JP2002533115A - Ｐｔｈ機能的ドメイン結合体ペプチド、それらの誘導体、および新規係留リガンド−レセプター分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リンカーを介して、Ｎ末端のシグナル伝達ドメイン（残基１〜９）とＣ末端の結合ドメイン（残基１５〜３１）とを結合したＰＴＨ（１〜３４）フラグメントの新規副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチド、およびそれらのアナログが、開示される。ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）５−ＰＴＨ（１５〜３１）（ＰＧ５）およびＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）７−ＰＴＨ（１５〜３１）および新規ＰＴＨレセプターに対する核酸分子およびペプチドが、開示される。さらに、ＰＴＨアゴニストについてのスクリーニングの方法、薬学的組成物、および処置の方法が、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、分子生物学、発生生物学、生理学、神経生物学、内分泌学および医
学の分野に関する。

【０００２】 （関連技術の説明） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、主要な標的細胞が骨および腎臓中に生じるカ
ルシウムホメオスタシスの主要なレギュレーターである。カルシウム濃度の調節
は、胃腸系、骨格系、神経系、神経筋系、および心血管系の正常な機能に必要と
される。ＰＴＨの合成および放出は、血清カルシウムレベルによって主に制御さ
れ；低レベルは、ホルモンの合成および放出の両方を刺激し、そして高レベルは
、ホルモンの合成および放出の両方を抑制する。次いで、ＰＴＨは、カルシウム
交換の３つの部位（腸、骨、および腎臓）にて、血液中へのカルシウムの進入を
直接的または間接的に促進することによって、血清カルシウムレベルを維持する
。ＰＴＨは、ビタミンＤの活性形態の腎臓での合成を促進することによって、カ
ルシウムの正味の胃腸吸収に寄与する。ＰＴＨは、骨吸収細胞である破骨細胞の
分化を刺激することによって、間接的に、骨からのカルシウム吸収を促進する。
これはまた、腎臓に対する少なくとも３つの主要な効果（尿細管カルシウム再吸
収の刺激、リン酸クリアランスの増強、およびビタミンＤの活性形態の合成を完
了させる酵素における増加の促進）を媒介する。ＰＴＨは、主に、アデニル酸シ
クラーゼおよびホスホリパーゼＣのレセプター媒介性活性化を通して、これらの
効果を発揮する。

【０００３】 カルシウムホメオスタシスの破壊は、多くの臨床的な障害（例えば、重篤な骨
疾患、貧血、腎臓障害、潰瘍、ミオパシー、および神経障害）を生じ得、そして
通常、副甲状腺ホルモンのレベルにおける変化を生じる状態から生じる。高カル
シウム血症は、血清カルシウムレベルにおける上昇によって特徴付けられる状態
である。これは、しばしば、過剰なＰＴＨ産生が上皮小体の病変（例えば、腺腫
、過形成、または癌腫）の結果として生じる原発性上皮小体機能亢進症と関連す
る。別の型の高カルシウム血症である、悪性の体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ
）は、最も一般的な腫瘍随伴性症候群である。これは、ＰＴＨとアミノ酸相同性
を共有するタンパク質ホルモンのクラスの腫瘍（例えば、扁平癌、腎臓癌、卵巣
癌、または膀胱癌）による産生からのほとんどの例を生じるようである。これら
のＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）は、ＰＴＨの特定の腎臓作用および骨格
作用を模倣するようであり、そしてこれらの組織においてＰＴＨレセプターと相
互作用すると考えられる。ＰＴＨｒＰは、通常、多くの組織（ケラチノサイト、
脳、下垂体、上皮小体、副腎皮質、髄質、胎児肝臓、骨芽細胞様細胞、および乳
汁分泌性乳房組織を含む）中で低レベルで見出される。多くのＨＨＭ悪性疾患に
おいて、ＰＴＨｒＰは、循環系において高レベルで見出され、それによってＨＨ
Ｍと関連するカルシウムレベルの上昇を生じる。

【０００４】 ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの薬理学的プロフィールは、ほとんどのインビトロで
のアッセイ系においてほぼ同一であり、そして上昇した血液レベルのＰＴＨ（す
なわち、原発性上皮小体機能亢進症）またはＰＴＨｒＰ（すなわち、ＨＨＭ）は
、ミネラルイオンのホメオスタシスに対して匹敵する効果を有する（Ｂｒｏａｄ
ｕｓ，Ａ．Ｅ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．、「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ
ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒ
ｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ」、
Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂｉｌｚｉｋｉａ
ｎ，Ｊ．Ｐ．ら編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、
２５９〜２９４頁；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｍ．ら、「Ｐａｒａｔｈｙｒｏ
ｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．およびＭ
ａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇ（１９９３）、１８５〜２０１頁）。この２つのリガンドの生物学的活性に
おける類似性は、骨および腎臓において豊富に発現される共通のレセプターであ
るＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターとのそれらの相互作用によって説明され得る（
Ｕｒｅｎａ，Ｐ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：４５１〜４５６（
１９９４））。

【０００５】 ネイティブなヒト副甲状腺ホルモンは、８４アミノ酸の非改変ポリペプチドで
ある。これは、低い血液カルシウムレベルに応答して、上皮小体から分泌され、
そして骨における骨芽細胞（骨構築細胞）、および腎臓の尿細管上皮細胞に作用
する。このホルモンは、骨芽細胞および腎尿細管細胞の両方によって発現される
細胞表面レセプター分子（ＰＴＨ−１レセプターまたはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセ
プターと呼ばれる）と相互作用する。ＰＴＨｒＰ（悪性の体液性高カルシウム血
症の主要な原因）はまた、発生における役割を含む正常な機能を有する。ＰＴＨ
ｒＰは、１４１アミノ酸を有するが、選択的遺伝子スプライシング機構から生じ
る改変体もまた、生じる。ＰＴＨｒＰは、ＰＴＨ−１レセプターへの結合もまた
含むプロセスを通じての骨格の形成における重要な役割を果たす（Ｋａｒａｐｌ
ｉｓ，Ａ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．８：２７７〜２８９（１９９
４）およびＬａｎｓｋｅ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：６６３〜６６６（
１９９６））。

【０００６】 ＰＴＨ−１レセプターは、ペプチドホルモン（例えば、セクレチン（Ｉｓｈｉ
ｈａｒａ，Ｔ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１６３５〜１６４１（１９９１））、
カルシトニン（Ｌｉｎ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２２〜１０
２４（１９９１）およびグルカゴン（Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５９：１６１４〜１６１６（１９９３））を結合する多数の他のレセプ
ターのメンバーに対して、一次構造において相同であり；ともに、これらのレセ
プターは、レセプターファミリーＢと呼ばれる独特なファミリーを形成する（Ｋ
ｏｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｆ．、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅｌ
ｓ ２：１〜７（１９９４））。このファミリー内では、ＰＴＨ−１レセプター
は、それが２つのペプチドリガンドに結合し、それによって２つの別々の生物学
的プロセスを調節するという点で独特である。最近同定されたＰＴＨレセプター
サブタイプ（ＰＴＨ−２レセプターと呼ばれる）は、ＰＴＨを結合するが、ＰＴ
ＨｒＰを結合しない（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：
１５４５５〜１５４５８（１９９５））。この観察は、ＰＴＨリガンドとＰＴＨ
ｒＰリガンドとの構造的差異が、ＰＴＨ−２レセプターとの相互作用についての
選択性を決定することを暗示した。このＰＴＨ−２レセプターは、脳、膵臓、お
よび血管系において、ＲＮＡ法によって検出されているが、その生物学的機能は
、決定されていない（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：
１５４５５〜１５４５８（１９９５））。ファミリーＢレセプターは、それら自
体の同属ペプチドホルモンが関与する、共通の分子機構を使用すると仮定されて
いる（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６
９〜２６４７２（１９９６））。

【０００７】 放射性標識したＰＴＨ（１〜３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３６）のいずれか
のＰＴＨ−１レセプターへの結合は、いずれかの非標識リガンドによって競合的
に阻害される（Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８
５５７〜８５６０（１９８８）；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２８６６〜１２８７１（１９８８））。従って、ＰＴ
Ｈ−１レセプターの２つのリガンドに対する認識部位は、おそらく重複する。Ｐ
ＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方において、１５〜３４の領域は、ＰＴＨ−１レセプ
ターへの結合に対する主要な決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を含む。これら
の領域は、最小の配列相同性（３アミノ酸のみの同一性）のみを示すが、各々の
１５〜３４ペプチドは、ＰＴＨ（１〜３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３４）のい
ずれかのＰＴＨ−１レセプターへの結合をブロックし得る（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，
Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３〜１０１８７（１９
８０）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２
７：８３〜８７（１９９０）；Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．−Ｂ．ら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５〜２２１７（１９８９））。さらに、各
リガンドのアミノ末端部分は、生物活性のために必要とされ、そしてこれらは、
おそらく、類似の様式にてＰＴＨ−１レセプターと相互作用する。なぜなら、こ
れらの残基の１３のうちの８は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰにおいて同一であるか
らである。

【０００８】 ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの両方は、ｎＭ範囲の親和性で、ＰＴＨ−１レセプタ
ーに結合し；リガンド占有レセプターは、中間的にヘテロ三量体ＧＴＰ結合タン
パク質（Ｇタンパク質）を含む機構を通じて、細胞内エフェクター酵素へと細胞
膜を横切って「シグナル」を伝達する。ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰに応答してＰＴ
Ｈ−１レセプターによって活性化される一次細胞内エフェクター酵素は、アデニ
リルシクラーゼ（ＡＣ）である。従って、ＰＴＨは、骨再造形（骨形成および骨
吸収の両方のプロセス）に関与する、不十分にしか特徴付けられていない「下流
」の細胞プロセスを調節し続ける、「セカンドメッセンジャー」分子であるサイ
クリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）における強い増大を誘導する。特定の
細胞ベースのアッセイ系において、ＰＴＨは、イノシトール三リン酸（ＩＰ₃）
、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、および細胞内カルシウム（ｉＣａ²⁺）の産
生を生じる、ＡＣ以外のエフェクター酵素（ホルホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を含む
）を刺激し得る。骨代謝におけるこれらの非ｃＡＭＰセカンドメッセンジャー分
子の役割は、現在未知である。

【０００９】 骨粗しょう症は、高齢集団のかなりの部分において、妊娠女性において、およ
び若年においてさえも観察される潜在的な損傷性（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）骨格疾
患である。この疾患は、骨質量の減少、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の減少、骨強
度の減少および骨折の危険性の増大によって特徴付けられる。現在、エストロゲ
ン、カルシトニンおよびビスホスホネート、エチドロネートおよびアレンドロネ
ート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）が、骨吸収を減少させるそれらの作用を通して
、種々のレベルの成功で、骨粗しょう症を処置するために使用されるが、この疾
患についての有効な治療は存在しない。副甲状腺ホルモンは、断続的に投与され
る場合、血液カルシウムおよびリン酸レベルを調節し、そして動物における骨格
に対する強力な同化（骨形成）効果（Ｓｈｅｎ，Ｖ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｉｎｔ．５０：２１４〜２２０（１９９２）；Ｗｈｉｔｅｆｉｌｄ，Ｊ
．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５６：２２７〜２３１（１９
９５）およびＷｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ
Ｉｎｔ．６０：２６〜２９（１９９７））、およびヒトにおける骨格に対する強
力な同化（骨形成）効果（Ｓｌｏｖｉｋ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅ
ｒ．Ｒｅｓ．１：３７７〜３８１（１９８６）；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら
、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４：６９０〜７０９（１９９３）およびＤｅｍｐｓ
ｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２６１（１９９４））を有
するので、ＰＴＨまたはＰＴＨ誘導体は、骨粗しょう症についての新規かつ効果
的な治療のための一番の候補である。

【００１０】 短縮型ＰＴＨ誘導体（例えば、ＰＴＨ（１〜３４）およびＰＴＨ（１〜３１）
）は、ほとんどのアッセイ系において活性であり、そして骨形成を促進する（Ｗ
ｈｉｔｅｆｉｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５６：
２２７〜２３１（１９９５）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ
．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．６０：２６〜２９（１９９７）；Ｓｌｏｖｉｋ，Ｄ．
Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１：３７７〜３８１（１９８６）
；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９
〜１３５３（１９７３）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ
．Ｒｅｓ．９：１１７９〜１１８９（１９９４）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ
．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１
６：３７２〜３８６（１９９５）ならびにＷｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃ
ａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５８：８１〜８７（１９９６））。しかし
、これらのペプチドは、効率的な非経口送達および低コストのためにはなお大き
すぎる。ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのさらにより小さな「最小化された」バージョ
ンの発見は、骨粗しょう症のための新しい処置を開発する試みにおいて重要な進
歩である。

【００１１】 １〜１４の領域において、アミノ酸の置換または欠失を有する、ＰＴＨ誘導体
およびＰＴＨｒＰ誘導体は、通常、活性の減少を示す（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９〜１３５３（１９７３）；
Ｇｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：３１９９〜３２
０３（１９７５）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：１０
５３〜１０５５（１９８３）およびＧａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３１４１〜１３１４６（１９９１））。

【００１２】 いくつかの短いＮＨ₂末端ＰＴＨペプチドまたはＰＴＨｒＰペプチドは、以前
に調査されているが、活性は、全く検出されなかった。例えば、ｂＰＴＨ（１〜
１２）は、ラット腎臓膜において行われたアデニリルシクラーゼアッセイにおい
て不活性であり（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．、「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈ
ｏｒｍｏｎｅ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ」、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ，Ｉ
ｏａｃｈｉｍ，Ｈ．Ｌ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８１）、５３〜８４頁）、そしてＰＴＨｒＰ（１〜１６）は、クローニングされ
たラットＰＴＨ−１レセプターを発現しているチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞において行われたＡＣアッセイにおいて不活性であった（Ａｚｕｒａ
ｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４９３１〜１４９３６（１
９９６））。ＰＴＨの１５〜３４のドメインにおける残基が、レセプター結合親
和性に重要に寄与することが既知である。なぜなら、ＰＴＨ（１５〜３４）フラ
グメントは、このレセプターに弱く結合するが、このペプチドは、ＡＣを活性化
しないからである（Ｎａｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５５：１０１８３〜１０１８７（１９８０）およびＧａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．
Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０２４〜２０３０（１９９３
））。

【００１３】 （発明の要旨） 比較的大きなサイズのネイティブなＰＴＨまたはＰＴＨｒＰは、骨粗しょう症
のための処置として、これらのペプチドの使用に対するチャレンジを提示する。
一般に、このサイズのタンパク質は、薬物としての使用に適切ではない。なぜな
ら、これは、単純な方法（例えば、鼻通気法）によって効果的に送達され得ない
からである。代わりに、注射が必要とされ、そしてＰＴＨの場合には、毎日また
はほぼ毎日の注射が、骨形成速度における増加を達成するために最も必要とされ
るようである。さらに、より大きなペプチドは、従来の合成化学法によって調製
するには技術的に困難であり、かつ高価である。組換えＤＮＡおよび細胞ベース
の発現系を用いる代替方法もまた、高価であり、外来タンパク質による混入に対
して潜在的に無防備であり、そして送達の問題を回避しない。

【００１４】 従って、当業者が、より大きなペプチドに基づき、そしてさらになお所望の生
物学的活性を保持する低分子アナログ（ペプチドまたは非ペプチドのいずれか）
を同定し得ることは有利である。活性は、インタクトなペプチドに対して初めは
弱くあり得るが、さらなる最適化は、効力および強度の増強を導き得る。

【００１５】 本発明は、式または構造がＳ−（Ｌ）_n−Ｂである化合物に関し、ここで、Ｓ
は、ＰＴＨのアミノ末端シグナル伝達の機能的ドメインであり；Ｌは、ｎ回存在
するリンカー分子であり、ｎは好ましくは１〜９の整数であり；そして、Ｂは、
ＰＴＨ（１〜３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３４）のカルボキシ末端の機能的ド
メインに一致する任意の配列である。好ましい実施形態は、１０〜２０アミノ酸
の長さであるＢ部分を含む。より好ましい実施形態は、ＰＴＨ（１５〜３１）ま
たはＰＴＨ（１７〜３１）を含む。化合物は、好ましくは、単離されたペプチド
またはポリペプチドである。本発明のこの局面はまた、ＳおよびＢ部分ならびに
その誘導体のアミノ酸組成、またはアミノ酸の鎖長における改変による、これら
のＳ−（Ｌ）_n−Ｂペプチド由来のペプチド誘導体に関し、その薬学的に受容可
能な塩、ならびに／または、それらのＣ−誘導体は、本明細書中以下、集団的に
「本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物およびその誘導体」といわれる。

【００１６】 本発明はさらに、単離されたポリペプチドに関し、ここでＳは、Ｘ Ｖａｌ
Ｘ Ｇｌｕ ＸＸＸＸ Ｈｉｓ（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）４２）であっ
て、ここでＸは、アミノ酸であり、Ｌは、５〜１０のグリシン残基であり、そし
てＢは、ＸＸＸＸＸ Ａｒｇ ＸＸ Ｔｒｐ Ｘ Ｌｅｕ Ｘ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
ＸＸ Ｖａｌ（配列番号４３）であって、ここでＸは、アミノ酸である。本発
明はまた、請求項１の単離されたポリペプチドに関し、ここでＳは、Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ（配列番号４
４）であり、Ｌは、５〜１０のグリシン残基であり；そしてＢは、Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ（配列番号４５）である
。

【００１７】 本発明はさらに、係留したリガンド／レセプターに関する化合物または単離さ
れたペプチドに関し、上記化合物または単離されたペプチドは、Ｒ₁−Ｓ−（Ｌ
）_n−ＲまたはＳ−（Ｌ）_n−Ｒである式または構造を有し、ここでＲ₁は、ＰＴ
Ｈ−１レセプターシグナル配列であり；Ｓは、アミノ末端のリガンドシグナル伝
達ペプチドであり；Ｌは、Ｎ回存在するリンカー分子であって、ここでＮは正の
整数１〜１０であり、最も好ましくは４であり、そしてＲは、ＰＴＨ−１レセプ
ター配列またはレセプター配列の一部分である。

【００１８】 本発明はさらに、化合物またはポリペプチドＳ−（Ｌ）_n−Ｂ、Ｒ₁−Ｓ−（Ｌ
）_n−ＲまたはＳ−（Ｌ）_n−Ｒをコードする核酸配列に関する。

【００１９】 本発明はさらに、単離されたポリペプチド、または式Ｓ−Ｒのポリペプチドを
コードする核酸に関し、ここでＳは、アミノ末端のシグナル伝達ポリペプチドで
あり；そしてＲは、カルボキシ末端のレセプターポリペプチドであり、そしてこ
こで上記シグナル伝達ポリペプチドおよび上記レセプターポリペプチドは、互い
に結合されている。本願発明の好ましい実施形態は、ポリペプチドに関し、ここ
でＳは、アミノ末端のシグナル伝達ポリペプチドＸ Ｖａｌ Ｘ Ｇｌｕ ＸＸ
ＸＸ Ｈｉｓであり、ここでＸはアミノ酸である。

【００２０】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂの別
々の機能的ドメインの、別々、または組み合わせた操作（すなわち、アミノ酸残
基の置換など）を介してＰＴＨ−１レセプター機能のアゴニストおよびアンタゴ
ニストを開発するための新規アプローチを提供する。

【００２１】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明は、治療有効量のＳ−（Ｌ）_n−
Ｂペプチド、Ｎ−誘導体またはＣ−誘導体、それらの薬学的に受容可能な塩；お
よび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、生物学的に活性な
ペプチドを必要とする患者の処置のための方法を提供する。

【００２２】 本発明のなおさらなる局面に従って、改変された、または過剰なＰＴＨ−１／
ＰＴＨ−２レセプターの作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供
され、この方法は、治療的有効量の生物学的に活性なＳ−（Ｌ）_n−Ｂペプチド
、その薬学的に受容可能な塩、またはそれらのＮ−誘導体もしくはＣ−誘導体、
および上記患者のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターの活性化を阻害するのに十
分な、薬学的に受容可能なキャリアを患者に投与する工程を包含する。

【００２３】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明はまた、骨再形成、骨吸収および
／または骨再造形の速度を決定するための方法を提供し、この方法は、有効量の
本発明の標識化Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂペプチド、またはその誘導体を患者に投与する
工程、および上記ペプチドの上記患者の骨への取り込みを決定する工程を包含す
る。このペプチドは、以下からなる群から選択される標識を用いて標識され得る
：放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識。適切な放射性標
識の例は、^99mＴｃである。

【００２４】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明は、ＰＴＨレセプター機能のアゴ
ニストおよびアンタゴニストの開発において有用な新規ＰＴＨレセプターを提供
する。

【００２５】 本発明はさらに、骨質量における減少により特徴づけられる哺乳動物の状態を
処置する方法に関し、ここで上記方法は、骨質量を増加する有効量の本発明のポ
リペプチドを、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。本発明の別
の局面は、上記ペプチドをコードするＤＮＡを患者に投与し、そして上記ペプチ
ドをインビボで発現させることにより同じ状態を処置することに関する。好まし
くは、処置されるべき状態は、骨粗しょう症である。このポリペプチドの投与は
、当業者に公知の任意の方法によるものであり得、好ましくは、上記ポリペプチ
ドの有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１．０μｇ／ｋｇ／日である。

【００２６】 本発明はさらに、減少したＴｅｔｈｅｒ１活性と関連する疾患および障害の処
置の方法に関し、それを必要とする患者に有効量の本発明のポリペプチドを投与
する工程を包含する。

【００２７】 本発明はさらに、ＰＨＴ−１レセプターを有する哺乳動物細胞において、ｃＡ
ＭＰを増加させることに関し、上記細胞を十分な量の本発明のポリペプチドに接
触させ、ｃＡＭＰを増加させる工程を包含する。

【００２８】 全ての本発明の上記実施形態において、本願ポリペプチドの「Ｓ」成分はまた
、疾患状態を処置するために使用され得る。

【００２９】 さらに、本発明は、ペプチドまたは非ペプチドＰＴＨアゴニストについてのス
クリーニングのための方法に関し、以下の工程を包含する：ａ）式Ｒ₁−Ｓ−（
Ｌ）_n−ＲまたはＳ−（Ｌ）_n−Ｒの構造を有するポリペプチドを結合させる工程
であって、ここで：ｉ）Ｒ₁は、ＰＴＨ−１レセプターシグナル配列であり；ｉ
ｉ）Ｓは、アミノ末端のリガンドシグナル伝達ペプチドであり；ｉｉｉ）Ｌは、
ｎ回存在するリンカー分子であり、ここでｎは正の整数１〜１０、最も好ましく
は４であり；そして、ｉｖ）Ｒは、潜在的なアゴニストに対するＰＴＨ−１レセ
プター配列またはそのレセプター配列の一部分である、工程；およびｂ）上記ポ
リペプチドから上記潜在的なアゴニストを単離する工程。好ましくは、上記ポリ
ペプチドは、Ｔｅｔｈｅｒ−１、［Ｒ１１］−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）または
ｒδＮｔである。本発明のさらなる実施形態において、上記の方法により単離さ
れたポリペプチドを得て、そしてそのポリペプチドを任意の上記の状態を処置す
るために使用するか、または代わりに、好ましいＲ₁−Ｓ−（Ｌ）_n−Ｒもしくは
Ｓ−（Ｌ）_n−ＲポリペプチドからＳ成分を選択的に使用し得る。

【００３０】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本明細書および特許請求の範囲のより明確な理解を提供するために、以下の定
義が提供される。

【００３１】 （１．定義） 以下の記載において、組換えＤＮＡ技術およびペプチド合成において用いられ
る多くの用語は、幅広く利用される。本明細書および特許請求の範囲の明確なか
つ一貫した理解を提供するために、そのような用語に与えられる範囲を含む、以
下の定義が提供される。

【００３２】 クローニングベクター：プラスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配
列は、宿主細胞で自律的に複製し得、そしてこのようなＤＮＡ配列がベクターの
本質的な生物学的機能を失うことなく所定の様式に切断され得る、１つまたは少
数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられ、そして、ＤＮＡフラ
グメントがその複製またはクローニングをもたらすために、この認識部位中にス
プライスされ得る。クローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形
質転換された細胞の同定において用いられる適切なマーカーを含む。例えば、マ
ーカーは、テトラサイクリン耐生またはアンピシリン耐生を提供する。

【００３３】 発現ベクター：クローニングベクターに類似するが、宿主への形質転換の後に
クローニングされた遺伝子の発現を増強し得る、ベクターである。このクローニ
ングされた遺伝子は、通常、プロモーター配列のような特定のコントロール配列
の制御下に（すなわち、作動可能に連結して）おかれる。プロモーター配列は、
構成的であっても誘導的であってもいずれでもよい。

【００３４】 組換え宿主：本発明によれば、組換え宿主は、所望のクローン化遺伝子を発現
ベクターまたはクローニングベクターに含む、任意の原核生物宿主細胞または真
核生物宿主細胞であり得る。この用語はまた、その生物の染色体もしくはゲノム
において所望の遺伝子を含むように遺伝子操作された、原核生物細胞または真核
生物細胞を含むことを意味する。このような宿主の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）
を参照のこと。好ましい組換え宿主は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換した真
核細胞である。より具体的には、哺乳動物細胞が好ましい。

【００３５】 プロモーター：開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領域として通常記
載される、ＤＮＡ配列である。隣接遺伝子の転写は、このプロモーター領域にお
いて開始される。プロモーターが誘導的プロモーターである場合には、転写速度
は、誘導薬剤に応答して増加する。対照的に、このプロモーターが構成的プロモ
ーターである場合には、転写速度は、誘導薬剤によって調節されない。プロモー
ターの例としては、ＣＭＶプロモーター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、およびｈＭＴ
ＩＩａプロモーター（米国特許第５，４５７，０３４号）、ＨＳＶ−１ ４／５
プロモーター（米国特許第５，５０１，９７９号）、および初期中間体ＨＣＭＶ
プロモーター（ＷＯ９２／１７５８１）が挙げられる。また、組織特異的なエン
ハンサーエレメントが利用され得る。さらに、このようなプロモーターは、生物
の組織特異的プロモーターおよび細胞特異的プロモーターを含み得る。

【００３６】 ポリヌクレオチド：この用語は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたは
ポリデオキシリボヌクレオチドをいい、これらは、改変されていないＲＮＡもし
くはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレ
オチド」としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：一本鎖ＤＮＡ
および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本
鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物で
あるＲＮＡ、一本鎖領域または、より代表的には、二本鎖もしくは一本鎖領域と
二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子。
さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよ
びＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域をいう。用語ポリヌクレオチドはまた、１つ
以上の改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性もしくは他の理
由のために骨格が改変されたＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「改変された」塩基と
は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられ
る。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされてきた；従って、「ポリ
ヌクレオチド」とは、代表的に自然に見出されるような、化学的に、酵素的に、
または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細
胞に特徴的であるＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。「ポリヌクレオチド
」はまた、比較的短いポリヌクレオチド（しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれ
る）を含む。

【００３７】 ポリペプチド：この用語は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合（す
なわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ））によって互いに連結され
た２つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリ
ペプチド」とは、短鎖（通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ば
れる）、および長鎖（一般にタンパク質と呼ばれる）の両方を意味する。ポリペ
プチドは、２０遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポ
リペプチド」とは、自然のプロセス（翻訳後プロセシングのような）、または当
該分野において周知の化学的改変技術のいずれかによって改変された、アミノ酸
配列を含む。このような改変は、基礎的な教科書に十分に記載され、そして研究
論文ならびに研究文献に、さらに詳細に記載される。改変は、ペプチド骨格、ア
ミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドの任
意の位置で起こり得る。所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位において、
同程度または種々の程度で、同じ型の改変が存在し得ることが、考慮される。ま
た、所定のポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。

【００３８】 ポリペプチドは分枝鎖であり得、そしてこれらは、分枝を有するかまたは有さ
ない環式であり得る。環状、分枝鎖、および分枝環状のポリペプチドは、翻訳後
の自然なプロセスから生じ得るか、または合成的方法によって作製され得る。改
変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘
導体の共有結合付着、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合付着、ホスファチジル
イノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合付着、
架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合架橋の形成、シスチン
の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、
セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような、トランスファーＲＮＡにより媒
介される、タンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が挙げられる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３、ならびに
Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３のＷｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒ
ｅｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔ
ｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）およびＲａｔ
ｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ Ｎ
Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８〜６２（１９９２）を参照のこと。本発明
のポリペプチドは、Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、そしてＣ末端にカルボキシア
ミドを有する。

【００３９】 相同性／非相同性：２つの核酸分子のヌクレオチド配列が、ＨＡＳＨコードア
ルゴリズム（Ｗｉｌｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７２６〜７３０（１９８３））により決
定して４０％より大きな類似性を共有する場合に、これら２つの核酸分子は「相
同性」であるとみなされる。２つの核酸分子のヌクレオチド配列が４０％より小
さな類似性を共有する場合には、これら２つの核酸分子は、「非相同性」である
とみなされる。

【００４０】 単離された：天然の状態から「人間の手によって」改変されることを意味する
用語である。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合には、それ
はその最初の環境から変えられているか、または除去されているか、あるいはそ
の両方である。例えば、本明細書中においてこの用語が使用される場合には、生
存動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」
ていないが、その天然の状態において共存する物質から分離された同一のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。従って、組換え宿主細
胞内で産生されそして／またはそこに含まれる、ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドは、本発明の目的で単離されたとみなされる。また、組換え宿主細胞また
は天然の供給源から、部分的にまたは実質的に精製された、ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドは、「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌク
レオチド」であると意図される。例えば、配列番号１の化合物の組換え的に産生
されたバージョンおよびその誘導体は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅ
ｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程方法によって、実質的
に精製され得る。

【００４１】 「単離された」によって、本発明のＤＮＡが誘導される生物（もしあれば）の
天然に存在するゲノムにおいて、本発明のＤＮＡをコードする遺伝子にすぐ隣接
する遺伝子のコード配列を、ＤＮＡが有さないことを意味する。単離されたＤＮ
Ａは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ
、組換えハイブリッドＤＮＡ、または合成ＤＮＡであり得る。これは、配列番号
１の化合物およびその誘導体をコードするネイティブＤＮＡ配列と同一であり得
るか、またはそのような配列と、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または
置換によって、異なり得る。本発明の一本鎖ＤＮＡは、一般に、少なくとも８ヌ
クレオチド長（好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、そしてより好ましく
は少なくとも３０ヌクレオチド長）であり、配列番号１の化合物およびその誘導
体をコードするＤＮＡ分子の全長（すなわち、４２ヌクレオチド）までの範囲に
わたる；これらは好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用の
ために、検出可能に標識され、そしてアンチセンスであり得る。

【００４２】 生物学的細胞または宿主から作製される調製物を言及する場合に、単離された
または精製されたとは、目的のＤＮＡまたはタンパク質の粗抽出物を含む、示さ
れたＤＮＡまたはタンパク質を含む任意の細胞抽出物を意味すると理解されるべ
きである。例えば、タンパク質の場合には、精製された調製物は、個々の技術、
または一連の調製技術もしくは生化学的技術に従って得られ得、そして目的のＤ
ＮＡまたはタンパク質は、これらの調製物中に種々の精製の程度で存在し得る。
これらの手順としては、例えば、硫酸アンモニウム分別、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法
、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。

【００４３】 「純粋な」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物とは、この
ようなＤＮＡまたはタンパク質が本質的に通常会合する、天然に存在する物質を
含まない調製物を意味することが理解されるべきである。「本質的に純粋な」と
は、少なくとも９５％の目的のＤＮＡまたはタンパク質を含む、「高度に」精製
された調製物を意味することが理解されるべきである。

【００４４】 目的のＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞抽出物とは、目的のタンパク質を発
現するか、または目的のＤＮＡを含む細胞から得られる、ホモジェネート調製物
または無細胞調製物を意味することが、理解されるべきである。用語「細胞抽出
物」は、培養培地、特に、細胞が除去された、使用済みの培養培地を含むことを
意図する。

【００４５】 特許請求される発明の多数の実施形態は、単離されたかまたは精製されたポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを使用するが、常にそうである必要はない。例
えば、本発明の新規なレセプターを発現する組換え宿主細胞を、スクリーニング
アッセイにおいて使用して、発現されたレセプタータンパク質をさらに精製する
ことなく、ＰＴＨアゴニストを同定し得る。

【００４６】 高いストリンジェンシー：「高いストリンジェンシー」によって、例えば、ｃ
ＤＮＡの単離のために記載される条件のような条件を意味する（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）もまた参照のこと。本
明細書中に参考として援用する）。本発明のＤＮＡは、本発明のペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列（例えば、配列番号１の化合物およびその誘導体）およびその
ベクター（または上述の単離されたＤＮＡ）を含む細胞またはその細胞の本質的
に均一な集団（例えば、原核生物細胞、または哺乳動物細胞のような真核動物細
胞）を含む、精製された調製物（例えば、ライブラリーを作製するベクターの混
合物から分離されるベクター）として提供され得るベクター内に組み込まれ得る
。

【００４７】 同一性：この用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を
いう。一般に、これらの配列は整列され、その結果、最高次の一致が得られる。
「同一性」自体は、当該分野において認識される意味を有し、そして公開された
技術を使用して算出され得る。（例えば、以下を参照のこと：Ｃｏｍｐｕｔａｔ
ｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８
；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、 Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およ
びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ
ｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅ
ｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋ
ｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。２つのポリヌクレオチド
配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定するための多数の方法が存在す
るが、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬ
ｉｐｏｔｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３
（１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通常使用
される方法としては、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａ
ｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、１９９４、ならびにＣａｒｉｌｌｏ，ＨおよびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．、Ｓ
ＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に記載さ
れる方法が挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定す
る方法は、コンピュータプログラムに体系化される。２つの配列間の同一性およ
び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法としては、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ
、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌｅｃ
Ｂｉｏｌ ２１５：４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００４８】 従って、本明細書中において使用する場合に、用語「同一性」とは、試験ポリ
ペプチドと参照ポリペプチドとの間の比較を表す。より特定すると、参照試験ポ
リペプチドは、参照ポリペプチドと８５％以上が同一である任意のポリペプチド
として、定義される。本明細書中において使用する場合に、用語少なくとも８５
％が同一であるとは、参照ポリペプチドに対して８５〜９９．９９のパーセント
同一性をいう。８５％以上のレベルの同一性は、例示の目的で１００アミノ酸の
試験ポリヌクレオチド長および参照ポリヌクレオチド長を仮定すると、この試験
ポリペプチドのうちの１５％のみ（すなわち、１００のうちの１５）のアミノ酸
が、参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。このような差異は
、本発明のアミノ酸配列の全長にわたって無作為に分配される点変異として表さ
れ得るか、またはこれらは、最大の許容可能な２／１４アミノ酸差異（約８５％
の同一性）まで変動する長さの１つ以上の位置でクラスター化し得る。差異は、
アミノ酸置換、または欠失として、規定される。

【００４９】 フラグメント：配列番号１の化合物またはその誘導体のような分子の「フラグ
メント」とは、これらの分子の任意のポリペプチドサブセットを言及することを
意味する。

【００５０】 機能性誘導体：用語「誘導体」は、分子の「改変体」、「誘導体」、または「
化学誘導体」を含むよう意図される。配列番号１の化合物またはその誘導体のよ
うな分子の「改変体」とは、その分子全体またはそのフラグメントのいずれかに
実質的に類似する分子を言及することを意味する。配列番号１の化合物またはそ
の誘導体のような分子の「アナログ」とは、配列番号１の分子またはそのフラグ
メントのいずれかに実質的に類似する、非天然分子を言及することを意味する。

【００５１】 ある分子と別の分子との両方のアミノ酸配列が実質的に同じであり、そして両
方の分子が類似の生物学的活性を有する場合に、これらの分子は「実質的に類似
する」といわれる。したがって、２つの分子が類似の活性を有すると仮定すると
、これらは、改変体、誘導体、またはアナログであるとみなされる。なぜなら、
この用語は、本明細書中において、これらの分子のうちの一方が他方には見出さ
れないさらなるアミノ酸残基を含む場合でさえ、またはアミノ酸残基の配列が同
一ではない場合でさえ、使用されるからである。

【００５２】 本明細書中において使用される場合に、ある分子が通常はその分子の一部では
ないさらなる化学部分を含む場合に、その分子は別の分子の「化学誘導体」であ
るといわれる。このような部分は、その分子の溶解度、吸収率、生物学的半減期
などを改善し得る。あるいは、この部分は、その分子の毒性を減少させ、その分
子の任意の所望されない副作用などを排除または減弱し得る。このような効果を
媒介し得る部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９８０）に開示され、そして当業者に明らかである
。

【００５３】 タンパク質の生物学的活性：この表現は、化合物（例えば、配列番号１または
その誘導体）の代謝機能または生理機能をいい、類似の活性または改善された活
性、あるいは記載した所望されない副作用が減少された活性が含まれる。また、
例えば、配列番号１の上記化合物またはその誘導体の、抗原活性および免疫原性
活性が含まれる。

【００５４】 融合タンパク質：用語「融合タンパク質」によって、例えば、配列番号１の化
合物またはその誘導体を含む融合タンパク質が意図され、これは、そのＮ末端に
おいて連結する「選択的切断部位」を有するかまたは有さず、これが次に、さら
なるアミノ酸リーダーポリペプチド配列に連結する。

【００５５】 選択的切断部位：用語「選択的切断部位」とは、化学物質または酵素のいずれ
かを用いて、予測可能な様式で、選択的に切断され得るアミノ酸残基（１つまた
は複数）をいう。選択的酵素切断部位とは、タンパク分解酵素によって認識およ
び加水分解される、アミノ酸またはペプチド配列である。このような部位の例と
しては、トリプシン切断部位またはキモトリプシン切断部位が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【００５６】 リーダー配列：用語「リーダー配列」によって、例えば、配列番号１の化合物
をコードするＤＮＡに連結され、そして選択的切断部位および配列番号１の化合
物に融合した融合タンパク質として宿主細胞中で発現される、ポリヌクレオチド
配列が意図される。用語「リーダーポリペプチド」とは、融合タンパク質におい
て得られるような「リーダー配列」の発現形態を記載する。

【００５７】 融合タンパク質（これはしばしば不溶性であり、そして過剰発現する場合には
、封入体中に見出される）は、他の細菌性タンパク質から、当該分野において周
知の方法によって、精製される。好ましい実施形態において、この不溶性の融合
タンパク質は、細胞溶解の後に遠心分離され、そして洗浄され、そしてグアニジ
ン−ＨＣｌで再溶解される。透析による変性体の除去後、これは可溶性のままで
あり得る。（退縮性のタンパク質の精製については、Ｊｏｎｅｓ、米国特許第４
，５１２，９２２号；Ｏｌｓｏｎ、米国特許第４，５１８，５２６号；ならびに
Ｂｕｉｌｄｅｒら、米国特許第４，５１１，５０２号および同第４，６２０，９
４８号を参照のこと）。

【００５８】 例えば、配列番号１の組換え生成された化合物、またはその誘導体は、種々の
方法論のいずれかの使用を通じて、可溶化融合タンパク質から、天然の夾雑物を
実質的に含まないように精製され得る。本明細書中で用いられる場合、化合物は
、それが、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞における発現の後に共に見出さ
れる物質から、実質的に精製されている場合に、「天然の夾雑物を実質的に含ま
ない」といわれる。配列番号１の化合物またはその誘導体は、標準的なクロマト
グラフィー分離技術の適用を通じて精製され得る。

【００５９】 あるいは、このペプチドは、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて
精製され得る（Ｒｏｔｍａｎ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ ６４１：１１４−１２１（１９８１）；Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．Ｒ．Ｊ、Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇ ２１５：１４３−１５２（１９８１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．
Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６４１０−６４１５（１９８２）；
Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７：５３５−５４２（１９
８４）；Ｐａｕｃｈａ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６７０−６８１（１９
８４）；およびＣｈｏｎｇ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：２６１
−２６８（１９８５））。

【００６０】 部分的精製または実質的精製の後、融合タンパク質は、切断部位に対応する酵
素を用いて酵素的に処理される。あるいは、そのより不純な状態にある融合タン
パク質は、たとえ屈折形態であっても、酵素を用いて処理され得る。必要とされ
る場合、生じた配列番号１の成熟化合物、またはその誘導体は、さらに精製され
得る。酵素処理の条件は、当業者に公知である。

【００６１】 遺伝子治療：治療の手段は、生物の遺伝子発現の正常なパターンを変化させる
ことに関する。一般に、組換えポリヌクレオチドが、生物の細胞または組織に導
入されて、遺伝子発現の変化をもたらす。

【００６２】 宿主動物：トランスジェニック動物、これらの生殖細胞および体細胞の全ては
、本発明のＤＮＡ構築物を含む。このようなトランスジェニック動物は、一般に
脊椎動物である。好ましい宿主動物は、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類動物、
マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、モルモット、げっ歯類動物（例えば、ラッ
ト）など）である。用語、宿主動物はまた、胚段階および胎仔段階を含む、発生
の全ての段階における動物を含む。

【００６３】 骨粗しょう症：骨粗しょう症は、高齢の成体集団の相当な部分、妊娠女性、お
よび若年体ににおいてさえ観察される強力に損害を与える骨格疾患である。用語
骨粗しょう症は、障害の異種群をいう。臨床的には、骨粗しょう症は、Ｉ型およ
びＩＩ型に分けられる。Ｉ型骨粗しょう症は、中年女性に優先的に生じかつ閉経
期のエストロゲンの減少に関連するが、ＩＩ型骨粗しょう症は、加齢に関連する
。骨粗しょう症を有する患者は、骨折修復を促進するために設計された新規治療
法、またはこの疾患に関連する骨折を予防もしくは減らすために設計された治療
法から恩恵を受ける。

【００６４】 （２．式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂの新規ＰＴＨ機能ドメイン結合体ペプチド） 最初の実施形態において、本発明は生物活性を保持する新規ＰＴＨ機能ドメイ
ン結合体ペプチドを提供する。この新規ペプチドは、アミノ末端およびカルボキ
シ末端機能ドメインがＰＴＨ（１−３４）ペプチド中に存在するという本発明者
らの発見および決定に対応する。本発明のこの局面は、各機能ドメインの生化学
的特性を、別々にまたは組み合わせて選択的に操作することによって、ＰＴＨレ
セプター活性のアゴニストの開発を可能にする。本発明のこの局面のペプチド化
合物の一般式は、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂであり、ここでＳは、アミノ末端シグナル伝
達機能ドメインであり；Ｌは、ｎ回存在するリンカー分子であり、ここでｎは、
１〜９の整数であり；そしてＢは、ペプチドホルモンのカルボキシ末端機能ドメ
インである。本発明のこの局面はまた、ＳおよびＢ部分のアミノ酸組成またはア
ミノ酸鎖長の改変による、これらのＳ−（Ｌ）_n−Ｂペプチド由来のペプチド誘
導体に関する。

【００６５】 タンパク質産物として、本発明の化合物および誘導体は、液相ペプチド合成ま
たは固相ペプチド合成の技術による産生に従う。特に固相ペプチド合成技術は、
ヒトＰＴＨの産生において首尾よく適用され、そして本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ
化合物もしくは誘導体の産生のために使用され得る（ガイダンスとして、Ｋｉｍ
ｕｒａら、前出を参照のこと。およびＦａｉｒｗｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
２：２６９１（１９８３）を参照のこと）。相対的に大きいスケールでのヒトＰ
ＴＨ産生の成功は、Ｇｏｕｄら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．６（８）：７
８１（１９９１）（参照として本明細書中に援用される）によって報告されてい
る。合成的なペプチド合成アプローチは、一般的に、自動化された合成機および
本発明の所望の化合物または誘導体のＣ末端アミノ酸が付着する固相としての適
切な樹脂の使用を伴う。次いで、Ｎ末端方向のペプチドの伸長は、代表的には、
ＦＭＯＣベースまたはＢＯＣベースの化学プロトコールのいずれかを用いて、合
成が完了するまで、適切に保護された形態の次の所望アミノ酸を首尾よくカップ
リングさせることによって達成される。次いで保護基が、通常、ペプチドを樹脂
から切断するのと同時にペプチドから切断され、次いでペプチドが単離され、そ
して従来の技術（例えば、アセトニトリルを溶媒としておよびトリフルオロ酢酸
をイオン対形成剤として用いる逆相ＨＰＬＣによる）を用いて精製される。その
よう手順は、一般的に多数の刊行物に記載され、そして例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ
およびＹｏｕｎｇ「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ」第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に参照され得る。このペプチド合成アプローチが、本
発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物ならびに遺伝的にコードされないアミノ酸を組み
込むその誘導体および改変体の産生に必要とされることが理解される。

【００６６】 １つの特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここで
Ｓが、シグナル伝達ペプチドＰＴＨ（１−９）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ（配列番号１））であり；Ｌが、
リンカー分子（Ｇｌｙ）₅であり；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨ（１５−３
１）（Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔ
ｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ（配
列番号２））である）を含むＰＴＨ−１レセプターまたはＰＴＨ−２レセプター
に対するアゴニストの設計のために有用な生物学的に活性なペプチドを提供する
。ＰＧ５である配列全体は、以下：

【００６７】

【化７】 である。

【００６８】 別の特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここでＳ
が、シグナル伝達ペプチドＰＴＨ（１〜５）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ（配列番号４））であり；Ｌが、リンカー分子（Ｇｌｙ）₉であり；そ
してＢが、結合ペプチドＰＴＨ（１５〜３１）（Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｍｅ
ｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ（配列番号２））である）を含むＰＴＨ１
ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレセプターに対するアゴニストの設計のために有
用な生物学的に活性なペプチドを提供する。ＰＧ９である配列全体は、以下：

【００６９】

【化８】 である。

【００７０】 別の特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここでＳ
が、シグナル伝達ペプチドＰＴＨ（１〜９）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ（配列番号１））であり；Ｌが、リ
ンカー分子（Ｇｌｙ）₇であり；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨ（１７〜３１
）（Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ（配列番号４））である
）を含むＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレセプターに対するアゴニスト
の設計のために有用な生物学的に活性なペプチドを提供する。ＰＧ７である配列
全体は、以下：

【００７１】

【化９】 である。

【００７２】 １つの特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここで
Ｓが、シグナル伝達ペプチドＰＴＨｒＰ（１〜９）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ（配列番号７））であり；Ｌ
が、リンカー分子（Ｇｌｙ）₅であり；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨｒＰ（
１５〜３１）（Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ（配列番号８））である）を含むＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレ
セプターに対するアゴニストの設計のために有用な生物学的に活性なペプチドを
提供する。ＰｒＰＧ５である配列全体は、以下：

【００７３】

【化１０】 である。

【００７４】 別の特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここでＳ
が、シグナル伝達ペプチドＰＴＨｒＰ（１〜５）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｈｉｓ（配列番号１０））であり；Ｌが、リンカー分子（Ｇｌｙ）₉であ
り；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨｒＰ（１５〜３１）（Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ（配列番号８））である）を含
むＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレセプターに対するアゴニストの設計
のために有用な生物学的に活性なペプチドを提供する。ＰｒＰＧ９である配列全
体は、以下：

【００７５】

【化１１】 である。

【００７６】 別の特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここでＳ
が、シグナル伝達ペプチドＰＴＨｒＰ（１〜９）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ（配列番号７））であり；Ｌが
、リンカー分子（Ｇｌｙ）₇であり；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨｒＰ（１
７〜３１）（Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅ
ｕ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ（配列番号１２
））である）を含むＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレセプターに対する
アゴニストの設計のために有用な生物学的に活性なペプチドを提供する。ＰｒＰ
Ｇ７である配列全体は、以下：

【００７７】

【化１２】 である。

【００７８】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、ＳペプチドおよびＢペプチド
におけるアミノ酸置換によって改変され得る。置換は、天然または合成の任意に
選択されたアミノ酸のＬ立体異性体（ｓｔｅｒｉｏｉｓｏｍｅｒ）およびＤ立体
異性体のいずれかが用いられ得る。

【００７９】 Ｓペプチド（ＰＴＨ（１〜９））において最も好ましい標的部位および好まし
い置換としては、以下が挙げられる： １） ３位（セリン）をアラニンへ：活性を増強するためのＰＴＨ（１〜４）の
アラニンスキャンにおいて示された。 ２） ３位（セリン）を他の小さいアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ
、Ｃｙｓ）へ、（Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：
１９９７−２００４（１９９１）に示されるように、３つの損なわれた活性にお
けるかさばったアミノ酸に留意）。 ３） １位（アラニン）を他の小さいアミノ酸または荷電アミノ酸へ（例えば、
Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＬｙｓ）（Ｌ立体異性体および
Ｄ立体異性体を含む（活性化に重要であると示された（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９−１３５３（１９７３））
ＰＴＨの残基１に留意）。 ４） ２位（バリン）を他の疎水性アミノ酸または小さいアミノ酸へ（例えば、
Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ）（ＰＴＨの残基２は、活性化に重要であると初期に示
されていたこと（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６６：１３１４１−１３１４６（１９９１））に留意）。 ５） ４位（グルタミン酸）を他の荷電アミノ酸または疎水性アミノ酸へ（例え
ば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ）（ＰＴＨの残基４は、活性化に
重要であると初期に示されていたこと（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３１４１−１３１４６（１９９１））に留意）。 ６） ５位（イソロイシン）を他の荷電アミノ酸または疎水性アミノ酸へ（例え
ば、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ）（Ｌ立体異性
体およびＤ立体異性体を含む（ＰＴＨの残基５は、活性化および結合に重要であ
ると初期に示されていたこと（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７０：６５８４−６５８８（１９９５）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９８８８−１９８９３（１９９６））
に留意）。 ７） ６位（グルタミン酸）を他の小さいアミノ酸、荷電アミノ酸または疎水性
アミノ酸へ（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ）（ＰＴＨの残
基６のデータは、活性化に重要であると初期に示されていたこと（Ｃｏｈｅｎ，
Ｆ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９９７−２００４（１９９１
））に留意）。

【００８０】 Ｂペプチド（ＰＴＨ（１５〜３１））において最も好ましい標的部位および好
ましい置換としては、以下が挙げられる： １） １９位（グルタミン酸）をアルギニンへ：ＰＴＨ（１〜３４）アナログの
結合を改善することが示されたＥＲ−１９置換（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６５８４−６５８８（１９９５）、Ｔａｋ
ａｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３４５３−１３４６０（１９９
９））。 ２） ２２位（グルタミン酸）をアラニンへ：ＰＴＨ（１７〜３１）の結合を改
善することが示されたＥＡ−２２置換（未公開のアラニンスキャンデータ）。

【００８１】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）またはＰＴＨｒＰ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３
１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、天然または合成の任意のＬアミノ酸
立体異性体またはＤアミノ酸立体異性体の置換によって改変され得る。そのよう
な置換は、ＳペプチドまたはＢペプチドのいずれかにおいてなされ得、ここで、
わずか１個のアミノ酸が荷電されるかまたは置換される。そのような化合物の設
計および合成は、当業者の範囲内である。

【００８２】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）またはＰＴＨｒＰ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３
１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、天然または合成の任意のＬアミノ酸
立体異性体またはＤアミノ酸立体異性体の置換によって改変され得る。そのよう
な置換は、ＳペプチドまたはＢペプチドのいずれかにおいてなされ得、ここで、
２以下のアミノ酸が荷電されるかまたは置換される。そのような化合物の設計お
よび合成は、当業者の範囲内である。

【００８３】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）またはＰＴＨｒＰ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３
１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、天然または合成の任意のＬアミノ酸
立体異性体またはＤアミノ酸立体異性体の置換によって改変され得る。そのよう
な置換は、ＳペプチドまたはＢペプチドのいずれかにおいてなされ得、ここで、
３以下のアミノ酸が荷電されるかまたは置換される。そのような化合物の設計お
よび合成は、当業者の範囲内である。

【００８４】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）またはＰＴＨｒＰ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３
１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、天然または合成の任意のＬアミノ酸
立体異性体またはＤアミノ酸立体異性体の置換によって改変され得る。そのよう
な置換は、ＳペプチドまたはＢペプチドのいずれかにおいてなされ得、ここで、
４以下のアミノ酸が荷電されるかまたは置換される。そのような化合物の設計お
よび合成は、当業者の範囲内である。

【００８５】 別の特定の実施形態において、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１
５〜３１）またはＰＴＨｒＰ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３
１）で示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物は、天然または合成の任意のＬアミノ酸
立体異性体またはＤアミノ酸立体異性体の置換によって改変され得る。そのよう
な置換は、ＳペプチドまたはＢペプチドのいずれかにおいてなされ得、ここで、
５以下のアミノ酸が荷電されるかまたは置換される。そのような化合物の設計お
よび合成は、当業者の範囲内である。

【００８６】 当業者に公知のように、Ｓペプチドの９残基全ておよびＢペプチドの１７残基
全てがＰＴＨレセプター活性のアゴニストを追求して置換されるように、別の置
換が、ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１５〜３１）またはＰＴＨｒ
Ｐ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨｒＰ（１５〜３１）においてなされ得る。

【００８７】 さらに、本発明の別の実施形態は、シグナル伝達ペプチド（「Ｓ」）が必要と
されるＰＴＨ（１〜１１）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号４６）を使用し得る。

【００８８】 ＰＴＨ−１レセプターは、カルシトニンおよびセクレチンに対するレセプター
もまた含むＧタンパク質共役レセプターのファミリーＢサブグループのメンバー
である（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｆ．「ＧＣＲＤｂ：Ａ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄａｔａｂａｓｅ」Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ２：１−７（１９９４））。変異誘発研究およ
び架橋研究により、大きいアミノ末端細胞外ドメイン、細胞外ループおよび膜貫
通らせんを含むこれらのレセプターの複数のドメインが、リガンド相互作用に寄
与することが示された（Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３４：８７９−８８４（１９９４）；Ｌｅｅ，Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ
．９：１２６９−１２７８（１９９５）；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ
Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１２（１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ １２１（１９９７）；Ｄａ
ｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：
４９４１−４９４６（１９９８）；Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７０：１４３９４−１４３９８（１９９５）；ＤｅＡｌｍｅｉｄａ
，Ｖ．およびＭａｙｏ，Ｋ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７５０−７６５（１９
９８）；Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０−１０５７（
１９９４）；Ｚｈｏｕ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９４：３６４４−３６４９（１９９７）；Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ，Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４９８−２２５０５（１９９８））。ＰＴＨ／
カルシトニンキメラレセプターおよびハイブリッドリガンドを用いた研究は、レ
セプターのアミノ末端細胞外ドメインが、リガンドのカルボキシル末端結合ドメ
インを認識し、一方、７回膜貫通らせんを含みかつループに連結するレセプター
の「コア」領域は、リガンドのアミノ末端シグナル伝達部分を認識する一般的な
相互作用のトポロジーを示唆した（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６９−２６４７２（１９９６））。同様の結論が、初
期のレセプターキメラ研究から（Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３４：８７９−８８４（１９９４）；Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０−１０５７（１９９４）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ
．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１１８６−１１９４（１９９
４））、そして光反応ＰＴＨアナログを用いた最近の架橋研究から（Ｂｉｓｅｌ
ｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４９８−２２５０５（１
９９８）；Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１
６８９０−１６８９６（１９９８））導き出された。ファミリーＢレセプターに
関するいくつかの認識決定基は、アミノ末端細胞外ドメイン、細胞外ループおよ
び膜貫通らせんにおいて同定された（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍ
ｕｔａｔｉｏｎｓ Ａｌｌｏｗ ｔｈｅ ＰＴＨ−２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ
Ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ＰＴＨｒＰ Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１２、
補遣１、要約＃１２１（１９９７）、Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：４９４１−４９４６（１９９８）、Ｈ
ｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３９４−１４
３９８（１９９５）、Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３５：１１８６−１１９４（１９９４）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８；Ｔｕｒｎｅｒ，
Ｐ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１６）：９２０５−９２０８（
１９９６））。従って、Ｇタンパク質共役レセプターリガンド系、そして特にＢ
ファミリーは、ＰＴＨ／ＰＴＨレセプター系と類似のリガンド／レセプター相互
作用を通じて機能する。

【００８９】 本発明の別の局面において、一般式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂの本発明の組成物は、Ｐ
ＴＨが、メンバー（例えば、カルシトニン、セクレチンなど）である他のリガン
ド／レセプターファミリーに進展され得る。図２において、このファミリーのい
くつかのリガンドのアミノ末端配列が、示される。このような情報は、これらの
リガンドについての機能的ドメイン結合体ペプチド（Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ）の設計
に有用である。当業者は、示される配列の特徴に精通しており、そして図３に提
供される配列から、ＳペプチドおよびＢペプチドを選択し得る。

【００９０】 本発明の別の局面に従って、置換基は、生物学的活性ペプチドの作製において
当該分野で公知の標準的な方法によって、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物また
はその誘導体のＮ末端アミノ酸の遊離アミンに結合され得る。例えば、アルキル
基（例えば、Ｃ_1-12アルキル）は、還元性アルキル化を使用して結合され得る。
ヒドロキシアルキル基（例えば、Ｃ_1-12ヒドロキシアルキル）もまた、還元性ア
ルキル化を使用して結合され得、ここで、遊離ヒドロキシ基は、ｔ−ブチルエス
テルで保護される。アシル基（例えば、ＣＯＥ₁）は、遊離酸（例えば、Ｅ₁ＣＯ
ＯＨ）を、Ｎ末端アミノ酸の遊離アミノにカップリングすることによって結合さ
れ得る。本発明の範囲内にはまた、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物、または本
発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物の二次構造、三次構造もしくは安定性性を変更す
るその誘導体、または生物学的活性をなお保持するその誘導体が意図される。こ
のような誘導体は、ラクタム環化、ジスルフィド結合、または当業者に公知の他
の手段によって達成され得る。

【００９１】 上記一般式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂにおいて、Ｌは、任意の有用な長さのリンカー配
列である。好ましくは、それはアミノ酸残基（Ｌ）_nであり、ここでｎは１以上
の整数であり、好ましくは５〜９の整数である。２つ以上の残基が存在する場合
、それは同じであってもよく、異なっていてもよい。スペーサー配列が含まれる
アミノ酸は、本質的であるか非本質的であるかにかかわらず、当業者に周知のい
ずれかであり得る。例えば、Ｌは、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、リジ
ン、アスパラギン酸、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイ
シン、メチオニン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、チロシン、アスパ
ラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシンもしくはフェニ
ルアラニンの単独または組み合わせのいずれかであり得る。本発明の実施におい
て、リンカー配列として使用するための好ましいアミノ酸残基は、グリシン、ノ
ルロイシン、チロシン、アスパラギン酸、リジン、ロイシン、およびフェニルア
ラニンの、単独または組み合わせのいずれかである。

【００９２】 Ｌはまた、脂肪属ジアミン、好ましくは、１〜６の炭素原子の脂肪属ジアミン
（例えば、メチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラ
メチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、およびヘキサメチレンジアミン であり得る。さらに、Ｌは、４〜６の炭素原子を有する脂肪属ジアミン（例えば
、テトラメチレンジアミン（カダベリンとしてもまた公知）、ペンタメチレンジ
アミン（プトレシンとしても公知であり、本明細書中以後Ｐｕ）、およびヘキサ
メチレンジアミン）であり得る。

【００９３】 他のリンカー分子は、当業者に公知であり、そして、本発明の生物学的活性ペ
プチドの作製のために、一般式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂにおける（Ｌ）_nに利用され得る
。

【００９４】 （３．ＰＴＨレセプターに対するＳ−（Ｌ）_n−Ｂ活性についてのスクリーニ
ング） 本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物およびその誘導体の生物学的特性の機能的特
徴づけは、リガンドに刺激されるｃＡＭＰの蓄積を測定するバイオアッセイによ
って行われ得る。

【００９５】 （Ａ．本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物によるサイクリックＡＭＰの蓄積の刺
激） 細胞内のｃＡＭＰの蓄積は、以前に記載された通りに測定される（Ａｂｏｕ−
Ｓａｍｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１２９，１９８６）。２４
ウェルプレートで増殖させた細胞を、０．１％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＩＢＭＸを
含有する培養培地でリンスする。次いで、細胞を、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物およ
びその誘導体とともに６０分間２１℃にてインキュベートする。その上清を取り
除き、そして細胞を、ドライアイス粉末中のホールプレートにおくことによって
、直ちに凍結する。細胞内ｃＡＭＰを、１ｍＭの５０ｍＭ ＨＣｌ中に細胞を融
解させることによって抽出し、そして抗ｃＡＭＰ抗体（例えば、Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を使用する特異的ラジオイムノアッセイによって分析す
る。ｃＡＭＰについてのトレーサーとして使用されるｃＡＭＰアナログ（２’−
Ｏ−モノスクシニル−アデノシン３’：５’−環状モノホスフェートチロシルメ
チルエステル（Ｓｉｇｍａから入手した））を、クロルアミンＴ法によってヨウ
素化する。遊離ヨウ素を、ヨウ素化ｃＡＭＰアナログをＣ１８ Ｓｅｐ−ｐａｋ
カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）に吸着させること
によって取り除く。ｄＨ₂Ｏでの洗浄後、ヨウ素化ｃＡＭＰアナログを、４０％
アセトニトリル（ＡＣＮ）および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて
Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジから溶出させる。ヨウ素化ｃＡＭＰアナログを凍結
乾燥し、１ｍｌの０．１％ＴＦＡで再構成し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム
（Ｗａｔｅｒｓ）に注入する。このカラムを、０．１％ＴＦＡ中１０％のＡＣＮ
で平衡化し、そして０．１％ＴＦＡ中１０〜３０％のＡＣＮ勾配を用いて溶出さ
せる。このことは、モノヨウ素化ｃＡＭＰアナログの非ヨウ素化ｃＡＭＰアナロ
グからの分離を可能にする。トレーサーは、−２０℃で保存した場合、４ヶ月ま
で安定である。アッセイに使用する標準物である、アデノシン３’：５’−環状
モノホスフェートは、Ｓｉｇｍａから購入され得る。サンプル（１〜１０ ８２
ｌのＨＣＬ抽出物）または標準物（０．０４から１００ｆｍｏｌ／管）を、５０
ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で希釈し、そしてトリエチルアミンおよび
無水酢酸の混合物（２：１ 容量：容量）の１０μｌでアセチル化する。アセチ
ル化後、ｃＡＭＰ抗血清（１００μｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび１％正常ウサギ血清で作製されたストック溶液（１：４０００）か
ら添加する。トレーサーを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈
し、そして添加する（２０，０００ｃｐｍ／管）。このアッセイを、４℃にて一
晩インキュベートする。結合したトレーサーを、１００μｌのヤギ抗ウサギ抗血
清（ＰＢＳ中１：２０）および１ｍｌの７％ポリエチレングリコール（ＭＷ ５
０００〜６０００）を添加し、２０００ｒｐｍにて３０分間４℃にて遠心分離す
ることによって、沈殿させる。その上清を取り除き、そして結合した放射活性を
、γカウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）で計数する。ｃＡＭＰのデータを計算
するために、ｌｏｇｉｔ計算を、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートで行う。代表的
には、このアッセイ感度は、０．１ｆｍｏｌ／管であり、そしてトレーサーの５
０％を置換する標準濃度は、５ｆｍｏｌ／管である。

【００９６】 （Ｂ．ＣＯＳ細胞上に発現されるクローン化レセプターへの本発明のＳ−（Ｌ
）_n−Ｂ化合物またはその誘導体の結合） 以下に記載のｃＡＭＰ蓄積アッセイに加えて、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合
物またはその誘導体もまたヨウ素化され、そして一過的にトランスフェクトされ
たＣＯＳ細胞におけるラジオレセプターベースのアッセイに使用され得ることが
可能である。ＣＯＳ−７細胞を、ＤＭＥＭ、１０％熱非動化ＦＢＳ、１０ｍｇ／
Ｌのゲンタマイシン中で、１５ｃｍプレートにおいて８０〜９０％コンフルエン
トまで増殖させる。１〜２μｇのプラスミドＤＮＡを用いてＤＥＡＥ／Ｄｅｘｔ
ｒａｎ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）によってトランスフェクトした２４時間
後、細胞をトリプシン処理し、そしてマルチウェルプラスチックディッシュ（１
６または３５ｍｍの直径、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）に
、５×１０⁴細胞／ｃｍ²の細胞濃度で再プレートする。細胞数は、トランスフェ
クション後、ほんのわずか増加した。さらに４８時間続けて培養した後、ラジオ
レセプターアッセイを行う。培養培地を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７
．７）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣＬ、０．５
％熱非動化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）、および５％熱非動化ウマ血清（ＫＣ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓ．）を含有する緩衝
液と入れ替え、研究の直前に開始する。他に示さない限りは、研究を、この緩衝
液中で、１５℃にて４時間、４×１０⁵ｃｐｍ／ｍｌ（９．６×１０^-11Ｍ）の^{12 5} Ｉ標識化［Ａｌａ¹］ＰＴＨ（１−１４）アミドまたは¹²⁵Ｉ標識化［Ｎｌｅ⁸］
ＰＴＨ（１−１４）とともにインキュベートした細胞を用いて行う。あるいは、
より従来のラジオリガンド（例えば、［ｎｅｌ８，２１，Ｔｙｒ３４］−ｒＰＴ
Ｈ（１−３４）ＮＨ₂）もまた使用し得る。

【００９７】 （４．ベクター、宿主細胞、および組換え発現） 本発明はまた、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂポリヌクレオチド（すなわち、本発
明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含むベクターに関する。こ
のようなポリヌクレオチド配列は、本明細書中に提供されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂペ
プチド配列を使用して、当業者によって容易に設計される。本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞は、組換え技術による本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂポリ
ペプチドの生成において、使用され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を生成するために使用
され得る。

【００９８】 組換え生成のために、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ
ポリヌクレオチドのための発現系またはその部分を組み込み得る。宿主細胞への
ポリヌクレオチドの導入は、多くの標準的な研究室用マニュアル（例えば、Ｄａ
ｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載される方法（例えば、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランス
フェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロイ
ンジェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレ
ーション、形質導入、切屑負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（
ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、または感染）によってもた
らされ得る。

【００９９】 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられる：細菌細胞（例えば、ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ細胞、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ
細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｔｂｔｉｌ
ｉｓ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞）
；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯ細胞Ｓ、ＨｅＬａ細
胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓメラ
ノーマ細胞）；および植物細胞。

【０１００】 多種多様の発現系が使用され得る。このような系としては、とりわけ、染色体
由来の系、エピソーム由来の系およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミ
ドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾ
ンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入エレメントに
由来するベクター、酵母染色体エレメントに由来するベクター、バキュロウイル
ス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのような
ウイルスに由来するベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター
（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント（例えば、コス
ミドおよびファージミド）に由来するもの）が挙げられる。これらの発現系は、
発現を調節および産生する制御領域を含み得る。一般には、宿主においてポリヌ
クレオチドを維持、増殖または発現してポリペプチドを産生するに適切な任意の
系またはベクターが使用され得る。適切なヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（前出）に示されるような、任意の種々の周知かつ慣用的な技
術によって、発現系に挿入され得る。

【０１０１】 ＲＮＡベクターはまた、本発明に開示されるＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはそ
の誘導体をコードする核酸の発現に利用され得る。これらのベクターは、広範な
種々の真核生物細胞において天然に複製するポジティブまたはネガティブ鎖ＲＮ
Ａウイルスに基づく（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．およびＲｉｃｅ，Ｃ．Ｍ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：２９７−３１０、１９９２）。レトロウイルスとは異
なり、これらのウイルスは、中間のＤＮＡライフサイクル期を欠き、全体的にＲ
ＮＡ形態で存在する。例えば、アルファウイルスは、外来タンパク質のための発
現ベクターとして使用される。なぜなら、これらは、広範な範囲の宿主細胞にお
いて利用され得、そして高レベルの発現を提供し得るからである；この型のウイ
ルスの例としては、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスが挙げられ
る（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１８−２２，１９
９３；Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）９３：１１３７１−１１３７７、１９９６）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのシン
ドビス発現系によって例示されるように、研究者は、研究室において、ＤＮＡ形
態（ｐＳｉｎｒｅｐ５プラスミド）で組換え分子を都合良く維持し得るが、ＲＮ
Ａ形態における増殖も、同様に実現可能である。発現に使用される宿主細胞にお
いて、目的の遺伝子を含むベクターは、ＲＮＡの形態で完全に存在し、そして所
望される場合、その状態で連続して増殖され得る。

【０１０２】 翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔、ペリプラズム空間または細胞外環境へ
の分泌のために、適切な分泌シグナルが、所望のＳ−（Ｌ）_n−Ｂポリペプチド
に組み込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して外因性であり得
るか、またはそれらは、異種シグナルであり得る。

【０１０３】 ＤＮＡ配列の発現は、ＤＮＡ配列が、転写および翻訳調節情報を含むＤＮＡ配
列に「作動可動に連結される」ことを必要とする。作動可能な連結は、制御また
は調節ＤＮＡ配列および発現されると考えられるＤＮＡ配列が、遺伝子の発現を
可能にするような方法で接続される連結である。遺伝子の発現に必要な「制御領
域」の厳密な性質は、生物から生物へと変動し得るが、一般的には、原核生物細
胞において、プロモーター（これは、ＲＮＡの転写の開始を指向する）、ならび
にＲＮＡへ転写されるときにタンパク質合成の開始をシグナル伝達するＤＮＡ配
列、の両方を含む、プロモーター領域を含むべきである。真核生物細胞中の調節
領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む
。

【０１０４】 ２つのＤＮＡ配列は、この２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレー
ムシフト変異の導入を生じないか、（２）プロモーター領域配列の融合タンパク
質コード配列の転写を指向する能力に影響しないか、または（３）融合タンパク
質コード配列のプロモーター領域配列によって転写される能力に影響しない場合
、作動可能に連結されるといわれる。従って、プロモーター領域は、このプロモ
ーターがＤＮＡ配列を転写し得る場合に、そのＤＮＡ配列に作動可能に連結され
る。

【０１０５】 種々のＤＮＡフラグメントを連結して、本発明の発現ベクターを産生すること
は、従来の技術（ライゲーションのために平滑末端化末端またはスタッガー末端
化（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄｅｄ）末端を使用すること、適切な末端を提供
するための制限酵素消化、適切なように付着末端を充填すること、所望でない連
結を回避するためのアルカリおよびホスファターゼ処理、ならびに適切なライゲ
ートとのライゲーション）に従って行われる。融合タンパク質の場合には、遺伝
子構築物は、誘導性プロモーターをコードし、このプロモーターは、この融合タ
ンパク質の５’遺伝子配列に作動可能に連結されて、この融合タンパク質の効率
的な発現を可能にする。

【０１０６】 原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなど）において本発明のＳ−（Ｌ）_n−
Ｂ化合物またはその誘導体を発現するために、配列番号１をコードするＤＮＡ配
列を、機能的原核生物プロモーターに作動可能に連結することが必要である。こ
のようなプロモーターは、構成性、またはより好ましくは、調節可能（すなわち
、誘導性または抑制性）のいずれかであり得る。構成性プロモーターの例として
は、バクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプ
ロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどが挙げられる。誘導性原核生物プロモー
ターの例としては、バクテリオファージλの主要な右および左プロモーター（Ｐ
ＬおよびＰＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩおよび
ｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓのσ−２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｇｅｎｅ
３２：１１−２０（１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓのバクテリオファージの
プロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモータ
ー（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４
７８（１９８６））が挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．
Ｒ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）；Ｃ
ｅｎａｔｉｅｍｐｏ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６（１９
８６）；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８
：４１５−４４２（１９８４）によって概説される。

【０１０７】 本発明に好ましい原核生物プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモータ
ーであり、これは、インドールアクリル酸を用いて誘導可能である。

【０１０８】 発現が、真核生物（例えば、酵母、真菌、哺乳動物細胞、または植物細胞）に
おいて所望される場合、このような真核生物宿主において転写を指向し得るプロ
モーターを使用することが必要である。好ましい真核生物プロモーターとしては
、以下が挙げられる：マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍ
ｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２
））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．，Ｃｅｌ
ｌ ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎ
ｏｉｓｔ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１
９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｈｏｎｓｔｏｎ，Ｓ．
Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−
６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））。

【０１０９】 好ましくは、導入される遺伝子配列は、レシピエント宿主において自己複製可
能なプラスミドまたはウイルスベクターに取り込まれる。任意の広範な種々のベ
クターが、この目的のために使用され得る。特定のプラスミドまたはウイルスベ
クターを選択する際の重要な因子としては、以下が挙げられる：ベクターを含む
レシピエント細胞が、ベクターを含まないレシピエント細胞から認識されそして
選択され得ることの容易さ；特定の宿主において所望されるベクターのコピー数
；および異なる種の宿主細胞間のベクターを「シャトル」し得ることが所望され
るか否か。

【０１１０】 好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製し得るプラスミド
のようなプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡ
ＣＹＣ１８４、πＶＸなど）が挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）により開示
される。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、Ｇａｒｄｅｌｌａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４〜１５８５９（１９８９）において記
載されるｐＧＦＰ−１プラスミド、またはＳｔｕｄｉｅｒおよびＤｕｎｎ、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０〜８９（１９９０）に
より記載されるｐＥＴベクターのうちの１つに基づく改変プラスミドが挙げられ
る。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２
７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．：Ｔｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ３０７〜３２９頁（１９８２）により開示さ
れる。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐＩＪＩＯＩ（Ｋ
ｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７〜４１
８３（１９８７））、およびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ（例
えば、ΦＣ３１）（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら：Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇ
ａｒｙ，４５〜５４頁（１９８６））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプ
ラスミドは、Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９
３〜７０４（１９８６）、およびＩｚａｋｉ，Ｋ．，Ｊｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．３３：７２９〜７４２（１９７８）により概説される。

【０１１１】 好ましい真核生物発現ベクターとしては、ＢＰＶ、ワクシニア、２−ミクロン
環状物（２−ｍｉｃｒｏｎ ｃｉｒｃｌｅ）などが挙げられるがこれらに限定さ
れない。このような発現ベクターは、当該分野において周知である（Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎ，Ｄ．ら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５〜２７４（１
９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃ
ｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
４４５〜４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ ２８：
２０３〜２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９〜４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａ
ｔｉｓｅ，第３巻，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，ＮＹ，５６３〜６０８頁（１９８０））。

【０１１２】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養物もまた、宿主として使用され
得る。原則的に、任意のこのような細胞培養物は、脊椎動物または無脊椎動物の
細胞供給源由来にかかわらず、使用可能である。しかし、興味は、脊椎動物供給
源由来の細胞において増大している。有用な脊椎動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲ
Ｏ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ
Ｉ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ならびにＭＤＣＫ細胞株が挙げられる。このよう
な細胞についての発現ベクターは、通常、（必要な場合には）任意の必要なリボ
ソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配
列とともに、複製起点、発現されるべき遺伝子の前またはその上流に位置するプ
ロモーターを含む。

【０１１３】 哺乳動物細胞における使用については、発現ベクターにおける制御機能は、し
ばしば、ウイルス性物質により提供される。例えば、一般に使用されるプロモー
ターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）お
よびサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターお
よび後期プロモーターは、特に有用である。なぜなら、両方は、ＳＶ４０ウイル
ス複製起点もまた含むフラグメントとして、ウイルスから容易に得られるからで
ある（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））。

【０１１４】 複製起点は、外因性の起点（例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）の供給源由来であり得る）を含むように
）ベクターを構築することにより提供され得るか、または宿主細胞染色体複製機
構により提供され得るかのいずれかである。ベクターが宿主細胞染色体に組み込
まれる場合、後者でしばしば十分である。

【０１１５】 強固な細胞膜障壁を含まない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランス
フェクションが、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ ５２：５４６（１９７８）により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿方
法により行われる。しかし、細胞中にＤＮＡを導入する他の方法（例えば、核注
入によってか、またはプロトプラスト融合によって）もまた、使用され得る。遺
伝子治療の場合、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソームであるがこ
れに限定されない）を用いてか、または用いずに、裸のプラスミドまたはウイル
スＤＮＡを直接的に注入する方法は、哺乳動物細胞のインビボまたはインビトロ
でのトランスフェクションの現在の方法に対して代替アプローチを提供する。原
核生物細胞または実質的な細胞壁構築物を含む細胞が使用される場合、トランス
フェクションの好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）に記載されるような塩化カルシ
ウムを使用する、カルシウム処理である。

【０１１６】 （５．本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体の有用性および投与
） 本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体は、骨質量の損失により表
される種々の哺乳動物状態の予防および処置に有用である。特に、本発明の化合
物は、ヒトにおける骨粗しょう症および骨減少症の予防および治療用処置につい
て示される。さらに、本発明の化合物は、他の骨疾患の予防および治療用処置に
ついて示される。本発明の化合物は、上皮小体機能低下症の予防および治療用処
置について示される。最終的には、本発明の化合物は、骨折の修復のためのアゴ
ニストとして、および高カルシウム血症についてのアンタゴニストとしての使用
について示される。。

【０１１７】 一般に、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体、あるいはそれら
の塩は、一日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１と１μｇとの間、好ましくは一
日あたり体重１ｋｇあたり約０．０７と約０．２μｇとの間の量で投与される。
５０ｋｇのヒトの女性の被験体については、配列番号１の生物学的に活性な化合
物またはその誘導体の１日用量は、約０．５〜約５０μｇ、好ましくは約３．５
〜約１０μｇである。他の哺乳動物（例えば、ウマ、イヌ、およびウシ）では、
より高用量が必要とされ得る。この投薬量は、単回投与によってか、複数回適用
によってか、または徐放を通じて、最も効果的な結果を達成するために必要とさ
れるように、好ましくは注射により一日に１回以上、従来の薬学的組成物におい
て送達され得る。例えば、この投薬量は、鼻腔吸入により、従来の薬学的組成物
において送達され得る。

【０１１８】 正確な用量および組成物ならびに最も適切な送達レジメンの選択は、とりわけ
、本発明の選択されたＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体の薬理学的特性
、処置される状態の性質および重篤度、ならびにレシピエントの身体状態および
精神の明瞭度（ｍｅｎｔａｌ ａｃｕｉｔｙ）により影響される。

【０１１９】 代表的な好ましい送達レジメンとしては、経口、非経口（皮下、経皮（ｔｒａ
ｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内および静脈内を含む）、直腸、口腔（舌下を
含む）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、および鼻腔内吸入が挙げられるがこ
れらに限定されない。

【０１２０】 薬学的に受容可能な塩は、毒性の副作用がない本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合
物またはその誘導体の所望の生物学的活性を保持する。このような塩の例は、無
機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）により形成される
酸付加塩；および有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイ
ン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸
、タンニン酸、パモ酸（ｐａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸、ポリグルタミ
ン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸な
どのような）で形成される塩；（ｂ）多価金属カチオン（例えば、亜鉛、カルシ
ウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッ
ケル、カドミウムなど）により形成される塩基付加塩；またはＮ，Ｎ’−ジベン
ジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンに
より形成される塩基付加塩；あるいは（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せ（例え
ば、亜鉛のタンニン酸塩など）である。

【０１２１】 本発明のさらなる局面は、本発明の活性成分Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはそ
の誘導体、あるいはその薬学的に受容可能な塩として、薬学的に受容可能な非毒
性のキャリアと混合して含む薬学的組成物に関する。上記のように、このような
組成物は、非経口（皮下、経皮、筋肉内または静脈内）投与のために、特に液体
溶液または懸濁液の形態において；経口または口腔投与のために、特に錠剤また
はカプセル剤の形態において；直腸、経皮投与のために；ならびに鼻腔内投与の
ために、特に粉末、点鼻（ｎａｓａｌ ｄｒｏｐ）またはエアロゾルの形態にお
いて、調製され得る。

【０１２２】 Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ組成物は、単位投薬形態において都合よく投与され得、そし
て薬学的分野において周知の任意の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８５）（本明
細書中で参考として援用される）において記載されるように）によって調製され
得る。非経口投与についての処方物は、賦形剤として滅菌水または生理食塩水、
アルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）、ポリアルキレングリ
コール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源の油、水素化ナフタレン
などを含み得る。経口投与については、この処方物は、胆汁酸塩またはアシルカ
ルニチンの添加によって増強され得る。鼻腔投与についての処方物は、固体であ
り得、そして賦形剤（例えば、ラクトースまたはデキストラン）を含み得るか、
あるいは点鼻または液体軽量スプレーの形態における使用のための水性溶液また
は油性溶液であり得る。口腔投与については、代表的な、賦形剤としては、糖、
ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、予めゼラチン化したデン
プンなどが挙げられる。

【０１２３】 投与の最も好ましい経路（鼻腔投与）のために処方される場合、鼻腔粘膜を横
切る吸収は、約０．２と１５重量パーセントとの間、好ましくは約０．５と４重
量パーセントとの間、最も好ましくは約２重量パーセントの範囲の量における、
界面活性剤の酸（例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコ
ール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコ
デオキシコール酸、シクロデキストリンなど）によって増強され得る。

【０１２４】 延長した期間（例えば、１週間から１年間の期間）にわたる被験体への本発明
のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物の送達は、所望の放出期間のために十分な活性成分を
含む徐放性系の単回投与により達成され得る。種々の徐放性系（例えば、モノリ
シック型マイクロカプセルまたはリザーバ型マイクロカプセル、デポーインプラ
ント、浸透ポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入デバイ
スおよび代替注射可能投薬形態）が、この目的のために利用され得る。活性成分
の送達が所望される部位での局在化は、いくつかの徐放性デバイスのさらなる特
性である。この特性は、特定の障害の処置における有益性を証明し得る。

【０１２５】 徐放性処方物の１つの形態は、ゆっくりと分解され、非毒性で、非抗原性のポ
リマー（例えば、Ｋｅｎｔ，Ｌｅｗｉｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ，およびＴｉｃｅ，米
国特許第４，６７５，１８９号（本明細書中に参考として援用される）の先駆的
研究において記載される、コポリ（乳酸／グリコール酸））中に分散されるか、
またはカプセル化される、ポリペプチドまたはその塩を含む。この化合物、また
は好ましくはそれらの比較的不溶性の塩もまた、コレステロールもしくは他の脂
質マトリクスペレット、またはシラストマー（ｓｉｌａｓｔｏｍｅｒ）マトリク
スインプラント中に処方され得る。さらなる遅延型放出、デポーインプラントま
たは注射可能処方物は当業者に明らかである。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａ
ｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８，およびＲ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ，Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖ
ｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９
８７（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【０１２６】 ＰＴＨと同様に、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ改変体は、所定の臨床状態を処置する際に
有用な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗しょう症および他の
骨関連障害を処置する場合、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ改変体は、カルシウム補助食品ま
たはビタミンＤアナログとともに投与され得る（米国特許第４，６９８，３２８
号を参照のこと）。あるいは、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ改変体は、例えば、米国特許第
４，７６１，４０６号に記載されるように、ビスホスホネートと組み合わせて、
またはカルシトニンおよびエストロゲン（限定はされない）のような１つ以上の
骨治療剤と組み合わせて、好ましくは、周期的治療レジメンを用いて投与され得
る。

【０１２７】 （Ｖ．本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体のレセプターシグナ
ル伝達活性） ホルモン作用の発現における重大な工程は、ホルモンと、標的細胞の原形質膜
表面のレセプターとの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成は、
細胞への細胞外シグナルの伝達を可能にし、種々の生物学的応答を誘発する。

【０１２８】 （Ａ．ＰＴＨ−１レセプターのアンタゴニストおよびアゴニストについてのス
クリーニング） 本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂポリペプチドは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用して
、それらのアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性についてスクリーニングさ
れ得る。その細胞表面上にＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞を、２ｍＭ Ｉ
ＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）の存在下、ネイティブＰＴＨ（１〜８４）と共に５〜６０分間、３
７℃でインキュベートする。サイクリックＡＭＰ蓄積を、上記のように、特異的
ラジオイムノアッセイによって測定する。ＰＴＨ−１レセプターへの結合につい
てネイティブＰＴＨ（１〜８４）と競合し、そしてｃＡＭＰ蓄積に対するネイテ
ィブＰＴＨ（１〜８４）の効果を阻害する、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物ま
たはその誘導体は、競合的アンタゴニストであるとみなされる。このような化合
物は、高カルシウム血症を処置するために有用である。

【０１２９】 逆に、ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１〜８４）
と競合しないが、（おそらく、レセプター活性化部位をブロックすることによっ
て）ｃＡＭＰ蓄積のネイティブＰＴＨ（１〜８４）活性化をなお防ぐ、本発明の
Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体は、非競合的アンタゴニストであると
みなされる。このような化合物は、高カルシウム血症を処置するために有用であ
る。

【０１３０】 ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１〜８４）と競合
し、そしてネイティブＰＴＨ（１〜８４）の存在下または非存在下でｃＡＭＰ蓄
積を刺激する、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体は、競合的ア
ゴニストである。ＰＴＨ−１レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１
〜８４）と競合しないが、ネイティブＰＴＨ（１〜８４）の存在下または非存在
下で、なおｃＡＭＰ蓄積を刺激し得るか、あるいは配列番号１の化合物またはそ
の誘導体単独で観察されるよりも高いｃＡＭＰ蓄積を刺激する、本発明のＳ−（
Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体は、非競合的アゴニストであるとみなされる
。

【０１３１】 （６．本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体の治療上の使用） 高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、ＰＴＨおよび
ＰＴＨｒＰと、ＰＴＨ−１レセプターおよびＰＴＨ−２レセプターとの間の相互
作用に関連する。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの異常な上昇が存
在する状態であり；これは、しばしば、以下を含む他の疾患に関連する：上皮小
体機能亢進症、骨粗しょう症、乳房、肺および前立腺の癌腫、頭部および頸部、
ならびに食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、および副腎腫。低カルシウム血症は、
血清カルシウムレベルが、異常に低い状態であり、有効なＰＴＨの欠損（例えば
、甲状腺手術後）から生じ得る。

【０１３２】 本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体をコードする本発明の核酸
をまた、選択された組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーに連結
し得、そして得られたハイブリッド遺伝子を、標準的な方法（例えば、Ｌｅｄｅ
ｒら、米国特許第４，７３６，８６６号（本明細書中に参考として援用される）
に記載のような）によって初期発生段階（例えば、受精卵母細胞段階）の動物胚
に導入し、選択された組織において上昇したレベルの本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ
化合物またはその誘導体を発現するトランスジェニック動物を生成し得る（例え
ば、骨についてのオステオカルシンプロモーター）。このようなプロモーターを
使用して、このトランスジェニック動物における配列番号１の化合物またはその
誘導体の組織特異的発現を指向する。

【０１３３】 さらに、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物がＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプタ
ーをアンタゴナイズまたはアゴナイズする能力（当業者に公知のアッセイによっ
て決定され、そして以下に議論されるような）を破壊しない、天然の任意の他の
アミノ酸置換が、本発明の範囲に含まれる。

【０１３４】 「アゴニスト」によって、ＰＴＨ−１レセプターによって媒介される細胞性応
答を増強または強化し得るリガンドが意図される。「アンタゴニスト」によって
、ＰＴＨ−１レセプターによって媒介される細胞性応答を阻害し得るリガンドが
意図される。本発明の任意の候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」が、
このような細胞性応答を増強または阻害し得るかは、当該分野で公知のタンパク
質リガンド／レセプターの細胞性応答アッセイまたは結合アッセイ（本出願の他
の箇所に記載されるアッセイを含む）を使用して決定され得る。

【０１３５】 本発明のなおさらなる局面に従って、ＰＴＨ−１レセプターの変更された作用
または過剰な作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供される。こ
の方法は、患者のＰＴＨ−１レセプターの活性化を阻害するに十分な、治療有効
量の本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体を、その患者に投与する
工程を包含する。

【０１３６】 この実施形態において、ＰＴＨ−１レセプターの変化した作用から生じる障害
を有すると疑われる患者は、ＰＴＨ−１レセプターの選択的アンタゴニストであ
る、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物または本発明のその誘導体を用いて処置さ
れ得る。このようなアンタゴニストとしては、（本明細書中で記載されるアッセ
イによって）ＰＴＨ−１レセプター媒介細胞活性化を妨害することが決定された
本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物または本発明のその誘導体、または類似の特性
を有する他の誘導体が挙げられる。

【０１３７】 アンタゴニストを投与するために、適切な、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物
またはその誘導体を、一般には、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、生理食
塩水）中に処方することにより、医薬品の製造のために使用し、そして好ましく
は、静脈内、筋肉内、皮下、経口的、または鼻腔内に、ＰＴＨ−１レセプターに
結合する本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体の、十分な阻害を提
供する投薬量で投与される。代表的な投薬量は、１ｎｇ〜１０ｍｇペプチド／ｋ
ｇ体重／日である。

【０１３８】 本発明のさらなる局面に従って、骨粗しょう症を処置するための方法が提供さ
れ、この方法は、患者に、この患者のＰＴＨ−１レセプターを活性化するに充分
な治療的に有効な量の、本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体を投
与する工程を包含する。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰアンタゴニストについて上記のよう
に、同様の投薬量および投与を、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰアゴニストの投与のために
、例えば、骨粗しょう症、他の代謝性骨障害、ならびに上皮小体機能低下症およ
び関連障害の処置のような状態のために使用し得る。

【０１３９】 本発明が、本発明の趣旨および範囲またはそのいずれの実施形態からも逸脱す
ることなく、組成、濃度、投与様式、および条件の等価なパラメーターの広い範
囲内で行われ得ることは当業者に明らかである。

【０１４０】 （７．本発明の新規なＰＴＨレセプター分子） １つの実施形態において、本発明は、ＰＴＨレセプター機能のアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定するために有用な、新規なＰＴＨレセプター分子の核酸
配列およびポリペプチド配列を提供する。

【０１４１】 従って、１つの特定の実施形態において、本発明は、新規なリガンド／レセプ
ターキメラ分子（本明細書中で、係留リガンド／レセプター分子といわれる）を
提供する。本発明のこの局面は、ＰＴＨ−１レセプターの細胞外アミノ末端ドメ
インの大部分がｃＡＭＰ生成によって測定されるようなリガンドシグナル伝達の
ために絶対に必要なわけではないことを確立することによって、技術を進歩させ
る。この結果は、構造的に分子をうわべは拘束する、細胞外ドメインに存在する
６つの非常に保存されたシステイン残基が存在することを予測外にも示す。さら
に、リガンドペプチドの欠失変異ｒδＮｔアミノ末端への「係留」は、ＰＴＨレ
セプター機能のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する際に有用な自己刺激
レセプター分子を作製するという予測外かつ驚くべき結果を提供する。ＰＴＨレ
セプターの公知のアンタゴニストの大部分は、リガンドのカルボキシ末端フラグ
メントに結合するので、Ｔｅｔｈｅｒ１は、リガンドのアミノ末端ドメインまた
はシグナル伝達ドメインで作用するアンタゴニストの同定における有用さを証明
するはずである。

【０１４２】 本発明の係留リガンド／レセプターの一般式は、Ｒ₁−Ｓ−（Ｌ）_n−Ｒであり
、ここで、Ｒ₁は、ＰＴＨ−１レセプターシグナル配列であり；Ｓは、アミノ末
端リガンドシグナル伝達ペプチドであり；Ｌは、Ｎ回存在するリンカー分子であ
り；ここでＮは、１〜１０の正の整数であり、最も好ましくは４であり、そして
Ｒは、ＰＴＨ−１レセプター配列である。係留レセプターの特定の例が以下に述
べられる場合において（例えば、Ｔｅｔｈｅｒ１）、他の係留レセプターは、例
えば、［Ｒ１１］−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）に置換され得るが、これに限定さ
れないことが明らかなはずである。

【０１４３】 特定の実施形態において、本発明は、図７に示されるＴｅｔｈｅｒ−１（Ｔｅ
ｔｈｅｒ（１〜９）ともいわれる）（配列番号３６）を提供する。Ｔｅｔｈｅｒ
−１についてのＲ₁−Ｓ−（Ｌ）_n−Ｒ組成式は、Ｒ₁は、ＰＴＨ−１レセプター
（１〜２５）ペプチドであり；Ｓは、ＰＴＨ（１〜９）ペプチドであり；ＬはＧ
ｌｙであり、ここでＮは４であり；そしてＲは、ＰＴＨ−１レセプター（１８２
〜最後）であると規定される。従って、配列全体は、以下のように規定される；
ＰＴＨ−１レセプター（１〜２５）−ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₄−ＰＴＨ
−１レセプター（１８２〜最後）。

【０１４４】 本発明はまた、式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｒによって規定されたＴｅｔｈｅｒ−１レセ
プターの成熟形態をを含み、ここでＲ₁部分は、シグナルプロセシングにより切
断されている。

【０１４５】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターは、分子生物学の分野における共通の認識を用い
て構築され得る。ネイティブなラットＰＴＨ−１レセプターのアミノ酸残基２６
〜１８１によって表される野生型配列の代わりに、ＰＴＨ（１〜９）（配列番号
１）アミノ末端フラグメントを用いることは、容易に達成される。得られるクロ
ーンは、Ｔｅｔｈｅｒ−１の構造を有し、ここでアミノ酸残基１〜２２は、切断
されるシグナルペプチドを表す。初めは、Ｔｙｒ²³が切断部位であると考えられ
ていたが、この残基が付着され、かつ２２位と２３位との間で切断が生じること
を証拠が示し；このＴｙｒ²³残基の除去が本明細書中に記載されるペプチドに対
して増加した活性を提供し得ることに注意すべきである。

【０１４６】 別の特定の実施形態において、本発明は、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプターを提
供し、これは、細胞内カルボキシ末端ドメイン（おそらくリン酸化機構によるレ
セプターのダウンレギュレーションにおいて重要であると考えられる領域）の短
縮型が存在することを除いて、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターに類似する。Ｔｅｔ
ｈｅｒ−１Ｃの構造は、ＰＴＨ−１レセプター部分のアミノ酸４８１位で導入さ
れている停止コドンを除いて、Ｔｅｔｈｅｒ−１に同一である。このレセプター
は、アゴニストについてのスクリーニングの感度を増大し、そしてリガンド／レ
セプター複合体のシグナル伝達／膜貫通領域で作用するアゴニストのより純粋な
スクリーニングを可能にするべきである。

【０１４７】 別の特定の実施形態において、本発明は、ｒδＮｔ／Ｃｔレセプター（レセプ
ターの細胞外アミノ末端ドメイン（リガンド相互作用のために重要）およびレセ
プターの細胞内カルボキシ末端ドメイン（ダウンレギュレーションのために重要
）を欠如する二重変異体レセプター）を提供する。

【０１４８】 従って、本発明の新規なレセプターは、ＰＴＨレセプター機能の新規なアゴニ
ストおよびアンタゴニストを同定するために重要であるはずである。このような
アゴニストおよびアンタゴニストは、ＰＴＨリガンドの改変体または構造的に異
なる模倣物であり得る。

【０１４９】 ａ）新規なレセプター核酸分子 他に示されなければ、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定された全ての核酸配列は、手動の配列決定により決定され、そして本明細書中
で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列
は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。従って、この
アプローチにより決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるよ
うに、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの間違いを
含み得る。手動配列決定により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定された
ＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には、少なくとも約９５
％〜少なくとも約９９．９％同一である。当該分野で公知でもあるように、決定
されたヌクレオチド配列における１つの挿入または欠失は、実際の配列と比較し
て、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列が、配列
決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる
ように、このような挿入または欠失の点で始まって、ヌクレオチド配列の翻訳に
おいてフレームシフトを生じる。

【０１５０】 例えば、図７、９、および１０におけるヌクレオチド配列のような本明細書中
で提供される情報を用いると、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１
Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドをそれぞれコード
する本発明の核酸分子は、標準的な技術を用いて得られ得る。野生型ＰＴＨ１Ｒ
配列の単離についてのクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物
質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡのクローニングのための手順）は公知であ
る。野生型レセプターのクローニングに続いて、配列中の適切な欠失は、本明細
書中に記載のように作製され得る。本発明の例示（配列番号３６、配列番号３８
、および配列番号４０に記載される核酸分子）は、当該分野における標準的制限
酵素消化およびクローニングの技術を用いることによって得られた。Ｔｅｔｈｅ
ｒ−１レセプター（配列番号３６）、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター（配列番号
１０）、およびｒδＮｔ／Ｃｔ（配列番号４０）の決定されたヌクレオチド配列
は、約２２アミノ酸残基の推定リーダー配列のタンパク質をコードするオープン
リーディングフレームを含む。推定成熟Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターのアミノ酸配列は、図
７、９、および１０に示される。

【０１５１】 記載されるように、本発明はまた、本発明のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔ
ｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの成熟形態を提
供する。シグナル仮定に従って、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、
一旦、粗面小胞体を通って伸長するタンパク質鎖の排出が開始されると、成熟タ
ンパク質から切断されるシグナルまたは分泌リーダー配列を有する。大部分の哺
乳動物細胞および昆虫細胞ですら、同じ特異性で分泌タンパク質を切断する。し
かし、いくつかの場合において、分泌タンパク質の切断は、完全に均質であるわ
けではなく、これにより、タンパク質に対して２つ以上の成熟種が生じる。さら
に、分泌タンパク質の切断特異性が完全タンパク質の一次構造により最終的に決
定され、すなわち、これは、このポリペプチドのアミノ酸配列において固有であ
る。従って、１つの実施形態において、本発明は、例えば、配列番号３７、配列
番号３９及び配列番号４１のアミノ酸をそれぞれ有する成熟Ｔｅｔｈｅｒ−１レ
セプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。さらなる実施形態は、寄
託されたプラスミドのいずれかによりコードされるヌクレオチド配列を含み得る
。本願発明の実施形態は、例えば、ヒトまたはラットのレセプター配列に関し得
る。

【０１５２】 レセプターをコードするいくつかのプラスミドは、以下のとおりに寄託されて
おり：

【０１５３】

【化１３】 ブタペスト条約の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａに１９９９年１２月２８
日および１９９９年１２月３０日に寄託され、登録番号 を与えられている
。

【０１５４】 成熟レセプター、例えば、アミノ酸配列を有する、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプタ
ー（Ｔｈｅｔｈｅｒ１〜９レセプター）、［Ｒ１１］−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１
）レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒｄｅｌＮｔ／Ｃｔレセ
プタータンパク質とは、寄託された宿主中のベクターに含まれるクローンのＤＮ
Ａ配列によりコードされる完全オープンリーディングフレームの、哺乳動物細胞
（例えば、以下に記載されるようなＣＯＳ細胞）における発現により生成される
、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター（Ｔｈｅｔｈｅｒ（１〜９）レセプター）、Ｔｅ
ｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、［Ｒ１１］−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）レセプター
、およびｒｄｅｌＮｔ／Ｃｔレセプターの成熟形態を意味する。以下に記載され
るように、ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟Ｔｅｔｈｅ
ｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセ
プターは、予測される切断の正確さに依存して、例えば、図７、９および１０に
示される、推定される「成熟」Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１
Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターのタンパク質と異なってもよい
し、異なっていなくともよい。

【０１５５】 タンパク質が分泌リーダーならびにそのリーダー配列についての切断点を有す
るか否かを予測するための方法は、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈの
方法（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））およびｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９
０（１９８６））が使用され得る。これらの方法の各々についての公知の哺乳動
物分泌タンパク質の切断点を予測することの正確性は、７５〜８０％の範囲であ
る（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ（前出））。しかし、これらの２つの方法は、常に所
定のタンパク質について、同じ予測切断点を生じるわけではない。計算方法は、
コンピュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」（Ｋ．ＮａｋａｉおよびＭ．Ｋａｎｅ
ｈｉｓａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９９２））において見
出され得る。このプログラムは、アミノ酸配列に基づいて、タンパク質の細胞位
置を予測するための専門プログラムである。位置のこの計算的予測の一部として
、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が組み込まれている。

【０１５６】 本発明の場合において、本発明の完全Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターのポリペプチドの予測
アミノ酸配列は、ラットＰＴＨ−１レセプター配列に対する比較によって、構造
特性について分析した。この分析は、配列番号３７、配列番号３９および配列番
号４１におけるアミノ酸２２と２３との間の予測切断部位を提供した。従って、
Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ
／Ｃｔレセプターのタンパク質についてのリーダー配列は、配列番号３７、配列
番号３９および配列番号４１におけるアミノ酸残基１〜２２からなると予測され
るが、この予測される成熟Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレ
セプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターのタンパク質は、配列番号３７、配
列番号３９および配列番号４１の残基で始まる。

【０１５７】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）ま
たはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるか、または合成により
生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）にあり得る。このＤＮＡは、二
本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（セン
ス鎖ともいわれる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわ
れる）であり得る。

【０１５８】 しかし、当業者に理解されるように、配列決定の誤りの可能性に起因して、Ｔ
ｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／
Ｃｔレセプターのポリペプチドは、約４３５アミノ酸を含むが、長さはわずかに
変化し得；そしてこのタンパク質のリーダー配列は、約２２アミノ酸であるが、
約１０〜約３０アミノ酸の範囲内のいずれかにあり得る。

【０１５９】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）ま
たはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるか、または合成により
生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）にあり得る。このＤＮＡは、二
本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（セン
ス鎖ともいわれる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわ
れる）であり得る。

【０１６０】 「単離される（た）」核酸分子により、そのネイティブな環境から取り出され
た核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれ
る組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離さ
れたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞に含まれる組換えＤＮＡ分
子または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ＤＮＡ分子が挙げられ
る。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはイン
ビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子は、合成に
よって生成されたこのような分子をさらに含む。

【０１６１】 本発明の単離された核酸分子として、以下が挙げられる：配列番号３６、配列
番号３８、および配列番号４０に示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を含むＤＮＡ分子；配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１に示
されるＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒ
δＮｔ／Ｃｔレセプターに対するコード配列を含むＤＮＡ分子；ならびに、上記
の配列とは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重に起因して、なおＴｅｔｈｅｒ
−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプ
ターをコードする配列を含む、ＤＮＡ分子。もちろん、遺伝コードは、当該分野
で周知である。従って、このような縮重改変体を生成することは、当業者にとっ
ては日常的である。

【０１６２】 別の局面においては、本発明は、本発明のｃＤＮＡクローンによってコードさ
れるアミノ酸配列を有するＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレ
セプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドをコードする単離され
た核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡク
ローンによってコードされる成熟ポリペプチドによってコードされ得る。さらな
る実施形態においては、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセ
プター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチド、または、Ｎ末端メチオ
ニンを欠失している、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプ
ター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドをコードする核酸分子が提
供される。本発明はまた、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する単離
された核酸分子、または上記の寄託されたクローン中に含まれる、Ｔｅｔｈｅｒ
−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプ
ターのｃＤＮＡのヌクレオチド配列、あるいは、上記の配列の１つに相補的な配
列を有する核酸分子を、提供する。このような単離された分子（特に、ＤＮＡ分
子）は、染色体を用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子のマ
ッピングのためのプローブとして、そして例えば、ノーザンブロット分析によっ
て、ヒトの組織中のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプタ
ー、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの遺伝子の発現を検出するためのプローブ
として、有用である。

【０１６３】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または配列番号３６、配
列番号３８、および配列番号４０に示されるヌクレオチド配列を有する単離され
た核酸分子のフラグメントによって、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好まし
くは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そ
してさらにより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図
される。これらは、本明細書中で議論される診断用プローブおよびプライマーと
して有用である。もちろん、約５０〜１５５０ｎｔの長さの大きなフラグメント
、およびより好ましくは、少なくとも約６００ｎｔの長さのフラグメントもまた
、これらが、寄託されたｃＤＮＡまたは配列番号３６、配列番号３８、および配
列番号４０に示されるようなヌクレオチド配列の全てではないがほとんどに対応
するフラグメントである場合には、本発明に従って有用である。例えば、少なく
とも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列、または配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１に示されるヌ
クレオチド配列に由来する、２０個以上の連続する塩基を含むフラグメントが意
図される。

【０１６４】 本発明の好ましい核酸フラグメントとして、以下をコードする核酸分子が挙げ
られる：Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、または
ｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチド；Ｔｅｔｈｅｒ
−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプ
ターの膜貫通ドメインを含むポリペプチド；ならびに全てまたは一部の膜貫通ド
メインが欠失しているＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプ
ター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチド。
リーダー配列についての上記のように、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの細胞外ドメインおよ
び膜貫通ドメインを構成するアミノ酸残基が、推定されている。従って、当業者
に明らかであるように、これらのドメインを構成するアミノ酸残基は、それぞれ
のドメインを定義するために使用される基準に依存してわずかに（例えば、約１
個から約１５個のアミノ酸残基によって）変化し得る。

【０１６５】 別の局面においては、本発明は、上記に記載される本発明の核酸分子中のポリ
ヌクレオチドの一部に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、以下を含む溶液
中での、４２℃で一晩のインキュベーション、それに続く０．１×ＳＳＣ中で約
６５℃でのフィルターの洗浄が意図される：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ
（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン
酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％のデキスト
ラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌの未変性の剪断されたサケの精子のＤＮＡ。

【０１６６】 ポリヌクレチドの「一部」に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドによ
って、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは、少なく
とも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらによ
り好ましくは、約３０〜７０ｎｔの参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、
上記に議論され、そして以下にさらに詳細に議論される、診断用のプローブおよ
びプライマーとして有用である。

【０１６７】 例えば、「少なくとも２０ｎｔの長さ」のポリヌクレオチドの部分によって、
参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または配列番号３７、配
列番号３９、および配列番号４１に示されるようなヌクレオチド配列）のヌクレ
オチド配列に由来する、２０個以上の連続するヌクレオチドが意図される。

【０１６８】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号３６、配列番号３８、および配列番
号４０に示される、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプタ
ー、およびｒδＮｔ／ＣｔレセプターのｃＤＮＡの３’末端のポリ（Ａ）索）、
またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチに対してのみハイブリダイズ
するポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするように使用
される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、このようなポリヌ
クレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子、またはそれらの相
補体（例えば、実質的には、任意の二本鎖のｃＤＮＡクローン）に対してハイブ
リダイズするからである。

【０１６９】 示されるように、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプタ
ー、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターのポリペプチドをコードする本発明の核酸
分子は、以下を含み得るが、これらに限定されない：それ自体によって成熟ポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペプチドおよびさらな
る配列（例えば、プレ−、またはプロ−、またはプレプロ−のタンパク質配列の
ような、アミノ酸リーダーまたは分泌配列をコードするポリペプチド）に対する
コード配列；転写される非翻訳配列（これは、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナル（例えば、リボソームの結合およびｍＲＮＡの安定性）を含む、転
写、ｍＲＮＡのプロセシングにおいて役割を果たす）のような、例えばイントロ
ン、および非コード５’ 配列および非コード３’配列を含むが、これらに限定
されない、さらなる非コード配列とともに、上記のさらなるコード配列を伴うか
またはそれらを伴わない成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる機能性を提供
するアミノ酸のような、さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従
って、ポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリペプチドの精製を容易
にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列に対して融合され得る
。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配
列は、多くの市販されているものの中でも、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）において提供されるタグのような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドである
。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２
１−８２４（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジン
は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ
赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する精製に有用な別のペプ
チドであり、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載され
ている。以下に議論されるように、他のこのような融合タンパク質として、（−
）またはＣ末端でＦｃに融合された、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅ
ｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターが挙げられる。

【０１７０】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関する。これは、Ｔｅｔｈｅｒ
−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプ
ターの一部、アナログ、または誘導体をコードする。改変体は、天然の対立遺伝
子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物体の
染色体上の所定の遺伝子座を占有している遺伝子のいくつかの別の形態の１つが
意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然には存在しない改変体は、当該
分野で公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。

【０１７１】 このような改変体として、１つ以上のヌクレオチドを含み得る、ヌクレオチド
の置換、欠失、または付加によって産生される改変体が挙げられる。改変体は、
コード領域、非コード領域、またはそれらの両方において変更され得る。コード
領域中での変更は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加
を生じ得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、およ
び欠失であり、これらは、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレ
セプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプター、またはその一部の、特性および活
性を変更しない。これに関して、保存的置換がまた特に好ましい。

【０１７２】 本発明のさらなる実施形態は、以下に対して、少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを含む、単離された核酸分子を含む：（ａ）推定されるリーダー配列を含む
、配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１中の完全なアミノ酸を有す
る、全長のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、また
はｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ
）配列番号３７、配列番号３９、または配列番号４１中のアミノ酸配列を有する
が、Ｎ末端のメチオニンを欠失するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
；（ｃ）図７、図９、または図１０（配列番号３７、配列番号３９、または配列
番号４１）に示されるアミノ酸配列を有する、成熟Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター
、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプター（リーダー
を除去された全長のポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ｃＤ
ＮＡによってコードされるリーダーを含む完全なアミノ酸配列を有する、全長の
Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ
／Ｃｔレセプターのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｅ
）ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟Ｔｅｔｈｅｒ−１
レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプター
をコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの細胞外ドメインをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｇ）Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ
−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの膜貫通ドメインをコード
するヌクレオチド配列；（ｈ）膜貫通ドメインの全体またはその一部を欠失して
いる、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒ
δＮｔ／Ｃｔレセプターの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；なら
びに（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または
（ｈ）中の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。

【０１７３】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮ
ｔ／Ｃｔレセプターのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に対して
、例えば、少なくとも９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドによって、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプタ
ー、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプターをコードする参照ヌクレオチド配列のそれ
ぞれ１００ヌクレオチドあたり５個までの点変異を含み得ることを除いて、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることが意図され
る。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌク
レオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得
るか、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの幾らかのヌクレオチ
ドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチ
ド配列の５’末端または３’末端の位置で生じ得るか、あるいは、参照配列中の
ヌクレオチドの中で個々に、または参照配列内で１つ以上の連続する群において
のいずれかで、分散されたこれらの末端部位の間の任意の場所で、生じ得る。

【０１７４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａに示されるヌクレ
オチド配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に
対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
かどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉ
ｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉ
ｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープ
ログラムを使用して従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で
の相同性の最良のセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａ
ｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：
４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムを使用して、2つの
配列の間の相同性の最適セグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明に
従う参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合には、もち
ろん、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の全体の長さにわたって計算される
ように、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギ
ャップが可能にされるように、パラメーターが設定される。

【０１７５】 本出願は、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、お
よびｒδＮｔ／Ｃｔレセプター活性を有するポリペプチドをコードするかどうか
にはかかわらず、図７、９、もしくは１０に示される核酸配列、または寄託され
たｃＤＮＡの核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一である核酸分子に関する。このことは、特定の核酸分子が、Ｔｅｔｈｅ
ｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセ
プター活性を有するポリペプチドをコードしない場合にもなお、当業者が、例え
ば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プ
ライマーとして核酸分子を使用する方法を知っているからである。Ｔｅｔｈｅｒ
−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプ
ター活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用として、
とりわけ、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴｅｔｈｅｒ−
１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプタ
ーの遺伝子またはそれらの対立遺伝子変異体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａ
ら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉ
ｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）に記載されているように、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプター遺伝子の正確な染色体
位置を提供するための、分裂中期の染色体スプレッドに対するインサイチュハイ
ブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３）特異的な組織中で
のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮ
ｔ／ＣｔレセプターのｍＲＮＡの発現を検出するための、ノーザンブロット分析
。

【０１７６】 しかし、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０に示される核酸配
列、または実際にＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター
、もしくはｒδＮｔ／Ｃｔレセプター活性を有するポリペプチドをコードする、
寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、
９８％、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「Ｔｅｔｈ
ｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレ
セプター活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的なアッセイにお
いて測定された場合に、本発明のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−
１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの活性と類似であるが、必ず
しも同一ではない、活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、Ｔｅｔｈｅ
ｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセ
プター活性は、本明細書中に記載されているような、候補のＴｅｔｈｅｒ−１レ
セプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプターポ
リペプチドを発現する細胞に対する標識されたＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの競合結
合実験を使用して測定され得る。

【０１７７】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、もしくはｒδ
Ｎｔ／Ｃｔレセプター、またはそれらの変異体を発現する任意の細胞株が、本明
細書中に記載されているようなリガンド結合活性および第２のメッセンジャーの
活性をアッセイするために使用され得る。もちろん、遺伝子コードの縮重に起因
して、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列、または配列番号３６、配列番号３８、も
しくは配列番号４０に示される核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「Ｔ
ｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／
Ｃｔレセプター活性を有する」ポリペプチドをコードすることが当業者にすぐに
理解される。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体の全てが同じポリペ
プチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセイをなお行うことなく
、当業者に明らかである。縮重変異体ではないこのような核酸分子について、妥
当な数がまた、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、
またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプタータンパク質の活性を有するポリペプチドをコー
ドすることがさらに、当該分野で認識される。このことは、当業者が、タンパク
質の機能に対して有意に影響を与える可能性が少ないか、またはその可能性がな
いアミノ酸の置換（例えば、第２の脂肪族アミノ酸での１つの脂肪族アミノ酸の
置換）を完全に知っていることに起因する。

【０１７８】 例えば、表現形的にはサイレントなアミノ酸置換を作製するための方法に関す
る指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅ
ｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここでは、編者ら
は、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを示す。

【０１７９】 ｂ）ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝的に操作される宿主細胞、および組換え技術によるＴｅｔｈｅｒ−１レ
セプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、もしくはｒδＮｔ／Ｃｔレセプター
ポリペプチド、またはそれらのフラグメントの産生に関する。

【０１８０】 ポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のための選択マーカーを含有しているベ
クターに連結され得る。一般的には、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈殿のような沈殿中に、または荷電した脂質との複合体中に導入される。ベクタ
ーがウイルスである場合は、これは、適切なパッケージング細胞株を使用してイ
ンビトロでパッケージされ得、次いで宿主細胞中に形質導入され得る。

【０１８１】 ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、少し挙げると、ファージλＰ
Ｌプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーター、
ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモ
ーターなど）に作動可能に連結されるはずである。他の適切なプロモーターが、
当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写の開始、終結のための部位、
および転写される領域、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によっ
て発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、開始する翻訳開始点、お
よび翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終結コドン（ＵＡＡ、Ｕ
ＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。

【０１８２】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとして、真核生物細胞の培養のためには、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、そしてＥ．ｃｏｌｉおよび他の
細菌中での培養のためには、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が
挙げられる。適切な宿主の代表的な例として、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；
昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細
胞）；ならびに植物細胞。上記の宿主細胞についての適切な培養培地および培養
条件は、当該分野で公知である。

【０１８３】 中でも、細菌での使用に好ましいベクターとして、以下が挙げられる：ｐＱＥ
７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベ
クター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐ
ＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
より入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３
、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。中でも、好
ましい真核生物ベクターは、以下が好ましい：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、
ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；
ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａから入手可能）。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。

【０１８４】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法に
よって達成され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような、多
くの標準的な研究室マニュアルに記載されている。

【０１８５】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけではなく、さらなる異種の機能的な領域をも含み得る。例え
ば、さらなるアミノ酸の領域（特に荷電したアミノ酸）が、精製の間の、または
続く操作および保存の間の、宿主細胞中での安定性および残存率を改善するため
に、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易
にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの
最終的な調製の前に除去され得る。中でも、分泌または排出を生じるため、安定
性を改善するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドに対するペプ
チド部分の付加は、よく知られており、そして当該分野での慣用的な技術である
。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化させるために有用なイムノグ
ロブリンに由来する異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４５３３（Ｃ
ａｎａｄｉａｎ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ２０４５８６９）は、別のヒトのタ
ンパク質またはその一部とともにイムノグロブリン分子の定常領域の種々の部分
を含む、融合タンパク質を開示している。多くの場合においては、融合タンパク
質の中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に完全に有利であり、従って
、例えば、改善された薬物動態特性を生じる（ＥＰ−Ａ−０２３２２６２）。一
方、いくつかの使用については、融合タンパク質が発現され、検出され、そして
記載されている有利な様式で精製された後に、Ｆｃ部分を除去することが可能で
あることが所望される。これは、Ｆｃ部分が、例えば、融合タンパク質が免疫化
のための抗原として使用される場合には、治療および診断における使用のために
は妨げとなることが証明されている場合である。薬物の発見においては、例えば
、ヒトのタンパク質（例えば、ｈＩＬ５−レセプター）は、ｈＩＬ−５のアンタ
ゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のため
に、Ｆｃ部分と融合させられている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，第８巻：５２−５８（１
９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７０巻、Ｎｏ．１６：９４５９−
９４７１（１９９５）を参照のこと。

【０１８６】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮ
ｔ／Ｃｔレセプターは、以下を含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回
収され得、そして精製され得る：硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー
、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフ
ィー。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が使用される。本発明のポリペプチドとして、天然の精製された産物、化学合成
手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高
等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された
産物が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明
のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなく
てもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主によって媒介されるプロ
セスの結果としていくつかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を
含み得る。

【０１８７】 ｃ）Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒ
δＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、ま
たは配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１のアミノ酸配列、あるい
は上記のポリペプチドの一部を含むペプチドまたはポリペプチドを有する、単離
されたＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒ
δＮｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドを提供する。

【０１８８】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮ
ｔ／Ｃｔレセプターのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能
の有意な影響を伴わずに変更され得ることが、当該分野で理解される。このよう
な配列における差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領
域が存在することが思い出されるはずである。従って、本発明はさらに、実質的
にＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮ
ｔ／Ｃｔレセプター活性を示すＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１
Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの変異体、あるいはＴｅｔｈｅ
ｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセ
プタータンパク質の領域（例えば、以下に議論されるタンパク質部分）を含むＴ
ｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／
Ｃｔレセプターの変異体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復
、および型の置換を含む。上記に示すように、アミノ酸の変更が、おそらく表現
形的にサイレントであることに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅ
ｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０
）に見出され得る。

【０１８９】 従って、配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１のポリペプチドの
フラグメント、誘導体、もしくはアナログ、または寄託されたｃＤＮＡによって
コードされるフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、以下であり得る：（
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的なアミノ酸残基または保存的ではないアミ
ノ酸残基（好ましくは、保存的なアミノ酸残基）で置換されており、そしてこの
ような置換されたアミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされてもよいし
、またはコードされなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチド
の半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、別
の化合物と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリ
ペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域のペプチド、またはリーダーもしくは
分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用さ
れる配列）に融合されているもの。このようなフラグメント、誘導体、およびア
ナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。

【０１９０】 特に興味深いのは、別の荷電したアミノ酸での荷電したアミノ酸の置換、およ
び中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である
。後者は、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およ
びｒδＮｔ／Ｃｔレセプタータンパク質の特徴を改善するように、減少した正の
電荷を有するタンパク質を生じる。凝集を防ぐことが非常に望ましい。タンパク
質の凝集は、活性の欠失を生じるだけではなく、それらのタンパク質が免疫原性
であり得ることに起因して、薬学的処方物を調製する場合にも問題となり得る。
（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４
０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５
（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９
３））。

【０１９１】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面のレセプターへの結合の選択性を変更し得る
。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２
つの公知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的結合
を生じる、特定の変異を記載している。従って、本発明のＴｅｔｈｅｒ−１レセ
プター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプターは、
天然の変異またはヒトの操作のいずれかによる、１つ以上のアミノ酸の置換、欠
失、または付加を含み得る。

【０１９２】 示されるように、変更は、好ましくは、主要ではない性質（例えば、タンパク
質の折り畳みまたは活性に有意には影響を与えない保存的なアミノ酸置換）であ
る（表１を参照のこと）。

【０１９３】

【表１】 機能に不可欠である、本発明のＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−
１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／Ｃｔレセプタータンパク質中のアミノ酸は、
部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍお
よびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））
のような、当該分野で公知の方法によって同定され得る。後者の手順は、分子中
のそれぞれの残基に単一のアラニン変異を導入する。得られた変異体分子は、次
いで、レセプター結合またはインビトロでの増殖アッセイのような、生物学的な
活性について試験される。リガンド−レセプターの結合に重要な部位はまた、結
晶化、核磁気共鳴、または光学的親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２４４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような、構造的な分析によって
も決定され得る。

【０１９４】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」によって、その天然の環境から取り出されたポリペプチド
が意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはその中に
含まれるポリペプチドは、本発明の目的については、単離されたと考えられる。
また、「単離されたポリペプチド」として、組換え宿主細胞から部分的に精製さ
れているかまたは実質的に精製されているポリペプチドが意図される。例えば、
抗菌性のペプチドポリペプチドの組換えによって産生されたバージョンは、Ｓｍ
ｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載
されている１工程の方法によって実質的に精製され得る。

【０１９５】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは、実質的に精製される。組換えによって産生された、Ｔｅｔｈｅｒ−１
レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプター
のバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４
０（１９８８）に記載されている１工程の方法によって実質的に精製され得る。

【０１９６】 本発明のポリペプチドはまた、寄託されたＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅ
ｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、およびｒδＮｔ／ＣｔレセプターのｃＤＮＡによっ
てコードされる、リーダーを含むポリペプチド；寄託されたｃＤＮＡによってコ
ードされる、リーダーを含まないポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；
配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１の、リーダーを含むポリペプ
チド；配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１の、リーダー、細胞外
ドメイン、膜貫通ドメインを含まないポリペプチド；配列番号３７、配列番号３
９、および配列番号４１のアミノ酸約１から約４３５を含むポリペプチド；なら
びに配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１中のアミノ酸約２から約
４３５を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも９
５％同一であり、なおより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるポリペプチドが挙げられる。そしてまた、少なくとも３０
アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有する、このような
ポリペプチドの一部が挙げられる。

【０１９７】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプター、またはｒδＮ
ｔ／Ｃｔレセプターポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例
えば、９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、その
ポリペプチド配列がＴｅｔｈｅｒ−１レセプター、Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプタ
ー、またはｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの参照アミノ酸のうちのそれぞれ１００ア
ミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、そのポリペプ
チドのアミノ酸が参照配列と同一であることが意図される。言いかえると、参照
アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを得るためには、参照配列中の５％までのアミノ酸残基が、欠失され得る
か、または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは参照配列中の全アミノ酸残
基の５％までの数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれら
の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置、ある
いはこれら両末端位置の間のどこででも、参照配列中の残基の中で個々に散在し
てか、または参照配列中の１つ以上の連続する群の状態で散在してかのいずれか
で、生じ得る。

【０１９８】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、寄託されたｃＤＮＡ
クローンによってコードされるアミノ酸配列に対して、配列番号３７、配列番号
３９、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉ
ｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａ
ｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に
決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に対して９５％同一で
あるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライン
メントプログラムを使用する場合には、もちろん、同一性の割合が参照アミノ酸
配列の全体の長さにわたって計算され、そして参照配列中のアミノ酸残基の総数
の５％までの相同性におけるギャップが可能になるように、パラメーターが設定
される。

【０１９９】 （７．係留されたリガンド／レセプター分子を利用する、ＰＴＨのアゴニスト
およびアンタゴニストのスクリーニング方法） 本発明の係留されたリガンド／レセプターのキメラ分子の特性は、それらを、
ＰＴＨレセプター活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニ
ングにおいて特に有用にする。スクリーニング方法は、当該分野で周知であり、
そしてアゴニスト性およびアンタゴニスト性のＰＴＨレセプターの特性を有する
新規のＰＴＨの機能的ドメイン結合ペプチドを同定する目的について本明細書中
で完全に記載されている。このようなスクリーニング方法は、ｃＡＭＰの産生に
対する影響を試験することによってか、またはレセプターに対する結合を試験す
ることによって、候補のアゴニストまたはアンタゴニストの有効性を測定する。
スクリーニングアッセイにおいて利用される細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）は、一
過性かまたは永久的のいずれかで、本発明の新規のレセプターを発現し得る。こ
の目的のための細胞株の樹立および維持に関する知見は、当該分野で周知である
。候補のアゴニストおよびアンタゴニストは、ＰＴＨのペプチド変異体であり得
るか、または例えば、模倣物のような、構造的に異なる分子を構成し得る。

【０２００】 本発明はいまや完全に記載されているが、本発明は、特定の実施例を参照して
より容易に理解される。これらの実施例は、本明細書中で特に記載されない限り
は、本発明の例示として提供され、そして本発明を制限するようには意図されな
い、 （実施例１） （ＰＴＨの機能的ドメイン結合ペプチドの構築） ＰＴＨの機能的な結合ペプチドを、分子生物学の分野において周知の方法を使
用して構築し得る。本発明者らは、本明細書中で使用されるリガンドアミノ末端
フラグメントであるＰＴＨ（１−９）を、天然のヒトのＰＴＨの最初の１４アミ
ノ酸に関連する他の研究に基づいて、構築した。このフラグメントの活性を最適
化するために、本発明者らは、アラニンで１位のセリンを置換した。これは、ラ
ットおよびウシのＰＴＨ、ならびにこれまでに報告されている全てのＰＴＨｒＰ
分子ヒト、ウシ、イヌ、ラット、マウス、ニワトリ）中の１位に見出されるアミ
ノ酸に対応する置換である。この変更は、天然のＰＴＨ（１−１４）ペプチドの
生物活性のバックグラウンドのレベルを超える、生物活性の測定可能な増大を生
じる。この新規のペプチド（本明細書中で［Ａｌａ¹］ＰＴＨ（１−１４）と呼
ばれる）のＣ末端残基はアミド化されている。アミノ末端の機能的ドメインＰＴ
Ｈ（１−９）は、この配列に基づく。カルボキシル末端の機能的ドメインＰＴＨ
（１５−３１）（ＬｕｅＡｓｎＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｒｇＶａｌＧｌｕＴｒｐＬ
ｅｕＡｒｇＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｎＡｓｐＶａｌ）（配列番号２）は、本明細
書中で詳細に記載されており、ペプチドの構築において使用される他のバリエー
ションもまた詳細に記載されている。ペプチドを、当該分野で周知の手順に従っ
て合成によって作成した。あるいは、このペプチドは、逆翻訳によって組換えＤ
ＮＡ技術を通じて作成し得る。使用される生物に依存して、コドン使用のチャー
トは、適切なコードを決定することを補助する。例えば、図８を参照のこと。こ
こでは、ＰＧ５、ＰＧ７、およびＰＧ９のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を詳
述する。

【０２０１】 （実施例２） ＰＴＨの機能的ドメイン結合ペプチドに暴露した細胞中でのｃＡＭＰの蓄積 アゴニスト活性についてスクリーニングするために、本発明の機能的ドメイン
結合ペプチドを、ｃＡＭＰの蓄積を介して細胞性の応答を測定するように設計さ
れたインビトロでのアッセイにおいて利用した。細胞内のｃＡＭＰの蓄積を、以
前に記載されているように測定する（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６２：１１２９、１９８６）。

【０２０２】 ２４ウェルプレート中で増殖させた細胞を、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭの
ＩＢＭＸを含有している培養培地でリンスする。次いで、細胞を、２１℃で６０
分間、Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ化合物またはその誘導体とともにインキュベートする。
上清を除去し、そして細胞を、プレート全体をドライアイス粉末中に配置するこ
とによって、すぐに凍結させる。細胞内のｃＡＭＰを、１ｍｌの５０ｍＭ ＨＣ
ｌ中で細胞を融解させることによって抽出し、そして抗ｃＡＭＰ抗体（例えば、
Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して特異的なラジオイムノアッセ
イによって分析する。ｃＡＭＰアナログ（２’−Ｏ−モノスクシニル−アデノシ
ン３’：５’−サイクリックモノホスフェートチロシルメチルエステル、Ｓｉｇ
ｍａから入手）（これは、ｃＡＭＰのトレーサとして使用する）を、クロラミン
Ｔ法によってヨウ素化する。遊離のヨウ素を、Ｃ１８ Ｓｅｐ−ｐａｋカートリ
ッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）上にヨウ素化したｃＡＭＰ
アナログを吸着させることによって除去する。ｄＨ₂Ｏでの洗浄後、ヨウ素化し
たｃＡＭＰアナログを、４０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）および０．１％のト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＳｅｐ−ｐａｋカートリッジから溶出させる
。ヨウ素化したｃＡＭＰアナログを凍結乾燥させ、１ｍｌの０．１％ ＴＦＡ中
で再構成し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）中に注入する。
カラムを、０．１％ ＴＦＡ中の１０％のＡＣＮで平衡化し、そして０．１％の
ＴＦＡ中の１０〜３０％のＡＣＮの勾配で溶出する。これによって、ヨウ素化し
ていないｃＡＭＰアナログからのモノヨウ素化されたｃＡＭＰアナログの分離を
可能にする。このトレーサーは、−２０℃で保存する場合に、４ヶ月まで安定で
ある。このアッセイに使用する標準である、アデノシン３’：５’−サイクリッ
クモノホスフェートは、Ｓｉｇｍａから購入し得る。サンプル（ＨＣｌ抽出物の
１−１０ ８２１）または標準（０．０４〜１００ｆｍｏｌ／チューブ）を、５
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に稀釈し、そして１０μｌのトリエチル
アミンおよび無水酢酸の混合物（２：１の容量：容量）でアセチル化する。アセ
チル化後、ｃＡＭＰ抗血清（１００μｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭの
ＥＤＴＡ，および１％の正常なウサギの血清中で作製したストック溶液（１：４
０００）から添加する。トレーサーを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で０．１％のＢ
ＳＡを用いて稀釈し、そして添加する（２０，０００ｃｐｍ／チューブ）。アッ
セイを、４℃で一晩インキュベートする。結合したトレーサーを、１００μｌの
ヤギ抗ウサギ抗血清（ＰＢＳ中で１：２０）および１ｍｌの７％のポリエチレン
グリコール（ＭＷ５０００−６０００）を添加し、４℃にて３０分間、２０００
ｒｐｍで遠心分離することによって、沈殿させる。上清を取り出し、そして結合
した放射活性を、γカウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）中で計数する。ｃＡＭ
Ｐのデータを計算するために、論理推定試験（ｌｏｇｉｔ）計算を、Ｅｘｃｅｌ
表計算プログラムにおいて行う。代表的には、アッセイの感度は、０．１ｆｍｏ
ｌ／チューブであり、そしてトレーサーの５０％が置き換わる標準濃度は、５ｆ
ｍｏｌ／チューブである。

【０２０３】 ｃＡＭＰの蓄積実験の結果を、図３および図４に示す。図３は、ｃＡＭＰの全
蓄積のデータを示し、一方、図４は、ｃＡＭＰの蓄積についてのＰＴＨペプチド
の用量応答曲線を示す。重要なことに、ＰＴＨの機能的ドメインペプチドである
、ＰＧ５、ＰＧ７、およびＰＧ９の全てが、刺激していない細胞中での基底レベ
ルと比較した場合に、ｃＡＭＰの蓄積の増大したレベルを実証する。

【０２０４】 （実施例３） （ＰＴＨ（１−１４）およびＰＴＨ（１７−３１）のアラニンスキャン） アミノ末端のＰＴＨ（１−９）シグナル伝達ペプチドおよびカルボキシ末端の
ＰＴＨ（１７−３１）結合ペプチド中の各アミノ酸残基の生物活性を決定するた
めに、２つの機能的ドメインのペプチドのそれぞれの個々のアミノ酸残基を、ア
ラニンで置換した。合成したペプチドを、本明細書中で記載するように、ｃＡＭ
Ｐの蓄積または競合的な結合のいずれかによって、天然のアミノ酸残基の生物活
性を決定するために使用した。ＰＴＨ（１−９）についての結果を、図５（ＰＴ
Ｈ（１−１４）のアラニンスキャン）に示す。ＰＴＨ（１７−３１）についての
結果を、図６に示す。結果は、ＰＴＨレセプター機能のアゴニストおよびアンタ
ゴニストの設計に有用であり、そして本発明のＳ−（Ｌ）_n−Ｂペプチドの構築
において使用し得る。

【０２０５】 （実施例４） （新規のＴｅｔｈｅｒレセプターの構築） 本発明の新規のレセプターを、分子生物学の分野での標準的な技術を使用して
構築した。Ｔｅｔｈｅｒ−１は、ＰＴＨ−１レセプターのアミノ末端配列；残基
２４および１８１の欠失を有する。残基２６−１８１は、ｒδＮｔ中の欠失の終
点を示す。Ａｌａ²²およびＴｙｒ²³の間の推定されるシグナルペプチドの切断部
位に基づいて、ｒδＮｔ中の残基２３−２５を、残基１８２に連結する。Ｔｅｔ
ｈｅｒ−１Ｃは、終止コドンが残基４８１に導入されていることを除いて、Ｔｅ
ｔｈｅｒ１と同一である。ｒδＮｔ／Ｃｔレセプターを、２６−１８１の欠失お
よび４８１の終止コドンの両方を有して、ＰＴＨ−１から構築する；これは、Ｐ
ＴＨレセプターの、細胞外アミノ末端のリガンド結合ドメインおよび細胞内のカ
ルボキシ末端ドメインの両方を欠失している。

【０２０６】 図１１には、テトラグリシンリンカーを介してレセプターのＧｌｕ−１８２に
対して融合されたラットＰＴＨ（Ａ−Ｖ−Ｓ−Ｅ−Ｉ−Ｑ−Ｌ−Ｍ−Ｈ−）のそ
のＮ末端残基（１−９）を含む、キメラのラットＰＴＨレセプターである、ｒＴ
ｅｔｈｅｒ−１を構築するために使用した、化学的に合成したオリゴヌクレオチ
ド（オリゴ）（＃Ｅ１６６３１Ａ１）を示す。従って、このオリゴは、ｒＰＴＨ
（１−９）のリガンド配列、およびその中心部分中の４つのＧｌｙ残基、および
隣接している部分としてｒＰＴＨレセプター残基をコードする。Ｅ１６６３１Ａ
１に類似しているが、ｒＰＴＨ（１−９）の代わりに、ＨＡエピトープタグに対
応するアミノ酸配列（Ｐ−Ｙ−Ｄ−Ｖ−Ｐ−Ｄ−Ｙ−Ａ−）が存在するコントロ
ールオリゴ（Ｅ１６８５３Ａ１）もまた示す：これは、本発明者らが以前に記載
したレセプター構築物を生じる（Ｌｕｃｋら、１９９９ Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ，１
３：６７０−６８０）。

【０２０７】 これらのオリゴを、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２；４８８−４９２）によって記載されている従来の部位
特異的変異誘発プロトコールにおいて使用した。簡潔には、一本鎖のオリゴを、
ｒｄｅｌＮＴ ＰＴＨ−１レセプターをコードするウラシル含有一本鎖プラスミ
ドＤＮＡ（Ｌｕｃｋら、１９９９ Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ、１３；６７０−６８０に
記載されている）に対してアニーリングさせ、ヘテ二量体を、Ｔ７ ＤＮＡポリ
メラーゼを使用する完全な第２鎖の合成に供し、そして反応生成物を、エレクト
ロポレーション方法によってＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。抗生
物質耐性コロニーから得られたプラスミドＤＮＡを単離し、正確なＤＮＡ配列を
確認し、次いで、続くＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションおよび機能的アッ
セイに使用した。

【０２０８】 ｈＴｅｔｈｅｒ−１、ｈｄｅｌＮＴ、およびｈＴｅｔｈｅｒ−Ｒ１１について
、核酸およびアミノ酸配列を、それぞれ図１７、１８、および１９に示す。

【０２０９】 （実施例５） （Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターの生物活性） ｃＡＭＰの蓄積を、Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターの活性を決定するために使用
した。ポジティブコントロールのレセプターを、天然のヒトのＰＴＨ−１レセプ
ターのアミノ末端に対するＨＡ抗原の付加によって構築した。このコントロール
の目的は、ＰＴＨ−１レセプターのアミノ末端への異種配列の付加が、レセプタ
ーの異常な活性を生じるかどうかを試験すること、および／またはレセプターが
、ＨＡ抗原の抗体認識を通じて細胞膜内に適切に取り込まれることを決定するこ
とである。利用したネガティブコントロールは、ｒδＮｔレセプターであった（
米国特許出願番号第６０／１０５，５３０号に記載されている）。このレセプタ
ーは、ＰＴＨ−１レセプターの細胞外アミノ末端ドメインを欠失している、ＰＴ
Ｈ−１の欠失変異体である。

【０２１０】 （実施例６） （係留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リガンドを含有しているＰＴＨ−１レセプターの
自己活性化） ペプチドホルモンが、膜結合レセプターとどのように相互作用するかの分析は
、不特定の三次元構造の大きなタンパク質を含むこのような生体分子システムに
おいて本来備わっている自由度の程度によって、不明瞭にされる。ヒトの副甲状
腺ホルモン（ｈＰＴＨ）は、狭い生存可能な範囲内に血液のカルシウム濃度を維
持する不可欠な役割を果たす、８４個のアミノ酸である（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ
，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｒ．編、Ｃｈａｐｍａｎおよ
びＨａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．（１９９７）、３８９−４２０頁）。ホル
モンはまた、骨に対して強力な同化効果を有する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４：６９０−７０９（１９９３）；およびＤｅｍ
ｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２６１（１９９４））
。これらの作用は、クラスＢのＧタンパク質結合レセプターである、ＰＴＨ−１
レセプターによって媒介される（Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５４：１０２４−１０２６（１９９１）。ＰＴＨペプチドの構造−活性の分析は
、（１−３４）フラグメントが、完全な生物学的な活性に十分であること、およ
びこのペプチド内では、Ｎ末端残基がレセプターの活性化に最も重要であること
、およびＣ末端残基はレセプターの結合エネルギーの大部分に寄与することを示
した（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９３：１３４９−
１３５３（１９７３）；Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５：１０１８３−１０１８７（１９８０））。

【０２１１】 レセプターの変異誘発および光化学的な架橋アプローチは、ＰＴＨの（１５−
３４）内の残基が、ＰＴＨレセプターの比較的大きな（約１７０アミノ酸）アミ
ノ末端の細胞外ドメインと相互作用すること、およびＰＴＨのＮ末端残基が、７
個の膜貫通ドメインおよび細胞外ループと相互作用することを示唆した（Ｂｅｒ
ｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６
８（１９９７）；Ｌｅｅ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．９：１２６９−１２７８
（１９９５）；Ｂｉｓｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：
２２４９８−２２５０５（１９９８））。この仮説の後者の部分の支持において
は、ＰＴＨ（１−１４）のような程度の小さい大きさのペプチドが、野生型のＰ
ＴＨレセプターおよび短縮型のＰＴＨレセプター（これは、Ｎ末端ドメインのほ
とんどを欠失している）の両方を用いて、ｃＡＭＰの形成を刺激し得ることが、
最近示された（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：
６７０−６８０（１９９９））。ＰＴＨ（１−１４）の能力は、完全なレセプタ
ーおよび短縮型のレセプターの両方を用いて低かった（ＥＣ₅₀＝ｃａ．１００μ
Ｍ）；対照的に、ＰＴＨ（１−３４）は、野生型のレセプターを用いて強力なア
ゴニストであったが（ＥＣ₅₀ｃａ．３ｎＭ）、その能力は短縮型のレセプターを
用いて厳しく低下した。これらの結果の両方ともが、レセプターのＮ末端ドメイ
ンとＰＴＨ（１−３４）のＣ末端ドメインとの間での相互作用が、リガンド／レ
セプター複合体を安定化させることにおいて重要であるという認識と一致する。
ＰＴＨ（１−１４）に対して行ったアラニンスキャン分析は、Ｓｅｒ³を除く残
基（１−９）が、レセプターのヘプタヘリックス領域および細胞外ループ領域と
の相互作用に重要であることを明らかにした（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：６７０−６８０（１９９９））。

【０２１２】 上記の結果に基づいて、ＰＴＨのＮ末端（１−９）残基が、それらが７個の膜
貫通ドメインおよび細胞外ループを含有しているレセプターの領域内に拘束され
る場合に、レセプターの活性化に十分であるという可能性を考察した。本明細書
中に記載するように、これは、Ｎ末端の細胞外ドメインを欠失している短縮型の
レセプターに対して直接的にＰＴＨのＮ末端残基を係留ことによって、達成され
得ることが示されている；得られた係留リガンド／レセプター構築物は活性であ
り、そしてＰＴＨ（１−１４）およびＰＴＨ（１−３４）を用いて以前に見られ
たものと同一ではないが同様の、変異プロフィールを示す。このシステムは、高
い結合親和性を有するリガンドを生成する必要なく、レセプターのシグナル伝達
に関係するＰＴＨ残基を分析するための新規のアプローチを提供する。

【０２１３】 材料および方法 ペプチド：ペプチド［Ａｌａ^1,3,10,12、Ａｒｇ¹¹、Ｔｙｒ³⁴］ｈＰＴＨ（１
−３４）ＮＨ₂｛Ｑ−ＰＴＨ（１−３４）｝を、Ｎ−（９−フルオレニル）メト
キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）主鎖保護およびＴＦＡ媒介切断／脱保護（ＭＧＨ
Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ
，ＭＡ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ４
３１Ａペプチド合成装置上で調製した。ペプチドを、１０ｍＭの酢酸中で再構成
し，そして−８０℃で保存した。Ｑ−ＰＴＨ（１−３４）の純度、実態、および
ストック濃度を、分析ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析、およびアミノ
酸分析によって確保した。

【０２１４】 細胞培養物：ＣＯＳ−７細胞を、ウシ胎児血清（１０％）、ペニシリンＧ（２
０ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸（２０μｇ／ｍｌ）、およびアン
フォテリシンＢ（０．０５μｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中で、５％のＣＯ₂を含有している加湿した空気中で、Ｔ−７５フ
ラスコ（７５ｍｍ²）中で３７℃にて培養した。細胞を、２４ウェルプレート中
で予備培養し、そしてコンフルエントになったら、新鮮な培地で処理し、そして
アッセイの前に１２〜２４時間で、３３℃にシフトさせた（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，
Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９７
）；Ａｂｅｌｌ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４５１８−４５２
７（１９９６））。

【０２１５】 ＰＴＨレセプターの変異誘発およびＣＯＳ−７細胞の発現：完全なｈＰＴＨ−
１レセプターをコードするｐＣＤＮＡ−１に基づくプラスミド（参考文献中ＨＫ
−ＷＴ（Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３２：２１５７
−２１６５（１９９３）および本明細書中でｈＰ１Ｒ−ＷＴと呼ばれる）を、Ｃ
ＯＳ−７細胞中での研究に使用した。短縮型のヒトのＰＴＨ−１レセプター（ｈ
Ｐ１Ｒ−ｄｅｌＮｔ）(図１８)を、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（Ｋｕｎ
ｋｅｌ，Ｙ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４
８８−４９２（１９８５））によって、ＨＫ−ＷＴプラスミドから構築した。こ
の変異レセプターは、残基２４〜１８１を欠失し、そしてシグナルペプチドの切
断が、Ａｌａ²²およびＴｙｒ²³の間で生じる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．ら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６（１９９７））という仮定す
ると、第１の膜貫通ドメインの境界またはその付近に配置されたＧｌｕ¹⁸²に対
して直接連結されたＮ末端残基として、Ｔｙｒ²³を有することが推定される。同
様の短縮型のラットＰＴＨレセプターは以前に本発明者らによって記載されてい
る（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：６７０−６
８０（１９９９））。係留ヒトＰＴＨ−１レセプター［ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ
（１−９）］（図１７中のｈＴｅｔｈｅｒ−１）は、ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴ構築
物に基づき、そして残基２３と１８２との間に挿入された、ＰＴＨ（１−９）お
よび４個のグリシンスペーサー（ＡＶＳＥＩＱＬＭＨＧＧＧＧ）を有する。シグ
ナルペプチドの切断が、Ａｌａ²²とＴｙｒ²³との間で生じると仮定すると、ｈＰ
１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−９）は、リガンドのＡｌａ¹に直接連結されたＮ末端
残基として、Ｔｙｒ²³を有すると推定される。ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−９
）のアナログを同様の様式で作製した。ＣＯＳ−７細胞の一時的なトランスフェ
クションを、ＤＥＡＥ−デキストラン、および２４ウェルプレートの１ウェル当
たり２００ｎｇの塩化セシウムで精製したプラスミドＤＮＡを使用して、以前に
記載されているように（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２：２８８６１−２８８６８（１９９７））に行った。

【０２１６】 ｃＡＭＰの刺激：ペプチドアナログでの細胞の刺激を、２４ウェルプレート中
で行った。細胞を、０．５ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１
００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、５％の熱不活化ウ
マ血清、０．５％のウシ胎仔血清、ＨＣｌでｐＨ７．７に調節した）でリンスし
、そして２００μｌのｃＡＭＰアッセイ緩衝液（２ｍＭの３−イソブチル−１−
メチルキサンチン、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、３５ｍＭのＨｅｐｅｓ
−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４を含有しているダルベッコ改変イーグル培地）および種
々の量のペプチドアナログを含有している１００μＬの結合緩衝液で処理した（
最終容量＝３００μＬ）。培地を、室温で１時間のインキュベーション後に除去
し、そして細胞を凍結させ（−８０℃）、０．５ｍＬの５０ｍＭのＨＣｌで溶解
させ、そして再度凍結させた（−８０℃）。稀釈した溶解物のｃＡＭＰ含有量を
、ラジオイムノアッセイによって決定した。

【０２１７】 データの計算：計算を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して行った。
２つのデータのセットの間での統計学的な有意性を、２つのセットについての不
等な分散を仮定する片側の（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントのt‐検定
を使用して決定した。

【０２１８】 （結果） 研究を、標的化された係留されたリガンド／レセプター構築物の構築で開始し
た。これは、出発点として、以前に報告されたｄｅｌＮＴレセプターを利用した
（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：６７０−６８
０（１９９９））。この変異レセプターは、細胞外Ｎ末端リガンド結合ドメイン
の残基２４−１８１を欠いており、そしてシグナルペプチドの切断後に、Ｇｌｕ ¹⁸² に直接連結されたＮ末端残基としてＴｙｒ²³を有すると推定される。係留さ
れたリガンド／レセプター構築物（ｈＴｅｔｈｅｒ）を構築するために、以下の
１３アミノ酸の配列を、Ｔｙｒ²³とＧｌｕ¹⁸²との間に挿入した。Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−（Ｇｌｙ）₄
。従って、シグナルペプチドの切断後には、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−９）
は、（Ｃ末端からＮ末端で）細胞内Ｃ末端ドメイン、７個の膜貫通へリックス（
およびループを伴う）、短いグリシンスペーサー、および［Ｔｙｒ^-1］−ｒＰＴ
Ｈ（１−９）を含むはずである。他の係留されたリガンド／レセプター構築物を
、同じ様式で作製した。ここでは、ｒＰＴＨ（１−９）に対応する配列のみを、
ｈＰ１Ｒ−［Ｒ（１−１１）］中にある場合には１つまたは２つのアミノ酸だけ
Ｃ末端方向に延長した（図１９）。

【０２１９】 一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中でのｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ
（１−９）およびそのアナログのいくつかのシグナル伝達特性の最初の特徴付け
を、図１２Ａ−図１２Ｂに示す。任意のアゴニストペプチドの非存在下では、ｈ
Ｐ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−９）は、ｈｄｅｌＮＴで見られるものと比較して、
ｃＡＭＰの基底レベルにおいて約５倍の増強を示す（図１２Ａ）。リガンド鎖（
ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１０）および（１−１１））の伸長は、有意では
ないが、中程度の、基底のｃＡＭＰシグナル伝達のレベルにおける改善を生じた
。この基底のシグナル伝達を、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）の１１位の
ロイシンをアラニンで置換することによってなおさらに増大し得た；本発明者ら
は、最近、この同じ改変がまた、短いＰＴＨペプチドのｃＡＭＰ能力を劇的に増
強させることを報告した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂ．Ｍ．Ｒ．１４：要
約 Ｆ３９６（１９９９））。全てのｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ構築物は、同様の
程度に、十分に強力なアナログ［Ａｌａ^1,3,10,12、Ａｒｇ¹¹、Ｔｙｒ³⁴］−Ｐ
ＴＨ（１−３４）ＮＨ₂［Ｑ−ＰＴＨ（１−３４）］の１μＭの用量に対して応
答した（図２Ｂ）。用量応答分析は、短縮型のレセプターであるｈＰ１Ｒ−ｄｅ
ｌＮＴ、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１−９）、およびｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅ
ｔｈｅｒ（１−１１）が全て、インタクトな野生型のレセプターと比較してＱ−
ＰＴＨに対して右側にシフトした応答を示したことを明らかにした；これらのレ
セプターのそれぞれは、最大のｃＡＭＰ応答を産生し得た（図１３）。ｈＰ１Ｒ
−Ｔｅｔｈｅｒ構築物についてのＱ−ＰＴＨ（１−３４）の用量応答曲線は、類
似であり、そしてｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴと比較して左側にシフトした。

【０２２０】 ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ構築物の構成的な活性化をさらに特徴付けるために、
基底のｃＡＭＰシグナル伝達およびアゴニストによって誘導されるｃＡＭＰのシ
グナル伝達の時間依存性およびＤＮＡ依存性を試験した。図１４に示すように、
ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）についての基底のｃＡＭＰシグ
ナル伝達の最大レベルは、４０分で観察された；これはまた、最大のアゴニスト
によって誘導されるシグナル伝達が、ｈＰ１Ｒ−ＷＴおよびｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］
−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）の両方について観察された時点であった。ｈＰ１Ｒ
−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）の基底シグナル伝達およびアゴニストに
よって誘導されるシグナル伝達の両方が、ＣＯＳ−７細胞の一時的なトランスフ
ェクションに使用したプラスミドＤＮＡの量に極めて依存した（図１５）。この
ＤＮＡ依存性は、ｈＰ１Ｒ−ＷＴおよび別の構成的に活性なＰＴＨ−１レセプタ
ー（これは、膜貫通へリックス２の細胞質側の末端でＨ２２３Ｒ点変異を含有し
ている）の両方の基底シグナル伝達およびアゴニストによって誘導されるシグナ
ル伝達の両方について観察されたＤＮＡ依存性と類似であった。

【０２２１】 上記のように、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ構築物についての基底のシグナル伝達
レベルは、Ｌｅｕ→Ａｒｇ¹¹の置換を利用することによって改善され得た。これ
は、本発明者らが、短いＰＴＨ（１−１４）ペプチドの状況において最初に発見
した。他の同様のことが、ＰＴＨペプチドとｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ
（１−１１）のＰＴＨ部分の構造−活性プロフィールとの間に存在するかどうか
を調べるために、アラニンスキャン分析（図１６Ａ−１６Ｂ）を行った。示すよ
うに、ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）中のＰＴＨ配列の最初の
９個のアミノ酸のそれぞれの置換は、基底のシグナル伝達のレベルに対して位置
特異的な影響を生じた（図１６Ａ）が、アゴニストによって誘導されるｃＡＭＰ
のシグナル伝達のレベルには劇的な影響を与えなかった（図１６Ｂ）。

【０２２２】 （考察） この研究は、ＰＴＨリガンドのＮ末端の「活性化のコア」に係留されたヘプタ
へリックスのＧタンパク質に共役したＰＴＨ−１レセプターの本体を含む、一連
の新規の係留されたＰＴＨリガンド−レセプター結合体を記載する。本研究のそ
れぞれの係留されたレセプターは、基底のｃＡＭＰシグナル伝達の増大したレベ
ルを示し、そしてｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１−１１）は、アゴニス
トリガンドで処理された場合に、ｈＰ１Ｒ−ＷＴによって弱められた最大応答に
近づいた基底のシグナル伝達のレベルを示した。ＰＴＨレセプターの本体に係留
された場合に、ＰＴＨの活性化ドメインに由来する小さいペプチドがＧタンパク
質の共役を刺激するこの能力は、プロテアーゼによって活性化されたレセプター
によって（トロンビンレセプターによって最良に示される）利用される天然によ
って設計された活性化の分子内機構に対して強力な類異性を有する（Ｃｈｅｎ，
Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６０４１−１６０４５（１９９４
））。

【０２２３】 係留されたＰＴＨレセプターについては、本発明者らは、それらのｈＰ１Ｒ−
ｄｅｌＮＴの対応物と比較して、外因性のＰＴＨリガンドに対する増強された応
答性を観察した。外因性のリガンドに対するこの増強された応答性の根底にある
機構は、現在は明らかではないが、係留されたレセプターのいくらかの割合が、
ＰＴＨ（１−３４）によってより用意に刺激される、占有されていないなお予め
活性化された状態にあるということがあり得る。このような予め活性化された状
態は、原則として、ロドプシンの光サイクルにおいて観察される代謝状態の１つ
に似ている（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１
−４（１９９２））。いずれの場合においても、アゴニストペプチドに対する増
強された応答性が、構成的に活性なＰＴＨレセプターの一般的な特徴ではないこ
とが明らかである（Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎ．Ｍｅｔａｂ．８４：３０５２−３０５７（１９９９））。係留されたリガン
ドシステムのこの特有の特性は、ＰＴＨレセプターの活性化の機構に新規の知見
をもたらし得，そして新規のＰＴＨ−１レセプターアゴニストについてのライブ
ラリーをスクリーニングするための利点を潜在的に付与する。

【０２２４】 係留されたリガンドとして、ＰＴＨ（１〜１０）、ＰＴＨ（１〜１９）、ＰＴ
Ｈ（１〜１１）のネイティブの配列は、これらの係留されたリガンドのそれぞれ
が、レセプターの膜に埋めこまれた部分の濃度と比較して、等モル比で存在した
としても、Ｌｅｕ¹¹→Ａｒｇの置換を含有している係留されたＰＴＨ（１〜１１
）配列よりも弱いことを見出した。それぞれが、高用量のＱ−ＰＴＨ（１〜３４
）に応答してｃＡＭＰ形成の類似の最大レベルを刺激したと仮定すると、これら
のレセプターの発現レベルは匹敵したようであった。Ａｒｇ¹¹を含有している係
留されたリガンドの改善された基底のシグナル伝達は、この同じ置換がＰＴＨ（
１〜１１）および（１〜１４）アナログの効力に対して有する有利な影響と一致
する。この観察は、係留されたリガンド−レセプターシステムによって惹起され
る以下の基本的な疑問点の１つをいう；外因性であり、そして係留されたリガン
ドは、レセプターの活性化のために同じ接触点を利用するかどうか。 上記のさらなる疑問点を試験するために、ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ
（１〜１１）のＰＴＨ（１〜１９）領域のアラニンスキャン分析を行った。結果
は、ＰＴＨ（１〜１４）ペプチド（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．１３：６７０−６８０（１９９９））、およびＰＴＨ（１〜３６）
（Ｇｏｍｂｅｒｔ，Ｆ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
１４ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｍｐｏｓｉｕｍ，Ｊｕｎ
ｅ １８−２３、Ｋａｍａｙａ，Ｐ．およびＨｏｄｇｅｓ，Ｒ．編、Ｍａｙｆｌ
ｏｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ．Ｋｉｎｇｓｗｉｎｆｏｒｄ
，ＵＫ（１９９６）、６６１−６６２頁）上で行われたアラニンスキャンによる
いくつかの差異を明らかにしたが、研究の前に、これらに対する非常に魅力的な
類似性が存在した。ＰＴＨ（１〜１４）の場合においては、Ｓｅｒ³→Ａｌａ変
異は、ネイティブのＰＴＨ（１〜１４）よりもわずかに強力なペプチドを生じた
；一方、（２〜９）領域内での任意の他の位置でのＡｌａ置換は、検出可能なレ
ベル未満に活性を低下させた（１位は、ネイティブの配列ではアラニンである）
（Ｌｕｃｋ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：６７０−６８
０（１９９９））。ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）の場合にお
いては、Ｓｅｒ³およびＬｅｕ⁷のアラニン置換は、置換された構築物で見られる
基底のシグナル伝達活性の約３３％を有する変異体を生じ、一方、Ｇｌｎ⁶およ
びＨｉｓ⁹の置換は、ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）とほぼ同
じ程度に活性な変異体を生じた。重要なことは、Ｖａｌ²、Ｉｌｅ⁵、およびＭｅ
ｔ⁸でのアラニン置換が、重篤な損傷した基底のシグナル伝達を有するレセプタ
ーを生じたことである。最近のコンピューターモデル化の取り組みによって、こ
れらの３つの残基が、レセプターのヘプタへリックスコアに入っていることが推
測されている（Ｍｉｅｒｋｅ，Ｄ．Ｆ．およびＰｅｌｌｉｇｒｉｎｉ，Ｍ．、Ｃ
ｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．５：２１−３６（１９９９））。これらの変異体
の全てが、外因性のＱ−ＰＴＨ（１〜３４）に対して十分に応答するので、シグ
ナル伝達に対する影響が、レセプターの発現における差異によって説明すること
が可能である可能性は低い。係留されたリガンドの相互作用が、ＰＴＨによって
使用される相互作用を模倣するという仮説をさらに証明するために、外因性のリ
ガンドのＮ末端残基との相互作用をもたらすことが公知の、第３の細胞外ループ
（Ｌｅｅ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．９：１２６９−１２７８（１９９５））
中の特定のレセプターの変異の影響に着手し得る。

【０２２５】 同様に置換したＰＴＨ（１〜１４）と比較した、ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］−Ｔｅｔ
ｈｅｒ（１〜１１）中の特定のＰＴＨ残基（例えば、Ｇｌｎ⁶、Ｌｅｕ⁷、および
Ｈｉｓ⁹）のより大きな変異寛容性についての１つの説明は、係留されたリガン
ドの高い有効モル濃度が、主にレセプターのシグナル伝達に影響を与える残基（
すなわち、Ｖａｌ²、Ｉｌｅ⁵、およびＭｅｔ⁸）と、リガンドの結合に主に影響
を与える残基との間での識別を可能にすることである。このような、ＰＴＨペプ
チドのＮ末端中での構造／機能の関係を解明する能力は、以前には利用可能では
なかった。なぜなら、所定のアナログのｃＡＭＰ効力は、レセプターに対するそ
の親和性と解けないほどに関連しているからである（Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ，Ｄ．
、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２５：９２４−９４７（１９９８））
。

【０２２６】 係留されそして外因性であるリガンドが同じレセプターの接触を利用するかど
うかに関して、高い親和性結合の必要性を排除する能力は、有意な利点を有する
。本明細書中に記載されている係留されたリガンド／レセプターシステムは、お
そらく、低分子のＰＴＨ模倣物の発見に近づく別の重要な進歩を示す。

【０２２７】 本発明の係留されたレセプター（Ｓ−Ｌ−Ｒ’）を、ＰＴＨアゴニストについ
てのスクリーニングアッセイに使用し得る。このようなアゴニストは、細胞中で
発現されるＳ−Ｌ−Ｒに対して外因的に付加される化合物（ペプチドまたは非ペ
プチド）のライブラリーから生じ得るか、またはこれらは、増強された自己活性
化を導くＳ−Ｌ−ＲのＳ成分の変異によるバリエーション（当該分野で公知の手
段によって変異体のＳ成分配列が合成され得る場合においては、短い単離された
ペプチドとして）から生じ得、次いで、これは、新規の薬物として使用され得る
。

【０２２８】 （実施例６のまとめ） ＰＴＨのＮ末端残基と、細胞外ループおよび膜貫通ドメインを含有しているＰ
ＴＨレセプターの領域との間での相互作用は、レセプターの活性化の重要な工程
であると考えられる。この仮説は、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜９）を生じる
ための第１の幕貫通ドメインの細胞外の末端でのＨｉｓ−９とＧｌｕ−１８２と
の間でテトラグリシンリンカーを使用して、ｒＰＴＨ（ＡＶＳＥＩＱＬＭＨ）の
残基（１〜９）を用いて、ｈＰＴＨ−１レセプターのＮ末端の細胞外ドメインを
置きかえることによって、評価した。ＣＯＳ−７細胞中でのｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈ
ｅｒ（１〜９）の発現は、ｈＰ１Ｒ−野生型でトランスフェクトしたコントロー
ル細胞中で見られるものよりも、４〜５倍高い基底のｃＡＭＰレベルを生じた。
１１位までリガンド配列を伸長することおよびＬｅｕ→Ａｒｇの活性を増強する
置換を含むことによって、ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）を生じ
、これは、ｈＰ１Ｒ−野生型によって弱められた最大のアゴニストによって刺激
された応答に接近する、基底のｃＡＭＰシグナル伝達における２０倍の増大を生
じた。ｈＰ１Ｒ−［Ｒ¹¹］Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のアラニンスキャンは、Ｖ
ａｌ−２、Ｉｌｅ−５、およびＭｅｔ−８が自己活性化に重要であったことを明
らかにした。従って、係留されたリガンドレセプター構築物は、ＰＴＨがどのよ
うにそのレセプターと相互作用し、そしてＧタンパク質の共役を誘導するかを分
析するために使用され得、そしてそのレセプターと複合体化したＰＴＨの全体的
なトポロジー的配向のモデルを強制することを助けるはずである。

【０２２９】 特定の実施形態および実施例を含む上記の明細書は、本発明の説明と意図され
、そして制限するとはみなされない。多数の他のバリエーションおよび改変が、
本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく行われ得る。本明細書中で記載
されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、本開示にそれらの全体が参
考として援用される。

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＧ５（ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１５〜３１））アミノ酸
（配列番号９）および核酸（配列番号１４）配列；ＰＧ７（ＰＴＨ（１〜９）−
（Ｇｌｙ）₇−ＰＴＨ（１７〜３１））アミノ酸（配列番号１１）および核酸（
配列番号１５）配列；ならびにＰＧ９（ＰＴＨ（１〜５）−（Ｇｌｙ）₉−ＰＴ
Ｈ（１５〜３１））アミノ酸（配列番号１３）および核酸（配列番号１６）配列
を示す。

【図２】 Ｂファミリーリガンドアミノ末端配列に結合したＧタンパク質レセプターを示
す。

【図３】 示されたＰＴＨペプチドへの曝露に応答する、ＣＯＳ細胞中の環状ＡＭＰ（ｃ
ＡＭＰ）の総蓄積の測定。Ａ）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ細胞
および翻訳が停止したヌルＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞中の総ｃＡＭＰ
蓄積の比較。Ｂ）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ細胞におけるｃＡ
ＭＰの蓄積に対するＰＧ５およびＰＧ９の効果を実証する第２の実験を示す。

【図４】 ヒトＰＴＨ−１レセプター（ＣＯＳ７／ｈＰＴＨ−１細胞）でトランスフェク
トされたＣＯＳ細胞における、短いアミノ末端ＰＴＨアナログのｃＡＭＰ用量応
答曲線。２４プレート中のＣＯＳ細胞を、示したペプチドで２１℃にて６０分間
処理し、次いで細胞内ｃＡＭＰレベルを測定した。示した全てのＰＴＨペプチド
は、ラットＰＴＨ配列に基づいており、そしてカルボキシ末端がアミド化されて
いる。４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、別々の実験を示す。

【図５】 ＰＴＨ（１〜１４）のアラニンスキャン。１４個の異なるＰＴＨ（１〜１４）
誘導体の生物活性を示し、各々は、アラニンによって置換された、ネイティブな
配列の異なるアミノ酸（図の下に示す）を有する。ペプチドを化学的に合成し、
精製し、そしてクローニングされたヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ
−７細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激する能力について試験した。ペプチドを、
２連で６７μＭの用量で試験した（±ｓ．ｅ．ｍ．）。コントロールとして、基
本（ｂａｓａｌ）によって示される未処理細胞を測定した。１位にアラニンを含
むＰＴＨ（１〜１４）を、野生型参照物として用いた。細胞を、２１℃にて３０
分間刺激した。この図は、本発明に用いられるＰＴＨ（１〜９）ペプチド中のア
ミノ酸残基の生物学的活性に関連する情報を提供する。

【図６】 ＰＴＨ（１７〜３１）のアラニンスキャン。１５個の異なるＰＴＨ（１７〜３
１）誘導体のＩＣ₅₀値で表わされる、競合的結合分析の結果を示し、各々は、ア
ラニンによって置換された、ネイティブな配列の異なるアミノ酸（図の下に示す
）を有する。ペプチドを化学的に合成し、精製し、そしてクローニングされたヒ
トＰＴＨ−２レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞に結合するＰＴＨ（１〜３４
）を阻害する能力について試験した。ＩＣ₅₀は¹²⁵ＩＰＴＨ（１〜３４）結合の
５０％を阻害するのに必要なペプチドの用量である。この図は、本発明で用いら
れるＰＴＨ（１７〜３１）ペプチド中のアミノ酸残基の生物学的活性に関する情
報を提供する。

【図７】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターの核酸配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列
（配列番号１２）を示す。

【図８】 Ａ）ｒＨＡ−Ｗｔレセプター、ｒδＮｔレセプター（またＤｅｌ−Ｎｔ、ｄｅ
ｌＮＴまたはｒΔＮｔとして本出願においていわれる）およびＴｅｔｈｅｒ−１
レセプターの模式図。Ｂ）８Ａに示される、組換えレセプター分子を試験するｃ
Ａｍｐ蓄積アッセイの結果。

【図９】 Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプターの核酸配列（配列番号３８）およびアミノ酸配
列（配列番号３９）を示す。

【図１０】 ｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの核酸配列（配列番号４０）およびアミノ酸配列（
配列番号４１）を示す。

【図１１Ａ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。図１１Ａは、野生型ＰＴＨに由来するＰＴＨレセプターの２つ
の隣接領域を示す。配列番号４６は左側隣接領域であり、そして配列番号４７は
右側隣接領域である。全体の介在性配列は示されない。

【図１１Ｂ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。図１１Ｂは、このオリゴヌクレオチドにおいて用いられるＰＴ
Ｈ（１〜９）をコードするコンピューター生成ヌクレオチド配列を示す。

【図１１Ｃ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。ｒＴｅｔｈｅｒ−１を構築するために用いられるオリゴヌクレ
オチドＥ１６６３１Ａ１（配列番号４８）の配列。

【図１１Ｄ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。隣接配列およびＰＴＨ挿入物（配列番号４９）。スラッシュマ
ーク（／）はＰＴＨ挿入物の左および右に対する隣接領域を示す。オリゴヌクレ
オチドＥ１６６３１Ａおよびそのタンパク質翻訳物の配列。（注記、ここでのＤ
ＮＡ配列は図１１Ｃ（配列番号４８）におけるものと同じである。）

【図１１Ｅ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。Ｔｅｔｈｅｒ−１候補物のスクリーニングにおいて用いられる
ＮｄｅＩ制限部位

【図１１Ｆ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。Ｔｅｔｈｅｒ−１のＰＴＨ（１〜９）配列の代わりにＨＡ−Ｅ
ＰＩＴＯＰＥ ＴＡＧを含むコントロールプラスミドの構築に用いられるＥ１６
８５３Ａ１の配列。

【図１１Ｇ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。オリゴＥ１６８５３Ａ１のＤＮＡ配列およびタンパク質翻訳物
（注記、ＤＮＡ配列は１１Ｆ（配列番号５１）におけるものと同じである。）

【図１２】 一過性でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈ
ｅｒ（１〜９）およびいくつかのそのアナログのシグナル伝達特性の特徴。

【図１３】 短縮型レセプターｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴ、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜９）
およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）の用量応答分析。

【図１４】 基礎およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）に対するアゴニスト
誘導ｃＡＭＰシグナル伝達の時間依存性およびＤＮＡ依存性。

【図１５】 基本およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のアゴニスト誘導シ
グナル伝達は、ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションに用いられるプラ
スミドＤＮＡの量に非常に依存している。

【図１６】 ｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のＰＴＨペプチドおよびＰＴＨ
部分の構造活性プロフィール。

【図１７】 ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ−１（ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜９）のヌクレオ
チド配列（配列番号６１）および対応するアミノ酸配列（配列番号６２）。ＰＴ
ＨのＡｌａ２４〜Ａｒｇ１８１をＡｌａ１〜Ｈｉｓ９で置換することによってヒ
トＰＴＨ−１レセプターから作製した。ＨＫ−Ｔｅｔｈｅｒ−１：配列番号：Ｅ
２０９８６Ａ１（９９ｎｔｓ）およびその翻訳物。ｈＰＴＨ−１ｒｅｃ（ＨＫ）
におけるＴｅｔｈｅｒ−１を構築するためのオリゴ。ｒｅｃのＡｌａ−２３をＰ
ＴＨ（１〜９）−−Ｇｌｙｘ４、−−Ｇｌｕ−１８２のＶａｌ−２に結合させる
。

【化１４】

【図１８】 ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌ１ＮＴのヌクレオチド配列（配列番号５９）および対応する
アミノ酸配列（配列番号６０）。

【図１９】 ｈＰ１Ｒ−[Ｒ１１]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のヌクレオチド配列（配列番
号５７）および対応するアミノ酸配列（配列番号５８）。Ｈｉｓ９とリンカーの
第１のＧｌｙとの間にＡｓｎ１０−Ａｒｇ１１を挿入することによって、ｈＴｅ
ｔｈｅｒ−１から作製した。図１９配列番号：Ｅ２７３０９Ａ１。ｈＴｈｒ−Ａ
ｒｇ１１：ＨＫ−Ｔｅｔｈｅｒ−１中にＡｓｎ−１０およびＡｒｇ１１を挿入す
る。Ｍｅｔ８／Ｈｉｓ９にＮＳｉＩ部位を付加する（ＡＴＧＣＡｔ）。

【化１５】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月１６日（２００１．７．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】 からなる群から選択される、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。

【化２】 からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。

【化３】 ならびにこれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の単
離されたポリペプチド。

【化４】 およびこれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項２に記載の単離
されたポリペプチド。

【化５】 である、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。

【化６】 からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７０】 別の特定の実施形態において、本発明は、化合物Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂ（ここでＳ
が、シグナル伝達ペプチドＰＴＨ（１〜９）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ（配列番号１））であり；Ｌが、リ
ンカー分子（Ｇｌｙ）₇であり；そしてＢが、結合ペプチドＰＴＨ（１７〜３１
）（Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ（配列番号６３））であ
る）を含むＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ２Ｒレセプターに対するアゴニス
トの設計のために有用な生物学的に活性なペプチドを提供する。ＰＧ７である配
列全体は、以下：

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７３】

【化１０】 である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７５】

【化１１】 である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７７】

【化１２】 である。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８７】 さらに、本発明の別の実施形態は、シグナル伝達ペプチド（「Ｓ」）が必要と
されるＰＴＨ（１〜１１）（Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号６７）を使用し得る。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０２２９】 特定の実施形態および実施例を含む上記の明細書は、本発明の説明と意図され
、そして制限するとはみなされない。多数の他のバリエーションおよび改変が、
本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく行われ得る。本明細書中で記載
されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、本開示にそれらの全体が参
考として援用される。

【表２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> PTH Functional Domain Conjugate Peptides, Derivatives Thereof and Novel Tethered Ligand-Receptor Molecules <130> 0609.478JP02 <150> PCT/US99/31108 <151> 1999-12-30 <150> US 60/114,577 <151> 1998-12-31 <160> 67 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp 1 5 10 15 Val <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 3 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Val Ser Glu Ile 1 5 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 5 Ala Val Ser Glu Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 6 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 1 5 10 15 Ile <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 9 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Val Ser Glu His 1 5 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 11 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile 1 5 10 15 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 13 Ala Val Ser Glu Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 20 25 30 <210> 14 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 14 gcuguuuccg aaauccagcu gaugcacggu ggugguggug gucugaacuc cauggaacgu 60 guugaauggc ugcguaaaaa acugcaggac guu 93 <210> 15 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 15 gcuguuuccg aaauccagcu gaugcacggu ggugguggug guggugguuc cauggaacgu 60 guugaauggc ugcguaaaaa acugcaggac guu 93 <210> 16 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 16 gcuguuuccg aaaucggugg uggugguggu ggugguggug gucugaacuc cauggaacgu 60 guugaauggc ugcguaaaaa acugcaggac guu 93 <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val 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acc agg cag cag tac 768 Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg Gln Gln Tyr 245 250 255 cgg aag ctg ctc agg tcc acg ttg gtg ctc gtg ccg ctc ttt ggt gtg 816 Arg Lys Leu Leu Arg Ser Thr Leu Val Leu Val Pro Leu Phe Gly Val 260 265 270 cac tac acc gtc ttc atg gcc ttg ccg tac acc gag gtc tca ggg aca 864 His Tyr Thr Val Phe Met Ala Leu Pro Tyr Thr Glu Val Ser Gly Thr 275 280 285 ttg tgg cag atc cag atg cat tat gag atg ctc ttc aac tcc ttc cag 912 Leu Trp Gln Ile Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn Ser Phe Gln 290 295 300 gga ttt ttt gtt gcc atc ata tac tgt ttc tgc aat ggt gag gtg cag 960 Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly Glu Val Gln 305 310 315 320 gca gag att agg aag tca tgg agc cgc tgg aca ctg gcg ttg gac ttc 1008 Ala Glu Ile Arg Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala Leu Asp Phe 325 330 335 aag cgc aaa gca cga agt ggg agt agc agc tac agc tat ggc cca atg 1056 Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Pro Met 340 345 350 gtg tct cac acg agt gtg acc aat gtg ggc ccc cgt gca gga ctc agc 1104 Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Ala Gly Leu Ser 355 360 365 ctc ccc ctc agc ccc cgc ctg cct cct gcc act acc aat ggc cac tcc 1152 Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Pro Pro Ala Thr Thr Asn Gly His Ser 370 375 380 cag ctg cct ggc cat gcc aag cca ggg gct cca gcc act gag act gaa 1200 Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Ala Pro Ala Thr Glu Thr Glu 385 390 395 400 acc cta cca gtc act atg gcg gtt ccc aag gac gat gga ttc ctt aac 1248 Thr Leu Pro Val Thr Met Ala Val Pro Lys Asp Asp Gly Phe Leu Asn 405 410 415 ggc tcc tgc tca ggc ctg gat gag gag gcc tcc ggg tct gcg cgg ccg 1296 Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser Gly Ser Ala Arg Pro 420 425 430 cct cca ttg ttg cag gaa gga tgg gaa aca gtc atg tga 1335 Pro Pro Leu Leu Gln Glu Gly Trp Glu Thr Val Met 435 440 <210> 37 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 37 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala 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tac tgt ttc tgc aat ggt gag gtg cag 960 Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly Glu Val Gln 305 310 315 320 gca gag att agg aag tca tgg agc cgc tgg aca ctg gcg tag 1002 Ala Glu Ile Arg Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala 325 330 <210> 39 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 39 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Ala Glu Thr Ser Glu His Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr Val Gly Tyr 35 40 45 Ser Met Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile Leu Ala Tyr 50 55 60 Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met His Met Phe 65 70 75 80 Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Ala Ser Ile Phe Val Lys Asp Ala Val 85 90 95 Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu Thr Glu Glu 100 105 110 Glu Leu His Ile Ile Ala Gln Val Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Val Gly Tyr Ala Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(972) <400> 40 atg ggg gcc gcc cgg atc gca ccc agc ctg gcg ctc cta ctc tgc tgc 48 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 cca gtg ctc agc tcc gca tat gcg ctg gag gta ttt gac cgc cta ggc 96 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly 20 25 30 atg atc tac acc gtg gga tac tcc atg tct ctc gcc tcc ctc acg gtg 144 Met Ile Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Met Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val 35 40 45 gct gtg ctc atc ctg gcc tat ttt agg cgg ctg cac tgc acg cgc aac 192 Ala Val Leu Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn 50 55 60 tac atc cac atg cac atg ttc ctg tcg ttt atg ctg cgc gcc gcg agc 240 Tyr Ile His Met His Met Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Ala Ser 65 70 75 80 atc ttc gtg aag gac gct gtg ctc tac tct ggc ttc acg ctg gat gag 288 Ile Phe Val Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Asp Glu 85 90 95 gcc gag cgc ctc aca gag gaa gag ttg cac atc atc gcg cag gtg cca 336 Ala Glu Arg Leu Thr Glu Glu Glu Leu His Ile Ile Ala Gln Val Pro 100 105 110 cct ccg ccg gcc gct gcc gcc gta ggc tac gct ggc tgc cgc gtg gcg 384 Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala Val Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala 115 120 125 gtg acc ttc ttc ctc tac ttc ctg gct acc aac tac tac tgg atc ctg 432 Val Thr Phe Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu 130 135 140 gtg gag ggg ctg tac ttg cac agc ctc atc ttc atg gcc ttt ttc tca 480 Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser 145 150 155 160 gag aag aag tac ctg tgg ggc ttc acc atc ttt ggc tgg ggt cta ccg 528 Glu Lys Lys Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Ile Phe Gly Trp Gly Leu Pro 165 170 175 gct gtc ttc gtg gct gtg tgg gtc ggt gtc aga gca acc ttg gcc aac 576 Ala Val Phe Val Ala Val Trp Val Gly Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn 180 185 190 act ggg tgc tgg gat ctg agc tcc ggg cac aag aag tgg atc atc cag 624 Thr Gly Cys Trp Asp Leu Ser Ser Gly His Lys Lys Trp Ile Ile Gln 195 200 205 gtg ccc atc ctg gca tct gtt gtg ctc aac ttc atc ctt ttt atc aac 672 Val Pro Ile Leu Ala Ser Val Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn 210 215 220 atc atc cgg gtg ctt gcc act aag ctt cgg gag acc aat gcg ggc cgg 720 Ile Ile Arg Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg 225 230 235 240 tgt gac acc agg cag cag tac cgg aag ctg ctc agg tcc acg ttg gtg 768 Cys Asp Thr Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Arg Ser Thr Leu Val 245 250 255 ctc gtg ccg ctc ttt ggt gtg cac tac acc gtc ttc atg gcc ttg ccg 816 Leu Val Pro Leu Phe Gly Val His Tyr Thr Val Phe Met Ala Leu Pro 260 265 270 tac acc gag gtc tca ggg aca ttg tgg cag atc cag atg cat tat gag 864 Tyr Thr Glu Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Ile Gln Met His Tyr Glu 275 280 285 atg ctc ttc aac tcc ttc cag gga ttt ttt gtt gcc atc ata tac tgt 912 Met Leu Phe Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys 290 295 300 ttc tgc aat ggt gag gtg cag gca gag att agg aag tca tgg agc cgc 960 Phe Cys Asn Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Arg Lys Ser Trp Ser Arg 305 310 315 320 tgg aca ctg gcg tag 975 Trp Thr Leu Ala <210> 41 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 41 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly 20 25 30 Met Ile Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Met Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val 35 40 45 Ala Val Leu Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn 50 55 60 Tyr Ile His Met His Met Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Ala Ser 65 70 75 80 Ile Phe Val Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Asp Glu 85 90 95 Ala Glu Arg Leu Thr Glu Glu Glu Leu His Ile Ile Ala Gln Val Pro 100 105 110 Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala Val Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala 115 120 125 Val Thr Phe Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu 130 135 140 Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser 145 150 155 160 Glu Lys Lys Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Ile Phe Gly Trp Gly Leu Pro 165 170 175 Ala Val Phe Val Ala Val Trp Val Gly Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn 180 185 190 Thr Gly Cys Trp Asp Leu Ser Ser Gly His Lys Lys Trp Ile Ile Gln 195 200 205 Val Pro Ile Leu Ala Ser Val Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn 210 215 220 Ile Ile Arg Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg 225 230 235 240 Cys Asp Thr Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Arg Ser Thr Leu Val 245 250 255 Leu Val Pro Leu Phe Gly Val His Tyr Thr Val Phe Met Ala Leu Pro 260 265 270 Tyr Thr Glu Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Ile Gln Met His Tyr Glu 275 280 285 Met Leu Phe Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys 290 295 300 Phe Cys Asn Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Arg Lys Ser Trp Ser Arg 305 310 315 320 Trp Thr Leu Ala <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(1) <223> May be any amino acid <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> May be any amino acid <220> <221> UNSURE <222> (5)..(8) <223> May be any amino acid <220> <221> misc#feature <223> Synthetic Polypeptide <400> 42 Xaa Val Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa His 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(5) <223> May be any amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (7)..(8) <223> May be any amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> May be any amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (12) <223> May be any amino acid. <220> <221> UNSURE <222> (15)..(16) <223> May be any amino acid. <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic Polypeptide <400> 43 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Trp Xaa Leu Xaa Lys Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Val <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 1 5 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln 1 5 10 15 Asp Val <210> 46 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 46 atgggggccg cccggatcgc acccagcctg gcgctcctac tctgctgccc agtgctcagc 60 tccgcatatg cgctggtgga tgcggacgat gtctttacca aagaggaaca gattttcctg 120 <210> 47 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 47 aaccggacgt gggccaacta cagcgagtgc ctcaagttca tgaccaatga gacccgggaa 60 cgggaggtat ttgaccgcct aggcatgatc tacaccgtgg gatactccat gtctctcgcc 120 <210> 48 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 48 gcuguuuccg aaauccagcu gaugcacggc ggaggaggc 39 <210> 49 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 49 ctctgctgcc cagtgctcag ctccgcctat gcggtttccg aaatccagct gatgcacggc 60 ggaggaggcg aggtatttga ccgcctaggc atgatctac 99 <210> 50 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 50 ctctgctgcc cagtgctcag ctccgcctat gcggtttccg aaatccagct gatgcacggc 60 ggaggaggcg aggtatttga ccgcctaggc atgatctac 99 <210> 51 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 51 ctctgctgcc cagtgctcag ctccgcatat ccctacgacg tccccgacta cgccggcgga 60 ggaggcgagg tatttgaccg cctaggcatg atctac 96 <210> 52 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 52 ctctgctgcc cagtgctcag ctccgcatat ccctacgacg tccccgacta cgccggcgga 60 ggaggcgagg tatttgaccg cctaggcatg atctac 96 <210> 53 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 53 Met Gly Ala Ala Arg Ile Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu Val Asp Ala Asp Asp Val Phe 20 25 30 Thr Lys Glu Glu Gln Ile Phe Leu 35 40 <210> 54 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 54 Asn Arg Thr Trp Ala Asn Tyr Ser Glu Cys Leu Lys Phe Met Thr Asn 1 5 10 15 Glu Thr Arg Glu Arg Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr 20 25 30 Val Gly Tyr Ser Met Ser Leu Ala 35 40 <210> 55 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 55 Leu Cys Cys Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Val Ser Glu Ile Gln 1 5 10 15 Leu Met His Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile 20 25 30 Tyr <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 56 Leu Cys Cys Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr 20 25 30 <210> 57 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1353) <400> 57 atg ggg acc gcc cgg atc gca ccc ggc ctg gcg ctc ctg ctc tgc tgc 48 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 ccc gtg ctc agc tcc gcg tac gcg gtt tcc gaa atc cag ctg atg cat 96 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 20 25 30 aat cgt ggc gga gga ggc gag gtg ttt gac cgc ctg ggc atg att tac 144 Asn Arg Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr 35 40 45 acc gtg ggc tac tcc gtg tcc ctg gcg tcc ctc acc gta gct gtg ctc 192 Thr Val Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu 50 55 60 atc ctg gcc tac ttt agg cgg ctg cac tgc acg cgc aac tac atc cac 240 Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His 65 70 75 80 atg cac ctg ttc ctg tcc ttc atg ctg cgc gcc gtg agc atc ttc gtc 288 Met His Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val 85 90 95 aag gac gct gtg ctc tac tct ggc gcc acg ctt gat gag gct gag cgc 336 Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg 100 105 110 ctc acc gag gag gag ctg cgc gcc atc gcc cag gcg ccc ccg ccg cct 384 Leu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro 115 120 125 gcc acc gcc gct gcc ggc tac gcg ggc tgc agg gtg gct gtg acc ttc 432 Ala Thr Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe 130 135 140 ttc ctt tac ttc ctg gcc acc aac tac tac tgg att ctg gtg gag ggg 480 Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly 145 150 155 160 ctg tac ctg cac agc ctc atc ttc atg gcc ttc ttc tca gag aag aag 528 Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys 165 170 175 tac ctg tgg ggc ttc aca gtc ttc ggc tgg ggt ctg ccc gct gtc ttc 576 Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe 180 185 190 gtg gct gtg tgg gtc agt gtc aga gct acc ctg gcc aac acc ggg tgc 624 Val Ala Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys 195 200 205 tgg gac ttg agc tcc ggg aac aaa aag tgg atc atc cag gtg ccc atc 672 Trp Asp Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile 210 215 220 ctg gcc tcc att gtg ctc aac ttc atc ctc ttc atc aat atc gtc cgg 720 Leu Ala Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg 225 230 235 240 gtg ctc gcc acc aag ctg cgg gag acc aac gcc ggc cgg tgt gac aca 768 Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr 245 250 255 cgg cag cag tac cgg aag ctg ctc aaa tcc acg ctg gtg ctc atg ccc 816 Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro 260 265 270 ctc ttt ggc gtc cac tac att gtc ttc atg gcc aca cca tac acc gag 864 Leu Phe Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu 275 280 285 gtc tca ggg acg ctc tgg caa gtc cag atg cac tat gag atg ctc ttc 912 Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe 290 295 300 aac tcc ttc cag gga ttt ttt gtc gca atc ata tac tgt ttc tgc aat 960 Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn 305 310 315 320 ggc gag gta caa gct gag atc aag aaa tct tgg agc cgc tgg aca ctg 1008 Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu 325 330 335 gca ctg gac ttc aag cga aag gca cgc agc ggg agc agc agc tat agc 1056 Ala Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser 340 345 350 tac ggc ccc atg gtg tcc cac aca agt gtg acc aat gtc ggc ccc cgt 1104 Tyr Gly Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg 355 360 365 gtg gga ctc ggc ctg ccc ctc agc ccc cgc cta ctg ccc act gcc acc 1152 Val Gly Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr 370 375 380 acc aac ggc cac cct cag ctg cct ggc cat gcc aag cca ggg acc cca 1200 Thr Asn Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro 385 390 395 400 gcc ctg gag acc ctc gag acc aca cca cct gcc atg gct gct ccc aag 1248 Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys 405 410 415 gac gat ggg ttc ctc aac ggc tcc tgc tca ggc ctg gac gag gag gcc 1296 Asp Asp Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala 420 425 430 tct ggg cct gag cgg cca cct gcc ctg cta cag gaa gag tgg gag aca 1344 Ser Gly Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr 435 440 445 gtc atg tga ccaggcgctg ggggctggac ctgctga 1380 Val Met 450 <210> 58 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 58 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 20 25 30 Asn Arg Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr 35 40 45 Thr Val Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu 50 55 60 Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His 65 70 75 80 Met His Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val 85 90 95 Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg 100 105 110 Leu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro 115 120 125 Ala Thr Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe 130 135 140 Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly 145 150 155 160 Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys 165 170 175 Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe 180 185 190 Val Ala Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys 195 200 205 Trp Asp Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile 210 215 220 Leu Ala Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg 225 230 235 240 Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr 245 250 255 Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro 260 265 270 Leu Phe Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu 275 280 285 Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe 290 295 300 Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn 305 310 315 320 Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu 325 330 335 Ala Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser 340 345 350 Tyr Gly Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg 355 360 365 Val Gly Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr 370 375 380 Thr Asn Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro 385 390 395 400 Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys 405 410 415 Asp Asp Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala 420 425 430 Ser Gly Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr 435 440 445 Val Met 450 <210> 59 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <220> <221> CDS <222> (28)..(1335) <400> 59 tggatcccgc ggccctaggc ggtggcg atg ggg acc gcc cgg atc gca ccc ggc 54 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly 1 5 ctg gcg ctc ctg ctc tgc tgc ccc gtg ctc agc tcc gca tat gag gtg 102 Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Glu Val 10 15 20 25 ttt gac cgc ctg ggc atg att tac acc gtg ggc tac tcc gtg tcc ctg 150 Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Val Ser Leu 30 35 40 gcg tcc ctc acc gta gct gtg ctc atc ctg gcc tac ttt agg cgg ctg 198 Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu 45 50 55 cac tgc acg cgc aac tac atc cac atg cac ctg ttc ctg tcc ttc atg 246 His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met His Leu Phe Leu Ser Phe Met 60 65 70 ctg cgc gcc gtg agc atc ttc gtc aag gac gct gtg ctc tac tct ggc 294 Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly 75 80 85 gcc acg ctt gat gag gct gag cgc ctc acc gag gag gag ctg cgc gcc 342 Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Ala 90 95 100 105 atc gcc cag gcg ccc ccg ccg cct gcc acc gcc gct gcc ggc tac gcg 390 Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Ala Ala Gly Tyr Ala 110 115 120 ggc tgc agg gtg gct gtg acc ttc ttc ctt tac ttc ctg gcc acc aac 438 Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn 125 130 135 tac tac tgg att ctg gtg gag ggg ctg tac ctg cac agc ctc atc ttc 486 Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe 140 145 150 atg gcc ttc ttc tca gag aag aag tac ctg tgg ggc ttc aca gtc ttc 534 Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Val Phe 155 160 165 ggc tgg ggt ctg ccc gct gtc ttc gtg gct gtg tgg gtc agt gtc aga 582 Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe Val Ala Val Trp Val Ser Val Arg 170 175 180 185 gct acc ctg gcc aac acc ggg tgc tgg gac ttg agc tcc ggg aac aaa 630 Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys Trp Asp Leu Ser Ser Gly Asn Lys 190 195 200 aag tgg atc atc cag gtg ccc atc ctg gcc tcc att gtg ctc aac ttc 678 Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile Leu Ala Ser Ile Val Leu Asn Phe 205 210 215 atc ctc ttc atc aat atc gtc cgg gtg ctc gcc acc aag ctg cgg gag 726 Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu 220 225 230 acc aac gcc ggc cgg tgt gac aca cgg cag cag tac cgg aag ctg ctc 774 Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu 235 240 245 aaa tcc acg ctg gtg ctc atg ccc ctc ttt ggc gtc cac tac att gtc 822 Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro Leu Phe Gly Val His Tyr Ile Val 250 255 260 265 ttc atg gcc aca cca tac acc gag gtc tca ggg acg ctc tgg caa gtc 870 Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Val 270 275 280 cag atg cac tat gag atg ctc ttc aac tcc ttc cag gga ttt ttt gtc 918 Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val 285 290 295 gca atc ata tac tgt ttc tgc aat ggc gag gta caa gct gag atc aag 966 Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys 300 305 310 aaa tct tgg agc cgc tgg aca ctg gca ctg gac ttc aag cga aag gca 1014 Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala 315 320 325 cgc agc ggg agc agc agc tat agc tac ggc ccc atg gtg tcc cac aca 1062 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Pro Met Val Ser His Thr 330 335 340 345 agt gtg acc aat gtc ggc ccc cgt gtg gga ctc ggc ctg ccc ctc agc 1110 Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro Leu Ser 350 355 360 ccc cgc cta ctg ccc act gcc acc acc aac ggc cac cct cag ctg cct 1158 Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr Thr Asn Gly His Pro Gln Leu Pro 365 370 375 ggc cat gcc aag cca ggg acc cca gcc ctg gag acc ctc gag acc aca 1206 Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Thr 380 385 390 cca cct gcc atg gct gct ccc aag gac gat ggg ttc ctc aac ggc tcc 1254 Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys Asp Asp Gly Phe Leu Asn Gly Ser 395 400 405 tgc tca ggc ctg gac gag gag gcc tct ggg cct gag cgg cca cct gcc 1302 Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser Gly Pro Glu Arg Pro Pro Ala 410 415 420 425 ctg cta cag gaa gag tgg gag aca gtc atg tga ccaggcgctg ggggctggac 1355 Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr Val Met 430 435 ctgctgacat agtggatgga cagat 1380 <210> 60 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 60 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile 20 25 30 Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val 35 40 45 Leu Ile Leu Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile 50 55 60 His Met His Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe 65 70 75 80 Val Lys Asp Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu 85 90 95 Arg Leu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro 100 105 110 Pro Ala Thr Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr 115 120 125 Phe Phe Leu Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu 130 135 140 Gly Leu Tyr Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val 165 170 175 Phe Val Ala Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly 180 185 190 Cys Trp Asp Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro 195 200 205 Ile Leu Ala Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val 210 215 220 Arg Val Leu Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp 225 230 235 240 Thr Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met 245 250 255 Pro Leu Phe Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr 260 265 270 Glu Val Ser Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu 275 280 285 Phe Asn Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys 290 295 300 Asn Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr 305 310 315 320 Leu Ala Leu Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr 325 330 335 Ser Tyr Gly Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro 340 345 350 Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala 355 360 365 Thr Thr Asn Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr 370 375 380 Pro Ala Leu Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro 385 390 395 400 Lys Asp Asp Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu 405 410 415 Ala Ser Gly Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu 420 425 430 Thr Val Met 435 <210> 61 <211> 1363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 61 atg ggg acc gcc cgg atc gca ccc ggc ctg gcg ctc ctg ctc tgc tgc 48 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 ccc gtg ctc agc tcc gcg tac gcg gtt tcc gaa atc cag ctg atg cac 96 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 20 25 30 ggc gga gga ggc gag gtg ttt gac cgc ctg ggc atg att tac acc gtg 144 Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr Val 35 40 45 ggc tac tcc gtg tcc ctg gcg tcc ctc acc gta gct gtg ctc atc ctg 192 Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile Leu 50 55 60 gcc tac ttt agg cgg ctg cac tgc acg cgc aac tac atc cac atg cac 240 Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met His 65 70 75 80 ctg ttc ctg tcc ttc atg ctg cgc gcc gtg agc atc ttc gtc aag gac 288 Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val Lys Asp 85 90 95 gct gtg ctc tac tct ggc gcc acg ctt gat gag gct gag cgc ctc acc 336 Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu Thr 100 105 110 gag gag gag ctg cgc gcc atc gcc cag gcg ccc ccg ccg cct gcc acc 384 Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro Ala Thr 115 120 125 gcc gct gcc ggc tac gcg ggc tgc agg gtg gct gtg acc ttc ttc ctt 432 Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe Phe Leu 130 135 140 tac ttc ctg gcc acc aac tac tac tgg att ctg gtg gag ggg ctg tac 480 Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly Leu Tyr 145 150 155 160 ctg cac agc ctc atc ttc atg gcc ttc ttc tca gag aag aag tac ctg 528 Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys Tyr Leu 165 170 175 tgg ggc ttc aca gtc ttc ggc tgg ggt ctg ccc gct gtc ttc gtg gct 576 Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe Val Ala 180 185 190 gtg tgg gtc agt gtc aga gct acc ctg gcc aac acc ggg tgc tgg gac 624 Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys Trp Asp 195 200 205 ttg agc tcc ggg aac aaa aag tgg atc atc cag gtg ccc atc ctg gcc 672 Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile Leu Ala 210 215 220 tcc att gtg ctc aac ttc atc ctc ttc atc aat atc gtc cgg gtg ctc 720 Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg Val Leu 225 230 235 240 gcc acc aag ctg cgg gag acc aac gcc ggc cgg tgt gac aca cgg cag 768 Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg Gln 245 250 255 cag tac cgg aag ctg ctc aaa tcc acg ctg gtg ctc atg ccc ctc ttt 816 Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro Leu Phe 260 265 270 ggc gtc cac tac att gtc ttc atg gcc aca cca tac acc gag gtc tca 864 Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu Val Ser 275 280 285 ggg acg ctc tgg caa gtc cag atg cac tat gag atg ctc ttc aac tcc 912 Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn Ser 290 295 300 ttc cag gga ttt ttt gtc gca atc ata tac tgt ttc tgc aat ggc gag 960 Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly Glu 305 310 315 320 gta caa gct gag atc aag aaa tct tgg agc cgc tgg aca ctg gca ctg 1008 Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala Leu 325 330 335 gac ttc aag cga aag gca cgc agc ggg agc agc agc tat agc tac ggc 1056 Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly 340 345 350 ccc atg gtg tcc cac aca agt gtg acc aat gtc ggc ccc cgt gtg gga 1104 Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Val Gly 355 360 365 ctc ggc ctg ccc ctc agc ccc cgc cta ctg ccc act gcc acc acc aac 1152 Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr Thr Asn 370 375 380 ggc cac cct cag ctg cct ggc cat gcc aag cca ggg acc cca gcc ctg 1200 Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro Ala Leu 385 390 395 400 gag acc ctc gag acc aca cca cct gcc atg gct gct ccc aag gac gat 1248 Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys Asp Asp 405 410 415 ggg ttc ctc aac ggc tcc tgc tca ggc ctg gac gag gag gcc tct ggg 1296 Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser Gly 420 425 430 cct gag cgg cca cct gcc ctg cta cag gaa gag tgg gag aca gtc atg 1344 Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr Val Met 435 440 445 tga ccaggcgctg ggggct 1363 <210> 62 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH receptor sequence <400> 62 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Glu Val Phe Asp Arg Leu Gly Met Ile Tyr Thr Val 35 40 45 Gly Tyr Ser Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Ala Val Leu Ile Leu 50 55 60 Ala Tyr Phe Arg Arg Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His Met His 65 70 75 80 Leu Phe Leu Ser Phe Met Leu Arg Ala Val Ser Ile Phe Val Lys Asp 85 90 95 Ala Val Leu Tyr Ser Gly Ala Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Leu Thr 100 105 110 Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Pro Pro Pro Pro Ala Thr 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Tyr Ala Gly Cys Arg Val Ala Val Thr Phe Phe Leu 130 135 140 Tyr Phe Leu Ala Thr Asn Tyr Tyr Trp Ile Leu Val Glu Gly Leu Tyr 145 150 155 160 Leu His Ser Leu Ile Phe Met Ala Phe Phe Ser Glu Lys Lys Tyr Leu 165 170 175 Trp Gly Phe Thr Val Phe Gly Trp Gly Leu Pro Ala Val Phe Val Ala 180 185 190 Val Trp Val Ser Val Arg Ala Thr Leu Ala Asn Thr Gly Cys Trp Asp 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Asn Lys Lys Trp Ile Ile Gln Val Pro Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Val Leu Asn Phe Ile Leu Phe Ile Asn Ile Val Arg Val Leu 225 230 235 240 Ala Thr Lys Leu Arg Glu Thr Asn Ala Gly Arg Cys Asp Thr Arg Gln 245 250 255 Gln Tyr Arg Lys Leu Leu Lys Ser Thr Leu Val Leu Met Pro Leu Phe 260 265 270 Gly Val His Tyr Ile Val Phe Met Ala Thr Pro Tyr Thr Glu Val Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Trp Gln Val Gln Met His Tyr Glu Met Leu Phe Asn Ser 290 295 300 Phe Gln Gly Phe Phe Val Ala Ile Ile Tyr Cys Phe Cys Asn Gly Glu 305 310 315 320 Val Gln Ala Glu Ile Lys Lys Ser Trp Ser Arg Trp Thr Leu Ala Leu 325 330 335 Asp Phe Lys Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly 340 345 350 Pro Met Val Ser His Thr Ser Val Thr Asn Val Gly Pro Arg Val Gly 355 360 365 Leu Gly Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Pro Thr Ala Thr Thr Asn 370 375 380 Gly His Pro Gln Leu Pro Gly His Ala Lys Pro Gly Thr Pro Ala Leu 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Thr Thr Pro Pro Ala Met Ala Ala Pro Lys Asp Asp 405 410 415 Gly Phe Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Leu Asp Glu Glu Ala Ser Gly 420 425 430 Pro Glu Arg Pro Pro Ala Leu Leu Gln Glu Glu Trp Glu Thr Val Met 435 440 445 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val 1 5 10 15 <210> 64 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 64 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 65 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 65 Ala Val Ser Glu His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 66 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 66 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile 20 25 30 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: modified PTH sequence <400> 67 Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu 1 5 10

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＧ５（ＰＴＨ（１〜９）−（Ｇｌｙ）₅−ＰＴＨ（１５〜３１））アミノ酸
（配列番号９）および核酸（配列番号１４）配列；ＰＧ７（ＰＴＨ（１〜９）−
（Ｇｌｙ）₇−ＰＴＨ（１７〜３１））アミノ酸（配列番号１１）および核酸（
配列番号１５）配列；ならびにＰＧ９（ＰＴＨ（１〜５）−（Ｇｌｙ）₉−ＰＴ
Ｈ（１５〜３１））アミノ酸（配列番号１３）および核酸（配列番号１６）配列
を示す。

【図２】 Ｂファミリーリガンドアミノ末端配列に結合したＧタンパク質レセプターを示
す。

【図３】 示されたＰＴＨペプチドへの曝露に応答する、ＣＯＳ細胞中の環状ＡＭＰ（ｃ
ＡＭＰ）の総蓄積の測定。Ａ）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ細胞
および翻訳が停止したヌルＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞中の総ｃＡＭＰ
蓄積の比較。Ｂ）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ細胞におけるｃＡ
ＭＰの蓄積に対するＰＧ５およびＰＧ９の効果を実証する第２の実験を示す。

【図４】 ヒトＰＴＨ−１レセプター（ＣＯＳ７／ｈＰＴＨ−１細胞）でトランスフェク
トされたＣＯＳ細胞における、短いアミノ末端ＰＴＨアナログのｃＡＭＰ用量応
答曲線。２４プレート中のＣＯＳ細胞を、示したペプチドで２１℃にて６０分間
処理し、次いで細胞内ｃＡＭＰレベルを測定した。示した全てのＰＴＨペプチド
は、ラットＰＴＨ配列に基づいており、そしてカルボキシ末端がアミド化されて
いる。４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、別々の実験を示す。

【図５】 ＰＴＨ（１〜１４）のアラニンスキャン。１４個の異なるＰＴＨ（１〜１４）
誘導体の生物活性を示し、各々は、アラニンによって置換された、ネイティブな
配列の異なるアミノ酸（図の下に示す）を有する。ペプチドを化学的に合成し、
精製し、そしてクローニングされたヒトＰＴＨ−１レセプターを発現するＣＯＳ
−７細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激する能力について試験した。ペプチドを、
２連で６７μＭの用量で試験した（±ｓ．ｅ．ｍ．）。コントロールとして、基
本（ｂａｓａｌ）によって示される未処理細胞を測定した。１位にアラニンを含
むＰＴＨ（１〜１４）を、野生型参照物として用いた。細胞を、２１℃にて３０
分間刺激した。この図は、本発明に用いられるＰＴＨ（１〜９）ペプチド中のア
ミノ酸残基の生物学的活性に関連する情報を提供する。

【図６】 ＰＴＨ（１７〜３１）のアラニンスキャン。１５個の異なるＰＴＨ（１７〜３
１）誘導体のＩＣ₅₀値で表わされる、競合的結合分析の結果を示し、各々は、ア
ラニンによって置換された、ネイティブな配列の異なるアミノ酸（図の下に示す
）を有する。ペプチドを化学的に合成し、精製し、そしてクローニングされたヒ
トＰＴＨ−２レセプターを発現するＣＯＳ−７細胞に結合するＰＴＨ（１〜３４
）を阻害する能力について試験した。ＩＣ₅₀は¹²⁵ＩＰＴＨ（１〜３４）結合の
５０％を阻害するのに必要なペプチドの用量である。この図は、本発明で用いら
れるＰＴＨ（１７〜３１）ペプチド中のアミノ酸残基の生物学的活性に関する情
報を提供する。

【図７】 Ｔｅｔｈｅｒ−１レセプターの核酸配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列
（配列番号３７）を示す。

【図８】 Ａ）ｒＨＡ−Ｗｔレセプター、ｒδＮｔレセプター（またＤｅｌ−Ｎｔ、ｄｅ
ｌＮＴまたはｒΔＮｔとして本出願においていわれる）およびＴｅｔｈｅｒ−１
レセプターの模式図。Ｂ）８Ａに示される、組換えレセプター分子を試験するｃ
Ａｍｐ蓄積アッセイの結果。

【図９】 Ｔｅｔｈｅｒ−１Ｃレセプターの核酸配列（配列番号３８）およびアミノ酸配
列（配列番号３９）を示す。

【図１０】 ｒδＮｔ／Ｃｔレセプターの核酸配列（配列番号４０）およびアミノ酸配列（
配列番号４１）を示す。

【図１１Ａ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。図１１Ａは、野生型ＰＴＨに由来するＰＴＨレセプターの２つ
の隣接領域を示す。配列番号４６は左側隣接領域であり、そして配列番号４７は
右側隣接領域である。全体の介在性配列は示されない。

【図１１Ｂ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。図１１Ｂは、このオリゴヌクレオチドにおいて用いられるＰＴ
Ｈ（１〜９）（配列番号４８）をコードするコンピューター生成ヌクレオチド配
列を示す。

【図１１Ｃ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。ｒＴｅｔｈｅｒ−１を構築するために用いられるオリゴヌクレ
オチドＥ１６６３１Ａ１（配列番号４９）の配列。

【図１１Ｄ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。隣接配列およびＰＴＨ挿入物（配列番号５０）。スラッシュマ
ーク（／）はＰＴＨ挿入物の左および右に対する隣接領域を示す。オリゴヌクレ
オチドＥ１６６３１Ａおよびそのタンパク質翻訳物の配列。（注記、ここでのＤ
ＮＡ配列は図１１Ｃ（配列番号４９）におけるものと同じである。）

【図１１Ｅ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。Ｔｅｔｈｅｒ−１候補物のスクリーニングにおいて用いられる
ＮｄｅＩ制限部位

【図１１Ｆ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。Ｔｅｔｈｅｒ−１のＰＴＨ（１〜９）配列の代わりにＨＡ−Ｅ
ＰＩＴＯＰＥ ＴＡＧを含むコントロールプラスミドの構築に用いられるＥ１６
８５３Ａ１の配列。

【図１１Ｇ】 キメララットＰＴＨ−１レセプターであるｒＴｅｔｈｅｒ−１の構築に使用さ
れるリガンド／レセプターキメラ分子の構築についてのオリゴヌクレオチドおよ
びストラテジー。オリゴＥ１６８５３Ａ１のＤＮＡ配列およびタンパク質翻訳物
（注記、ＤＮＡ配列は１１Ｆ（配列番号５１）におけるものと同じである。）

【図１２】 一過性でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞におけるｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈ
ｅｒ（１〜９）およびいくつかのそのアナログのシグナル伝達特性の特徴。

【図１３】 短縮型レセプターｈＰ１Ｒ−ｄｅｌＮＴ、ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜９）
およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）の用量応答分析。

【図１４】 基礎およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）に対するアゴニスト
誘導ｃＡＭＰシグナル伝達の時間依存性およびＤＮＡ依存性。

【図１５】 基本およびｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のアゴニスト誘導シ
グナル伝達は、ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションに用いられるプラ
スミドＤＮＡの量に非常に依存している。

【図１６】 ｈＰ１Ｒ−[Ｒ¹¹]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のＰＴＨペプチドおよびＰＴＨ
部分の構造活性プロフィール。

【図１７】 ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ−１（ｈＰ１Ｒ−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜９）のヌクレオ
チド配列（配列番号６１）および対応するアミノ酸配列（配列番号６２）。ＰＴ
ＨのＡｌａ２４〜Ａｒｇ１８１をＡｌａ１〜Ｈｉｓ９で置換することによってヒ
トＰＴＨ−１レセプターから作製した。ＨＫ−Ｔｅｔｈｅｒ−１：配列番号：Ｅ
２０９８６Ａ１（９９ｎｔｓ）およびその翻訳物。ｈＰＴＨ−１ｒｅｃ（ＨＫ）
におけるＴｅｔｈｅｒ−１を構築するためのオリゴ。ｒｅｃのＡｌａ−２３をＰ
ＴＨ（１〜９）−−Ｇｌｙｘ４、−−Ｇｌｕ−１８２のＶａｌ−２に結合させる
。

【化１４】

【図１８】 ｈＰ１Ｒ−ｄｅｌ１ＮＴのヌクレオチド配列（配列番号５９）および対応する
アミノ酸配列（配列番号６０）。

【図１９】 ｈＰ１Ｒ−[Ｒ１１]−Ｔｅｔｈｅｒ（１〜１１）のヌクレオチド配列（配列番
号５７）および対応するアミノ酸配列（配列番号５８）。Ｈｉｓ９とリンカーの
第１のＧｌｙとの間にＡｓｎ１０−Ａｒｇ１１を挿入することによって、ｈＴｅ
ｔｈｅｒ−１から作製した。図１９配列番号：Ｅ２７３０９Ａ１。ｈＴｈｒ−Ａ
ｒｇ１１：ＨＫ−Ｔｅｔｈｅｒ−１中にＡｓｎ−１０およびＡｒｇ１１を挿入す
る。Ｍｅｔ８／Ｈｉｓ９にＮＳｉＩ部位を付加する（ＡＴＧＣＡｔ）。

【化１５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｐ 43/00 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/635 43/00 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/635 19/00 14/72 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クローネンバーグ， ヘンリー エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02478， ベルモント， ヘースティング ス ロード 48 (72)発明者 ポッツ， ジョーン ティ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02165， ウエスト ニュートン， チェ スナット ストリート 129 (72)発明者 ユップナー， ハラルト アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02116， ボストン， ホリーオーク ス トリート 38 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB20 BB46 BB48 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA01 BA63 CA02 CA05 CA07 DA01 DA02 DA05 DA12 EA04 FA18 GA11 GA18 HA01 HA11 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA02 BA23 BA41 CA53 CA56 ZA96 ZA97 ZC06 ZC41 4H045 AA10 AA30 BA10 BA18 BA19 BA41 CA40 DA30 DA50 EA20 EA30 EA50 FA74

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｂの構造の化合物であって、ここで： ａ）Ｓは、ＰＴＨのアミノ末端シグナル伝達機能的ドメインであり； ｂ）Ｌは、ｎ回存在するリンカー分子であり；そして ｃ）Ｂは、ＰＴＨ（１〜３４）またはＰＴＨｒＰ（１〜３４）のＣ末端結合部
   分である、 化合物。
2. 【請求項２】 前記化合物が単離されたポリペプチドである、請求項１に記
   載の化合物。
3. 【請求項３】 ｎが１〜９である、請求項２に記載の単離されたポリペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 Ｓが以下： 【化１】 からなる群から選択される、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 Ｌが、Ｇｌｙ₅、Ｇｌｙ₇およびＧｌｙ₉からなる群から選択
   される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 Ｂが以下： 【化２】 からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 以下： 【化３】 ならびにこれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の単
   離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが、以下： 【化４】 およびこれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項２に記載の単離
   されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 一アミノ酸置換が存在する、請求項８に記載の単離されたポ
   リペプチド。
10. 【請求項１０】 （ａ）Ｓが、Ｘ Ｖａｌ Ｘ Ｇｌｕ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ
    Ｈｉｓ（配列番号４２）であって、ここでＸは、アミノ酸であり； （ｂ）Ｌが、５〜１０のグリシン残基であり；そして （ｃ）Ｂが、Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ａｒｇ Ｘ Ｘ Ｔｒｐ Ｘ Ｌｅｕ Ｘ
    Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｘ Ｘ Ｖａｌ（配列番号４３）であって、ここでＸは、ア
    ミノ酸である、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 （ｄ）Ｓが、Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
    Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ（配列番号４４）であり； （ｅ）Ｌが、５〜１０のグリシン残基であり；そして （ｆ）Ｂが、以下： 【化５】 である、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 以下： 【化６】 からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 前記ポリペプチドが生物学的に活性なポリペプチドである
    、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
14. 【請求項１４】 配列番号１４、配列番号１５および核酸（配列番号１６）
    の配列からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項２に記載
    の単離されたポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項２〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコ
    ードする、単離された核酸配列。
16. 【請求項１６】 式Ｒ₁−Ｓ−（Ｌ）_n−ＲまたはＳ−（Ｌ）_n−Ｒの構造の
    、単離されたポリペプチドであって、ここで： ａ）Ｒ₁は、ＰＴＨ−１レセプターシグナル配列であり； ｂ）Ｓは、アミノ末端のリガンドシグナル伝達ペプチドであり； ｃ）Ｌは、ｎ回存在するリンカー分子であって、ここでｎは正の整数１〜１０
    、最も好ましくは４であり；そして ｄ）Ｒは、ＰＴＨ−１レセプター配列または該レセプター配列の一部分である
    、 単離されたポリペプチド。
17. 【請求項１７】 Ｒ₁がＰＴＨ−１レセプター（１〜２５）ペプチドであり
    、ＳがＰＴＨ（１〜９）ペプチドであり、ＬがＧｌｙであり、ここでｎが４であ
    り；そしてＲがＰＴＨ−１レセプター（１８２〜末端）である、請求項１６に記
    載の単離されたポリペプチド。
18. 【請求項１８】 式Ｓ−（Ｌ）_n−Ｒを有し、ここで前記Ｒ₁部分が切断され
    ている、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１６に記載のポリペプチドをコードする、単離され
    た核酸配列。
20. 【請求項２０】 式Ｓ−Ｒの、単離されたポリペプチドであって、ここで： １．Ｓがアミノ末端シグナル伝達ポリペプチドであり；そして ２．Ｒがカルボキシ末端のレセプターポリペプチドである、 単離されたポリペプチド。
21. 【請求項２１】 Ｓがアミノ末端のシグナル伝達ポリペプチドＸ Ｖａｌ
    Ｘ Ｇｌｕ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｈｉｓであり、ここでＸがアミノ酸である、請求
    項２０に記載の単離されたポリペプチド。
22. 【請求項２２】 配列番号３７、配列番号３９および配列番号４１からなる
    配列の群から選択される配列を含む、単離されたポリペプチド。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のポリペプチド配列をコードする、単離
    された核酸配列。
24. 【請求項２４】 配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０からなる
    群から選択される、単離された核酸配列。
25. 【請求項２５】 単離された核酸配列であって、該配列が、請求項２４に記
    載の配列に対して、少なくとも９５％同一か、またはストリンジェントな条件下
    で結合する、単離された核酸配列。
26. 【請求項２６】 請求項１５に記載の核酸配列を含む、組換えベクター。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載のＤＮＡを含む、組換え宿主細胞。
28. 【請求項２８】 請求項２３に記載の核酸配列を含む、組換えベクター。
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載のＤＮＡを含む、組換え宿主細胞。
30. 【請求項３０】 骨質量における減少により特徴づけられる哺乳動物の状態
    を処置する方法であって、ここで、該方法が、骨質量を増加する有効量の、請求
    項２、１６または２０のいずれか１項に記載のポリペプチドを、それらを必要と
    する被験体に投与する工程を包含する、方法。
31. 【請求項３１】 骨の再形成、骨吸収および／または骨再造形の速度を決定
    するための方法であって、有効量の、請求項２、２０または４０のいずれか１項
    に記載のポリペプチドを患者に投与する工程、および該患者の骨への該ペプチド
    の取り込みを決定する工程を包含する、方法。
32. 【請求項３２】 前記骨質量を増加する有効量の、前記ペプチドが、該ペプ
    チドをコードするＤＮＡを前記患者に提供すること、およびインビボで該ペプチ
    ドを発現することにより投与される、請求項３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 処置されるべき状態が骨粗しょう症である、請求項３２に
    記載の方法。
34. 【請求項３４】 骨質量を増加するための、前記ポリペプチドの有効量が約
    ０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１．０μｇ／ｋｇ／日である、請求項３２に記載
    の方法。
35. 【請求項３５】 減少したＴｅｔｈｅｒ１活性と関連する疾患および障害の
    処置方法であって、有効量の、請求項２、２０もしくは４０のうちのいずれか１
    項に記載のポリペプチド、またはそれらのアゴニストを、それらを必要とする患
    者に投与する工程を包含する、方法。
36. 【請求項３６】 ＰＴＨ−１レセプターを有する哺乳動物細胞におけるｃＡ
    ＭＰを増加させる方法であって、該細胞を十分な量の請求項２、２０または４０
    のいずれか１項に記載のポリペプチドに接触させて、ｃＡＭＰを増加させる工程
    を包含する、方法。
37. 【請求項３７】 Ｂが、長さが１０〜２０アミノ酸である、請求項２に記載
    の単離されたポリペプチド。
38. 【請求項３８】 ペプチドまたは非ペプチドＰＴＨアゴニストについてのス
    クリーニングのための方法であって、以下の工程： ａ）請求項１６に記載のポリペプチドを潜在的なアゴニストに結合させる工程
    ；および ｂ）該潜在的なアゴニストを該ポリペプチドから単離する工程、 を包含する、方法。
39. 【請求項３９】 前記ポリペプチドがＴｅｔｈｅｒ１またはｒδＮｔである
    、請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが請求
    項３８に記載の方法により得られる、ポリペプチド。