CZ34799A3

CZ34799A3 - Analogy paratyroidního hormonu pro léčení osteoporézy

Info

Publication number: CZ34799A3
Application number: CZ99347A
Authority: CZ
Inventors: JEAN-RENé BARBIER; Paul Morley; Witold Neugebauer; Virginia Ross; James Whitfield; Gordon E. Willick
Original assignee: National Research Council Of Canada
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 1999-07-14
Also published as: KR100500859B1; BG103128A; WO1998005683A1; ES2207740T3; FI990126A; DK0915911T3; BR9711002B1; GEP20033095B; JP2001500845A; KR20000029783A; SK13299A3; JP2007254480A; PT915911E; AU3690597A; LV12293A; JP4224111B2; JP2009057386A; SI9720057A; RU2203286C2; EP0915911B1

Description

Oblast techniky , Vynález se týká analogů lidského paratyroidního hormonu, o nichž se zjistilo, že jsou účinné při léčení osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Osteoporóza je vedoucí příčinou neschopnosti starých lidí, zejména starších žen. Nedávno se zjistilo, že lidský paratyroidní hormon (hPTH) a jeho jisté analogy jsou stimulátory růstu kostí, takže jsou užitečné při léčení osteoporózy. Osteoporóza je progresivní nemoc, která vede k redukci celkové hmoty kostí a zvýšené křehkosti kostí. To často vede ke spontánním zlomeninám kostí nesoucích zátěž a k fyzickému a mentálnímu zhoršení charakteristik žnehýbftujících poranění. Postmenopausálňí osteoporóza je způsobena vymizením estrogenů, které podněcují desetiletí trvající urychlení obměny kostí se zvýšenou nerovnováhou mezi resorbcí starých kostí a tvořením nové kosti. To vede k zřídnutí, zvýšené poróžitě a trabekulámí redukci kostí nesoucích zátěž. Osteoporóza je také spojena s hypertyroidismem, hyperparatyroidismem, Cushingovým syndromem a užíváním jistých steroídních léků. Léčení historicky zahrnovalo zvýšení vápníku v jídle, léčení estrogeny, zvýšené dávky vitaminu D, avšak hlavně léky jako antiresobtiva, která inhibují resorpci kostí osteoklasty.

Paratyroidní hormon (PTH) vzniká vpříštítné žláze a je hlavním regulátorem hladin vápníku v krvi PTH polypeptid a syntetický polypeptid lze připravit způsobem popsaným Erickson a Merrifield, The Proteins. Neurath aj., Eds., Academie Press, New York, 1976, strana 257, a modifikovaným způsobem Hodges aj., Peptide Research 1, 19 nebo Atherton, E. a Sheppard, R.C. Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989.

Když se sérový vápník sníží pod normální hladinu, příštitná žláza uvolňuje PTH a ’ hladina vápníku se zvýší resorbcí kostního vápníku, zvýšenou absorpcí vápníku z vnitřností ,a. zvýšenou absorpcí vápníku v ledvinách ze vznikající moči v ledvinových kanálcích. Ačkoliv kontinuální inťuze nízkých hladin PTH mohou odstraňovat vápník z kostí, stejné nízké dávky, když se injikují přetržitě, mohou skutečně podporovat růst kostí.

Trager, US patent 4,086,196 popisuje analogy lidského PTH a tvrdí, že prvé 27 až 34 aminokyseliny jsou nejúěinnější s ohledem na stimulaci adenynylcyklázy v pokusu s buňkami in vitro. Rosenblatt, US patent 4,771,124 popisuje vlastnosti hPTH analogů, kde Trp--’ j_esubstituován aminokyselinami fenylalaninem, leucinem, norleucinem, valinem, tyrosinem, β2 i, ····>····*· a»·*·····* • « « « · * »·*· · ··· «V» »·»·*« * * «··**· ♦* · ·* *· nafty lalaninem nebo <x-naftylalaninem, jako antagonistu PTH. Tyto modifikované analogy PTH také mají odstraněny 2 a 6 koncové aminokyseliny, což vede k ztrátě většiny aktivity antagonisty, když se použijí k léčení osteoporózy. Tyto analogy se navrhovaly jako inhibitory PTH a peptidu příbuzného PTH. Analogy se nárokovaly jako pravděpodobně užitečné při léčení hyperkalcemie spojené s některými tumory.

Pang aj., WO93/06845 publikované 15. dubna 1993, popisují hPTH analogy, kde jsou substituovány Arg--\ Lys^, Lys^ četnými aminokyselinami, včetně alaninu, asparaginu, asparagové kyseliny, cysteinu, glutaminu, glutamové kyseliny, glycinu, histidinu, isoleucinu, leucinu, methioninu, fenylalaninu, prolinu, šeřinu, threoninu, tryptofanu, tyrosinu nebo valinu. Ty se nárokují bez žádných podpůrných údajů ze zvířecích nebo lidských testů, že jsou účinné při léčení osteoporózy s minimálními účinky na krevní tlak a hladké svaly.

PTH působí aktivací dvou druhých mediátorových soustav?, adenynyl cykíázy aktivované G5-proteinem a fosfolipázy aktivované Gq-proteinem. Poslední vede ke stimulaci aktivity protein kinázy Cs (PKC) vázané na membránu. Ukázalo se, že aktivita PKC vyžaduje PTH zbytky 29 až 32 (Jouishomme aj. (1994) J. Bone Minerál Res. 9, 1197-1189). Zjistilo se, že zvýšený růst kostí, například účinek, který je užitečný při léčení osteoporózy, je spojen se schopností peptidového řetězce zvyšovat aktivitu AC. Zjistilo se, že nativní řetězec PTH má všechny tyto aktivity. Typický řetězec hPTH-(l-34) je ukázán jako (A);

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu

Gin AspVal His Asn Phe-OH A

Následující lineární analog hPTH-(l-31)-NH2, jehož údaje jsou zahrnuty v tabulce 1 níže, má pouze aktivitu stimulující AC a zjistilo se, že je zcela aktivní při obnově kostí v modelu krys s odstraněnými vaječníky (Rixon, R. H. aj.,_r.(1994) J. Bone, Minerál Res. 9, 1197.-1189, Whitfield aj. (1996) Calcified Tissue Int. 58, 81-87, Willick aj., US patent 5,556,940 vydaný 17. září 1996)):

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu

Gin Asp Val-NH₂ B

Molekula B výše může mít karboxylové zakončení místo ukázaného aminové zakončení.

F «φ Φ ·· ·· • » * 4 ·♦·· « · · φ ♦ · > · • · · * φφφφ φ ·φφ φφ-φ »φφ· · φ

Předmětem tohoto vynálezu je příprava novýcťanalogů s větší metabolíckou stabilitou, se zvýšenou aktivitou obměny kostí, se zvýšenou AC aktivitou a s minimálními postranními účinky.

Podstata vynálezu

Podle jednoho aspektu vynálezu se zabezpečuje lidský paratyroidm hormon hPTH a jeho farmaceuticky přijatelné soli mající řetězec aminokyselin:

R-NH-Rl-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-ArgVal-R8-Trp-Leu-R9--R10-Rll-Leu-R12-Asp-Y kde

R = vodík riébo jakákoliv lineární nebo rozvětvená alkylová, acylová nebo arylová skupina,

R1 = Ser, Ala nebo Aib,

R2 = Met nebo přirozeně se vyskytující hydrofobní aminokyselina,

R3 = His nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R4 = Leu nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R5 = Asn nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R6 = Ser nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R7 = Met nebo přirozeně se vyskytující hydrofobní aminokyselina,

R8 - Glu, Lys nebo Asp,

R9 = Cys, Glu nebo Om,

R10 = Arg, Lys, Om, Gin, Glu nebo Asp, · '

R11 = přirozeně se vyskytující hydrofobní nebo polární aminokyselina,

R12 = Gin, Arg, Glu, Asp, Lys nebo Om,

X = OH,NH₂a

Y = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-Phe-ValX, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X, cyklizované jako mezi jednímnebo dvěma páry aminokyselin 22 a 26j 26 a 30, 27 a 30 a 25 a 29, když R3 a R6 jsou «« ·· ♦· · ·· ♦* « · ♦ · i·· · «*· toto* I « * · «··· to* · to to to to··· · «·· ··· «•toto, * · · · ····· ·· to to· ·*

Lys, Om, Glu nebo Asp, s výjimkou cyklo(Lys-^-Asp^O) (Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-NH₂.

cyklo(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(l-34)-NH₂ acyklo(Lys²⁶-Asp³⁰)(Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-OH.

'ř

Příklady solí zahrnují anorganické soli, solí organických kyselin, například kyseliny mravenčí, kyseliny octové, kyseliny vinné a kyseliny citrónové, soli anorganických baží, jako sodné a amonné soli, a soli organických baží, jako triethylamin, ethylamín a methylamin.,

Podle jiného rysu vynálezu se cyklizace dosahuje tvorbou laktamů vznikajících spojením bočních řetězců vybraných párů zbytků aminokyselin, například mezi přirozenými zbytky 22 a 26 nebo 26 a 30. Berou se v úvahu i jiné typy cyklizace, jako tvorba disulfidického můstku například mezi analogy obsahujícími Cys Cys²²-Cys²^ a Cys^2ť>-Cys³0

Také se zjistilo, že jsou účinné substituce různých aminokyselin, Lys²⁷ se může nahradit Leu nebo různými hydrofobními nebo polárními zbytky. Jiným faktorem je to, jak dobře zbytek se hodí k receptoru. Ala není tak hydrofobní jako Leu. Lys a Tyr se obecně považují za polární, avšak přesto mají hydrofobní interakce s receptorem. Například Lys se může složit, tak že hydrofobní část reaguje s jinými hydrofobními zbytky receptoru, a NH₂ je vystaveno rozpouštědlu. Takové substituce zahrnují omithin, citrullin, kyselinu a-aminomáselnou, norleucin, isoleucin a tyrosin, nebo jakákoliv lineární nebo rozvětvenou α-amino alifatickou kyselinu mající 2-10 uhlíků v postraním řetězci, jakýkoliv takový analog mající polární nebo nabitou skupinu na konci alifatického řetězce. Příklady polárních nebo nabitých skupin zahrnují amino, karboxyl, acetamido, quanido a ureido. Ačkoliv se zdá, že Leu²⁷ je nejlepší substituce, také se zdá, že řada jiných substitucí v poloze 27 si zachovává téměř plnou aktivitu a také by mohla mít žádané vlastnosti, jako zvýšenou proteolytickou stabilitu nebo rozpustnost ve vodě. Očekává se, že nejaktivnější budou Ile, norleucin, Met a omithin.

*ť

Tato substituce vede ke stabilizaci α-šroubovnice v oblasti hormonu vázající receptor. To se potvrdilo studiem cirkulárního dichroismu spektra laktamových analogů-ve srovnání se spektry cirkulárního dichroismu lineární molekuly (Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-NH2. Spektra cirkulárního dichroismu jsou velmi citlivá k přítomnosti sekundární struktury α-šroubovnice a -technika- se použila- k‘ ukázání přítomnosti ct-šroubovnice- ve¹ fragmentech hPTH'(Neugebauer aj (1991) Biochemistry, 31, 2056-2063). Mimoto byla ukázána stabilizace α-šroubovnice tvorbou shora zmíněných laktamů v hPTH-(20-34)-NH2 (Neugebauer aj., (1994) lnt. J. Protein Peptide

Res.,43, 555-562). Existuje možná amfifilní α-Šroubovnice mezi zbytky 21 a 31 hPTH-(l-34)NH₂ a býly představeny údaje ukazující, že hydrofobní strana šroubovnice reaguje s PTH * » • φ φ φ φ ♦ h φ φ φ • ·« · φ·· φ φ

4»· Φ· «φ φφ φ · φ · φ φ φ φ · φφφ φφφφ φφ • ΦΦΦ φ receptorem (Neugebauer, W. (1995) Biochemistry, 34, 8835-8842, Gardella, T. J. aj., (1993)

Endocrinology 132, 2024-2030).

Zjistilo se, že nejúčinnější cyklizace vyžadují tvorbu laktamu, například mezi zbytky G1u22 _a Ly$26 n_ebo Lys^6 _a Asp^O Jiné cyklizace jsou rovněž možné, jako mezi Lys-⁷ a Asp-^O, ačkoliv se zjistilo, že tento laktam má nějaký destabilizující účinek na a-šroubovnici.

Studie fragmentů PTH vázajících se na receptor blíže naznačily hlavní vázající oblast mezi zbytky 14-34^, Navrhli jsme, že zbytky 17-29 α-šroubovnice se váží jako takové na PTH receptor a že amfifílní část této α-šroubovnice se váže svou hydrofobní stranou na receptor^. Tento model je shodný s výsledky studia analogů vázající oblasti receptoru^.

Studie NMR ukázaly, že i modelový peptid, o němž se zjistilo, že je vysoce helikální pomočí CD, také obsazuje řadu nehelikálních konformací. Tedy strukturu peptidického hormonu vázaného na receptor, například PTH, nelže spolehlivě odvodit z jeho volné struktury v roztoku. Stéricky bráněné analogy peptidického hormonu se použily k omezení počtu konformačních stavů dostupných pro peptid^. Výzkum řetězce hPTH ukazuje 3 možné solné můstky mezi zbytky 17-29, což by mohlo jak stabilizovat, tak destabilizovat α-šroubovnici. Ty jsou mezi Glu^2 a Lys^6 a Lys^ a Asp-^θ. Očekává se, že oba stabilizují a-šroubovnici. Očekává se, že mezi Lvs-^ a Asp^O destabilizují α-šroubovnici^. Tvorba laktamu mezi těmito páry zbytků by omezila konformace dostupné pro hPTH v této oblasti α-Šroubovnice. Mimoto dva z těchto laktamů, Glu^^-Lys^é _a Lys^-Asp^O, o kterých se očekává, že stabilizují strukturu α-šroubovnice, jsou položeny na polární straně amfifílní části α-šroubovnice. Očekává se, že třetí Lys27-Asp30 aspoň částečně destabilizuje α-šroubovníci, a zahrnuje zbytek Lys^ který je na hydrofobní straně amfifílní šroubovnice. K cyklízaci mezi polohami 25 a 29 může také dojít, pokud Lys nebo Om nahradí Arg v poloze 25 a pokud se Gln29 nahradí Glu nebo Asp.

Substituce Leu za Lys^^ vede k hydrofobnějšímu zbytku na hydrofobní stráně amfifílní šroubovnice. To vede ke zvýšené stimulaci aktivity adenynyl cyklázy v buněčné linii ROS. Odborníci poznají, že jiné takové substituce diskutovanévýše by asi vedly k analogůmse stejnými zvýšenými aktivitami.

Očekává se, že kombinovaný účinek buď substituce, nebo tvorby laktamu bude stabilizovat α-šroubovnici a zvyšovat bioaktivitu a chránit tuto oblast molekuly proti proteolytické degradaci. Dává se přednost přítomnosti amidu na C-konci v tom smyslu, že se dále očekává, že to dále chrání peptid proti exoproteolytické degradaci, ačkoliv mohou být hydrolyzovány některými peptidázami (Leslie, F. M. a Goldstein, A. (1982), Neuropeptides, 2, 185-196).

Také se zjistilo, že lze užitečně provádět jiné substituce aminokyselin. Jmenovitě jsme nahradili zbytek Met citlivý k oxidaci v polohách 8, 18 přirozeně se vyskytujícím hydrofobním zbytkem, Nle, jako v japonské patentové publikace 61-24598. Také lze očekávat, že jiné hydrofobni zbytky, jako Leu, Ile, Val, Phe a Trp by byly užitečné jako podle USP 5,393.869 pro Nakagawa aj..

Také jsou brány v úvahu reversní laktamy. Ukázali jsme účinnost změny Lys^^-Glu^é. Lze tedy očekávat, že lze užitečně provádět podobné změny mezi laktamy 26-30 a 27-30.

Lze provádět, vedle dříve zmíněných Cys-Cys i jiné substituce na výhodném místě laktamů 22-26, například Asp22-Orm“^. aby se osvětlilo, že lze připravit různá místa cyklizace/ velikosti kruhu.

V USP 5,393,869 pro Nakagawa aj. a v USP 5,434,246 pro Fukuda aj. se uvádí, že některé substituované analogy hPTH mají podstatnou AC aktivitu a mohou mít zvýšenou stabilitu proti proteolytickému ataku, jmenovitě;

1. Ser-1 na Aib (kyselina a-aminomáselná),

2. Lýs-27 na Gin (uvádí se, že má 2,5 x AC aktivitu),

3. Zbytky 14, 15, 16, 17 na Lys vcelku nebo v části 9 (uvádí se, že má silně zvýšenou aktivitu - až 8 x). To může být způsobeno zvýšenou rozpustností ve vodě. Očekává se, že in vivo budou labilnější k enzymům podobným trypsinu. Nárokují tento tetrapeptid (zbytky 14-17 včetně) tak, aby v něm byla alespoň jedna aminokyselina rozpustná ve vodě. Například His-14 nebo Lys-14, Leu-15, Lys-15 nebo Arg-15, Asn-16, Om-16, Hci (homocitrullin)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, DLys-16, Ser-16 nebo Gly-16, a 17-Ser, 17-Lys, 17-Asp nebo 17-Arg. Například také mohou zahrnovat Glu. 4. Arg 25 na His, aby se minimalizoval atak proteázou. Protože naše laktamy, zejména s Leu nebo jinou hydrofobni aminokyselinou v poloze 27, se mohou stát poněkud nerozpustnými a také nesnadno, rozpustnými, _L mohkh.by se-očekávat,-že stejné - substituce¹budou Užitečné v našich Iaktamech.

Odborníci také poznají, že i když se může dávat přednost cyklickým 1-31 hPTH, také se očekává podle zde ukázaných údajů, že cyklické fragmenty v rozsahu 1-30 až 1-37 také budou účinné. Zejména v literatuře neexistuje žádný důkaz, že přítomnost dalších aminokyselin až do

Ί ovlivňuje biologické vlastnosti hormonu, zejména podle zde zahrnutých potvrzujících údajů 1-34.

Laktamy podle tohoto vynálezu lze připravit známými způsoby popsanými níže a lze je použít k stimulaci růstu kostí, pro obměnu kostí, pro hojení kostí v různých situacích, jako je léčení osteoporózy a běžných zlomenin.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje strukturu lidského paratyroidního hormonu PTH, zbytky 1-31 (SEQ ID

NO: 1).

Obr. 2 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO : 3).

Obr. 3 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Lys²⁶-Asp³0)-hPTH-( 1-31)-14¾ (SEQ ID

NO: 4).

Obr. 4 ukazuje aktivity analogů podle vynálezu při stimulaci adenynyl cyklázy v buňkách ROS 17/2.

Obr. 5 ukazuje reprezentativní histologické řezy kostí připravených na konci 8 týdnů po OVX, což osvětluje různé schopnosti hPTH-( 1-31)-14¾ a jeho laktamových derivátů zabránit ztrátě kosti a stimulovat růst kostí u Sprague-Dawley krys s odstraněnými vaječníky (OVX).

Obr. 6 ukazuje trabekulámí objem kostí u kontrolních zvířat a u zvířat ošetřených hPTH analogem u krys původně silně zbavených kostí. Ošetření zvířat počalo 9 týdnů po OVX. Nejúčinnější z fragmentů byl (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-31)-NH2, který obnovil kosti na hodnoty normálních kontrolních krys.

Obr. 7 ukazuje trabekulámí tloušťka krysích femurů pro normální, s odstraněnými vaječníky (OVX), falešné a zvířata ošetřenými hPTH-( 1-31)-14¾ (Leu²⁷)cyklo(Glu²²Lys²⁶)-hPTH-( 1 -31 )-NH₂ a (Leu²⁷)cyklo(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-( 1 -31 )-14¾

Obr. 8 ukazuje maximální pokles tlaku krve a čas do maximálního poklesu tlaku krve po přidání dávky 0,8 nmol/ 100 g hPTH-( 1-31)-14¾ (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l31)-14¾ a (Leu²⁷)cyklo(Lys²6-Asp³G)-hPTH-( 1-31)-14¾. Peptidy se podávaly buď

....., Γ ’^ť podkožně (prázdný sloupec), nebo intravenosně (plný sloupec).

'«Λ

Obr. 9 ukazuje strukturu (Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-NH2 (SEQ ID NO: 5).

Obr. 10 ukazuje strukturu cyklo(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO : 6). Obr. 11 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-30)-NH2 (SEQ ID

NO: 7).

•τ-¹—

Obr. 12 ukazuje aktivity různých analogů podle tohoto vynálezu při stimulaci adenynylcyklázy.

Obr. 13 ukazuje hypotenzivní účinek hPTH-(l-31)-NH₂ a hPTH-(l-30)-NH₂ a jejich cyklických analogů.

Obr. 14 je graf ukazující účinek různých dávek lineárního hPTH-(l-31)-NH2 na růst kostí.

Obr. 15 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-30)-OH (SEQ ID NO :8).

Obr. 16 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-34)-NH2 (SEQ ID

NO: 9).

Obr. 17 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-34)-OH2 (SEQ ID NO: 10).

Obr. 18 ukazuje strukturu (Ala²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²6)-hPTH-( 1-31)-14¾ (SEQ ID NO: 11).

Obr. 19 ukazuje strukturu (Nle²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 12).

Obr. 20 ukazuje strukturu (Ňle8>28 Leu²⁷)cyklo(Ghi²²-Lys²6)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 13).

Obr. 21 ukazuje strukturu cykIo(Glu²²-Lys²ý)-hPTH-(l.’31)-NH2.(SEQ.ID NO :_14).. Obr. 22 ukazuje strukturu (Ile²⁷)cykIo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-( 1 -31 )-NH2 (SEQ ID NO :15).

Obr. 23 ukazuje strukturu ,(Tyr²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l -31)-NH2 (SEQ ID

NO: 16).

Obr. 24 ukazuje strukturu a-acetyI-(Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 17).

Obr. 25 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 18).

Obr. 26 ukazuje strukturu (Leu²⁷)cyklo(Asp²²-Om²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 (SEQ ID NO: 19).

Obr. 27 ukazuje strukturu (Cys²², Cys²⁶, Leu²⁷)cyklo(Cys²²-Cys²⁶)-hPTH-(l-31)NH₂ (SEQ ID NO: 20).

Obr. 28 ukazuje strukturu (Cys²⁶, Cys 30, Leu²⁷)cyklo(Cys²²-Cys²⁶)-hPTH-(l-31)NH₂ (SEQ ID NO: 21).

Příklady provedení vynálezu

Příprava analogů hormonu

Technika syntézy peptidů v pevné fázi vyvinutá R. B. Merrifieldem (Solid Phase Synthesis, Advances ín Enzymology 32, 221-296, 1969), která je zahrnuta do popisu tímto odkazem, se široce a úspěšně používala při syntéze polypeptidů, jako je paratyroidní hormon. Strategie je založená na připojení karboxylového konce k pevnému nosiči. Pak se přidávají postupně aminokyseliny s vysokým výtěžkem. N-konec α-amino skupiny se tak chrání, takže tato ochranná skupina se může snadno odstranit bez odstranění peptidu z pevného nosiče. Zde použitá chemie vyžaduje modifikaci původního Merrifieldova způsobu, označovanou jako Fmoc přístup. Fmoc skupina (fluorenylmethoxykarbonyl) se může odstranit za mírných alkalických podmínek, což ponechává nedotčené ochranné skupiny bočního řetězce odolné alkálíím a připojení k nosiči. Technika je popsaná E. Atherton a R. C. Sheppard, Solid Phase Synthesis, a Practical Approach, IRL Press, New York, N. Y., což je sem zahrnuto tímto odkazem.

Příklad 1

Syntéza a čistění lineárních analogů hPTH-( 1-31 )-amidu α-Amino skupiny aminokyselin se chránily 9-fluorenylmethoxykarbonylem (Fmoc) . · ’ · .ta během spojem. Spojení se provedlo směsí hydroxybenzotriazolem (HOBt), 2-(lH-benzotnazol10 l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluorborátu (TBTU) a diisopropylethy laminu (DIPEA). Použil se 4 násobný přebytek aktivovaných aminokyselin s dvojitým spojením na přidání zbytků Asn, Gin, His, Val a Ile. Doby spojení pro přidání Arg a Gly se zvýšily z 30 na 60 minut. Spojem prvého zbytku (Vapl) k nosiči (Tentagel* R, Rapp Polymere, Tubingen, Německo) se provádělo ručně. Všechny ostatní kroky se prováděly na automatickém syntetizátoru PerSeptive Biosystems* Model 9050 Plus. Ochrany pobočného řetězce byly postupně: Arg (2,2,5,7,8pentamethylchroman-6-sulfonyl), Glu, Asp a Ser (t-butyl), His, Gin a Asp (trityl), Trp (tbutyloxykarbonyl).

Po odstranění Fmoc z N-koncového Ser se peptidická pryskyřice promyla DCM, pak se štěpila od pryskyřice třepáním s 7,5 ml reagentu K (6,19 ml TFA, po 0,38 ml vody, 90% fenol/vody a thioanisolu, a 0,19 ml 1,2-ethandithiolu po 4 hodiny při 20 °C. Směs odštěpených peptidů se odstranila filtrací a srážela se přidáním t-butyl-methyl etheru. Sraženina se sebrala odstředěním, promyla se dvakrát t-butyl-methyl etherem a pak se sušila vakuovým odstřeďováním.

Surový produkt se rozpustil v 14 ml 15 % acetonitril/vody, 0,1% TFA a chromatografoval se na koloně Vydac* Cjg (0,010 ml, 1 x 25 cm). Produkt se eluoval minimálním 1% gradientem acetonitrilu (14-40%) v 0,1% TFA ve vodě. Čistota konečného produktu se určila analytickou HPLC na koloně Vydac* Cjg (0,010 ml, 0,4 x 25 cm) a molekulárním hmotnostním testem na hmotnostním spektrometru s elektrorozprašováním (VG Quattro). Údaje pro takto vzniklý hPTH-(l-31)-NH2 jsou uvedena v tabulce 1 níže.

Příklad 2

Syntéza a Čistění cyklických analogů (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH₂. Tento peptid se syntetizoval, jak se popisuje pro příklad 1 s Lys-Alloc a Glu-OAU substitucemi v poloze 26 a 22. Po přidání FmocSeú⁷ se peptidická pryskyřice odstranila z kolony do reakční zkumavky (Minivial*, Applied

Science), suspendovala se v 1,7 ml roztoku tetrakis(trifenylfosfin)paladia(0) (0,24 mmol), 5% kyseliny octové a 2,5% N-methylmorfolinu (NMM) v.dichlormethanu (DCM) pod argonem, pak o se třepala 6 hodin při 20 C, aby se odstranily allylové a alloc ochranné skupiny (Solé, N. A. aj. (1993) v Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Smith, J. a Hodges, R (Eds), ESCOM, strany 93-94, což je zahrnuto do popisu tímto odkazem. Peptidická pryskyřice se pak promyla 0,5% diethyldithiokarbamátem.(DEDT), 0,5% NMM v DMF (50. ml), pak DMF (50 ml) a DCM (50 ml). Peptid se cyklizoval 0,06 mmol l-hydroxy-7-azabenzotriazolem (HOAt/ 0,12 •Λ

0 0 tl ·· ·*

0« · • «

0 0 00000 0

0 0

00

0 ·

0 »

000 000 0 0

00 mmol NMM v DMF (2 ml) 14 hodin při 20 °C (Carpino, L. A. (1993) J. Am. Chem. Soc., 115, 4397-4398. Peptidická pryskyřice se filtrovala, jednou se promyla DMF, znovu se naplnila do kolony a promyla se DMF, dokud se neodstranily bublinky ze suspenze. Zbylá syntéza se prováděla jako v příkladě 1, pouze N-koncová Fmoc skupina se neodstranila. Fmoc peptid se štěpil od pryskyřice reagentem K, jak se popisuje shora. HPLC se prováděla jako v příkladě 1 s Fmoc skupinou neodstraněnou před konečnou HPLC.

Analog (Leu22)cyklo(Lys2^-Asp^^)-hPTH-(l-31)-NH2 se připravil analogickým způsobem.

Příklad 3

Testy adenynylcyklázy

Schopnost analogů hPTH vázat receptory a aktivovat signální mechanismus spojený s adenynylcyklázou se stanovila na diferenciaci buněčné linie kompetentního osteoblastu podobného ROS 17/2 krysím osteosarkomem (ROS). Je známo, že tato aktivita je úzce spojená se schopností analogů obnovit hmotu kostí u krys s odstraněnými vaječníky. Stimulující aktivita na adenynylcyklázu se stanovila nejprve označením buněčné ATP kultury (^H)-adeninem a pak měřením množství (^Hj-cyklický AMP vzniklého z (^H)-ATP během prvých 10 minut expozice danému analogu. To je založeno na postupu, jak popisují Whitfield aj., J. Cellular Physiology, 150,299-303, 1992, což je zahrnuto do popisu tímto odkazem.

Výsledky s adenynylcyklázou jsou uvedeny v tabulce 2 níže jako koncentrace nutné k vyjádření poloviny maximálního zvýšení AC aktivity. Tyto údaje jsou také uvedeny na obr. 4. Plné kroužky ukazují aktivitu adenynylcyklázy hPTH-(l-31)-NH2· Aktivity (Leu27)cyklo(Glu22-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH₂ a (Leu27)cyklo(Lys²6-Asp30)-hPTH-(l-31)NH2 se ukazují prázdnými a plnými trojúhelníky.

Příklad 4

Stanovení anabolické aktivity hPTH analogů u krys s odstraněnými vaječníky

Dávkování: - - - - Dávky byly založeny na dávkové odpovědi na hPTH-(l-31)-NH2- Schopnost hPTH(1-31)-NH2 budovat kost se testovala s použitím více dávek (0,8, 0,6, 0,4 a 0,2 nmol/ 100 g tělesné hmotnosti) a regenerativním nebo léčení oceňujícím spíše než preventivním modelu^.

. ,,ζ, · . . · l·’

Krysy s odstraněnými vaječníky staré 3 měsíce se ponechaly 9 týdnů, aby jejich většinou »« ·* ·· * ·· *· **«·· · · · ··· · » I « · * · · · · ♦ · «, · a · ······ ··· ··· ······ * *

...... ·· · ·· *· nelamelárm, femolámí, trabekulární kost byla silně ochuzena před zahájením 6 týdnů denních injekcí. Ke konci 9 týdne ztratily asi 75 % hmotnosti femolámí, trabekulární kosti. Obr. 14 ukazuje zvýšení střední trabekulární tloušťky závislé na dávce způsobené lamelámím ukládáním vyvolaným 36 injekcemi 4 různých dávek fragmentu. Fragment by také mohl stimulovat růst trabekulární kosti u mnohem starších krys. Tak 36 injekcí střední dávky lineárního hPTH-(l31)'NH2 ¹¹³ růst kostí 0,6 nmol hPTH-(l-31)-NH2/ 100 g tělesné hmotnosti mohlo významně zvýšit střední trabekulární tloušťku nad normální výchozí hodnotu u krys starých 1 rok a činily to stejně účinně jako hPTH-(l-84). Dávky 0,6 nmol/100 g tělesné hmotnosti se tedy použily v dalších testech.

Úplný popis protokolu dávají Rixon, R. H. aj., (1994) J. Bone Minerál Res. 9, 11971189 a Whitfield aj. (1996) Calcified Tissue Int. 58, 81-87, což je zahrnuto do popisu tímto odkazem. Normální Sham-OVX (s odstraněnými vaječníky) a OVX Sprague-Dawley krysy (staré 3 měsíce 255-260 g) se získaly z Charles River Laboratories (St. Constant, QC). Krysy se náhodně rozdělily do skupin po 8 zvířatech, které dostávaly krysí stravu Purina a vodu podle libosti. Nedošlo k žádným neplánovitým úmrtím. Zvířata dostala jednou denně 6 podkožních injekcí za týden počínaje od konce druhého týdnu po OVX a konče na konci osmého týdne po OVX (například 36 injekcí). Osm Sham-OVX a osm OVX kontrolních krys dostalo 36 injekcí vehikula (0,15MNaCl obsahující 0,001N HC1), zatímco osm OVX krys dostalo 0,6 nmol/100 g tělesné hmotnosti fragmentu ve vehikulu/ 100 g tělesné hmotnosti. Na konci osmého týdne po OVX se femury vyjmuly, isolovaly, Čistily a rozřízly na polovinu u střední diaphysis a proximální půle se vyhodila. Po odstranění epiíyzy se každá půle femuru podélně rozštěpila na dvě části a kostní morek se vypláchl.

Schopnosti fragmentů tvořit kost se hodnotily podle změn průměrné tloušťky (plocha/obvod) trabekulí v distální polovině femuru u různě ošetřených zvířat. Aby se změřila průměrná tloušťka trabekulí, dvě demineralizované poloviny femuru od každé krysy se dehydrovaly a zalily se do parafinu. Podélné 0,010 mm sekce ze střední roviny každé kosti se vyřízly a obarvily se Sandersonovým rychlým barvivém kostí (Surgipath Medical Industries, lne., Winnipeg, MB, Kanada). Průměrná tloušťka trabekulí se změřila s použitím zobrazovací soustavy. M4 a.kostního morfometrického software-od Imaging Research, lne., St. Catherines, On, Kanada).

Reprezentativní histologické řezy kostí připravené na konci osmého týdne po OVX se ukazují na obr. 5. Výsledky se dále ukazují ve formě sloupcového grafu na obr. 7. Sloupce ukazují hodnoty tloušťky trabekulí u normálních krys, křys s odstraněnými vaječníky (OVX), ·

0 · ·

000 0

0 0 *0 0« B 0 0 » 0 · 0 *00 00·

0 falešných, hPTH-(l-31)-NH₂, (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 a (Leu²⁷)cyklo(Lys²⁶-Asp³⁰)-hPTH-( 1 -31 )-NH2. (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l -31 )NH₂ ukazuje zvlášť výbornou aktivitu ve srovnání s lineárním analogem hPTH-( 1-31 )-NH₂. Tento lineární analog se ukázal být zcela aktivní při obnově kosti, ale užívá jen cestu buněčné signalizace (AC-aktivace). Tedy se očekává, že cyklické analogy podobně jako jejich lineární analogy mají méně nežádoucích postranních klinických účinků než jejich delší vzory jako hPTH-(l-34) nebo hPTH-(l-84).

Příklad 5

0'

Obnova kosti analogy hPTH u krys se silně zbavenou trabekulámí kostí

V tomto druhém příkladu obnovy kosti se srovnávají schopnosti fragmentů obnovit silně zbavenou trabekulámí kost. V tomto pokusu se 6. týdenní program injekcí jednou denně 0,6 nmol peptidu/ 100 g tělesné hmotnosti u mladých sexuálně zralých krys se odložil až na konec 9. týdne po OVX. V této době se ztratilo 75 % jejich trabekulárních kostí, jak lze vidět na obr. 6, nejúčinnější z fragmentů byl (Leu²⁷)cyklo(GIu²²-Lys²^)-hPTH-(l-31)-NH₂, který obnovil kosti na hodnoty normálních kontrolních krys.

Příklad 6

Hypotenzivní účinky analogů hPTH

Samičí Sprague-Dawley krysy (vážící přes 290 g) se anestetikovaly intraperitoneálně injikovaným pentobárbitalem sodným (65 mg/ kg tělesné hmotnosti). Monitorovala se rektální teplota termistorem YSI402 (Yellow Springs Instrument Co., Yellow Sprtngs, OH) a udržovala se mezi 36,0 a 38,5 °C během pokusu. Také se monitorovala teplota ušního boltce s použitím termistoru YSI banjo. Ocasní artérie se obnažila a kanulovala se Jelco 25-gIV katetrem (Johnson and Johnson Medical lne., Arlington, TX) a připojila se k Stanthamovu převodníku tlaku, jehož signály se digitálně zapisovaly monitorem Biopac Systems MP100 (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Kanada). Také se obnažila femorální žíla pro íntravenosní injekci PTH nebo jednoho jeho fragmentů. Po operaci se krysy nechaly 8 minut stabilizovat. Potom se PTH nebo jeden z jeho’ fragmentů (rozpuštěný v okyselené solance obsahující 0,00'1'N HC1) se infikovaly do femorální žíly nebo pod kůži zadku. Údaje se sbíraly 12 minut po íntravenosní injekci nebo 22 minut po podkožní injekci. Obr. 8 ukazuje maximální pokles tlaku krve a čas do maximálního poklesu tlaku krve po přidání dávky 0,8 nmol hPTH-(l-31)-NH₂/ 100 g tělesné hmotnosti, (Leu^⁷jcyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-31)-NH₂ a (Leu²⁷)cykfo(Lys²^-Asp³Q)14 hPTH-(l-31)-NH2· Podávalo se buď podkožně (prázdný sloupec), nebo intravenosně (plný sloupec). (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-31)-NH2 analog ukazuje zvýšenou biodostupnost ve srovnání s (Leu^{2 7})cyklo(Lys²6-Asp30)-hPTH-( 1-31)-14¾. To naznačuje mnohem kratší doba potřebná k poklesu tlaku krve na minimum po podkožní injekci. Oba cyklické analogy ukazují zvýšené hypotenzivní účinky, když se injikují podkožně ve srovnání s hPTH-(l-31)-NH2· Tedy se očekává, že každý cyklický laktamový analog, když se injikuje podkožně, bude mít více žádoucích vlastností než lineární obdoba. Ty zahrnují zvýšenou biodostupnost pro transport z lipidických okolí. Toto by mohlo být důsledkem stabilizace ašroubovníce blízko C-konce hormonu.

Další výsledky:

Pro účely těchto výsledků se peptidy identifikují následovně: hPTH'(l-31)-NH₂ (1), (Leu²⁷)-hPTH-( 1 -31 )-NH₂ (2), (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-31)-NH2 (3) (obr. 2), (Leu²⁷)cyklo(Lys²⁶-Asp30)-hPTH-( 1 -31 )-NH2 (4), cyklo(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(l-31)-NH2 (5) (obr. 10), (Leu²⁷)-hPTH-(l-30)-NH₂ (7), (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²^)-hPTH-(l-30)-NH₂ (8).

Aktivity adenynylcyklázy. Dříve jsme uvedli, že (Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-NH2 je účinnější při stimulaci AC aktivity v ROS buněčné linii než,hPTH-( 1-34)-14¾.

Také jsme zjistili, že peptid (2) (EC50 11,5 +/- 5,2 nmol) je aktivnější než nativní sekvence (1), (EC5Q 19,9 +/- 3,9 nmol) (obr. 12). Jsou ukázané peptidy 1 (·), 2 (□), 3 (Δ), 4 (^A), (O). Vzníř láictamu mezi Glu²² a Lys²^ indukovalo ještě větší AC- stimulující aktivitu s EC5Q hodnotami 3,3 +/- 0,3 nmol) (obr. 12). Tedy zesíťující vliv cyklizace a náhrada Lys^{27 23}Leu vede k asi 6-násobné zvýšení aktivity. Naproti tomu vznik laktamu jak mezi Lys^2ť> a Asp^O (4) tak mezi Lvs².?, a Asp^O (5) vedlo ke snížení stimulace aktivity adenynylcyklázy vzhledem k ‘ jejich výchozím lineárním sekvencím. Tak 26-30 laktam (4) má trochu menší aktivitu než jeho ·« ·· «· · ♦· »· «·» * · · · · · · • 41 · · · · · · · · • · « · ·· · ·»« ··· ··»·« « · lineární forma s EC₅₀ 17,0 +/- 3,3 nmol proti 11,5 +/-**5,2*nmol*pro (2). 27-30 laktam (5) snižuje aktivitu výchozího lineárního peptidu. Má ECjq 40,3 +/- 4,4 nmol ve srovnání s 19 +/3,9 nmol pro (1).

Dříve jsme uvedli, že hPTH-(l-30)-NH2 (6) má stimulační AC-aktivitu (EC50 20 nmol), blízkou analogu (1). Nyní jsme našli, že (Leu27)-hPTH-(l-30)-NH2 (7) a (Leu27)_Cyklo(Glu²^Lys26)-hPTH-(l-30)-NH2 (8) (obr. 11) mají stimulační AC-aktivity podobné peptidu (6),

Hypotenzivní účinky:

Obrázek 13 ukazuje hypotenzivní účinek lineárních (6 a 7) a cyklických analogů (3 a 8). Ukazují se maximální poklesy (horního) tlaku krve získané po injekcí krysám 0,8 nmol analogu/ 100 g tělesné hmotnosti a čas do dosažení maximálního poklesu tlaku krve (nižší). Analogy (od leva do prava peptidy 8, 7, 6, 3) se injikovaly buď intravenosně (stínovaný sloupec) nebo podkožně (prázdný sloupec). Odstranění VaP¹ vedlo u všech analogů 6, 7 a 8 k významnému (p < 0,05) snížení rychlostí přenosu podkožně injikováných peptídů do vaskulámího systému (obr. 13). Skutečné celkové poklesy tlaku krve u peptidů 6 a 8 se nicméně významně (p > 0,05) nelišily od poklesů u jiných analogů, ať se podávaly podkožně nebo intravenosně, s výjimkou peptidu 5.

Pokus srovnávající hypotenzivní účinek s osteogenní aktivitou

Jak se popisuje v příkladě 6 a ukazuje se na obr. 8, rychlý hypotenzivní účinek pozorovaný po podkožní injekci hPTH analogů koreluje s osteogenní aktivitou. Proto je užitečný pokus pro screening kandidátních hPTH analogů pro osteogenní účinek a aby se vyloučily nehypotenzivní konstrukty, aniž by se musela obětovat laboratorní testovací zvířata.

, Pro pozadí, použili jsme jediný soubor osteogenních a neosteogenních AC-, AC/PLCnebo PLC-aktivujících fragmentů, aby se definitivně dokázalo, že je to pouze AC-stimulace, která snižuje tlak krve, a porovnaly se hypotenzivní účinky těchto fragmentů, když se injikují podkožně nebo intravenosně krysím samicím. Ukázali jsme, že hypotenzivní odpověď se spouští pouze fragmenty stimulujícími AC-, ÁČ/PLC- nebo PLC- a že je to relativně slabá odpověď na podkožní injekci a nikoliv mnohem větší odpověď na intravenosní injekci, která koreluje s osteogenními aktivitami hPTH-(l-31)-NH2, hPTH-(l-34) a hPTH-(l-84) u OVX krys, nikoliv však k hPTH-(l-30)-NH2, která stimuluje AC a snižuje tlak krve, ale nestimuluje růst kostí.

IV ·· 99 ·· 9 ♦ · 9· • « ♦ 9 9 · 9 * · « 9 * · * · · · 9 · 9 » • 9 9 9» 9 99«J · 9·« ·«·

9 9 9 9 9 * 9

Podrobněji, hPTH-(l-84) a její fragmenty hPŤtí-(l-34), hPŤH-íl-ílj-SjHya hPTH(l-30)-NH2 snižovaly tlak krve v ocasní artérii samičích Sprague-Dawley krys o 42,7-67,1 % asi během 1 minuty po injekci do femorální žíly, ale snižovaly tlak krve jen o 8,5-36,2 % 2-19 minut po podkožní injekci. hPTH-(l-84) a hPTH-(l-34) stimulují v cílových buňkách jak adenynylcyklázu, tak fosfolipázu-C, avšak hypotenzivní účinky musely být stimulovány specificky aktivací adenynylcyklázy, protože hPTH-( 1-3 0)-15¾ a hPTH-( 1-31)-14¾ které mohou stimulovat pouze_adenynylcyklázu,^byly^sílně^hypotenzivní, .když. , se_k injikovaly intravenosně, zatímco hPTH-(l-84), která stimuluje pouze fosfolipázu-C, nebyla silně hypotenzivní, když se injikovala intravenosně. Poněvadž osteogenní účinek PTH je také zprostředkován stimulací adenynylcyklázy, očekávalo se, že hypotenzivní odpověď by se mohla využít pro screening nových ΡΊΉ konstruktů na možnou osteogenicitu. Osteogenní aktivity podkožně injiko váných hPTH-(l-31)-NH2, hPTH-(l-34) a hPTH-(l-84) blízko korelovaly s jejich hypotenzivními aktivitami. hPTH-(l-34) byl o hodně více hypotenzivní a významně více než ostatní dvě molekuly. hPTH-( 1-31)-14¾ ^a hPTH-(l-84) byly stejně osteogenní a hypotenzivní. Avšak tato korelace selhala u hPTH-( 1-3 0)-14¾ která stimuluje AC skoro tak silně jako hPTH-(l-31)-NH₂ a hPTH-(l-34) a snižuje tlak krve jako hPTH-(l-31)-NH₂, ale nestimuluje růst kostí. Nicméně schopnost významně snižovat tepenný tlak je obecnou vlastností osteogenní PTH a PTH fragmentů a je tedy rychle stanovitelným předběžným ukazatelem bioaktivity in vivo PTH fragmentů.

Podrobněji, jak hPTH-(l-34) tak hPTH-( 1-31)-15¾ byly maximálně hypotenzivní při

0,8 nmol/ 100 g tělesné hmotnosti. Tato hypotenzivní odpověď byla doprovázena přechodným (20-30 minut) zčervenáním krysích uší a tlapek, což lze považovat za užitečný vizuální kvalitativní znak.

Ačkoliv AC- nebo AC/PLC- stimulující fragmenty byly silně hypotenzivní, když se injikovaly intravenosně, intřávenosní injekce 0,8 nmol hPTH-(7^:84) / 100 g tělesné hmotnosti¹, která může stimulovat pouze PLC velmi pomalu (9,8 +/- 2,0 minut) a pouze velmi lehce, snižovala tlak v ocasní tepně o 0,44 +/- 0,13 kPa v porovnání s rychlým (0,9 +/- 0,08 minut) snížením 5,76 +/- 0,77 kPa způsobeným^ AC/PLC; stimulující hPTH-(l-84) nebo stejně rychlým poklesem 6,88 +/- 0,44 způsobeným AC stimulující hPTH-( 1-30)-14¾

Jedna podkožní injekce AC- nebo AC/PLC- stimulujícího fragmentu způsobila mnohem pomalejší a menší snížení tlaku v ocasní tepně než intřávenosní injekce stejné dávky. Například 0,8 nmol hPTH-(l-34) / 100 g tělesné hmotnosti snižovala tlak v ocasní tepně o 3,72 • · 9 · · 4 4 W · * * • · · · 4 * *··· 4 ··· ··· • i i 4 * · · ♦ •444*4 4* « ·* ** +/- 0,48 kPa, když se injikovala podkožně v porovnání s 6,79 +/- 0,75 kPa, když se injikovala intravenosně. Stejná dávka hPTH-( 1-30)-14¾ snižovala tlak krve jen o 1,48 +/- 0,21 kPa, když se injikovala podkožně, v porovnání s 6,88 +/- 0,44 kPa, když se injikovala intravenosně.

Neexistoval významný rozdíl mezi rychlým a velkým poklesem tlaku v ocasní tepně způsobeného intravenosní injekcí hPTH-(l-84), hPTH-(l-34) a hPTH-( 1-31)-14¾ avšak hPTH-(l-34) byl alespoň dvakrát tak účinný (p < 0,001) jako ostatní dvě molekuly, když se injikovaly„ podkožně., , - ,. . . ---Jedním z faktorů ovlivňujících hypotenzivní aktivitu a osteogenicitu podkožně injikovaných PTH nebo PTH fragmentů je schopnost se pohybovat bez dezaktivace z místa injekce ke svému cíli nejprve do svalstva a pak do kostí. Tato schopnost se odráží v době potřebné pro tlak v ocasní tepně klesnout na minimální hodnotu po injekci. Zkrácení PTH molekuly na C-konci z 84 na 31 zbytků odstranilo schopnost stimulovat PLC bez snížení schopnosti stimulovat AC a snížilo devětkrát množství času potřebného pro tlak v ocasní tepně, aby dosáhl svého minima. Odstranění jednoho zbytku, aby vznikl hPTH-(l-30)-NH2, dramaticky zvýšilo množství času potřebného pro tlak v ocasní tepně, aby spadl na své minimum z 2,0 +/- 0,31 minut v případě hPTH-( 1-31)-14¾ na 13,8 +/- 2,3 minut. Je však důležité poznamenat, že hPTH-( 1-31)-14¾ trvalo déle snížit tlak krve než hPTH-(l-84).

Použití v této studii hPTH-(l-31)-NH2, prvého PTH konstruktu schopného stimulovat

AC stejně silně jako hPTH-(l-31) bez aktivace PLC a stimulujícího aktivitu PKC spojenou s membránou, nyní dalo nejpřímější důkaz, že hypotenzivní účinek PTH je způsoben úplně AC aktivací. Tedy ačkoliv intravenosní injekce 0,8 nmol hPTH-(7-84) / 100 g tělesné hmotnosti, která může pouze stimulovat PLC/PKC, neovlivnila významně tlak v ocasní tepně, intravenosní injekce stejné dávky hPTH-( 1-3 0)-14¾ snížila tlak stejně jako hPTH-(l-34).

Protože AC také zprostředkovává PTH indukovanou stimulaci kortikální a trabekulámí tvorby kostí u OVX krys, spuštění hypotenzivní odpovědi u nedotčených krysích samic se zdá být jednoduchým, snadno měřitelným ukazatelem možné osteogenicity PTH konstruktů. Na druhé straně selhání při snižování arteriálního tlaku by vyloučilo fragment z dalšího - vyhodnocování, tedy vyřazujícím zbytečné, nákladné dlouhodobé testy osteogenicity OVX krys. Hypotenzivní odpovědi na intravenosní injekce PTH by nebyly korelovány s osteogenicitami. Avšak mnohem menší hypotenzivní odpovědi na podkožní injekce hPTH-( 1-31)-14¾ hPTH(1-34) a hPTH-(l-84) byly paralelní k osteogenicitám těchto molekul s hPTH-(l-34) majícím nejsilnější hypotenzivní a osteogenní aktivitu a druhé dvě molekuly vzájemně stejně účinné, *♦ · · · · * . . - ·· · · · ·.

i I · · · '·* ♦ » “ · • ι ♦>·’·.·♦·*·♦ *·· ·*· • I e> 4 » ί * » »t ·.· · *· ·* ale méně účinné než hPTH-( 1-34) při snižování tlaku krve a stimulaci tvorby kostí. Avšak tato korelace selhala u hPTH-(l-30)-NH2, která stimuluje AC skoro tak silně jako hPTH-( 1-31)-14¾ a hPTH-(l-34) a snižuje tlak krve jako hPTH-(l-31)-NH₂, ale nestimuluje růst kostí 1 k Důvod tohoto nedostatku osteogenicity není znám. Nemůže být působen pouze podkožně injikovaným hPTH-(l-30)-NH₂, potřebujícím více času na snížení tlaku krve, protože podkožně injikovaný hPTH-(l-84) potřebuje stejné množství času na snížení tlaku krve, avšak je silně osteogenní. Osteogenní odpověď jasně závisí na řadě různých faktorů, které se kombinují, aby umožnil přístup z místa injekce dosti aktivního hormonu nebo fragmentu hormonu na cílové zralé osteoblasty exprimují PTH receptor. Neschopnost hPTH-(l-30)-NH2, AC- stimulujícího a snižujícího tlak krve, stimulovat tvorbu kostí by mohla být výsledkem větší nestability, poněkud vyšší EC50 pro AC stimulaci, například 20 nmol místo 16 nmol pro hPTH-(l-31)-NH₂a hPTH-(l-34), a dlouhé doby pro vstup do cirkulace z místa injekce.

Přes neschopnost hPTH-(l-3O)-NH2 být osteogenní, schopnost významně snižovat tepenný tlak je stále obecnou vlastností osteogenních PTH a je tedy rychle stanovitelným ukazatelem možné bioaktivity in vivo PTH fragmentů. Z toho plyne, že hypotenzívní odpověď by také měla sloužit jako účinný ukazatel schopnosti osteogenního PTH konstruktu dosáhnout své cíle po podám orální nebo jinou neinjekční cestou.

Nepohodlí a jiné možné nepříjemnosti hypotenzivní reakce na každou injekci by mohly snížit vůli pacientů s osteoporózou přijímat dlouhodobé léčení s PTH a PTH fragmenty. Naštěstí se přerušované podkožní injekce se běžně užívají k stimulaci tvorby kostí a tyto molekuly jsou mnohem méně hypotenzivní, když se injikují podkožně, než když se injikují intravenosně. Jak jsme'také argumentovali dříve ^{6 7} hP-TH-(l-30)-NH₂ by také měl další výhodu stimulace AC bez stimulace PLC a kterýchkoliv možných postranních účinků působených Ca^⁴ a PKC, které by mohl spustit.

Příklad 7

Cyklo(Lys27-Asp30)-hPTH-(l-31)-NH2 (5). Syntéza se provedla analogickým ' žpůšóbémrk (Leu2'^)cykίo(Glu2--L·ys2^)-hPTH-(l'-3Ί)-NH2. Produkt měl odhadnutou -čistotu přes 95 % s molekulovou hmotností 3700,64 (+/-0,38) (očekávaná Μ + 1 = 3700,14). Peptid se sekvenoval, aby se potvrdila poloha laktamu.

« « · w V >> * τ • 0 ··· ««···· ··· ··· t *·> · · a 0 fc ·»··· ·' · · t ·$ »0 (Leu²⁷)cyklo(Glu²²-Lys²⁶)-hPTH-(l-30)-NH2· Tento peptid se připravil jako peptid (3) bez ručního přidávání Val na nosič. Produkt měl odhadnutou čistotu přes 97 % s molekulovou hmotností 3586,14 (+/-0,19) (očekávaná Μ + 1 = 3685,99).

Analogy podle vynálezu se mohou podávat teplokrevnému savci, který to potřebuje, zejména lidem, parenterálně, topicky, rektálně, inhalací nebo ústně. Analogy se mohou konvenčně upravit do parenterální dávkové formy, smícháním asi 1 do asi 300 mg na jednotkovou dávkovou formu s konvenčním vehikulem, excipientem, pojivém, konzervačním činidlem, stabilizátorem, barvivém, a podobně, jak je běžné u přijaté farmaceutické praxe.

Pro parenterální podávám by bylo potřeba dávat 1 až 2 ml bezbolestné podkožní injekce velmi jemnou injekční jehlou 30-guage více než jednou denně po jeden až dva roky, v závislosti na závažnosti choroby. Injikovaný materiál by obsahoval jednu sloučeninu podle vynálezu ve vodném, isotonickém sterilním roztoku nebo suspenzi (případně s konzervačním činidlem, jako je fenol, a solubilizátorem, jako je ethyleňdiamin tetraoctová kyselina (EDTA). Mezi přijatelnými vehikuly a rozpouštědly, které se mohou použít jsou voda, mírně okyselená voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Mimoto se konvenčně používají jako rozpouštědla nebo suspendující media sterilní fixované oleje. Při přípravě injekcí jako fixované oleje nacházejí použití syntetické monoglyceridy, diglycerídy, mastné kyseliny (jako kyselina olejová).

Pro rektální podávání lze analogy podle vynálezu připravit ve formě čípků smícháním s vhodným nedráždivým excipientem, jako je kakaové máslo nebo polyethylenglykoly. .

Pro topické použití lze analogy podle vynálezu připravit ve formě mastí, gelů, roztoků, suspenzí nebo kožních adhesivních náplastí.

Inhalace lze například dosáhnout prostředky popsanými v PCT publikované přihlášce WO 94/07514. Denní dávka by neměla překročit 0,05 mg/ kg tělesné hmotnosti, nebo asi 3,5 mg/ 70 kg člověka v závislosti na aktivitě dané sloučeniny, věku, hmotnosti, pohlaví a podmínkách léčeného subjektu. Jak je dobře známo, množství aktivní složky, která se může kombinovat s nosiči, aby se doslaJa jednotková dávka, se bude měnit v závislosti na hostiteli a daném způsobu ·--=- - podávání? -.....--------- Následující tabelo váný soupis analogů připravených podle postupů popsaných shora.

· · • ? · > · 3 · * fc ·0 »

\.^b i

·· £·

0 0 ' » 0

0 -00 0 • 0 «9 er

Tabulka 1: Molekulové hmotnosti PTH analogů

sekv. ID	analog	hmotnost (stanovená)	hmotnost (očekávaná) ΜΊ
1	hPTH-(1-31>NHí	3717,77(+0,13)	3717,14
3	[Leu^cydotGlu^-Lys^bhPTH-íl-SD-NH,	3685,46 (±0,46)	3685,12
7	[Leu^í7lcyclo{Glu²²-Lys“)-hPTH-(1-30)-NH₂	3586,14(10,19)	3585,99
4	[Leu^í7lcyc!o(Lys^2e-Asp³⁰)-hPTH-( 1 -31 HH	3685,61 (±0,36)	3685,12
6	cydotLys^-Asp^HiPTH.d^D-NHj	3700,64 (±0,38)	3700,14
a	[Leu^J7]cyclo(GIa²²-Lys^2s)-hPTH-(1-31)-OH	3685,96 (±0,07)	3686,12
9	(leu^Z7]cyclo(Glu^a-Lys^M)-hPTH-(1-34)-NH₂	4083,62(±0,33)	4083,52
10	(Leu^cycIofGlu^Lys^HiPTH-tl-Saj-OH	4084,14(10,87)	4084.52
11	tAla^cyclofGfu^-Lys^HiPTH-tl-aD-NH,	3642,70(10,76)	3643,04
12	[Nle²⁷lcyclo(Gfu^2Z-Lys^2e}-hPTH-(1-31)-NH₂	3684,57(10,99)	3685,12
13	[Nle^^Leu^IcycIotGlu^Lys^PTH-íl-aiJ-NH,	3649,50(0,59)	3649,04
14	cyclo(Glu^a-Lys*WiPTH-{1-31>.NH₂	3699,66 (±0,49)	3700,14
15	(Ile^lcycIoíGlu^-Lys^hPTH-íl-aiJ-NHj	3684,76(10,74)	3685,12

i.!

• i í ♦ ♦ b ·« · · ·

M *· « · · Φ £ « * » «·« ··· » * ·· ··

Tabulka 1 Molekulové hmotnosti PTH analogů

sekv. ID	analog	hmotnost (stanovená)	hmotnost (očekávaná)M⁺l
16	rTyr^]cydo(Glu^s-Lys^w>hRTH-{1 -31 >NH,	3734.47 (±0,80)	3735,14
17	a-acetyl-[Leu²⁷]cyclo(Glu²²-Lys²⁶}-íiPTH-{1-31)-NH₇	3726,25 (±0,42)	3727,12
18	(Leu^rlcyclo(lys^a-Glu^a)-hPTH-{1-31)-NH}	3684,67 (±0,52)	3685,12
19	[Leu^OTIcydo(Asp“<>n^a>hPTH-(1-31)-NH,	3656,90(10,87)	3657,12
20	[Cys²:Cys^2e;Leu²⁷lcyclo(Cys²²-Cys^!6)hPTH(1-31)NH,	3651,2610,31	3650,1
21		3663,61 ±0,16	3664,13

Tabulka 2 Adenynylcyklázové aktivity peptidových analogů

sekv. ID	analog	adenylylcykláza (Ε(Ζ<.θ)
1	hPTH-(1-31}-NH,	20
3	[Leu^lcyclofGlu^Lys^J-hPTHfl-ŠIJ-NHj	3
7	[Leu^lcycIoíGlu^ys^J-hPTH-tl-SOl-NH,	20
4	[Leu²⁷]cycio(Lys^M-Asp^M)-hPTH-(1-31>-NH,	3*, 17°
6	cydo(Lys-Asp®)-hPTH-(1 -31 )-NH₂	40
8	Leu^ÍTlcydo(Glu^a-Lys^ÍB)-hPTH-(1-31)-OH	7
9	fLeu^2T]cyclo(Glu^a-Lys^ie)-hPTH-(1-34)-NHj	8
10	f Leu²⁷lcyclo(Glu²²-Lys“)-hPTH-( 1 -34 )-OH	6
11	\|Ala^írlcydo(Gtu^a-Lys^a)-hPTH-(1-31)-NH,	9
12	\|Nle^alcyclo{Glu^a-Lys^seHiPTH-(1-31).NH,	9
13	tNle^e’^e;Leu^ÍTlcyc1o(Glu^a-Lys”)-hPTH.(1-31>NH,	6
Í4 '	cýclo(Gíu^a-Lys^MřliPTH-(Í-31 )-NH;⁷ ---------- ’ ~ -----	' ' 17 ......~
15	flleⁿlcydo(Glu^a Lys*>hPTH-(1 -31 >NH,	9

·'· ·/

722 i

Tabulka 2 Adenynylcyklázové aktivity peptidových analogů

4* ·· · « 4 • 4 4 to 4 · «' · 4 »44 4 ·· • ·. » • 4 to *

k · · « « 4 4 »

« • · * ♦·· to

4 >4 • « • t «4 4

4»

sekv. ID	analog	adenylylcykláza (EC„)
16	(Tyč^clolGIu“ tys^PTK-ll-SIJ-NHí	9
17	a -acetyl-ILeuⁿ]cydo(Glu^H-Lys^a)-hPTH-(1-31 >NH₃	24
18	ILeu^cyctofLys^Gl^hhPTH-d-SI >NH,	4
19	[Leu^s]cydo(Asp^a-Om^w}-fiPTH-{1-3 1 >NH₃	>200
20	(Cy^Cys^-.Leu^IcycteíCya^-Cys^PTHd-SnNHí	16
21	[Cys^Cys^Leu^lcycIoíCys^-Cys^hPTHd-SDNHj	24

•obr. 4 **obr,12

Literatura

Obsah následujících publikací je sem zahrnut tímto odkazem.

(1) Cauffield, Μ. P.; McKee, R. L.; Goldman, Μ. E.; Duong, L. T.; Fisher, J. E.; Gay, C. T.; DoHaven, P. A.; Levý, J. J.; Roubini, Nutt, R. F.; Chorev,

M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone(PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences - The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Withín the 14-34 Region. Endocrinology 1990, 727, 83-87.

(2) Neugebauer. W.; Barbier, J.-R.;Sung, W.L.; Whitfield, J.F.; Willick, G.E. Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues Biochemistry 1995, 34, 8835-8842.

(3) Gardella, T. J.; Wilson, A. K.; Keutmann, Η. T.; Oberstein, R.; Potts, J. T.; Kronenberg, H.M., and Nussbaum, S. R. Analysis of Parathyroid Hormone's Principal Receptor-Btnding Region by Site-Directed Mutagenesisand Analog Design. Endocrinology 1993, 732, 2024-2030.

(4) Marqusee, S.; Baldwin, R.L. Helix Stabilization by Glu ...Lys+ Salt

Bridges in Short Peptides of De Novo Design. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1987, 84,8898-8902. '

I < rt v ο·;· c< , * Μρ 4' »« b· * -W f ^;q ¢1, * <TA <5?

c<e» «j íf f<

4>

t\ T < Ϊ t e ^: t 1 f t

t. >; II I r.

< ť Γ ! t č r«

(5) Surewiczi W.K.; Neugebauer, W.; Gagnon, L; MacLean, S.; Whitfield, J,F.; Willicít, G.E. Strocture-Function Relationships in Human Parathyroid Hormone: The Essential Role of Amphiphilio-Helix. In Peptides: Chemistry,

Structure, and Biology 1993; Smith, J.; Hodges, R., Eds.; ESCOM Leiden, f!'

The Netheriands, 1993, pp. 556-558 'Ρ (6) Whitfield, J. F.; Morley, P.; Willick, G, E.; Ross, V.; Barbier, J. R.; isaacs, R. J.; Ohannessianbany, L. Stimutation of the Growth of Femoral Trabecular Bone in Ovariectomized Rats by the Novel Parathyroid Hormone Fragment, hPTH-(1-31)NH2 (Ostabolín) Calcif. Tissue Int. 1996, 58,81-87.

t (7) Whitfield, J. F.; Morley, P, Smáli Bone-Biiilding Fragments of, i ti·

Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis Trends Pharmacol. Sci. 1995 16,382-386.

II

5Í i'

Τ' .,>'·$

Γ——ι^Μ~ι·-II -Λίγτιιι-----------·_ — - ., - - - ----_ . — . . ' II MÍMiiáiftrÍ

í.

Seznam sekvencí (2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 1:

Charakteristika řetězce:

(i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

ή.

D) Topologie: lineární, •t (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 1: ‘

V »

Ser Val Ser Glu Iíě Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His í 5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Ařg Lys Lys Leu

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 2:

« * ♦ ♦ « · · · • · »··· t ·· *·· • · a · · ·« Ϊ <1 «·

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO:2:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO: 3:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie; cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 3 :

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO: 4;

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, ř’ · · * ·'

4« φ · ·« · * '» (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 4:

Ser Val Ser Glu lle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu 15 20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO : 5:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: protein, (xí) Popis řetězce: SEQ ID NO: 5:

Ser Val Ser Glu lle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu 15 20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO: 6:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulárm, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 6:

Ser Val Ser Glu lle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 ·· φ'φ ·<..&' ·· ·Φ b Φ » « φ « « « Φ Φ : · , Φ φ · · · Φ ιφ * Φ · Φ

Φ φ Φ · Φ *····· ΦΦΦ Φ Φ Φ

Φ*« Φ « * φ Φ

Φ Φ · Φ ί · « Φ '· ·Φ> ΦΦ

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 7:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 30 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 7:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 8:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 8:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 9:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 34 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 9:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val His Asn Phe

Informace o řetězci SEQ ID NO : 10:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 34 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xí) Popis řetězce : SEQ ID NO: 10:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val His Asn Phe

Informace o řetězci SEQ ID NO : 11:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina, a¹ ♦

MM ‘•aaaa a aaa a

a a

0 *

«••0 «0 ««

0· *·

0 0 ♦ 0 ·

0« 0 0 0 0

0 000 0. 000 000

0 0 0 »· >0

D) Topologie: cirkulámí, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 11:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Ala Leu

20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO: 12:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulámí, (íi) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 12:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Xaa Leu

20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO : 13 :

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulámí, (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 13:

φφ φ

• φ φ ΦΦΦ· ·Φ

Ser Val Ser Glu íle Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val

ΦΦ Φ φφφφ φφφ φφφφ

Φ Φ' Φ. Φ ί· φ φ Φ φ φφφφφφ φφφ φφφ φ φ * * φ φφ φ φφ φφ

Informace ο řetězci SEQ ID NO: 14:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulárm, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce ; SEQ ID NO: 14:

Ser Val Ser Glu lle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 15:

Charakteristika řetězce: 15

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 15:

Ser Val Ser Glu íle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys lle Leu líirfíV.ϋ,.ζ· '1i ·αΛι.

·· to b · · • · · * b * • · » ·« ·· • «to · • · to to >b i ····· « · • to toto

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO: 16:

Charakteristika řetězce: i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 16:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Tyr Leu

20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO : 17:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 17:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val

Informace o řetězci SEQ ID NO : 18:

Charakteristika řetězce:

44 44 4 44 44

44 4 4 44. 4 4 4 4

4 4 444 4 4 4 4

444 4 4444 4> 444 444

4 * 4 4 * * ·

444444 44 * 4 4 44

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie; lineární, (ií) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 18:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO: 19:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulámí, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 19:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 20:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, aa aa aa » ·· ·· • aaa aaa. · * · * • a a a · · · a ·· · • > · · · a ···· · «a· *·· • · a a a « ·' . · aaaaaa aa a aa aa (xí) Popis řetězce : SEQ ID NO: 20:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Cys Leu Leu

20 25

Gin Asp Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO: 21:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: cirkulární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 21:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Cys Leu Leu

20 25

Gin Cys Val 30

Informace o řetězci SEQ ID NO : 22:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 34 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 22:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His l 5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu·

20 25 • 4 44 44 4 44. 44 • 4 4 * 444 4444

444 4*44 4444

444 4 4444 4 444 444 «44444 « 4

4444*4 44 4 44 44

Gin Asp Val His Asn Phe ³⁰

Informace o řetězci SEQ ID NO : 23:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 31 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: protein, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 23:

Xaa Val Ser Glu Ile Gin Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys Xaa

5 10

Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu

20 25

Xaa Asp Xaa ³⁰

Informace o řetězci SEQ ID NO : 24:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 4 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární,

I(ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 24:

Val His Asn Xaa

Informace o řetězci SEQ ID NO : 25:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 5 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární,

0 0 « 0 0 0 0 0·· 000 0000 0000

0 «00 0000« 0 000 000 000««· 0 0

0000*0 0 0 · «· ·· (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 25:

Val His Asn Phe Xaa

5

Informace o řetězci SEQ ID NO: 26:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 6 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 26:

Val His Asn Phe Val Xaa

5

Informace o řetězci SEQ ID NO : 27:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 7 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ií) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 27:

Val His Asn Phe Val Ala Xaa

5

Informace o řetězči SEQ ID NO: 28:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 8 aminokyselin,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární,

ΦΦ φφ φφ · * * » · φ · φ ♦ · · · φ · φ φ · φ · φ ·· · φ • · * * · φ φφφ φ φφφ φφφ φφφφφφ φ φ φφφφ*· φφ φ φφ φ· (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 28:

Val His Asn Phe Val Ala Leu Xaa

5

Informace o řetězci SEQ ID NO: 29:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 4 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xí) Popis řetězce : SEQ ID NO: 29:

His Lys Lys Lys

Informace o řetězci SEQ ID NO: 30:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 4 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 30:

His Leu Lys Lys

Informace o řetězci SEQ ID NO : 31:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 4 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid,

9*99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 · 9 9 9

9 999 9 99«9 9 ·»9 «99

999999 · 9

9 9 9 99 9 9· 99 (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 31:

Lys Lys Lys Lys

Informace o řetězci SEQ ID NO: 32:

Charakteristika řetězce: i) A) Délka: 4 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 32:

His Leu Lys Ser

Informace o řetězci SEQ ID NO : 33:

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 5 aminokyseliny,

B) Typ: aminokyselina,

D) Topologie: lineární, (ii) Typ molekuly: peptid, (xí) Popis řetězce : SEQ ID NO: 33:

Val Leu Asn Phe Xaa

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

t)

1. Analog lidského paratyroidního hormonu hPTH-( 1-31) v jehož poloze 27 je Lys nebo byl substituován vhodným hydrofobním zbytkem a který byl cyklizován, aby vznikl laktam.
2. Analog podle nároku 1, kde cyklizace je buď mezi Glu²² a Lys²^ nebo mezi Lys²^ a Asp^O
3. Analog podle nároku 1, kde hydrofobní zbytek je Leu.
4. Analog podle nároku 1, kde hydrofobní zbytek je vybrán ze skupiny sestávající z omithinu, citrulinu, kyseliny α-aminomáselné, nebo jakékoliv lineární nebo rozvětvené a-amino alifatické kyseliny mající 2 až 10 uhlíků v postranním řetězci, jakéhokoliv takového analogu majícího polární nebo nabitou skupinu na konci alifatického řetězce.
5. Analog podle nároku 4, kde hydrofobní zbytek je vybrán ze skupiny sestávající z Ile, norleucinem, Met a omithinem.
6. Analog podle nároku 1, kde má buď C-koncové amidové zakončení, nebo Ckoncové karboxylové zakončení.
7. Analog podle nároku 1, kde je to SEQ ID NO: 3. i
8. Analog podle nároku 1, kde je to SEQ ID NO: 4. 1
9. Kompozice pro podávání teplokrevnému zvířeti, které to potřebuje, obsahující analog lidského paratyroidního hormonu hPTH-(l-31) podle nároku 1 ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.
10. Kompozice podle nároku 9, kde hydrofobní zbytek v analogu je Leu.
11. Kompozice podle nároku 9, kde hydrofobní zbytek v analogu je vybrán ze skupiny sestávající z Ile, norleucinu, Met a omithinu.

í
12. Kompozice podle nároku 9, kde analogem je SEQ ID NO: 3.
13. Kompozice podle nároku 9, kde analogem je SEQ ID NO: 4.
14. Způsob lečem teplokrevného zvířete, které takové lečem potřebuje, zahrnující j podávání takovému teplokrevnému zvířeti terapeuticky účinné množství analogu lidského paratyroidního hormonu hPTH-(l-31) podle nároku 1.

i • · · · • · · · ·

1 · « · ·#1· · ·« ·· • · · • · • * • · MM ·· • · · · »·· ·♦· ·· ··
15. Způsob podle nároku 14, kde hydrofobní zbytek v analogu je Leu.
16. Způsob podle nároku 14, kde hydrofobní zbytek v analogu je vybrán ze skupiny sestávající z Ile, norleucinu, Met a omithinu.
17. Způsob podle nároku 14, kde analogem je SEQ ID NO: 3.
18. Způsob podle nároku 14, kde že analogem je SEQ ID NO: 4.
19. Lidský paratyroidní hormon hPTH a jeho farmaceuticky přijatelné soli mající řetězec aminokyselin:

R-NH-Rl-Val-Ser-Glu-IIe-Gln-Leu-R2-His Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-ArgV al-R8-Trp-Leu-R9-Rl O-Rl 1 -Leu-Rl 2-Asp-Y kde

R = vodík nebo jakákoliv lineární nebo rozvětvená alkylová, acylová nebo arylová , skupina,

R1 = Ser, Ala nebo Aib,

R2 = Met nebo přirozeně se vyskytující hydrofobní aminokyselina,

R3 = His nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R4 = Leu nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R5 = Asn nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R6 - Ser nebo ve vodě rozpustná aminokyselina,

R7 = Met nebo přirozeně se vyskytující hydrofobní aminokyselina,

R8 = Glu, Lys nebo Asp,

R9 - Cys, Glu nebo Om,

R10 = Arg, Lys, Om, Gin, Glu nebo Asp,

R11 = přirozeně.se vyskytující.hydrofobní nebo polární aminokyselina,.

R12 = Gin, Arg, Glu, Asp, Lys nebo Om,

X = OH, NH₂ a

Y = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-Hís-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-Phe-ValX, Val-His-Asn-Phe-Val-AIa-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X, cyklizované jako mezi jedním nebo dvěma páry aminokyselin 22 a 26, 26 a 30, 27 a 30 a 25 a 29, když R3 a R6 jsou

-Jrt «* · · · · · · · ·

JV ···»··» »··· •t« · * · · ·««« • | 9 9· · ···· * ··· ··· >·»·*· · * *··>·· ·· · ·· ·*

Lys, Om, Glu nebo Asp, s výjimkou cyklo(Lys²⁶-Asp³⁰)(Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-NH2, cyklo(Lys²⁷-Asp³⁰)-hPTH-(l-34)-NH2 acyklo(Lys²⁶-Asp³⁰)(Leu²⁷)-hPTH-(l-34)-OH.
20. Analog podle nároku 19, kde cyklizace má formu laktamu.
21. Analog podle nároku 20, kde laktam je i, i + 4 laktam.
22. Analog podle nároku 21, kde laktam je Glu²²-Lys²⁶ laktam.
23. Analog podle nároku 21, kde laktam je Lys²⁶-Asp³^ laktam.
24. Analog podle nároku 20, kdeR je HaXjeNH225. Analog podle nároku 24, kde Rl 1 je Lys nebo Leu.
26. Analog podle nároku 25, kde R2 a R7 jsou Met nebo Nle.
27. Analog podle nároku 26, kde Rl je Ser, R2 je Met, R7 je Met, R8 je Glu, R9 je Arg, R10 je Lys a R12 je Gin.
28. Analog podle nároku 27, kde R3 je His nebo Lys, R4 je Leu, Lys nebo Arg, R5 je Asn, Om, Hci, Asp, Arg, Lys, D-Lys, Ser nebo Gly a R6 je Ser, Lys Asp nebo Arg.
29. Analog podle nároku 27, kde R3-R6 jsou His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys nebo His-Leu-Lys-Ser.
30. Analog podle nároku 27, kde Y = X.
31. Analog podle nároku 27, kde Y = Val-X.
32. Analog podle nároku 27, kde Y = Val-Leu-Asn-Phe-X.
33. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 6.
34. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 7.
35. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 8.
36. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 9.
37. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 10.
38. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: II.
39. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 12.
40. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 13.
41. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 14.

·« *0 000. ·0 ·>

• 000 0 · Ů 0000

0 0 0 0 00« 0 00 ·

00 000 0 0000 0 000 00« 000 ··· · 0 • 00 0 00 0· · 0· ··
42. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 15.
43. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 16.
44. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 17.
45. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 18.
46. Analog podle nároku 19, kde má SEQ ID NO: 19.
47. Způsob screeningu peptidových konstruktů na osteogenicitu vyznačený tím, že (a) testovaná zvířata se anestetikují, (b) testovanému zvířeti se dá podkožní injekce účinná dávka kandidátního peptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli rozpuštěného ve farmaceuticky přijatelném rozpouštědle, (c) měření tepenného tlaku krve zvířete, kde malý pokles tlaku krve po krátké době ukazuje osteogenicitu peptidu.
48. Způsob podle nároku 47 vyznačený tím, že rozpouštědlem je okyselená solanka.
49. Způsob podle nároku 48 vyznačený tím, že rozpouštědlo obsahuje 0,0001 M HC1.
50. Způsob podle nároku 49 vyznačený tím, že testovaným zvířetem je krysa a pokles tlaku krve je 8,5 až 36,2 % při 2 až 19 minutách po injekci.
51. Způsob podle nároku 50 vyznačený tím, že peptidem je hPTH fragment, podle nároku 19.
52. Způsob podle nároku 51 vyznačený tím, že dávka hPTH je asi 0,8 nmol / 100 g tělesné hmotnosti.
53. Způsob podle nároku 52 vyznačený tím, že hPTH má SEQ ID NO: 3.
54. Způsob podle nároku 52 vyznačený tím, že hPTH má SEQ ID NO: 4.