JP4486258B2 - ヒト副甲状腺ホルモンの改変、調製および使用 - Google Patents
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Description
(発明の背景)
(連邦政府に支援された研究および開発の下でなされた発明に対する権利についての声明)
本発明の開発の間に実施された研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
この研究は、国立衛生研究所助成金DK1 1974によって支援された。
【0003】
(発明の分野)
本発明は、新規な副甲状腺ホルモンペプチド(PTH)誘導体に関する。特に、本発明は、1つ以上のアミノ酸置換を有するPTH誘導体に関し、この置換は、この誘導体に対するPTH−1レセプターアゴニスト特性またはPTH−1レセプターアンタゴニスト特性を与える。
【0004】
(関連技術の説明)
副甲状腺ホルモン(PTH)の複雑な生物学的役割の完全な理解およびその治療的潜在能力を利用するための試みは、このホルモンの作用の複数のシグナル伝達パターンおよび細胞性経路の解明を必要とする。PTHは、腎性標的細胞および骨性標的細胞中で特定のレセプターを結合および活性化し、この細胞はまた、PTH関連ペプチド(PTHrP)を認識する(Kronenberg,H.ら、「The PTH/PTHrP receptor:one receptorfor two ligands」、Genetics of Endocrine and Metabolic Disorders、Thakker,R.ら、Chapman & Hall、London(1997)389〜420頁)。腎性細胞株および骨性細胞株において、PTHは、いくつかの平行な細胞内シグナル伝達応答を誘発し、この応答は、アデニリルシクラーゼ(AC)、プロテインキナーゼA(PKA)、ホスホリパーゼC(PLC)およびプロテインキナーゼC(PKC)の活性化ならびにセカンドメッセンジャー(例えば、サイクリックAMP(cAMP)、イノシトール三リン酸(IP3)、ジアシルグリセロール、および増加された細胞質ゾルを含まないカルシウム(Cai ++))の生成を含む。
【0005】
【表1】
現在まで、実質的に関連するが別個である2つのPTHレセプターの種が、クローニングされている(Abou−Samra,A.B.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(7)2732〜2736(1992);Usdin,T.B.ら、J.Biol.Chem.270(26):15455〜15458(1995);Schipani,E.ら、Endocrinology−132(5):2157〜2165(1993))。これらのうちの第1(A型)は、異種1型PTH/PTHrPレセプター(本明細書中以後、PTH−1レセプター)を欠如する細胞中で非相同的に発現される場合に、骨細胞および腎細胞の両方から単離され、そしてPTH(1−34)またはPTHrP(1−36)に対する複数のシグナル伝達応答を伝達することが示された。
【0006】
【表2】
PTH分子の結合およびシグナル伝達特性に対するそのPTH分子の特定の領域の寄与を規定するための以前の試みは、主に、複雑なインビボバイオアッセイ、器官培養物、異種PTH−1レセプターの1つより多い型を発現し得る単離された細胞膜または細胞株(一般にげっ歯類起源)の使用によって行われてきた。
【0007】
【表3】
ウシPTH−(1−34)の初期の構造/機能研究は、単離された腎臓膜を用いて実施され、レセプター結合についてのカルボキシル(C)末端bPTH−(25−34)領域の重要な役割およびAC活性化についてのアミノ(N)末端(すなわち、Ser1)の重要な役割を同定した(Segre,G.V.ら、J.Biol.Chem.254:6980〜6986(1979);Tregear,G.W.およびPotts,J.T.,Jr.Endocr.Res.Commun.2:561〜567(1975))。以後の研究は、インタクトな尿細管を用いてかまたは培養された腎細胞もしくは骨細胞を用いて、インビトロで実施したが、しかし、N短縮型(N−transcated)アナログ(例えば、PTH−(3−34))は(ACを刺激し得ないにもかかわらず)、PKCを完全に活性化し得、そして特定のPKC依存性の遠い生物学的応答を調節し得ることを示した(Janulis,M.ら、Endocrinology 133:713〜719(1993);Siegfried,G.ら、Endocrinology 136(3):1267〜1275(1995);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53〜60(1992))。PTH(1−34)のアミノ短縮型アナログもまた、いくつかの細胞中でPLC活性またはCai ++を増加するが(Donahue,H.J.ら、J.Biol.Chem.263:13522〜13527(1988);Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032〜3039(1991);Siegfried,G.ら、Endocrinology 136(3):1267〜1275(1995))、他の細胞においては増加しないことが見出された(Reid,I.R.ら、Am.J.Physiol.253(1 Pt 1):E45〜51(1987);Tamura,T.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.159:1352〜1358(1989))。クローニングされたPTH−1レセプターのシグナル伝達特性の研究は、AC、PLCまたはCai ++の活性化に対してほぼ独占的に焦点を置かれてきたが(Abou−Samra,A.B.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(7)2732〜2736(1992);Bringhurst,F.R.ら、Endocrinology 132(5):2090〜2098(1993);Guo,J.ら、Endocrinology 136(9)3884〜3891(1995);Pines,M.ら、Bone 18(4):381〜389(1996);Jobert,A.−S.ら、Endocrinology 138(12):5282〜5292(1997);Schneider,H.ら、Eur.J.Pharm.246(2):149〜155(1993))、hPTH(1−34)、hPTH−(3−34)および他のhPTHフラグメントによるPKCの刺激およびPKC依存性イオン輸送の刺激は、ラットPTH−1レセプターcDNAを用いてトランスフェクトされたCHO細胞において報告された(Azarani,A.ら、J.Biol.Chem.271(25):14931〜14936(1996))。
【0008】
まとめると、これらの観察は、AC/PKAシグナル伝達の活性化についての構造決定因子は、PLCまたはPKCの活性化について必要とされる決定因子とは異なり、そしてこれらが、それぞれ、PTH−(1ー34)のN末端ドメインおよびC末端ドメインに存在するという概念を生じてきた(Jouishomme,H.ら、J.Bone Miner.Res.9(6):943〜949(1994);Tregear,G.W.およびPotts,J.T.,Jr.Endocr.Res.Commun.2:561〜567(1975);Whitfield,J.F.およびMorley,P.Trends Pharm.Sci.16(11):382〜386(1995))。特に、領域hPTH−(29−32)は、重要なPKC活性化ドメインとして具体的に同定された(Jouishomme,H.ら、J.Bone Miner.Res.9(6):943〜949(1994);Whitfield,J.F.およびMorley,P.Trends Pharm.Sci.16(11):382〜386(1995)。
【0009】
ラットPTH−1レセプターのこれらの研究から公知であるものと比較して、ヒトPTH−1レセプターに対する結合またはヒトPTH−1レセプターの種々のシグナル伝達様式の活性化に必要な、ヒトPTHの構造的特徴に関して利用可能である情報は、ほとんどない。アラニンスキャニング変異誘発は、ラットPTH−1レセプターに対する結合についてhPTH−(1−34)のC末端部分の重要性を強調させた(30)。COS−7細胞またはHEK293細胞中にトランスフェクトされたヒトPTHレセプターの機能的研究は、hPTH−(1−34)がACおよびCai ++を活性化するが、PLCの刺激は一貫して観察されず、そして報告された応答が適度であったことを、確認した(Pines,M.ら、Bone 18(4):381〜389 (1996);Seuwen,K.ら、Brit.J.Pharm.114(8):1613〜1620(1995);Jobert,A.−S.ら、Endocrinology 138(12):5282〜5292(1997);Schneider,H.ら、FEBS Lett.351(2):281〜285(1994);)。Cai ++に対するhPTH−(3−34)の効果は、同様に議論の余地があるが(Pines,M.ら、Bone 18(4):381〜389 (1996);Jobert,A.−S.ら、Endocrinology 138(12):5282〜5292(1997))、一方、ヒトPTH−1レセプターを介するシグナル伝達におけるhPTH−(1−34)分子の他の領域の役割は、全体的に検討されていない。合成のhPTH−1(1−30)NH2、hPTH−1(1−29)NH2、hPTH−1(1−28)NH2、hPTH−1(1−27)NH2、およびhPTH−1(1−26)NH2は、各々、骨芽細胞様ROS17/2細胞における膜結合PKCの活性を刺激し得なかった(Neugebauerら(Biochem 34:8835〜8842(1995))。
【0010】
(発明の要旨)
比較的大きなサイズのネイティブなPTHは、これらのペプチドの骨粗しょう症の治療としての使用に対する難問を提示する。一般に、このサイズのタンパク質は、薬物としての使用に適切ではない。なぜなら、このタンパク質は、鼻吸入のような単純な方法によって有効に送達され得ないからである。その代わり、注射が必要とされ、そしてPTHの場合、骨形成速度の増加を達成するためには、毎日またはほぼ毎日の注射が必要とされる可能性が最も高い。さらに、より大きなペプチドは、従来の合成化学方法によって調製することが技術的に困難でかつ高価である。組換えDNAおよび細胞に基づく発現系を用いる代替方法もまた、高価であり、外来タンパク質によって潜在的に汚染され易く、そして送達の問題を回避しない。
【0011】
従って、当業者は、より大きなペプチドに基づき、なお依然として所望の生物学的活性を保持する低分子アナログ(ペプチド性または非ペプチド性のいずれか)を同定し得ることが有利である。この活性は最初は、インタクトなペプチドと比較して弱いかもしれないが、さらなる最適化によって増強された効力および効能となり得る。
【0012】
本発明者らは近年、充分なACアゴニストであるが、げっ歯類PTH−1レセプターを介してPKCを活性化し得ないことが他者によって示された(Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992))hPTH−(1−31)が、LLC−PKI細胞、COS−7細胞またはHEK 293細胞において発現されたヒトPTH−1レセプターを介してACおよびPLCの両方を活性化する際にhPTH−(1−34)と同等に強力であることを観察した(Takasu,H.およびBringhurst,F.R.,Endocrinology 139(10):4293−4299(1998))。これらの予期せぬ観察は、本発明者らが、PLC活性化に特に焦点をあてて、ヒトPTH−1レセプターへの結合およびこのレセプターの活性化におけるhPTH−(1−34)のN末端領域およびC末端領域の相対的役割のより詳細な分析を行うのを促した。本発明は、PTH−1レセプターを介したホスホリパーゼCシグナル伝達を選択的に変更する、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ/カルボキシ末端改変物に関する。この予期せぬ知見は、シグナル特異的PTHリガンドの設計に対して重要な意味を有する。このようなシグナル特異的リガンドは、所望のサブセットのPTH作用のみを誘発する際に有用であり、それゆえ、シグナル特異的リガンドは、完全なセットのPTH作用によっては適合されない固有の利点を有し得る。
【0013】
本発明は、PTH(1−28)ペプチドおよびその誘導体に関する。PTH(1−28)ペプチド、そのフラグメント、その誘導体、薬学的に受容可能なその塩、およびそのN誘導体またはC誘導体を含む、本発明の化合物は、本明細書中で集合的に「配列番号(SEQ ID NO)1の化合物およびその誘導体」と呼ばれる。
【0014】
本発明は、PTH(1−28)の合成および/または組換えの生物学的に活性なペプチド誘導体を提供する。1つの特定の実施形態では、本発明は、本質的に以下の式:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26もしくは1〜27を含むそのフラグメント;
(c)薬学的に受容可能なその塩;または
(d)そのN誘導体もしくはC誘導体;
からなるペプチドと少なくとも90%同一の、生物学的に活性なペプチドを提供し、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgであるが、但し、上記のペプチドは、hPTH(1−26)NH2、hPTH(1−27)NH2またはhPTH(1−28)NH2ではない。
【0015】
なおさらなる局面によれば、本発明はまた、以下:
(a)式:
X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1)から本質的になるペプチドに少なくとも90%同一な生物学的に活性なペプチド;
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26もしくは1〜27を含むそのフラグメント;
(c)薬学的に受容可能なその塩;または
(d)そのN誘導体もしくはC誘導体;
および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供し、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgである。
【0016】
なおさらなる局面によれば、本発明は、以下:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26または1〜27を含むそのフラグメント;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドをコードするポリヌクレオチドから本質的になる核酸分子を提供し、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgである。
【0017】
なおさらなる局面によれば、本発明は、以下を含む組換えDNA分子を提供する:(1)発現制御領域、この領域は、(2)生物学的に活性なペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、と作動可能に連結されており、ここでこのペプチドは、以下:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26または1〜27を含むそのフラグメント;
からなる群より選択され、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgである。
【0018】
なおさらなる局面によれば、本発明は、骨質量の減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を処置するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする被験体に、骨質量を増大するに有効な量の生物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を含み、ここでこのペプチドは、以下:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26もしくは1〜27を含むそのフラグメント;
(c)薬学的に受容可能なその塩;または
(d)そのN誘導体もしくはC誘導体;
から本質的になる群より選択されるメンバーに少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgであるが、但し、このペプチドは、hPTH(1−26)NH2、hPTH(1−27)NH2、またはhPTH(1−28)NH2ではない。
【0019】
なおさらなる局面によれば、PTH−1/PTH−2レセプターの変化したかまたは過剰な作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供され、この方法は、この患者のPTH−1/PTH−2レセプターの活性化を阻害するに充分な治療有効量の生物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを患者に投与する工程を含み、ここで、このペプチドは、以下:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26もしくは1〜27を含むそのフラグメント;
(c)薬学的に受容可能なその塩;または
(d)そのN誘導体もしくはC誘導体;
から本質的になる群より選択されるメンバーに少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02はGluまたはArgであるが、但し、このペプチドは、hPTH(126)NH2、hPTH(1−27)NH2またはhPTH(1−28)NH2ではない。
【0020】
なおさらなる局面によれば、本発明はまた、骨形成、骨再吸収および/または骨リモデリングの速度を決定する方法を提供し、この方法は、有効量の配列番号1の標識ペプチドまたはその誘導体を患者に投与する工程、およびこの患者の骨へのこのペプチドの取り込みを決定する工程を含む。このペプチドは、以下からなる群より選択される標識を用いて標識され得る:放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識。適切な放射性標識の例は、99mTcである。
【0021】
本発明のなおさらなる局面によれば、(当業者に公知の、そして以下で考察されるアッセイによって決定した場合)PTH−1/PTH−2レセプターをアゴナイズする(agonize)PTH(1−28)ペプチドアナログの生物学的活性を破壊しない、1〜28位での任意のアミノ酸置換、より具体的にはアミノ酸1位および/または19位でのアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【0022】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
(定義)
以下の説明では、組換えDNA技術およびペプチド合成において用いられる多数の用語は、広範囲に利用される。このような用語が与えられるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【0023】
クローニングベクター:宿主細胞中で自律複製し得、そしてそのDNA配列がベクターの本質的な生物学的機能の喪失を伴わずに決定可能な様式で切断され得る1または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、そしてその中にDNAフラグメントがスプライスされてその複製およびクローニングをもたらし得る、プラスミドまたはファージのDNAまたは他のDNA配列。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に用いられるのに適切なマーカーをさらに含み得る。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する。
【0024】
発現ベクター:クローニングベクターと類似であるが、宿主中に形質転換された後にこのベクターの中にクローニングされた遺伝子の発現を増強し得る、ベクター。クローニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列のような、特定の制御配列の制御下に配置される(すなわち、作動可能に連結される)。プロモーター配列は、構成性または誘導性のいずれかであり得る。
【0025】
組換え宿主:本発明によれば、組換え宿主は、発現ベクターまたはクローニングベクターに所望のクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞であり得る。この用語はまた、その生物の染色体またはゲノムに所望の遺伝子を含むように遺伝子操作された原核生物細胞または真核生物細胞を含むことを意味する。このような宿主の例については、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)を参照のこと。好ましい組換え宿主は、本発明のDNA構築物で形質転換された真核生物細胞である。より詳細には、哺乳動物細胞が好ましい。
【0026】
プロモーター:一般に、開始コドンに近位に配置された、遺伝子の5’領域として記載されるDNA配列。隣接遺伝子の転写は、プロモーター領域で開始される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導因子に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写速度は、誘導因子によって調節されない。プロモーターの例としては、CMVプロモーター(InVitrogen,San Diego,CA)、SV40プロモーター、MMTVプロモーターおよびhMTIIaプロモーター(米国特許第5,457,034号)、HSV−1 4/5プロモーター(米国特許第5,501,979号)、ならびに前初期HCMVプロモーター(WO92/17581)が挙げられる。また、組織特異的エンハンサーエレメントが用いられ得る。さらに、このようなプロモーターは、ある生物の組織および細胞特異的プロモーターを含み得る。
【0027】
ポリヌクレオチド:この用語は一般に、改変されていないRNAもしくはDNAまたは改変されたRNAもしくはDNAであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド(polydeoxribonucleotide)をいう。「ポリヌクレオチド」としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるDNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNA、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、一本鎖であり得るか、より代表的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得る、DNAとRNAとを含むハイブリッド分子。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAとの両方を含む三本鎖領域をいう。用語ポリヌクレオチドはまた、1以上の改変された塩基を含むDNAまたはRNA、ならびに安定性または他の目的のために改変された骨格を有するDNAまたはRNAを含む。「改変された」塩基としては例えば、トリチル化された塩基および異常な塩基(例えば、イノシン)が挙げられる。種々の改変がDNAおよびRNAに行われている;従って、「ポリヌクレオチド」は、代表的は天然に見出されるような、化学的、酵素的または代謝敵に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特有の化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしば、オリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドを含む。
【0028】
ポリペプチド:この用語は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに連結された2以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質(すなわち、ペプチド同配体)をいう。「ポリペプチド」とは、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質と呼ばれる、より長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされる20個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」としては、天然のプロセス(例えば、翻訳後プロセシング)または当該分野で周知である化学修飾技術のいずれかによって改変されたアミノ酸配列が挙げられる。このような改変は、基本書およびより詳述される研究論文、ならびに研究文献に充分に記載されている。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド中のどこかで生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが認識される。また、所定のポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。例えば、Proteins−Structure and Molecular Properties、第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993およびWold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects,1−12頁,Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson編,Academic Press,New York,1983;Seifterら,「Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors」,Methods in Enzymol.182:626−646(1990)およびRattanら,「Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging」,Ann NY Acad Sci 663:48−62(1992)を参照のこと。
【0029】
相同/非相同:2つの核酸分子は、それらのヌクレオチド配列が、HASHコードアルゴリズム(Wilber,W.J.およびLipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.80:726−730(1983))によって決定したときに40%を超える類似性を共有する場合、「相同」であるとみなされる。2つの核酸分子は、それらのヌクレオチド配列が、40%未満の類似性を共有する場合、「非相同」であるとみなされる。
【0030】
単離された:天然の状態から「ヒトの手によって」変更されたことを意味する用語。組成物または物質が天然に存在する場合、単離された形態は、その本来の環境から変更されているか、もしくは取り出されているか、またはその両方である。例えば、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ていないが、この用語が本明細書中で使用されるように、天然の状態で共存している物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ている。従って、組換え宿主細胞中で産生されたおよび/または組換え宿主細胞中に含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」として意図されるのはまた、組換え宿主細胞から、または天然の供給源から、部分的にまたは実質的に精製されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、組換え的に産生されたバージョンの配列番号1の化合物およびその誘導体は、SmithおよびJohnson、Gene 67:31〜40(1988)に記載される1工程法によって実質的に精製され得る。
【0031】
同一性:この用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度をいう。一般的に、最大の順序の一致が得られるように、配列は整列される。「同一性」自体は、当該分野で認識される意味を有し、そして公開された技術を使用して算出され得る。(例えば、Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、Oxford University Press、New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、Academic Press、New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,第I部,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press、1987;ならびにSequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M Stockton Press、New York,1991を参照のこと)。2つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である(Carillo,H.およびLipton,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために通常使用される方法は、以下に開示される方法を含むが、これらに限定されない:Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop編、Academic Press、San Diego,1994、ならびにCarillo,H.およびLipton,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988)。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータプログラムに体系化されている。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(i):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.ら、J Molec Biol 215:403(1990))を含むが、これに限定されない。
【0032】
フラグメント:分子(例えば、配列番号1の化合物またはその誘導体)の「フラグメント」は、これら分子の任意のポリペプチドサブセットを言及することを意味する。
【0033】
機能的誘導体:用語「誘導体」は、分子の「改変体」、その「誘導体」または「化学的誘導体」含むことを意図する。分子(例えば、配列番号1の化合物、またはその誘導体)の「改変体」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子を言及することを意味する。分子(例えば、配列番号1の化合物またはその誘導体)の「アナログ」は、配列番号1の分子、またはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然の分子を言及することを意味する。
【0034】
両分子におけるアミノ酸の配列が実質的に同じである場合、および両分子が類似の生物学的活性を保有する場合、ある分子は別の分子に対して「実質的に類似」であると言われる。従って、2つの分子が類似の活性を保有するとすれば、その用語は本明細書中では、一方の分子が他方では見出されないさらなるアミノ酸残基を含む場合、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でさえ使用されるので、それらは改変体、誘導体、またはアナログであるとみなされる。
【0035】
本明細書中で使用される場合、ある分子が通常はその分子の一部でないさらなる化学的部分を含むとき、その分子は、別の分子の「化学的誘導体」であると言われる。そのような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいはその部分は、その分子の毒性を減少させ得るが、その分子の任意の所望しない副作用などを除去または弱毒化し得るなどである。そのような影響を媒介し得る部分の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)に開示され、そして当業者に明らかである。
【0036】
タンパク質の生物学的活性:この表現は、類似の活性、または改善された活性または所望しない副作用が減少した活性を含む、配列番号1の化合物またはその誘導体の代謝的または生理学的な機能をいう。上記の配列番号1の化合物またはその誘導体の抗原活性および免疫原活性もまた含まれる。
【0037】
遺伝子治療:生物の遺伝子発現の正常なパターンを変化させることに関する治療手段。一般的に、組み換えポリヌクレオチドは、生体の細胞中または組織中に導入され、遺伝子発現に変化をもたらす。
【0038】
宿主動物:生殖細胞および体細胞の全てが、本発明のDNA構築物を含む、トランスジェニック動物。そのようなトランスジェニック動物は、一般的に脊椎動物である。好ましい宿主動物は、哺乳動物である(例えば、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、モルモット、げっ歯類(例えば、ラット)など)。用語、宿主動物はまた、胚の段階および胎児の段階を含む、発生の全ての段階における動物を含む。
【0039】
(I.配列番号1の化合物およびその誘導体−−構造的特性および機能的特性)
副甲状腺ホルモン(PTH)およびPTH関連ペプチド(PTHrP)は、PTH/PTHrPレセプターを活性化して、アデニリルシクラーゼ(AC)およびホスホリパーゼC(PLC)における並行的増加を誘発する。PTH−(1−34)のアミノ(N)末端領域は、AC活性化において必須である。PLC、PKCおよび他のエフェクターの活性化に必要なリガンドドメインは、あまり十分には定義されていないが、げっ歯類系におけるいくつかの研究では、PKC活性化に関与するコア領域(PTH−(29−32))が同定されている。PLC活性化における重要なリガンドドメインを決定するために、トランスフェクトされた大量のヒトPTH/PTHrPレセプターまたはラットPTH/PTHrPレセプターを安定に発現するLLC−PKI細胞を使用して、一連の短縮型hPTH−(1−34)アナログが評価された。
【0040】
ホスホリパーゼCシグナル伝達およびリガンド結合親和性は、hPTH−(1−34)のカルボキシル(C)末端短縮化により減少したが、ACおよびPLCの両方を完全に活性化し得る最も短いhPTHペプチドであるhPTH−(1−28)中に結合増強置換(Glu19→Arg19)を、配置した場合、協調的に回復した。ホスホリパーゼACではなく、ホスホリパーゼCの活性は、hPTH−(1−34)においてGly1でSer1を置換することによって減少し、そして残基1またはαアミノ基のいずれかを単独で除去することによって消去された。これらの変化は結合親和性を変化させなかった。これらの知見は顕著にシグナル選択性であり、PLC活性はないが全てのAC活性を有する、アナログ[Gly1,Arg19] hPTH−(1−28)の設計を導いた。従って、hPTHの最N末端は、PLCと連結するための活性化ドメインの一部を構成する。C末端領域(特にhPTH−(28−31))は、結合への影響を通してPLC活性化に寄与する:領域hPTH−(29−34)は全てのPLC活性化にとって明らかに必要ではない。hPTH−(1−34)におけるAC活性化およびPLC活性化のN末端決定基は、この領域におけるわずかな改変が、これら2つのエフェクターの活性化を分離し得るので、重複しているが同一ではない。特に、[Gly1,Arg19] hPTH−(1−28)アナログは、PTHのPLC依存性作用からAC依存性作用を分離するのに有用である。
【0041】
本発明は、hPTH(1−28)ペプチドおよびその誘導体に関する。hPTH(1−28)ペプチド、そのフラグメント、その誘導体、その薬学的に受容可能な塩類、およびそのN誘導体またはC誘導体を含む本発明の化合物は、「配列番号1の化合物およびその誘導体」として、本明細書中で以下に集団的に言及される。
【0042】
詳細には、本発明は、hPTH(1−28)の合成および/または組換えの、生物学的に活性なペプチド誘導体を提供する。1つの特定の実施形態において、本発明は、以下の式から本質的になるペプチドに対して、少なくとも90%同一の生物学的に活性なペプチドを提供する:
(a)X01ValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetX02ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号1);
(b)アミノ酸1〜24、1〜25、1〜26、または1〜27を含むそのフラグメント;
(c)その薬学的に受容可能な塩;または
(d)そのN誘導体またはC誘導体;
ここでは:
X01はSer、AlaまたはGlyであり;そして
X02はGluまたはArgであるが、
ただし、上記のペプチドは、hPTH(1〜26)NH2、hPTH(1−27)NH2またはhPTH(1−28)NH2ではない。
【0043】
従って、本発明は、強力で小さなシグナル選択性PTH−1/PTH−2レセプターアゴニストである新規のhPTH(1−28)誘導体を提供する。好ましい実施形態において、hPTH(1−28)誘導体は、残基1および19で変更されている。最も好ましくは、本発明は、hPTH(1−28)の1位でのセリンについてアラニンまたはグリシンのアミノ酸置換、およびhPTH(1−28)の19位でのグルタミンについてアルギニンのアミノ酸置換を有するhPTH(1−28)誘導体を含む。
【0044】
さらに、hPTH(1−28)誘導体が、(当業者に公知のアッセイおよび以下で議論されるアッセイによって決定される場合、)PTH−1/PTH−2レセプターをアゴナイズ(agonize)またはアンタゴナイズ(antagonize)する能力を破壊しない天然の任意の他のアミノ酸置換もまた本発明の範囲内に含まれる。
【0045】
タンパク質の産物として、本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体は、液相ペプチド合成技術または固相ペプチド合成技術によって産生される。特に、固相ペプチド合成技術は、ヒトPTHの産生において首尾よく適用され、そして本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体の産生のために使用され得る(ガイダンスについては、Kimuraら、前出を参照のこと、およびFairwellら、Biochem.22:2691(1983)を参照のこと)。比較的大規模でヒトPTHを産生することの成功は、本明細書中で参考文献として援用されるGoudら、J.Bone Min.Res.6(8):781(1991)により報告されている。合成的ペプチド合成アプローチは、一般的に、自動化合成機および固相としての適切な樹脂の使用を伴い、その樹脂に所望の配列番号1の化合物またはその誘導体のC末端アミノ酸が付着される。次いで、N末端方向におけるペプチドの伸長は、代表的には合成が完了するまで、FMOCまたはBOCのいずれかに基づく化学的プロトコルを使用して、適切に保護された形態の次の所望のアミノ酸を首尾よく連結することによって達成される。次いで保護基は、通常、樹脂からのペプチドの切断と同時にペプチドから切断され、そして、次いでそのペプチドは、従来の技術を使用して(例えば、溶媒としてアセトニトリルを、およびイオン対剤としてトリフルオロ酢酸を用いた逆相HPLCによって)単離および精製される。そのような手順は一般的に、莫大な刊行物に記載され、例えば、StewartおよびYoung、「Solid Phase Peptide Synthesis」、第2版、Pierce Chemical Company,Rockford,IL(1984)に対する参照が行われ得る。ペプチド合成のアプローチは、遺伝子にコードされていないアミノ酸を取り込む、配列番号1の改変体およびその誘導体の改変体の産生のために必要とされることが認識される。
【0046】
本発明の別の局面に従って、置換基は、当該分野で公知の標準的な方法によって、配列番号1の化合物またはその誘導体のN末端アミノ酸の遊離のアミンに付着され得る。例えば、アルキル基(例えば、C1-12アルキル)を、還元的アルキル化を用いて付着させ得る。ヒドロキシアルキル基(例えば、C1-12ヒドロキシアルキル)もまた、還元的アルキル化を使用して付着させ得、ここで、遊離の水酸基はt−ブチルエステルで保護される。アシル基(例えば、COE1)を、遊離の酸(例えば、E1COOH)をN末端アミノ酸の遊離のアミノに連結することによって付着させ得る。依然として生物学的活性を保持する配列番号1の化合物またはその誘導体の、二次構造もしくは三次構造、または安定性を変更する、配列番号1の化合物およびその誘導体もまた、本発明の範囲内で意図される。そのような誘導体は、ラクタム環化、ジスルフィド結合、または当業者に公知の他の手段を通して達成され得る。
【0047】
本発明の最も好ましい実施形態の中には、PTH−1/PTH−2レセプターのシグナル選択的アゴニストとして働く化合物がある。特に、好ましい実施形態は、X01がGlyであり、そしてX02がArgである化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、GlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号2)またはその誘導体である。[[Gly1Arg19]hPTH(1−28)]。
【0048】
好ましい実施形態の別のセットは、配列番号2のカルボキシ末端に1つのアミノ酸欠失を有する化合物であり、ここで、X01はGlyであり;そしてX02はArgである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、GlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号3)またはその誘導体である。[[Gly1Arg19]hPTH(1−27)]。
【0049】
本発明の好ましい実施形態の中には、PTH−1/PTH−2レセプターの非シグナル選択的アゴニストとして働く化合物がある。特に、好ましい実施形態は、X01がAlaであり;そしてX02がArgである化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号4)またはその誘導体である。[[Ala1Arg19]hPTH(1−28)]。
【0050】
好ましい実施形態の別のセットは、配列番号4のカルボキシ末端に1つのアミノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、X01はAlaであり;そしてX02はArgである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号5)またはその誘導体である。[[Ala1Arg19]hPTH(1−27)]。
【0051】
好ましい実施形態の別のセットは、X01がSerであり;そしてX02がArgである化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、SerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号6)またはその誘導体である。[[Arg19]hPTH(1−28)]。
【0052】
好ましい実施形態の別のセットは、配列番号6のカルボキシ末端に1つのアミノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、X01はSerであり;そしてX02はArgである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、SerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetArgArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号7)またはその誘導体である。[[Arg19]hPTH(1−27)]。
【0053】
好ましい実施形態の別のセットは、X01がAlaであり;そしてX02がGluである化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号8)またはその誘導体である。[[Ala1]hPTH(1−28)]。
【0054】
好ましい実施形態の別のセットは、配列番号8のカルボキシ末端に1つのアミノ酸欠失を有する化合物であり、ここで、X01はAlaであり;そしてX02はGluである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、AlaValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号9)またはその誘導体である。[[Ala1]hPTH(1−27)]。
【0055】
好ましい実施形態の別のセットは、X01がGlyであり;そしてX02がGluである化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、GlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号10)またはその誘導体である。[[Gly1]hPTH(1−28)]。
【0056】
好ましい実施形態の別のセットは、配列番号10のカルボキシ末端に1つのアミノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、X01はGlyであり;そしてX02はGluである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、GlyValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号11)またはその誘導体である。[[Gly1]hPTH(1−27)]。
【0057】
好ましい実施形態の別のセットは、X01がSerであり;そしてX02がGluである薬学的組成物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、SerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeu(配列番号12)またはその誘導体である。[hPTH(1−28)]。
【0058】
好ましい実施形態の別のセットは、X01がSerであり;そしてX02がGluである薬学的組成物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、SerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLys(配列番号13)またはその誘導体である。[hPTH(1−27)]。
【0059】
(III.ベクター、宿主細胞および組換え体の発現)
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび本発明のベクターで遺伝子操作されている宿主細胞ならびに組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。無細胞翻訳系はまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用してそのようなタンパク質を産生するために使用され得る。
【0060】
組換え産生については、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドについて発現系またはその部分を取り込むように遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、衝撃導入(ballistic introduction)または感染のような、多くの標準実験室マニュアル(例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology(1986)およびSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))に記載の方法によって達成され得る。
【0061】
適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞(例えば、streptococci、staphylococci、E.coli、StreptomycesおよびBacillus subtilis細胞);真菌細胞(例えば、酵母細胞およびAspergillus細胞);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2細胞およびSpondoptera Sf9細胞);動物細胞(例えば、CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびBowesメラノーマ細胞)ならびに植物細胞が挙げられる。
【0062】
極めて多様な発現系が使用され得る。そのような系としては、とりわけ、染色体性の系、エピソーム性の系およびウイルス由来の系(例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレメント由来のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、ウイルス(例えば、バキュロウイルス、パポーバウイルス(例えば、SV40)、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス由来のベクター、ならびにそれらの組合わせに由来するベクター(例えば、プラスミドの遺伝的エレメントとバクテリオファージの遺伝的エレメントに由来するベクター(例えば、コスミドおよびファージミド))が挙げられる。発現系は、発現を調節および発生させる制御領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持、繁殖または発現するのに適している任意の系またはベクターが使用され得る。適切なヌクレオチド配列は、任意の多様な周知の、および慣用的な技術(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(前出)に示される技術など)によって発現系中に挿入され得る。
【0063】
RNAベクターはまた、本発明に開示される配列番号1の化合物またはその誘導体をコードする核酸の発現のために利用され得る。これらのベクターは、広範な多様性の真核生物細胞において天然に複製する、+鎖RNAウイルスまたは−鎖RNAウイルスに基づいている(Bredenbeek,P.J.およびRice,C.M.,Virology 3:297〜310、1992)。レトロウイルスとは異なり、これらのウイルスは、中間のDNA生活環相を欠失し、全体的にRNA形態で存在する。例えば、αウイルスは、広い範囲の宿主細胞において利用され得、そして高レベルの発現を提供するので、外来タンパク質の発現ベクターとして使用される;この型のウイルスの例としては、シンドビスウイルス(Sindbis virus)およびセムリキ森林ウイルスが含まれる(Schlesinger,S.,TIBTECH 11:18〜22、1993;Frolov,I.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93:11371〜11377,1996)が挙げられる。InvitrogenのSinbis発現系により例示されるように研究者は、実験室において組換え分子をDNA形態(pSinrep5プラスミド)で簡便に維持し得るが、RNA形態での繁殖もまた実施可能である。発現に使用される宿主細胞では、目的の遺伝子を含むベクターは、完全にRNA形態で存在し、そして所望の場合はその状態で継続的に繁殖され得る。
【0064】
小胞体の内腔への、ペリプラズム空間への、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌について、適切な分泌シグナルが、所望のポリペプチドに組み込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得、またはこれらのシグナルは、異種シグナルであり得る。
【0065】
DNA配列の発現は、転写調節情報および翻訳調節情報を含むDNA配列に「作動可能に連結した」DNA配列を必要とする。作動可能な連結は、制御DNA配列または調節DNA配列、および発現されることが求められるDNA配列が、遺伝子発現を可能にするような方法で結合した連結である。遺伝子発現に必要とされる「制御領域」の正確な性質は、生物体間で変化し得るが、一般に、原核生物細胞において、プロモーター(RNAの転写の開始を指向する)、ならびにDNA配列(RNAに転写されるときに、タンパク質合成の開始をシグナル伝達する)の両方を含むプロモーター領域を含むはずである。真核生物細胞における調節領域は、一般に、RNA合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む。
【0066】
2つのDNA配列が、2つのDNA配列間の連結の性質が以下の場合に、作動可能に連結すると言われている。(1)この性質が、フレームシフト変異の導入の結果ではないこと、(2)この性質が、プロモーター領域の配列が融合タンパク質コード配列の転写を指向する能力を妨げないこと、または(3)この性質が、融合タンパク質コード配列がプロモーター領域配列によって転写される能力を妨げないこと。従って、プロモーター領域が、このDNA配列を転写し得る場合に、プロモーター領域は、DNA配列に作動可能に連結する。
【0067】
本発明の発現ベクターを産生するために、種々のDNAフラグメントの接合が、従来技術(連結のための平滑末端化された末端、または付着末端化された末端の利用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合の付着末端の充填、所望されない接合を避けるためのアルカリおよびホスファターゼ処理、および適切なリガーゼを用いた連結)に従って、行われる。融合タンパク質の場合においては、遺伝的構築物が、融合タンパク質の5’遺伝子配列へ作動可能に連結した誘導性のプロモーターをコードし、融合タンパク質の効率的な発現を可能にする。
【0068】
原核生物細胞において(例えば、E.coli、B.subtilis、Pseudomonas、Streptomycesなどのようなものにおいて)、配列番号1の化合物、またはその誘導体を発現するために、機能的な原核生物プロモーターに対して配列番号1をコードするDNA配列に作動可能に連結することが必要である。このようなプロモーターは、構成的、またはより好ましくは、調節可能的(すなわち、誘導性、または抑制性)のどちらかであり得る。構成的なプロモーターの例としては、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpBR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターなどが挙げられる。誘導性の原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージλの主要右プロモーターおよび主要左プロモーター(PLおよびPR)、E.coliのtrpプロモーター、E.coliのrecAプロモーター、E.coliのlacZプロモーター、E.coliのlacIプロモーターおよびE.coliのgalプロモーター、B.subtilisのα−アミラーゼ特異的プロモーター(Ulmanen,Iら、J.Bacteriol.162:176−182(1985))およびB.subtilisのσ−28特異的プロモーター(Gilman,M.Z.ら、Gene 32:11−20(1984))、Bacilliusのバクテリオファージのプロモーター(Gryczan,T.J. The Molecular Biology of the Bacilli、Academic Press,Inc.、NY(1982))、ならびにStreptomycesプロモーター(Ward,J.M.ら、Mol.Gen.Genet.203:468−478(1986))が挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick,B.R.、J.Ind.Microbiol.1:277−282(1987);Cenatiempo,Y.、Biochimie 68:505−516(1986);およびGottesman,S.、Ann.Rev.Genet.18:415−442(1984)によって概説されている。
【0069】
発現が、真核生物細胞(例えば、酵母、真菌類、哺乳動物細胞または植物細胞)において所望される場合、このような真核生物宿主における転写を指向し得るプロモーターを利用することが必要である。好ましい真核生物プロモーターとしては、マウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer,D.ら、J.Mol.Appl.Gen.1:273−288(1982));ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,S.、Cell 31:355−365(1982));SV40初期プロモーター(Benoist,C.ら、Nature(London) 290:304−310(1981));および酵母のgal4遺伝子プロモーター(Johnston,S.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 79:6971−6975(1982));Silver,P.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:5951−5955(1984))が挙げられる。
【0070】
好ましくは、導入されたDNA配列は、レシピエント宿主において自律複製し得るプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。任意の広範な種々のベクターが、この目的のために利用され得る。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択における重要性の因子としては、以下が挙げられる:ベクターを含むこれらのレシピエント細胞が認識され得、そしてベクターを含まないこれらのレシピエント細胞から選択され得ることが容易であること;特定の宿主において所望されるベクターのコピーの数;および異なる種の宿主細胞間のベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か。
【0071】
好ましい原核生物ベクターとしては、E.coliにおいて複製し得るようなプラスミド(例えば、pBR322、ColEl、pSC101、pACYC 184、πVX)が挙げられるが、これらには限定されない。このようなプラスミドは、例えば、Maniatis,T.ら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY(1982)によって開示される。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、Gardellaら、J.Biol.Chem.265:15854−15859(1989)において記載されるpGFP−1プラスミド、または、StudierおよびDunn、Methods in Enzymology 185:60−89(1990)によって記載される、pETベクターの1つに基づいた改変されたプラスミドが挙げられる。Bacillusプラスミドとしては、pC194、pC221、pT127などが挙げられる。このようなプラスミドは、Gryczan,T.、The Molecular Biology of the Bacilli、Academic Press、NY 307−329頁(1982)によって開示される。適切なStreptomycesプラスミドとしては、pIJIOI(Kendall,K.J.ら、J.Bacteriol. 169:4177−4183(1987))およびφC31のようなストレプトミセスバクテリオファージ(Chater,K.F.ら、Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology、Akademiai Kaido、Budapest、Hungary、45−54頁(1986))が挙げられる。シュードモナスプラスミドは、John,J.F.ら、Rev.Infect.Dis.8:693−704(1986)、およびIzaki,K.,Jon.J.Bacteriol.33:729−742(1978)によって概説される。
【0072】
好ましい真核生物発現ベクターとしては、BPV、ワクシニア、2−ミクロン環(2−micron circle)などが挙げられるが、これらには限定されない。このような発現ベクターは当該分野において周知である(Botstein,D.ら、Miami Wntr.Symp.19:265−274(1982);Broach,J.R.、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY 445−470頁(1981);Broach,J.R.、Cell 28:203−204(1982);Bollon,D.P.ら、J.Clin.Hematol.Oncol.10:39−48(1980);Maniatis,T.、Cell Biology:A Comprehensive Treatise、第3巻、Gene Expression、Academic Press、NY、563−608頁(1980))。
【0073】
微生物に加えて、多細胞生物体由来の細胞の培養物もまた、宿主として用いられ得る。原則として、任意のこのような細胞培養物は、脊椎動物細胞源でも無脊椎動物細胞源由来でも、実行可能である。しかし、興味は、脊椎動物源由来の細胞に対して、より大きくなっている。有用な脊椎動物宿主細胞株の例としては、VERO細胞およびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、WI38細胞株、BHK細胞株、COS−7細胞株ならびにMDCK細胞株が挙げられる。このような細胞についての発現ベクターとしては、通常、(必要ならば)複製起点、発現されるべき遺伝子に対して前方または上流に位置するプロモーター、任意の必要なリボソーム結合部位に加えて、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列が挙げられる。
【0074】
哺乳動物細胞の使用については、発現ベクター上での制御機能が、しばしば、ウイルス物質によって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、シミアンウイルス40(SV40)およびサイトメガロウイルス由来である。SV40ウイルスの初期プロモーターおよびSV40ウイルスの後期プロモーターは、特に有用であり、なぜなら、両方のプロモーターが、SV40ウイルスの複製起源もまた含むフラグメントとして、ウイルスから容易に得られるからである(Fiersら、Nature 273:113(1978))。
【0075】
複製起点は、例えば、SV40ウイルス源または他のウイルス源(例えば、ポリオーマ源、アデノ源、VSV源、BPV源)由来であり得る、外因性起点を含むためのベクターの構築によっていずれかを提供され得るか、あるいは、宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供され得る。ベクターが、宿主細胞染色体に組み込まれる場合には、後者がしばしば十分である。
【0076】
手強い細胞膜バリアを含まない細胞が宿主細胞として用いられる場合、トランスフェクションは、GrahamおよびVan der Erb、Virology 52:546(1978)によって記載されるような、リン酸カルシウム沈殿法によって行われる。しかし、例えば、核インジェクションによって、またはプロトプラスト融合によって、DNAを細胞へ導入するための他の方法もまた、用いられ得る。遺伝子治療の場合においては、トランスフェクション促進剤(例えば、これに限定されないが、リポソーム)を伴っても伴わなくても、直接裸のプラスミドまたはウイルスDNAインジェクション方法は、哺乳動物細胞のインビボまたはインビトロでのトランスフェクションの、現在の方法に対する代替のアプローチを提供する。原核生物細胞、または実質的な細胞壁構築物を含む細胞が用いられる場合、トランスフェクションの好ましい方法は、Cohenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110(1972)において記載されるように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【0077】
(IV. 配列番号1の化合物またはその誘導体の投与および治療的有用性)
((A) 配列番号1の化合物またはその誘導体の投与)
一般に、本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体、あるいはその塩を、1日あたり約0.01μg/kg体重と1μg/kg体重の間の量で、好ましくは、1日あたり約0.07μg/kg体重〜0.2μg/kg体重の量で投与する。50kgのヒト女性被験体について、生物学的に活性な配列番号1の化合物またはその誘導体の日用量は、約0.5μg〜約50μg、好ましくは、約3.5μg〜約10μgである。他の哺乳動物、例えば、ウマ、イヌおよびウシにおいては、より高い用量が、必要とされ得る。この投薬量は、最も効果的な結果を得るために必要とされる場合、1回の投与によって、多数の適用によって、または制御された放出を介して、好ましくは、1日1回以上の注射によって、従来の薬学的組成物において送達され得る。最も好ましくは、この投薬量は、鼻吸入法によって、従来の薬学的化合物において送達され得る。
【0078】
正確な用量および化合物および最も適切な送達レジメンの選択は、特に、選択された配列番号1の化合物またはその誘導体の薬学的性質、処置されている状態の性質および重症度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神明瞭度によって影響される。
【0079】
代表的な好ましい送達レジメンとしては、経口レジメン、非経口レジメン(皮下的、経皮的、筋肉内および静脈内を含む)直腸レジメン、頬レジメン(舌下を含む)、経皮的レジメンならびに鼻内吸入法レジメンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0080】
薬学的に受容可能な塩は、毒性の副作用なしに、配列番号1の化合物またはその誘導体の、所望された生物学的活性を保持する。このような塩の例は、(a)例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸を用いて形成される酸付加塩;および例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイン酸(pamoic acid)、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸(naphthalene disulfonic acid)、ポリガラクツロン酸などの有機酸を用いて形成される塩;(b)例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属陽イオン;またはN,N’−ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンを用いて形成される塩基付加塩;あるいは(c)(a)および(b)の組み合わせ(例えば、亜鉛のタンニン酸塩(zinc tannate salt)など)である。
【0081】
本発明のさらなる局面は、薬学的に受容可能な非毒性キャリアとの混合物における、本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体、あるいは薬学的に受容可能なその塩を活性成分として含む薬学的組成物に関する。上記の通り、このような組成物は、非経口(皮下、経皮、筋肉内または静脈内)投与(特に液体溶液または液体懸濁液の形態で);経口または頬の投与(特に、錠剤またはカプセルの形態で);直腸、経皮投与;および鼻腔内投与(特に、散剤、鼻のドロップまたはエアロゾルの形態で)のために調製され得る。
【0082】
この組成物は、単位投薬形態で便利に投与され得、そして、例えば、本明細書中で参考として援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa、(1985)において記載されるように、薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方物は、賦形剤として、滅菌水または生理食塩水、アルキレングリコール(例えば、プロピレングリコール)、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール)、植物起源の油、水素化されたナフタレンなどを含み得る。経口投与については、処方物は、胆汁酸塩またはアシルカルニチンの添加によって増強され得る。鼻の投与についての処方物は、固体であり得、そして賦形剤(例えば、乳糖またはデキストラン)を含み得、あるいは、鼻のドロップまたは計量スプレーの形態における使用について、水性溶液または油性溶液であり得る。頬の投与について、代表的な賦形剤としては、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプン(pregelatinated starch)などが挙げられる。
【0083】
投与の最も好ましい経路のために処方される場合、鼻の投与(鼻の粘液の膜を横切った吸収)は、約0.2重量パーセントと15重量パーセントの間の範囲の量における、好ましくは、約0.5重量パーセントと4重量パーセントの間、最も好ましくは、約2重量パーセントの範囲の量における、例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸(ethocholic acid)、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコデオキシコール酸(glycodeoxycholic acid)、シクロデキストリンなどのような界面活性剤の酸によって増強され得る。
【0084】
長期間(例えば、1週間〜1年)にわたる被験体への本発明の化合物の送達は、所望の放出期間にわたって十分に活性な成分を含む制御された放出システムの1回の投与によって達成され得る。種々の制御された放出システム(例えば、モノリシックのマイクロカプセルまたはリザーバー型マイクロカプセル、デポーインプラント、浸透圧ポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入デバイスおよび代替の注入可能な投薬形態)が、この目的のために利用され得る。活性成分の送達が所望される部位における局在は、いくつかの制御された放出デバイスのさらなる特徴であり、これは、特定の障害の処置において有利であることを証明し得る。
【0085】
制御された放出処方物の1つの形態は、本明細書中で参考として援用されるKent、Lewis、SandersおよびTiceの米国特許第4,675,189号の先駆的研究において記載されるように、分散されるか、あるいはゆっくりと分解し、非毒性、非抗原性ポリマー(例えば、コポリ乳酸/コポリグリコール酸)にカプセル化されるポリペプチドまたはその塩を含む。化合物、または好ましくは、それらの比較的不溶性の塩はまた、コレステロールまたは他の脂質マトリックスペレット、あるいはシラストマー(silastomer)マトリックスインプラントにおいて、処方され得る。さらなる遅い放出、デポーインプラントまたは注入可能な処方物は、当業者に明らかである。例えば、本明細書中で参考として援用されるSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R.Robinson編、Marcel Dekker,Inc.、New York、1978、およびR.W.Baker、Controlled Release of Biologically Active Agents、John Wiley&Sons、New York、1987を参照のこと。
【0086】
PTHのように、配列番号1の化合物およびその誘導体は、所定の臨床状態の処置において有用な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗しょう症および他の骨関連障害の処置の場合、配列番号1の化合物およびその誘導体は、カルシウム栄養補助食品またはビタミンDアナログと組み合わせて投与され得る(米国特許第4,698,328号を参照のこと)。あるいは、配列番号1の化合物およびその誘導体は、例えば、米国特許第4,761,406号に記載のように、好ましくは、ビスホスホネートと組み合わせた周期的治療レジメンを用いて投与され得るか、または、1つ以上の骨治療薬剤(例えば、これらに限定されないが、カルシトニンおよびエストロゲン)と組み合わせた周期的治療レジメンを用いて投与され得る。
【0087】
((B) 配列番号1の化合物またはその誘導体の治療的有用性)
本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体は、骨質量の損失によって明らかになる種々の哺乳動物の状態の予防および処置について有用である。特に、本発明の化合物は、ヒトにおける骨粗しょう症および骨減少症の予防および治療的処置について指示される。さらに、本発明の化合物は、他の骨疾患の予防および治療的処置について指示される。本発明の化合物は、上皮小体機能低下症の予防および治療的処置について指示される。最後に、本発明の化合物は、骨折修復のためのアゴニストとして、および高カルシウム血症のアンタゴニストとしての使用について指示される。
【0088】
高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、PTHおよびPTHrPとPTH−1レセプターおよびPTH−2レセプターとの間の相互作用に関する。高カルシウム血症は、血清のカルシウムレベルにおいて、異常な上昇が存在する状態である;これは、しばしば、他の疾患(上皮小体機能亢進症、骨粗しょう症、乳房、肺および前立腺の癌腫、頭部および頸部の類表皮癌ならびに食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、ならびに副腎腫を含む)に関連する。低カルシウム血症(血清カルシウムレベルが異常に低い状態)は、事実上のPTHの欠乏(例えば、甲状腺手術後)から生じ得る。
【0089】
配列番号1の化合物またはその誘導体をコードする本発明の核酸はまた、選択された組織特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーと連結され、そして得られたハイブリッド遺伝子が標準的な方法(例えば、本明細書中で参考として援用される、Lederら、米国特許第4,736,866号によって記載されるような)によって、初期発生期(例えば、受精卵母細胞期)に動物胚へ導入され、選択された組織において、配列番号1の化合物またはその誘導体の上昇したレベルを発現するトランスジェニック動物を産生し得る(例えば、骨についてのオステオカルシンプロモーター)。このようなプロモーターは、トランスジェニック動物において、配列番号1の化合物またはその誘導体の組織特異的発現を指向するために用いられる。
【0090】
さらに、PTHアナログが、PTH−1/PTH−2レセプター(当業者に公知のアッセイによって決定され、そして以下で議論するように)をアンタゴナイズまたはアゴナイズする能力を破壊しない、任意の他のアミノ酸置換の性質が、本発明の範囲に含まれる。
【0091】
「アゴニスト」によって、PTH−1/PTH−2レセプターによって媒介される細胞応答を増強または強力にし得るリガンドが意図される。「アンタゴニスト」によって、PTH−1/PTH−2レセプターによって媒介される細胞応答を阻害し得るリガンドが意図される。本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」が、このような細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得るかは、当該分野で公知のタンパク質リガンド/レセプター細胞応答または結合アッセイ(本出願の他の場所に記載されるアッセイを含む)を用いて決定され得る。
【0092】
本発明のよりさらなる局面に従って、PTH−1/PTH−2レセプターの変化した作用または過剰な作用から生じた医学的障害を処置するための方法であって、治療的に有効な(患者のPTH−1/PTH−2レセプターの活性化を阻害するに十分な)量の配列番号1の化合物またはその誘導体を、この患者に投与する工程を包含する方法が提供される。
【0093】
この実施形態において、PTH−1/PTH−2レセプターの変更される作用から生じる障害を有すると疑われる患者が、PTH−1/PTH−2レセプターの選択的アンタゴニストである本発明の配列番号1の化合物またはその誘導体を用いて処置され得る。このようなアンタゴニストとしては、(本明細書中に記載されるアッセイにより)PTH−1/PTH−2レセプター媒介細胞活性化を妨害するように決定されている、本発明の配列番号1の化合物もしくはその誘導体、または類似の特性を有する他の誘導体が挙げられる。
【0094】
このアンタゴニスト、配列番号1の適切な化合物またはその誘導体を投与するために、一般に適切なキャリアまたは賦形剤(例えば、生理的食塩水)で処方されていることにより、そして好ましくは、PTH−1/PTH−2レセプターに結合する配列番号1の化合物またはその誘導体の適切な阻害を提供する投薬量で、静脈内に、筋内に、皮下に、経口に、または鼻腔に投与されることにより、医薬の製造において使用される。代表的な投薬量は、1日あたり体重1kgあたり1ng〜10mgのペプチドである。
【0095】
好ましい実施形態では、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、アミノ末端に1つのアミノ酸欠失を有する。この好ましい実施形態において、PTHアナログは、[Arg19]hPTH(2−28)である。さらに別の好ましい実施形態では、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、アミノ末端に2つのアミノ酸欠失を有する。この好ましい実施形態において、PTHアナログは、[Arg19]hPTH(3−28)である。
【0096】
本発明のなおさらなる局面に従って、骨粗しょう症を処置するための方法(この患者のPTH−1/PTH−2レセプターを活性化するのに十分な、配列番号1の化合物またはその誘導体の治療的有効量の患者への投与を包含する)が、提供される。PTHアンタゴニストについて上記に記載のような類似の投薬量および投与が、例えば、骨粗しょう症、他の代謝性骨障害、および上皮小体機能低下症および関連する障害のような状態の処置のために、PTHアゴニストの投与について使用され得る。
【0097】
好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、配列番号1の化合物の1位のアミノ酸においてセリンの代わりにアラニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、PTH誘導体は、[Arg1]hPTH(1−28)(配列番号8)である。別の好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、配列番号1の19位においてグルタミンの代わりにアルギニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、PTH誘導体は、[Arg19]hPTH(1−28)(配列番号6)である。別の好ましい実施形態では、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、配列番号1の1位においてセリンの代わりにグリシンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、PTH誘導体は、[Gly1]hPTH(1−28)(配列番号10)である。別の好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、配列番号1の1位のアミノ酸においてセリンの代わりにアラニンを用いるアミノ酸置換、および配列番号1の19位においてグルタミンの代わりにアルギニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、PTH誘導体は、[Ala1Arg19]hPTH(1−28)(配列番号4)である。別の好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号1の化合物またはその誘導体は、配列番号1の1位アミノ酸においてセリンの代わりにグリシンを用いるアミノ酸置換、および配列番号1の19位においてグルタミンの代わりにアルギニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、PTH誘導体は、[Gly1Arg19]hPTH(1−28)(配列番号2)である。
【0098】
(V.配列番号1の化合物またはその誘導体のレセプター−シグナル伝達活性)
ホルモン作用の発現における重要な工程は、標的細胞の形質膜表面上のレセプターとのホルモンの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成は、種々の生物学的応答を誘発するために細胞外シグナルの細胞への伝達を可能にする。
【0099】
(A.PTHレセプターアンタゴニストおよびアゴニストについてのスクリーニング)
本発明のポリペプチドは、cAMP蓄積(accumulation)アッセイを用いて、それらのアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性についてスクリーニングされる。細胞表面上のPTH−1レセプターを発現する細胞は、2mM IBMX(3−イソブチル−1−メチル−キサンチン、Sigma,St.Louis,MO)の存在下で、37℃で5〜60分の間、ネイティブPTH(1−84)とともにインキュベートされる。サイクリックAMPの蓄積が、上記のように、特定のラジオイムノアッセイにより測定される。PTH−1レセプターに対する結合についてネイティブPTH(1−84)と競合し、そしてcAMPの蓄積に対するネイティブPTH(1−84)の効果を阻害する、配列番号1の化合物またはその誘導体は、競合的アンタゴニストとみなされる。このような化合物は、高カルシウム血症を処置するために有用である。
【0100】
逆に、PTH−1レセプターに対する結合についてネイティブPTH(1−84)と競合しない配列番号1の化合物またはその誘導体は、これはなおcAMPの蓄積のネイティブPTH(1−84)活性を妨げる(おそらく、レセプター活性部位を阻害することによる)が、非競合的アンタゴニストとみなされる。このような化合物は、高カルシウム血症を処置するために有用である。
【0101】
PTH−1レセプターに対する結合についてネイティブPTH(1−84)と競合し、そしてネイティブPTH(1−84)の存在または非存在においてcAMPの蓄積を刺激する、配列番号1の化合物またはその誘導体は、競合的アゴニストである。PTH−1レセプターに対する結合についてネイティブPTH(1−84)と競合しないが、なおネイティブPTH(1−84)の存在または非存在においてcAMPの蓄積を刺激することが可能であるか、あるいは配列番号1の化合物またはその誘導体単独により観察されるcAMPの蓄積よりも高いcAMPの蓄積を刺激する、配列番号1の化合物またはその誘導体は、非競合的アゴニストとみなされる。
【0102】
本発明は、本発明の精神もしくは範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく、組成物、濃度、投与の様式、および状態の広範な等価のパラメーター内で行われ得ることは、当業者に明らかである。
【0103】
ここで本発明が十分に記載され、本発明は、例示により提供される特定の実施例に対する参考によって、より容易に理解され、そして本明細書において特定されない限り、本発明を限定することを意図しない。
【0104】
(実施例1)
(材料および方法)
(細胞培養)
ヒトまたはラットPTH−1レセプター(それぞれ、950,000レセプター/細胞および320,000レセプター/細胞)を安定して発現する、HKRK B7細胞またはEW 5細胞(32)、LLC−PKI腎上皮細胞のサブクローンを、7%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO−BRL、Grand Island,NY)含むダルベッコ改変必須培地中において、空気中で5%CO2下で維持した。HEK−293細胞およびCOS−7細胞を、10%FBSを培地中に使用したことを除いて、同様に培養した。細胞を、2〜2.5×105細胞/ウェル(HKRK B7細胞もしくはEW 5細胞)または6×105細胞/ウェル(6ウェルプレートにおいて)(HEK−293細胞)の密度で、アッセイ2日前に、24ウェルプレートに播種した。HEK−293細胞に関与する実験において、DNAトランスフェクションをプレーティング24時間後に行い、そしてイノシトール放射性標識をその24時間後に加えた(以下を参照のこと)。COS−7細胞トランスフェクションを、以前に記載されたように行った(Gardella,T.J.ら、Endocrinology 132(5):2024−2030(1993))。
【0105】
(放射性リガンド結合およびシグナル伝達アッセイ)
細胞内のcAMPの蓄積、PLC活性化およびPTHR結合親和性を以前に報告されたように測定した(Bringhurst,F.R.ら、Endocrinology 132(5):2090−2098(1993);Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995))。細胞内cAMPの蓄積が、イソブチルメチキサンチン(IBMX、1mM)の存在下で、37℃で15分間、ヒトPTHペプチドに曝した細胞の抽出物中で測定した。吸引によりこの反応を終結し、そして液体窒素中で凍結した後、細胞単層を50mM HClを用いて抽出し、そしてcAMPをラジオイムノアッセイキット(Dupont−New England Nuclear、Boston、MA)を使用して測定した。
【0106】
PLCを、0.1%ウシ血清アルブミンを含む無血清培地中で[3H]ミオイノシトール(3uCi/ml)を用いて16時間標識後、30分間37℃で、30mM LiClの存在下で、PTHアゴニストにより活性化した。この反応を、急速吸引および冷5%TCAの添加により停止した。水溶性放射性標識イノシトールトリスホスフェート(IP3)を、イオン交換クロマトグラフィーによるエーテル抽出後、単離した(Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995))。HEK 293細胞に関する実験において、Lipofectamine(Gibco BRL)を使用して(pcDNA1発現ベクターHKRKにおいて)ヒトPTHR cDNAを用いて以前にトランスフェクトされた細胞を、全水溶性[3H]イノシトールポリホスフェートをイオン交換カラムからの1つの分画として回収することを除いて、上記のように[3H]ミオイノシトールを用いて標識し、そしてアッセイした。
【0107】
放射性リガンド競合的結合アッセイを、非放射性hPTH−(1−34)アナログの存在または非存在下で、125I−[Nle8,21,Tyr34]ラットPTH−(1−34)(100,000cpm/ウェル)を使用して2〜8℃で6時間行った。細胞層を細胞結合(cell−associated)放射能の決定のために、可溶化の前に3回洗浄した。
【0108】
本明細書中で報告されるアッセイについてHKRK B7細胞において観察される基底の平均レベルhPTH−(1−34)の最大濃度存在下における平均レベルは、cAMPの蓄積について、それぞれ12±4pmoles/ウェル/15分および207±37pmoles/ウェル/15分、IP3形成について898±142cpm/ウェルおよび1908±251cpm/ウェル、ならびに結合について25520±1909cpm/ウェルおよび956±135cpm/ウェルであった。
【0109】
(ペプチドおよび他の試薬)
他に特定しない限り、全ての試薬を、Sigma(St.Louis,MO)から購入した。全ての同位体を、Dupont−New England Nuclear(Boston,MA)から得た。ヒトPTHペプチドを、C末端アミド化をを用いて、Endocrine UnitのBiopolymer Core Laboratoryにおいて合成し、そして存在する場合、天然に存在するPhe34の代わりにTyr34を用いた。[Tyr0]hPTH−(1−34)を、Sigma Co.から購入した。125I−[Nle8,21,Tyr34]ラットPTH−(1−34)を、ヨウ素化し、そして以前に記載のように精製した(Bringhurst,F.R.ら、Endocrinology 132(5):2090−2098(1993);Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995))。
【0110】
(結果)
(カルボキシル短縮型(carboxyl−truncated)PTHアナログ)
本発明者らは、C短縮型ペプチドhPTH−(1−31)およびhPTH−(1−30)が、HKRK B7細胞においてヒトPTH−1レセプターを介してACおよびPLCの両方を十分に活性化すること、ならびにこれらの応答についてのEC50は同一、またはhPTH−(1−34)について見られるEC50とほとんど同一であることを、以前に報告した(Takasu,H.、およびBringhurst,F.R.、Endocrinology 139(10):4293−4299(1998))。生物学的活性の保持のためにC末端限界(C−terminal limit)をさらに規定するために、C短縮型hPTHペプチドの本分析を、hPTH−(1−29)を用いて開始し、そしてhPTH−(1−24)まで広げた。
【0111】
図1Aにおいて示すように、hPTH−(1−29)およびhPTH−(1−28)は、hPTH−(1−34)と同様に効果的に、HKRK B7細胞においてヒトPTH−1レセプターを介してACを活性化したが、一方、さらに短くすること(すなわち、Leu28の除去)は、およそ100倍(EC50=100nM対1nM)にAC活性を著しく減じた。さらなる短縮(hPTH−(1−26)まで)は、潜在能においてさらに10倍の減少を生じた。hPTH−(1−26)およびhPTH−(1−25)に対する応答は、ほとんど同一であったが、一方hPTH−(1−24)は、試験された最も高い濃度(1000nM)でただ最小に活性であった。
【0112】
これらのペプチドのPLC活性のプロフィールは、ACについてのプロフィールとは著しく異なった。従って、これらの細胞におけるhPTH−(1−29)によるPLC活性化は、hPTH−(1−34)の活性化と比較して劇的に減少した(EC50=1000nM対30nM)。さらに、hPTH−(1−28)は、hPTH−(1−29)よりおよそ5倍低い潜在能力であり、そしてhPTH−(1−28)よりも短いペプチドは、PLC活性を有意に増加できなかった(図1B)。これらのC短縮型ペプチドにおいて観察されるPLC活性における減少(それらの結合親和性において測定される低下と関連する)(すなわちhPTH−(1−29)およびhPTH−(1−28)の結合についての明らかなIC50)はまた、hPTH−(1−34)のそれと比較して30〜100倍減少し、そして放射性リガンドの置換は、1000nMと同様に高い濃度で、hPTH−(1−28)よりも短いペプチドを用いて生じなかった(図1C)。
【0113】
PTH−(1−34)の段階的なC末端短縮と関連するPLC活性の漸進的な低下が、結合親和性において観察される平行的な低下によるか、または、代わりに、重要なPLC活性化ドメインの同時の欠失によるものか否かを決定するために、本発明者らは、齧歯類のPTHレセプターに対してhPTH−(1−34)の結合を増幅することが以前に報告されている改変(19位のGluの代わりにArgを用いる)を、hPTH−(1−28)に導入した(Gardella,T.J.ら、J.Biol.Chem.270(12):6584−6588(1995))。得られたペプチド([Arg19]hPTH−(1−28))は、hPTH−(1−28)と比較して、結合の増強(IC50=100nM対1000nM)およびPLC活性の増大(EC50=300nM対6000nM)の両方を示した(図3を参照のこと)。重要なことに、この[Arg19]hPTH−(1−28)アナログは、PKC活性化のために不可欠であると報告されているhPTH−(29−32)配列の非存在に関わらず、PLCを最大に活性化した(Jouishomme,H.ら、J.Bone Miner.Res.9(6):943−949(1994);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992))。アデニリルシクラーゼ活性は、Arg19置換により影響されなかった(図3A)。これらの結果は、hPTHの28位に対するアミノ酸C末端が、最適なリガンド結合に重要である一方、ヒトPTHレセプターを介した最大のPLC活性のために必要でないことを示唆したので、次いで本発明者らは、PLC活性化においてhPTHのN末端の役割に集中した。
【0114】
(N末端改変hPTHアナログ)
ヒトPTH−(3−34)を、齧歯類PTHレセプターを介してPLC/PKC選択ペプチドとして以前に特徴付けた(Azarani,A.ら、J.Biol.Chem.271(25):14931−14936(1996);Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992))。しかし、本発明者らは、1000nM程度の高さの濃度で、このペプチドが、ラットPTH−1レセプターまたはヒトPTH−1レセプターを発現するHKRK B7細胞またはCOS−7細胞においてPLCを活性化しないことを観察した(Takasuら、J.Bone Miner.Res.、印刷中)。これらの結果は、hPTH−(1−34)のN末端において最初の2つのアミノ酸(Ser1−Val2)が、ヒトPTHレセプターを介してPLC活性化ならびにAC活性化について重要であるに違いないことを示した。
【0115】
この分析を正確にするために、本発明者らは、第1にhPTH−(2−34)の特性を研究した。図2Aおよび2Bにおいて示すように、たとえACのhPTH−(2−34)の活性化が、hPTH−(1−34)の活性化と、大きさおよび感受性に匹敵したとしても、hPTH−(2−34)は、HKRK B7細胞におけるPLC活性を誘発しなかった。類似の結果を、大量のヒトPTH−1レセプターを発現するCOS−7細胞を使用して得た(データは示していない)。hPTH−(2−34)がヒトPTH−1レセプターを介してPLCを活性化できないことを、ヒトPTH−1レセプターcDNAを用いて一過的にトランスフェクトしたHEK−293ヒト胚性腎細胞を使用することにより、十分なホモログ系において確認した(表1)。
【0116】
【表4】
示された1000nMのペプチドに応答して産生される全イノシトールポリホスフェートを、ヒトPTH−1レセプターを一過的に発現するHEK−293細胞において測定した。結果は、3連の測定について基底活性の%の平均値±SEMとして表した。コントロールにおいて、総計IPの基底レベルは、578±91cpm/ウェル/30分であった。* コントロールとは有意に異なる(p<0.05)。
【0117】
本発明者らは、次に、ヒトPTH−1レセプターに対する結合およびヒトPTH−1レセプターの活性化におけるN末端Ser1残基の役割およびそのαアミノ基の役割を検討した。単離されたラット腎臓膜を用いた初期の研究は、hPTH−(1−34)においてSer1の代わりにAla1を用いることが、そのAC活性を増加したことを示し、一方Gly1置換は、bPTH−(1−34)によるAC活性化を弱めたので(Tregear,G.W.、およびPotts,J.T.,Jr.Endocr.Res.Commun.2:561−567(1975))、これらの1位の改変を、hPTH−(1−34)に導入し、その結果を図2に示した。[Ala1]hPTH−(1−34)アナログは、ACまたはPLCの結合ならびに活性化に関して、hPTH−(1−34)と識別できなかったが、一方Gly1置換ペプチドは、変化しない結合親和性およびAC活性にも関わらず、試験されたもっとも高い濃度(1000nM)で、減じられたPLC活性(hPTH−(1−34)の最大値の25%)を示した。
【0118】
これらAla1−置換hPTH−(1−34)および−Gly1−置換hPTH−(1−34)のα−アミノ基の欠損(すなわち、それぞれ、デスアミノ[Ala1]hPTH−(1−34)およびデスアミノ[Gly1]hPTH−(1−34))は、HKRK B7細胞において検出可能なPLC活性の完全な損失を生じたが、見かけの結合親和性において変化はなく、そしてAC効力において2〜5倍の減少があるにすぎなかった。(図2)。これらの結果を、ラットPTH−1レセプターまたはヒトPTH−1レセプターを発現するCOS−7細胞を使用し(示さず)、そしてヒトPTH−1レセプターcDNAを用いて一過的にトランスフェクトしたHEK−293ヒト腎臓細胞の研究において確認した(表1)。hPTHrP(1−36)のαアミノ基の除去はまた、HKRK B7細胞におけるPLCリガンドによるPLC活性を除去した[すなわち、それぞれ1000nMペプチドにおいて基底の、hPTHrP(1−36)=178±12%;デスアミノ−hPTHrP(1−36)=101±6%]。hPTH−(1−34)のN末端のチロシン残基の介在(interposition)によるN末端αアミノ基の置換(すなわち、[Thr0]hPTH−(1−34))はまた、PLC活性を消滅した(1000nMペプチドで基底の105±5%)。まとめると、これらの知見は、ヒトPTH−1レセプターによるPLCの活性における、hPTH−(1−34)のN末端残基、および特にその遊離したαアミノ基のN末端残基の重大な役割を示した。それぞれの1位の変化の影響は、これらの細胞におけるPLCの相対的な選択(ACに対する)および結合親和性における変化の非依存性の両方であったので、PTH−1レセプターを介したAC活性化からPLCを潜在的に分離するための戦略が示唆された。
【0119】
(hPTH−(1−28)の改変)
先に示したように(図1)、hPTH−(1−28)は、hPTH−(1−34)の最も短いアナログであり、試験した最も高い濃度(10μM)でなお、HKRK B7細胞において、ヒトPTH−1レセプターを介してACおよびPLCの両方を活性化した。hPTH−(1−28)配列においてAla1がSer1に置換された場合、結合親和性およびPLC活性化に対するEC50の両方は、部分的に改善されたが、[Arg19]hPTH−(1−28)を用いて以前に観察された程度ほどではなかった(図3Bおよび3C)。すでにhPTH−(1−34)のACに等価なACの活性化は、さらに高まらなかった。対照的に、Gly1置換(すなわち、[Gly1]hPTH−(1−28))は、10μMでの弱い応答の他に、選択的にPLCシグナル伝達を除去し、そして結合親和性を穏やかに損なった(図3Bおよび3C)。
【0120】
結合増強Arg19改変を[Ala1]hPTH−(1−28)アナログおよび[Gly1]hPTH−(1−28)アナログに重ねた場合、これらのペプチドのヒトPTHRに対する結合親和性は、5〜10倍増加した(図3Cと比較した図4C)。[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)の場合では、PLC活性化に対するEC50はまた、[Ala1]hPTH−(1−28)の場合よりも5倍改善した[すなわち、1000nM(図3B)から200nM(図4B)まで]。興味深いことに、Ala1、Arg19の二重置換は、hPTH−(1−27)へのPLC活性を回復できなかったが、これはAC活性化に対するEC50を10倍改善した(表2、図1)。
【0121】
【表5】
シグナル伝達応答を、方法に記載されたようにhPTH−(1−34)または[Ala1,Arg19]hPTH−(1−27)により刺激された細胞において測定した。結果を、同様のアッセイにおいて観察されたhPTH−(1−34)への最大の応答の%として示した。値は、それぞれ2連および3連で行った2つの別々の実験より得た、4回測定(cAMP蓄積)および6回測定(IP3形成)の平均±SEMである。
【0122】
[Ala1,Arg19]hPTH(1−28)とは対照的に、結合親和性において5倍に匹敵するほど改善されたにもかかわらず、[Gly1]hPTH−(1−28)へのArg19置換の導入に続くPLC活性における増加はなかった(図4)。従って、[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)および[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)の両方に対するAC活性化曲線は、hPTH−(1−34)の曲線と識別できなかったが(図4A)、一方でPLC応答プロフィールは、[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)とは異なり、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)が、このシグナル伝達経路の活性化の点で著しくかつ選択的に減じられることを示した。
【0123】
PTH−1レセプターを介したPLCシグナル伝達からACを分離するためのシグナル選択アナログとしてのげっ歯類モデルにおいて特に、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)ペプチドが有用であり得るという可能性を、LLC−PK1細胞のEW5サブクローン(ラットPTH−1レセプターを安定に発現する)を使用してさらに試験した(Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995))。表3に示すように、EW5細胞における種々の置換hPTH−(1−28)アナログのシグナル伝達および結合特性は、上記のHKRK B7細胞におけるそれらに同一ではないが、類似していた。hPTH−(1−28)ペプチドにおけるラットレセプターとヒトレセプターとの間の注意すべき差異としては、以下が挙げられる:(1)ラットPTH−1レセプターを介するhPTH−(1−28)のシグナル伝達は、匹敵する結合親和性にもかかわらず、ヒトPTH−1レセプターを介するよりも厳しく減じられた(表3および図1の比較);(2)Gly1置換は、ラットPTH−1レセプターに対するhPTH−(1−28)ペプチドの結合親和性をわずかに増強したが(2倍)、一方それは、ヒトPTH−1レセプターへの結合を約3倍減じた(表3と図3および4を比較);ならびに(3)ラットPTH−1レセプターに対する[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)のACに対する結合親和性およびEC50は、hPTH−(1−34)に関して約6倍に減じられたのみであったが、一方このアナログのヒトPTH−1レセプターへの結合は、ほぼ40倍減少した。ヒトPTH−1レセプターを介するACの活性化に対する[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)の有効性は、HKRK−B7細胞におけるhPTH−(1−34)の有効性と類似であったが、それは10〜20倍まで減少し、ずっと少ないヒトPTH−1レセプターを発現した他の細胞(LLC−PKIまたはSaOS−2骨肉腫)におけるその減少した結合親和性と一致した(すなわち、細胞あたり10,000〜100,000対950,000)(データ示さず)。概して、結果は、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)ペプチドが、ラットPTH−1レセプターおよびヒトPTH−1レセプターの両方を介するAC対PLCに対して高度にシグナル選択的であること、および、それが、十分に保存された結合親和性のために、インビボでのげっ歯類モデルを使用する研究に特に有用であり得ることを示した。
【0124】
(考察)
hPTH−(1−34)とPTH−1レセプターとの相互作用に関するいくつかの主要な結論が、これらの実験の結果より引き出され得る。第一に、hPTH−(1−34)リガンドのインタクトなN末端は、PTH−1レセプターを介するPLCの有効な活性化に不可欠であることは、明白である。結合が他の手段により維持され得る場合は、hPTH−(1−34)のC末端、特に、配列hPTH−(28−30)は、リガンドの結合の安定化による有効なPLCの活性化に寄与するが、最大のPLC活性化に必要でない。第二に、hPTHのN末端はPTH−1レセプターを介するACおよびPLCの両方の活性化に重要であるが、これら二つのエフェクターの活性化におけるリガンドのN末端中の特定の構造的特徴の役割は異なる。具体的には、本発明者らは、PLC活性化が、N末端の構造(すなわち、N末端アミノ酸の同一性およびN末端αアミノ基の存在の両方)に対して、PLCとは異なるAC応答(1位のアミノ酸の非存在においてさえも通常に生じ得る)よりも、さらにより敏感であることを見出した。第三に、hPTHペプチドのN末端の変化に対するACシグナル伝達およびPLCシグナル伝達の感受性におけるこの差異のために、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)アナログに対して本明細書中で示したように、リガンドの構造を変更することによりこれら二つのエフェクターの活性化を分離することが可能である。本発明者らは、以前に、PTH−1レセプターにおける変異を介してそのようなシグナル伝達選択性を達成した(DSELに対する細胞内ループ2におけるEKKY配列を変化させることによる(Iida−Klein,A.ら、J.Biol.Chem.272(11):6882−6889(1997)))が、ここで野生型レセプターを介して活性である、高度にシグナル選択的なリガンドもまた、設計され得ることは明白である。
【0125】
これらの知見は、再試験されるPTHシグナル伝達の構造決定因子に関する、いくつかの重要な概念を必要とする。内因性のPTH−1レセプターを発現するげっ歯類細胞およびオポッサム細胞を用いて、以前に行われた研究は、PTH−(1−34)のようなN短縮型PTHアナログが、AC活性を欠如するが、それにもかかわらず、いくつかの系ではPKCおよび一過的にCai ++を潜在的に活性化し得るが(Donahue,H.J.ら、J.Biol.Chem.263:13522−13527(1988);Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991);Siegfried,G.ら、Endocrinology 136(3):1267−1275(1995))、他の系では活性化し得なかった(Reid,I.R.ら、Am.J.Physiol.253(1 Pt 1):E45−51(1987);Tamura,T.ら、Biochem.Biophys.,,Res.Commun.159:1352−1358(1989))ことを示した。N短縮型hPTH−(1−34)アナログおよびC短縮型hPTH−(1−34)アナログのPKC活性化特性の詳細な分析は、配列hPTH−(29−32)が重大な「PKC活性化ドメイン」を示すという結論を導いた(Jouishomme,H.ら、J.Bone Miner.Res.9(6):943−949(1994);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992);Whitfield,J.F.およびMorley,P.Trends Pharm.Sci.16(11):382−386(1995))。
【0126】
本発明者らが、[Ala1、Arg19]hPTH−(1−28)のようなC短縮型アナログを用いて観察した活発なPLC活性化は、hPTH−(29−32)領域が、ヒトPTH−1レセプターを介するPLCの完全な活性化のために必要ではないことを明確に示す。本発明者らの結果は、ラット腎臓膜におけるbPFH−(1−34)について以前に報告されたように、この領域が、そのレセプターに対するhPTH−(1−34)リガンドの高親和性結合のために重要であることを示す(Serge,G.V.ら、J.Biol.Chem.254:6980−6986(1979))。同時に、ヒトPTH−1レセプターのPLC応答が、リガンド結合親和性における減少に対するAC応答であるよりも、より敏感であることは明白である。この結論はまた、PLCがPHT−1レセプター表面発現のレベルにより強く依存性であるという事実に一致する(Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995))。
【0127】
COS−7細胞およびHEK−293細胞において非相同的に発現された組換えヒトPTH−1レセプターを介するPLCの活性化またはCai ++シグナル伝達に対するhPTH−(1−34)またはPTH−(3−34)の効果の以前の研究は、一致しない知見を生じた(Pines,M.ら、Bone 18(4):381−389(1996);Seuwen,K.ら、Brit.J.Pharm.114(8):1613−1620(1995);Jobert,A.−S.ら、Endocrinology 138(12):5282−5292(1997);Schneider,H.ら、FEBS Lett.351(2):281−285(1994))。しかし、N末端短縮型PTHアナログが、他の系においてPKCおよびCai ++の活性化を誘発するという多数の知見のために(Azarani,Aら、J.Biol.Chem.271(25):14931−14936(1996);Donahue,H.J.ら、J.Biol.Chem.263:13522−13527(1988);Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991);Fujimori,A.ら、Endocrinology 130(1):29−36(1992);Janulis,M.ら、Endocrinology 133:713−719(1993);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1)53−60(1992);Chakravarthy,B.R.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.171(3):1105−1110(1990);Cole,J.A.ら、Endocrinology 1229:2981−2989(1988);Rixon,R.H.ら、J.Bone Miner.Res.9(8)1179−1189(1994))、hPTH−(1−34)の1位の遊離のαアミノ基が、ヒトPTH−1レセプターを介するPLC活性化のために絶対的に必要とされるという本発明者らの知見は、全く予想外であった。実際に、本発明者らのデータは、PTH−1レセプターを介するPLCの活性化が、ACであるより、そのようなかすかなN末端改変に対して、さらにより敏感であること、およびhPTH−(1−34)の段階的なC末端短縮の結果とは対照的に、これらのアナログのPLC効力における減少が、より低い結合親和性に寄与し得ないことを示す。これは、hPTH−(1−34)の極端なN末端が、ヒトPTH−1を介するPLCシグナル伝達にための真の「活性化ドメイン」を構成することを示唆する。本発明者らは、他のグループが以前に報告したラットUMR 106−01骨肉種細胞における、N短縮型ペプチドbPTH−(2−34)およびbPTH−(2−34)によるPLCの活性化(Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991))に注意すべきである。この矛盾に対する説明は、種の相違(細胞およびリガンドにおける)、またはPLC結合PTH−1レセプターの代替の種のUMR骨肉種細胞による可能な発現にあり得、この存在は、内因性のPTH−1レセプターをまた発現するラット骨肉種細胞において除外され得ない(Murray,T.M.ら、Calcif.Tiss.Intemat.49(2):120−123(1991);Inomata,N.ら、Endocrinology 136(11):4732−4740(1995))。クローン化ヒトPTH−1レセプターを介してPLCを活性化する、本明細書中で研究されたN短縮型hPTH−(1−34)アナログの不全は、ブタ宿主細胞に独特ではなかったが、これらの知見は同様に、COS−7細胞および相同なヒト細胞系の両方において確認された。
【0128】
本発明者らの結果は、hPTH−(1−34)のC末端の部分が、PTH−1レセプターを介してPKCを活性化するという知見に矛盾しない(Azarani,A.ら、J.Biol.Chem.271(25):14931−14936(1996);Janulis,M.ら、Endocrinology 133:713−719(1993);Jouishomme,H.ら、J.Bone Miner.Res.9(6):943−949(1994);Siegfried,G.ら、Endocrinology 136(3):1267−1275(1995);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992))。プロテインキナーゼCは、PLC以外の機構(ホスホリパーゼDおよびホスホリパーゼA2(PLA2)を含む)によって活性化され得る(Nishizuka,Y.、FASEB J.9:484−496(1995))。実際、腎臓細胞において、PTHはPLA2(42)を活性化し得、そしてPLCの増加なしにPKCを刺激し得る(Friedman,P.A.ら、Endocrinology 137(1):13−20(1996))。同様に、ヒトPTH−1レセプターを介する一過的なPTH刺激性のCai ++のPLC非依存性機構についての証拠が、提供されており(Seuwen,K.ら、Brit.J.Pharm.114(8):1613−1620(1995);Jobert,A.−S.ら、Endocrinology 138(12):5282−5292(1997))、これは、本発明者らがPLCを刺激しないことを示したN短縮型PTHアナログにより、Cai ++の活性化を説明し得る(Donahue,H.J.ら、J.Biol.Chem.263:13522−13527(1988);Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−9(1991);Jouishomme,H.ら、Endocrinology 130(1):53−60(1992))。従って、PTH−(1−34)のC末端ドメインは、PKC活性化またはCai ++活性化のそのような代替経路の活性化に関与し得る。そのような場合、本発明者らの結果は、少なくとも3つのドメインが、hPTH−(1−34)分子内に(2つは、ACおよびPLCの活性化を媒介するN末端に、そして1つは1つ以上のPLC非依存性機構を介してPKCを活性化するC末端の近くに)存在するという結論を導く。インビボでのPTHの生理学的作用または薬理学的作用のためのこれらの種々の活性化ドメインの有意性のさらなる明確化は、PTH−1レセプター媒介AC、PLCおよびPKCシグナル伝達により活性化される重要な細胞経路の役割の、より優れた定義を必要とする。これらの問題は今や、PLCではなくPKC活性化を誘発する、他に記載されるN末端が短縮されたPTHアナログ(Azarani,A.ら、J.Biol.Chem.271(25):14931−14936(1996);Janulis,M.ら、Endocrinology 133:713−719(1993);Siegfried,G.ら、Endocrinology 136(3):1267−1275(1995);Rixon,R.H.ら、J.Bone Miner.Res.9(8):1179−1189(1994))を有する、本明細書中に記載されるC短縮型/N末端改変PTHアナログの生物学的作用を比較することにより、より明確に扱われ得る。例えば、本発明者らは、ラットPTH−1レセプターの第2の細胞内ループ内の変異を介するPTH−(1−34)に対するPLC応答の選択的な除去が、LLC−PK1細胞におけるナトリウム依存性リン酸輸送(Iida−Klein,A.ら、J.Biol.Chem.272(11):6882−6889(1997))のような特定の下流の生物学的応答、および増殖プレート軟骨細胞によるインターロイキン6の産生をブロックすることを以前に見出した(公開されていないデータ)。野生型PTH−1レセプターを介する選択的シグナル伝達を有する新規リガンドの有効性は、今や、インビトロでのそのような問題を扱うための補完的なアプローチを提供する。最終的に、インビトロ試験とインビボでのアナログ活性の研究の慎重な相関は、これらの別々のPTH−1レセプターシグナルの生理学的な役割を分析し、加えて十分に定義するために必要とされる。
【0129】
bPTH−(2−34)、hPTH−(2−38)およびデスアミノ−PTH−(1−34)を含むアミノ短縮型アナログは、インビトロで試験した場合、弱いAC活性のみを示すことが、以前に見出されたが(Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991);Fujimori,A.ら、Endocrinology 130(1):29−36(1992);Tregear,G.W.およびPotts,J.T.,Jr.Endocr.Res.Commun.2:561−567(1975);Rixon,R.H.ら、J.Bone Miner.Res.9(8):1179−89(1994))、一方、本発明者らは、hPTH−(2−34)、デスアミノ−[Ala1]hPTH−(1−34)およびデスアミノ−[Gly1]hPTH−(1−34が、hPTH−(1−34)と等力であったことを見出した。この相違は、おそらく、以前の研究において使用された骨肉種細胞または部分的に精製された膜によるよりも、HKRKB7細胞により発現された非常に多数のヒトPTH−1レセプターにより、説明される(Fujimori,A.ら、Endocrinology 128(6):3032−3039(1991);Fujimori,A.ら、Endocrinology 130(1):29−36(1992);Tregear,G.W.およびPotts,J.T.,Jr.Endocr.Res.Commun.2:561−567(1975);Rixon,R.H.ら、J.Bone Miner.Res.9(8):1179−1189(1994))。HKRK B7細胞を、高レベルのレセプター発現を必要とするヒトPTH−1レセプターを介するPLCシグナル伝達の構造的な基礎の分析を最適化するために、本発明者らは研究のために選択した(Guo,J.ら、Endocrinology 136(9):3884−3891(1995));Pines,M.ら、Endocrinology 135(4):1713−1716(1994))。これらN短縮型ペプチドが、より少ない(すなわち、細胞あたり100,000〜300,000)ヒトPTH−1レセプターを発現する他のLLC−PKIサブクローンを用いて試験された場合、それらのAC応答は、実際に、hPTH−(1−34)と比較して10倍までも減少した(データは示さず)。一方、インビボでのそのようなN短縮型PTHアナログの研究は、インビトロでのAC活性の測定より予測されたよりも大きな生物作用能を示した(Tregear,G.W.ら、Endocrinology 93:1349−1353(1973);Hilliker,S.ら、Bone 19:469−477(1996))。また、インビボでの関連する標的細胞により発現されたPTH−1レセプターの実際の数は、不確かなままであるが、本明細書中で研究された範囲内にあり得る(Shukunarni,C.ら、J.Cell Biol.133(2):457−468(1996);Bos,M.P.ら、Calcif.Tiss.Internat.58(2):95−100(1996))。
【0130】
これは、PTH−(1−28)より短いペプチドが、PTH−1レセプターを介してACを十分に活性化し得る第1の実証である。単離された腎臓膜またはROS17/2骨肉種細胞を使用する以前の研究においては、PTH−(1−27)またはより短いC短縮型アナログを用いて、ほとんど活性が検出されないか、または全く活性が検出されなかった(Segre,G.V.ら、J.Biol.Chem.254:6980−6986(1979);Tregear,G.W.ら、Endocrinology 93:1349−1353(1973);Neugebauer,W.ら、Biochemistry 34(27):8835−8842(1995))。さらに、突然変異誘発のスキャニングは、Leu2についてのラットPTH−1レセプターに対する結合における重大な役割を同定した。Leu2は、hPTH−(1−34)分子のC末端の近くのαヘリックスを安定化させる際に重要であると考えられている(Gombert,F.ら、Proc.14th Am.Peptide Symp.、Kaumaya,P.およびHodges,R.編、Mayflower Scientific Limited,Kingswinford,UK(1996)、661−662頁;Neugebauer,W.ら、Biochemistry 34(27):8835−8842(1995))。上記のように、N短縮型ペプチドについて、本発明らがhPTH−(1−28)よりも短いC短縮型hPTHペプチドによってAC活性化を検出する能力は、本発明者が使用した細胞におけるヒトPTH−1レセプターの発現の高いレベルに起因するようである。一過的にトランスフェクトしたCOS−7細胞またはHEK 293細胞(PTHおよびPTH−1レセプターの両方の構造−機能の研究において広く使用されている)は、代表的に、少なくともHKRK B7細胞が発現するのと同程度のレセプターを発現する(Iida−Klein,A.ら、J.Biol,Chem.270(15):8458−8465(1995))。もちろん、PTH−1レセプター発現の生理学的なレベルがインビボでの関連する標的細胞において定義されるまで、得られたPTHアナログまたは模倣化合物のAC活性の推定値(これらの高度に敏感なインビトロの系を使用する)は、慎重に解釈されなければならない。同時に、そのような系は、弱いヒトPTH−1レセプターアゴニストを同定し、およびこのレセプターによる結合および複数の平行するシグナル伝達に関与するリガンドの基本的構造の特徴を規定するために、重要な利点を提供するようである。
【0131】
最終的に、改変されたhPTH−(1−28)アナログの本発明者らの研究は、新規hPTHアナログである、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)を同定した。これは、ヒトPTH−1レセプターを介するACの活性化(対PLC)に対するhPTH−(1−34)に関連する顕著な選択性(>40倍)を示す。大量のヒトPTH−1レセプターを発現するHKRK B7細胞において、このアナログによるACの活性化は、30倍低い結合親和性にもかかわらずhPTH(1−34)による活性化のと等価であったが、一方PLC効力は約100倍減少した。hPTH−(2−34)およびデスアミノアナログと同様に、[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)の絶対的なAC効力は、ずっと少ないヒトPTH−1レセプター/細胞を発現する細胞において減少したが、それにもかかわらず、このペプチドは、ヒトPTH−1レセプターを発現する標的細胞における特定のPTH作用のシグナル伝達の基礎の研究について、単一の選択的PTHRアゴニストとして有用であると証明するに十分な結合親和性およびAC活性を保持する。[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)アナログは、げっ歯類系におけるインビトロ研究およびインビボ研究の両方に対して、特に有用であるはずである。このペプチドは、ラットPTH−1レセプターを介するAC対PLCについて10倍よりも大きい選択性である。さらに、ラットPTH−1に対する、その結合親和性は、ヒトPTH−1レセプターに対するよりも10倍大きく、そしてhPTH−(1−34)の結合親和性よりも7倍低いのみである。インビトロおよびインビボでのこのアナログの特性の慎重な分析は、PTH作用におけるPTH−1レセプター依存性のPLC活性化の役割を明確にするのに役立ち、そして他のシグナル選択性のhPTHアナログの開発のためのさらなる指示を提供するはずである。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 HKRB B7細胞におけるC末端短縮型hPTHアナログの特性。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)が、示した濃度の以下のものについて示される:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(1−29)(黒三角)、hPTH−(1−28)(白丸)、hPTH−(1−27)(白三角)、hPTH−(1−26)(黒逆三角)、hPTH−(1−25)(白逆四角)およびhPTH−(1−24)(黒四角)。結果を、同じアッセイにおいて観察された、hPTH−(1−34)に対する最大応答のパーセンテージとして(AおよびB)または125I−[Nle8,21,Tyr34]ラットPTH−(1−34)放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセンテージとして(C)表す。各点は、いくつかの(すなわち、2〜4の)実験からの結果の平均±SEMを表す。この実験の各々は、3連で行った(結合データのSEMは代表的に、総結合の3%未満であり、従ってしばしば記号によって隠されている)。
【図1B】 HKRB B7細胞におけるC末端短縮型hPTHアナログの特性。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)が、示した濃度の以下のものについて示される:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(1−29)(黒三角)、hPTH−(1−28)(白丸)、hPTH−(1−27)(白三角)、hPTH−(1−26)(黒逆三角)、hPTH−(1−25)(白逆四角)およびhPTH−(1−24)(黒四角)。結果を、同じアッセイにおいて観察された、hPTH−(1−34)に対する最大応答のパーセンテージとして(AおよびB)または125I−[Nle8,21,Tyr3 4]ラットPTH−(1−34)放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセンテージとして(C)表す。各点は、いくつかの(すなわち、2〜4の)実験からの結果の平均±SEMを表す。この実験の各々は、3連で行った(結合データのSEMは代表的に、総結合の3%未満であり、従ってしばしば記号によって隠されている)。
【図1C】 HKRB B7細胞におけるC末端短縮型hPTHアナログの特性。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)が、示した濃度の以下のものについて示される:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(1−29)(黒三角)、hPTH−(1−28)(白丸)、hPTH−(1−27)(白三角)、hPTH−(1−26)(黒逆三角)、hPTH−(1−25)(白逆四角)およびhPTH−(1−24)(黒四角)。結果を、同じアッセイにおいて観察された、hPTH−(1−34)に対する最大応答のパーセンテージとして(AおよびB)または125I−[Nle8,21,Tyr34]ラットPTH−(1−34)放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセンテージとして(C)表す。各点は、いくつかの(すなわち、2〜4の)実験からの結果の平均±SEMを表す。この実験の各々は、3連で行った(結合データのSEMは代表的に、総結合の3%未満であり、従ってしばしば記号によって隠されている)。
【図2A】 HKRK B7細胞におけるN末端が改変されたhPTH−(1−34)アナログの特性。(A)示した濃度の以下のものに対応した細胞内cAMP蓄積:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(2−34)(白丸)、[Ala1]hPTH−(1−34)(黒三角)、[Gly1]hPTH−(1−34)(黒逆三角)、デスアミノ−[Ala1]hPTH−(1−34)(白三角)、およびデスアミノ−[Gly1]hPTH−(1−34)(白逆三角);(B)1000nMの示したペプチドに応答したIP3の形成;(C)パネルAに示したのと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図1に記載したように表す。
【図2B】 HKRK B7細胞におけるN末端が改変されたhPTH−(1−34)アナログの特性。(A)示した濃度の以下のものに対応した細胞内cAMP蓄積:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(2−34)(白丸)、[Ala1]hPTH−(1−34)(黒三角)、[Gly1]hPTH−(1−34)(黒逆三角)、デスアミノ−[Ala1]hPTH−(1−34)(白三角)、およびデスアミノ−[Gly1]hPTH−(1−34)(白逆三角);(B)1000nMの示したペプチドに応答したIP3の形成;(C)パネルAに示したのと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図1に記載したように表す。
【図2C】 HKRK B7細胞におけるN末端が改変されたhPTH−(1−34)アナログの特性。(A)示した濃度の以下のものに対応した細胞内cAMP蓄積:hPTH−(1−34)(黒丸)、hPTH−(2−34)(白丸)、[Ala1]hPTH−(1−34)(黒三角)、[Gly1]hPTH−(1−34)(黒逆三角)、デスアミノ−[Ala1]hPTH−(1−34)(白三角)、およびデスアミノ−[Gly1]hPTH−(1−34)(白逆三角);(B)1000nMの示したペプチドに応答したIP3の形成;(C)パネルAに示したのと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図1に記載したように表す。
【図3A】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位または19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度で添加した[Arg19]hPTH−(1−28)(黒四角)、[Ala1]hPTH−(1−28)(白三角)、および[Gly1]hPTH−(1−28)(白三角)について示す。結果を、図1に記載したように表す。参照のために、図1に先に示したhPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を、それぞれ、破線および点線を用いて再度プロットする。
【図3B】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位または19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度で添加した[Arg19]hPTH−(1−28)(黒四角)、[Ala1]hPTH−(1−28)(白三角)、および[Gly1]hPTH−(1−28)(白三角)について示す。結果を、図1に記載したように表す。参照のために、図1に先に示したhPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を、それぞれ、破線および点線を用いて再度プロットする。
【図3C】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位または19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度で添加した[Arg19]hPTH−(1−28)(黒四角)、[Ala1]hPTH−(1−28)(白三角)、および[Gly1]hPTH−(1−28)(白三角)について示す。結果を、図1に記載したように表す。参照のために、図1に先に示したhPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を、それぞれ、破線および点線を用いて再度プロットする。
【図4A】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位および19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度での[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒三角)および[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒逆三角)について示す。結果を、図1において記載されるように表す。参照のために、hPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を図3においてと同様に示す。
【図4B】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位および19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度での[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒三角)および[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒逆三角)について示す。結果を、図1において記載されるように表す。参照のために、hPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を図3においてと同様に示す。
【図4C】 HKRK B7細胞におけるhPTH−(1−28)の特性に対する1位および19位での変異の効果。細胞内cAMP蓄積(A)、IP3形成(B)および競合的放射性リガンド結合(C)を、示した濃度での[Ala1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒三角)および[Gly1,Arg19]hPTH−(1−28)(黒逆三角)について示す。結果を、図1において記載されるように表す。参照のために、hPTH−(1−34)およびhPTH−(1−28)についての応答を図3においてと同様に示す。
【配列表】
Claims (29)
- 以下の式からなるペプチド:
(a)
(c)(a)または(b)の薬学的に受容可能な塩;
ここで:
X01は、Ser、AlaまたはGlyであり;そして
X02は、GluまたはArgであり、
ただし、該ペプチドは、hPTH(1−26)NH2、hPTH(1−27)NH2またはhPTH(1−28)NH2ではない。 - 前記ペプチドが、放射標識、蛍光標識、生物発光標識または化学発光標識からなる群より選択される標識を用いて標識される、請求項1に記載のペプチド。
- 前記放射標識が99mTcである、請求項2に記載のペプチド。
-
-
-
-
-
- 請求項1に記載のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 請求項1に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる、核酸分子。
- 以下を含む、組換えDNA分子:
(1)発現制御領域;
(2)該領域に作動可能に連結された、請求項1に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。 - ペプチドを調製する方法であって、該方法は、請求項11に記載の組換えDNA分子を宿主に導入する工程、および該分子の発現を引き起こす工程、を包含する、方法。
- 請求項10に記載の核酸分子をベクター中に挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
- 請求項11に記載の組換えDNA分子であって、ここで、前記制御領域が、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、真菌プロモーターまたは哺乳動物プロモーターを含む、組換えDNA分子。
- 請求項11に記載の組換えDNA分子を含む、宿主細胞。
- 原核生物細胞である、請求項15に記載の細胞。
- 細菌細胞である、請求項16に記載の細胞。
- 真核生物細胞である、請求項15に記載の細胞。
- 酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項18に記載の細胞。
- 骨質量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を処置するための組成物であって、該組成物は、骨質量を増大するに有効な量の請求項1に記載のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
- 骨形成、骨吸収および/または骨リモデリングの速度を決定するための組成物であって、該組成物は、患者に投与するのに適した有効量の請求項3に記載のペプチドを含み、さらにここで、該患者の骨への該ペプチドの取り込みが決定される、組成物。
- 骨質量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態を処置するための組成物であって、ここで、骨質量を増大するに有効な量の請求項1に記載のペプチドをコードするDNAを含み、該組成物は、患者への投与およびインビボでの該ペプチドの発現に適している、組成物。
- 前記処置されるべき状態が骨粗しょう症である、請求項20に記載の組成物。
- 前記骨粗しょう症が、老年性骨粗しょう症である、請求項23に記載の組成物。
- 前記骨粗しょう症が閉経後の骨粗しょう症である、請求項23に記載の組成物。
- 前記骨質量を増大するに有効な量のペプチドが、0.01μg/kg/日〜1.0μg/kg/日である、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が非経口的投与に適している、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が皮下的投与に適している、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物が鼻吸入的投与に適している、請求項20に記載の組成物。
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