения положения лактама определили последовательность пептида.
[Leu27] -цикло(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-30)-NH2 (8). Данный пептид синтезировали так же, как пептид 3, без добавления вручную Val к носителю. Продукт обладал частотой, оцененной как >97%, и молекулярной массой 3586,14 (±0,19) (ожидаемая М+1 =3685,99).
Аналоги по настоящему изобретению можно вводить теплокровному млекопитающему, нуждающемуся в этом, в частности человеку, посредством парентерального, местного или ректального введения, либо посредством ингаляции, либо посредством перорального приема. Препараты аналогов можно традиционно изготавливать в парентеральной лекарственной форме, смешивая от примерно 1 до примерно 300 мг на единицу дозировки с традиционным стандартным носителем, эксципиентом, связывающим веществом, консервантом, стабилизатором, красителем или тому подобным, как предусмотрено общепринятой фармацевтической практикой.
Для парентерального введения безболезненную подкожную инъекцию от 1 до 2 мл через ультратонкую иглу номер 30 для шприца должно быть необходимо делать не более чем один раз в сутки, в течение от одного года до двух лет, в зависимости от тяжести заболевания. Инъецируемый материал должен содержать материал по настоящему изобретению в водном изотоническом стерильном растворе или суспензии (возможно с консервантом, таким как фенол, или с солюбилизирующим агентом, таким как этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)). Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, находится вода, мягко подкисленная вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Синтетические моноглицериды, диглицериды, жирные кислоты (такие как олеиновая кислота) находят применение в качестве нелетучего масла при получении препаратов для инъекций.
Для ректального введения аналоги по настоящему изобретению можно изготовлять в форме суппозиториев посредством смешивания с подходящим не раздражающим эксципиентом, таким как масло какао или полиэтиленгликоли.
Для местного применения аналоги по настоящему изобретению можно изготовлять в форме мазей, гелей, растворов, суспензий или кожных липких пластырей.
Ингаляцию можно осуществлять, например способом, описанным в опубликованной заявке РСТ WО 94/07514.
Суточная доза не должна превышать 0,05 мг/кг массы тела, или примерно 3,5 мг/человека массой 70 кг, в зависимости от активности конкретного соединения, возраста, массы, пола и состояния субъекта, которого лечат. Как должно быть хорошо известно, количество активного ингредиента, которое можно смешивать с материалами-носителями для получения разовой дозировки, будет варьировать в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения.
Пример фармацевтической композиции 8
Раствор для инъекции 0,2%-ный может быть приготовлен, например, следующим образом:
Аналог hРТН (1-31) - 5,0 г
Натрия хлорид - 22,5 г
Фосфатный буфер рН 7,4 - 300,0 г
Деминерализованная вода - До 2500,0 мл
Активное вещество (аналог hРТН (1-31)) растворяют в 1000 мл воды и фильтруют через микрофильтр. Добавляют буферный раствор, и весь объем доводят до 2500 мл водой. Для получения стандартных лекарственных форм в стеклянные ампулы вносят порции по 1,0 или 2,5 мл каждая (каждая ампула содержит, соответственно, 2,0 или 5,0 мг активного вещества).
Раствор для инъекции 0,2%-ный может быть приготовлен, например, следующим образом:
Аналог hРТН (1-31) - 5,0 г
Натрия хлорид - 22,5 г
Фосфатный буфер рН 7,4 - 300,0 г
Деминерализованная вода - До 2500,0 мл
Активное вещество (аналог hРТН (1-31)) растворяют в 1000 мл воды и фильтруют через микрофильтр. Добавляют буферный раствор, и весь объем доводят до 2500 мл водой. Для получения стандартных лекарственных форм в стеклянные ампулы вносят порции по 1,0 или 2,5 мл каждая (каждая ампула содержит, соответственно, 2,0 или 5,0 мг активного вещества).
Все аналоги, приведенные в таблицах, были получены в соответствии с методиками, описанными выше.
Источники информации
1. Caulfield, М. Р.; МсКее, R. L; Goldman, М. Е.; Duong, L. Т.; Fisher, J. Е. ; Gay, С. Т.; DeHaven, P. A.; Levy, J. J.; Roubini, Е.; Nutt, R. F.; Chorev, M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone (PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences - The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the 14-34 Region. Endocrinology 1990, 127, 83-87.
1. Caulfield, М. Р.; МсКее, R. L; Goldman, М. Е.; Duong, L. Т.; Fisher, J. Е. ; Gay, С. Т.; DeHaven, P. A.; Levy, J. J.; Roubini, Е.; Nutt, R. F.; Chorev, M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone (PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences - The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the 14-34 Region. Endocrinology 1990, 127, 83-87.
2. Neugebauer, W. ; Barbier, J.-R.; Sung, W. L; Whitfield, J. F.; Willick, G. E. Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues. Biochemistry 1995, 34, 8835-8842.
3. Gardella, T. J.; Wilson, A. K.; Keutmann, H. Т.; Oberstein, R.; Potts, J. Т. ; Kronenberg, H. M., and Nussbaum, S. R. Analysis of Parathyroid Hormone's Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesis and Analog Design. Endocrinology 1993, 132, 2024-2030.
4. Marqusee, S.; Baldwin, R. L. Helix Stabilization by Glu...Lys+ Salt Bridges in Short Peptides of De Novo Design. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987, 84, 8898-8902.
5. Surewicz, W. К., Neugebauer, W.; Gagnon, L.; MacLean, S.; Whitfield, J. F.; Willick, G. E. Structure-Function Relationships in Human Parathyroid Hormone: The Essential Role of Amphiphilic-Helix. In Peptides: Chemistry, Structure, and Biology 1993; Smith, J.; Hodges, R., Eds.; ESCOM Leiden, The Netherlands, 1993, pp. 556-558.
6. Whitfield, J. F.; Morley, P.; Willick, G. E.; Ross, V.; Barbier, J. R.; Isaacs, R. J.; Ohannessianbarry, L. Stimulation of the Growth of Femoral Trabecular Bone in Ovariectomized Rats by the Novel Parathyroid Hormone Fragment, hPTH-(1-31)NH2 (Ostabolin) Calcif. Tissue Int. 1996, 58, 81-87.
7. Whitfield, J. F. ; Morley, P. Small Bone-Building Fragments of Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis Trends Pharmacol. Sci. 1995 16, 382-386.
Claims (20)
1. Аналог паратиреоидного гормона человека hPTH и его фармацевтически приемлемые соли, имеющие аминокислотную последовательность
R-NH-Rl-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID NO 23),
где R=водород;
Rl- Ser,
R2=Met или Nle;
R3=His или водорастворимая аминокислота;
R4=Leu или водорастворимая аминокислота;
R5=Asn или водорастворимая аминокислота;
R6=Ser или водорастворимая аминокислота;
R7=Met или Nle;
R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asn;
R9=Arg;
R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp;
R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, Nle, Ile или Туг;
R12=Gln;
R13=Asp, Cys или Lys;
X=OH, NH2;
Y=X, Val-X или Val-His-Asn-Phe-X,
циклизованную между одной из пар аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или, когда R11 и R13 представляют собой Lys или Asp, 27 и 30.
R-NH-Rl-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-R12-R13-Y (SEQ ID NO 23),
где R=водород;
Rl- Ser,
R2=Met или Nle;
R3=His или водорастворимая аминокислота;
R4=Leu или водорастворимая аминокислота;
R5=Asn или водорастворимая аминокислота;
R6=Ser или водорастворимая аминокислота;
R7=Met или Nle;
R8=Glu, Lys, Cys, Orn или Asn;
R9=Arg;
R10=Lys, Orn, Cys, Glu или Asp;
R11=Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, Nle, Ile или Туг;
R12=Gln;
R13=Asp, Cys или Lys;
X=OH, NH2;
Y=X, Val-X или Val-His-Asn-Phe-X,
циклизованную между одной из пар аминокислот 22 и 26, 26 и 30 или, когда R11 и R13 представляют собой Lys или Asp, 27 и 30.
2. Аналог по п.1, отличающийся тем, что он циклизован в форме лактама между одной из пар аминокислот 22/26, 26/30 или, когда R11 и R13 представляют собой Lys или Asp, 27/30; либо он циклизован в форме дисульфидного мостика между Cys парами 22/26 или 26/30.
3. Аналог по п.1, отличающийся тем, что циклизация имеет место в форме лактама или дисульфидного мостика между Cys парами 22/26.
4. Аналог по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что лактам представляет собой 22-26 лактам.
5. Аналог по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что Х представляет собой NH2.
6. Аналог по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что R11 представляет собой Lys или Leu.
7. Аналог по п.6, отличающийся тем, что R2 и R7 представляют собой Met.
8. Аналог по п.7, отличающийся тем, что R8 представляет собой Glu, R10 представляет собой Lys, a R13 представляет собой Asp.
9. Аналог по п.8, отличающийся тем, что R3 представляет собой His или Lys, R4 представляет собой Leu, Lys или Arg, R5 представляет собой Asn или Lys.
10. Аналог по п.8, отличающийся тем, что R3-R6 представляют собой His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys или His-Leu-Lys-Ser.
11. Аналог по п.1, отличающийся тем, что он имеет SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19.
12. Аналог по п. 1, включающий в себя аналог паратиреоидного гормона человека hPTH (1-31), в положении 27 которого находится Lys, Leu, Ile, Nle или Met и который циклизован между Glu22 и Lys26 с образованием лактама.
13. Аналог по п.12, отличающийся тем, что гидрофобный остаток представляет собой Leu, а аналог имеет либо С-концевое амидное окончание, либо С-концевое карбоксильное окончание.
14. Аналог по п.12, отличающийся тем, что он имеет SEQ ID NO: 3.
15. Композиция, предназначенная для лечения остеопороза теплокровного животного, содержащая аналог паратиреоидного гормона человека (hPTH)-(l-31) по п. 12, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что в аналоге в положении 27 находится Leu.
17. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что аналог имеет SEQ ID N0:3.
18. Способ лечения остеопороза теплокровного животного, при котором такому теплокровному животному вводят терапевтически эффективное количество аналога паратиреоидного гормона человека (hPTH)-(1-31) по п.12.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что в положении 27 находится Leu.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что аналог имеет SEQ ID NO: 3.
Приоритеты по пунктам и признакам:
02.08.1996 по пп.1-9 при R=водород, R1=Ser, R2=Met, R3=His, R4=Leu, R5= Asn, R6=Ser, R7=Met, R8=Glu, R9=Arg, R10=Lys, R11=Lys,Leu,Nle,Ile, R12=Gln, R13= Asp, X=OH, NH2 и Y=Val-X, циклизация между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30, циклизация в форме лактама; по п.11 при SED ID NO 6, пп.12-20;
14.03.1997 по пп. 1-9 при R2=Nle, R3=водорастворимая кислота, R4=водорастворимая кислота, R5=водорастворимая кислота, R6=водорастворимая кислота, R7= Nle, R8= Lys, Cys, Orn, Asp, R10=Orn,Cys,Glu,Asp, R11=Asp,Gln,Ala,Tyr, R13= Cys, Lys, Y=X, циклизация между парами аминокислот 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Arg, циклизация в форме дисульфидного мостика между Cys парами 22/26 или 26/30; п.10, по п.11 при SEQ ID NO 7;
01.08.1997 по признаку: Y= Val-His-Asn-Phe-X, по п.11 при SEQ ID Nos 8-16, 18, 19.
02.08.1996 по пп.1-9 при R=водород, R1=Ser, R2=Met, R3=His, R4=Leu, R5= Asn, R6=Ser, R7=Met, R8=Glu, R9=Arg, R10=Lys, R11=Lys,Leu,Nle,Ile, R12=Gln, R13= Asp, X=OH, NH2 и Y=Val-X, циклизация между парами аминокислот 22 и 26, 26 и 30, циклизация в форме лактама; по п.11 при SED ID NO 6, пп.12-20;
14.03.1997 по пп. 1-9 при R2=Nle, R3=водорастворимая кислота, R4=водорастворимая кислота, R5=водорастворимая кислота, R6=водорастворимая кислота, R7= Nle, R8= Lys, Cys, Orn, Asp, R10=Orn,Cys,Glu,Asp, R11=Asp,Gln,Ala,Tyr, R13= Cys, Lys, Y=X, циклизация между парами аминокислот 27 и 30, если R11 или R13 представляют собой Lys или Arg, циклизация в форме дисульфидного мостика между Cys парами 22/26 или 26/30; п.10, по п.11 при SEQ ID NO 7;
01.08.1997 по признаку: Y= Val-His-Asn-Phe-X, по п.11 при SEQ ID Nos 8-16, 18, 19.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/691,647 US5955425A (en) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis |
US08/691,647 | 1996-08-02 | ||
US4056097P | 1997-03-14 | 1997-03-14 | |
US60/040,560 | 1997-03-14 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU99104132A RU99104132A (ru) | 2001-02-20 |
RU2203286C2 true RU2203286C2 (ru) | 2003-04-27 |
Family
ID=26717175
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99104132/14A RU2203286C2 (ru) | 1996-08-02 | 1997-08-01 | Аналоги паратиреоидного гормона для лечения остеопороза |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0915911B1 (ru) |
JP (3) | JP4122061B2 (ru) |
KR (1) | KR100500859B1 (ru) |
CN (1) | CN1176947C (ru) |
AT (1) | ATE253078T1 (ru) |
AU (1) | AU723728B2 (ru) |
BG (1) | BG103128A (ru) |
BR (1) | BR9711002B1 (ru) |
CA (1) | CA2261564C (ru) |
CZ (1) | CZ34799A3 (ru) |
DE (1) | DE69725850T2 (ru) |
DK (1) | DK0915911T3 (ru) |
EE (1) | EE9900039A (ru) |
ES (1) | ES2207740T3 (ru) |
FI (1) | FI990126A (ru) |
GE (1) | GEP20033095B (ru) |
IS (1) | IS4962A (ru) |
LV (1) | LV12293B (ru) |
NZ (1) | NZ333809A (ru) |
PT (1) | PT915911E (ru) |
RU (1) | RU2203286C2 (ru) |
SI (1) | SI9720057A (ru) |
SK (1) | SK287397B6 (ru) |
WO (1) | WO1998005683A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2604809C2 (ru) * | 2010-05-13 | 2016-12-10 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Аналоги паратиреоидного гормона и их применение |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2290443A1 (en) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Peptide parathyroid hormone analogs |
EP1123401A1 (en) | 1998-10-22 | 2001-08-16 | The General Hospital Corporation | BIOACTIVE PEPTIDES AND PEPTIDE DERIVATIVES OF PARATHYROID HORMONE (PTH) AND PARATHYROID HORMONE-RELATED PEPTIDE (PTHrP) |
WO2000031266A1 (en) | 1998-11-25 | 2000-06-02 | The General Hospital Corporation | Human parathyroid hormone modifications, preparation and use |
JP2002534081A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-15 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Pthレセプターおよびそれを使用するスクリーニングアッセイ |
EP1221963A4 (en) * | 1999-07-28 | 2006-03-22 | Univ Pennsylvania | METHODS OF INHIBITING OSTEOCLASTOGENESIS |
US6316410B1 (en) * | 1999-09-22 | 2001-11-13 | National Research Council Of Canada | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis |
WO2003009804A2 (en) | 2001-07-23 | 2003-02-06 | The General Hospital Corporation | Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs |
EP1531855A4 (en) | 2002-01-10 | 2009-07-22 | Osteotrophin Llc | TREATMENT OF BONE DISEASES WITH SKELETTAL ANABOLIKA |
CA2511966A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-07-22 | Amgen Inc. | Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein |
US8088734B2 (en) * | 2003-01-21 | 2012-01-03 | Unigene Laboratories Inc. | Oral delivery of peptides |
EP1933863A4 (en) * | 2005-09-06 | 2010-06-09 | Zelos Therapeutics Inc | PARATHYROIDIAN HORMONE ANALOGS AND METHODS USING SAME |
EP2056862A2 (en) * | 2006-07-31 | 2009-05-13 | Zelos Therapeutics, Inc. | Parathyroid hormone analogues and uses thereof |
US7820179B2 (en) | 2006-10-13 | 2010-10-26 | Eli Lilly And Company | Pegylated PTH as PTH receptor modulators and uses thereof |
BRPI0814962B8 (pt) | 2007-08-01 | 2021-05-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | métodos in vitro para determinar se um composto candidato é um agonista de longa duração ou de curta duração de um receptor acoplado à proteína g, polipeptídeo, seu uso e composição farmacêutica |
CN105440126B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-10-25 | 南京工业大学 | 治疗骨质疏松的α-螺旋多肽及其制备方法与应用 |
WO2019018238A1 (en) | 2017-07-15 | 2019-01-24 | The Regents Of The University Of California | CATHEPSIN K OSTEOADSORBENT FLUOROGEN SUBSTRATE FOR THE IMAGING OF OSTEOCLAST ACTIVITY AND MIGRATION |
BR112021003442A2 (pt) | 2018-09-26 | 2021-05-18 | Borealis Ag | composição de copolímero de propileno com excelentes propriedades mecânicas e ópticas |
JP7342310B2 (ja) | 2019-05-28 | 2023-09-12 | 国立大学法人東北大学 | 電源装置、超伝導装置、超伝導デバイス、及び超伝導デバイスの製造方法 |
CN113549144A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-26 | 华南理工大学 | 一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5317010A (en) * | 1991-10-10 | 1994-05-31 | Peter K. T. Pang | Parathyroid hormone analogues substituted at AA 25, 26, 27, and use in osteoporosis treatment |
US5814603A (en) * | 1992-06-12 | 1998-09-29 | Affymax Technologies N.V. | Compounds with PTH activity |
AU672790B2 (en) * | 1992-07-15 | 1996-10-17 | Novartis Ag | Variants of parathyroid hormone and its fragments |
CA2126299C (en) * | 1994-06-20 | 2000-12-12 | Gordon E. Willick | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis |
-
1997
- 1997-08-01 ES ES97933603T patent/ES2207740T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-01 JP JP50741398A patent/JP4122061B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-01 AT AT97933603T patent/ATE253078T1/de active
- 1997-08-01 KR KR10-1999-7000903A patent/KR100500859B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 AU AU36905/97A patent/AU723728B2/en not_active Ceased
- 1997-08-01 DK DK97933603T patent/DK0915911T3/da active
- 1997-08-01 PT PT97933603T patent/PT915911E/pt unknown
- 1997-08-01 EE EEP199900039A patent/EE9900039A/xx unknown
- 1997-08-01 GE GEAP19974655A patent/GEP20033095B/en unknown
- 1997-08-01 EP EP97933603A patent/EP0915911B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-01 RU RU99104132/14A patent/RU2203286C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 SK SK132-99A patent/SK287397B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 CA CA002261564A patent/CA2261564C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-01 WO PCT/CA1997/000547 patent/WO1998005683A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-01 DE DE69725850T patent/DE69725850T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-01 NZ NZ333809A patent/NZ333809A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 CZ CZ99347A patent/CZ34799A3/cs unknown
- 1997-08-01 BR BRPI9711002-7A patent/BR9711002B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 SI SI9720057A patent/SI9720057A/sl not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 CN CNB971981612A patent/CN1176947C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-01-22 FI FI990126A patent/FI990126A/fi unknown
- 1999-01-28 BG BG103128A patent/BG103128A/xx unknown
- 1999-01-29 IS IS4962A patent/IS4962A/is unknown
- 1999-02-01 LV LVP-99-15A patent/LV12293B/en unknown
-
2007
- 2007-05-01 JP JP2007121289A patent/JP4224111B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-09-25 JP JP2008246839A patent/JP2009057386A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2604809C2 (ru) * | 2010-05-13 | 2016-12-10 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Аналоги паратиреоидного гормона и их применение |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4224111B2 (ja) | 骨粗鬆症の治療のための副甲状腺ホルモン類似体 | |
US6316410B1 (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
US6110892A (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
US5955425A (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
RU2198182C2 (ru) | Аналоги гормона паращитовидной железы | |
CA2126299C (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
CN101108878B (zh) | 胰高血糖素样肽-1的类似物 | |
US7632811B2 (en) | Analogs of parathyroid hormone | |
US7410948B2 (en) | Analogs of parathyroid hormone | |
US7531621B1 (en) | PTH2 receptor selective compounds | |
EP1352912A1 (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
CA2599885A1 (en) | Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis | |
CZ20003999A3 (cs) | Analog PTH, způsob selektivního navázání na receptor, způsob vyvolání agonistické a antagonistické odezvy, farmaceutický prostředek a způsob léčby |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120802 |