JP2002534081A - Ｐｔｈレセプターおよびそれを使用するスクリーニングアッセイ - Google Patents

Ｐｔｈレセプターおよびそれを使用するスクリーニングアッセイ

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JP2002534081A JP2000592396A JP2000592396A JP2002534081A JP 2002534081 A JP2002534081 A JP 2002534081A JP 2000592396 A JP2000592396 A JP 2000592396A JP 2000592396 A JP2000592396 A JP 2000592396A JP 2002534081 A JP2002534081 A JP 2002534081A
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ヘンリー エム． クローネンバーグ，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なＰＴＨレセプターポリペプチドであるｒδＮｔを提供し、このｒδＮｔは、そのレセプターの細胞外アミノ末端のリガンド結合ドメインの欠失によって特徴付けられる。さらに、このレセプターをコードする核酸分子が開示される。このレセプターは、リガンド結合のための最少のドメインを有し、ＰＴＨレセプター活性のアゴニストおよびアンタゴニストの同定のために設計されるスクリーニングアッセイにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （連邦政府の援助による研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関
する陳述） 本発明の開発中になされた研究の一部は、米国政府資金を利用した。米国政府
は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、分子生物学、発生生物学、生理学、神経生物学、内分泌学および医
学の分野に関連する。
【０００３】 （関連技術） ＰＴＨは、血液カルシウムレベルの主な調節因子であり、そして骨および腎臓
細胞上のＰＴＨ−１レセプターへの結合を介して、この作用を媒介する（Ｋｒｏ
ｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈ．Ｍ．ら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ」Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ（１９９３））。このレセプターはまた、ＰＴＨ関連ペプチドに
応答する。このペプチドは、胚の骨発生において役割を果たし、そして悪性疾患
の高カルシウム血症の原因因子である、因子である（Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７３：６６３〜６６６（１９９６））。ＰＴＨペプチドおよび
ＰＴＨｒＰペプチドは、骨に対して強力な同化効果を有することが示されており
、従って、ＰＴＨ−１レセプターアンタゴニストが、代謝性骨疾患（例えば、骨
粗鬆症）を処置するために最終的に使用され得ることが、可能である（Ｄｅｍｐ
ｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．１４（６）：６０９〜７０９（
１９９４））。
【０００４】 完全に生物活性なＰＴＨ（１〜３４）ペプチドにおいて、レセプター結合親和
性の主要な決定基は、アミノ酸１５〜３４の中にある（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．
Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３〜１０１８７（１９８０
）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５
）２０２４〜２０３０（１９９３）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：８３〜８７（１９９０）；Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒ
ａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５〜２２１７（
１９８９））。これらは、種々の種由来のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰ間で、中程度
に保存されている（Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７（４８１７
）：８９３〜８９６（１９８７））。レセプター活性化の決定基は、より厳密に
保存されたアミノ末端残基内に存在し、そしてこれらの残基の欠失によって、競
合ＰＴＨ−１レセプターアンタゴニストが生じる（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：１０５３〜１０５５（１９８３）；Ｎｕｔｔ，Ｒ．Ｆ
．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：４９１〜４９３（１９９０））。
ＰＴＨ（１〜２７）よりも長さが短いアミノ末端ＰＴＨフラグメントまたはアミ
ノ末端ＰＴＨｒＰフラグメントは、以前には、生物学的に活性であると見出され
ていない（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕ
ａｌ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１１：５３〜８４（１９８
１）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１
４９３１〜１４９３６（１９９６）；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９〜１３５３（１９７３））が、このアミノ末
端残基の機能の重要性および進化的保存によって、これらの残基がこのレセプタ
ーと相互作用することが予測される。
【０００５】 このＰＴＨ−１レセプターは、アデニリルシクラーゼ／プロテインキナーゼＡ
シグナル伝達経路に強力につながり、そしていくつかの状況においては、ホスホ
リパーゼＣ／プロテインキナーゼＣおよび細胞内カルシウムにより媒介される経
路を含む、他の経路につながる（Ａｂｏｕｔ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：２５４７〜２５５４（１９９１）；Ｊｕｅｐｐ
ｅｒ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４〜１０２６（１９９１）；Ｇ
ｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４〜３８９１（１
９９５）；Ｈｒｕｓｋａ，Ｋ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：２
３０〜２３９（１９８７）；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３：１３５２２〜１３５２７（１９８８））。ＰＴＨ−１レセプター
は、ファミリーＢサブグループのＧタンパク質結合レセプターのメンバーであり
、これはまた、カルシトニンおよびセクレチンのレセプターも含む（Ｋｏｌａｋ
ｏｗｓｋｉ，Ｌ．Ｆ．「ＧＣＲＤｂ：Ａ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄａｔａｂｅｓｅ」Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｈａ
ｎｎｅｌｓ ２：１〜７（１９９４））。突然変異研究および架橋研究によって
、これらのレセプターの複数のドメインが、リガンド相互作用に寄与することが
示された。このドメインは、大きいアミノ末端細胞外ドメイン、細胞外ループお
よび膜貫通へリックスを含む（Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３４：８７９〜８８４（１９９４）；Ｌｅｅ，Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｅ
ｎｄｏ．９：１２６９〜１２７８（１９９５）；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂ
ｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１２（１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ １２１（１９９７）
；Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
９５：４９４１〜４９４６（１９９８）；Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３９４〜１４３９８（１９９５）；ＤｅＡｌｍｅ
ｉｄａ，Ｖ．およびＭａｙｏ．Ｋ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７５０〜７６５
（１９９８）；Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０〜１０
５７（１９９４）；Ｚｈｏｕ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：３６４４〜３６４９（１９９７）；Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４９８〜２２５０５（１９９８））。Ｐ
ＴＨ／カルシトニンキメラレセプターおよびハイブリッドリガンドを使用する研
究によって、このレセプターのアミノ末端細胞外ドメインがこのリガンドのカル
ボキシル末端結合ドメインを認識する一方で、７つの膜貫通へリックスおよび結
合ループを含むこのレセプターの「コア」領域がこのリガンドのアミノ末端シグ
ナル伝達部分を認識する、相互作用の一般的トポロジーが示唆されている（Ｂｅ
ｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６９〜２６４
７２（１９９６））。同様の結論が、より早期のレセプターキメラ研究（Ｊｕｅ
ｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：８７９〜８８４（
１９９４）；Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０〜１０５
７（１９９４）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３５：１１８６〜１１９４（１９９４））および光反応性ＰＴＨアナログを
用いた最近の架橋研究（Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７３：２２４９８〜２２５０５（１９９８）；Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｍ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６８９０〜１６８９６（１９９８））から誘
導された。
【０００６】 現在の研究において、本発明者らは、ドメインベースのアプローチを使用して
、ＰＴＨとＰＴＨ−１レセプターとの間の相互作用のシグナル伝達成分を調査し
ている。このアプローチは、短いアミノ末端ＰＴＨフラグメントアナログ、およ
びこのアミノ末端細胞外ドメインのほとんどを欠失しているＰＴＨレセプター変
異体を使用する。これらのより小さいリガンドおよびレセプターを用いて実施さ
れたｃＡＭＰシグナル伝達アッセイの結果は、ＰＴＨの保存的アミノ末端（Ｋｒ
ｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｍ．ら「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ」Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ（１９９３）；Ｌａｎｓｋｅ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３
：６６３〜６６６（１９９６）；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ
Ｒｅｖ．１４（６）：６９０〜７０９（１９９４）；Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．
Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３〜１０１８７（１９８０
）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５
）：２０２４〜２０３０（１９９３）；Ｍ．Ｐ．Ｃａｕｆｉｅｌｄら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：８３〜８７（１９９０）；Ａ．Ｂ．Ａｂｏｕ−Ｓ
ａｍｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５〜２２１７（１９
８９）；Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７（４８１７）：８９３
〜８９６（１９８７）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：
１０５３〜１０５５（１９８３）：Ｎｕｔｔ．Ｒ．Ｆ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １２７：４９１〜４９３（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｍ．
、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、１１：５３〜８４（１９８１）；Ａｚａｒａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１（２５）：１４９３１〜１４９３６（１９９６）；Ｔｒｅｇ
ｅａｒ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９３：１３４９〜１３５３
（１９７３）；Ａｂｏｕｔ−Ｓａｍｒａ，Ａ．Ｂ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ １２９：２５４７〜２５４４（１９９１））セグメントが、自律性シグナ
ル伝達ドメインとして機能すること、およびこのドメインが、このレセプターの
コア領域と相互作用することを、示す。
【０００７】 （発明の要旨） ＰＴＨは、血液カルシウムレベルの主な調節因子であり、そして骨および腎臓
細胞上のＰＴＨ−１レセプターへの結合を介して、この作用を媒介する。ＰＴＨ
−１レセプターアゴニストは、最終的には、代謝性骨疾患（例えば、骨粗鬆症）
を処置するために使用され得る。従って、ヒト疾患の処置のための、新規でかつ
改良された、ＰＴＨおよびＰＴＨレセプター試薬を開発する強力な必要性が、当
該分野に存在する。
【０００８】 第１の実施形態において、本発明は、細胞外アミノ末端リガンド結合ドメイン
の欠失により特徴付けられる、新規なＰＴＨ−１レセプターポリペプチドである
、ｒδＮｔを提供する。本発明はまた、このｒδＮｔレセプターポリペプチドを
コードする、核酸分子を提供する。
【０００９】 第２の実施形態において、本発明のｒδＮｔレセプターは、ＰＴＨレセプター
機能のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するように設計された、スクリー
ニング手順に有用である。本発明は、このｒδＮｔレセプターを発現する細胞を
用いて、ｃＡＭＰの蓄積または競合結合のいずれかを利用する、試験化合物の評
価のためのスクリーニングを提供する。
【００１０】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、ｒδＮｔレセプターポリペプチド（新規な変異体ＰＴＨ１Ｒレセプ
ターポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
を提供する。このｒδＮｔレセプターポリペプチドは、図１に示されるアミノ酸
配列（配列番号２）を有し、この配列は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定
することによって決定された。本発明のｒδＮｔタンパク質は、以前に同定され
た非変異体ＰＴＨ１Ｒ配列およびＰＴＨ２Ｒ配列と配列相同性を共有する。図１
に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｃＤＮＡクローン（ｒδＮｔ）
を配列決定することによって得られた。このクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｂｏｕｌｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０
−２２０９）に＿日に寄託され、そして受託番号＿を与えられた。
【００１１】 （１．ｒδＮｔレセプター） （ａ）核酸分子） そうでないと示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することに
より決定された全てのヌクレオチド配列は、手作業配列決定により決定され、そ
して本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列すべては、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された
。従って、このアプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野
において公知のように、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、い
くつかの誤りを含み得る。手作業の配列決定により決定されるヌクレオチド配列
は代表的に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少
なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。当該分野においてま
た公知のように、決定されたヌクレオチド配列中の、実際の配列と比較しての単
一の挿入または単一の欠失は、そのヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシ
フトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる
推定アミノ酸配列は、その配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされた
アミノ酸配列とは完全に異なり、これは、このような挿入または欠失の点で始ま
る。
【００１２】 本明細書中に提供される情報を使用して、例えば、図１のヌクレオチド配列（
ｒδＮｔポリペプチドをコードする本発明の核酸分子）は、それぞれ、標準的技
術を使用して、入手され得る。野生型ＰＴＨ１Ｒ配列の単離のためのクローニン
グ手順およびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてｍＲＮＡを使用して
ｃＤＮＡをクローニングするための手順）は、公知である。野生型レセプターを
クローニングした後に、この配列中に適切な欠失を、本明細書中に記載のように
作製し得る。本発明の例示として、図１に記載される核酸分子（配列番号１）は
、当該分野における標準的制限酵素消化技術およびクローニング技術を使用する
ことによって得られた。図１のｒδＮｔ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配
列（配列番号１）は、約２２アミノ酸残基の推定リーダー配列とともに、約４３
５アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む
。推定成熟ｒδＮｔレセプターのアミノ酸配列は、図１のアミノ酸残基約２３〜
残基約４３５に示される。図１に示されるｒδＮｔタンパク質（配列番号２）は
、ラットＰＴＨ１レセプターと約８４％同一である。
【００１３】 示されるように、本発明はまた、本発明のｒδＮｔレセプターの成熟形態を提
供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞により分泌されたタンパク質は、
シグナル配列または分泌リーダー配列を有し、この配列は、一旦成長するタンパ
ク質鎖の粗面小胞体を横切る輸送が開始されると、この成熟タンパク質から切断
される。大部分の哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえ、分泌タンパク質を同じ特
異性で切断する。しかし、いくつかの場合において、分泌タンパク質の切断は、
完全には均一でなく、このタンパク質に関して２つ以上の成熟種を生じる。さら
に、分泌タンパク質の切断特異性は、完全なタンパク質の一次構造により最終的
に決定されること、つまり、そのポリペプチドのアミノ酸配列において固有であ
ることが、長い間公知であった。従って、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号＿として
同定される宿主中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされ、そして図１
に示されるような、アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ｒδＮｔポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号＿として同定
される宿主中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を
有する成熟ｒδＮｔタンパク質によって、この寄託宿主中のベクターに含まれる
クローンのＤＮＡ配列によりコードされる完全オープンリーディングフレームの
、哺乳動物細胞（例えば、下記のような、ＣＯＳ細胞）における発現により産生
されるｒδＮｔレセプターの成熟形態が意味される。以下に示されるように、Ａ
ＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配
列を有する成熟ｒδＮｔレセプターは、図１に示される推定「成熟」ｒδＮｔタ
ンパク質（アミノ酸約２３〜約４３５）とは、推定切断の正確性に依存して、異
なるかもしれない、または異ならないかもしれない。
【００１４】 このリーダー配列について、タンパク質が分泌リーダーならびに切断点を有す
るか否かを推定するための方法は、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法およびｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９
０（１９８６））の方法が用いられ得る。これらの方法の各々について、公知の
哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定することの精度は、７５〜８０％の範囲
にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、この２つの方法は、所定のタ
ンパク質について同じ推定切断点を必ずしも生じない。計算的な方法は、コンピ
ュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」（Ｋ．ＮａｋａｉおよびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓ
ａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９９２））において見出され
得、それは、アミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞位置を推定するためのエキ
スパートシステムである。局在のこの計算的な推定の一部として、ＭｃＧｅｏｃ
ｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が援用される。
【００１５】 この場合では、本発明の完全なｒδＮｔポリペプチドの推定アミノ酸配列は、
構造的特性について、ラットｒδＮｔ配列に対する比較により分析された。この
分析は、図１（配列番号２）のアミノ酸２２とアミノ酸２３との間の推定切断部
位を提供した。従って、ｒδＮｔレセプタータンパク質についてのこのリーダー
配列は、図１におけるアミノ酸残基１〜２２（配列番号２におけるアミノ１〜２
２）からなると推定されるが、一方、推定成熟ｒδＮｔタンパク質は、残基２３
〜４３５（配列番号２におけるアミノ酸２３〜４３５）からなる。
【００１６】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に生成されることによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）であり得る。このＤＮＡ
は、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、コード鎖（センス鎖としても公知である）であり得、またはそれらは、非
コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。
【００１７】 しかし、当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性に起因して、寄託さ
れたｃＤＮＡによってコードされるｒδＮｔレセプターポリペプチドは、約４３
５アミノ酸を含むが、しかし概して４２５〜４３５アミノ酸の範囲であり得；そ
してこのタンパク質のリーダー配列は、約２２アミノ酸であるが、概して約１０
〜約３０アミノ酸の範囲であり得る。
【００１８】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に生成されることによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）であり得る。このＤＮＡ
は、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたは一本
鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても公知である）であり得、またはそれら
は、非コード鎖（アンチ鎖ともいわれる）であり得る。
【００１９】 「単離された」核酸分子は、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子
、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ
分子は、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子
のさらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中
の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分
子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む
。本発明に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されたそのような分子を
さらに含む。
【００２０】 本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含み；ＤＮＡ分子は、図１に示
されるｒδＮｔレセプター（配列番号２）に関するコード配列を含み；そして上
記の配列と実質的に異なる（しかしこれは、遺伝コードの縮重に起因する）配列
を含むＤＮＡ分子は、ｒδＮｔレセプターをなおコードする。もちろん、遺伝コ
ードは、当該分野で周知である。従って、そのように縮重した改変体を生成する
ことは、当業者にとって慣用的である。
【００２１】 別の局面では、本発明は、 にＡＴＣＣ寄託番号第 号として寄託されたプラ
スミドに含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するｒ
δＮｔポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは
、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟
ポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、ｒδＮｔポリペプチドまた
はＮ末端のメチオニンを欠くｒδＮｔポリペプチドをコードする核酸分子が、提
供される。本発明はまた、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する単離
された核酸分子、または上記の寄託されたクローンに含まれるｒδＮｔのｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸
分子を提供する。そのような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのイ
ンサイチュハイブリダイズゼーションにより、遺伝子地図のためのプローブとし
て、および例えば、ノーザンブロット分析によって、ヒト組織におけるｒδＮｔ
遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００２２】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、あるいは図１（配列番号
１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントは
、本明細書中で議論されるような診断的プローブおよびプライマーとして有用で
ある、長さが少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎ
ｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少
なくとも約４０ｎｔのフラグメントが意図される。もちろん、長さが約５０ｎｔ
〜１５５０ｎｔのより大きなフラグメント、およびより好ましくは、長さが少な
くとも約６００ｎｔのフラグメントもまた、本発明に従って有用であり、同様に
、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド
配列の、全てではなくとも、ほぼ対応するフラグメントも有用である。例えば、
長さが少なくとも２０ｎｔのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列由来の２０
以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。
【００２３】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：ｒ
δＮｔレセプター細胞外ドメイン（図１において約２３〜約１４７のアミノ酸残
基（または、配列番号２の約２３〜約１４７のアミノ酸残基）を構成することが
推定される）を含むポリペプチド；ｒδＮｔレセプター膜貫通ドメイン（図１に
おいて約１４８〜約４１６のアミノ酸残基（または、配列番号２の約１４８〜約
４１６のアミノ酸残基）を構成することが推定される）を含むポリペプチド；お
よび膜貫通ドメインの全てまたは一部が欠失した、ｒδＮｔレセプター細胞外ド
メインを含むポリペプチド。上記のようにリーダー配列を用いて、ｒδＮｔレセ
プター細胞外ドメインおよびｒδＮｔレセプター膜貫通ドメインを含むアミノ酸
残基が、推定された。従って、当業者が理解するように、これらのドメインを構
成しているアミノ酸残基は、各々のドメインを定義するために用いられる判定基
準に依存して、わずかに（例えば、約１〜約１５のアミノ酸残基）変化し得る。
【００２４】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、ｒδＮｔレセプタータンパク質の
エピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。当業者に公知であるように、
核酸配列は、その中でコードされるポリペプチド配列を推定するために使用され
得る。次いで、そのような情報は、この分析により同定される抗原決定基をコー
ドする、対応するポリヌクレオチド領域に関連すし得るポリペプチドにおいて、
抗原決定基を推定するために使用され得る。ポリペプチドの抗原決定基を推定す
るための方法は、当該分野で周知である。
【００２５】 ｒδＮｔタンパク質の他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方
法は、以下に詳細に記載される。
【００２６】 別の局面では、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄託番
号第 号または同第 号に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの
一部分に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、お
よび２０ｇ／ｍｌの変性、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃での
一晩のインキュベーション、続いて、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でそのフィ
ルターを洗浄することが、意図される。
【００２７】 ポリヌクレオチドの一「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、参
照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ま
しくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、
なおより好ましくは約３０〜約７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記に、そして以
下でより詳細に議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして有用で
ある。
【００２８】 「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの一部分は、例えば、参照
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは図１
（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）から、２０以上の連続する
ヌクレオチドが意図される。
【００２９】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるｒδＮｔレセ
プターｃＤＮＡの３’末端のポリ（Ａ）トラクト、またはＴ（もしくはＵ）残基
の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核
酸の一部分にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに
含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ
またはその相補体（例えば、実質的には、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含
む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
【００３０】 示されるように、ｒδＮｔポリペプチドをコードする本発明の核酸分子として
は、以下が挙げられる得が、これらに限定されない：単独で成熟ポリペプチドの
アミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペプチドおよびさらなる配列のコ
ード配列（例えば、アミノ酸リーダー配列または分泌配列（例えば、プレタンパ
ク質配列、もしくはプロタンパク質配列、またはプレプロタンパク質配列）をコ
ードする配列）；さらなる非コード配列（例えば、イントロンならびに非コード
５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、スプライシングおよびポリア
デニル化シグナル（例えば、リボソーム結合）を含むｍＲＮＡプロセシング、な
らびにｍＲＮＡの安定性において役割を果たす転写非翻訳配列を含むが、これら
に限定されない））と共に、上述のさらなるコード配列を伴うかまたは伴わない
、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる機能性を提供するアミノ酸のような
さらなるアミノ酸をコードする、さらなるコード配列。従って、このポリペプチ
ドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易
にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の、特定
の好ましい実施形態では、このマーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉ
ａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチ
ドであり、とりわけ、これらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９
８９）に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製
を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する、精製に有用な別のペプチドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）により記載されている。以下で議論す
るように、他のそのような融合タンパク質としては、アミノ末端またはＣ末端で
Ｆｃに融合したｒδＮｔレセプターが挙げられる。
【００３１】 本発明は、さらに、ｒδＮｔレセプターの部分、アナログまたは誘導体をコー
ドする本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然の対立遺伝子改変体
のように、天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」は、生物の染色体上の所定
の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態の１つを意図される。Ｇｅｎ
ｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変
異誘発技術を使用して、生成され得る。
【００３２】 このような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生成
される改変体が挙げられ、これは、１以上のヌクレオチドを含み得る。この改変
体は、コード領域、非コード領域、または両方において変化し得る。コード領域
における変化は、保存的アミノ酸置換、欠失もしくは付加、または非保存的アミ
ノ酸置換、欠失もしくは付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイ
レントな置換、付加および欠失であり、ｒδＮｔレセプターまたはその部分の性
質および活性を変化しない。また、この点に関して特に好ましいのは、保存的置
換である。
【００３３】 本発明のさらなる実施形態は、単離された核酸分子を含み、これは、以下と少
なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを含む：（ａ）推定リーダー配列を含む、配列
番号２における完全アミノ酸配列を有する全長ｒδＮｔポリペプチドをコードす
る、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するが、Ｎ
末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｃ）配
列番号２における約２３〜約４３５の位置のアミノ酸配列を有する成熟ｒδＮｔ
レセプター（リーダー配列が除去された全長ポリペプチド）をコードする、ヌク
レオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第 号に含まれるｃＤＮＡクローンによ
りコードされるリーダーを含む完全アミノ酸配列を有する全長ｒδＮｔポリペプ
チドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７８８３号
に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ｒδ
Ｎｔレセプターをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ｒδＮｔレセプター細
胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；（ｇ）ｒδＮｔレセプター膜貫
通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；（ｈ）膜貫通ドメインの全てまた
は一部が欠失したｒδＮｔレセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチ
ド配列；および（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ
）、または（ｈ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチ
ド配列。
【００３４】 ｒδＮｔポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例
えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、こ
のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ｒδＮｔレセプターをコードする参
照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つのまでの点変異を含み得
ることを除き、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して
同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９
５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照
配列中のヌクレオチドの５％までが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチド
で置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌク
レオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照配列中
のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群におい
てのいずれかに分散された、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置
か、またはこれらの末端位置の間のいずれの場合でも生じ得る。
【００３５】 実際問題として、任意の特定の核酸分子は、例えば、図１に示されるヌクレオ
チド配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対
して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否
かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登
録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラム
を用いて従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅ
ｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ
２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの
配列の間の相同性の最適セグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明に
よる参照配列に対して、９５％同一であるか否かを決定するためのＢｅｓｔｆｉ
ｔまたは任意の他の配列アラインメント（整列）プログラムを用いる場合、当然
ながら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出
されるように、そしてこの参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性
においてギャップが可能になるように、パラメーターを設定する。
【００３６】 本出願は、図１（配列番号１）に示される核酸配列に対して、または寄託され
たｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一である核酸分子（それらの核酸分子がｒδＮｔレセプター活性を
有するポリペプチドをコードするか否かにかかわらず）に関する。これは、特定
の核酸分子がｒδＮｔレセプター活性を有するポリペプチドをコードしない場合
でさえ、当業者は、核酸分子の使用方法、例えば、ハイブリダイゼーションプロ
ーブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用方法をなお
知っているからである。ｒδＮｔレセプター活性を有するポリペプチドをコード
しない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ以下：（１）ｃＤＮＡライブ
ラリー中のｒδＮｔレセプター遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離するこ
と；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載のような、ｒδＮｔレセプター遺伝子
の正確な染色体位置を提供するための中期染色体分裂へのインサイチュハイブリ
ダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；ならびに（３）特定の組織中でのｒ
δＮｔレセプターのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙
げられる。
【００３７】 しかし、図１（配列番号１）に示される核酸配列に対して、または寄託された
ｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％また
は９９％同一である配列を有する核酸分子（これは、実際にｒδＮｔレセプター
活性を有するポリペプチドをコードする）が好ましい。「ｒδＮｔレセプター活
性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイで測定して、本発明の
ｒδＮｔレセプターの活性に類似である（ただし同一である必要はない）活性を
示すポリペプチドを意図する。例えば、ｒδＮｔレセプター活性は、本明細書中
に記載のように、候補のｒδＮｔポリペプチドを発現する細胞に対する、標識し
たＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの競合結合実験を用いて測定され得る。
【００３８】 ｒδＮｔレセプター、またはそれらの改変体を発現する任意の細胞株は、実施
例３および４に記載のようにリガンド結合およびセカンドメッセンジャー活性化
をアッセイするために用いられ得る。当然ながら、遺伝コードの縮重に起因して
、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列、または図１（配列番号１）に示さ
れる核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「ｒδＮｔレセプター活性を有す
る」ポリペプチドをコードすることを、直ちに認識する。実際、これらのヌクレ
オチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードするので、これは、
上記の比較アッセイを実施せずとも当業者に明白である。縮重改変体でないこの
ような核酸分子について、合理的な数がまたｒδＮｔタンパク質活性を有するポ
リペプチドをコードすることが当該分野でさらに認識される。これは、タンパク
質機能にそれほど有意に影響しないか、または有意に影響するようではないかの
いずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族ア
ミノ酸での置換）を、当業者が十分認知しているためである。
【００３９】 例えば、表現型としてサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダン
スは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａ
ｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３０６〜１３１０（１９９０）（ここでは、著者らは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど耐性であることを示している）に提供される。
【００４０】 （ｂ）ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベ
クターで遺伝子操作した宿主細胞、および組換え技術によるｒδＮｔポリペプチ
ドまたはそれらのフラグメントの産生に関する。
【００４１】 このポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベク
ターに連結され得る。一般にプラスミドベクターは、沈殿（例えば、リン酸カル
シウム沈殿）または荷電脂質との複合体で導入される。このベクターがウイルス
である場合、これは適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケー
ジングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００４２】 このＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（２〜３例を挙げると、例えば
、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーターおよびｔｒｐプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プ
ロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）と作動可能に連結
されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。この発現
構築物はさらに転写開始部位、終止部位、および（転写領域中に）翻訳のための
リボソーム結合部位を含む。この構築物により発現される成熟転写物のコード部
分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドンおよび翻訳されるべきポリペプチドの
ほぼ末端に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００４３】 示されたとおり、この発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マー
カーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物培養細胞に対するジヒドロ
葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養のためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピ
シリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆
虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞およびＢｏｗｅｓ
黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記の
宿主細胞のための適切な培養培地および培養条件が当該分野で公知である。
【００４４】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およ
びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ
、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならび
にｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲ
ＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベ
クターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１および
ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ
、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。
他の適切なベクターは当業者に容易に明白である。
【００４５】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によ
りもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的実験マニュアル（例えば、
Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載されている。
【００４６】 このポリペプチドは、改変型（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そし
て分泌シグナルのみでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さら
なるアミノ酸（特に荷電したアミノ酸）の領域は、精製中または引き続く取り扱
いおよび貯蔵の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するためにポ
リペプチドのＮ末端に付加され得る。また、精製を容易にするために、ペプチド
部分が、このポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの
最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性
を改善するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部
分の付加は、当該分野で周知でかつ慣用的技術である。好ましい融合タンパク質
は、タンパク質を可溶化するために有用である、免疫グロブリン由来の異種領域
を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ４６４５３３（カナダ対応２０４５８６９）は、
別のヒトタンパク質またはその部分と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の種
々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦ
ｃ部分は、治療および診断における使用のために十分に利点があり、従って、例
えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ０２３２２６２）。一方
では、いくつかの用途のために、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発
現、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失し得ることが所望される。これは
、Ｆｃ部分が治療および診断における使用に対する障害であることが証明される
場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられるべきである
場合）である。薬物開発において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、ｈＩＬ５
−レセプター）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高性能スクリ
ーニングアッセイのためにＦｃ部分と融合された。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、第８巻：５
２〜５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７０巻、第１６号：
９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと。
【００４７】 ｒδＮｔレセプターは、周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精
製され得る。この方法としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ
ィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高速液
体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。本発明のポリペプ
チドは、天然に精製された産物、化学合成手順による産物、ならびに原核生物宿
主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞
および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術により産生された産物を含む。組換
え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコ
シル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに本発明の
ポリペプチドはまた、ある場合には、宿主媒介性プロセスの結果として、最初の
改変されたメチオニン残基を含み得る。
【００４８】 （ｃ）ｒδＮｔのポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有す
る単離されたｒδＮｔポリペプチド、または図１（配列番号２）中のアミノ酸配
列、または上記のポリペプチドの部分を含むペプチドもしくはポリペプチドを提
供する。
【００４９】 ｒδＮｔレセプターのいくつかのアミノ酸配列が、このタンパク質の構造また
は機能への有意な影響なく変化され得ることが当該分野で認識される。配列にお
けるこのような差異が考慮される場合、活性を決定する重要な領域がタンパク質
上に存在することが想起されるべきである。従って、本発明はさらに、ｒδＮｔ
レセプターの改変体（これは、実質的なｒδＮｔレセプター活性を示すか、また
はｒδＮｔタンパク質の領域（例えば、以下に考察するタンパク質部分）を含む
）を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復および型置換を含む。
上記のように、アミノ酸変化が表現型としてサイレントであることに関するガイ
ダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓ
ｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔ
ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。
【００５０】 従って、図１（配列番号２）のポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによ
りコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下：
（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残
基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されたものであり、そしてこのよ
うな置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたものであっても
なくてもよいポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、または（ｉ
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む、ポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログ、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば
、ポリペプチドの半減期を延長するための化合物（例えば、ポリエチレングリコ
ール））と融合されている、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナロ
グ、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチ
ド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチド配列もしく
はプロタンパク質配列の精製に使用される配列がその成熟ポリペプチドに融合さ
れる、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、であり得る。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範
囲内であるとみなされる。
【００５１】 特に目的とするのは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸による置換
、および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸による置換である。後者は、
正電荷が減少したタンパク質を生じ、ｒδＮｔタンパク質の特徴を改善する。凝
集の防止が非常に所望される。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけで
なく、それが免疫原生であり得ることにより、薬学的処方物を調製する場合に問
題にもなり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６
：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７
〜３７７（１９９３））。
【００５２】 アミノ酸置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、２つ
の公知のＴＮＦレセプター型の１つのみに対するＴＮＡ−αの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のｒδＮｔレセプターは、天然の
変異またはヒト操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸置換、欠失また
は付加を含み得る。
【００５３】 示されるとおり、タンパク質のフォールディング（折り畳み）または活性に有
意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、わずかな性質の変化が好ましい（
表１を参照のこと）。
【００５４】
【表１】 機能に必須である本発明のｒδＮｔタンパク質のアミノ酸は、部位特異的変異
誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の方法によ
り同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子内のあらゆる残
基において単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、レ
セプター結合またはインビトロでの増殖活性のような生物学的活性について試験
される。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、
または光親和性標識のような構造分析により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００５５】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」によって、それらのネイティブの環境から取り出されたポリ
ペプチドを意図する。従って、組換え宿主細胞中に産生されるポリペプチドおよ
び／または含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されると考慮さ
れる。また、「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え宿主細
胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、抗菌ペプ
チドポリペプチドの組換え産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載された一工程の方法に
よって実質的に精製され得る。
【００５６】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。ｒδＮｔレセプターの組換え産生されたバージョン
は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８
）に記載された一工程の方法によって実質的に精製され得る。
【００５７】 本発明のポリペプチドはまた、リーダーを含む寄託されたｒδＮｔ ｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド、リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡによ
りコードされるポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）、リーダーを含む図
１（配列番号２）のポリペプチド、リーダーを含まない図１（配列番号２）のポ
リペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、配列番号２のアミノ酸およそ１
〜およそ４３５を含むポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸およそ２〜お
よそ４３５を含むポリペプチド、ならびに、上記のポリペプチドに少なくとも９
５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも３０アミノ酸、および
より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有する、そのようなポリペプチドの一
部も含む。
【００５８】 ｒδＮｔポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同
一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列がｒδ
Ｎｔレセプターの参照アミノ酸の１００アミノ酸ごとに５つまでのアミノ酸の変
化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列に同
一であることを意図する。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同
一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基
の５％までが、欠失もしくは、別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列
の合計アミノ酸残基の５％までの幾らかのアミノ酸が、その参照配列に挿入され
得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置かまたは
カルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照
配列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのい
ずれかで間に散在する。
【００５９】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号
２）に示されるアミノ酸配列、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンによりコー
ドされるアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピ
ュータープログラムを使用して従来のように決定され得る。特定の配列が、本発
明に従う参照配列に、例えば９５％同一かどうか決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ
または任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、もちろん、参照
アミノ酸配列の全長に渡って同一性の百分率が算出されるように、そして参照配
列中のアミノ酸残基の合計の数の５％までの相同性のギャップが許容されるよう
に、パラメーターは設定される。
【００６０】 （２．ｒδＮｔレセプター活性のアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明のｒδＮｔレセプターおよびその誘導体の生物学的特性の機能的特徴付
けは、リガンドに刺激されるｃＡＭＰの蓄積を測定するバイオアッセイによって
実施され得る。
【００６１】 （Ａ．試験化合物への曝露後にｒδＮｔレセプターを発現する細胞におけるサ
イクリックＡＭＰ蓄積の検出のためのアッセイ） 細胞内ｃＡＭＰ蓄積は、以前に記載されたように（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１２９、１９８６）測定される。２４ウェ
ルプレート中で増殖するｒδＮｔレセプター発現細胞を、０．１％ＢＳＡおよび
２ｍＭ ＩＢＭＸを含有する培養培地でリンスする。次いで、細胞を試験化合物
と共に、２１℃で６０分間インキュベートする。上清を取り除き、そしてドライ
アイス粉末中にこのプレート全体を配置することによって、この細胞を直ちに凍
結させる。１ｍｌの５０ｍＭ ＨＣｌ中でこの細胞を解凍することによって、細
胞内ｃＡＭＰを抽出し、そして抗ｃＡＭＰ抗体（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ、Ｍｏ）を使用する特異的ラジオイムノアッセイによって分析する。ｃ
ＡＭＰについてのトレーサーとして使用されるｃＡＭＰアナログ（２’−Ｏ−モ
ノスクシニル−アデノシン３’：５’−サイクリックモノホスフェートチロシル
メチルエステル（Ｓｉｇｍａから入手））を、クロラミンＴ方法によってヨウ素
化する。Ｃ１８ Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ
、Ｍａｓｓ）上にヨウ素化ｃＡＭＰアナログを吸着することによって、遊離ヨウ
素を取り除く。ｄＨ2Ｏでの洗浄後、ヨウ素化ｃＡＭＰアナログを、４０％アセ
トニトリル（ＡＣＮ）および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、こ
のＳｅｐ−ｐａｋカートリッジから溶出する。ヨウ素化ｃＡＭＰアナログを凍結
乾燥し、１ｍｌの０．１％ＴＦＡ中で再構成させ、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣカ
ラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入する。このカラムを、０．１％ＴＦＡ中の１０％Ａ
ＣＮで平衡化し、そして０．１％ＴＦＡ中の１０〜３０％ＡＣＮの勾配を用いて
溶出する。これは、非ヨウ素化ｃＡＭＰアナログからのモノヨウ素化ｃＡＭＰア
ナログの分離を可能にする。このトレーサーは、−２０℃で保存される場合に、
４ヶ月まで安定である。アッセイで使用される標準（アデノシン３’：５’−サ
イクリックモノホスフェート）は、Ｓｉｇｍａから購入され得る。サンプル（Ｈ
Ｃｌ抽出物の１−１０ ８２ １）または標準（０．０４〜１００ｆｍｏｌ／チ
ューブ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に希釈し、そしてトリエ
チルアミンおよび無水酢酸の混合物（２：１（容量：容量））１０μｌでアセチ
ル化する。アセチル化後、ｃＡＭＰ抗血清（１００μｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．
４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％正常ウサギ血清中に作製されたストック溶液
（１：４０００）から添加する。トレーサーを、０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ
（ｐＨ７．４）中に希釈し、そして添加する（２０，０００ｃｐｍ／チューブ）
。アッセイは、４℃にて一晩インキュベートされる。１００μｌのヤギ抗ウサギ
抗血清（ＰＢＳ中で１：２０）および１ｍｌの７％ポリエチレングリコール（Ｍ
Ｗ ５０００〜６０００）を添加することによって、結合したトレーサーを沈殿
させ、４℃にて３０分間２０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を取り除き、そし
て結合した放射能をγ計数器（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）で計数する。ｃＡＭＰデ
ータを計算するために、Ｅｘｃｅｌ表計算ソフトでロジット計算を実施する。代
表的に、このアッセイ感度は０．１ｆｍｏｌ／チューブであり、そしてトレーサ
ーの５０％を置換する標準濃度は５ｆｍｏｌ／チューブである。
【００６２】 （Ｂ．ｒδＮｔレセプター結合アッセイに利用するスクリーニング化合物） 以下に記載されるｃＡＭＰ蓄積アッセイに加えて、ｒδＮｔを一過的にトラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞におけるラジオレセプターに基づくアッセイにおい
て、化合物をヨウ素化し得、そして使用し得ることが可能である。ＣＯＳ−７細
胞を、８０〜９０％コンフルエントまで、１５ｃｍプレートにおいてＤＭＥＭ、
１０％熱非働化ＦＢＳ、１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン中で増殖させる。１〜２μ
ｇのプラスミドＤＮＡを用いたＤＥＡＥ／デキストラン方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、前出）によるトランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理し
、そして５×１０4細胞／ｃｍ2でマルチウェルプラスチック皿（１６または３５
ｍｍ直径、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）中に配置する。細
胞数は、トランスフェクション後にわずかにのみ増加した。さらに４８時間培養
を継続した後、ラジオレセプターアッセイを実施する。研究を開始する直前に、
培養培地を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＫＣＬ、０．５％熱非働化胎仔ウシ血清（Ｇ
ＩＢＣＯ）および５％熱非働化ウマ血清（ＫＣ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ
．、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓ．）を含有する緩衝液で置換する。他に示されない
限り、４×１０5ｃｐｍ／ｍｌ（９．６×１０-11Ｍ）の125Ｉ標識化［Ａｌａ1］
ＰＴＨ（１−１４）アミドまたは125Ｉ標識化［Ｎｌｅ8］ＰＴＨ（１−１４）を
有するこの緩衝液中で１５℃にて４時間インキュベートされた細胞を用いて、研
究を実施する。
【００６３】 （Ｃ．ＰＴＨ−１レセプターアンタゴニストおよびアゴニストのスクリーニン
グ） 本発明のｒδＮｔレセプターは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用して、ＰＴＨ応
答に対してアゴニスト性またはアンタゴニスト性である化合物をスクリーニング
するために利用され得る。細胞表面上にＰＴＨ−１レセプターを発現する細胞を
、２ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、Ｓｉｇｍａ、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、ネイティブなＰＴＨ（１−８４）と共に
５〜６０分間３７℃でインキュベートする。サイクリックＡＭＰ蓄積を、上記の
ように、特異的ラジオイムノアッセイによって測定する。ｒδＮｔレセプターへ
の結合についてネイティブなＰＴＨ（１−８４）と競合し、そしてｃＡＭＰ蓄積
に対するネイティブなＰＴＨ（１−８４）の影響を阻害する試験化合物を、競合
的アンタゴニストとみなす。このような化合物は、高カルシウム血症を処置する
ために有用である。
【００６４】 逆に、ｒδＮｔレセプターへの結合についてネイティブなＰＴＨ（１−８４）
と競合しないが、ｃＡＭＰ蓄積のネイティブなＰＴＨ（１−８４）活性をなお阻
害する（おそらく、レセプターの活性化部位をブロックすることによる）試験化
合物を、非競合的アンタゴニストとみなす。このような化合物は、高カルシウム
血症を処置するために有用である。
【００６５】 ｒδＮｔレセプターへの結合についてネイティブなＰＴＨ（１−８４）と競合
し、そしてネイティブなＰＴＨ（１−８４）の存在下または非存在下でｃＡＭＰ
蓄積を刺激する候補化合物は、競合的アゴニストである。ｒδＮｔレセプターへ
の結合についてネイティブなＰＴＨ（１−８４）と競合しないが、ネイティブな
ＰＴＨ（１−８４）の存在下もしくは非存在下でｃＡＭＰ蓄積をなお刺激し得る
か、またはＰＴＨ化合物で観察される蓄積よりも高いｃＡＭＰ蓄積を刺激する候
補化合物を、非競合的アゴニストとみなす。
【００６６】 従って、さらなる局面では、候補アゴニストまたは候補アンタゴニストが、Ｐ
ＴＨまたはＰＴＨｒＰに対する細胞性応答を増強または阻害し得るか否かを決定
するための、スクリーニング方法が提供される。この方法は、ｒδＮｔポリペプ
チドを発現する細胞と候補化合物およびＰＴＨまたはＰＴＨｒＰリガンドとを接
触させる工程、細胞性応答をアッセイする工程、ならびにその細胞性応答を標準
の細胞性応答（この標準は、候補化合物の非存在下でリガンドとの接触がなされ
る場合に、アッセイされる）に対して比較し、それによって、標準を超える増加
した細胞性応答は、この候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路の
アゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少した細胞性応答は、こ
の候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタゴニストである
ことを示す、工程を包含する。「細胞性応答をアッセイする」とは、候補化合物
および／またはＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰに対する細胞性応答（例えば、サイク
リックＡＭＰ蓄積）を定性的または定量的に測定することを意図する。本発明に
より、ｒδＮｔポリペプチドを発現する細胞を、内因的または外因的に投与され
たＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかと接触させ得る。
【００６７】 （実施例） （一般的方法） （ペプチド）ペプチドを、Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカル
ボニル）保護基を用いる固相化学、ならびにＴＦＡ媒介性切断および脱保護を使
用して、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂ
ｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｉｌ
ｉｔｙによって、調製した。すべてのペプチドを、Ｃ末端でアミド化した。ＰＴ
Ｈ（１−１４）アナログを、複数ペプチド合成装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅ
ｍｔｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６ ＭＢＳ）において、０．０２５ｍＭスケール
で合成した。完全なペプチドを、Ｃ１８カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）上に吸
着させることによって脱塩し、次いで、逆相Ｃ１８に基づくＨＰＬＣ、ＭＡＬＤ
Ｉ質量分析法、およびアミノ酸分析によって分析した。ＰＴＨ（１−３４）コン
トロールペプチドである［Ｎｌｅ8,21，Ｔｙｒ34］ｒＰＴＨ−（１−３４）ＮＨ 2 、およびＰＴＨｒＰ（７−３４）アンタゴニストペプチドである［Ｌｅｕ11，
Ｄ−Ｔｒｐ12］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）ＮＨ2を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａ）において０．
１ｍＭスケールで調製し、逆相Ｃ１８に基づくＨＰＬＣによって精製し、そして
上記のように特徴付けた。ペプチドの濃縮ストック溶液（ＰＴＨ（１−１４）ア
ナログについて１０ｍＭ、ならびにＰＴＨｒＰ（７−３４）およびＰＴＨ（１−
３４）について０．３ｍＭ）を、１０ｍＭ酢酸中に調製し、酸加水分解およびア
ミノ酸分析によって定量し、そして−８０℃で保存した。
【００６８】 （細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション）ＣＯＳ−７細胞およびＨＫＲ
Ｋ−Ｂ７細胞を、胎仔ウシ血清（１０％）；ペニシリンＧ（２０ユニット／ｍｌ
）、硫酸ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）（
２０μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（０．０５μｇ／ｍｌ）を補充したＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ2を含む加湿雰
囲気下で、３７℃にて培養した。アッセイの２４〜１６時間前に、２４ウェルプ
レート中の細胞を、３３℃に設定された５％ＣＯ2を含む加湿インキュベーター
に移した。ＥＧＴＡ／トリプシンおよび抗生物質のストック溶液は、ＧＩＢＣＯ
からであり；胎仔ウシ血清は、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ
ｏｇａｎ、ＵＴ）からであった。ｈＰＴＨ−１レセプターをコードするｐＣＤＮ
Ａ−１に基づくプラスミド（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）でのＬＬＣ−ＰＫ1細胞の安定的トランスフェクションによる、ＨＨＲＫ−
Ｂ７細胞株の誘導体化および特徴付けは、以前に記載された（Ｔａｋａｓｕ，Ｈ
．およびＢｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（印刷中）
（１９９８））。これらの細胞は、１細胞あたり約１×１０6ＰＴＨ結合部位の
表面密度でＰＴＨ−１レセプターを発現する。ＨＨＲＫ−Ｂ７細胞を、細胞単層
がコンフルエンシーに達して２４〜７２時間後に、機能的アッセイに使用した。
【００６９】 インタクトなラットＰＴＨ−１レセプターおよび短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ
）ラットＰＴＨ−１レセプターを用いる研究のために、以前に記載されたように
（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−
２８８６８）、ＤＥＡＥ−デキストランを用いて、ＣＯＳ−７細胞の一過的トラ
ンスフェクションを実施した。インタクトなラットＰＴＨ−１レセプターまたは
短縮型ラットＰＴＨ−１レセプターのいずれかをコードする、ｐＣＤＮＡ−１に
基づくプラスミドの構築および最初の特徴付けは、以前に記載されている（Ｌｅ
ｅ，Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５（４）：１４８８−１４９５
）。インタクトなレセプター（ｒＷＴ−ＨＡ）は、細胞外ドメインの残基９３〜
１０１の代わりに、９個のアミノ酸のＨＡエピトープタグを含む；このエピトー
プタグは、レセプター機能に影響しない（Ｌｅｅ，Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １３５（４）：１４８８−１４９５）。短縮型ラットＰＴＨ−１レセ
プター（ｒδＮｔ）は、エキソンＥ１〜エキソンＧ（残基２６〜１８１）を欠失
する。Ａｌａ−２２とＴｙｒ−２３との間でシグナルペプチダーゼ切断が生じる
と仮定すると（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ １０：１−６（１９９７））、ｒδＮｔは、Ｇｌｕ−１８２に連結された
そのＮ末端残基を有すると推定される（Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９４１−４９４６（１９
９８）；Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３
９４−１４３９８（１９９５）；ＤｅＡｌｍｅｉｄａ，Ｖ．およびＭａｙｏ，Ｋ
．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７５０−７６５（１９９８））（図３Ｂ）。ＣＯ
Ｓ−７細胞を、２４ウェルプレートにおいてこれらの細胞が８５〜９５％コンフ
ルエンシーになった時点で、各ウェルについて塩化セシウム／エチジウムブロミ
ド勾配遠心によって精製された２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いてトランス
フェクトした。アッセイを、トランスフェクション後７２〜９６時間で実施した
。これらの条件下で、約２０％のＣＯＳ−７細胞がトランスフェクトされ、そし
て１細胞あたり約５×１０6個の表面ＰＴＨレセプターを発現する（Ｂｅｒｇｗ
ｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８）
。
【００７０】 細胞内サイクリックＡＭＰ：トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞またはＨ
ＫＲＫ−Ｂ７細胞を、５００ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．７）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、
５％熱非働化ウマ血清、０．５％熱非働化胎仔ウシ血清）でリンスし、そして２
００ｍｌのＩＢＭＸ緩衝液（２ｍＭ ＩＢＭＸ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、３５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を含有するＤＭＥＭ）およ
び１００ｍｌの結合緩衝液または種々の量のペプチドを含有する結合緩衝液を添
加した。このプレートを、室温にて６０分間インキュベートした。次いで、緩衝
液を取り除き、そして細胞をドライアイスで凍結させ、０．５ｍｌの５０ｍＭ
ＨＣｌで処理し、そして再凍結させた。解凍後、この溶解産物をｄＨ２Ｏ中で３
０倍希釈し、そしてアリコートを、標識化されていないｃＡＭＰを標準として用
いる決定されたラジオイムノアッセイによって、ｃＡＭＰ含量について分析した
。
【００７１】 ｃＡＭＰ阻害アッセイについて、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を５
００ｍｌの結合緩衝液で一度リンスし、そして２００ｍｌのＩＢＭＸ緩衝液およ
び１００ｍｌの結合緩衝液またはアンタゴニストである［Ｌｅｕ１１，Ｄ−Ｔｒ
ｐ１２］ｈＰＴＨｒＰ（７−３４）ＮＨ２（１０ｍＭ）を含有する結合緩衝液を
添加した。室温での５分間のインキュベーション後、ＰＴＨ（１−１４）または
ＰＴＨ（１−３４）（アゴニストペプチド）を含有する１０ｍｌの結合緩衝液を
添加し、そしてさらに３０分間インキュベーションを継続した。次いで、細胞を
溶解し、そして上記のように、細胞内ｃＡＭＰレベルを測定した。
【００７２】 （実施例１） （安定な細胞におけるＰＴＨ（１−１４）作用） ラットＰＴＨ配列に基づき、そしてＰＴＨ（１−９）からＰＴＨ（１−１５）
の長さの範囲のアミノ末端ペプチドフラグメントを合成し、そして高レベル（１
×１０6レセプター／細胞）のクローン化したヒトＰＴＨ−１レセプター（Ｔａ
ｋａｓｕ，Ｈ．およびＢｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ（印刷中）（１９９８））を安定に発現する、ＨＫＲＫ−Ｂ７と称されるＬＬ
Ｃ−ＰＫ１由来の細胞株における活性を試験した。図１Ａに示されるように、イ
ンタクトなコントロールペプチドＰＴＨ（１−３４）は、基底ｃＡＭＰレベルと
比較して細胞内ｃＡＭＰレベルにおいて５０倍の増加を媒介し、そしてこの応答
に対する推定ＥＣ５０は約２ｎＭであった。ＰＨ（１−１３）およびより短いフ
ラグメントでは、ｃＡＭＰ蓄積の増加は、ほとんどまたは全く観察されなかった
（図１Ａ）。しかし、２つのアミノ末端フラグメントＰＴＨ（１−１４）および
ＰＴＨ（１−１５）は、基底レベルを超えて約２０倍までｃＡＭＰ形成を刺激し
たが、この活性化に必要とされる用量は、ＰＴＨ（１−３４）に必要とされる用
量よりも５〜６のオーダーの大きさで高かった。これらの活性ペプチドに対する
応答は、トランスフェクトされたＰＴＨレセプターに依存した。なぜなら、親の
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞（これは、ＰＴＨレセプターを発現しないが、関連のカルシ
トニンレセプターを発現する）は、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨ（１−１４
）に対して非応答性であったからである（図２Ｂ）。
【００７３】 インタクトなレセプターでは、ＰＴＨ（１−１４）の作用強度は、ＰＴＨ（１
−３４）の作用強度よりも約５のオーダーの大きさで弱かった。ＰＴＨ（１−１
４）ペプチドは、ＰＴＨ（１５−３４）ドメイン中のＰＴＨ（１５−３４）領域
中に位置付けられる重要なレセプター結合残基（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０１８３−１０１８７（１９８０）；Ｇ
ａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２（５）：
２０２４−２０３０（１９９３）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：８３−８７（１９９０）；およびＡｂｏｕ−Ｓａ
ｍｒａ，Ａ．−Ｂ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２５：２２１５−２２
１７（１９８９））を欠失することを考えると、この作用強度の減少は、驚くこ
とではない。これと一致して、非標識化ＰＴＨ（１−１４）は、あまりに弱く結
合するので、トレーサーリガンドとして放射ヨウ素標識化ｒＰＴＨ（１−３４）
を使用した本発明者らの標準的な競合結合アッセイでは検出可能でなく、本発明
者らは、本研究で使用したインタクトなレセプターまたは短縮型レセプターへの
放射標識化ＰＴＨ（１−１４）アナログの結合も直接検出し得なかった（データ
示さず）。
【００７４】 （実施例２） （ＰＴＨ（１−１４）のアラニンスキャニング） アデニリルシクラーゼ−シグナル伝達経路を活性化する際に役割を果たすＰＴ
Ｈ（１−１４）フラグメント中の残基を同定するために、アラニンスキャニング
アプローチを使用した。１３個の異なるアラニン置換ラットＰＴＨ（１−１４）
アナログを合成し、そしてＨＫＲＫ−Ｂ７細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激する
能力について試験した（図２）。一置換アナログで得られた活性プロフィールは
、１〜９領域中の残基は、比較的不耐性のペプチドセグメントを形成するが、１
０〜１４領域中の残基は、比較的耐性のセグメントを形成することを明らかにし
た。従って、Ｓｅｒ−３およびＡｌａ−１（これは、ラットＰＴＨのネイティブ
なアミノ末端残基である）を除いて、１〜９領域中の大半のアラニン置換体は、
ほとんど活性がないかまたは不活性のペプチドを産生した。対照的に、１０〜１
４領域中の各アラニン置換体は、ネイティブなラットＰＴＨ（１−１４）の活性
に匹敵する活性を有するペプチドを産生した。アラニン−３置換ペプチドの活性
は、小さな側鎖を有するアミノ酸がこの部位で耐性であることを示したＰＴＨ（
１−３４）アナログでの以前の研究（Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６６：１９９７−２００４（１９９１））とよく相関した。
【００７５】 （実施例３） （小さなリガンドとのｒδＮｔレセプターの作用強度） 実験では、インタクトなラットＰＴＨ−１レセプター（ｒＷＴ−ＨＡ、図４Ａ
）またはアミノ末端細胞外ドメインの大半を欠失した短縮型ラットＰＴＨ−１レ
セプター（ｒδＮｔ、図４Ｂ）のいずれかでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細
胞を利用した。ｒＷＴ−ＨＡを発現するＣＯＳ−７細胞では、ＰＴＨ（１−３４
）およびＰＴＨ（１−１４）は、ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞において見られる応答と類
似したｃＡＭＰ応答を媒介した：ＰＴＨ（１−１４）は、ｃＡＭＰ形成を１５倍
刺激したが、これはＰＴＨ（１−３４）の作用強度よりも４〜５のオーダーの大
きさで弱い作用強度であった（図３Ｃ）。両方のペプチドはまた、ｒδＮｔでト
ランスフェクトされた細胞におけるｃＡＭＰ形成を刺激したが、この短縮型レセ
プターとのＰＴＨ（１−１４）の作用強度は、ＰＴＨ（１−３４）の作用強度よ
りもわずか２のオーダーの大きさで弱かった（図３Ｄ）。２つのリガンドの相対
的作用強度におけるこの変化は、２つのレセプターと等価な強度（ｅｑｕｉｐｏ
ｔｅｎｔ）であったＰＴＨ（１−１４）の作用強度におけるシフトではなく、ｒ
ＷＴ−ＨＡとのＰＴＨ（１−３４）の作用強度と比較した場合に、ＰＴＨ（１−
３４）がｒδＮｔと示した作用強度の１００倍の減少によって説明され得る（図
４のパネルＣとＤとを比較）。
【００７６】 本研究においてレセプター発現の直接的な測定は存在しないが、ｒＷＴ−ＨＡ
と比較した場合に、ＰＴＨ（１〜３４）がｒδＮｔとともに示す能力の１００分
の１への減少は、その短縮型レセプターの表面発現の減少に起因するようではな
い。なぜなら、ＰＴＨ（１〜３４）は、ｒδＮｔおよびｒＷＴ−ＨＡとともに等
価的な活性を示すからである（図４ＣおよびＤ）。このことは、この２つのレセ
プターが、ほぼ等しいレベルで発現されることを示唆する。従って、ｒδＮｔと
のＰＴＨ（１〜３４）の活性の減少は、おそらく、リガンドのドメイン（Ｊｕｅ
ｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１０２６（１９９１
）、Ｇｕｏ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：３８８４−３８９
１（１９９５）；Ｈｒｕｓｋａ，Ｋ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９
：２３０−２３９（１９８７）；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３：１３５２２−１３５２７（１９８８）；Ｋｏｌａｋｏｗｓｋ
ｉ，Ｌ．Ｆ．，ＧＣＲＤｂ：Ａ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅ
ｌｓ ２：１−７（１９９４）；Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ １３４：８７９−８８４（１９９４）；Ｌｅｅ，Ｃ．ら、Ｍｏｌ．
Ｅｎｄｏ．９：１２６９−１２７８（１９９５）；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｓｉ
ｎｇｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ａｌｌｏｗ ｔｈｅ ＰＴＨ−２ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｔｏ Ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ＰＴＨｒＰ、Ｊ．Ｖｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒ
ｅｓ．１２，Ｓｕｐｐｌｌｅｍｅｎｔ １、Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１２１（１９９
７）；Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．９５：４９４１−４９４６（１９９８）、Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３９４−１４３９８（１９９５）；ＤｅＡｌ
ｍｅｉｄａ，Ｖ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７５０−７６５（１９９８）；
Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０５０−１０５７（１９９４
）；Ｚｈｏｕ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４
：３６４４−３６４９（１９９７）；Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７３：２２４９８−２２５０５（１９９８）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，
Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６９−２６４７２（１９９６
）；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１
１８６−１１９４（１９９４）；Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７３：１６８９０−１６８９６（１９９８）；Ｔａｋａｓｕ，Ｈ．
およびＢｒｉｎｇｈｕｒｓｔ，Ｆ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，印刷中（１
９９８）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８
８６１−２８８６８（１９９７）；Ｌｅｅ，Ｃ．ら．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ １３５（４）：１４８８−１４９５（１９９４））とレセプターのアミノ末
端ドメイン（Ｊｕｅｐｐｎｅｒ，Ｈ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４
：８７９−８８４（１９９４）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１：１６４６９−２６４７２（１９９６）；Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，
Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６８９０−１６８９６（１９９８
））との間で通常生じる、重要な結合相互作用の損失を反映する。これらの同じ
結合相互作用の欠失はまた、ＰＴＨｒＰ（７〜３４）がｒδＮｔとともにはアン
タゴニストとして機能しないことを説明し得る（図７Ｂを参照のこと）。
【００７７】 （実施例４） （ｒδＮｔレセプターは、インタクトなＰＴＨ−１レセプターと同じＰＴＨ（
１〜１４）機能的残基と相互作用する） 短縮型レセプターとの機能に必要とされるＰＴＨ（１〜１４）残基が、インタ
クトなレセプターとの機能に必要とされるＰＴＨ（１〜１４）残基と異なるか否
かを試験するために実験を設計した。ＰＴＨ（１〜１４）アナログのアラニンス
キャニングセットを使用して、ＣＯＳ−７細胞におけるこの２つのラットＰＴＨ
−１レセプターについてのｃＡＭＰ刺激活性を実験により試験した。図５Ａおよ
び５Ｂに示されるように、ｒδＮｔによって得られる活性プロフィールは、ｒＷ
Ｔ−ＨＡを用いて得られる活性プロフィールを反映する。なぜなら、このペプチ
ドのＳｅｒ−３および１０〜１４の領域は、変異に寛容であるが、残基２および
４〜９は、非寛容であったからである（図４Ａおよび４Ｂ）。従って、インタク
トなＰＴＨ−１レセプターとの相互作用に必要であるＰＴＨ（１〜１４）におけ
る同じセットの機能的残基もまた、レセプターのコアドメインとの相互作用に必
要である。
【００７８】 （実施例５） （短縮型リガンドおよびＰＴＨレセプターの特異性） ＰＴＨ（１〜１４）およびｒδＮｔが、対応する親リガンドについて適切な認
識特異性を保持したか否かを試験するために、セクレチンリガンドおよびクロー
ン化したラットセクレチンレセプターを使用して、交差反応性実験を行った。セ
クレチンレセプターでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、セクレチン（
１〜２７）（１ｍＭ）に応答して、ｃＡＭＰレベルの５０倍の増加を示したが、
ＰＴＨ（１〜３４）（１ｍＭ）またはＰＴＨ（１〜１４）（１００ｍＭ）のいず
れにも応答しなかった（図５Ｃ）。ｒδＮｔを発現する細胞は、ＰＴＨ（１〜３
４）およびＰＴＨ（１〜１４）に応答したが、セクレチン（１〜２７）（１ｍＭ
）またはセクレチン（１〜１３）（１ｍＭ）には応答しなかった（図５Ｂ）。従
って、ＰＴＨ（１〜１４）およびｒδＮｔの認識特異性は、インタクトな親分子
の認識特異性を複製するようである。緩やかな特異性についての証拠は、これら
の研究において、何も検出されなかった（図６）。ＰＴＨ（１〜１４）は、ＬＬ
Ｃ−ＰＫ１細胞において発現される内因性カルシトニンレセプターを活性化しな
かったこともまた注意する価値がある（図２Ｂ）。
【００７９】 （実施例６） （ｒδＮｔ刺激は、インヒビター［Ｌｅｕ１１，Ｄ−Ｔｒｐ１２］ｈＰＴＨｒ
Ｐ（７〜３４）ＮＨ２によって影響されない） ［Ｌｅｕ１１，Ｄ−Ｔｒｐ１２］ｈＰＴＨｒＰ（７〜３４）ＮＨ２（ＰＴＨ（
１〜３４）作用の強力な競合的アンタゴニスト（Ｎｕｔｔ．Ｒ．Ｆ．ら、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：４９１−４９３（１９９０）））が、ｒＷＴ−
ＨＡまたはｒδＮｔのいずれかを発現するＣＯＳ−７におけるｃＡＭＰ形成を刺
激する、ＰＴＨ（１〜１４）の能力をブロックし得るか否かを決定した（図６）
。ｒＷＴ−ＨＡによって、このインヒビターペプチドは、ＰＴＨ（１〜１４）お
よびＰＴＨ（１〜３４）の両方の効力を、インヒビターの非存在下でこれらのア
ゴニストによって誘発される応答と比較して、７０％程度の大きさの分減少した
（図６Ａ）。対照的に、ＰＴＨｒＰ（７〜３４）は、ｒδＮｔを発現する細胞に
おいてｃＡＭＰ産生を刺激するＰＴＨ（１〜３４）またはＰＴＨ（１〜１４）の
能力に対して、ほとんどまたは全く影響を有さなかった。
【００８０】 ＰＴＨｒＰ（７〜３４）がインタクトなレセプターに対するＰＴＨ（１〜１４
）作用をアンタゴナイズする能力（図６Ａ）は、これらの２つのリガンドによっ
て占有されるレセプター部位が重複することを示唆する。この重複は、リガンド
残基７〜１４およびそのレセプターのコア領域におけるいくつかの部分を含む。
しかし、図の残基（７〜３４）とそのレセプターのコア領域との間ので生じ得る
どの結合相互作用も非常に弱く、アミノ末端細胞外レセプタードメインの非存在
下での効果的な拮抗作用を可能にしない。
【００８１】 これらの知見は、これまでに認められたものよりも、よりかなり小さいＰＴＨ
（１〜３４）の領域が、レセプター活性化を刺激し得ること、およびＰＴＨのア
ミノ末端部分で、そのホルモンが、インタクトなＰＴＨリガンドとレセプターに
ついて以前に仮定されたように（Ｌｅｅ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．９：１２
６９−１２７８（１９９５）；Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３：２２４９８−２２５０５（１９９８）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６４６９−２６４７２（１９９６）；Ｇ
ａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１１８６
−１１９４（１９９４）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７２：２８８６１−２８８６８；Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１：１２８２０−１２８２５（１９９６））７つの膜貫通らせ
んおよび連結ループを含むレセプターのコア領域と相互作用することを確立する
。さらに、この相互作用の構成要素は、レセプターシグナル伝達に十分である。
ＰＴＨの１５〜３４領域が、レセプターのアミノ末端細胞外ドメインに結合する
という仮説は、それ自体でｃＡＭＰ形成を刺激しない（データは示さず）このド
メインもまた、レセプターのコア領域と相互作用することによっていくらかの結
合エネルギーを提供するという可能性を排除しない。実際、ＰＴＨ（１〜１４）
がこのレセプターと示すと能力と比較して、ＰＴＨ（１〜３４）がｒδＮｔとと
もに示す約１００倍大きい能力（図４Ｄ）は、このような相互作用に十分起因し
得る。しかし、本発明者らは、この１５〜３４ドメインが、例えば、そのリガン
ドのアミノ末端部分において有利な二次構造を安定化することによって、（１〜
１４）セグメントの内因的シグナル活性を増強するという、代わりの可能性を排
除し得ない。ＰＴＨによって利用されるレセプター認識部位およびレセプターが
結合したリガンドの構造についてのより詳細な情報が、このような可能性を区別
するために必要である。
【００８２】 いくつかの認識決定基が、Ｂファミリーのレセプターの、アミノ末端細胞外ド
メイン、細胞外ループおよび膜貫通らせんにおいて同定された（Ｔｕｒｎｅｒ，
Ｐ．ら、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ａｌｌｏｗ ｔｈｅ ＰＴＨ−２
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ Ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ＰＴＨｒＰ Ｊ．Ｂｏｎｅ
Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１２，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １，Ａｂｓｔｒａｔ ＃１２
１（１９９７）、Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．９５：４９４１−４９４６（１９９８）、Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｍ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４３９４−１４３９８（１９９５）
、Ｇａｒｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３５：１１
８６−１１９４（１９９４）；Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２：２８８６１−２８８６８（１９９６）；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｒ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１６）：９２０５−９２０８（１９９６
））。
【００８３】 ファミリーＢレセプターの１つの顕著な特徴は、そのアミノ末端細胞外ドメイ
ンである。これは、比較的大きく、そして６つのシステインを含む多くの保存さ
れた残基を含む。従って、ＰＴＨ−１レセプターのこのドメインが、ｒδＮｔレ
セプターとの結果によって示されるように、リガンド依存性シグナル伝達につい
て必須でないことは興味深い。
【００８４】 他のファミリーＢレセプターに対するいくつかの他の報告は、これらのレセプ
ターのアミノ末端細胞外ドメインが機能的発現に必須ではないかもしれないとい
うことを示唆するさらなる証拠を提供する。カルシトニンレセプター（Ｕｎｓｏ
ｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７７２０−２７７２７（１９
９５））および成長ホルモン放出因子レセプター（ＤｅＡｌｍｅｄｉａ，Ｖおよ
びＭａｙｏ，Ｋ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７５０−７６５（１９９８））に
おける大きなアミノ末端欠失は、免疫学的方法によって評価された場合に、発現
に適合性であり、アミノ末端ドメインを欠失し、そしてヘリックス２（ＨＲ−１
７８）における活性化変異を含むグルカゴンレセプターは、構成的なｃＡＭＰシ
グナル伝達活性を示した（Ｈｊｏｒｔｈ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１２：７
８−８６（１９９８））。しかし、これらの研究において、本発明者らがＰＴＨ
−１レセプターについて見出したように、その短縮型レセプターとリガンドが相
互作用し得るという証拠は、報告されなかった。ルトルピンレセプター（大きい
グリコホルモン（ｇｌｙｃｏｈｏｒｍｏｎｅ）ヒト絨毛性ゴナドトロピンを結合
するグループＡレセプター）についての別の研究において、その大きいアミノ末
端細胞外ドメインの欠失が、高用量のｈＣＧに対するｃＡＭＰ応答を媒介し得る
レセプターを生じることが観察された（Ｊｉ．Ｉ．Ｈ．およびＪｉ．Ｔ．Ｈ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２０）：１３０７６−１３０７９（１９９１
））。
【００８５】 ＰＴＨ（１〜１４）の活性が、そのアミノ末端レセプタードメインの欠失によ
って影響されなかったことは、このペプチドが、そのレセプターのコア領域と優
先的に相互作用することを示唆する。この結論は、ＰＴＨ（１〜１４）に対して
行われたアラニンスキャニング実験によって支持される。この実験で、ｒδＮｔ
を用いて観察された寛容残基および非寛容残基のプロフィールが、そのインタク
トなレセプターを用いて観察されたプロフィールとほぼ同じであった（図４）。
各レセプターを用いて、リガンドの１０〜１４領域の残基は、寛容セグメントを
形成したが、１〜９領域中の残基（１および３を除く）は、非寛容セグメントを
形成した。ＰＴＨ（１〜１４）フラグメントの状況下で観察された重要な残基お
よび重要でない残基のこのパターンは、より長いＰＴＨアナログについての研究
で以前に見出されたパターンにほぼ一致する（Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９９７−２００４（１９９１）；Ｇｏｍｂｅｒｔ
，Ｆら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、変異体ＰＴＨ１Ｒレセプターである、ｒδＮｔの核酸配列およびアミ
ノ酸配列の提示である。
【図２】 図２は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中でのＰＴＨフラグメントのｃＡＭＰ刺激活性を
示す。Ａ）ラットＰＴＨ（１−３４）アナログまたはアミノ末端ｒＰＴＨフラグ
メントを、ヒトＰＴＨ−１レセプターで安定にトランスフェクトされたＬＬＣ−
Ｐ１由来細胞株（ＨＫＲＫ−Ｂ７）においてｃＡＭＰ刺激活性について試験した
。細胞を、示される用量のペプチドを用いて、２２℃で６０分間処理した。細胞
内ｃＡＭＰを、実験手順に記載されるように、ＲＩＡによって測定した。各二連
で行った３つの別々の実験からの組み合わせたデータ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）を
示す。Ｂ９ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞またはトランスフェクトされていないＬＬＣ−Ｐ
Ｋ１を、ｒＰＴＨ（１〜３４）またはｒＰＴＨ（１〜１４）で処理し、そして細
胞内ｃＡＭＰを測定した。二連で実施した１つの代表的実験からのデータ（平均
±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。
【図３】 図３は、ＰＴＨ（１〜１４）のアラニンスキャンを示す。ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞
を、１４個の異なるｒＰＴＨ（１〜１４）アナログのうちの１つ（１００ｍＭ）
で処理した。このアナログ各々は、示されるアミノ酸位置の別々のアラニン置換
を有する。生じたｃＡＭＰレベルを、実験手順に記載するように決定した。各二
連で実施した３つの別々の実験からの組み合わせたデータ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．
）を示す。３つの実験において観察された平均（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）基底ｃＡ
ＭＰレベルは、２．１±０．１ｐｍｏｌｅ／ウェルであり、そして０．１ｍＭの
ｒＰＴＨに対する最大応答は、２５４±１６ｐｍｏｌｅ／ウェルであった。
【図４】 図４は、ＣＯＳ−７細胞における、インタクトなＰＴＨ−１レセプターおよび
短縮型ＰＴＨ−１レセプターのＰＴＨ応答を示す。上に、ＣＯＳ−７細胞の一過
性トランスフェクションおよび後のｃＡＭＰ応答アッセイに使用したインタクト
なラットＰＴＨ−１レセプター（Ａ）および短縮型ラットＰＴＨ−１レセプター
（Ｂ）の図を示す。保存された細胞外システイン残基を、白丸として示し、そし
て配列位置に従って番号を付け、そしてｒＷＴ−ＨＡ中のエピトープタグ（ＨＡ
）の９つのアミノ酸に影を付ける。残基２６および１８１の特徴は、ｒδＮｔに
おける欠失の終点を示す。Ａｌａ−２２の推定シグナルペプチド切断部位に基づ
いて、ｒδＮｔ中の残基２３〜２５は、残基１８２と結合している。ｒＰＴＨ（
１〜３４）（Ｊ）またはｒＰＴＨ（１〜１４）（Ｃ）に対する、インタクトなレ
セプター（Ｃ）およびｒδＮｔ（Ｄ）を発現するＣＯＳ−７細胞のｃＡＭＰ応答
もまた、示す。これらのグラフは、各二連で実施した５つの異なる実験からの組
み合わせデータ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。
【図５】 図５は、インタクトなＰＴＨレセプターおよび短縮型ＰＴＨレセプターを用い
たアラニンスキャンを示す。ｒＷＴ−ＨＡ（Ａ）またはｒＣＥＩ−Ｇ（Ｂ）で一
過性トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、１００ｍＭのネイティブラットＰ
ＴＨ（１〜１４）または１００ｍＭの単一アラニン置換を含むｒＰＴＨ（１〜１
４）アナログを用いて、２１℃で１時間処理した。そして生じた細胞内ｃＡＭＰ
レベルを、ＲＩＡによって測定した。アミノ酸置換を、座標の表示に基づいて示
す。ペプチドを二連で試験し、そして他の３つの代表的となる１つの実験を示す
。
【図６】 図６は、短縮型リガンドおよびＰＴＨレセプターの特異性を示す。ｒＷＴ−Ｈ
Ａ（Ａ）、ｒδＮｔ（Ｂ）、またはインタクトなラットセクレチンレセプター（
Ｃ）のいずれかで一過性トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、示されるペプ
チドを用いて、２２℃で６０分間処理した。そして生じた細胞内ｃＡＭＰレベル
を、ＲＩＡによって定量した。このインキュベーションの間の存在するペプチド
の濃度は、ｒＰＴＨ（１〜３４）が０．１ｍＭ；ｒＰＴＨ（１〜１４）が１００
ｍＭ；セクレチン（１〜２７）が１ｍＭ、そしてセクレチン（１〜１３）が１０
０ｍＭであった。二連で実施した１つの実験からのデータ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．
）を示す。これを２回以上反復して、等価な結果を得た。
【図７】 図７は、ＰＴＨ（１〜１４）とのＰＴＨｒＰ（７〜３４）のアンタゴニスト特
性を示す。ｒＷＴ−ＨＡ（Ａ）またはｒδＮｔ（Ｂ）で一過性トランスフェクト
したＣＯＳ−７細胞を、アンタゴニスト[Ｌｕｅ１１，Ｄ−Ｔｒｐ１２]ｈＰＴＨ
ｒＰ（７〜３４）ＮＨ２（または緩衝液のみ）を用いて２２℃で５分間、続いて
ｒＰＴＨ（１〜３４）アゴニストペプチドまたはｒＰＴＨ（１〜１４）アゴニス
トペプチドのいずれか１０ｍｌで処理した。インキュベーションを２１℃で３０
分間続け、そして生じたｃＡＭＰレベルを、実験手順に記載されるように、ＲＩ
Ａによって測定した。このインキュベーションの間に存在するアンタゴニストペ
プチドの最終濃度は、１０ｍＭであった。三連で実施した１つの実験からのデー
タを示す。同じ実験を反復すると、等価な結果を生じた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クローネンバーグ， ヘンリー エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02178， ベルモント， ヘイスティング ズ ロード 48 (72)発明者 ポッツ， ジョン ティー． ジュニア アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02165， ニュートン， チェスナット ストリート 129 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QQ62 QR33 QR59 QR77 QR80 QS05 QX07 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一
    であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
    ： （ａ）配列番号２における約１〜約４３５位の完全アミノ酸配列を有するｒδ
    Ｎｔレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２における約２〜約４３５位のアミノ酸配列を有するｒδＮｔ
    レセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２における約２３〜約４３５位のアミノ酸配列を有する成熟ｒ
    δＮｔレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
    完全アミノ酸配列を有するｒδＮｔレセプターをコードする、ヌクレオチド配列
    ； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
    アミノ酸配列を有する成熟ｒδＮｔレセプターをコードする、ヌクレオチド配列
    ； （ｆ）ｒδＮｔ細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｇ）ｒδＮｔ膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；および （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけ
    るヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、図１の完全ヌクレオチド配列（配
    列番号１）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、図１における完全アミノ酸配列（
    配列番号２）を有するｒδＮｔレセプターをコードする図１のヌクレオチド配列
    （配列番号１）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、図１におけるアミノ酸配列（配列
    番号２）を有する成熟ｒδＮｔレセプターをコードする図１のヌクレオチド配列
    （配列番号１）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃ
    ＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃ
    ＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するｒδＮｔレセプ
    ターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃ
    ＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ｒδＮｔレセプ
    ターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
    、（ｆ）または（ｇ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
    ハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、こ
    こで、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみ
    からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハ
    イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
    、（ｆ）または（ｇ）におけるアミノ酸配列を有するｒδＮｔレセプターのエピ
    トープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離され
    た核酸分子。
  10. 【請求項１０】 ｒδＮｔレセプター細胞外ドメインをコードする、請求項
    １に記載の単離された核酸分子。
  11. 【請求項１１】 ｒδＮｔレセプター膜貫通ドメインをコードする、請求項
    １に記載の単離された核酸分子。
  12. 【請求項１２】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項１
    に記載の単離された核酸分子をベクター内に挿入する工程を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法によって作製された、組換えベク
    ター。
  14. 【請求項１４】 組換え宿主細胞を作製する方法であって、請求項１３に記
    載の組換えベクターを宿主細胞内に導入する工程を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法によって産生された、組換え宿主
    細胞。
  16. 【請求項１６】 ｒδＮｔポリペプチドを産生するための組換え方法であっ
    て、請求項１５に記載の組換え宿主細胞を該ポリペプチドが発現される条件下で
    培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸配列を有する、単離されたｒδＮｔポリペプチド： （ａ）配列番号２における約１〜約４３５位の完全アミノ酸配列を有する、ｒ
    δＮｔポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２における約２〜約４３５位のアミノ酸配列を有する、ｒδＮ
    ｔポリペプチドのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２における約２３〜約４３５位のアミノ酸配列を有する、成熟
    ｒδＮｔポリペプチドのアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
    完全アミノ酸配列を有する、ｒδＮｔポリペプチドのアミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号＿に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる
    アミノ酸配列を有する、成熟ｒδＮｔポリペプチドのアミノ酸配列。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のｒδＮｔレセプターポリペプチドに特
    異的に結合する、単離された抗体。
  19. 【請求項１９】 ＰＴＨレセプター活性のアゴニストまたはアンタゴニスト
    についてスクリーニングする方法であって、以下： （ａ）試験化合物をＰＴＨレセプターを発現する細胞に接触させる工程；およ
    び （ｂ）該細胞の生物学的応答を測定する工程 を包含する、方法。
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