JP2002530111A - ヒト副甲状腺ホルモンの改変、調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 以下の式から本質的になるペプチドに対して、少なくとも９０％同一である生物学的に活性なペプチドを含む、ＰＴＨ（１−２８）の合成および／または組換えの、生物学的に活性なペプチド誘導体：（ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｕＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）；（ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ酸１〜２６またはアミノ酸１〜２７を含む、そのフラグメント；（ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは（ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体；ここで、Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そしてＸ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、ただし、該ペプチドは、ｈＰＴＨ（１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）ＮＨ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （連邦政府に支援された研究および開発の下でなされた発明に対する権利につ
いての声明） 本発明の開発の間に実施された研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国
政府は、本発明において一定の権利を有する。

【０００２】 この研究は、国立衛生研究所助成金ＤＫ１ １９７４によって支援された。

【０００３】 （発明の分野） 本発明は、新規な副甲状腺ホルモンペプチド（ＰＴＨ）誘導体に関する。特に
、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換を有するＰＴＨ誘導体に関し、この置換は
、この誘導体に対するＰＴＨ−１レセプターアゴニスト特性またはＰＴＨ−１レ
セプターアンタゴニスト特性を与える。

【０００４】 （関連技術の説明） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の複雑な生物学的役割の完全な理解およびその治
療的潜在能力を利用するための試みは、このホルモンの作用の複数のシグナル伝
達パターンおよび細胞性経路の解明を必要とする。ＰＴＨは、腎性標的細胞およ
び骨性標的細胞中で特定のレセプターを結合および活性化し、この細胞はまた、
ＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）を認識する（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．ら
、「Ｔｈｅ ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒｆｏｒ ｔｗｏ ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔｈａｋｋｅｒ，
Ｒ．ら、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９７）３８９〜４
２０頁）。腎性細胞株および骨性細胞株において、ＰＴＨは、いくつかの平行な
細胞内シグナル伝達応答を誘発し、この応答は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）
、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびプロテ
インキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化ならびにセカンドメッセンジャー（例えば、
サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ₃）、ジアシル
グリセロール、および増加された細胞質ゾルを含まないカルシウム（Ｃａ_i ⁺⁺）
）の生成を含む。

【０００５】

【表１】 現在まで、実質的に関連するが別個である２つのＰＴＨレセプターの種が、ク
ローニングされている（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（７）２７３２〜２７３６（１９９２
）；Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２６）：１５
４５５〜１５４５８（１９９５）；Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ−１３２（５）：２１５７〜２１６５（１９９３））。これらのう
ちの第１（Ａ型）は、異種１型ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（本明細書中以後
、ＰＴＨ−１レセプター）を欠如する細胞中で非相同的に発現される場合に、骨
細胞および腎細胞の両方から単離され、そしてＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ
ｒＰ（１−３６）に対する複数のシグナル伝達応答を伝達することが示された。

【０００６】

【表２】 ＰＴＨ分子の結合およびシグナル伝達特性に対するそのＰＴＨ分子の特定の領
域の寄与を規定するための以前の試みは、主に、複雑なインビボバイオアッセイ
、器官培養物、異種ＰＴＨ−１レセプターの１つより多い型を発現し得る単離さ
れた細胞膜または細胞株（一般にげっ歯類起源）の使用によって行われてきた。

【０００７】

【表３】 ウシＰＴＨ−（１−３４）の初期の構造／機能研究は、単離された腎臓膜を用
いて実施され、レセプター結合についてのカルボキシル（Ｃ）末端ｂＰＴＨ−（
２５−３４）領域の重要な役割およびＡＣ活性化についてのアミノ（Ｎ）末端（
すなわち、Ｓｅｒ¹）の重要な役割を同定した（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．Ｖ．ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６９８０〜６９８６（１９７９）；Ｔｒｅｇｅａ
ｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．２：５６１〜５６７（１９７５））。以後の研究は、インタクトな尿
細管を用いてかまたは培養された腎細胞もしくは骨細胞を用いて、インビトロで
実施したが、しかし、Ｎ短縮型（Ｎ−ｔｒａｎｓｃａｔｅｄ）アナログ（例えば
、ＰＴＨ−（３−３４））は（ＡＣを刺激し得ないにもかかわらず）、ＰＫＣを
完全に活性化し得、そして特定のＰＫＣ依存性の遠い生物学的応答を調節し得る
ことを示した（Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３
：７１３〜７１９（１９９３）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７〜１２７５（１９９５）；Ｊｏｕｉｓｈ
ｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３〜６０（
１９９２））。ＰＴＨ（１−３４）のアミノ短縮型アナログもまた、いくつかの
細胞中でＰＬＣ活性またはＣａ_i ⁺⁺を増加するが（Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３５２２〜１３５２７（１９８８）；Ｆ
ｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３
２〜３０３９（１９９１）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７〜１２７５（１９９５））、他の細胞におい
ては増加しないことが見出された（Ｒｅｉｄ，Ｉ．Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．２５３（１ Ｐｔ １）：Ｅ４５〜５１（１９８７）；Ｔａｍｕｒａ，
Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：１
３５２〜１３５８（１９８９））。クローニングされたＰＴＨ−１レセプターの
シグナル伝達特性の研究は、ＡＣ、ＰＬＣまたはＣａ_i ⁺⁺の活性化に対してほぼ
独占的に焦点を置かれてきたが（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（７）２７３２〜２７３６（
１９９２）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３２（５）：２０９０〜２０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）３８８４〜３８９１（１９９５）；Ｐｉｎｅ
ｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１〜３８９（１９９６）；Ｊｏｂｅｒ
ｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２〜
５２９２（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ
．２４６（２）：１４９〜１５５（１９９３））、ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰ
ＴＨ−（３−３４）および他のｈＰＴＨフラグメントによるＰＫＣの刺激および
ＰＫＣ依存性イオン輸送の刺激は、ラットＰＴＨ−１レセプターｃＤＮＡを用い
てトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において報告された（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１〜１４９３６（１
９９６））。

【０００８】 まとめると、これらの観察は、ＡＣ／ＰＫＡシグナル伝達の活性化についての
構造決定因子は、ＰＬＣまたはＰＫＣの活性化について必要とされる決定因子と
は異なり、そしてこれらが、それぞれ、ＰＴＨ−（１ー３４）のＮ末端ドメイン
およびＣ末端ドメインに存在するという概念を生じてきた（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍ
ｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９４３〜９４９（
１９９４）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅ
ｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１〜５６７（１９７５）；Ｗｈｉ
ｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．
Ｓｃｉ．１６（１１）：３８２〜３８６（１９９５））。特に、領域ｈＰＴＨ−
（２９−３２）は、重要なＰＫＣ活性化ドメインとして具体的に同定された（Ｊ
ｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：
９４３〜９４９（１９９４）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅ
ｙ，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１６（１１）：３８２〜３８６（
１９９５）。

【０００９】 ラットＰＴＨ−１レセプターのこれらの研究から公知であるものと比較して、
ヒトＰＴＨ−１レセプターに対する結合またはヒトＰＴＨ−１レセプターの種々
のシグナル伝達様式の活性化に必要な、ヒトＰＴＨの構造的特徴に関して利用可
能である情報は、ほとんどない。アラニンスキャニング変異誘発は、ラットＰＴ
Ｈ−１レセプターに対する結合についてｈＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端部分の
重要性を強調させた（３０）。ＣＯＳ−７細胞またはＨＥＫ２９３細胞中にトラ
ンスフェクトされたヒトＰＴＨレセプターの機能的研究は、ｈＰＴＨ−（１−３
４）がＡＣおよびＣａ_i ⁺⁺を活性化するが、ＰＬＣの刺激は一貫して観察されず
、そして報告された応答が適度であったことを、確認した（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら
、Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１〜３８９ （１９９６）；Ｓｅｕｗｅｎ，Ｋ．
ら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１４（８）：１６１３〜１６２０（１９９５
）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２
）：５２８２〜５２９２（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３５１（２）：２８１〜２８５（１９９４）；）。Ｃａ_i ⁺⁺に対す
るｈＰＴＨ−（３−３４）の効果は、同様に議論の余地があるが（Ｐｉｎｅｓ，
Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１〜３８９ （１９９６）；Ｊｏｂｅｒｔ
，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２〜５
２９２（１９９７））、一方、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するシグナル伝達
におけるｈＰＴＨ−（１−３４）分子の他の領域の役割は、全体的に検討されて
いない。合成のｈＰＴＨ−１（１−３０）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ−１（１−２９）Ｎ
Ｈ₂、ｈＰＴＨ−１（１−２８）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ−１（１−２７）ＮＨ₂、およ
びｈＰＴＨ−１（１−２６）ＮＨ₂は、各々、骨芽細胞様ＲＯＳ１７／２細胞に
おける膜結合ＰＫＣの活性を刺激し得なかった（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒら（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ ３４：８８３５〜８８４２（１９９５））。

【００１０】 （発明の要旨） 比較的大きなサイズのネイティブなＰＴＨは、これらのペプチドの骨粗しょう
症の治療としての使用に対する難問を提示する。一般に、このサイズのタンパク
質は、薬物としての使用に適切ではない。なぜなら、このタンパク質は、鼻吸入
のような単純な方法によって有効に送達され得ないからである。その代わり、注
射が必要とされ、そしてＰＴＨの場合、骨形成速度の増加を達成するためには、
毎日またはほぼ毎日の注射が必要とされる可能性が最も高い。さらに、より大き
なペプチドは、従来の合成化学方法によって調製することが技術的に困難でかつ
高価である。組換えＤＮＡおよび細胞に基づく発現系を用いる代替方法もまた、
高価であり、外来タンパク質によって潜在的に汚染され易く、そして送達の問題
を回避しない。

【００１１】 従って、当業者は、より大きなペプチドに基づき、なお依然として所望の生物
学的活性を保持する低分子アナログ（ペプチド性または非ペプチド性のいずれか
）を同定し得ることが有利である。この活性は最初は、インタクトなペプチドと
比較して弱いかもしれないが、さらなる最適化によって増強された効力および効
能となり得る。

【００１２】 本発明者らは近年、充分なＡＣアゴニストであるが、げっ歯類ＰＴＨ−１レセ
プターを介してＰＫＣを活性化し得ないことが他者によって示された（Ｊｏｕｉ
ｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６
０（１９９２））ｈＰＴＨ−（１−３１）が、ＬＬＣ−ＰＫＩ細胞、ＣＯＳ−７
細胞またはＨＥＫ ２９３細胞において発現されたヒトＰＴＨ−１レセプターを
介してＡＣおよびＰＬＣの両方を活性化する際にｈＰＴＨ−（１−３４）と同等
に強力であることを観察した（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．およびＢｒｉｎｇｈｕｒｓｔ
，Ｆ．Ｒ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９（１０）：４２９３−４２９
９（１９９８））。これらの予期せぬ観察は、本発明者らが、ＰＬＣ活性化に特
に焦点をあてて、ヒトＰＴＨ−１レセプターへの結合およびこのレセプターの活
性化におけるｈＰＴＨ−（１−３４）のＮ末端領域およびＣ末端領域の相対的役
割のより詳細な分析を行うのを促した。本発明は、ＰＴＨ−１レセプターを介し
たホスホリパーゼＣシグナル伝達を選択的に変更する、ヒト副甲状腺ホルモンの
アミノ／カルボキシ末端改変物に関する。この予期せぬ知見は、シグナル特異的
ＰＴＨリガンドの設計に対して重要な意味を有する。このようなシグナル特異的
リガンドは、所望のサブセットのＰＴＨ作用のみを誘発する際に有用であり、そ
れゆえ、シグナル特異的リガンドは、完全なセットのＰＴＨ作用によっては適合
されない固有の利点を有し得る。

【００１３】 本発明は、ＰＴＨ（１−２８）ペプチドおよびその誘導体に関する。ＰＴＨ（
１−２８）ペプチド、そのフラグメント、その誘導体、薬学的に受容可能なその
塩、およびそのＮ誘導体またはＣ誘導体を含む、本発明の化合物は、本明細書中
で集合的に「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）１の化合物およびその誘導体」と
呼ばれる。

【００１４】 本発明は、ＰＴＨ（１−２８）の合成および／または組換えの生物学的に活性
なペプチド誘導体を提供する。１つの特定の実施形態では、本発明は、本質的に
以下の式： （ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕ
ＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬ
ｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６もしくは１〜２７を含むそのフ
ラグメント； （ｃ）薬学的に受容可能なその塩；または （ｄ）そのＮ誘導体もしくはＣ誘導体； からなるペプチドと少なくとも９０％同一の、生物学的に活性なペプチドを提供
し、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであるが、但し、上記のペプチドは、ｈＰＴＨ（
１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）ＮＨ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ ₂ ではない。

【００１５】 なおさらなる局面によれば、本発明はまた、以下： （ａ）式： Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬ
ｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒ
ｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）から本質的になるペプチドに少なくとも９
０％同一な生物学的に活性なペプチド； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６もしくは１〜２７を含むそのフラ
グメント； （ｃ）薬学的に受容可能なその塩；または （ｄ）そのＮ誘導体もしくはＣ誘導体； および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供し、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。

【００１６】 なおさらなる局面によれば、本発明は、以下： （ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧ
ｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅ
ｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６または１〜２７を含むそのフラグ
メント； からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドから本質的になる核酸分子を提供し、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。

【００１７】 なおさらなる局面によれば、本発明は、以下を含む組換えＤＮＡ分子を提供す
る：（１）発現制御領域、この領域は、（２）生物学的に活性なペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列、と作動可能に連結されており、ここでこのペプチ
ドは、以下： （ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧ
ｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅ
ｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６または１〜２７を含むそのフラグ
メント； からなる群より選択され、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。

【００１８】 なおさらなる局面によれば、本発明は、骨質量の減少によって特徴付けられる
哺乳動物の状態を処置するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする
被験体に、骨質量を増大するに有効な量の生物学的に活性なペプチドおよび薬学
的に受容可能なキャリアを投与する工程を含み、ここでこのペプチドは、以下：
（ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧ
ｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅ
ｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６もしくは１〜２７を含むそのフラ
グメント； （ｃ）薬学的に受容可能なその塩；または （ｄ）そのＮ誘導体もしくはＣ誘導体； から本質的になる群より選択されるメンバーに少なくとも９０％同一なアミノ酸
配列を含み、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであるが、但し、このペプチドは、ｈＰＴＨ（１
−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）ＮＨ₂、またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ ₂ ではない。

【００１９】 なおさらなる局面によれば、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの変化したか
または過剰な作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供され、この
方法は、この患者のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの活性化を阻害するに充
分な治療有効量の生物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリア
を患者に投与する工程を含み、ここで、このペプチドは、以下： （ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕ
ＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬ
ｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６もしくは１〜２７を含むそのフ
ラグメント； （ｃ）薬学的に受容可能なその塩；または （ｄ）そのＮ誘導体もしくはＣ誘導体； から本質的になる群より選択されるメンバーに少なくとも９０％同一なアミノ酸
配列を含み、ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂はＧｌｕまたはＡｒｇであるが、但し、このペプチドは、ｈＰＴＨ（１２
６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）ＮＨ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂では
ない。

【００２０】 なおさらなる局面によれば、本発明はまた、骨形成、骨再吸収および／または
骨リモデリングの速度を決定する方法を提供し、この方法は、有効量の配列番号
１の標識ペプチドまたはその誘導体を患者に投与する工程、およびこの患者の骨
へのこのペプチドの取り込みを決定する工程を含む。このペプチドは、以下から
なる群より選択される標識を用いて標識され得る：放射性標識、蛍光標識、生物
発光標識、または化学発光標識。適切な放射性標識の例は、^99mＴｃである。

【００２１】 本発明のなおさらなる局面によれば、（当業者に公知の、そして以下で考察さ
れるアッセイによって決定した場合）ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターをアゴ
ナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）ＰＴＨ（１−２８）ペプチドアナログの生物学的
活性を破壊しない、１〜２８位での任意のアミノ酸置換、より具体的にはアミノ
酸１位および／または１９位でのアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内に含まれ
る。

【００２２】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 以下の説明では、組換えＤＮＡ技術およびペプチド合成において用いられる多
数の用語は、広範囲に利用される。このような用語が与えられるべき範囲を含む
、明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下
の定義が提供される。

【００２３】 クローニングベクター：宿主細胞中で自律複製し得、そしてそのＤＮＡ配列が
ベクターの本質的な生物学的機能の喪失を伴わずに決定可能な様式で切断され得
る１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、そし
てその中にＤＮＡフラグメントがスプライスされてその複製およびクローニング
をもたらし得る、プラスミドまたはファージのＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。ク
ローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に用
いられるのに適切なマーカーをさらに含み得る。マーカーは、例えば、テトラサ
イクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する。

【００２４】 発現ベクター：クローニングベクターと類似であるが、宿主中に形質転換され
た後にこのベクターの中にクローニングされた遺伝子の発現を増強し得る、ベク
ター。クローニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列のような、特定の制
御配列の制御下に配置される（すなわち、作動可能に連結される）。プロモータ
ー配列は、構成性または誘導性のいずれかであり得る。

【００２５】 組換え宿主：本発明によれば、組換え宿主は、発現ベクターまたはクローニン
グベクターに所望のクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物宿主細胞
または真核生物宿主細胞であり得る。この用語はまた、その生物の染色体または
ゲノムに所望の遺伝子を含むように遺伝子操作された原核生物細胞または真核生
物細胞を含むことを意味する。このような宿主の例については、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）
を参照のこと。好ましい組換え宿主は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換された
真核生物細胞である。より詳細には、哺乳動物細胞が好ましい。

【００２６】 プロモーター：一般に、開始コドンに近位に配置された、遺伝子の５’領域と
して記載されるＤＮＡ配列。隣接遺伝子の転写は、プロモーター領域で開始され
る。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導因子に応
答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転
写速度は、誘導因子によって調節されない。プロモーターの例としては、ＣＭＶ
プロモーター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＶ４０
プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターおよびｈＭＴＩＩａプロモーター（米国特
許第５，４５７，０３４号）、ＨＳＶ−１ ４／５プロモーター（米国特許第５
，５０１，９７９号）、ならびに前初期ＨＣＭＶプロモーター（ＷＯ９２／１７
５８１）が挙げられる。また、組織特異的エンハンサーエレメントが用いられ得
る。さらに、このようなプロモーターは、ある生物の組織および細胞特異的プロ
モーターを含み得る。

【００２７】 ポリヌクレオチド：この用語は一般に、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮ
Ａまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオ
チドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ）をいう。「ポリヌクレオチド」としては、以下が挙げられるがこ
れらに限定されない：一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖
領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖であり得るか、より代表的に
は二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得る、ＤＮＡとＲＮＡ
とを含むハイブリッド分子。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域をいう。用語ポリヌク
レオチドはまた、１以上の改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに
安定性または他の目的のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含
む。「改変された」塩基としては例えば、トリチル化された塩基および異常な塩
基（例えば、イノシン）が挙げられる。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡに行わ
れている；従って、「ポリヌクレオチド」は、代表的は天然に見出されるような
、化学的、酵素的または代謝敵に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびに
ウイルスおよび細胞に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポ
リヌクレオチド」はまた、しばしば、オリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短
いポリヌクレオチドを含む。

【００２８】 ポリペプチド：この用語は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によ
って互いに連結された２以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク
質（すなわち、ペプチド同配体）をいう。「ポリペプチド」とは、通常ペプチド
、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質
と呼ばれる、より長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によってコード
される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」としては
、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知である
化学修飾技術のいずれかによって改変されたアミノ酸配列が挙げられる。このよ
うな改変は、基本書およびより詳述される研究論文、ならびに研究文献に充分に
記載されている。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端または
カルボキシル末端を含む、ポリペプチド中のどこかで生じ得る。同じ型の改変が
、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し
得ることが認識される。また、所定のポリペプチドは、多くの型の改変を含み得
る。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３および
Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃ
ｔｓ，１−１２頁，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ
編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔ
ｅｒら，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）およびＲａｔ
ｔａｎら，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」，Ａｎｎ Ｎ
Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと。

【００２９】 相同／非相同：２つの核酸分子は、それらのヌクレオチド配列が、ＨＡＳＨコ
ードアルゴリズム（Ｗｉｌｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７２６−７３０（１９８３））に
よって決定したときに４０％を超える類似性を共有する場合、「相同」であると
みなされる。２つの核酸分子は、それらのヌクレオチド配列が、４０％未満の類
似性を共有する場合、「非相同」であるとみなされる。

【００３０】 単離された：天然の状態から「ヒトの手によって」変更されたことを意味する
用語。組成物または物質が天然に存在する場合、単離された形態は、その本来の
環境から変更されているか、もしくは取り出されているか、またはその両方であ
る。例えば、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、「単離され」ていないが、この用語が本明細書中で使用されるよ
うに、天然の状態で共存している物質から分離された同じポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離され」ている。従って、組換え宿主細胞中で産生された
および／または組換え宿主細胞中に含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離されたポリペプチ
ド」または「単離されたポリヌクレオチド」として意図されるのはまた、組換え
宿主細胞から、または天然の供給源から、部分的にまたは実質的に精製されてい
るポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、組換え的に産生された
バージョンの配列番号１の化合物およびその誘導体は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈ
ｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程法によ
って実質的に精製され得る。

【００３１】 同一性：この用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を
いう。一般的に、最大の順序の一致が得られるように、配列は整列される。「同
一性」自体は、当該分野で認識される意味を有し、そして公開された技術を使用
して算出され得る。（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３
；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，
第Ｉ部，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍ
ａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉ
ｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびにＳｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅ
ｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９９１を参照のこと）。２つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチ
ド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、用語「同一性」は
、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩ
ＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。２つの
配列間の同一性または類似性を決定するために通常使用される方法は、以下に開
示される方法を含むが、これらに限定されない：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４、ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．
およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：
１０７３（１９８８）。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュ
ータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定
するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴ
Ａ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３
（１９９０））を含むが、これに限定されない。

【００３２】 フラグメント：分子（例えば、配列番号１の化合物またはその誘導体）の「フ
ラグメント」は、これら分子の任意のポリペプチドサブセットを言及することを
意味する。

【００３３】 機能的誘導体：用語「誘導体」は、分子の「改変体」、その「誘導体」または
「化学的誘導体」含むことを意図する。分子（例えば、配列番号１の化合物、ま
たはその誘導体）の「改変体」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれか
に実質的に類似する分子を言及することを意味する。分子（例えば、配列番号１
の化合物またはその誘導体）の「アナログ」は、配列番号１の分子、またはその
フラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然の分子を言及することを意味
する。

【００３４】 両分子におけるアミノ酸の配列が実質的に同じである場合、および両分子が類
似の生物学的活性を保有する場合、ある分子は別の分子に対して「実質的に類似
」であると言われる。従って、２つの分子が類似の活性を保有するとすれば、そ
の用語は本明細書中では、一方の分子が他方では見出されないさらなるアミノ酸
残基を含む場合、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でさえ使用される
ので、それらは改変体、誘導体、またはアナログであるとみなされる。

【００３５】 本明細書中で使用される場合、ある分子が通常はその分子の一部でないさらな
る化学的部分を含むとき、その分子は、別の分子の「化学的誘導体」であると言
われる。そのような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し
得る。あるいはその部分は、その分子の毒性を減少させ得るが、その分子の任意
の所望しない副作用などを除去または弱毒化し得るなどである。そのような影響
を媒介し得る部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示され、そして当業者に明らかである
。

【００３６】 タンパク質の生物学的活性：この表現は、類似の活性、または改善された活性
または所望しない副作用が減少した活性を含む、配列番号１の化合物またはその
誘導体の代謝的または生理学的な機能をいう。上記の配列番号１の化合物または
その誘導体の抗原活性および免疫原活性もまた含まれる。

【００３７】 遺伝子治療：生物の遺伝子発現の正常なパターンを変化させることに関する治
療手段。一般的に、組み換えポリヌクレオチドは、生体の細胞中または組織中に
導入され、遺伝子発現に変化をもたらす。

【００３８】 宿主動物：生殖細胞および体細胞の全てが、本発明のＤＮＡ構築物を含む、ト
ランスジェニック動物。そのようなトランスジェニック動物は、一般的に脊椎動
物である。好ましい宿主動物は、哺乳動物である（例えば、非ヒト霊長類、マウ
ス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、モルモット、げっ歯類（例えば、ラット）など
）。用語、宿主動物はまた、胚の段階および胎児の段階を含む、発生の全ての段
階における動物を含む。

【００３９】 （Ｉ．配列番号１の化合物およびその誘導体−−構造的特性および機能的特性
） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）は、Ｐ
ＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターを活性化して、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）およ
びホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）における並行的増加を誘発する。ＰＴＨ−（１−
３４）のアミノ（Ｎ）末端領域は、ＡＣ活性化において必須である。ＰＬＣ、Ｐ
ＫＣおよび他のエフェクターの活性化に必要なリガンドドメインは、あまり十分
には定義されていないが、げっ歯類系におけるいくつかの研究では、ＰＫＣ活性
化に関与するコア領域（ＰＴＨ−（２９−３２））が同定されている。ＰＬＣ活
性化における重要なリガンドドメインを決定するために、トランスフェクトされ
た大量のヒトＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターまたはラットＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレ
セプターを安定に発現するＬＬＣ−ＰＫＩ細胞を使用して、一連の短縮型ｈＰＴ
Ｈ−（１−３４）アナログが評価された。

【００４０】 ホスホリパーゼＣシグナル伝達およびリガンド結合親和性は、ｈＰＴＨ−（１
−３４）のカルボキシル（Ｃ）末端短縮化により減少したが、ＡＣおよびＰＬＣ
の両方を完全に活性化し得る最も短いｈＰＴＨペプチドであるｈＰＴＨ−（１−
２８）中に結合増強置換（Ｇｌｕ¹⁹→Ａｒｇ¹⁹）を、配置した場合、協調的に回
復した。ホスホリパーゼＡＣではなく、ホスホリパーゼＣの活性は、ｈＰＴＨ−
（１−３４）においてＧｌｙ¹でＳｅｒ¹を置換することによって減少し、そして
残基１またはαアミノ基のいずれかを単独で除去することによって消去された。
これらの変化は結合親和性を変化させなかった。これらの知見は顕著にシグナル
選択性であり、ＰＬＣ活性はないが全てのＡＣ活性を有する、アナログ［Ｇｌｙ ¹ ，Ａｒｇ¹⁹］ ｈＰＴＨ−（１−２８）の設計を導いた。従って、ｈＰＴＨの
最Ｎ末端は、ＰＬＣと連結するための活性化ドメインの一部を構成する。Ｃ末端
領域（特にｈＰＴＨ−（２８−３１））は、結合への影響を通してＰＬＣ活性化
に寄与する：領域ｈＰＴＨ−（２９−３４）は全てのＰＬＣ活性化にとって明ら
かに必要ではない。ｈＰＴＨ−（１−３４）におけるＡＣ活性化およびＰＬＣ活
性化のＮ末端決定基は、この領域におけるわずかな改変が、これら２つのエフェ
クターの活性化を分離し得るので、重複しているが同一ではない。特に、［Ｇｌ
ｙ¹，Ａｒｇ¹⁹］ ｈＰＴＨ−（１−２８）アナログは、ＰＴＨのＰＬＣ依存性
作用からＡＣ依存性作用を分離するのに有用である。

【００４１】 本発明は、ｈＰＴＨ（１−２８）ペプチドおよびその誘導体に関する。ｈＰＴ
Ｈ（１−２８）ペプチド、そのフラグメント、その誘導体、その薬学的に受容可
能な塩類、およびそのＮ誘導体またはＣ誘導体を含む本発明の化合物は、「配列
番号１の化合物およびその誘導体」として、本明細書中で以下に集団的に言及さ
れる。

【００４２】 詳細には、本発明は、ｈＰＴＨ（１−２８）の合成および／または組換えの、
生物学的に活性なペプチド誘導体を提供する。１つの特定の実施形態において、
本発明は、以下の式から本質的になるペプチドに対して、少なくとも９０％同一
の生物学的に活性なペプチドを提供する： （ａ）Ｘ₀₁ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕ
ＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＸ₀₂ＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬ
ｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１）； （ｂ）アミノ酸１〜２４、１〜２５、１〜２６、または１〜２７を含むそのフラ
グメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；または （ｄ）そのＮ誘導体またはＣ誘導体； ここでは： Ｘ₀₁はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂はＧｌｕまたはＡｒｇであるが、 ただし、上記のペプチドは、ｈＰＴＨ（１〜２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７
）ＮＨ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。

【００４３】 従って、本発明は、強力で小さなシグナル選択性ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセ
プターアゴニストである新規のｈＰＴＨ（１−２８）誘導体を提供する。好まし
い実施形態において、ｈＰＴＨ（１−２８）誘導体は、残基１および１９で変更
されている。最も好ましくは、本発明は、ｈＰＴＨ（１−２８）の１位でのセリ
ンについてアラニンまたはグリシンのアミノ酸置換、およびｈＰＴＨ（１−２８
）の１９位でのグルタミンについてアルギニンのアミノ酸置換を有するｈＰＴＨ
（１−２８）誘導体を含む。

【００４４】 さらに、ｈＰＴＨ（１−２８）誘導体が、（当業者に公知のアッセイおよび以
下で議論されるアッセイによって決定される場合、）ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レ
セプターをアゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｅ）またはアンタゴナイズ（ａｎｔａｇｏ
ｎｉｚｅ）する能力を破壊しない天然の任意の他のアミノ酸置換もまた本発明の
範囲内に含まれる。

【００４５】 タンパク質の産物として、本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体は、
液相ペプチド合成技術または固相ペプチド合成技術によって産生される。特に、
固相ペプチド合成技術は、ヒトＰＴＨの産生において首尾よく適用され、そして
本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体の産生のために使用され得る（ガ
イダンスについては、Ｋｉｍｕｒａら、前出を参照のこと、およびＦａｉｒｗｅ
ｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２６９１（１９８３）を参照のこと）。比較的
大規模でヒトＰＴＨを産生することの成功は、本明細書中で参考文献として援用
されるＧｏｕｄら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．６（８）：７８１（１９９
１）により報告されている。合成的ペプチド合成アプローチは、一般的に、自動
化合成機および固相としての適切な樹脂の使用を伴い、その樹脂に所望の配列番
号１の化合物またはその誘導体のＣ末端アミノ酸が付着される。次いで、Ｎ末端
方向におけるペプチドの伸長は、代表的には合成が完了するまで、ＦＭＯＣまた
はＢＯＣのいずれかに基づく化学的プロトコルを使用して、適切に保護された形
態の次の所望のアミノ酸を首尾よく連結することによって達成される。次いで保
護基は、通常、樹脂からのペプチドの切断と同時にペプチドから切断され、そし
て、次いでそのペプチドは、従来の技術を使用して（例えば、溶媒としてアセト
ニトリルを、およびイオン対剤としてトリフルオロ酢酸を用いた逆相ＨＰＬＣに
よって）単離および精製される。そのような手順は一般的に、莫大な刊行物に記
載され、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に対する参照が
行われ得る。ペプチド合成のアプローチは、遺伝子にコードされていないアミノ
酸を取り込む、配列番号１の改変体およびその誘導体の改変体の産生のために必
要とされることが認識される。

【００４６】 本発明の別の局面に従って、置換基は、当該分野で公知の標準的な方法によっ
て、配列番号１の化合物またはその誘導体のＮ末端アミノ酸の遊離のアミンに付
着され得る。例えば、アルキル基（例えば、Ｃ_1-12アルキル）を、還元的アルキ
ル化を用いて付着させ得る。ヒドロキシアルキル基（例えば、Ｃ_1-12ヒドロキシ
アルキル）もまた、還元的アルキル化を使用して付着させ得、ここで、遊離の水
酸基はｔ−ブチルエステルで保護される。アシル基（例えば、ＣＯＥ₁）を、遊
離の酸（例えば、Ｅ₁ＣＯＯＨ）をＮ末端アミノ酸の遊離のアミノに連結するこ
とによって付着させ得る。依然として生物学的活性を保持する配列番号１の化合
物またはその誘導体の、二次構造もしくは三次構造、または安定性を変更する、
配列番号１の化合物およびその誘導体もまた、本発明の範囲内で意図される。そ
のような誘導体は、ラクタム環化、ジスルフィド結合、または当業者に公知の他
の手段を通して達成され得る。

【００４７】 本発明の最も好ましい実施形態の中には、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター
のシグナル選択的アゴニストとして働く化合物がある。特に、好ましい実施形態
は、Ｘ₀₁がＧｌｙであり、そしてＸ₀₂がＡｒｇである化合物である。従って、こ
の好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＧｌｙＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎ
ＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔ
ＡｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号２
）またはその誘導体である。［［Ｇｌｙ¹Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−２８）］。

【００４８】 好ましい実施形態の別のセットは、配列番号２のカルボキシ末端に１つのアミ
ノ酸欠失を有する化合物であり、ここで、Ｘ₀₁はＧｌｙであり；そしてＸ₀₂はＡ
ｒｇである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＧｌｙＶａｌＳ
ｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬ
ｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬ
ｙｓ（配列番号３）またはその誘導体である。［［Ｇｌｙ¹Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ
（１−２７）］。

【００４９】 本発明の好ましい実施形態の中には、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの非
シグナル選択的アゴニストとして働く化合物がある。特に、好ましい実施形態は
、Ｘ₀₁がＡｌａであり；そしてＸ₀₂がＡｒｇである化合物である。従って、この
好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＡｌａＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬ
ｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡ
ｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号４）
またはその誘導体である。［［Ａｌａ¹Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−２８）］。

【００５０】 好ましい実施形態の別のセットは、配列番号４のカルボキシ末端に１つのアミ
ノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、Ｘ₀₁はＡｌａであり；そしてＸ₀₂は
Ａｒｇである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＡｌａＶａｌ
ＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓ
Ｌｙｓ（配列番号５）またはその誘導体である。［［Ａｌａ¹Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴ
Ｈ（１−２７）］。

【００５１】 好ましい実施形態の別のセットは、Ｘ₀₁がＳｅｒであり；そしてＸ₀₂がＡｒｇ
である化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、Ｓｅｒ
ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓ
ＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号６）またはその誘導体である。［［Ａｒｇ¹⁹］ｈ
ＰＴＨ（１−２８）］。

【００５２】 好ましい実施形態の別のセットは、配列番号６のカルボキシ末端に１つのアミ
ノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、Ｘ₀₁はＳｅｒであり；そしてＸ₀₂は
Ａｒｇである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＳｅｒＶａｌ
ＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＡｒｇＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓ
Ｌｙｓ（配列番号７）またはその誘導体である。［［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−
２７）］。

【００５３】 好ましい実施形態の別のセットは、Ｘ₀₁がＡｌａであり；そしてＸ₀₂がＧｌｕ
である化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、Ａｌａ
ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓ
ＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号８）またはその誘導体である。［［Ａｌａ¹］ｈ
ＰＴＨ（１−２８）］。

【００５４】 好ましい実施形態の別のセットは、配列番号８のカルボキシ末端に１つのア
ミノ酸欠失を有する化合物であり、ここで、Ｘ₀₁はＡｌａであり；そしてＸ₀₂は
Ｇｌｕである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＡｌａＶａｌ
ＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉｓ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓ
Ｌｙｓ（配列番号９）またはその誘導体である。［［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−
２７）］。

【００５５】 好ましい実施形態の別のセットは、Ｘ₀₁がＧｌｙであり；そしてＸ₀₂がＧｌｕ
である化合物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ
ＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓ
ＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇ
ＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１０）またはその誘導体である。［［Ｇｌｙ¹］
ｈＰＴＨ（１−２８）］。

【００５６】 好ましい実施形態の別のセットは、配列番号１０のカルボキシ末端に１つのア
ミノ酸欠失を有する化合物であり、そこでは、Ｘ₀₁はＧｌｙであり；そしてＸ₀₂ はＧｌｕである。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、ＧｌｙＶａ
ｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙＬｙｓＨｉ
ｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕＡｒｇＬｙ
ｓＬｙｓ（配列番号１１）またはその誘導体である。［［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（
１−２７）］。

【００５７】 好ましい実施形態の別のセットは、Ｘ₀₁がＳｅｒであり；そしてＸ₀₂がＧｌｕ
である薬学的組成物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、
ＳｅｒＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙ
ＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕ
ＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕ（配列番号１２）またはその誘導体である。［ｈＰＴ
Ｈ（１−２８）］。

【００５８】 好ましい実施形態の別のセットは、Ｘ₀₁がＳｅｒであり；そしてＸ₀₂がＧｌｕ
である薬学的組成物である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、
ＳｅｒＶａｌＳｅｒＧｌｕＩｌｅＧｌｎＬｅｕＭｅｔＨｉｓＡｓｎＬｅｕＧｌｙ
ＬｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬｅｕ
ＡｒｇＬｙｓＬｙｓ（配列番号１３）またはその誘導体である。［ｈＰＴＨ（１
−２７）］。

【００５９】 （ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞および組換え体の発現） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび本発明のベク
ターで遺伝子操作されている宿主細胞ならびに組換え技術による本発明のポリペ
プチドの産生に関する。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来する
ＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産生するために使用され得る。

【００６０】 組換え産生については、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドについて発現
系またはその部分を取り込むように遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチドの宿
主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉ
ｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ
ｌｏａｄｉｎｇ）、衝撃導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
）または感染のような、多くの標準実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら、
Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１
９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載の方法によって達成され得る。

【００６１】 適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細
胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびＢｏ
ｗｅｓメラノーマ細胞）ならびに植物細胞が挙げられる。

【００６２】 極めて多様な発現系が使用され得る。そのような系としては、とりわけ、染色
体性の系、エピソーム性の系およびウイルス由来の系（例えば、細菌プラスミド
由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来のベ
クター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレメント由来のベクター、酵母
染色体エレメント由来のベクター、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポ
ーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス由来のベクター、なら
びにそれらの組合わせに由来するベクター（例えば、プラスミドの遺伝的エレメ
ントとバクテリオファージの遺伝的エレメントに由来するベクター（例えば、コ
スミドおよびファージミド））が挙げられる。発現系は、発現を調節および発生
させる制御領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリペプチドを産生するた
めにポリヌクレオチドを維持、繁殖または発現するのに適している任意の系また
はベクターが使用され得る。適切なヌクレオチド配列は、任意の多様な周知の、
および慣用的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（前出）に示される技術
など）によって発現系中に挿入され得る。

【００６３】 ＲＮＡベクターはまた、本発明に開示される配列番号１の化合物またはその誘
導体をコードする核酸の発現のために利用され得る。これらのベクターは、広範
な多様性の真核生物細胞において天然に複製する、＋鎖ＲＮＡウイルスまたは−
鎖ＲＮＡウイルスに基づいている（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．およびＲｉ
ｃｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：２９７〜３１０、１９９２）。レトロ
ウイルスとは異なり、これらのウイルスは、中間のＤＮＡ生活環相を欠失し、全
体的にＲＮＡ形態で存在する。例えば、αウイルスは、広い範囲の宿主細胞にお
いて利用され得、そして高レベルの発現を提供するので、外来タンパク質の発現
ベクターとして使用される；この型のウイルスの例としては、シンドビスウイル
ス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）およびセムリキ森林ウイルスが含まれる（Ｓ
ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１８〜２２、１９９３；
Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９
３：１１３７１〜１１３７７，１９９６）が挙げられる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
のＳｉｎｂｉｓ発現系により例示されるように研究者は、実験室において組換え
分子をＤＮＡ形態（ｐＳｉｎｒｅｐ５プラスミド）で簡便に維持し得るが、ＲＮ
Ａ形態での繁殖もまた実施可能である。発現に使用される宿主細胞では、目的の
遺伝子を含むベクターは、完全にＲＮＡ形態で存在し、そして所望の場合はその
状態で継続的に繁殖され得る。

【００６４】 小胞体の内腔への、ペリプラズム空間への、または細胞外環境への翻訳された
タンパク質の分泌について、適切な分泌シグナルが、所望のポリペプチドに組み
込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得、また
はこれらのシグナルは、異種シグナルであり得る。

【００６５】 ＤＮＡ配列の発現は、転写調節情報および翻訳調節情報を含むＤＮＡ配列に「
作動可能に連結した」ＤＮＡ配列を必要とする。作動可能な連結は、制御ＤＮＡ
配列または調節ＤＮＡ配列、および発現されることが求められるＤＮＡ配列が、
遺伝子発現を可能にするような方法で結合した連結である。遺伝子発現に必要と
される「制御領域」の正確な性質は、生物体間で変化し得るが、一般に、原核生
物細胞において、プロモーター（ＲＮＡの転写の開始を指向する）、ならびにＤ
ＮＡ配列（ＲＮＡに転写されるときに、タンパク質合成の開始をシグナル伝達す
る）の両方を含むプロモーター領域を含むはずである。真核生物細胞における調
節領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含
む。

【００６６】 ２つのＤＮＡ配列が、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が以下の場合に、作動
可能に連結すると言われている。（１）この性質が、フレームシフト変異の導入
の結果ではないこと、（２）この性質が、プロモーター領域の配列が融合タンパ
ク質コード配列の転写を指向する能力を妨げないこと、または（３）この性質が
、融合タンパク質コード配列がプロモーター領域配列によって転写される能力を
妨げないこと。従って、プロモーター領域が、このＤＮＡ配列を転写し得る場合
に、プロモーター領域は、ＤＮＡ配列に作動可能に連結する。

【００６７】 本発明の発現ベクターを産生するために、種々のＤＮＡフラグメントの接合が
、従来技術（連結のための平滑末端化された末端、または付着末端化された末端
の利用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合の付着末端の充
填、所望されない接合を避けるためのアルカリおよびホスファターゼ処理、およ
び適切なリガーゼを用いた連結）に従って、行われる。融合タンパク質の場合に
おいては、遺伝的構築物が、融合タンパク質の５’遺伝子配列へ作動可能に連結
した誘導性のプロモーターをコードし、融合タンパク質の効率的な発現を可能に
する。

【００６８】 原核生物細胞において（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどのようなものにおいて）、
配列番号１の化合物、またはその誘導体を発現するために、機能的な原核生物プ
ロモーターに対して配列番号１をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結するこ
とが必要である。このようなプロモーターは、構成的、またはより好ましくは、
調節可能的（すなわち、誘導性、または抑制性）のどちらかであり得る。構成的
なプロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐ
ＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２
５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモー
ターなどが挙げられる。誘導性の原核生物プロモーターの例としては、バクテリ
オファージλの主要右プロモーターおよび主要左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ
）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃＡプロモーター
、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩプロモーター
およびＥ．ｃｏｌｉのｇａｌプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラ
ーゼ特異的プロモーター（Ｕｌｍａｎｅｎ，Ｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６２：１７６−１８２（１９８５））およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８特
異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｇｅｎｅ ３２：１１−２０（
１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒ
ｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ． Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１
９８２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ，Ｊ．
Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８（１９８６））
が挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．、Ｊ．Ｉｎｄ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ
，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６（１９８６）；およびＧｏ
ｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（
１９８４）によって概説されている。

【００６９】 発現が、真核生物細胞（例えば、酵母、真菌類、哺乳動物細胞または植物細胞
）において所望される場合、このような真核生物宿主における転写を指向し得る
プロモーターを利用することが必要である。好ましい真核生物プロモーターとし
ては、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペ
スウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．、Ｃｅｌｌ ３１：３
５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ２９０：３０４−３１０（１９８１））
；および酵母のｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ７９：６９７１−６９７
５（１９８２））；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））が挙げられる。

【００７０】 好ましくは、導入されたＤＮＡ配列は、レシピエント宿主において自律複製し
得るプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。任意の広範な種々のベ
クターが、この目的のために利用され得る。特定のプラスミドまたはウイルスベ
クターの選択における重要性の因子としては、以下が挙げられる：ベクターを含
むこれらのレシピエント細胞が認識され得、そしてベクターを含まないこれらの
レシピエント細胞から選択され得ることが容易であること；特定の宿主において
所望されるベクターのコピーの数；および異なる種の宿主細胞間のベクターを「
シャトル」し得ることが望ましいか否か。

【００７１】 好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製し得るような
プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ
１８４、πＶＸ）が挙げられるが、これらには限定されない。このようなプラス
ミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９
８２）によって開示される。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、Ｇａｒ
ｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９（１
９８９）において記載されるｐＧＦＰ−１プラスミド、または、Ｓｔｕｄｉｅｒ
およびＤｕｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０
−８９（１９９０）によって記載される、ｐＥＴベクターの１つに基づいた改変
されたプラスミドが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１
９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇ
ｒｙｃｚａｎ，Ｔ．、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ ３０７−３２９
頁（１９８２）によって開示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミ
ドとしては、ｐＩＪＩＯＩ（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． １６９：４１７７−４１８３（１９８７））およびφＣ３１のようなス
トレプトミセスバクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｓｉｘｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ、Ｂｕｄａｐ
ｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ、４５−５４頁（１９８６））が挙げられる。シュード
モナスプラスミドは、Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
８：６９３−７０４（１９８６）、およびＩｚａｋｉ，Ｋ．，Ｊｏｎ．Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８）によって概説される。

【００７２】 好ましい真核生物発現ベクターとしては、ＢＰＶ、ワクシニア、２−ミクロン
環（２−ｍｉｃｒｏｎ ｃｉｒｃｌｅ）などが挙げられるが、これらには限定さ
れない。このような発現ベクターは当該分野において周知である（Ｂｏｔｓｔｅ
ｉｎ，Ｄ．ら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９
８２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙ
ｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
４４５−４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ ２８：２
０３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ
．、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔ
ｉｓｅ、第３巻、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、ＮＹ、５６３−６０８頁（１９８０））。

【００７３】 微生物に加えて、多細胞生物体由来の細胞の培養物もまた、宿主として用いら
れ得る。原則として、任意のこのような細胞培養物は、脊椎動物細胞源でも無脊
椎動物細胞源由来でも、実行可能である。しかし、興味は、脊椎動物源由来の細
胞に対して、より大きくなっている。有用な脊椎動物宿主細胞株の例としては、
ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
株、ＷＩ３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株ならびにＭＤＣＫ細胞株
が挙げられる。このような細胞についての発現ベクターとしては、通常、（必要
ならば）複製起点、発現されるべき遺伝子に対して前方または上流に位置するプ
ロモーター、任意の必要なリボソーム結合部位に加えて、ＲＮＡスプライス部位
、ポリアデニル化部位および転写終結配列が挙げられる。

【００７４】 哺乳動物細胞の使用については、発現ベクター上での制御機能が、しばしば、
ウイルス物質によって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、
ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびサイ
トメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよびＳＶ
４０ウイルスの後期プロモーターは、特に有用であり、なぜなら、両方のプロモ
ーターが、ＳＶ４０ウイルスの複製起源もまた含むフラグメントとして、ウイル
スから容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１
３（１９７８））。

【００７５】 複製起点は、例えば、ＳＶ４０ウイルス源または他のウイルス源（例えば、ポ
リオーマ源、アデノ源、ＶＳＶ源、ＢＰＶ源）由来であり得る、外因性起点を含
むためのベクターの構築によっていずれかを提供され得るか、あるいは、宿主細
胞染色体複製メカニズムによって提供され得る。ベクターが、宿主細胞染色体に
組み込まれる場合には、後者がしばしば十分である。

【００７６】 手強い細胞膜バリアを含まない細胞が宿主細胞として用いられる場合、トラン
スフェクションは、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ５２：５４６（１９７８）によって記載されるような、リン酸カルシウム
沈殿法によって行われる。しかし、例えば、核インジェクションによって、また
はプロトプラスト融合によって、ＤＮＡを細胞へ導入するための他の方法もまた
、用いられ得る。遺伝子治療の場合においては、トランスフェクション促進剤（
例えば、これに限定されないが、リポソーム）を伴っても伴わなくても、直接裸
のプラスミドまたはウイルスＤＮＡインジェクション方法は、哺乳動物細胞のイ
ンビボまたはインビトロでのトランスフェクションの、現在の方法に対する代替
のアプローチを提供する。原核生物細胞、または実質的な細胞壁構築物を含む細
胞が用いられる場合、トランスフェクションの好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）
において記載されるように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

【００７７】 （ＩＶ． 配列番号１の化合物またはその誘導体の投与および治療的有用性） （（Ａ） 配列番号１の化合物またはその誘導体の投与） 一般に、本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体、あるいはその塩を、
１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ体重と１μｇ／ｋｇ体重の間の量で、好ましく
は、１日あたり約０．０７μｇ／ｋｇ体重〜０．２μｇ／ｋｇ体重の量で投与す
る。５０ｋｇのヒト女性被験体について、生物学的に活性な配列番号１の化合物
またはその誘導体の日用量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ、好ましくは、約３．
５μｇ〜約１０μｇである。他の哺乳動物、例えば、ウマ、イヌおよびウシにお
いては、より高い用量が、必要とされ得る。この投薬量は、最も効果的な結果を
得るために必要とされる場合、１回の投与によって、多数の適用によって、また
は制御された放出を介して、好ましくは、１日１回以上の注射によって、従来の
薬学的組成物において送達され得る。最も好ましくは、この投薬量は、鼻吸入法
によって、従来の薬学的化合物において送達され得る。

【００７８】 正確な用量および化合物および最も適切な送達レジメンの選択は、特に、選択
された配列番号１の化合物またはその誘導体の薬学的性質、処置されている状態
の性質および重症度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神明瞭度によ
って影響される。

【００７９】 代表的な好ましい送達レジメンとしては、経口レジメン、非経口レジメン（皮
下的、経皮的、筋肉内および静脈内を含む）直腸レジメン、頬レジメン（舌下を
含む）、経皮的レジメンならびに鼻内吸入法レジメンが挙げられるが、これらに
限定されない。

【００８０】 薬学的に受容可能な塩は、毒性の副作用なしに、配列番号１の化合物またはそ
の誘導体の、所望された生物学的活性を保持する。このような塩の例は、（ａ）
例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸を用いて形成され
る酸付加塩；および例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、
フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タン
ニン酸、パモイン酸（ｐａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸、ポリグルタミン
酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ポリガラクツロン酸などの有機酸を用い
て形成される塩；（ｂ）例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグ
ネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属
陽イオン；またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジア
ミンから形成される有機陽イオンを用いて形成される塩基付加塩；あるいは（ｃ
）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ（例えば、亜鉛のタンニン酸塩（ｚｉｎｃ
ｔａｎｎａｔｅ ｓａｌｔ）など）である。

【００８１】 本発明のさらなる局面は、薬学的に受容可能な非毒性キャリアとの混合物にお
ける、本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体、あるいは薬学的に受容可
能なその塩を活性成分として含む薬学的組成物に関する。上記の通り、このよう
な組成物は、非経口（皮下、経皮、筋肉内または静脈内）投与（特に液体溶液ま
たは液体懸濁液の形態で）；経口または頬の投与（特に、錠剤またはカプセルの
形態で）；直腸、経皮投与；および鼻腔内投与（特に、散剤、鼻のドロップまた
はエアロゾルの形態で）のために調製され得る。

【００８２】 この組成物は、単位投薬形態で便利に投与され得、そして、例えば、本明細書
中で参考として援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、（１９８５）において記載されるように、薬学
分野において周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方
物は、賦形剤として、滅菌水または生理食塩水、アルキレングリコール（例えば
、プロピレングリコール）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレン
グリコール）、植物起源の油、水素化されたナフタレンなどを含み得る。経口投
与については、処方物は、胆汁酸塩またはアシルカルニチンの添加によって増強
され得る。鼻の投与についての処方物は、固体であり得、そして賦形剤（例えば
、乳糖またはデキストラン）を含み得、あるいは、鼻のドロップまたは計量スプ
レーの形態における使用について、水性溶液または油性溶液であり得る。頬の投
与について、代表的な賦形剤としては、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリ
ン酸マグネシウム、アルファ化デンプン（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎａｔｅｄ ｓｔ
ａｒｃｈ）などが挙げられる。

【００８３】 投与の最も好ましい経路のために処方される場合、鼻の投与（鼻の粘液の膜を
横切った吸収）は、約０．２重量パーセントと１５重量パーセントの間の範囲の
量における、好ましくは、約０．５重量パーセントと４重量パーセントの間、最
も好ましくは、約２重量パーセントの範囲の量における、例えば、グリココール
酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸（ｅｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉ
ｄ）、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコデ
オキシコール酸（ｇｌｙｃｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、シクロデキ
ストリンなどのような界面活性剤の酸によって増強され得る。

【００８４】 長期間（例えば、１週間〜１年）にわたる被験体への本発明の化合物の送達は
、所望の放出期間にわたって十分に活性な成分を含む制御された放出システムの
１回の投与によって達成され得る。種々の制御された放出システム（例えば、モ
ノリシックのマイクロカプセルまたはリザーバー型マイクロカプセル、デポーイ
ンプラント、浸透圧ポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導
入デバイスおよび代替の注入可能な投薬形態）が、この目的のために利用され得
る。活性成分の送達が所望される部位における局在は、いくつかの制御された放
出デバイスのさらなる特徴であり、これは、特定の障害の処置において有利であ
ることを証明し得る。

【００８５】 制御された放出処方物の１つの形態は、本明細書中で参考として援用されるＫ
ｅｎｔ、Ｌｅｗｉｓ、ＳａｎｄｅｒｓおよびＴｉｃｅの米国特許第４，６７５，
１８９号の先駆的研究において記載されるように、分散されるか、あるいはゆっ
くりと分解し、非毒性、非抗原性ポリマー（例えば、コポリ乳酸／コポリグリコ
ール酸）にカプセル化されるポリペプチドまたはその塩を含む。化合物、または
好ましくは、それらの比較的不溶性の塩はまた、コレステロールまたは他の脂質
マトリックスペレット、あるいはシラストマー（ｓｉｌａｓｔｏｍｅｒ）マトリ
ックスインプラントにおいて、処方され得る。さらなる遅い放出、デポーインプ
ラントまたは注入可能な処方物は、当業者に明らかである。例えば、本明細書中
で参考として援用されるＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏ
ｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９７８、およびＲ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７を参照のこと。

【００８６】 ＰＴＨのように、配列番号１の化合物およびその誘導体は、所定の臨床状態の
処置において有用な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗しょう
症および他の骨関連障害の処置の場合、配列番号１の化合物およびその誘導体は
、カルシウム栄養補助食品またはビタミンＤアナログと組み合わせて投与され得
る（米国特許第４，６９８，３２８号を参照のこと）。あるいは、配列番号１の
化合物およびその誘導体は、例えば、米国特許第４，７６１，４０６号に記載の
ように、好ましくは、ビスホスホネートと組み合わせた周期的治療レジメンを用
いて投与され得るか、または、１つ以上の骨治療薬剤（例えば、これらに限定さ
れないが、カルシトニンおよびエストロゲン）と組み合わせた周期的治療レジメ
ンを用いて投与され得る。

【００８７】 （（Ｂ） 配列番号１の化合物またはその誘導体の治療的有用性） 本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体は、骨質量の損失によって明ら
かになる種々の哺乳動物の状態の予防および処置について有用である。特に、本
発明の化合物は、ヒトにおける骨粗しょう症および骨減少症の予防および治療的
処置について指示される。さらに、本発明の化合物は、他の骨疾患の予防および
治療的処置について指示される。本発明の化合物は、上皮小体機能低下症の予防
および治療的処置について指示される。最後に、本発明の化合物は、骨折修復の
ためのアゴニストとして、および高カルシウム血症のアンタゴニストとしての使
用について指示される。

【００８８】 高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、ＰＴＨおよび
ＰＴＨｒＰとＰＴＨ−１レセプターおよびＰＴＨ−２レセプターとの間の相互作
用に関する。高カルシウム血症は、血清のカルシウムレベルにおいて、異常な上
昇が存在する状態である；これは、しばしば、他の疾患（上皮小体機能亢進症、
骨粗しょう症、乳房、肺および前立腺の癌腫、頭部および頸部の類表皮癌ならび
に食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、ならびに副腎腫を含む）に関連する。低カル
シウム血症（血清カルシウムレベルが異常に低い状態）は、事実上のＰＴＨの欠
乏（例えば、甲状腺手術後）から生じ得る。

【００８９】 配列番号１の化合物またはその誘導体をコードする本発明の核酸はまた、選択
された組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーと連結され、そして
得られたハイブリッド遺伝子が標準的な方法（例えば、本明細書中で参考として
援用される、Ｌｅｄｅｒら、米国特許第４，７３６，８６６号によって記載され
るような）によって、初期発生期（例えば、受精卵母細胞期）に動物胚へ導入さ
れ、選択された組織において、配列番号１の化合物またはその誘導体の上昇した
レベルを発現するトランスジェニック動物を産生し得る（例えば、骨についての
オステオカルシンプロモーター）。このようなプロモーターは、トランスジェニ
ック動物において、配列番号１の化合物またはその誘導体の組織特異的発現を指
向するために用いられる。

【００９０】 さらに、ＰＴＨアナログが、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター（当業者に公
知のアッセイによって決定され、そして以下で議論するように）をアンタゴナイ
ズまたはアゴナイズする能力を破壊しない、任意の他のアミノ酸置換の性質が、
本発明の範囲に含まれる。

【００９１】 「アゴニスト」によって、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターによって媒介さ
れる細胞応答を増強または強力にし得るリガンドが意図される。「アンタゴニス
ト」によって、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターによって媒介される細胞応答
を阻害し得るリガンドが意図される。本発明の任意の候補「アゴニスト」または
「アンタゴニスト」が、このような細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得るか
は、当該分野で公知のタンパク質リガンド／レセプター細胞応答または結合アッ
セイ（本出願の他の場所に記載されるアッセイを含む）を用いて決定され得る。

【００９２】 本発明のよりさらなる局面に従って、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの変
化した作用または過剰な作用から生じた医学的障害を処置するための方法であっ
て、治療的に有効な（患者のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの活性化を阻害
するに十分な）量の配列番号１の化合物またはその誘導体を、この患者に投与す
る工程を包含する方法が提供される。

【００９３】 この実施形態において、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの変更される作用
から生じる障害を有すると疑われる患者が、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター
の選択的アンタゴニストである本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体を
用いて処置され得る。このようなアンタゴニストとしては、（本明細書中に記載
されるアッセイにより）ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター媒介細胞活性化を妨
害するように決定されている、本発明の配列番号１の化合物もしくはその誘導体
、または類似の特性を有する他の誘導体が挙げられる。

【００９４】 このアンタゴニスト、配列番号１の適切な化合物またはその誘導体を投与する
ために、一般に適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、生理的食塩水）で処方さ
れていることにより、そして好ましくは、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターに
結合する配列番号１の化合物またはその誘導体の適切な阻害を提供する投薬量で
、静脈内に、筋内に、皮下に、経口に、または鼻腔に投与されることにより、医
薬の製造において使用される。代表的な投薬量は、１日あたり体重１ｋｇあたり
１ｎｇ〜１０ｍｇのペプチドである。

【００９５】 好ましい実施形態では、この方法において使用される配列番号１の化合物また
はその誘導体は、アミノ末端に１つのアミノ酸欠失を有する。この好ましい実施
形態において、ＰＴＨアナログは、［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（２−２８）である。
さらに別の好ましい実施形態では、この方法において使用される配列番号１の化
合物またはその誘導体は、アミノ末端に２つのアミノ酸欠失を有する。この好ま
しい実施形態において、ＰＴＨアナログは、［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（３−２８）
である。

【００９６】 本発明のなおさらなる局面に従って、骨粗しょう症を処置するための方法（こ
の患者のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを活性化するのに十分な、配列番号
１の化合物またはその誘導体の治療的有効量の患者への投与を包含する）が、提
供される。ＰＴＨアンタゴニストについて上記に記載のような類似の投薬量およ
び投与が、例えば、骨粗しょう症、他の代謝性骨障害、および上皮小体機能低下
症および関連する障害のような状態の処置のために、ＰＴＨアゴニストの投与に
ついて使用され得る。

【００９７】 好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号１の化合物
またはその誘導体は、配列番号１の化合物の１位のアミノ酸においてセリンの代
わりにアラニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、
ＰＴＨ誘導体は、［Ａｒｇ¹］ｈＰＴＨ（１−２８）（配列番号８）である。別
の好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号１の化合物
またはその誘導体は、配列番号１の１９位においてグルタミンの代わりにアルギ
ニンを用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、ＰＴＨ誘導
体は、［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−２８）（配列番号６）である。別の好ましい
実施形態では、この方法において使用される配列番号１の化合物またはその誘導
体は、配列番号１の１位においてセリンの代わりにグリシンを用いるアミノ酸置
換を有する。この特定の実施形態において、ＰＴＨ誘導体は、［Ｇｌｙ¹］ｈＰ
ＴＨ（１−２８）（配列番号１０）である。別の好ましい実施形態において、こ
の方法において使用される配列番号１の化合物またはその誘導体は、配列番号１
の１位のアミノ酸においてセリンの代わりにアラニンを用いるアミノ酸置換、お
よび配列番号１の１９位においてグルタミンの代わりにアルギニンを用いるアミ
ノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、ＰＴＨ誘導体は、［Ａｌａ¹
Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−２８）（配列番号４）である。別の好ましい実施形態
において、この方法において使用される配列番号１の化合物またはその誘導体は
、配列番号１の１位アミノ酸においてセリンの代わりにグリシンを用いるアミノ
酸置換、および配列番号１の１９位においてグルタミンの代わりにアルギニンを
用いるアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、ＰＴＨ誘導体は、
［Ｇｌｙ¹Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ（１−２８）（配列番号２）である。

【００９８】 （Ｖ．配列番号１の化合物またはその誘導体のレセプター−シグナル伝達活性
） ホルモン作用の発現における重要な工程は、標的細胞の形質膜表面上のレセプ
ターとのホルモンの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成は、種
々の生物学的応答を誘発するために細胞外シグナルの細胞への伝達を可能にする
。

【００９９】 （Ａ．ＰＴＨレセプターアンタゴニストおよびアゴニストについてのスクリー
ニング） 本発明のポリペプチドは、ｃＡＭＰ蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）アッセ
イを用いて、それらのアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性についてスクリ
ーニングされる。細胞表面上のＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞は、２ｍＭ
ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、３７℃で５〜６０分の間、ネイティブＰＴＨ（１
−８４）とともにインキュベートされる。サイクリックＡＭＰの蓄積が、上記の
ように、特定のラジオイムノアッセイにより測定される。ＰＴＨ−１レセプター
に対する結合についてネイティブＰＴＨ（１−８４）と競合し、そしてｃＡＭＰ
の蓄積に対するネイティブＰＴＨ（１−８４）の効果を阻害する、配列番号１の
化合物またはその誘導体は、競合的アンタゴニストとみなされる。このような化
合物は、高カルシウム血症を処置するために有用である。

【０１００】 逆に、ＰＴＨ−１レセプターに対する結合についてネイティブＰＴＨ（１−８
４）と競合しない配列番号１の化合物またはその誘導体は、これはなおｃＡＭＰ
の蓄積のネイティブＰＴＨ（１−８４）活性を妨げる（おそらく、レセプター活
性部位を阻害することによる）が、非競合的アンタゴニストとみなされる。この
ような化合物は、高カルシウム血症を処置するために有用である。

【０１０１】 ＰＴＨ−１レセプターに対する結合についてネイティブＰＴＨ（１−８４）と
競合し、そしてネイティブＰＴＨ（１−８４）の存在または非存在においてｃＡ
ＭＰの蓄積を刺激する、配列番号１の化合物またはその誘導体は、競合的アゴニ
ストである。ＰＴＨ−１レセプターに対する結合についてネイティブＰＴＨ（１
−８４）と競合しないが、なおネイティブＰＴＨ（１−８４）の存在または非存
在においてｃＡＭＰの蓄積を刺激することが可能であるか、あるいは配列番号１
の化合物またはその誘導体単独により観察されるｃＡＭＰの蓄積よりも高いｃＡ
ＭＰの蓄積を刺激する、配列番号１の化合物またはその誘導体は、非競合的アゴ
ニストとみなされる。

【０１０２】 本発明は、本発明の精神もしくは範囲またはその任意の実施形態から逸脱する
ことなく、組成物、濃度、投与の様式、および状態の広範な等価のパラメーター
内で行われ得ることは、当業者に明らかである。

【０１０３】 ここで本発明が十分に記載され、本発明は、例示により提供される特定の実施
例に対する参考によって、より容易に理解され、そして本明細書において特定さ
れない限り、本発明を限定することを意図しない。

【０１０４】 （実施例１） （材料および方法） （細胞培養） ヒトまたはラットＰＴＨ−１レセプター（それぞれ、９５０，０００レセプタ
ー／細胞および３２０，０００レセプター／細胞）を安定して発現する、ＨＫＲ
Ｋ Ｂ７細胞またはＥＷ ５細胞（３２）、ＬＬＣ−ＰＫＩ腎上皮細胞のサブク
ローンを、７％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイ
シン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）含むダルベッコ
改変必須培地中において、空気中で５％ＣＯ₂下で維持した。ＨＥＫ−２９３細
胞およびＣＯＳ−７細胞を、１０％ＦＢＳを培地中に使用したことを除いて、同
様に培養した。細胞を、２〜２．５×１０⁵細胞／ウェル（ＨＫＲＫ Ｂ７細胞
もしくはＥＷ ５細胞）または６×１０⁵細胞／ウェル（６ウェルプレートにお
いて）（ＨＥＫ−２９３細胞）の密度で、アッセイ２日前に、２４ウェルプレー
トに播種した。ＨＥＫ−２９３細胞に関与する実験において、ＤＮＡトランスフ
ェクションをプレーティング２４時間後に行い、そしてイノシトール放射性標識
をその２４時間後に加えた（以下を参照のこと）。ＣＯＳ−７細胞トランスフェ
クションを、以前に記載されたように行った（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０２４−２０３０（１９９３）
）。

【０１０５】 （放射性リガンド結合およびシグナル伝達アッセイ） 細胞内のｃＡＭＰの蓄積、ＰＬＣ活性化およびＰＴＨＲ結合親和性を以前に報
告されたように測定した（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９
５））。細胞内ｃＡＭＰの蓄積が、イソブチルメチキサンチン（ＩＢＭＸ、１ｍ
Ｍ）の存在下で、３７℃で１５分間、ヒトＰＴＨペプチドに曝した細胞の抽出物
中で測定した。吸引によりこの反応を終結し、そして液体窒素中で凍結した後、
細胞単層を５０ｍＭ ＨＣｌを用いて抽出し、そしてｃＡＭＰをラジオイムノア
ッセイキット（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏ
ｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して測定した。

【０１０６】 ＰＬＣを、０．１％ウシ血清アルブミンを含む無血清培地中で[³Ｈ]ミオイノ
シトール（３ｕＣｉ／ｍｌ）を用いて１６時間標識後、３０分間３７℃で、３０
ｍＭ ＬｉＣｌの存在下で、ＰＴＨアゴニストにより活性化した。この反応を、
急速吸引および冷５％ＴＣＡの添加により停止した。水溶性放射性標識イノシト
ールトリスホスフェート（ＩＰ₃）を、イオン交換クロマトグラフィーによるエ
ーテル抽出後、単離した（Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
６（９）：３８８４−３８９１（１９９５））。ＨＥＫ ２９３細胞に関する実
験において、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して（
ｐｃＤＮＡ１発現ベクターＨＫＲＫにおいて）ヒトＰＴＨＲ ｃＤＮＡを用いて
以前にトランスフェクトされた細胞を、全水溶性[³Ｈ]イノシトールポリホスフ
ェートをイオン交換カラムからの１つの分画として回収することを除いて、上記
のように[³Ｈ]ミオイノシトールを用いて標識し、そしてアッセイした。

【０１０７】 放射性リガンド競合的結合アッセイを、非放射性ｈＰＴＨ−（１−３４）アナ
ログの存在または非存在下で、¹²⁵Ｉ−[Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴]ラットＰＴＨ−
（１−３４）（１００，０００ｃｐｍ／ウェル）を使用して２〜８℃で６時間行
った。細胞層を細胞結合（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）放射能の決定のた
めに、可溶化の前に３回洗浄した。

【０１０８】 本明細書中で報告されるアッセイについてＨＫＲＫ Ｂ７細胞において観察さ
れる基底の平均レベルｈＰＴＨ−（１−３４）の最大濃度存在下における平均レ
ベルは、ｃＡＭＰの蓄積について、それぞれ１２±４ｐｍｏｌｅｓ／ウェル／１
５分および２０７±３７ｐｍｏｌｅｓ／ウェル／１５分、ＩＰ₃形成について８
９８±１４２ｃｐｍ／ウェルおよび１９０８±２５１ｃｐｍ／ウェル、ならびに
結合について２５５２０±１９０９ｃｐｍ／ウェルおよび９５６±１３５ｃｐｍ
／ウェルであった。

【０１０９】 （ペプチドおよび他の試薬） 他に特定しない限り、全ての試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
から購入した。全ての同位体を、Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ
ｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。ヒトＰＴＨペプチドを、Ｃ末端ア
ミド化をを用いて、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ＵｎｉｔのＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃ
ｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて合成し、そして存在する場合、天然に存
在するＰｈｅ³⁴の代わりにＴｙｒ³⁴を用いた。[Ｔｙｒ⁰]ｈＰＴＨ−（１−３４
）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．から購入した。¹²⁵Ｉ−[Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴]ラッ
トＰＴＨ−（１−３４）を、ヨウ素化し、そして以前に記載のように精製した（
Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５
）：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５））。

【０１１０】 （結果） （カルボキシル短縮型（ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＰＴＨアナ
ログ） 本発明者らは、Ｃ短縮型ペプチドｈＰＴＨ−（１−３１）およびｈＰＴＨ−（
１−３０）が、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞においてヒトＰＴＨ−１レセプターを介して
ＡＣおよびＰＬＣの両方を十分に活性化すること、ならびにこれらの応答につい
てのＥＣ₅₀は同一、またはｈＰＴＨ−（１−３４）について見られるＥＣ₅₀とほ
とんど同一であることを、以前に報告した（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．、およびＢｒｉ
ｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９（１０）：４
２９３−４２９９（１９９８））。生物学的活性の保持のためにＣ末端限界（Ｃ
−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｉｍｉｔ）をさらに規定するために、Ｃ短縮型ｈＰＴＨ
ペプチドの本分析を、ｈＰＴＨ−（１−２９）を用いて開始し、そしてｈＰＴＨ
−（１−２４）まで広げた。

【０１１１】 図１Ａにおいて示すように、ｈＰＴＨ−（１−２９）およびｈＰＴＨ−（１−
２８）は、ｈＰＴＨ−（１−３４）と同様に効果的に、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞にお
いてヒトＰＴＨ−１レセプターを介してＡＣを活性化したが、一方、さらに短く
すること（すなわち、Ｌｅｕ²⁸の除去）は、およそ１００倍（ＥＣ₅₀＝１００ｎ
Ｍ対１ｎＭ）にＡＣ活性を著しく減じた。さらなる短縮（ｈＰＴＨ−（１−２６
）まで）は、潜在能においてさらに１０倍の減少を生じた。ｈＰＴＨ−（１−２
６）およびｈＰＴＨ−（１−２５）に対する応答は、ほとんど同一であったが、
一方ｈＰＴＨ−（１−２４）は、試験された最も高い濃度（１０００ｎＭ）でた
だ最小に活性であった。

【０１１２】 これらのペプチドのＰＬＣ活性のプロフィールは、ＡＣについてのプロフィー
ルとは著しく異なった。従って、これらの細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２９）
によるＰＬＣ活性化は、ｈＰＴＨ−（１−３４）の活性化と比較して劇的に減少
した（ＥＣ₅₀＝１０００ｎＭ対３０ｎＭ）。さらに、ｈＰＴＨ−（１−２８）は
、ｈＰＴＨ−（１−２９）よりおよそ５倍低い潜在能力であり、そしてｈＰＴＨ
−（１−２８）よりも短いペプチドは、ＰＬＣ活性を有意に増加できなかった（
図１Ｂ）。これらのＣ短縮型ペプチドにおいて観察されるＰＬＣ活性における減
少（それらの結合親和性において測定される低下と関連する）（すなわちｈＰＴ
Ｈ−（１−２９）およびｈＰＴＨ−（１−２８）の結合についての明らかなＩＣ ₅₀ ）はまた、ｈＰＴＨ−（１−３４）のそれと比較して３０〜１００倍減少し、
そして放射性リガンドの置換は、１０００ｎＭと同様に高い濃度で、ｈＰＴＨ−
（１−２８）よりも短いペプチドを用いて生じなかった（図１Ｃ）。

【０１１３】 ＰＴＨ−（１−３４）の段階的なＣ末端短縮と関連するＰＬＣ活性の漸進的な
低下が、結合親和性において観察される平行的な低下によるか、または、代わり
に、重要なＰＬＣ活性化ドメインの同時の欠失によるものか否かを決定するため
に、本発明者らは、齧歯類のＰＴＨレセプターに対してｈＰＴＨ−（１−３４）
の結合を増幅することが以前に報告されている改変（１９位のＧｌｕの代わりに
Ａｒｇを用いる）を、ｈＰＴＨ−（１−２８）に導入した（Ｇａｒｄｅｌｌａ，
Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１２）：６５８４−６５８８（
１９９５））。得られたペプチド（［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ−（１−２８））は、
ｈＰＴＨ−（１−２８）と比較して、結合の増強（ＩＣ₅₀＝１００ｎＭ対１００
０ｎＭ）およびＰＬＣ活性の増大（ＥＣ₅₀＝３００ｎＭ対６０００ｎＭ）の両方
を示した（図３を参照のこと）。重要なことに、この［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ−（
１−２８）アナログは、ＰＫＣ活性化のために不可欠であると報告されているｈ
ＰＴＨ−（２９−３２）配列の非存在に関わらず、ＰＬＣを最大に活性化した（
Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）
：９４３−９４９（１９９４）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２））。アデニリルシクラ
ーゼ活性は、Ａｒｇ¹⁹置換により影響されなかった（図３Ａ）。これらの結果は
、ｈＰＴＨの２８位に対するアミノ酸Ｃ末端が、最適なリガンド結合に重要であ
る一方、ヒトＰＴＨレセプターを介した最大のＰＬＣ活性のために必要でないこ
とを示唆したので、次いで本発明者らは、ＰＬＣ活性化においてｈＰＴＨのＮ末
端の役割に集中した。

【０１１４】 （Ｎ末端改変ｈＰＴＨアナログ） ヒトＰＴＨ−（３−３４）を、齧歯類ＰＴＨレセプターを介してＰＬＣ／ＰＫ
Ｃ選択ペプチドとして以前に特徴付けた（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｆｕｊ
ｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−
３０３９（１９９１）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２））。しかし、本発明者らは、１
０００ｎＭ程度の高さの濃度で、このペプチドが、ラットＰＴＨ−１レセプター
またはヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＨＫＲＫ Ｂ７細胞またはＣＯＳ−
７細胞においてＰＬＣを活性化しないことを観察した（Ｔａｋａｓｕら、Ｊ．Ｂ
ｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、印刷中）。これらの結果は、ｈＰＴＨ−（１−
３４）のＮ末端において最初の２つのアミノ酸（Ｓｅｒ¹−Ｖａｌ²）が、ヒトＰ
ＴＨレセプターを介してＰＬＣ活性化ならびにＡＣ活性化について重要であるに
違いないことを示した。

【０１１５】 この分析を正確にするために、本発明者らは、第１にｈＰＴＨ−（２−３４）
の特性を研究した。図２Ａおよび２Ｂにおいて示すように、たとえＡＣのｈＰＴ
Ｈ−（２−３４）の活性化が、ｈＰＴＨ−（１−３４）の活性化と、大きさおよ
び感受性に匹敵したとしても、ｈＰＴＨ−（２−３４）は、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞
におけるＰＬＣ活性を誘発しなかった。類似の結果を、大量のヒトＰＴＨ−１レ
セプターを発現するＣＯＳ−７細胞を使用して得た（データは示していない）。
ｈＰＴＨ−（２−３４）がヒトＰＴＨ−１レセプターを介してＰＬＣを活性化で
きないことを、ヒトＰＴＨ−１レセプターｃＤＮＡを用いて一過的にトランスフ
ェクトしたＨＥＫ−２９３ヒト胚性腎細胞を使用することにより、十分なホモロ
グ系において確認した（表１）。

【０１１６】

【表４】 示された１０００ｎＭのペプチドに応答して産生される全イノシトールポリホ
スフェートを、ヒトＰＴＨ−１レセプターを一過的に発現するＨＥＫ−２９３細
胞において測定した。結果は、３連の測定について基底活性の％の平均値±ＳＥ
Ｍとして表した。コントロールにおいて、総計ＩＰの基底レベルは、５７８±９
１ｃｐｍ／ウェル／３０分であった。^* コントロールとは有意に異なる（ｐ＜
０．０５）。

【０１１７】 本発明者らは、次に、ヒトＰＴＨ−１レセプターに対する結合およびヒトＰＴ
Ｈ−１レセプターの活性化におけるＮ末端Ｓｅｒ¹残基の役割およびそのαアミ
ノ基の役割を検討した。単離されたラット腎臓膜を用いた初期の研究は、ｈＰＴ
Ｈ−（１−３４）においてＳｅｒ¹の代わりにＡｌａ¹を用いることが、そのＡＣ
活性を増加したことを示し、一方Ｇｌｙ¹置換は、ｂＰＴＨ−（１−３４）によ
るＡＣ活性化を弱めたので（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．、およびＰｏｔｔｓ，Ｊ
．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１
９７５））、これらの１位の改変を、ｈＰＴＨ−（１−３４）に導入し、その結
果を図２に示した。［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）アナログは、ＡＣまた
はＰＬＣの結合ならびに活性化に関して、ｈＰＴＨ−（１−３４）と識別できな
かったが、一方Ｇｌｙ¹置換ペプチドは、変化しない結合親和性およびＡＣ活性
にも関わらず、試験されたもっとも高い濃度（１０００ｎＭ）で、減じられたＰ
ＬＣ活性（ｈＰＴＨ−（１−３４）の最大値の２５％）を示した。

【０１１８】 これらＡｌａ¹−置換ｈＰＴＨ−（１−３４）および−Ｇｌｙ¹−置換ｈＰＴＨ
−（１−３４）のα−アミノ基の欠損（すなわち、それぞれ、デスアミノ[Ａｌ
ａ¹]ｈＰＴＨ−（１−３４）およびデスアミノ[Ｇｌｙ¹]ｈＰＴＨ−（１−３４
））は、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞において検出可能なＰＬＣ活性の完全な損失を生じ
たが、見かけの結合親和性において変化はなく、そしてＡＣ効力において２〜５
倍の減少があるにすぎなかった。(図２)。これらの結果を、ラットＰＴＨ−１レ
セプターまたはヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞を使用し（
示さず）、そしてヒトＰＴＨ−１レセプターｃＤＮＡを用いて一過的にトランス
フェクトしたＨＥＫ−２９３ヒト腎臓細胞の研究において確認した（表１）。ｈ
ＰＴＨｒＰ（１−３６）のαアミノ基の除去はまた、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけ
るＰＬＣリガンドによるＰＬＣ活性を除去した[すなわち、それぞれ１０００ｎ
Ｍペプチドにおいて基底の、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）＝１７８±１２％；デス
アミノ−ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）＝１０１±６％]。ｈＰＴＨ−（１−３４）
のＮ末端のチロシン残基の介在（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）によるＮ末端α
アミノ基の置換（すなわち、[Ｔｈｒ⁰]ｈＰＴＨ−（１−３４））はまた、ＰＬ
Ｃ活性を消滅した（１０００ｎＭペプチドで基底の１０５±５％）。まとめると
、これらの知見は、ヒトＰＴＨ−１レセプターによるＰＬＣの活性における、ｈ
ＰＴＨ−（１−３４）のＮ末端残基、および特にその遊離したαアミノ基のＮ末
端残基の重大な役割を示した。それぞれの１位の変化の影響は、これらの細胞に
おけるＰＬＣの相対的な選択（ＡＣに対する）および結合親和性における変化の
非依存性の両方であったので、ＰＴＨ−１レセプターを介したＡＣ活性化からＰ
ＬＣを潜在的に分離するための戦略が示唆された。

【０１１９】 （ｈＰＴＨ−（１−２８）の改変） 先に示したように（図１）、ｈＰＴＨ−（１−２８）は、ｈＰＴＨ−（１−３
４）の最も短いアナログであり、試験した最も高い濃度（１０μＭ）でなお、Ｈ
ＫＲＫ Ｂ７細胞において、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介してＡＣおよびＰＬ
Ｃの両方を活性化した。ｈＰＴＨ−（１−２８）配列においてＡｌａ¹がＳｅｒ¹ に置換された場合、結合親和性およびＰＬＣ活性化に対するＥＣ₅₀の両方は、部
分的に改善されたが、[Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）を用いて以前に観察さ
れた程度ほどではなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。すでにｈＰＴＨ−（１−３４
）のＡＣに等価なＡＣの活性化は、さらに高まらなかった。対照的に、Ｇｌｙ¹
置換（すなわち、[Ｇｌｙ¹]ｈＰＴＨ−（１−２８））は、１０μＭでの弱い応
答の他に、選択的にＰＬＣシグナル伝達を除去し、そして結合親和性を穏やかに
損なった（図３Ｂおよび３Ｃ）。

【０１２０】 結合増強Ａｒｇ¹⁹改変を[Ａｌａ¹]ｈＰＴＨ−（１−２８）アナログおよび[Ｇ
ｌｙ¹]ｈＰＴＨ−（１−２８）アナログに重ねた場合、これらのペプチドのヒト
ＰＴＨＲに対する結合親和性は、５〜１０倍増加した（図３Ｃと比較した図４Ｃ
）。[Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）の場合では、ＰＬＣ活性化に
対するＥＣ₅₀はまた、[Ａｌａ¹]ｈＰＴＨ−（１−２８）の場合よりも５倍改善
した[すなわち、１０００ｎＭ（図３Ｂ）から２００ｎＭ（図４Ｂ）まで]。興味
深いことに、Ａｌａ¹、Ａｒｇ¹⁹の二重置換は、ｈＰＴＨ−（１−２７）へのＰ
ＬＣ活性を回復できなかったが、これはＡＣ活性化に対するＥＣ₅₀を１０倍改善
した（表２、図１）。

【０１２１】

【表５】 シグナル伝達応答を、方法に記載されたようにｈＰＴＨ−（１−３４）または
[Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２７）により刺激された細胞において測
定した。結果を、同様のアッセイにおいて観察されたｈＰＴＨ−（１−３４）へ
の最大の応答の％として示した。値は、それぞれ２連および３連で行った２つの
別々の実験より得た、４回測定（ｃＡＭＰ蓄積）および６回測定（ＩＰ₃形成）
の平均±ＳＥＭである。

【０１２２】 [Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ（１−２８）とは対照的に、結合親和性におい
て５倍に匹敵するほど改善されたにもかかわらず、[Ｇｌｙ¹]ｈＰＴＨ−（１−
２８）へのＡｒｇ¹⁹置換の導入に続くＰＬＣ活性における増加はなかった（図４
）。従って、[Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）および[Ｇｌｙ¹，Ａ
ｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）の両方に対するＡＣ活性化曲線は、ｈＰＴＨ−
（１−３４）の曲線と識別できなかったが（図４Ａ）、一方でＰＬＣ応答プロフ
ィールは、[Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）とは異なり、[Ｇｌｙ¹
，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）が、このシグナル伝達経路の活性化の点で
著しくかつ選択的に減じられることを示した。

【０１２３】 ＰＴＨ−１レセプターを介したＰＬＣシグナル伝達からＡＣを分離するための
シグナル選択アナログとしてのげっ歯類モデルにおいて特に、[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ ¹⁹ ]ｈＰＴＨ−（１−２８）ペプチドが有用であり得るという可能性を、ＬＬＣ
−ＰＫ１細胞のＥＷ５サブクローン（ラットＰＴＨ−１レセプターを安定に発現
する）を使用してさらに試験した（Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５））。表３に示すように、Ｅ
Ｗ５細胞における種々の置換ｈＰＴＨ−（１−２８）アナログのシグナル伝達お
よび結合特性は、上記のＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるそれらに同一ではないが、
類似していた。ｈＰＴＨ−（１−２８）ペプチドにおけるラットレセプターとヒ
トレセプターとの間の注意すべき差異としては、以下が挙げられる：（１）ラッ
トＰＴＨ−１レセプターを介するｈＰＴＨ−（１−２８）のシグナル伝達は、匹
敵する結合親和性にもかかわらず、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するよりも厳
しく減じられた（表３および図１の比較）；（２）Ｇｌｙ¹置換は、ラットＰＴ
Ｈ−１レセプターに対するｈＰＴＨ−（１−２８）ペプチドの結合親和性をわず
かに増強したが（２倍）、一方それは、ヒトＰＴＨ−１レセプターへの結合を約
３倍減じた（表３と図３および４を比較）；ならびに（３）ラットＰＴＨ−１レ
セプターに対する[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）のＡＣに対する
結合親和性およびＥＣ₅₀は、ｈＰＴＨ−（１−３４）に関して約６倍に減じられ
たのみであったが、一方このアナログのヒトＰＴＨ−１レセプターへの結合は、
ほぼ４０倍減少した。ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＡＣの活性化に対する
[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）の有効性は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞
におけるｈＰＴＨ−（１−３４）の有効性と類似であったが、それは１０〜２０
倍まで減少し、ずっと少ないヒトＰＴＨ−１レセプターを発現した他の細胞（Ｌ
ＬＣ−ＰＫＩまたはＳａＯＳ−２骨肉腫）におけるその減少した結合親和性と一
致した（すなわち、細胞あたり１０，０００〜１００，０００対９５０，０００
）（データ示さず）。概して、結果は、[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−
２８）ペプチドが、ラットＰＴＨ−１レセプターおよびヒトＰＴＨ−１レセプタ
ーの両方を介するＡＣ対ＰＬＣに対して高度にシグナル選択的であること、およ
び、それが、十分に保存された結合親和性のために、インビボでのげっ歯類モデ
ルを使用する研究に特に有用であり得ることを示した。

【０１２４】 （考察） ｈＰＴＨ−（１−３４）とＰＴＨ−１レセプターとの相互作用に関するいくつ
かの主要な結論が、これらの実験の結果より引き出され得る。第一に、ｈＰＴＨ
−（１−３４）リガンドのインタクトなＮ末端は、ＰＴＨ−１レセプターを介す
るＰＬＣの有効な活性化に不可欠であることは、明白である。結合が他の手段に
より維持され得る場合は、ｈＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端、特に、配列ｈＰＴ
Ｈ−（２８−３０）は、リガンドの結合の安定化による有効なＰＬＣの活性化に
寄与するが、最大のＰＬＣ活性化に必要でない。第二に、ｈＰＴＨのＮ末端はＰ
ＴＨ−１レセプターを介するＡＣおよびＰＬＣの両方の活性化に重要であるが、
これら二つのエフェクターの活性化におけるリガンドのＮ末端中の特定の構造的
特徴の役割は異なる。具体的には、本発明者らは、ＰＬＣ活性化が、Ｎ末端の構
造（すなわち、Ｎ末端アミノ酸の同一性およびＮ末端αアミノ基の存在の両方）
に対して、ＰＬＣとは異なるＡＣ応答（１位のアミノ酸の非存在においてさえも
通常に生じ得る）よりも、さらにより敏感であることを見出した。第三に、ｈＰ
ＴＨペプチドのＮ末端の変化に対するＡＣシグナル伝達およびＰＬＣシグナル伝
達の感受性におけるこの差異のために、[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−
２８）アナログに対して本明細書中で示したように、リガンドの構造を変更する
ことによりこれら二つのエフェクターの活性化を分離することが可能である。本
発明者らは、以前に、ＰＴＨ−１レセプターにおける変異を介してそのようなシ
グナル伝達選択性を達成した（ＤＳＥＬに対する細胞内ループ２におけるＥＫＫ
Ｙ配列を変化させることによる（Ｉｉｄａ−Ｋｌｅｉｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７２（１１）：６８８２−６８８９（１９９７）））が、ここで
野生型レセプターを介して活性である、高度にシグナル選択的なリガンドもまた
、設計され得ることは明白である。

【０１２５】 これらの知見は、再試験されるＰＴＨシグナル伝達の構造決定因子に関する、
いくつかの重要な概念を必要とする。内因性のＰＴＨ−１レセプターを発現する
げっ歯類細胞およびオポッサム細胞を用いて、以前に行われた研究は、ＰＴＨ−
（１−３４）のようなＮ短縮型ＰＴＨアナログが、ＡＣ活性を欠如するが、それ
にもかかわらず、いくつかの系ではＰＫＣおよび一過的にＣａ_i ⁺⁺を潜在的に活
性化し得るが（Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３
：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｓｉｅ
ｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７
−１２７５（１９９５））、他の系では活性化し得なかった（Ｒｅｉｄ，Ｉ．Ｒ
．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３（１ Ｐｔ １）：Ｅ４５−５１（１
９８７）；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，，Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：１３５２−１３５８（１９８９））ことを示した。
Ｎ短縮型ｈＰＴＨ−（１−３４）アナログおよびＣ短縮型ｈＰＴＨ−（１−３４
）アナログのＰＫＣ活性化特性の詳細な分析は、配列ｈＰＴＨ−（２９−３２）
が重大な「ＰＫＣ活性化ドメイン」を示すという結論を導いた（Ｊｏｕｉｓｈｏ
ｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９４３−９４
９（１９９４）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３０（１）：５３−６０（１９９２）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およ
びＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１６（１１）：３８
２−３８６（１９９５））。

【０１２６】 本発明者らが、[Ａｌａ¹、Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）のようなＣ短縮
型アナログを用いて観察した活発なＰＬＣ活性化は、ｈＰＴＨ−（２９−３２）
領域が、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＰＬＣの完全な活性化のために必要
ではないことを明確に示す。本発明者らの結果は、ラット腎臓膜におけるｂＰＦ
Ｈ−（１−３４）について以前に報告されたように、この領域が、そのレセプタ
ーに対するｈＰＴＨ−（１−３４）リガンドの高親和性結合のために重要である
ことを示す（Ｓｅｒｇｅ，Ｇ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６９
８０−６９８６（１９７９））。同時に、ヒトＰＴＨ−１レセプターのＰＬＣ応
答が、リガンド結合親和性における減少に対するＡＣ応答であるよりも、より敏
感であることは明白である。この結論はまた、ＰＬＣがＰＨＴ−１レセプター表
面発現のレベルにより強く依存性であるという事実に一致する（Ｇｕｏ，Ｊ．ら
、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５
））。

【０１２７】 ＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ−２９３細胞において非相同的に発現された組換
えヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＰＬＣの活性化またはＣａ_i ⁺⁺シグナル伝
達に対するｈＰＴＨ−（１−３４）またはＰＴＨ−（３−３４）の効果の以前の
研究は、一致しない知見を生じた（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ １８（４）
：３８１−３８９（１９９６）；Ｓｅｕｗｅｎ，Ｋ．ら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍ．１１４（８）：１６１３−１６２０（１９９５）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−
Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（
１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１（２）
：２８１−２８５（１９９４））。しかし、Ｎ末端短縮型ＰＴＨアナログが、他
の系においてＰＫＣおよびＣａ_i ⁺⁺の活性化を誘発するという多数の知見のため
に（Ａｚａｒａｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９
３１−１４９３６（１９９６）；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，
Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１
９９１）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（
１）：２９−３６（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）５３−６０（１９９２）；Ｃｈ
ａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ
．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１（３）：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｃｏｌｅ，
Ｊ．Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２９：２９８１−２９８９（１
９８８）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（
８）１１７９−１１８９（１９９４））、ｈＰＴＨ−（１−３４）の１位の遊離
のαアミノ基が、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＰＬＣ活性化のために絶対
的に必要とされるという本発明者らの知見は、全く予想外であった。実際に、本
発明者らのデータは、ＰＴＨ−１レセプターを介するＰＬＣの活性化が、ＡＣで
あるより、そのようなかすかなＮ末端改変に対して、さらにより敏感であること
、およびｈＰＴＨ−（１−３４）の段階的なＣ末端短縮の結果とは対照的に、こ
れらのアナログのＰＬＣ効力における減少が、より低い結合親和性に寄与し得な
いことを示す。これは、ｈＰＴＨ−（１−３４）の極端なＮ末端が、ヒトＰＴＨ
−１を介するＰＬＣシグナル伝達にための真の「活性化ドメイン」を構成するこ
とを示唆する。本発明者らは、他のグループが以前に報告したラットＵＭＲ １
０６−０１骨肉種細胞における、Ｎ短縮型ペプチドｂＰＴＨ−（２−３４）およ
びｂＰＴＨ−（２−３４）によるＰＬＣの活性化（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１）
）に注意すべきである。この矛盾に対する説明は、種の相違（細胞およびリガン
ドにおける）、またはＰＬＣ結合ＰＴＨ−１レセプターの代替の種のＵＭＲ骨肉
種細胞による可能な発現にあり得、この存在は、内因性のＰＴＨ−１レセプター
をまた発現するラット骨肉種細胞において除外され得ない（Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．
Ｍ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｅｍａｔ．４９（２）：１２０−１２
３（１９９１）；Ｉｎｏｍａｔａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
６（１１）：４７３２−４７４０（１９９５））。クローン化ヒトＰＴＨ−１レ
セプターを介してＰＬＣを活性化する、本明細書中で研究されたＮ短縮型ｈＰＴ
Ｈ−（１−３４）アナログの不全は、ブタ宿主細胞に独特ではなかったが、これ
らの知見は同様に、ＣＯＳ−７細胞および相同なヒト細胞系の両方において確認
された。

【０１２８】 本発明者らの結果は、ｈＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端の部分が、ＰＴＨ−１
レセプターを介してＰＫＣを活性化するという知見に矛盾しない（Ａｚａｒａｎ
ｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９３
６（１９９６）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
３：７１３−７１９（１９９３）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎ
ｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９４３−９４９（１９９４）；Ｓｉｅｇｆ
ｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７−１
２７５（１９９５）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２））。プロテインキナーゼＣは、Ｐ
ＬＣ以外の機構（ホスホリパーゼＤおよびホスホリパーゼＡ₂（ＰＬＡ₂）を含む
）によって活性化され得る（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：
４８４−４９６（１９９５））。実際、腎臓細胞において、ＰＴＨはＰＬＡ２（
４２）を活性化し得、そしてＰＬＣの増加なしにＰＫＣを刺激し得る（Ｆｒｉｅ
ｄｍａｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１）：１３−２
０（１９９６））。同様に、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介する一過的なＰＴＨ
刺激性のＣａ_i ⁺⁺のＰＬＣ非依存性機構についての証拠が、提供されており（Ｓ
ｅｕｗｅｎ，Ｋ．ら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１４（８）：１６１３−１
６２０（１９９５）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（１９９７））、これは、本発明者ら
がＰＬＣを刺激しないことを示したＮ短縮型ＰＴＨアナログにより、Ｃａ_i ⁺⁺の
活性化を説明し得る（Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６３：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−９（１９９１）；Ｊｏｕ
ｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−
６０（１９９２））。従って、ＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端ドメインは、ＰＫ
Ｃ活性化またはＣａ_i ⁺⁺活性化のそのような代替経路の活性化に関与し得る。そ
のような場合、本発明者らの結果は、少なくとも３つのドメインが、ｈＰＴＨ−
（１−３４）分子内に（２つは、ＡＣおよびＰＬＣの活性化を媒介するＮ末端に
、そして１つは１つ以上のＰＬＣ非依存性機構を介してＰＫＣを活性化するＣ末
端の近くに）存在するという結論を導く。インビボでのＰＴＨの生理学的作用ま
たは薬理学的作用のためのこれらの種々の活性化ドメインの有意性のさらなる明
確化は、ＰＴＨ−１レセプター媒介ＡＣ、ＰＬＣおよびＰＫＣシグナル伝達によ
り活性化される重要な細胞経路の役割の、より優れた定義を必要とする。これら
の問題は今や、ＰＬＣではなくＰＫＣ活性化を誘発する、他に記載されるＮ末端
が短縮されたＰＴＨアナログ（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｊａｎｕｌｉｓ，
Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）；
Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１
２６７−１２７５（１９９５）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉ
ｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）：１１７９−１１８９（１９９４））を有する、本明
細書中に記載されるＣ短縮型／Ｎ末端改変ＰＴＨアナログの生物学的作用を比較
することにより、より明確に扱われ得る。例えば、本発明者らは、ラットＰＴＨ
−１レセプターの第２の細胞内ループ内の変異を介するＰＴＨ−（１−３４）に
対するＰＬＣ応答の選択的な除去が、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるナトリウム依
存性リン酸輸送（Ｉｉｄａ−Ｋｌｅｉｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２（１１）：６８８２−６８８９（１９９７））のような特定の下流の生物学
的応答、および増殖プレート軟骨細胞によるインターロイキン６の産生をブロッ
クすることを以前に見出した（公開されていないデータ）。野生型ＰＴＨ−１レ
セプターを介する選択的シグナル伝達を有する新規リガンドの有効性は、今や、
インビトロでのそのような問題を扱うための補完的なアプローチを提供する。最
終的に、インビトロ試験とインビボでのアナログ活性の研究の慎重な相関は、こ
れらの別々のＰＴＨ−１レセプターシグナルの生理学的な役割を分析し、加えて
十分に定義するために必要とされる。

【０１２９】 ｂＰＴＨ−（２−３４）、ｈＰＴＨ−（２−３８）およびデスアミノ−ＰＴＨ
−（１−３４）を含むアミノ短縮型アナログは、インビトロで試験した場合、弱
いＡＣ活性のみを示すことが、以前に見出されたが（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら
、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１
）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：
２９−３６（１９９２）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ
．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９７
５）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）
：１１７９−８９（１９９４））、一方、本発明者らは、ｈＰＴＨ−（２−３４
）、デスアミノ−[Ａｌａ¹]ｈＰＴＨ−（１−３４）およびデスアミノ−[Ｇｌｙ ¹ ]ｈＰＴＨ−（１−３４が、ｈＰＴＨ−（１−３４）と等力であったことを見出
した。この相違は、おそらく、以前の研究において使用された骨肉種細胞または
部分的に精製された膜によるよりも、ＨＫＲＫＢ７細胞により発現された非常に
多数のヒトＰＴＨ−１レセプターにより、説明される（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９
１）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）
：２９−３６（１９９２）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．
Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９
７５）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８
）：１１７９−１１８９（１９９４））。ＨＫＲＫ Ｂ７細胞を、高レベルのレ
セプター発現を必要とするヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＰＬＣシグナル伝
達の構造的な基礎の分析を最適化するために、本発明者らは研究のために選択し
た（Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−
３８９１（１９９５））；Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３５（４）：１７１３−１７１６（１９９４））。これらＮ短縮型ペプチドが
、より少ない（すなわち、細胞あたり１００，０００〜３００，０００）ヒトＰ
ＴＨ−１レセプターを発現する他のＬＬＣ−ＰＫＩサブクローンを用いて試験さ
れた場合、それらのＡＣ応答は、実際に、ｈＰＴＨ−（１−３４）と比較して１
０倍までも減少した（データは示さず）。一方、インビボでのそのようなＮ短縮
型ＰＴＨアナログの研究は、インビトロでのＡＣ活性の測定より予測されたより
も大きな生物作用能を示した（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ ９３：１３４９−１３５３（１９７３）；Ｈｉｌｌｉｋｅｒ，Ｓ．
ら、Ｂｏｎｅ １９：４６９−４７７（１９９６））。また、インビボでの関連
する標的細胞により発現されたＰＴＨ−１レセプターの実際の数は、不確かなま
まであるが、本明細書中で研究された範囲内にあり得る（Ｓｈｕｋｕｎａｒｎｉ
，Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３３（２）：４５７−４６８（１９９６
）；Ｂｏｓ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．５８（
２）：９５−１００（１９９６））。

【０１３０】 これは、ＰＴＨ−（１−２８）より短いペプチドが、ＰＴＨ−１レセプターを
介してＡＣを十分に活性化し得る第１の実証である。単離された腎臓膜またはＲ
ＯＳ１７／２骨肉種細胞を使用する以前の研究においては、ＰＴＨ−（１−２７
）またはより短いＣ短縮型アナログを用いて、ほとんど活性が検出されないか、
または全く活性が検出されなかった（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５４：６９８０−６９８６（１９７９）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９−１３５３（１９７３）；
Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４（２７）：８
８３５−８８４２（１９９５））。さらに、突然変異誘発のスキャニングは、Ｌ
ｅｕ２についてのラットＰＴＨ−１レセプターに対する結合における重大な役割
を同定した。Ｌｅｕ２は、ｈＰＴＨ−（１−３４）分子のＣ末端の近くのαヘリ
ックスを安定化させる際に重要であると考えられている（Ｇｏｍｂｅｒｔ，Ｆ．
ら、Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ Ａｍ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐ．、Ｋａｕｍａｙａ
，Ｐ．およびＨｏｄｇｅｓ，Ｒ．編、Ｍａｙｆｌｏｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｋｉｎｇｓｗｉｎｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９６）、６６１−
６６２頁；Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４（
２７）：８８３５−８８４２（１９９５））。上記のように、Ｎ短縮型ペプチド
について、本発明らがｈＰＴＨ−（１−２８）よりも短いＣ短縮型ｈＰＴＨペプ
チドによってＡＣ活性化を検出する能力は、本発明者が使用した細胞におけるヒ
トＰＴＨ−１レセプターの発現の高いレベルに起因するようである。一過的にト
ランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞またはＨＥＫ ２９３細胞（ＰＴＨおよびＰ
ＴＨ−１レセプターの両方の構造−機能の研究において広く使用されている）は
、代表的に、少なくともＨＫＲＫ Ｂ７細胞が発現するのと同程度のレセプター
を発現する（Ｉｉｄａ−Ｋｌｅｉｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７０
（１５）：８４５８−８４６５（１９９５））。もちろん、ＰＴＨ−１レセプタ
ー発現の生理学的なレベルがインビボでの関連する標的細胞において定義される
まで、得られたＰＴＨアナログまたは模倣化合物のＡＣ活性の推定値（これらの
高度に敏感なインビトロの系を使用する）は、慎重に解釈されなければならない
。同時に、そのような系は、弱いヒトＰＴＨ−１レセプターアゴニストを同定し
、およびこのレセプターによる結合および複数の平行するシグナル伝達に関与す
るリガンドの基本的構造の特徴を規定するために、重要な利点を提供するようで
ある。

【０１３１】 最終的に、改変されたｈＰＴＨ−（１−２８）アナログの本発明者らの研究は
、新規ｈＰＴＨアナログである、[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）
を同定した。これは、ヒトＰＴＨ−１レセプターを介するＡＣの活性化（対ＰＬ
Ｃ）に対するｈＰＴＨ−（１−３４）に関連する顕著な選択性（＞４０倍）を示
す。大量のヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＨＫＲＫ Ｂ７細胞において、
このアナログによるＡＣの活性化は、３０倍低い結合親和性にもかかわらずｈＰ
ＴＨ（１−３４）による活性化のと等価であったが、一方ＰＬＣ効力は約１００
倍減少した。ｈＰＴＨ−（２−３４）およびデスアミノアナログと同様に、[Ｇ
ｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）の絶対的なＡＣ効力は、ずっと少ない
ヒトＰＴＨ−１レセプター／細胞を発現する細胞において減少したが、それにも
かかわらず、このペプチドは、ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現する標的細胞に
おける特定のＰＴＨ作用のシグナル伝達の基礎の研究について、単一の選択的Ｐ
ＴＨＲアゴニストとして有用であると証明するに十分な結合親和性およびＡＣ活
性を保持する。[Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹]ｈＰＴＨ−（１−２８）アナログは、げっ
歯類系におけるインビトロ研究およびインビボ研究の両方に対して、特に有用で
あるはずである。このペプチドは、ラットＰＴＨ−１レセプターを介するＡＣ対
ＰＬＣについて１０倍よりも大きい選択性である。さらに、ラットＰＴＨ−１に
対する、その結合親和性は、ヒトＰＴＨ−１レセプターに対するよりも１０倍大
きく、そしてｈＰＴＨ−（１−３４）の結合親和性よりも７倍低いのみである。
インビトロおよびインビボでのこのアナログの特性の慎重な分析は、ＰＴＨ作用
におけるＰＴＨ−１レセプター依存性のＰＬＣ活性化の役割を明確にするのに役
立ち、そして他のシグナル選択性のｈＰＴＨアナログの開発のためのさらなる指
示を提供するはずである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＨＫＲＢ Ｂ７細胞におけるＣ末端短縮型ｈＰＴＨアナログの特性。細胞内ｃ
ＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ３形成（Ｂ）および競合的放射性リガンド結合（Ｃ）が
、示した濃度の以下のものについて示される：ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）
、ｈＰＴＨ−（１−２９）（黒三角）、ｈＰＴＨ−（１−２８）（白丸）、ｈＰ
ＴＨ−（１−２７）（白三角）、ｈＰＴＨ−（１−２６）（黒逆三角）、ｈＰＴ
Ｈ−（１−２５）（白逆四角）およびｈＰＴＨ−（１−２４）（黒四角）。結果
を、同じアッセイにおいて観察された、ｈＰＴＨ−（１−３４）に対する最大応
答のパーセンテージとして（ＡおよびＢ）または¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ_8,21，Ｔｙｒ_{3 4} ］ラットＰＴＨ−（１−３４）放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセン
テージとして（Ｃ）表す。各点は、いくつかの（すなわち、２〜４の）実験から
の結果の平均±ＳＥＭを表す。この実験の各々は、３連で行った（結合データの
ＳＥＭは代表的に、総結合の３％未満であり、従ってしばしば記号によって隠さ
れている）。

【図１Ｂ】 ＨＫＲＢ Ｂ７細胞におけるＣ末端短縮型ｈＰＴＨアナログの特性。細胞内ｃ
ＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ３形成（Ｂ）および競合的放射性リガンド結合（Ｃ）が
、示した濃度の以下のものについて示される：ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）
、ｈＰＴＨ−（１−２９）（黒三角）、ｈＰＴＨ−（１−２８）（白丸）、ｈＰ
ＴＨ−（１−２７）（白三角）、ｈＰＴＨ−（１−２６）（黒逆三角）、ｈＰＴ
Ｈ−（１−２５）（白逆四角）およびｈＰＴＨ−（１−２４）（黒四角）。結果
を、同じアッセイにおいて観察された、ｈＰＴＨ−（１−３４）に対する最大応
答のパーセンテージとして（ＡおよびＢ）または¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ_8,21，Ｔｙｒ_{3 4} ］ラットＰＴＨ−（１−３４）放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセン
テージとして（Ｃ）表す。各点は、いくつかの（すなわち、２〜４の）実験から
の結果の平均±ＳＥＭを表す。この実験の各々は、３連で行った（結合データの
ＳＥＭは代表的に、総結合の３％未満であり、従ってしばしば記号によって隠さ
れている）。

【図１Ｃ】 ＨＫＲＢ Ｂ７細胞におけるＣ末端短縮型ｈＰＴＨアナログの特性。細胞内ｃ
ＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ３形成（Ｂ）および競合的放射性リガンド結合（Ｃ）が
、示した濃度の以下のものについて示される：ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）
、ｈＰＴＨ−（１−２９）（黒三角）、ｈＰＴＨ−（１−２８）（白丸）、ｈＰ
ＴＨ−（１−２７）（白三角）、ｈＰＴＨ−（１−２６）（黒逆三角）、ｈＰＴ
Ｈ−（１−２５）（白逆四角）およびｈＰＴＨ−（１−２４）（黒四角）。結果
を、同じアッセイにおいて観察された、ｈＰＴＨ−（１−３４）に対する最大応
答のパーセンテージとして（ＡおよびＢ）または¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ_8,21，Ｔｙｒ_{3 4} ］ラットＰＴＨ−（１−３４）放射性リガンドの特異的結合の合計のパーセン
テージとして（Ｃ）表す。各点は、いくつかの（すなわち、２〜４の）実験から
の結果の平均±ＳＥＭを表す。この実験の各々は、３連で行った（結合データの
ＳＥＭは代表的に、総結合の３％未満であり、従ってしばしば記号によって隠さ
れている）。

【図２Ａ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるＮ末端が改変されたｈＰＴＨ−（１−３４）アナ
ログの特性。（Ａ）示した濃度の以下のものに対応した細胞内ｃＡＭＰ蓄積：ｈ
ＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）、ｈＰＴＨ−（２−３４）（白丸）、［Ａｌａ¹
］ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒三角）、［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（
黒逆三角）、デスアミノ−［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白三角）、お
よびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白逆三角）；（Ｂ）１
０００ｎＭの示したペプチドに応答したＩＰ₃の形成；（Ｃ）パネルＡに示した
のと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図１に記載したように
表す。

【図２Ｂ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるＮ末端が改変されたｈＰＴＨ−（１−３４）アナ
ログの特性。（Ａ）示した濃度の以下のものに対応した細胞内ｃＡＭＰ蓄積：ｈ
ＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）、ｈＰＴＨ−（２−３４）（白丸）、［Ａｌａ¹
］ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒三角）、［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（
黒逆三角）、デスアミノ−［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白三角）、お
よびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白逆三角）；（Ｂ）１
０００ｎＭの示したペプチドに応答したＩＰ₃の形成；（Ｃ）パネルＡに示した
のと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図１に記載したように
表す。

【図２Ｃ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるＮ末端が改変されたｈＰＴＨ−（１−３４）アナ
ログの特性。（Ａ）示した濃度の以下のものに対応した細胞内ｃＡＭＰ蓄積：ｈ
ＰＴＨ−（１−３４）（黒丸）、ｈＰＴＨ−（２−３４）（白丸）、［Ａｌａ¹
］ｈＰＴＨ−（１−３４）（黒三角）、［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（
黒逆三角）、デスアミノ−［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白三角）、お
よびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）（白逆三角）；（Ｂ）１
０００ｎＭの示したペプチドに応答したＩＰ₃の形成；（Ｃ）パネルＡに示した
のと同じペプチドの競合的放射性リガンド結合。結果を、図１に記載したように
表す。

【図３Ａ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位また
は１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度で添加した［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴ
Ｈ−（１−２８）（黒四角）、［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）
、および［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）について示す。結果を
、図１に記載したように表す。参照のために、図１に先に示したｈＰＴＨ−（１
−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）についての応答を、それぞれ、破線およ
び点線を用いて再度プロットする。

【図３Ｂ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位また
は１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度で添加した［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴ
Ｈ−（１−２８）（黒四角）、［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）
、および［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）について示す。結果を
、図１に記載したように表す。参照のために、図１に先に示したｈＰＴＨ−（１
−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）についての応答を、それぞれ、破線およ
び点線を用いて再度プロットする。

【図３Ｃ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位また
は１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度で添加した［Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴ
Ｈ−（１−２８）（黒四角）、［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）
、および［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ−（１−２８）（白三角）について示す。結果を
、図１に記載したように表す。参照のために、図１に先に示したｈＰＴＨ−（１
−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）についての応答を、それぞれ、破線およ
び点線を用いて再度プロットする。

【図４Ａ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位およ
び１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度での［Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈ
ＰＴＨ−（１−２８）（黒三角）および［Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ−（１
−２８）（黒逆三角）について示す。結果を、図１において記載されるように表
す。参照のために、ｈＰＴＨ−（１−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）につ
いての応答を図３においてと同様に示す。

【図４Ｂ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位およ
び１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度での［Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈ
ＰＴＨ−（１−２８）（黒三角）および［Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ−（１
−２８）（黒逆三角）について示す。結果を、図１において記載されるように表
す。参照のために、ｈＰＴＨ−（１−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）につ
いての応答を図３においてと同様に示す。

【図４Ｃ】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞におけるｈＰＴＨ−（１−２８）の特性に対する１位およ
び１９位での変異の効果。細胞内ｃＡＭＰ蓄積（Ａ）、ＩＰ₃形成（Ｂ）および
競合的放射性リガンド結合（Ｃ）を、示した濃度での［Ａｌａ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈ
ＰＴＨ−（１−２８）（黒三角）および［Ｇｌｙ¹，Ａｒｇ¹⁹］ｈＰＴＨ−（１
−２８）（黒逆三角）について示す。結果を、図１において記載されるように表
す。参照のために、ｈＰＴＨ−（１−３４）およびｈＰＴＨ−（１−２８）につ
いての応答を図３においてと同様に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ガーデラ， トーマス ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02492， ニードハム， グリーンデイル アベニュー 1045 (72)発明者 ポッツ， ジョン ティー． ジュニア アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02165， ウエスト ニュートン， チェ スナット ストリート 129 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 CA02 DA02 DA05 DA12 FA02 GA11 GA25 HA11 HA17 4B064 AG15 CA02 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 BA01 BA19 BA23 DB32 MA55 MA59 MA66 NA14 ZA97 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA52 CA40 DA30 EA20 EA50 FA50 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本質的に以下の式からなるペプチドに対して少なくとも９０
   ％同一である、生物学的に活性なペプチド： （ａ） 【化１】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
   酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、 ただし、該ペプチドは、ｈＰＴＨ（１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）Ｎ
   Ｈ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。
2. 【請求項２】 本質的に以下の式からなる、生物学的に活性なペプチド： （ａ） 【化２】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
   酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、 ただし、該ペプチドは、ｈＰＴＨ（１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）Ｎ
   Ｈ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。
3. 【請求項３】 前記ペプチドが、放射標識、蛍光標識、生物発光標識または
   化学発光標識からなる群より選択される標識を用いて標識される、請求項１に記
   載のペプチド。
4. 【請求項４】 前記放射標識が^99mＴｃである、請求項３に記載のペプチド
   。
5. 【請求項５】 【化３】 である、請求項１に記載のペプチド。
6. 【請求項６】 【化４】 である、請求項１に記載のペプチド。
7. 【請求項７】 【化５】 である、請求項１に記載のペプチド。
8. 【請求項８】 【化６】 である、請求項１に記載のペプチド。
9. 【請求項９】 【化７】 である、請求項１に記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 以下および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組
    成物： （ａ）本質的に以下の式からなるペプチドに対して少なくとも９０％同一であ
    る、生物学的に活性なペプチド： 【化８】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。
11. 【請求項１１】 以下および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組
    成物： （ａ）本質的に以下の式からなる、生物学的に活性なペプチド： 【化９】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。
12. 【請求項１２】 本質的に、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を
    有する生物学的に活性なペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる、核酸
    分子： （ａ） 【化１０】 ；あるいは （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。
13. 【請求項１３】 以下を含む、組換えＤＮＡ分子： （１）発現制御領域； （２）該領域が作動可能に連結される、生物学的に活性なペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド配列、 であって、ここで、該ペプチドは、以下からなる群より選択される： （ａ） 【化１１】 ；あるいは （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇである。
14. 【請求項１４】 生物学的に活性なペプチドを調製する方法であって、該方
    法は、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子を宿主に導入する工程、および該分
    子の発現を引き起こす工程、を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の核酸分子をベクター中に挿入する工程
    を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子であって、ここで、
    前記制御領域が、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、真菌プロモーター
    または哺乳動物プロモーターを含む、組換えＤＮＡ分子。
17. 【請求項１７】 請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、宿主細胞。
18. 【請求項１８】 原核生物細胞である、請求項１７に記載の細胞。
19. 【請求項１９】 細菌細胞である、請求項１８に記載の細胞。
20. 【請求項２０】 真核生物細胞である、請求項１７に記載の細胞。
21. 【請求項２１】 酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の
    細胞。
22. 【請求項２２】 骨質量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状
    態を処置するための方法であって、該方法は、骨質量を増大するに有効な量の生
    物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを、処置する必要が
    ある被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドは、本質的に以下から
    なる群より選択されるメンバーに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配
    列を含む、方法： （ａ） 【化１２】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、 ただし、該ペプチドは、ｈＰＴＨ（１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）Ｎ
    Ｈ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。
23. 【請求項２３】 骨質量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状
    態を処置するための方法であって、該方法は、骨質量を増大するに有効な量の生
    物学的に活性なペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを、処置する必要が
    ある被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ペプチドは、本質的に以下の式
    からなる、方法： （ａ） 【化１３】 （ｂ）アミノ酸１〜２４、アミノ酸１〜２５、アミノ鎖１〜２６またはアミノ
    酸１〜２７を含む、そのフラグメント； （ｃ）その薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）そのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； ここで： Ｘ₀₁は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｙであり；そして Ｘ₀₂は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり、 ただし、該ペプチドは、ｈＰＴＨ（１−２６）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（１−２７）Ｎ
    Ｈ₂またはｈＰＴＨ（１−２８）ＮＨ₂ではない。
24. 【請求項２４】 骨形成、骨吸収および／または骨リモデリングの速度を決
    定するための方法であって、該方法は、有効量の請求項４に記載のペプチドを患
    者に投与する工程、ならびに該患者の骨への該ペプチドの取り込みを決定する工
    程を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記骨質量を
    増大するに有効な量の前記ペプチドが、該ペプチドをコードする患者のＤＮＡに
    提供されることおよびインビボで該ペプチドを発現することによって投与される
    工程を包含する、方法。
26. 【請求項２６】 前記処置されるべき状態が骨粗しょう症である、請求項２
    ３に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記骨粗しょう症が、老年性骨粗しょう症である、請求項
    ２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記骨粗しょう症が閉経後の骨粗しょう症である、請求項
    ２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記骨質量を増大するに有効な量のペプチドが、約０．０
    １μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日である、請求項２３に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記投与の方法が非経口的である、請求項２３に記載の方
    法。
31. 【請求項３１】 前記投与の方法が皮下的である、請求項２３に記載の方法
    。
32. 【請求項３２】 前記投与の方法が鼻吸入的である、請求項２３に記載の方
    法。