JP2003533167A - アミノ末端改変副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）アナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ） 【化２６】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を含む、そのフラグメント；（ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは（ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体；から本質的になるペプチドに少なくとも９０％同一であり、ここで：Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、生物学的に活性なペプチドを含み、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターアゴニスト特性を付与するアミノ酸置換を１つ以上有する、ＰＴＨ誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （連邦政府の援助による研究および開発の下でなされた発明に対する権利の陳
述） 本発明の開発中に行われた研究の一部は、米国政府基金を利用した。米国政府
は、本発明において特定の権利を有する。

【０００２】 本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
Ｇｒａｎｔ ＤＫ １ １７９４によって援助された。

【０００３】 （発明の分野） 本発明は、新規な副甲状腺ホルモンペプチド（ＰＴＨ）誘導体に関する。特に
、本発明は、誘導体に対してＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターアゴニストまた
はＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターアンタゴニストの性質を与える１つ以上の
アミノ酸置換を有するＰＴＨ誘導体に関する。

【０００４】 （関連技術の説明） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の複雑な生物学的役割の充分な理解およびその治
療学的な可能性を利用する試みは、そのホルモンの複数のシグナル伝達パターン
および作用の細胞経路の分析が必要である。ＰＴＨは、腎臓および骨の標的細胞
中の特異的なレセプターに結合しそして活性化し、このレセプターは、ＰＴＨ関
連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）もまた認識する（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．ら、「
Ｔｈｅ ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｆｏｒ ｔｗｏ ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｒ
．編、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９７）、３８９−４
２０頁）。腎臓細胞株および骨芽細胞株において、ＰＴＨは、以下に挙げられる
、幾つかの並行した細胞内シグナル伝達応答を誘発する：アデニリルシクラーゼ
（ＡＣ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およ
びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、ならびにサイクリックＡＭＰ（ｃ
ＡＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ₃）、ジアシルグリセロール、および増
加した細胞質ゾルの遊離カルシウム（Ｃａ_i ⁺⁺）のような第二メッセンジャーの
産生（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（７）：２７３２−２７３６（１９９２）；Ａｚａｒａ
ｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９
３６（１９９６）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｃｉｖｉｔｅｌｌｉ
，Ｒ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５（５第１部）：Ｅ６６０−６６７
（１９８８）；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３
：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｄｕｎｌａｙ，Ｒ．およびＨｒｕｓｋ
ａ，Ｋ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８（２第２部）：Ｆ２２３−２３１
（１９９０）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２８
（６）：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：２９−３６（１９９２）；Ｇｕｏ，Ｊ．
ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９
５）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３
−７１９（１９９３）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ
ｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９４３−９４９（１９９４）；Ｊｕｐｐｎｅｒ，Ｈ．
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３４）：１０２４−１０２６（１９９１）；
Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１−３８９（１９９６）；Ｓ
ｅｕｗｅｎ，Ｋ．ら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１４（８）：１６１３−１
６２０（１９９５）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３６（３）：１２６７−１２７５（１９９５）。

【０００５】 現在までに、２つの構造的に関連するが異なる種のＰＴＨレセプターが、クロ
ーニングされている（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（７）：２７３２−２７３６（１９９２
）；Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２６）：１５
４５５−１５４５８（１９９５）；Ｓｃｈｉｐａｎｉ，Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ−１３２（５）：２１５７−２１６５（１９９３））。これらの最
初の型であるＡ型は、骨細胞および腎臓細胞の両方から単離され、そして内在性
１型ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＰＴＨＲ）が欠損した細胞内で異種発現さ
せたとき、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３６）に対する多重シグ
ナル伝達応答を伝達することを示した（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（７）：２７３２−２
７３６（１９９２）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１（２５）：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ
．Ｒ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（
１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３
８８４−３８９１（１９９５）；Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ １８（４）：
３８１−３８９（１９９６）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉ
ｄｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２４６（２）：１４９−１５５（１
９９３））。

【０００６】 結合およびシグナル伝達の特性に対するＰＴＨ分子の特定領域の寄与を限定す
る以前の試みは主に、複雑なインビボバイオアッセイ、器官培養、単離された細
胞膜または１より多くの内在性ＰＴＨレセプターを発現し得る（一般にげっ歯類
起源の）細胞株の使用によって行なわれている（Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら、Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）；Ｓｉｅｇｆｒ
ｉｅｄ，Ｇ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７−１２
７５（１９９５）；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３８：２０６６−２０７２（１９９７）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２）；Ｓｅｇｒ
ｅ，Ｇ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６９８０−６９８６（１９
７９）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄ
ｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９７５）；Ｔａｋａｓ
ｕ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１２）：５５３７−５５４
３（１９９６）；Ｏｒｌｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６
２（５第１部）：Ｅ５９９−６０７（１９９２））。例えば、相対的に少数の改
変が、ＰＴＨの最アミノ末端に対して行なわれている：合成の［デスアミノ（ｄ
ｅｓａｍｉｎｏ）−Ａｌａ−１］ｂＰＴＨ−（１−３４）は、Ｔｒｅｇｅａｒら
（Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５７０、５６６頁（１９
７５））により、Ｇｏｌｔｚｍａｎｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：３
１９９−３２０３，（１９７５））により、そしてＰａｒｓｏｎｓら（Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ
ｓｏｍｅ ｏｆ ｉｔｓ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ．
：Ｔａｌａｍａｇｅ ＲＶ、Ｏｗｅｎ Ｍ，ＰａｒｓｏｎｓＪＡ（編）Ｃａｌｃ
ｉｕｍ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３３−３９頁（１９７５））により開示され；
合成の［デスアミノＳｅｒ¹］−ｈＰＴＨ（１−３４）は、Ｔｒｅｇｅａｒら（
Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５７０（１９７５））によ
り、そしてＲｉｘｏｎら（Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．９
：１１７９−１１８９（１９９４））により開示され；合成の１−デスアミノｈ
ＰＴＨ−（１−３１）は、Ｒｉｘｏｎら（Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａ
ｌ Ｒｅｓ．９：１１７９−１１８９（１９９４））により開示され、そして合
成の［Ａｌａ¹］−ｈＰＴＨ（１−３４）および合成の［Ｇｌｙ¹］−ｈＰＴＨ（
１−３４）は、Ｔｒｅｇｅａｒら（Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：
５６１−５７０ ５６３頁（１９７５））により開示された。

【０００７】 ウシＰＴＨ−（１−３４）の初期構造／機能研究は、単離された腎臓膜につい
て行なわれ、カルボキシル（Ｃ）末端ｂＰＴＨ−（２５−３４）領域のレセプタ
ー結合に対する重要な役割およびアミノ（Ｎ）末端（すなわち、Ｓｅｒ¹）のＡ
Ｃ活性化に対する重要な役割を同定した（Ｓｅｇｒｅ，Ｇ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６９８０−６９８６（１９７９）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ
．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．２：５６１−５６７（１９７５））。後の研究は、インタクトな尿細管を用
いてあるいは培養した腎臓細胞または骨細胞を用いてインビトロにおいて行なわ
れたが、ＰＴＨ−（３−３４）のようなＮ切断アナログ（ａｎａｌｏｇ）は、Ａ
Ｃを刺激することはできないとはいえ、ＰＫＣを完全に活性化し得、そして特定
のＰＫＣ依存な末端生物学的応答も調節し得ることを示した（Ｊａｎｕｌｉｓ，
Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）；
Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１
２６７−１２７５（１９９５）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２））。ＰＴＨ−（１−３
４）のアミノ切断アナログもまた、いくつかの細胞でＰＬＣ活性またはＣａ_i ⁺⁺
を上昇させる（Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３
：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｓｉｅ
ｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（３）：１２６７
−１２７５（１９９５））が、他の細胞においては上昇させない（Ｒｅｉｄ，Ｉ
．Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３（ｌ第１部）：Ｅ４５−５１（１
９８７）；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｒｅｓ
．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：１３５２−１３５８（１９８９））ことが見出された
。クローン化されたＩ型ＰＴＨＲのシグナル伝達特性の研究は、ほとんど独占的
にＡＣ、ＰＬＣ、またはＣａ_i ⁺⁺の活性化に焦点をあてている（Ａｂｏｕ−Ｓａ
ｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
９（７）：２７３２−２７３６（１９９２）；Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（１９９
３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４
−３８９１（１９９５）；Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１
−３８９（１９９６）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２４６（２）：１４９−１５５（１９９３
））が、しかしながら、ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（３−３４）および他
のｈＰＴＨフラグメントによるＰＫＣおよびＰＫＣ依存的イオン輸送の刺激は、
ラットＰＴＨＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において報告さ
れた（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１
４９３１−１４９３６（１９９６））。

【０００８】 ひとまとめにして、これらの観察は、ＡＣ／ＰＫＡシグナル伝達の活性化に対
する構造決定基が、ＰＬＣまたはＰＫＣの活性化に必要な構造決定期とは異なる
という着想およびこれらがそれぞれＰＴＨ−（１−３４）のＮ末端ドメイン内お
よびＣ末端ドメイン内に存在するという着想を生じた。（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ
，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９４３−９４９（１
９９４）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎ
ｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９７５）；Ｗｈｉｔ
ｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓ
ｃｉ．１６（１１）：３８２−３８６（１９９５））。特に、ｈＰＴＨ−（２９
−３２）領域は、重要なＰＫＣ活性化ドメインとして具体的に同定された（Ｊｏ
ｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（６）：９
４３−９４９（１９９４）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．およびＭｏｒｌｅｙ
，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１６（１１）：３８２−３８６（１
９９５））。

【０００９】 ラットＰＴＨＲのこれらの研究から理解されることと比較すると、ヒトＰＴＨ
Ｒに結合するためまたはその多様なシグナル伝達機序の活性化に必要なヒトＰＴ
Ｈの構造的特徴に関してはずっと少ない情報しか入手可能ではない。アラニン走
査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は
、ラットＰＴＨＲ（３０）へ結合するためのｈＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端部
分の重要性を強調した。ＣＯＳ−７細胞またはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェ
クトされたヒトＰＴＨＲの機能研究は、ＰＬＣの刺激が一貫して認められずそし
て報告された応答は穏やかであったにも関わらず、ｈＰＴＨ−（１−３４）がＡ
ＣおよびＣａ_i ⁺⁺を活性化することを確認した（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ
１８（４）：３８１−３８９（１９９６）；Ｓｅｕｗｅｎ，Ｋ．ら、Ｂｒｉｔ
．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１４（８）：１６１３−１６２０（１９９５）；Ｊｏｂｅ
ｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２
−５２９２（１９９７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
３５１（２）：２８１−２８５（１９９４））。Ｃａ_i ⁺⁺に対するｈＰＴＨ−（
３−３４）の影響は、同様に議論の余地があり（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら、Ｂｏｎｅ
１８（４）：３８１−３８９（１９９６）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（１９９７）
）、一方、ヒトＰＴＨＲを経由するシグナル伝達におけるｈＰＴＨ−（１−３４
）分子のほかの領域の役割は、体系的には取り組まれていない。合成ｈＰＴＨ−
（１−３０）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ−（１−２９）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ−（１−２８）Ｎ
Ｈ₂、ｈＰＴＨ−（１−２７）ＮＨ₂およびｈＰＴＨ−（１−２６）ＮＨ₂は、そ
れぞれ骨芽細胞様ＲＯＳ１７／２細胞において膜結合ＰＫＣの活性を刺激できな
かった（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：８８３５−８８４２
（１９９５））。

【００１０】 （発明の要旨） 比較的大きなサイズのネイティブなＰＴＨは、骨粗鬆症のための処置として、
これらのペプチドの使用に対するチャレンジを提示する。一般に、このサイズの
タンパク質は、薬物としての使用に適切ではない。なぜなら、これは、単純な方
法（例えば、経鼻吸入法）によって効果的に送達され得ないからである。代わり
に、注射が必要とされ、そしてＰＴＨの場合には、毎日またはほぼ毎日の注射が
、骨形成速度における増加を達成するために最も必要とされるようである。さら
に、より大きなペプチドは、従来の合成化学法によって調製するには技術的に困
難であり、かつ高価である。組換えＤＮＡおよび細胞ベースの発現系を用いる代
替方法もまた、高価であり、外来タンパク質による混入に対して潜在的に無防備
であり、そして送達の問題を回避しない。

【００１１】 従って、当業者が、より大きなペプチドに基づき、そしてさらになお所望の生
物学的活性を保持する低分子アナログ（ペプチドまたは非ペプチドのいずれか）
を同定し得ることは有利である。活性は、インタクトなペプチドに対してより大
きいが、さらなる最適化は、効力および強度の増強を導き得る。

【００１２】 本研究者らは最近、ｈＰＴＨ−（１−３１）（他者によって、完全なＡＣアゴ
ニストであるがげっ歯類ＰＴＨＲを経由したＰＫＣの活性化は不可能であると示
される（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｉｇｙ １３０
（１）：５３−６０（１９９２）））が、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＣＯＳ−７細胞
またはＨＥＫ２９３細胞において発現されたヒトＰＴＨＲを経由するＡＣおよび
ＰＬＣの両方の活性化におけるｈＰＴＨ−（１−３４）と同じくらい強力である
ことを認めた（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．およびＢｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９（１０）：４２９３−４２９９（１９９８）
。これらの予期せぬ知見によって本研究者らは、ＰＬＣ活性化に特に焦点を当て
ながら、ヒトＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターへの結合およびその選択的活性
化におけるｈＰＴＨ−（１−３４）の最Ｎ末端領域の関連した役割のより詳細な
分析を行うことが促された。

【００１３】 本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４ペプチドのアミノ末端改変に関し、
これはネイティブなｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂リガンドがするよりもよりさら
に効果的にＰＴＨ−２レセプターを選択的に活性化するが、これはなお、たとえ
減少したレベルであっても古典的ＰＴＨ−１レセプターを活性化する。この予期
しない発見は、両方のレセプターが発現されるインビボを含む系における、優れ
たレセプター選択的ＰＴＨアゴニストの設計に対し、重要な暗示である。重要な
ことは、これらがいくらかのｃＡＭＰ活性を保有するがＰＬＣ活性を最小化して
いるという点で、本発明のデスアミノペプチドが、なおＰＴＨ−１レセプターを
介するシグナル選択的である。従って、本明細書中で記載されるデスアミノペプ
チドは、インビボにおける骨疾患の治療的処置のための骨タンパク質同化試薬と
して有用である。

【００１４】 本発明は、ＰＴＨ（１−３４）ペプチドおよびそれらの誘導体に関する。ＰＴ
Ｈ（１−３４）ペプチド、それらのフラグメント、それらの誘導体、それらの薬
学的に受容可能な塩およびそれらのＮ−誘導体またはＣ−誘導体を含む、本発明
の化合物は、本明細書中以後、集合的に、「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）
１の化合物およびその誘導体」といわれる。

【００１５】 本発明は、ＰＴＨ（１−３４）の合成および／または組換えの生物学的に活性
なペプチド誘導体を提供する。１つの特定の実施形態では、本発明は、以下の式
： （ａ）

【００１６】

【化１１】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
含む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になるペプチドに少なくとも９０％同一である、生物学的に活性なペ
プチドであって、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
、但し上記のペプチドは、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂または
デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではないペプチドを提供する。

【００１７】 なおさらなる局面に従って、本発明はまた、以下の式： （ａ）

【００１８】

【化１２】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になるペプチドに対して少なくとも９０％同一の生物学的に活性なペ
プチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的な組成物を提供し、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙである
。

【００１９】 なおさらなる局面に従って、本発明は、以下： （ａ）

【００２０】

【化１３】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
む、そのフラグメント； からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドから本質的になる核酸分子を提供し、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
、但し上記のペプチドは、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂または
デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない。

【００２１】 なおさらなる局面に従って、本発明は、（１）発現制御領域を含み、この領域
が、（２）生物学的に活性なペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と作動
可能に連結されていて、ここで上記ペプチドは、以下： （ａ）

【００２２】

【化１４】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
む、そのフラグメント； からなる群より選択され、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
、但し上記のペプチドは、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂または
デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではないペプチドである組換えＤ
ＮＡ分子を提供する。

【００２３】 なおさらなる局面に従って、本発明は、骨量における減少によって特徴付けら
れる哺乳動物の状態を処置するための方法を提供し、この方法は、該処置を必要
とする被験体に、骨量増加に有効な量の生物学的に活性なペプチドおよび薬学的
に受容可能なキャリアを投与する工程を包含し、ここで上記ペプチドが、以下： （ａ）

【００２４】

【化１５】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になる群から選択されるメンバーに少なくとも９０％同一なアミノ酸
配列を含み； ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
、但し上記のペプチドは、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂または
デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない。

【００２５】 なおさらなる局面に従って、ＰＴＨ−２レセプターの変更されたかまたは過剰
な作用から生じる医学的障害を処置するための方法が提供され、この方法は、患
者に治療的に有効な量の生物学的に活性なペプチド、および上記の患者のＰＴＨ
−１は活性化しないがＰＴＨ−２レセプターを活性化するのに十分な薬学的に受
容可能なキャリアを投与する過程を包含し、ここで上記ペプチドは、以下： （ａ）

【００２６】

【化１６】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になる群から選択されるメンバーに少なくとも９０％同一なアミノ酸
配列を含み； ここで、 Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
、但し上記のペプチドは、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂または
デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない。

【００２７】 なおさらなる局面に従って、本発明はまた、骨再形成、骨吸収、および／また
は骨リモデリングの速度を決定するための方法であって、有効量の、配列番号１
の標識ペプチドまたはその誘導体を、患者に投与する工程、および上記の患者の
骨中への上記ペプチドの取り込みを決定する工程を包含する方法を提供する。こ
のペプチドは、放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識から
なる群より選択される標識で標識され得る。適切な放射性標識の例は、^99mＴｃ
である。

【００２８】 本発明のなおさらなる局面に従って、１位〜３４位での任意のアミノ酸の置換
、そしてより詳細にはアミノ酸１位でのこれらのアミノ酸の置換（（これらは、
当業者に公知のアッセイおよび以下に議論されるアッセイによって決定されるよ
うに）ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを選択的にアゴナイズする、ＰＴＨ（
１−３４）ペプチドアナログの生物学的活性を破壊しない）がまた、本発明の範
囲内に含まれる。

【００２９】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 以下の説明では、組換えＤＮＡ技術およびペプチド合成において用いられる多
数の用語を広範に利用する。本明細書および特許請求の範囲（このような用語に
よって与えられるべき範囲を含む）の明瞭かつ一貫した理解を提供するために、
以下の定義を提供する。

【００３０】 （クローニングベクター）：宿主細胞において自律的に複製し得、かつ１また
は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる、プラスミド
もしくはファージのＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、この部位において、
このようなＤＮＡ配列は、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく、決
定可能な様式で切断され得、そしてこの部位に、ＤＮＡフラグメントがスプライ
スされて、その複製およびクローニングをもたらし得る。このクローニングベク
ターは、このクローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用に
適切なマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカーは、テトラサイクリン耐性
またはアンピシリン耐性を提供する。

【００３１】 （発現ベクター）：クローニングベクターに類似するが、宿主中に形質転換さ
れた後にベクター中にクローニングされた遺伝子の発現を増強し得るベクター。
クローニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列のような特定の制御配列の
制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結される）。プロモーター配列は、
構成性または誘導性のいずれかであり得る。

【００３２】 （組換え宿主）：本発明によれば、組換え宿主は、発現ベクターまたはクロー
ニングベクター上の所望のクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物宿
主細胞または真核生物細胞であり得る。この用語はまた、所望の遺伝子をその生
物の染色体またはゲノム中に含むように遺伝子操作された、原核生物細胞または
真核生物細胞を含むことを意味する。このような宿主の例については、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８９）を参照のこと。好ましい組換え宿主は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換
された真核生物細胞である。より詳細には、哺乳動物細胞が好ましい。

【００３３】 （プロモーター）：一般的に、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の５’領
域と記載されるＤＮＡ配列。隣接遺伝子の転写は、プロモーター領域で開始され
る。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答
して増大する。対照的に、転写速度は、プロモーターが構成性プロモーターであ
る場合、誘導剤によって調節されない。プロモーターの例としては、ＣＭＶプロ
モーター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＶ４０、Ｍ
ＭＴＶおよびｈＭＴＩＩａプロモーター（米国特許第５，４５７，０３４号）、
ＨＳＶ−１ ４／５プロモーター（米国特許第５，５０１，９７９号）ならびに
前初期ＨＣＭＶプロモーター（ＷＯ９２／１７５８１）が挙げられる。また、組
織特異的エンハンサーエレメントが、用いられ得る。さらに、このようなプロモ
ーターは、生物の組織特異的プロモーターおよび細胞特異的プロモーターを含み
得る。

【００３４】 （ポリヌクレオチド）：この用語は一般に、未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡま
たは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチド
またはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ）をいう。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖のＤＮ
Ａ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の
ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖で
あり得るか、より代表的には二本鎖または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物
であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるがこれら
に限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまた
はＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。用語ポリヌクレオチドは
また、１以上の改変された塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および安定性に関
してまたは他の理由に関して改変された骨格を有するＤＮＡもしくはＲＮＡを含
む。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのよ
うな普通でない塩基が挙げられる。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡになされて
いる；従って、「ポリヌクレオチド」は、天然に代表的に見出されるような、化
学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびに
ウイルスおよび細胞に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ポリヌ
クレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチド（しばしば、オリゴヌクレオ
チドと呼ばれる）を含む。

【００３５】 （ポリペプチド）：この用語は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合
（すなわち、ペプチド同配体）によって互いに連結された２以上のアミノ酸を含
む任意のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、短鎖（通常、
ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる）およびより長い鎖（一
般にタンパク質と呼ばれる）の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子にコードさ
れる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、自然の
プロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知である化学的改
変技術のいずれかによって改変されたアミノ酸配列を含む。このような改変は、
基本的教科書に十分に記載されており、そしてより詳細な研究論文ならびに調査
文献に記載されている。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端
またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドにおいてどこでも生じ得る。同じ
型の改変が所定のポリペプチドにおいて同じまたは種々の程度でいくつかの部位
に存在し得ることが認識される。また、所定のポリペプチドは、多くの型の改変
を含み得る。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，
Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９
３およびＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏ
ｓｐｅｃｔｓ，１〜１２頁、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３；
Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）な
らびにＲａｔｔａｎら「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、
Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８〜６２（１９９２）を参照のこ
と。

【００３６】 （相同性／非相同性）：２つの核酸分子は、ＨＡＳＨ−コーディングアルゴリ
ズム（Ｗｉｌｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７２６〜７３０（１９８３））によって決定さ
れる場合、それらのヌクレオチド配列が４０％より大きい類似性を共有する場合
、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」であると考えられる。２つの核酸分子は
、それらのヌクレオチド配列が、４０％未満の類似性を共有する場合、「非相同
性」であると考えられる。

【００３７】 （単離した（単離された）（Ｉｓｏｌａｔｅｄ））：天然状態から「ヒトの手
によって」変化したことを意味する用語。組成物または物質が天然に存在する場
合、その単離した形態は、その元来の環境から変化したかもしくは取り出された
かまたはその両方ともである。例えば、生存する動物において天然に存在するポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の
共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その
用語が本明細書において使用されるとおり「単離されている」。従って、組換え
宿主細胞内で生成されるおよび／または組換え宿主細胞内に含まれるポリペチド
またはポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。ま
た、「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」と意図
されるのは、部分的にまたは実質的に、組換え型宿主細胞から、またはネイティ
ブな供給源から精製されたポリペチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、
配列番号１の化合物の組換え的に生成されたバージョンおよびそれの誘導体は、
ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に
記載されている一段法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）によって、実質的に
精製され得る。

【００３８】 （同一性）：この用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の指
標をいう。一般に、最高の大きさのマッチが得られるように、配列は整列される
。「同一性」とは、本来、当該分野で認識された意味を有し、そして公表された
技術を用いて算出され得る。（例えば、以下を参照のこと：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉ
ｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；
Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ．Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧ
ｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８７；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，
Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．および Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。２つのポリヌクレオチド配
列またはポリペチド配列の間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが
、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．およびＬｉｐ
ｔｏｎ，Ｄ．ＳＩＡＭＪ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９
８８））。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するために通常用いられ
る方法としては、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」Ｍａｒ
ｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，ＨおよびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ
Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に開示される方
法が挙げられるがこれらに限定されない。同一性および類似性を決定するための
方法は、コンピュータープログラムにおいて確認される。２つの配列の間の同一
性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法として
は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳ
ＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌｅ
ｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３（１９９０））が挙げられるがこれらに限定され
ない。

【００３９】 （フラグメント）：配列番号１の化合物またはその誘導体のような分子の「フ
ラグメント」とは、これらの分子の任意のポリペプチドサブセットをいうことを
意味する。

【００４０】 （機能的誘導体）：用語「誘導体」とは、分子の「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）
」「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」または「化学的誘導体（ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」を含むことを意図する。配列番号１の化合物
またはそれの誘導体のような分子の「改変体」とは、分子全体またはそれのフラ
グメントのいずれかに実質的に類似の分子をいうことを意味する。配列番号１の
化合物またはそれらの誘導体のような分子の「アナログ」は、配列番号１の分子
またはそれらのフラグメントのいずれかに実質的に類似の非天然の分子をいうこ
とを意味する。

【００４１】 分子が別の分子と「実質的に類似である」といわれるのは、両方の分子のアミ
ノ酸の配列が、実質的に同じものである場合、および両方の分子が、類似した生
物学的活性度を所有する場合である。従って、２つの分子が類似した活性を所有
するという条件では、分子のうちの１つが他方で見出されないさらなるアミノ酸
残基を含むか、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でさえも、その語が
本願明細書において使われる場合、それらは改変体、誘導体またはアナログと考
えられる。

【００４２】 本明細書中で用いられる場合、分子は、それが通常は、分子の一部ではない、
さらなる化学部分を含む場合に、別の分子の「化学誘導体」であると言われる。
このような部分は、分子の溶解性、吸着、生物学的半減期などを改善し得る。こ
の部分は、代替的に、分子の毒性を減少させ得るか、分子の任意の望まれない副
作用などを排除し得るか、または減弱し得る。このような効果を媒介し得る部分
の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８０）に開示され、そして当業者に明らかである。

【００４３】 （タンパク質の生物学的活性）：この表現は、配列番号１の化合物またはその
誘導体の代謝機能または生理学的機能（同様の活性、もしくは改善された活性、
または低下した望まれない副作用を有するそれらの活性を含む）をいう。配列番
号１の化合物またはその誘導体の、抗原性活性および免疫原性活性もまた含まれ
る。

【００４４】 （遺伝子治療）：治療の手段は、生物の遺伝子発現の正常なパターンを変化さ
せることに関する。一般に、組換えポリヌクレオチドは、生物の細胞または組織
に導入されて、遺伝子発現の変化をもたらす。

【００４５】 （宿主動物）：トランスジェニック動物、これらの生殖細胞および体細胞の全
ては、本発明のＤＮＡ構築物を含む。このようなトランスジェニック動物は、一
般に脊椎動物である。好ましい宿主動物は、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類動
物、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、モルモット、げっ歯類（例えば、ラッ
ト）など）である。用語、宿主動物はまた、胚段階および胎仔段階を含む、発生
の全ての段階における動物を含む。

【００４６】 （Ｉ．配列番号１の化合物およびその誘導体−構造的特徴ならびに機能的特徴
） 本発明の重要性は、２つのクローン化された副甲状腺ホルモンレセプターの種
、ＰＴＨ−１およびＰＴＨ−２の存在に関する。これらの２つレセプターは、有
意な（５０％より大きい）の配列相同性を共有し、そして明らかに通常のレセプ
ターファミリーのメンバーである。しかし、これらは、非常に異なる組織におい
て発現されるようである。具体的には、ＰＴＨ−２レセプターは、中でも脳、肺
、内皮および膵臓の特定の領域に発現するが、１型レセプターは、特に腎臓およ
び骨により偏在して発現する。これまでＰＴＨ−２レセプターは、ネイティブな
ＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）が、このレセプターに結合もせず活性化もし
ないという点において、ＰＴＨに対して選択的であるということのみが知られて
いる。ＰＴＨ−２レセプターは、ＨＥＫ腎臓細胞のような相同性の細胞系におい
て高いレベルで発現され、そしてアデニリルシクラーゼおよび細胞性自由カルシ
ウム過渡応答の両方のシグナルに対して示される。

【００４７】 特定のアミノ末端が改変されたアナログのｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂、特に
、デスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂およびデスアミノ−［Ａ
ｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂を作製し、ネイティブなｈＰＴＨ（１−３４
）ＮＨ₂リガンドがするよりもよりさらに効果的にＰＴＨ−２レセプターを活性
化するという発見がなされた。同時に、これら２つのペプチドは、たとえ減少さ
れたレベルであっても古典的なＰＴＨ−１レセプターを活性化する。この発見の
直接的関連は、これらアミノ改変ＰＴＨアナログが、ＰＴＨ−２レセプターに対
する選択的アナログであることである。

【００４８】 本発明は、ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチドおよびその誘導体に関する。ｈＰＴ
Ｈ（１−３４）ペプチド、そのフラグメント、その誘導体、その薬学的に受容可
能な塩、およびそのＮ末端誘導体またはＣ末端誘導体を含む本発明の化合物は、
本明細書中の以降において、「配列番号１の化合物およびその誘導体」として総
称的に呼ばれる。

【００４９】 詳細には、本発明は、ｈＰＴＨ（１−３４）の合成および／または組換え生物
学的に活性なペプチド誘導体を提供する。１つの特定の実施形態において、本発
明は生物学的に活性なペプチドであって、以下の式： （ａ）

【００５０】

【化１７】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
含む、そのフラグメント； （ｃ）それらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）それらのＮ−誘導体またはＣ−誘導体； から本質的になるペプチドに少なくとも９０％同一であり、ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノ（ｄｅｓａｍｉｎｏ）Ｓｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデ
スアミノＧｌｙであり、ただし上記ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（
１−３１）ＮＨ₂またはデスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない
ペプチドを提供する。

【００５１】 従って本発明は、強力な選択的ＰＴＨ−２レセプターのアゴニストである新規
のｈＰＴＨ（１−３４）誘導体を提供する。好ましい実施形態において、このｈ
ＰＴＨ（１−３４）誘導体は、残基１において変化させられる。最も好ましくは
、本発明は、ｈＰＴＨ（１−３４）の位置１のセリンにつていデスアミノアラニ
ンまたはデスアミノグリシンで置換したアミノ酸を有するｈＰＴＨ（１−３４）
誘導体を含む。

【００５２】 さらに、任意の他の天然なアミノ酸置換（これは、ｈＰＴＨ（１−３４）誘導
体が選択的にＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターをアゴナイズする能力を壊さな
い）（当業者に公知のアッセイおよび以下に考察されるアッセイにより決定され
る場合）が、本発明中の範囲に含まれる。

【００５３】 タンパク質産物の場合、本発明の配列番号１の化合物またはその誘導体は、液
相ペプチド合成または固相ペプチド合成の技術による産生に従う。固相ペプチド
合成技術は、特に、ヒトＰＴＨの産生に首尾良く適用されており、そして本発明
の配列番号１の化合物またはその誘導体の産生のために用いられ得る（ガイダン
スについては、Ｋｉｍｕｒａら、前出、を参照のこと、そしてＦａｉｒｗｅｌｌ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２６９１（１９８３）を参照のこと）。比較的大き
な規模でヒトＰＴＨを産生することの成功は、Ｇｏｕｄら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉ
ｎ．Ｒｅｓ．６（８）：７８１（１９９１）（本明細書中で参考として援用され
る）により報告されている。合成ペプチド合成アプローチは、一般的に、自動合
成機および固相として、適切な樹脂の使用を、必要とする。この樹脂は、配列番
号１の所望の化合物またはその誘導体のＣ末端アミノ酸に付着される。次いで、
Ｎ末端方向での、ペプチドの伸長は、代表的には、ＦＭＯＣ−またはＢＯＣ−の
いずれかに基づく化学プロトコルを用いて、合成が完了するまで、適切に保護さ
れた形態の次に所望されるアミノ酸を、連続的にカップリングすることにより達
成される。次いで、保護基は、通常、樹脂からのペプチドの切断と同時に、ペプ
チドから切断され、次いでこのペプチドは、従来技術（例えば、溶媒としてアセ
トニトリルそしてイオン対形成剤（ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とし
てトリフルオロ酢酸を用いる逆相ＨＰＬＣによる）を用いて単離され、そして精
製される。このような手順は、一般に多数の刊行物に記載されており、そして例
えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）を、参照されても良い。ペ
プチド合成アプローチが、遺伝的にコードされないアミノ酸を組み込む、配列番
号１およびその誘導体の改変体の生成のために必要とされることが理解される。

【００５４】 本発明の別の局面に従って、置換基は、当該分野において公知の標準的方法に
よって、配列番号１の化合物またはその誘導体のＮ末端アミノ酸の遊離アミンに
付加され得る。例えば、アルキル基（例えば、Ｃ_1-12アルキル）は、還元的アル
キル化を使用して付着され得る。ヒドロキシアルキル基（例えば、Ｃ_1-12ヒドロ
キシアルキル）もまた、還元的アルキル化を使用して付着され得、ここで遊離ヒ
ドロキシ基はｔ−ブチルエステルを用いて保護される。アシル基（例えば、ＣＯ
Ｅ₁）は、遊離酸（例えば、Ｅ₁ＣＯＯＨ）をＮ末端アミノ酸の遊離アミン（ａｍ
ｉｎｏ）にカップリングすることにより、付着され得る。配列番号１の化合物も
しくはその誘導体の二次構造または三次構造、または安定性を改変し、なお生物
学的活性を保持する、配列番号１のそれらの化合物およびその誘導体もまた、本
発明の範囲内と意図される。このような誘導体は、ラクタム環化、ジスルフィド
結合、または当業者に公知の他の手段を通して達成され得る。

【００５５】 本発明のなかでも最も好ましい実施形態は、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプタ
ーの選択的アゴニストとして作用し得るそれらの化合物である。特に、好ましい
実施形態は、Ｘ₀₁がデスアミノＧｌｙであるそれらの化合物である。従って、こ
の好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００５６】

【化１８】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＧｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）〕。

【００５７】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号２のカルボキシ末端で１つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＧｌｙである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００５８】

【化１９】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＧｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３３）〕。

【００５９】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号２のカルボキシ末端で７つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＧｌｙである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００６０】

【化２０】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＧｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−２７）〕。

【００６１】 好ましい実施形態の別の組は、Ｘ₀₁がデスアミノＡｌａであるそれらの化合物
である。従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００６２】

【化２１】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＡｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）〕。

【００６３】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号５のカルボキシ末端で１つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＡｌａである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００６４】

【化２２】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＡｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３３）〕。

【００６５】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号５のカルボキシ末端で７つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＡｌａである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００６６】

【化２３】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＡｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−２７）〕。

【００６７】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号８のカルボキシ末端で１つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＳｅｒである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００６８】

【化２４】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＳｅｒ¹］ｈＰＴＨ（１−３３）〕。

【００６９】 好ましい実施形態の別の組は、配列番号８のカルボキシ末端で７つのアミノ酸
の欠失を有するそれらの化合物であり、ここでＸ₀₁はデスアミノＳｅｒである。
従って、この好ましい実施形態のアミノ酸配列は、

【００７０】

【化２５】 またはその誘導体である。〔［デスアミノＳｅｒ¹］ｈＰＴＨ（１−２７）〕。

【００７１】 （ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞、および組換え発現） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベ
クターで遺伝子操作される宿主細胞、ならびに組換え技術による本発明のポリペ
プチドの産生に関する。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由
来のＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を産生するために使用され得る。

【００７２】 組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドについての発現
系またはその部分を組込むように遺伝子操作され得る。宿主細胞へのポリヌクレ
オチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介性トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉ
ｏｎ）、微量注入、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎ
ｇ）、弾道的導入、または感染のような、多くの標準的実験室マニュアル（例え
ば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載される方法によ
って、もたらされ得る。

【００７３】 適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉ細胞、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ細胞およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞）；真菌細胞
（例えば、酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞）；昆虫細胞（例えば、
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；
動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３
Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植
物細胞が挙げられる。

【００７４】 非常に種々の発現系が、使用され得る。このような系としては、特に、染色体
由来の系、エピソーム由来の系およびウイルス由来の系（例えば、細菌性プラス
ミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来
のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレメント由来のベクター、
酵母染色体エレメント由来のベクター、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、
パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）由来のベク
ター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝因子（例えば、コスミドおよびファージミド）由来のベクタ
ー）が挙げられる。発現系は、発現を調節しかつ発現を生じる制御領域を含み得
る。一般に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するために適切な任意の系またはベクターが、使用され得る
。適切なヌクレオチド配列は、任意の種々の周知および慣用的な技術（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（前出）に示される技術）によって、発現系へ挿入され
得る。

【００７５】 ＲＮＡベクターはまた、本発明に開示される配列番号１の化合物またはその誘
導体をコードする核酸の発現のために利用され得る。これらのベクターは、広範
な種々の真核生物細胞において天然に複製される、＋（プラス）鎖または−（マ
イナス）鎖のＲＮＡウイルスに基づく（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．および
Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：２９７−３１０、１９９２）。レ
トロウイルスとは異なり、これらのウイルスは、ＲＮＡ形態において完全に存在
する、中間のＤＮＡライフサイクル期を欠如する。例えば、αウイルスは、外来
タンパク質のための発現ベクターとして使用される。なぜなら、これらは、広範
囲の宿主細胞において利用され得、そして高レベルの発現を提供し得るからであ
る；この型のウイルスの例としては、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウ
イルスが挙げられる（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：
１８−２２、１９９３；Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１１３７１−１１３７７、１９９６）。Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎのシンビス発現系によって例示されるように、研究者らは、簡便に、
研究室でＤＮＡ形態（ｐＳｉｎｒｅｐ５プラスミド）において組換え分子を維持
し得るが、ＲＮＡ形態における増殖も同様に可能である。発現のために使用され
る宿主細胞において、目的の遺伝子を含むベクターは、完全にＲＮＡ形態で存在
し、そして所望であれば、この状態において連続的に増殖され得る。

【００７６】 翻訳されたタンパク質の、小胞体の管腔への分泌、ペリプラズム空間への分泌
または細胞外環境への分泌について、適切な分泌シグナルは、所望のポリペプチ
ドへ組み込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり
得るか、またはこれらは、外因性シグナルであり得る。

【００７７】 ＤＮＡ配列の発現は、そのＤＮＡ配列が転写調節情報および翻訳調節情報を含
むＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」必要がある。作動可能な連結は、制御
ＤＮＡ配列または調節ＤＮＡ配列および発現されようとしているＤＮＡ配列が、
遺伝子発現を許容するような方法で連結される、連結である。遺伝子発現のため
に必要な「制御領域」の正確な性質は、生物間で変化し得るが、一般に、プロモ
ーター領域（原核生物細胞において、プロモーター（これは、ＲＮＡ転写の開始
を指向する）ならびにＤＮＡ配列（ＲＮＡへ転写される場合に、タンパク質合成
の開始をシグナル伝達する）の両方を含む）を含む。真核生物細胞における調節
領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む
。

【００７８】 ２つのＤＮＡ配列は、その２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレー
ムシフト変異の導入を生じない場合、（２）プロモーター領域配列が融合タンパ
ク質をコードする配列の転写を指向する能力を妨害しない場合、または（３）融
合タンパク質をコードする配列がプロモーター領域配列によって転写される能力
を妨害しない場合に、作動可能に連結されているといわれる。従って、プロモー
ター領域は、このプロモーター領域がＤＮＡ配列を転写し得た場合に、そのＤＮ
Ａ配列に作動可能に連結される。

【００７９】 本発明の発現ベクターを生成するための、種々のＤＮＡフラグメントの結合は
、従来技術に従い、連結のために平滑末端または付着末端、適切な末端を提供す
るための制限酵素消化、適切な粘着末端の平滑化（ｆｉｌｌｉｎｇ）、望まない
結合を回避するためのアルカリおよびホスファターゼ処理、ならびに適切な連結
物との連結を使用して、実施される。融合タンパク質の場合において、遺伝的構
築物は、この融合タンパク質の５’遺伝子配列に作動可能に連結された誘導性プ
ロモーターをコードして、この融合タンパク質の効率的な発現を可能にする。

【００８０】 原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどのような）において、配列番号１の
化合物またはその誘導体を発現するために、配列番号１をコードするＤＮＡ配列
を機能性原核生物プロモーターに作動可能に連結する必要がある。このようなプ
ロモーターは、構成性であり得るか、またはより好ましくは、調節性（すなわち
、誘導性または抑制解除性（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ））のいずれかであり
得る。構成性プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモ
ーター、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐ
ＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴ
プロモーターなどが挙げられる。誘導性原核生物プロモーターの例としては、バ
クテリオファージλの主要な（ｍａｊｏｒ）右鎖（ｒｉｇｈｔ）プロモーターお
よび左鎖（ｌｅｆｔ）プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ
プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｌａｃＩプロモ
ーターおよびｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ，Ｉ．ら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））、およびＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｚ．ら
、Ｇｅｎｅ ３２：１１−２０（１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓのバクテリ
オファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓのプロモーター（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０
３：４６８−４７８（１９８６））が挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇ
ｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（
１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５
−５１６（１９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）によって総説されている。

【００８１】 発現が真核生物細胞（例えば、酵母、真菌、哺乳動物細胞、または植物細胞）
において所望される場合、このような真核生物宿主において転写を指向し得るプ
ロモーターを使用することが必要である。好ましい真核生物プロモーターとして
は、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８ （１９８２））；ヘルペス
ウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．、Ｃｅｌｌ ３１：３５
５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．
ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；な
らびに酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１
９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））が挙げられる。

【００８２】 好ましくは、導入されるＤＮＡ配列は、レシピエント宿主において自律的に複
製し得るプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。任意の広範な種々
のベクターが、この目的のために使用され得る。特定のプラスミドまたはウイル
スベクターを選択する際に重要な因子としては、以下が挙げられる：ベクターを
含むレシピエント細胞が、ベクターを含まないレシピエント細胞から認識および
選択され得る、容易性；特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；な
らびに、異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）」し
得ることが所望されるか否か。

【００８３】 好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製可能なプラス
ミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ １８４
、πＶＸのような）が挙げられるが、限定されない。このようなプラスミドは、
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）に
よって開示される。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、ｐＧＦＰ−１プ
ラスミド（Ｇａｒｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４
−１５８５９（１９８９）に記載される）；またはｐＥＴベクターの１つに基づ
く改変プラスミド（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＤｕｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９（１９９０）に記載される）が挙げら
れる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１
２７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．：Ｔｈ
ｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、３０７−３２９頁（１９８２）によって開
示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドとしては、ｐＩＪＩＯＩ
（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−
４１８３（１９８７））、およびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ
（例えば、φＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら：Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎ
ｇａｒｙ、４５−５４頁（１９８６））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
プラスミドは、Ｊｏｈｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６
９３−７０４（１９８６）、およびＩｚａｋｉ，Ｋ．、Ｊｏｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８）によって総説される。

【００８４】 好ましい真核生物発現ベクターとしては、限定はしないが、ＢＰＶ、ワクシニ
ア、２−ミクロンサークル（２−ｍｉｃｒｏｎ ｃｉｒｃｌｅ）などが挙げられ
る。このような発現ベクターは、当該分野において周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ，Ｄ．ら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８
２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃ
ｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、４
４５−４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ ２８：２０
３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．
：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉ
ｓｅ、第３巻、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ＮＹ、５６３−６０８頁（１９８０））。

【００８５】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養物もまた、宿主として使用され
得る。原理的に、任意のこのような細胞培養物は、脊椎動物細胞供給源由来であ
ろうと無脊椎動物細胞供給源由来であろうと実行可能である。しかし、脊椎動物
供給源由来の細胞を用いるものが、大いに興味深い。有用な脊椎動物宿主細胞株
の例は、ＶＥＲＯ細胞株およびＨｅＬａ細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株、およびＭ
ＤＣＫ細胞株である。このような細胞のための発現ベクターは、通常（必要であ
れば）、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位および転写終結配列とともに、複製起点、発現される遺伝子の前または
その上流に位置するプロモーターを含む。

【００８６】 哺乳動物細胞における使用に関しては、発現ベクターの制御機能は、しばしば
、ウイルス性物質により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは
、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびサ
イトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後
期プロモーターは、特に有用である。なぜなら、両方とも、ＳＶ４０ウイルスの
複製起点もまた含むフラグメントとして、このウイルスから容易に得られるから
である（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８））。

【００８７】 複製起点は、外因性の起点（例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）の供給源由来であり得る）を含むように
）ベクターを構築することにより提供され得るか、または宿主細胞染色体複製機
構により提供され得るかのいずれかである。ベクターが宿主細胞染色体に組み込
まれる場合、後者でしばしば充分である。

【００８８】 強固な（ｆｏｒｍｉｄａｂｌｅ）細胞膜障壁のない細胞が宿主細胞として使用
される場合、トランスフェクションは、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅ
ｒｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６（１９７８）に記載されるように、リン
酸カルシウム沈澱法により行われる。しかし、細胞にＤＮＡを導入するための他
の方法（例えば、核注入によるか、またはプロトプラスト融合による）もまた使
用され得る。遺伝子治療の場合では、トランスフェクション促進剤（例えば、リ
ポソームが挙げられるが、これに限定されない）の有無に拘わらず、裸のプラス
ミドまたはウイルスＤＮＡの直接注入法が、哺乳動物細胞のインビボまたはイン
ビトロのトランスフェクションという現在の方法に対する代替アプローチを提供
する。実質的な細胞壁構築物を備える原核生物細胞が使用される場合、好ましい
トランスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）に記載のように、塩化カルシウムを
用いたカルシウム処理である。

【００８９】 （ＩＶ．配列番号１の化合物またはその誘導体の投与および治療的有用性） （（Ａ）配列番号１またはその誘導体の化合物の投与） 一般に、本発明の、配列番号１の化合物もしくはその誘導体、またはそれらの
塩は、１日あたり約０．０１〜１μｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは、１日あたり
約０．０７〜約０．２μｇ／ｋｇ体重の間の量で投与される。５０ｋｇのヒト女
性被験体に関しては、配列番号１の生物学的に活性な化合物またはその誘導体の
日用量は、約０．５〜約５０μｇ、好ましくは、約３．５μｇ〜約１０μｇであ
る。他の哺乳動物（例えば、ウマ、イヌ、およびウシ）においては、より高い用
量が必要であり得る。この用量は、最も有効な結果を達成するために必要とされ
るように、１回の投与により、複数回の適用により、または徐放により、好まし
くは、１日１回以上の注射により、従来の薬学的組成物中で送達され得る。最も
好ましくは、この投薬量は、経鼻吸入法により、従来の薬学的組成物中で送達さ
れ得る。

【００９０】 正確な用量および組成物ならびに最も適切な送達レジメンの選択は、特に、選
択された配列番号１の化合物またはその誘導体の薬理学的特性、処置される状態
の性質および重篤度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神的明瞭度に
より影響される。

【００９１】 代表的な好ましい送達レジメンとしては、経口、非経口的（皮下的、経皮的、
筋肉内および静脈内を含む）、直腸、口内（舌下を含む）、経皮、および経鼻吸
入法が挙げられるが、これらに限定されない。

【００９２】 薬学的に受容可能な塩は、有毒な副作用なく、配列番号１の化合物またはその
誘導体の所望される生物学的活性を保持する。このような塩の例は、（ａ）無機
酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）で形成された酸付加
塩；および有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、
フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タン
ニン酸、パモ酸（ｐａｍｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸、ポリグルタミン酸、
ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など）で
形成された塩；（ｂ）多価金属カチオン（例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス
、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウ
ムなど）で形成された塩基付加塩；またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミ
ンまたはエチレンジアミンから形成された有機カチオンで形成された塩基付加塩
；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ（例えば、亜鉛タンニン酸塩な
ど）である。

【００９３】 本発明のさらなる局面は、薬学的に受容可能な非毒性キャリアとの混合物中に
、活性成分として、本発明の配列番号１の化合物もしくはそれらの誘導体、また
は薬学的に受容可能なそれらの塩を含む薬学的組成物に関する。上記のように、
このような組成物は、非経口的（皮下的、経皮的、筋肉内または静脈内）投与の
ために、特に、液体の溶液または懸濁液の形態で；経口または口内投与のために
、特に錠剤またはカプセル剤の形態で；直腸、経皮投与のために；ならびに鼻腔
内投与のために、特に粉末、点鼻薬またはエアロゾルの形態で調製され得る。

【００９４】 この組成物は、単位投薬形態で簡便に投与され得、そして薬学分野において周
知の任意の方法（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９
８５）に記載）によって調製され得る。非経口投与のための処方物は、賦形剤（
滅菌水または生理食塩水、アルキレングリコール（例えば、プロピレングリコー
ル）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起
源の油、水素添加ナフタレン（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｎａｐｈｔｈａｌｅ
ｎｅ）など）を含み得る。経口投与に関しては、この処方物は、胆汁酸塩または
アシルカルニチンの付加により増強され得る。経鼻投与のための処方物は、固体
であってもよく、そして賦形剤（例えば、ラクトースまたはデキストラン）を含
み得、あるいは経鼻ドロップまたは用量測定スプレーの形態で使用するための水
溶液または油溶液であってもよい。口内投与に関しては、代表的な賦形剤として
、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、予めゼラチン様に
したデンプンなどが挙げられる。

【００９５】 最も好ましい投与経路である経鼻投与のために処方される場合、鼻粘膜を通る
吸収は、界面活性剤の酸（例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸
、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸
、グリコデオキシコール酸、シクロデキストリンなど）を約０．２〜１５重量％
、好ましくは、約０．５〜４重量％、最も好ましくは、約２重量％の範囲の量に
より増強され得る。

【００９６】 本発明の化合物を長期間（例えば、１週間から１年の期間）にわたり被験体に
送達することは、所望の放出期間にわたり充分活性な成分を含む徐放系の１回の
投与により達成され得る。種々の徐放系（例えば、モノリシックまたはリザーバ
型マイクロカプセル、デポー（ｄｅｐｏｔ）インプラント、浸透圧ポンプ、小胞
、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン浸透デバイスおよび代替的な注射可
能投薬形態）がこの目的のために利用され得る。活性成分の送達が所望される部
位における局在化は、特定の障害の処置において利益があることが証明され得る
いくつかの徐放デバイスのさらなる特徴である。

【００９７】 徐放性処方物の１つの形態は、ゆっくりと分解され、非毒性で、非抗原性のポ
リマー（例えば、Ｋｅｎｔ，Ｌｅｗｉｓ，Ｓａｎｄｅｒｓ，およびＴｉｃｅ，米
国特許第４，６７５，１８９号（本明細書中に参考として援用される）の先駆的
研究において記載される、コポリ（乳酸／グリコール酸））中に分散されるか、
またはカプセル化される、ポリペプチドまたはその塩を含む。この化合物、また
は好ましくはそれらの比較的不溶性の塩もまた、コレステロールもしくは他の脂
質マトリクスペレット、またはシラストマー（ｓｉｌａｓｔｏｍｅｒ）マトリク
スインプラント中に処方され得る。さらなる遅延型放出、デポーインプラントま
たは注射可能処方物は当業者に明らかである。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａ
ｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８，およびＲ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ，Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖ
ｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９
８７（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【００９８】 ＰＴＨと同様に、配列番号１の化合物およびその誘導体は、所定の臨床状態を
処置する際に有用な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、骨粗鬆症お
よび他の骨関連障害を処置する場合、配列番号１の化合物およびその誘導体は、
カルシウム補助食品またはビタミンＤアナログとともに投与され得る（米国特許
第４，６９８，３２８号を参照のこと）。あるいは、配列番号１の化合物および
その誘導体は、例えば、米国特許第４，７６１，４０６号に記載の二リン酸と組
み合わせて、またはカルシトニンおよびエストロゲン（限定はされない）のよう
な１つ以上の骨治療剤と組み合わせて、好ましくは、循環的治療レジメを用いて
投与され得る。

【００９９】 （（Ｂ）配列番号１の化合物またはその誘導体の治療的有用性） 本発明の、配列番号１の化合物またはその誘導体は、骨量の喪失により現れた
種々の哺乳動物の状態を予防および処置するために有用である。特に、本発明の
化合物は、ヒトにおける骨粗鬆症およびオステオペニアの予防処置および治療処
置に関して記載される。さらに、本発明の化合物は、他の骨疾患の予防処置およ
び治療処置に関して記載される。本発明の化合物は、上皮小体低下症の予防処置
および治療処置に関して記載される。最終的に、本発明の化合物は、骨折修復の
ためのアゴニストとしての使用、および高カルシウム血症のためのアンタゴニス
トとしての使用に関して記載される。

【０１００】 高カルシウム血症および低カルシウム血症のいくつかの形態は、ＰＴＨおよび
ＰＴＨｒＰと、ＰＴＨ−１レセプターおよびＰＴＨ−２レセプターとの間の相互
作用に関連する。高カルシウム血症は、血清カルシウムレベルの異常な上昇が存
在する状態であり；これは、しばしば、以下を含む他の疾患に関連する：上皮小
体機能亢進症、骨粗鬆症、乳房、肺および前立腺の癌腫、頭部および頸部、なら
びに食道の類表皮癌、多発性骨髄腫、および副腎腫。低カルシウム血症は、血清
カルシウムレベルが、異常に低い状態であり、有効なＰＴＨの欠損（例えば、甲
状腺手術後の）から生じ得る。

【０１０１】 配列番号１の化合物またはその誘導体をコードする本発明の核酸をまた、選択
された組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーに連結し得、そして
得られたハイブリッド遺伝子を、標準的な方法（例えば、Ｌｅｄｅｒら、米国特
許第４，７３６，８６６号（本明細書中に参考として援用される）に記載のよう
な）によって初期発生段階（例えば、受精卵母細胞段階）の動物胚に導入し、選
択された組織において上昇したレベルの配列番号１の化合物またはその誘導体を
発現するトランスジェニック動物を生成し得る（例えば、骨についてのオステオ
カルシンプロモーター）。このようなプロモーターを使用して、このトランスジ
ェニック動物における配列番号１の化合物またはその誘導体の組織特異的発現を
指向する。

【０１０２】 さらに、ＰＴＨアナログがＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを拮抗する能力
（当業者に公知のアッセイによって決定され、そして以下に議論されるような）
を破壊しない、天然の任意の他のアミノ酸置換が、本発明の範囲に含まれる。

【０１０３】 「アゴニスト」によって、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターによって媒介さ
れる細胞性応答を増強または強化し得るリガンドが意図される。本発明の任意の
候補「アゴニスト」が、このような細胞性応答を増強または阻害し得るかは、当
該分野で公知のタンパク質リガンド／レセプターの細胞性応答アッセイまたは結
合アッセイ（本出願の他の箇所に記載されるアッセイを含む）を使用して決定さ
れ得る。

【０１０４】 本発明のなおさらなる局面に従って、骨粗鬆症を処置するための方法が提供さ
れ、この方法は、患者のＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを選択的に活性化す
るのに十分な、治療有効量の配列番号１の化合物またはその誘導体を、その患者
に投与する工程を包含する。アゴニストを投与するために、適切な配列番号１の
化合物またはその誘導体を、一般的に、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、
生理学的生理食塩水）中に処方することによって、医薬の製造において使用して
、そして好ましくは、配列番号１の化合物またはその誘導体の結合後にＰＴＨ−
１／ＰＴＨ−２レセプターの選択的な活性化を提供する投薬量で、静脈内、筋内
、皮下、経口または鼻内投与する。代表的な投薬量は、１ｎｇ〜１０ｍｇのペプ
チド／ｋｇ体重／日である。このような投薬量および投与は、ＰＴＨアゴニスト
の投与のために（例えば、骨粗鬆症、他の代謝性骨障害、ならびに上皮小体機能
低下症および関連する障害のような状態の処置のため）、使用され得る。

【０１０５】 好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号１の化合物
またはその誘導体は、配列番号１の化合物のアミノ酸１位で、セリンの代わりに
デスアミノアラニンでのアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において、
ＰＴＨ誘導体は、［デスアミノＡｌａ¹］ＰＴＨ（１〜３４）（配列番号５）で
ある。別の好ましい実施形態において、この方法において使用される配列番号１
の化合物またはその誘導体は、配列番号１の１位のアミノ酸で、セリンの代わり
にデスアミノグリシンでのアミノ酸置換を有する。この特定の実施形態において
、ＰＴＨ誘導体は、［デスアミノＧｌｙ¹］ＰＴＨ（１〜３４）（配列番号２）
である。

【０１０６】 （Ｖ．配列番号１の化合物またはその誘導体のレセプターシグナル伝達活性） ホルモン作用の発現における重大な工程は、ホルモンと、標的細胞の原形質膜
表面のレセプターとの相互作用である。ホルモン−レセプター複合体の形成は、
細胞への細胞外シグナルの伝達を可能にし、種々の生物学的応答を誘発する。

【０１０７】 （Ａ．ＰＴＨ−２レセプターアンタゴニストについてのスクリーニング） 本発明のポリペプチドは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用して、それらのアゴニ
ストの特性についてスクリーニングされ得る。その細胞表面上にＰＴＨ−２レセ
プターを発現する細胞を、２ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キ
サンチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下、ネイティブＰＴＨ
（１〜８４）と共に５〜６０分間、３７℃でインキュベートする。サイクリック
ＡＭＰ蓄積を、上記のように、特異的ラジオイムノアッセイによって測定する。

【０１０８】 ＰＴＨ−２レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１〜８４）と競合
し、そしてネイティブＰＴＨ（１〜８４）の存在下または非存在下でｃＡＭＰ蓄
積を刺激する、配列番号１の化合物またはその誘導体は、競合的アゴニストであ
る。ＰＴＨ−２レセプターへの結合についてネイティブＰＴＨ（１〜８４）と競
合しないが、ネイティブＰＴＨ（１〜８４）の存在下または非存在下で、なおｃ
ＡＭＰ蓄積を刺激し得るか、あるいは配列番号１の化合物またはその誘導体単独
で観察されるよりも、より高いｃＡＭＰ蓄積を刺激する、配列番号１の化合物ま
たはその誘導体を、非競合的アゴニストとみなす。

【０１０９】 本発明が、本発明の精神もしくは範囲またはその任意の実施形態から逸脱する
ことなく、組成、濃度、投与形態および状態の広範な等価のパラメーターの範囲
内で実施され得ることが、当業者に理解される。

【０１１０】 本発明を本明細書中で十分に記載してきたが、本発明は、特定の実施例を参照
することによって、より容易に理解される。本明細書中に明記されない限り、こ
れらの特定の実施例は、例示目的で提供され、そして本発明を限定することが意
図されない。

【０１１１】 （実施例１） （材料および方法） （細胞培養） 以下の細胞株をこれらの研究に使用した。ＨＫＲＫ Ｃ５３は、ヒトＰＴＨ−
１レセプターを安定に発現する（１５０，０００レセプター／細胞）ＬＬＣ−Ｐ
ＫＩブタ腎臓上皮細胞のサブクローンである。ＳａＯＳ−２細胞は、比較的少な
い（１細胞当たり１０，０００〜２０，０００）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発
現する、形質転換されたヒト骨肉腫細胞である。ＨＰＲ２−７細胞は、１細胞当
たり約２５０，０００の組換えヒトＰＴＨ−２レセプターを発現するＬＬＣ−Ｐ
Ｋ₁のサブクローンである。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞は、１細胞当たり約１００万の
ｈＰＴＨ−１レセプターを安定に発現するＬＬＣ−ＰＫのサブクローンである。
ＨＰＲ２−２２細胞は、１細胞当たり１５０万の組換えｈＰＴＨ−２レセプター
を発現するＬＬＣ−ＰＫ１のサブクローンである。ＨＰＲ２−２７細胞株および
ＨＰＲ２−２２細胞株は、（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ
．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９
９５））のトランスフェクション技術を用いて、ＨＫＲＫ細胞と同じ様式である
が、代わりに２型ＰＴＨレセプターｃＤＮＡを使用して作製された。

【０１１２】 全ての細胞を、５％ＣＯ₂雰囲気下、７％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および１％
ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａ
ｎｄ，ＮＹ）を含むダルベッコ改変必須培地で維持した。細胞を、アッセイの２
日前に適切な細胞密度（約２〜２．５×１０⁵細胞／ウェル）で、２４ウェルプ
レートに播種した。ＣＯＳ／ＨＥＫ細胞におけるＤＮＡトランスフェクトション
を、プレート後の２４時間で行い、そしてイノシトール放射性標識をその後２４
時間で加えた（下記参照）。細胞トランスフェクションを、以前に記載されたよ
うに（Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３２（５
）：２０２４−２０３０（１９９３））行った。

【０１１３】 （放射リガンド結合およびシグナル伝達アッセイ） 細胞内ｃＡＭＰ蓄積、ＰＬＣ活性化およびＰＴＨＲ結合親和性を、以前に報告
されたように（Ｂｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３２（５）：２０９０−２０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５））測定
した。細胞内ｃＡＭＰ蓄積は、イソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌ
ｍｅｔｈｙｘａｎｔｈｉｎｅ）（ＩＢＭＸ、１ｍＭ）の存在下、３７℃で１５分
間、ヒトＰＴＨペプチドに対して曝露された細胞の抽出物において測定した。吸
引および液体窒素中での凍結によって反応を終結させた後、細胞の単層を、５０
ｍＭ ＨＣｌを用いて抽出し、そしてラジオイムノアッセイキット（Ｄｕｐｏｎ
ｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて
ｃＡＭＰを測定した。

【０１１４】 ＰＬＣを、０．１％ウシ血清アルブミンを含む無血清培地で［³Ｈ］ミオ−イ
ノシトール（３μＣｉ／ｍｌ）を用いる１６時間の標識の後、３７℃で３０分間
、３０ｍＭ ＬｉＣｌの存在下、ＰＴＨアゴニストによって活性化した。この反
応を、迅速な吸引および冷５％ＴＣＡの添加によって停止した。水溶性放射性標
識イノシトール３リン酸（ＩＰ₃）を、イオン交換クロマトグラフィーによるエ
ーテル抽出の後に単離した。（Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５））によるエーテル抽出の後に単
離した。ＨＥＫ２９３細胞に関する実験において、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ）を用いてヒトＰＴＨＲ ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１発現ベクターＨＫ
ＲＫの中）で先にトランスフェクトした細胞を、水溶性［³Ｈ］イノシトールポ
リリン酸の全量をイオン交換カラムから単一画分として回収することを除き、上
記のように［³Ｈ］ミオ−イノシトールを用いて標識し、かつアッセイした。

【０１１５】 放射リガンド競合結合アッセイを、非放射活性ｈＰＴＨ−（１−３４）アナロ
グの存在下または非存在下において、２〜８℃で６時間、¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21
］ラットＰＴＨ−（１−３４）（１００，０００ｃｐｍ／ウェル）を用いて行っ
た。細胞層を、細胞結合放射活性の定量のための可溶化の前に、３回洗浄した。

【０１１６】 本明細書に報告されるアッセイについてＨＫＲＫ Ｃ５３細胞中に観察される
基底の、および最大濃度のｈＰＴＨ−（１−３４）の存在下での平均レベルは、
それぞれ、ｃＡＭＰ蓄積について１２±４ｐモル／ウェル／１５分および２０７
±３７ｐモル／ウェル／１５分、ＩＰ₃形成について８９８±１４２ｃｐｍ／ウ
ェルおよび１９０８±２５１ｃｐｍ／ウェル、および結合について２５５２０±
１９０９ｃｐｍ／ウェルおよび９５６±１３５ｃｐｍ／ウェルであった。本明細
書に報告されるアッセイについてＨＫＲＫ Ｂ２８細胞中に観察される基底の、
および最大濃度のｈＰＴＨ−（１−３４）の存在下での平均レベルでは、それぞ
れ、ｃＡＭＰ蓄積について１．６±０．５ｐモル／ウェル／１５分および３３７
±５５ｐモル／ウェル／１５分、ならびに結合について１４９７±１２１ｃｐｍ
／ウェルおよび１６，１３７±９１９ｃｐｍ／ウェルであった。本明細書に報告
されるアッセイについてＨＰＲ２−７細胞中に観察される基底の、および最大濃
度のｈＰＴＨ−（１−３４）の存在下での平均レベルは、それぞれ、ｃＡＭＰ蓄
積について２．５±１．０ｐモル／ウェル／１５分および１３３±１４ｐモル／
ウェル／１５分、ならびに結合について１１５６±２４３ｃｐｍ／ウェルおよび
４５４１±３８６ｃｐｍ／ウェルであった。本明細書に報告されるアッセイにつ
いてＨＰＲ２−２２細胞中に観察される基底の、および最大濃度のｈＰＴＨ−（
１−３４）の存在下での平均レベルは、それぞれ、ｃＡＭＰ蓄積について５．２
±０．５ｐモル／ウェル／１５分および２８６±８ｐモル／ウェル／１５分、な
らびにＩＰ₃形成について３３５±６８ｃｐｍ／ウェル（基底）であった。

【０１１７】 （ペプチドおよび他のリガンド） 全ての試薬を、特に指定されない限りＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
から購入した。全てのアイソトープを、Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。ヒトＰＴＨペプチドを、Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｅ Ｕｎｉｔにおいて、Ｃ末端アミド化、および存在する場合に、天
然に存在するＰｈｅ³⁴へのＴｙｒ³⁴の置換によって合成した。［Ｔｙｒ⁰］ｈＰ
ＴＨ−（１−３４）はＳｉｇｍａ Ｃｏ．から購入した。¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21
］ラットＰＴＨ−（１−３４）を、以前に記載されたように（Ｂｒｉｎｇｈｕｒ
ｓｔ，Ｆ．Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：２０９０−２
０９８（１９９３）；Ｇｕｏ，Ｊ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（
９）：３８８４−３８９１（１９９５））ヨード化し、そして精製した。

【０１１８】 （結果） （Ｎ末端改変ｈＰＴＨアナログ） 本発明者らは、ヒトＰＴＨ−１およびＰＴＨ−２レセプターへの結合およびこ
れらのレセプターの活性化におけるＮ末端のＳｅｒ¹残基の、およびそのα−ア
ミノ基の役割に焦点を当てた。単離されたラット腎臓膜を用いた初期の研究は、
ｈＰＴＨ−（１−３４）のＳｅｒ¹へのＡｌａ¹の置換が、そのＡＣ活性を上昇す
るが、Ｇｌｙ¹の置換はｂＰＴＨ−（１−３４）によるＡＣ活性化を損なうこと
を示したので（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．，およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ
．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９７５））、
これらの１位の改変を、ｈＰＴＨ−（１−３４）の中に導入し、そして生じたペ
プチドを使用して、このｈＰＴＨ（１−３４）のＮ末端での改変の、試験される
種々の細胞株中に発現するこれら２つのレセプターに対する結合、およびこれら
のレセプターの活性に対する効果を比較した。サイクリックＡＭＰ蓄積の測定の
結果を、図１〜３に示した。

【０１１９】 図１は、ＨＫＲＫ Ｃ５３細胞中のサイクリックＡＭＰ蓄積の測定を示す。こ
れらは、１細胞当たり約１５０，０００の組換えｈＰＴＨ−１レセプターを安定
に発現する、ＬＬＣ−ＰＫ₁ブタ腎臓細胞である。データを、２つの濃度のペプ
チド（１０^-9Ｍおよび１０^-7Ｍ）について示す。Ａｌａ¹置換およびＧｌｙ¹置換
ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂分子は、本アッセイにおいてネイティブｈＰＴＨ（
１−３４）ＮＨ₂とほぼ同じ効果を有すると示され得るが、これらのデスアミノ
対応物は、活性が大きく減少され、特に１ｎＭ濃度において顕著である。このペ
プチドｈＰＴＨ（２−３４）は、ＰＴＨ−１レセプターを介する、同様に減少さ
れた活性を有する。

【０１２０】 図２は、ＳａＯＳ−２細胞中のｃＡＭＰの測定を示す。これらは、形質転換さ
れたヒト骨肉腫細胞で、これは比較的少ない（１細胞当たり１０，０００〜２０
，０００）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現することが知られている。図２に示
したように、［Ｇｌｙ¹］および［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂アナロ
グのシクラーゼ活性はまた、コントロールペプチドｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂
の活性に匹敵するが、ｈＰＴＨ（２−３４）のようなデスアミノアナログは、試
験した最も高い濃度（１μＭ）で、非常に弱いアゴニストである。

【０１２１】 ＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞においてなされるこれらの知見と対照的
に、図３は、１細胞あたり約２５０，０００の組換えヒトＰＴＨ−２レセプター
を発現する他のクローンＬＬＣ−ＰＫ₁細胞（ＨＰＲ２−７）に同じペプチドが
添加された場合の、この同じペプチドに対するｃＡＭＰ応答性を示す。デスアミ
ノ−［Ａｌａ¹］およびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ペプチドが、ｈＰＴＨ（１−３
４）ＮＨ₂、ｈＰＴＨ（２−３４）またはそれらの［Ａｌａ¹］および［Ｇｌｙ¹
］が置換された相当物と比較して増強した効力を示すことは、図３から明らかで
ある。さらに、デスアミノペプチドは、非常に高い濃度において（１μＭ）、実
質的により大きい最大のシクラーゼ活性を示す。

【０１２２】 ヒトＰＴＨ−（３−３４）は、げっ歯類ＰＴＨレセプターを介したＰＬＣ／Ｐ
ＫＣ−選択的ペプチドとして以前に特徴付けられた。（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９３６（１９９
６）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）
：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３０（１）：５３−６０（１９９２））しかし本研究者ら
は、このペプチドが、濃度１０００ｎＭの高さにおいてラットまたはヒトのＰＴ
ＨＲを発現するＨＫＲＫ Ｂ７細胞またはＣＯＳ−７細胞においてＰＬＣを活性
化しなかったことを認めた。（Ｔａｋａｓｕら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒ
ｅｓ．，印刷中）これらの結果は，ｈＰＴＨ−（１−３４）（Ｓｅｒ¹−Ｖａｌ² ）のＮ末端における最初の２アミノ酸が、ヒトＰＴＨＲを介してＰＬＣおよびＡ
Ｃの活性化に対して重要であることを示した。

【０１２３】 この分析を洗練させるため、本発明者らは初めに種々の細胞株におけるｈＰＴ
Ｈ−（２−３４）の特徴を研究した。図４および５に示すように、ｈＰＴＨ−（
２−３４）は、たとえＡＣのその活性化が、規模および感受性においてｈＰＴＨ
−（１−３４）の活性化と比較可能であったとしても、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞にお
いてＰＬＣ活性を誘発しなかった。さらに、図６で示されるように、ＰＴＨ（２
−３４）はまた、ＰＴＨ（１−３４）が結合するのと同様にｈＰＴＨレセプター
に対して結合する。同様の結果が、ヒトＰＴＨＲを十分に発現するＣＯＳ−７細
胞を用いて得られた（データには示さない）。ｈＰＴＨ−（２−３４）がヒトＰ
ＴＨ−１レセプターを介してＰＬＣを活性化できないことは、一過性にヒトＰＴ
ＨＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３ヒト胎児腎臓細胞を用
いることにより十分に相同な系において確認された（データには示さない）。

【０１２４】 本発明者らは次に、ＰＴＨ（１−３４）の最Ｎ末端アミノ酸の、ＰＬＣ／ＰＫ
Ｃ経路の活性化における効果に焦点を当てた。図４は、１細胞当たり約１００万
ｈＰＴＨ−１レセプターを安定に発現するＬＬＣ−ＰＫ細胞（ＨＫＲＫ−Ｂ７）
に指示されたペプチドを最終濃度１０００ｎＭで添加した後の、ホスホリパーゼ
Ｃ（ＰＬＣ）の活性の測定を示す。図４に示すように、デスアミノ−［Ａｌａ¹
］およびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］化合物は、このレセプターを介したＰＬＣの
活性化を及ぼさないが、ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂および［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ
（１−３４）ＮＨ₂は、共に完全なアゴニストである。［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１
−３４）ＮＨ₂が置換換されたペプチドは、試験された濃度において、減少した
ＰＬＣ活性を示し（最大ｈＰＴＨ（１−３４）の約５０％）、そして従って、こ
のレセプターを経由したＰＬＣ活性化に対する部分的なアゴニストにすぎない。
デスアミノペプチドのようなヒトＰＴＨ（２−３４）は、このアッセイにおいて
不活性である。

【０１２５】 対照的に、図５に示されるのは、１細胞当たり１５０万の組換えｈＰＴＨ−２
レセプターを発現するＨＰＲ２−２２細胞における、これらのペプチドのホスホ
リパーゼＣ活性化の性質である。図に示されるように、どちらのデスアミノ−［
Ａｌａ¹］およびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチドも、試
験された濃度において（１，０００ｎＭ）、ホスホリパーゼＣの、ヒトＰＴＨ（
１−３４）ＮＨ₂が及ぼすよりもより大きな最大の活性化を及ぼす。ＰＴＨ−１
レセプターを介してデスアミノペプチドと類似した活性を有するヒトＰＴＨ（２
−３４）は、本アッセイ中で単に部分的なアゴニストとして示される。

【０１２６】 図６に示されるように、ＰＴＨ−２レセプターに対するデスアミノペプチドの
増強された効力は、そのレセプター（対ＰＴＨ−１レセプター）に対する、ｈＰ
ＴＨ（１−３４）と比較して、１０倍高い明確な結合親和性と関連付けられる。
図に示されるように、ｈＰＴＨ（１−３４）、ＨＰＴＨ（２−３４）およびデス
アミノペプチドは、１細胞当たり２８０，０００組換えヒトＰＴＨ−１レセプタ
ーを発現するＨＫＲＫ Ｂ２８細胞に結合した¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8.21］ｒＰＴＨ
（１−３４）放射リガンドの類似した競合の置換を示すが、デスアミノ化合物は
、ヒトＰＴＨ−２レセプターを発現するＨＰＲ２−７細胞からこの放射リガンド
を置換する場合に、１０倍を超えて強力である。

【０１２７】 （議論） これらの実施例中に示された知見は、ＰＴＨ−１およびＰＴＨ−２シグナル伝
達の構造的決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の現在のモデルのいくつかの重
要な局面が再検討されることを必要とする。内因性ＰＴＨＲを発現するげっ歯類
およびオポサムの細胞を用いて以前行なわれた研究は、ＰＴＨ−（３−３４）の
ようなＮ短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＰＴＨアナログが、ＡＣ活性を欠くが、
それにもかかわらずいくつかの系（Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６３：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ
，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（
１９９１）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
６（３）：１２６７−１２７５（１９９５））において（しかし、他は活性化し
ない（Ｒｅｉｄ，Ｉ．Ｒ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５３（１第１部）
：Ｅ４５−５１（１９８７）；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：１３５２−１３５８（１９８９）
））強力にＰＫＣおよびＣａ_i ⁺⁺一過性を活性化し得ることを示した。Ｎ短縮化
およびＣ短縮化ｈＰＴＨ−（１−３４）アナログのＰＫＣ活性化特性の詳細な解
析は、配列ｈＰＴＨ−（２９−３２）が重要な「ＰＫＣ活性化ドメイン」を表す
という結論を導いた（Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅ
ｒ．Ｒｅｓ．，９（６）：９４３−９４９（１９９４）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ
，Ｈ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２
）；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｆ．，およびＭｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１６（１１）：３８２−３８６（１９９５））。

【０１２８】 ＰＴＨ−１レセプターおよびＰＴＨ−２レセプターがＰＴＨリガンドの同じ構
造特徴を認識するか否かを決定するために、本研究者らは、ｈＰＴＨ（１−３４
）のＮ末端改変のこれら２つのレセプターに対する結合およびその活性化に対す
る影響を比較した。ヒトＰＴＨ−１レセプターを安定に発現したクローンＬＬＣ
−ＰＫ１細胞対ヒトＰＴＨ−２レセプターを安定に発現したクローンＬＬＣ−Ｐ
Ｋ１細胞の間の比較において、ｈＰＴＨ（１−３４）は、それぞれ、ＡＣの濃度
依存活性化（１ｎＭのＥＣ５０）を誘発した。ヒトＰＴＨ（２−３４）は、両方
のレセプターを介してもより低い活性（１０倍以下）であった。ｈＰＴＨ（１−
３４）のＮ末端Ｓｅｒ残基に対するＡｌａまたはＧｌｙの置換は、１細胞当たり
１５０，０００（ＨＫＲＫ Ｃ５３）または１０，０００〜２０，０００（Ｓａ
ＯＳ）のいずれかのヒトＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞において試験した
場合、どちらのレセプターを介してもＡＣ活性化を変化させなかった。デスアミ
ノ−［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）またはデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ
（１−３４）を産生するためのα−アミノ基の除去は、ヒトＰＴＨ−１レセプタ
ーを介したＡＣ活性を１０倍減少する。著しい対照において、本研究者らは、こ
れらのデスアミノペプチドが、大いに増強された効力を伴ってヒトＰＴＨ−２レ
セプターを活性化することを見出した：両方に関するＥＣ５０は、３倍低く（３
０ｎＭに対して１０ｎＭ）、そして最大応答はｈＰＴＨ（１−３４）で見られる
応答の２倍であった。

【０１２９】 ｂＰＴＨ−（２−３４），ｈＰＴＨ−（２−３８）およびデスアミノＰＴＨ−
（１−３４）を含むアミノ短縮化アナログは、以前、インビトロで試験されたと
き、弱いＡＣ活性のみ示すことが見出された（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｆ
ｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：２９−
３６（１９９２）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．，およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，
Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：５６１−５６７（１９７５）
；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）：１
１７９−１１８９（１９９４））が、本研究者らは、ｈＰＴＨ−（２−３４），
デスアミノ−［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ−（１−３４）およびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹ ］ｈＰＴＨ−（１−３４）が、ｈＰＴＨ−（１−３４）とおよそ等しく強力であ
ることを見出した。このＡＣ活性化における相違は、骨肉腫細胞または以前の研
究で使用された部分的に精製された膜によるよりも、ＨＫＲＫ Ｂ７細胞によっ
て発現されたはるかに多数のヒトＰＴＨ−１レセプターによっておそらく説明さ
れる（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）
：３０３２−３０３９（１９９１）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：２９−３６（１９９２）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ
．Ｗ．，およびＰｏｔｔｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．２：５６１−５６７（１９７５）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎ
ｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）：１１７９−１１８９（１９９４））。

【０１３０】 ＨＫＲＫ Ｂ７細胞はまた、ヒトＰＴＨＲを介したＰＬＣシグナル伝達の構造
的基本の分析を最適化するためにこれらの研究に対して選択され、ヒトＰＴＨＲ
は、高レベルのレセプター発現を必要とする（Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ １３６（９）：３８８４−３８９１（１９９５）；Ｐｉｎｅｓ，
Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５（４）：１７１３−１７１６（１
９９４））。これらのＮ短縮化ペプチドが、ヒトＰＴＨＲを少なく発現する（す
なわち、１細胞当たり１００，０００〜３００，０００）他のＬＬＣ−ＰＫＩサ
ブクローンと共に試験された場合、それらのＡＣ応答は、ｈＰＴＨ−（１−３４
）と比較して１０倍程度に確かに減少された（データには示さない）。一方、そ
のようなＮ短縮化ＰＴＨアナログのインビボの研究は、インビトロにおいてＡＣ
活性の測定から予想されるよりも、より大きい生物学的効力（ｂｉｏｐｏｔｅｎ
ｃｙ）を示した（Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
９３：１３４９−１３５３（１９７３）；Ｈｉｌｌｉｋｅｒ，Ｓ．ら、Ｂｏｎｅ
１９：４６９−４７７（１９９６））。さらに、インビボにおいて関連する標
的細胞により発現するＰＴＨ−１レセプターの実際の数は、不確かなままである
が、本明細書の研究の範囲の中であり得る（Ｓｈｕｋｕｎａｒｎｉ，Ｃ．ら，Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３３（２）：４５７−４６８（１９９６）；Ｂｏｓ，
Ｍ．Ｐ．ら，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．５８（２）９５−１
００（１９９６））。

【０１３１】 異種的にＣＯＳ−７細胞またはＨＥＫ−２９３細胞に発現された組換えヒトＰ
ＴＨＲを経由した、ＰＬＣ活性化またはＣａ_i ⁺⁺シグナル伝達に対するｈＰＴＨ
−（１−３４）またはＰＴＨ−（３−３４）の効果に関する以前の研究は、相い
れない知見を生み出した（Ｐｉｎｅｓ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ １８（４）：３８１
−３８９（１９９６）；Ｓｅｕｗｅｎ，Ｋ．ら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１
１４（８）：１６１３−１６２０（１９９５）；Ｊｏｂｅｒｔ，Ａ．−Ｓ．ら，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（１２）：５２８２−５２９２（１９９７
）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１（２）：２８１
−２８５（１９９４））。しかし、（Ｎ末端が短縮化されたＰＴＨアナログは、
他の系のＰＫＣおよびＣａ_i ⁺⁺の活性化を誘発するという）数多くの観察のため
に（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４
９３１−１４９３６（１９９６）；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６３：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ
，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（
１９９１）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０
（１）：２９−３６（１９９２）；Ｊａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９（１９９３）；Ｊｏｕｉｓｈｏｍｍｅ，Ｈ
．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（１）：５３−６０（１９９２）；
Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１（３）：１１０５−１１１０（１９９０）；Ｃｏｌ
ｅ，Ｊ．Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２９：２９８１−２９８９
（１９８８）；Ｒｉｘｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．
９（８）：１１７９−１１８９（１９９４））ｈＰＴＨ−（１−３４）の１位に
おける遊離αアミノ基が、ヒトＰＴＨ−１レセプターを経由したＰＬＣ活性化に
絶対に必要であるという本研究者らの知見は、全く予想外であった。実際に、本
研究者らのデータは、ＰＴＨ−１レセプターを経由したＰＬＣ活性化でさえも、
そのようなわずかなＮ末端改変に対してＡＣよりも感受性であり、そしてｈＰＴ
Ｈ−（１−３４）の段階的なＣ末端短縮化の結果と対照的に（データには示さな
い）、これらのアナログのＰＬＣ効力における減少が、より低い結合親和性に起
因し得ないことを示す。これは、ｈＰＴＨ−（１−３４）のＮ最末端は、ヒトＰ
ＴＨ−１レセプターを経由したＰＬＣシグナル伝達に対する真の「活性化ドメイ
ン」を構成することを示唆する。本発明者らは、ラットＵＭＲ １０６−０１骨
肉種細胞においてＮ短縮化ペプチドのｂＰＴＨ−（２−３４）およびｂＰＴＨ−
（３−３４）によるＰＬＣの活性化が他の研究者らにより以前に報告されたこと
を述べなければならない（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ａ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ １２８（６）：３０３２−３０３９（１９９１）。この矛盾に対する説明
は、種の違い（細胞およびリガンドにおいて）、またはＰＬＣ共役ＰＴＨレセプ
ターの代替の種のＵＭＲ骨肉種細胞による可能性のある発現であり得、その存在
は、内因性ＰＴＨ−１レセプターもまた発現するラット骨肉腫細胞において除外
され得ない（Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｅｍ
ａｔ．４９（２）：１２０−１２３（１９９１）；Ｉｎｏｍａｔａ，Ｎ．ら，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（１１）：４７３２−４７４０（１９９５）
。クローン化ヒトＰＴＨ−１レセプターを経由したＰＬＣ活性化に対して本明細
書中で研究されるＮ短縮化ｈＰＴＨ−（１−３４）アナログの不全は、ブタ宿主
細胞に固有ではなかったが、これらの発見は、ＣＯＳ−７細胞および同種ヒト細
胞系の両方においても同様に確認された（データには示さない）。

【０１３２】 ｈＰＴＨ−（１−３４）ならびにＰＴＨ−１およびＰＴＨ−２レセプターの相
互作用に関するいくつかの主要な結論は、これらの実験の結果から引き出され得
る。第一に、ｈＰＴＨ−（１−３４）リガンドのインタクトなＮ末端が、ＰＴＨ
−１レセプターを経由したＰＬＣの効果的な活性化に対し不可欠であることは明
らかである。第二に、ｈＰＴＨのＮ末端は、ＰＴＨ−１レセプターを経由したＡ
ＣおよびＰＬＣの両方の活性化に対し重要ではあるが、これら２つのエフェクタ
ーを活性化する際のリガンドのＮ末端内にある特異的構造特徴の役割は、異なる
。特に、本発明者らは、ＰＬＣ活性化は、ＡＣ応答よりもＮ末端の構造（すなわ
ち、Ｎ末端アミノ酸の同一性およびＮ末端αアミノ基の存在の両方）に対して非
常により感受性であることを見出した。このＡＣ応答は、ＰＬＣとは異なり１位
のアミノ酸の非存在下でさえ正常に起こり得る。本発明者らは以前に、ＰＴＨレ
セプターにおける変異を介したそのようなシグナル伝達選択性を達成した（ＤＳ
ＥＬに対する細胞内ループ２の中のＥＫＫＹ配列を変化させることによる：Ｉｉ
ｄａ−Ｋｌｅｉｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１１）：６８８
２−６８８９（１９９７））が、野生型レセプターを介して活性である、高度に
シグナル選択的なリガンドもまた設計され得ることは、今や明らかである。

【０１３３】 さらに、これらの研究におけるデスアミノペプチドが、ＰＴＨ−１レセプター
を経由してＰＬＣを活性化しなかったが、１０００ｎＭのｈＰＴＨ（１−３４）
を用いて観察される最大の応答よりも５０％より大きいレベルでＰＴＨ−２レセ
プターを介してＰＬＣを刺激したので、本発明者らは、ヒトＰＴＨ−１レセプタ
ーおよびヒトＰＴＨ−２レセプターは、ｈＰＴＨリガンドのＮ末端での重要な構
造的特徴のそれらの認識が異なると結論付ける。さらに、アミノ末端が改変され
たｈＰＴＨペプチドで観察された増大されたシグナル伝達および結合と共に、匹
敵するレセプター発現での細胞におけるＰＴＨ−２対ＰＴＨ−１レセプターを経
由するＡＣ活性化についてのｈＰＴＨ（１−３４）の大きく減少された効力は、
ＰＴＨが、ＰＴＨ−２に対して天然のリガンドであり得ないことを示唆する。

【０１３４】 もちろん、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター発現の生理的なレベルがインビ
ボの関連する標的細胞において規定されるまで、ＰＴＨアナログまたはこれらの
高感受性インビボ系を用いて得られた模擬化合物のＡＣ活性の推定は、慎重に解
釈されなければならない。同時に、そのような系は、弱いヒトＰＴＨ−１／ＰＴ
Ｈ−２レセプターアゴニストの同定ならびに結合に関与するリガンドの基本的な
構造特徴およびこのレセプターによる複数の並行するシグナル伝達の定義のため
の、重要な利点を提供するようである。

【０１３５】 インビトロおよびインビボにおけるこれらのアナログの特性の慎重な分析は、
ＰＴＨ作用におけるＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプター依存ＰＬＣ活性化の役割
を明確にすることを補助するはずであり、そして他のシグナル選択的ｈＰＴＨア
ナログの開発に対してさらなる方向を提供する。

【０１３６】 インビボにおけるＰＴＨの生理的または薬理学的な作用に対するこれら種々の
活性化ドメインの重要性をさらに明らかにすることは、ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２
レセプター媒介ＡＣシグナル伝達、およびＰＬＣシグナル伝達によって活性化さ
れる重要な細胞の経路の役割のさらなる規定を必要とする。これらの問題は今や
、本明細書中に記載されるＮ末端が改変されたＰＴＨアナログの生物学的作用を
、ＰＬＣではなくＰＫＣ活性化を誘発する、他のものによって記載されるＮ末端
が短くされたＰＴＨアナログの生物学的作用（Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１−１４９３６（１９９６）；Ｊ
ａｎｕｌｉｓ，Ｍ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：７１３−７１９
（１９９３）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３
６（３）：１２６７−１２７５（１９９５）；Ｒｉｘｏｎ．Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂ
ｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）：１１７９−１１８９（１９９４））と
比較することにより、より明確に取り組まれ得る。例えば、本発明者らは以前、
（ラットＰＴＨＲの第２細胞内ループ中の変異を経由する）ＰＴＨ−（１−３４
）に対するＰＬＣ応答の選択的除去は、特定の下流の生物学的応答（例えば、Ｌ
ＬＣ−ＰＫ１細胞中のナトリウム依存的リン酸輸送（Ｉｉｄａ−Ｋｌｅｉｎ，Ａ
．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１１）：６８８２−６８８９（１９９
７））および増殖プレート軟骨細胞によるインターロイキン６の産生（未公表の
データ））をブロックする。野生型ＰＴＨ−１／ＰＴＨ−２レセプターを経由し
たレセプター特異的選択的シグナル伝達を有する新規リガンドのアベイラビリテ
ィーは、今や、インビトロにおける重要な問題に取り組むための補完的なアプロ
ーチを提供する。最終的に、インビトロの試験とインビボにおけるアナログ活性
の研究との慎重な相関が、これら別々のレセプターに特異的なシグナルの生理的
役割を分析し、そして十分に規定するために必要とされる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１．ＨＫＲＫ Ｃ５３細胞におけるサイクリックＡＭＰ蓄積の測定。これら
は、１細胞あたり約１５０，０００の組換えｈＰＴＨ−１レセプターを安定に発
現する、ＬＬＣ−ＰＫ₁ブタ腎臓細胞である。データは、ペプチドの２つの濃度
（１０^-9Ｍ（白四角）および１０^-7Ｍ（黒四角））を表す。Ａｌａ¹置換ｈＰＴ
Ｈ（１−３４）ＮＨ₂分子およびＧｌｙ¹置換ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂分子が
、このアッセイにおいて、ネイティブｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂が有するのと
ほとんど同じ効力を有するが、一方これらデスアミノ対応物は大きく減少された
活性を有し、特に１ｎＭ濃度において注目すべきであることが、理解され得る。
ペプチドｈＰＴＨ（２−３４）は、ＰＴＨ−１レセプターを介して同様に減少し
た活性を有する。

【図２】 図２．ＳａＯＳ−２細胞中のｃＡＭＰの測定。これらは、形質転換されたヒト
骨肉腫細胞であり、これは比較的少ない（１細胞当たり１０，０００〜２０，０
００）ヒトＰＴＨ−１レセプターを発現することが知られている。この図に示し
たように、［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂（黒菱形）および［Ａｌａ¹
］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂（黒四角）アナログのシクラーゼ活性はまた、コ
ントロールペプチドであるｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（黒丸）の活性に匹敵
するが、一方、ｈＰＴＨ（２−３４）ペプチドのようなデスアミノ−［Ａｌａ¹
］（白四角）ペプチドおよびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］（白菱形）ペプチドは、
非常に高い濃度（すなわち、μＭ）であっても最少の活性を表す。

【図３】 図３．クローンＬＬＣ−ＰＫ₁細胞（ＨＰＲ２−７）中のｃＡＭＰ測定。クロ
ーンＬＬＣ−ＰＫ₁細胞（ＨＰＲ２−７）は、１細胞あたり約２５０，０００の
組換えヒトＰＴＨ−２レセプターを発現する。デスアミノ［Ａｌａ¹］−（白四
角）ペプチドおよびデスアミノ−［Ｇｌｙ¹］（白菱形）ペプチドは、ｈＰＴＨ
（１−３４）ＮＨ₂（黒丸）、ｈＰＴＨ（２−３４）（白丸）またはそれらの［
Ａｌａ¹］（黒四角）置換対応物および［Ｇｌｙ¹］（黒菱形）置換対応物と比較
して増強した効力を表す。デスアミノペプチドは、非常に高い濃度（１μＭ）に
おいて、実質的により大きい最大のシクラーゼ活性を示した。

【図４】 図４．１細胞当たり約１００万のヒトＰＴＨ−１レセプターを安定に発現する
ＬＬＣ−ＰＫ細胞（ＨＫＲＫ−Ｂ７）中の、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性の
測定。デスアミノ［Ａｌａ¹］およびデスアミノ［Ｇｌｙ¹］化合物は、このレセ
プターを介したＰＬＣの活性化を及ぼさないが、一方、ｈＰＴＨ（１−３４）Ｎ
Ｈ₂および［Ａｌａ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂は、完全なアゴニストである
。［Ｇｌｙ¹］ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂およびｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂は
、１型ｈＰＴＨレセプターを経由したＰＬＣ活性化に対する、単に部分的なアゴ
ニストである。デスアミノペプチドのようなヒトＰＴＨ（２−３４）は、このア
ッセイにおいて不活性である（１０００ｎＭ濃度）。

【図５】 図５．１細胞当たり１５０万の組換えヒトＰＴＨ−２レセプターを発現する細
胞（ＨＰＲ２−２２）中の、これらのペプチドのホスホリパーゼＣ活性化プロフ
ィール。この図に示されるように、どちらのデスアミノペプチドも、試験された
濃度（１，０００ｎＭ）で、ヒトＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂がするよりも、ホス
ホリパーゼＣのより大きな最大の活性化を及ぼす。ＰＴＨ−１レセプターを介し
てデスアミノペプチドと類似した活性を有するヒトＰＴＨ（２−３４）は、本ア
ッセイ中で単に部分的なアゴニストであると示される。

【図６】 図６．ｈＰＴＨアナログの放射リガンド結合。ＰＴＨ−２レセプターに対する
デスアミノペプチドの増強された潜在力は、そのレセプター（対ＰＴＨ−１レセ
プター）に対する、ｈＰＴＨ（１−３４）に関連した１０倍高い明確な結合親和
性と関連する。この図に示されるように、ｈＰＴＨ（１−３４）（黒丸）、ＨＰ
ＴＨ（２−３４）（白丸）およびデスアミノペプチドは、細胞当たり２８０，０
００の組換えＰＴＨ−１レセプターを発現するＨＫＲＫ Ｂ２８細胞に対する^{12 5} Ｉ−［Ｎｌｅ^8.21］ｒＰＴＨ（１−３４）放射リガンド結合の類似した競合置
換を示すが、一方、デスアミノ化合物は、ヒトＰＴＨ−２レセプターを発現する
ＨＰＲ２−７細胞からこの放射リガンドを置換する際に、１０倍潜在力が高い。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/635 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/635 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 高須 尚 静岡県三島市徳倉１−13−17 ビー303 (72)発明者 ガーデラ， トーマス ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02492， ニードハム， グリーンデイル アベニュー 1045 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA01 CA04 CA07 CA11 DA02 DA05 DA11 DA12 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG15 CA01 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA79X AA90X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA19 BA23 BA35 CA18 CA53 CA56 CA59 CA62 DB32 MA02 MA55 MA59 MA66 NA13 NA14 ZA962 ZA972 4H045 AA10 AA20 AA30 BA18 BA41 CA40 DA30 EA20 FA72 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的に活性なペプチドであって、以下の式： （ａ） 【化１】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
   含む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になるペプチドに少なくとも９０％同一であり、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
   、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
   スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、生物学的に活性なペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 生物学的に活性なペプチドであって、以下の式： （ａ） 【化２】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
   含む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になり、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
   、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
   スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、生物学的に活性なペプチ
   ド。
3. 【請求項３】 以下： 【化３】 である、請求項１に記載のペプチド。
4. 【請求項４】 以下： 【化４】 である、請求項１に記載のペプチド。
5. 【請求項５】 放射性標識、蛍光標識、生物発光標識、または化学発光標識
   からなる群より選択される標識で標識される、請求項１に記載のペプチド。
6. 【請求項６】 前記放射性標識が^99mＴｃである、請求項５に記載のペプチ
   ド。
7. 【請求項７】 薬学的組成物であって、以下： （ａ）以下の式： 【化５】 から本質的になるペプチドに少なくとも９０％同一の、生物学的に活性なペプチ
   ド； （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
   む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含み、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙである
   、薬学的組成物。
8. 【請求項８】 薬学的組成物であって、以下： （ａ）以下の式： 【化６】 から本質的になる、生物学的に活性なペプチド； （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
   む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含み、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙである
   、薬学的組成物。
9. 【請求項９】 核酸分子であって、以下： （ａ） 【化７】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
   む、そのフラグメント； からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドをコ
   ードするポリヌクレオチドから本質的になり、 ここで： Ｘ₀₁が、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
   、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
   スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、核酸分子。
10. 【請求項１０】 組換えＤＮＡ分子であって、（１）発現制御領域を含み、
    該領域は、（２）生物学的に活性なペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
    と作動可能に連結されており、ここで該ペプチドは、以下： （ａ） 【化８】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２または１〜３３を含
    む、そのフラグメント； からなる群より選択され、 ここで： Ｘ₀₁が、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
    、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
    スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、組換えＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 生物学的に活性なペプチドを調製する方法であって、請求
    項１０に記載の組換えＤＮＡ分子を宿主中に導入する工程、および該分子の発現
    を引き起こす工程を包含する、方法。
12. 【請求項１２】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項９
    に記載の核酸分子をベクター中に挿入する工程を包含する、方法。
13. 【請求項１３】 前記制御領域が細菌プロモーター、ウイルスプロモーター
    、真菌プロモーターまたは哺乳動物プロモーターを含む、請求項１０に記載の組
    換えＤＮＡ分子。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、宿主細胞。
15. 【請求項１５】 原核生物である、請求項１４に記載の細胞。
16. 【請求項１６】 細菌である、請求項１５に記載の細胞。
17. 【請求項１７】 真核生物である、請求項１４に記載の細胞。
18. 【請求項１８】 酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の
    細胞。
19. 【請求項１９】 骨量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態
    を処置するための方法であって、該方法は、該処置を必要とする被験体に、骨量
    増加に有効な量の生物学的に活性なペプチドならびに薬学的に受容可能なキャリ
    アを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドが、： （ａ） 【化９】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
    含む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になる群から選択されるメンバーに少なくとも９０％同一なアミノ酸
    配列を含み、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
    、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
    スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、方法。
20. 【請求項２０】 骨量における減少によって特徴付けられる哺乳動物の状態
    を処置するための方法であって、該方法は、該処置を必要とする被験体に、以下
    の式： （ａ） 【化１０】 （ｂ）アミノ酸１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、または１〜３３を
    含む、そのフラグメント； （ｃ）これらの薬学的に受容可能な塩；あるいは （ｄ）これらのＮ誘導体またはＣ誘導体； から本質的になる骨量増加に有効な量の生物学的に活性なペプチド、ならびに薬
    学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含し、 ここで： Ｘ₀₁は、デスアミノＳｅｒ、デスアミノＡｌａまたはデスアミノＧｌｙであり
    、ただし該ペプチドが、デスアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂またはデ
    スアミノＳｅｒ¹ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂ではない、方法。
21. 【請求項２１】 骨の再形成、骨吸収および／または骨リモデリングの速度
    を決定するための方法であって、有効な量の請求項４に記載のペプチドを患者に
    投与する工程、ならびに該患者の骨への該ペプチドの取り込みを決定する工程を
    包含する、方法。
22. 【請求項２２】 前記骨量増加に有効な量の前記ペプチドが、該ペプチドを
    コードするＤＮＡを前記患者に提供しそしてインビボで該ペプチドを発現させる
    ことによって投与される、請求項１９に記載の方法。
23. 【請求項２３】 処置されるべき前記状態が骨粗鬆症である、請求項１９に
    記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記骨粗鬆症が老齢骨粗鬆症である、請求項２３に記載の
    方法。
25. 【請求項２５】 前記骨粗鬆症が閉経後骨粗鬆症である、請求項２３に記載
    の方法。
26. 【請求項２６】 前記骨量増加に有効な量の前記ペプチドが、一日あたり約
    ０．０１μｇ／ｋｇ〜一日あたり約１．０μｇ／ｋｇである、請求項１９に記載
    の方法。
27. 【請求項２７】 前記投与方法が非経口的である、請求項１９に記載の方法
    。
28. 【請求項２８】 前記投与方法が皮下的である、請求項１９に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記投与方法が経鼻吸入法である、請求項１９に記載の方
    法。