DE69832206T2 - Pth rezeptor und testverfahren unter verwendung desselben - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie, der Entwicklungsbiologie, der Physiologie, der Neurobiologie, der Endokrinologie und der Medizin.
  • Stand der Technik
  • PTH ist der Hauptregulator des Blutcalciumspiegels und überträgt diese Wirkung mittels einer Bindung an PTH-1-Rezeptoren an Knochen- und Nierenzellen (H. M. Kronenberg et al. in "Handbook of Experimental Pharmacology, Springer-Verlag", Heidelberg (1993)). Dieser Rezeptor reagiert auch auf ein mit PTH verwandtes Peptid, einen Faktor, der in der embryonischen Knochenentwicklung eine Rolle spielt und das verursachende Mittel für die Hyperkalzämie der Malignität ist (B. Lanske et al., Science 273:663–666 (1996)). Es ist gezeigt worden, dass PTH- und PTHrP-Peptide potente anabole Wirkungen auf Knochen haben, und daher ist es möglich, dass PTH-1-Rezeptoragonisten schlussendlich zur Behandlung von metabolischen Knochenkrankheiten wie Osteoporose verwendet werden können (D. W. Dempster et al., Endocr. Rev. 14(6):690–709 (1994)).
  • Beim vollständig bioaktiven PTH(1-34)-Peptid befinden sich die Hauptdeterminanten der rezeptorbindenden Affinität innerhalb der Aminosäuren 15 bis 34 (S. R. Nussbaum et al., J. Biol. Chem. 255:10183–10187 (1980); T. J. Gardella et al., Endocrinology 132(5):2024–2030 (1993); M. P. Caulfield et al., Endocrinology 127:83–87 (1990); A. B. Abou-Samra et al., Endocrinology 125:2215–2217 (1989)), die unter PTH und PTHrP von verschiedenen Spezies mäßig konserviert bleiben (L. J. Suva et al., Science 237(4817):893–896 (1987)). Die Determinanten der Rezeptoraktivierung liegen innerhalb der strenger konservierten aminoterminalen Reste, und eine Deletion dieser Reste ergibt kompetitive PTH-1-Rezeptorantagonisten (N. Horiuchi et al., Science 220:1053–1055 (1983); R. F. Nutt et al., Endocrinology 127:491–493 (1990)). Zuvor ist nicht gefunden worden, dass aminoterminale PTH- oder PTHrP-Fragmente, deren Länge kürzer als diejenige von PTH(1-27) ist, biologisch aktiv sind (M. Rosenblatt, Pathobilogy Annual, Raven Press, New York, 11:53–84 (1981); a. Azarani et al., J. Biol. Chem. 271 (25):14931–14936 (1996); G. W. Gregear et al., Endocrinology 93:1349–1353 (1973)), obwohl sich aufgrund der funktionellen Wichtigkeit und der evolutionären Konservierung der aminoterminalen Reste vorhersagen lässt, dass sie mit dem Rezeptor in eine direkte Wechselwirkung treten.
  • Der PTH-1-Rezeptor koppelt stark an den Adenylaylcyclase/Proteinkinase-A-Signalstoff-Stoffwechselweg und in einigen Einstellungen an andere Stoffwechselwege einschließlich derjenigen, die von Phospholipase C/Proteinkinase C und intrazellulärem Calcium vermittelt werden (A. B. About-Samra et al., Endocrinology 129:2547–2554 (1991); H. Jüppner et al., Science 254:1024–1026 (1991); J. Guo et al., Endocrinology 136:3884–3891 (1995); K. A. Hruska et al., J. Clin. Invest. 79:230–239 (1987); H. J. Donahue et al., J. Biol. Chem. 263:13522–13527 (1988)). Der PTH-1-Rezeptor ist ein Mitglied der Familie-B-Untergruppe von Rezeptoren, die an das G-Protein gekoppelt sind, die auch die Rezeptoren für Calcitonin und Secretin einschließt (L. F. Kolakowski, "GCRDb: A G-Protein-Couplec Receptor Database", Receptors and Channels 2:1–7 (1994)). Mutagenese- und Vernetzungsstudien deuten darauf hin, dass mehrere Domänen dieser Rezeptoren einschließlich der großen aminoterminalen, extrazellulären Domäne, der extrazellulären Schleifen und der Transmembran-Helices zur Ligand-Wechselwirkung beitragen (H. Jüppner et al., Endocrinology 134:879–884 (1994); C. Lee et al., Mol, Endo. 9:1269–1278 (1995); P. Turner et al., ). Bone Min. Res. 12(1): Abstract 121 (1997); F. Dautzenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:4941–4946 (1998); M. Holgmann et al., J. Biol. Chem. 270:14394–14398 (1995); V. DeAlmeida und K. Mayo, Mol, Endo. 12:750–765 (1998); S. Stroop et al, Biochem. 34:1050–1057 (1994); A. Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3644–3649 (1997); A. Bisello et al., J. Biol. Chem. 273:22 498–22 505 (1998)). Untersuchungen, bei denen chimäre PTH/Calcitonin-Rezeptoren und Hybridliganden eine allgemeine Topologie der Wechselwirkung haben vermuten lassen, bei der die aminoterminale, extrazelluläre Domäne des Rezeptors die carboxylterminale Bindungsdomäne des Liganden erkennt, während der "Kern"bereich des Rezeptors, der die sieben Transmembranhelices und Verbindungsschleifen enthält, den aminoterminalen Signalteil des Liganden erkennt (C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem. 271:26469–26472 (1996)). Ähnliche Schlüsse wurden aus früheren Studien von Rezeptorchimären (H. Jüppner et al., Endocrinology 134:879–884 (1994); S. Stroop et al., Biochem. 34:1050–1057 (1994); T. J. Gardella et al., Endocrinology 135:1186–1194 (1994)) und and kürzlich durchgeführten Vernetzungsstudien mit photochemisch reaktiven PTH-Analoga (A. Bisello et al., J. Biol. Chem. 273:22498–22505 (1998); M. Mannstadt et al., J. Biol. Chem. 273:16890–16896 (1998)) gezogen.
  • In der vorliegenden Studie untersuchen wir die Signalkomponente der Wechselwirkung zwischen PTH und dem PTH-1-Rezeptor unter Verwendung eines Ansatzes auf Domänenbasis. Bei diesem Ansatz werden kurze, aminoterminale PTH-Fragmentanaloga und eine PTH-Rezeptormutante, der das Meiste der aminoterminalen, extrazellulären Domäne fehlt, verwendet. Die Ergebnisse von mit diesen kleineren Liganden und Rezeptoren durchgeführten cAMP-Signalweg-Assays demonstrieren, dass das konservierte aminoterminale (H. M. Kronenberg et al., in "Handbook of Experimental Pharmacology", Springer Verlag, Heidelberg (1993); B. Lanske et al., Science 273:663–666 (1996); D. W. Dempster et al., Endocr. Rev. 14(6):690–709 (1994); S. R. Nussbaum et al., J. Biol. Chem. 255:10183–10187 (1980); T. J. Gardella et al., Endocrinology 132(5):2024–2030 (1993); M. P. Caulfield et al., Endocrinology 127:83–87 (1990); A. B. Abou-Samra et al., Endocrino logy 125:2215–2217 (1989); L. J. Suva et al., Science 237(4817):893–896 (1987); N. Horiuchi et al., Science 220:1053–1055 (1983); R. F. Nutt et al., Endocrinology 127:491–493 (1990); M. Rosenblatt, Pathobilogy Annual, Raven Press, New York, 11:53–84 (1981); A. Azarani et al., J. Biol. Chem. 271(25):14931–14936 (1996); G. W. Tregear et al., Endocrinology 93:1349–1353 (1973); A. B. About-Samra et al., Endocrinology 129:2547–2554 (1991)) Segment von PTH als autonome Signaldomäne wirkt und dass diese Domäne mit dem Kernbereich des Rezeptors in Wechselwirkung tritt.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • PTH ist der Hauptregulator von Blutcalciumspiegeln und überträgt diese Wirkung mittels einer Bindung an PTH-1-Rezeptoren an Knochen- und Nierenzellen. PTH-1-Rezeptoragonisten können schlussendlich zur Behandlung von metabolischen Knochenkrankheiten wie Osteoporose verwendet werden. Somit besteht im Fachgebiet ein hoher Bedarf an einer Entwicklung von neuem und verbesserten PTH und neuen und verbesserten PTH-Rezeptorreagenzien zur Behandlung von humanen Krankheiten.
  • In einer ersten Ausführungsform macht die Erfindung ein neues PTH-1-Rezeptor-Polypeptid, rδNt, verfügbar, das durch eine Deletion der extrazellulären, aminoterminalen Ligandbindungsdomäne gekennzeichnet ist. Die Erfindung macht auch Nucleinsäuremoleküle verfügbar, die das rδNt-Rezeptorpolypeptid codieren.
  • In einer zweiten Ausführungsform ist der rδNt-Rezeptor der Erfindung für Screening-Verfahren brauchbar, die zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der PTH-Rezeptorfunktion entworfen sind. Die Erfindung macht ein Screening unter Verwendung entweder einer cAMP-Anreicherung oder einer kompetitiven Bindung zur Auswertung der Testverbindungen mit den rδNt-Rezeptor exprimierenden Zellen verfügbar.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1. Präsentation der Nucleinsäuresequenz und der Aminosäuresequenz des mutierten PTH1R-Rezeptors, rδNt.
  • 2. cAMP-stimulierende Aktivität von PTH-Fragmenten in LLC-PK1-Zellen. A) Analoge oder aminoterminale rPTH-Fragmente von Ratten-PTH(1-34) wurden auf ihre cAMP-stimulierende Aktivität in einer von LLC-P1 stammenden, mit dem humanen PTH-1-Rezeptor stabil transfizierten Zelllinie (HKRK-B7) getestet. Zellen wurden 60 min lang bei 22°C mit den angegebenen Dosen mit Peptid behandelt. Intrazelluläres cAMP wurde gemäß der Beschreibung unter "experimentelle Verfahren" mittels RIA gemessen. Dargestellt sind kombinierte Daten (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) aus drei getrennten, jeweils doppelt durchgeführten Experimenten gemessen. B) HKRK-B7-Zellen oder untransfizierte LLC-PK1 wurden mit rPTH(1-34) oder rPTH(1-14) behandelt, und intrazelluläres cAMP wurde gemessen. Dargestellt sind Daten (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) aus einem einzigen, repräsentativen, doppelt durchgeführten Experiment.
  • 3. Alanin-Scan von PTH(1-14). HKRK-B7-Zellen wurden mit 100 mM von einer von 14 verschiedenen rPTH(1-14)-Analogen behandelt, von denen jede eine verschiedene Alanin-Substitution an der angegebenen Aminosäureposition aufwies. Die resultierenden cAMP-Konzentrationen entsprachen der Beschreibung unter "experimentelle Verfahren". Dargestellt sind die kombinierten Daten (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) aus drei getrennten Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. Die mittleren (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) basalen cAMP-Konzentrationen, die in den drei Experimenten beobachtet wurden, betrugen 2,1 ± 0,1 pmol/Napf, und die maximale Reaktion auf rPTH(1-34) bei 0,1 mM betrug 254 ± 16 pmol/Napf.
  • 4. PTH-Reaktionen intakter und gestutzter PTH-1-Rezeptoren in COS-7-Zellen. Oben dargestellt sind schematische Darstellungen der intakten (A) und der gestutzten (B) Ratten-PTH-1-Rezeptoren, die zur transienten Transfektion von COS-7-Zellen verwendet wurden, und nachfolgende Assays auf die cAMP-Reaktion. Die konservierten extrazellulären Cysteinreste sind als Kreissymbole dargestellt und gemäß der Sequenzposition nummeriert, und die neun Aminosäuren der epitopen Markierungssubstanz (HA) in rWT-HA sind schattiert dargestellt. Die Markierungen an den Resten 26 und 181 stellen die Endpunkte der Deletion von rδNt dar. Auf der Grundlage der vorhergesagten Signalpeptid-Spaltstelle bei Ala-22 werden die Reste 23–25 in rδNt mit Rest 182 verbunden. Die cAMP-Reaktionen von COS-7-Zellen, die den intakten Rezeptor (C) und rδNt (D) bis rPTH(1-34) (J) oder rPTH(1-14) (C) exprimieren, sind ebenfalls dargestellt. Die Diagramme zeigen vereinigte Daten (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) aus fünf getrennten Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt wurden.
  • 5. Alanin-Scan von PTH(1-14) mit intakten und gestutzten PTH-Rezeptoren. Vorrübergehend mit rWT-HA (A) oder rCEI-G (B) transfizierte COS-7-Zellen wurden mit 100 mM nativem Ratten-PTH(1-14) oder 100 mM eines eine einzige Alaninsubstitution enthaltenden rPTH(1-14)-Analogons 1 h lang bei 21°C behandelt, und die resultierenden intrazellulären cAMP-Konzentrationen wurden mittels RIA gemessen. Die Aminosäuresubstitutionen sind auf den Bezeichnungen der Achsen aufgeführt. Peptide wurden doppelt getestet, und ein einziges, für die drei anderen repräsentatives Experiment ist dargestellt.
  • 6. Spezifität des gestutzten Liganden und des PTH-Rezeptors. Vorrübergehend entweder mit rWT-HA (A), rδNt (B) oder dem intakten Ratten-Sekretinrezeptor (C) transfizierte COS-7-Zellen wurden 60 min lang bei 22°C mit den aufgeführten Peptiden behandelt, und die resultierenden intrazellulären cAMP-Konzentrationen wurden mittels RIA quantifiziert. Die Konzentration der während der Inkubationen vorhandenen Peptide war wie folgt: rPTH(1-34) 0,1 mM; rPTH(1-14) 100 mM; Sekretin(1-27) 1 mM und Sekretin(1-13) 100 mM. Dargestellt sind die Daten (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts) aus einem, doppelt durchgeführtem Experiment, und dieses wurde noch zweimal mit äquivalenten Ergebnissen wiederholt.
  • 7. Antagonisteigenschaften von PTHrP(7-34) mit PTH(1-14). Mit rWT-HA (A) oder rδNt (B) transfizierte COS-7-Zellen wurden mit dem Antagonisten [Leu11,D-Trp12]hPTHrP(7-34)NH2 (oder Puffer allein) 5 min lang bei 22°C behandelt, gefolgt entweder vom rPTH(1-34)- oder vom rPTH(1-14)-Agonist-Peptid. Inkubationen wurden 30 min lang bei 21°C fortgesetzt, und die resultierenden cAMP-Konzentrationen wurden mittels RIA gemessen, wie unter "experimentelle Verfahren" beschrieben ist. Die Endkonzentration des während der Inkubation vorhandenen Antagonist-Peptids betrug 10 mM. Dargestellt sind Daten eines einzigen Experiments, das dreimal durchgeführt wurde. Eine Wiederholung desselben Experiments ergab äquivalente Ergebnisse.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung macht isolierte Nucleinsäuremoleküle verfügbar, die ein Polynucleotid umfassen, das das rδNt-Rezeptorpolypeptid codiert, ein neues, mutantes PTH1R-Rezeptorpolypeptid mit der in 1 dargestellten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2), das durch das Sequenzieren einer klonierten cDNA bestimmt wurde. Das rδNt-Protein der vorliegenden Erfindung teilt eine Sequenzhomologie mit zuvor identifizierten nichtmutanten PTH1R- und PTH2R-Sequenzen. Die in Figur (SEQ ID Nr. 1) dargestellte Nucleotidsequenz wurde durch das Sequenzieren eines cDNA-Klons (rδNt) erhalten, der am 28. Dezember 1999 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–2209 hinterlegt und dem die Hinterlegungsnummer PTA-1136 gegeben wurde.
  • 1. Der rδNt-Rezeptor
  • a) Nucleinsäuremoleküle
  • Sofern nichts anderes aufgeführt ist, wurden alle Nucleotidsequenzen, die hier durch das Sequenzieren eines DNA-Moleküls bestimmt wurden, durch manuelles Sequenzieren bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die mit hier bestimmten DNA-Molekülen codiert waren, wurden durch eine Translation einer oben bestimmten DNA-Sequenz vorhergesagt. Daher kann, wie im Fachgebiet bekannt ist, für eine beliebige DNA-Sequenz, die durch diesen Zugang bestimmt ist, eine hier bestimmte beliebige Nucleotidsequenz einige Fehler enthalten. Durch manuelles Sequenzieren bestimmte Nucleotidsequenzen sind typischerweise zu wenigstens etwa 95% bis wenigstens etwa 99,9% mit der tatsächlichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls identisch. Wie auch im Fachgebiet bekannt ist, bewirkt eine einzelne Insertion oder Deletion in einer bestimmten Nucleotidsequenz im Vergleich zur tatsächlichen Sequenz eine solche Rasterverschiebung der Translation der Nucleotidsequenz, dass die vorhergesagte von einer bestimmten Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz von derjenigen Aminosäuresequenz, die tatsächlich vom sequenzierten DNA-Molekül codiert wird, beginnend am Punkt einer solchen Insertion oder Deletion vollständig verschieden ist.
  • Unter Anwendung der hier zur Verfügung gestellten Informationen, wie der Nucleotidsequenz in den 1, kann unter Verwendung von standardmäßigen Techniken ein ein jeweiliges rδNt-Polypeptid codierendes Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Klonierungs- und Screening-Verfahren zur Isolation der Wildtyp-PTH1R-Sequenz wie diejenigen zum Klonieren von cDNA unter Verwendung von mRNA als Ausgangsstoff sind bekannt. Nach dem Klonieren des Wildtyp-Rezeptors kann gemäß der Beschreibung hier eine zweckmäßige Deletion in der Sequenz erfolgen. Veranschaulichend für die Erfindung wurde das in 1 (SEQ ID Nr. 1) beschriebene Nucleinsäuremolekül erhalten, indem im Fachgebiet standard mäßige Restriktionsenzym-Aufschluss- und Klonierungstechniken verwendet wurden. Die bestimmte Nucleotidsequenz der rδNt-cDNA von 1 (SEQ ID Nr. 1) enthält ein offenes Leseraster, das ein Protein mit etwa 435 Aminosäureresten mit einer vorhergesagten Leader-Sequenz mit etwa 22 Aminosäureresten codiert. Die Aminosäuresequenz des vorhergesagten reifen rδNt-Rezeptors ist in 1 vom Aminosäurerest 23 bis zum Rest von etwa 435 dargestellt. Das in 1 dargestellte rδNt-Protein (SEQ ID Nr. 2) ist zu etwa 84% mit dem PTH1-Rezeptor der Ratte identisch.
  • Wie aufgeführt wurde, macht die vorliegende Erfindung auch die reife(n) Form(en) des rδNt-Rezeptors der vorliegenden Erfindung verfügbar. Gemäß der Signalhypothese haben von Säugetierzellen exprimierte Proteine eine Signal- oder sezernierende Leader-Sequenz, die vom reifen Protein abgespalten wird, sobald der Export der wachsenden Proteinkette über das raue endoplasmatische Retikulum initiiert ist. Die meisten Säugetierzellen und sogar Insektenzellen spalten sezernierte Proteine mit derselben Spezifität. In einigen Fällen ist die Spaltung eines sezernierten Proteins aber nicht vollständig gleichmäßig, was zu einer oder mehreren reifen Spezies auf dem Protein führt. Weiterhin ist seit Langem bekannt, dass die Spaltungsspezifität eines sezernierten Proteins letztendlich von der Primärstruktur des vollständigen Proteins bestimmt wird, d.h., sie ist für die Aminosäuresequenz des Polypeptids inhärent. Daher macht die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz verfügbar, die die reifen rδNt-Polypeptide mit derjenigen Aminosäuresequenz codiert, die von demjenigen cDNA-Klon codiert wird, der in dem als ATCC-Hinterlegungsnr. PTA-1136 gekennzeichneten und in 1 als (SEQ ID Nr. 2) veranschaulichten Wirt enthalten ist. Mit dem reifen rδNt-Protein mit der Aminosäuresequenz, die von demjenigen cDNA-Klon codiert wird, der in dem als ATCC-Hinterlegungsnr. PTA-1136 gekennzeichneten Wirt enthalten ist, ist gemeint, dass die reife(n) Form(en) des rδNt-Rezeptors, die durch Expression in einer Säugetierzelle (z.B. den unten beschriebenen COS-Zellen) des kompletten offenen Leserasters, das von der DNA-Sequenz des im Vektor im hinterlegten Wirt enthaltenen Klons codiert wird, erzeugt werden. Wie unten aufgeführt ist, kann sich der reife rδNt-Rezeptor mit der Aminosäurese quenz, die von dem in ATCC-Hinterlegungsnr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Klon codiert wird, vom vorhergesagten, in 1 dargestellten "reifen" rδNt-Protein (Aminosäuren von etwa 23 bis etwa 435) in Abhängigkeit von der Genauigkeit der vorhergesagten Spaltung unterscheiden oder auch nicht.
  • Verfahren zur Vorhersage, ob ein Protein einen Sekretions-Leader hat, und die Spaltstelle für diese Leader-Sequenz sind verfügbar. Zum Beispiel können die Methoden von McGeoch (Virus Res. 3:271–286 (1985)) und von Heinje (Nucleic Acids Res. 14:4683–4690 (1986)) verwendet werden. Die Genauigkeit der Vorhersage der Spaltstellen bekannter Säugetier-Sekretionsproteine für jede dieser Methoden liegt im Bereich von 75–80%, von Heinje, s.o. Die beiden Methoden ergeben für ein gegebenes Protein aber nicht immer denselben (dieselben) vorhergesagten Spaltstelle(n). Eine rechnerische Methode kann im Computerprogramm "PSORT" (K. Nakai und M. Kanehisa, Genomics 14:897–911 (1992)), bei dem es sich um ein Expertensystem zur Vorhersage der zellulären Position eines Proteins auf der Grundlage der Aminosäuresequenz handelt, gefunden werden. Als Teil dieser rechnerischen Vorhersage der Lokalisierung sei auf die Methoden von McGeoch und von Heinje ausdrücklich Bezug genommen.
  • Im vorliegenden Fall wurde die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vollständigen rδNt-Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch einen Vergleich mit der Ratten-rδNt-Sequenz auf strukturelle Eigenschaften analysiert. Diese Analyse ergab die Vorhersage einer Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 22 und 23 in 1 (SEQ ID Nr. 2). Somit wird vorhergesagt, dass die Leader-Sequenz für das rδNt-Rezeptorprotein aus den Aminosäureresten 1–22 in 1 (Aminosäurereste 1 bis 22 in SEQ ID Nr. 2) besteht, während das vorhergesagte reife rδNt-Protein aus den Resten 23–435 (Aminosäurereste 23 bis 435 in SEQ ID Nr. 2) besteht.
  • Wie aufgeführt ist, können Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Form von RNA wie mRNA oder in Form von DNA einschließlich beispielsweise cDNA und genomische DNA, die durch Klonen erhalten oder synthetisch hergestellt wird, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Einsträngige DNA oder RNA kann als codierender Strang, auch bekannt als Sense-Strang, vorliegen, oder er kann der nichtcodierende, auch als Antisense-Strang bezeichnete Strang vorliegen.
  • Für einen Durchschnittsfachmann ist aber ersichtlich, dass aufgrund der Möglichkeiten von Sequenzerungsfehlern das von der hinterlegten cDNA codierte rδNt-Rezeptorpolypeptid etwa 435 Aminosäuren umfasst, die Anzahl aber irgendwo im Bereich von 425–435 Aminosäuren liegen kann, und dass die Leader-Sequenz dieses Proteins etwa 22 Aminosäuren umfasst, die Anzahl aber irgendwo im Bereich von etwa 10 bis etwa 30 Aminosäuren liegen kann.
  • Wie aufgeführt ist, können Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Form von RNA wie mRNA oder in Form von DNA einschließlich beispielsweise cDNA und genomischer DNA, die durch Klonen erhalten oder synthetisch hergestellt wird, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Einsträngige DNA oder RNA kann als codierender Strang, auch bekannt als Sense-Strang, vorliegen, oder er kann als der nichtcodierende, auch als Antisense-Strang bezeichnete Strang vorliegen.
  • (Ein) "Isolierte(s)" Nucleinsäuremolekül(e) soll(en) ein Nucleinsäuremolekül, DNA oder RNA, sein, das (die) aus seiner (ihrer) natürlichen Umgebung entfernt wurde(n). Zum Beispiel werden für die Zwecke der Erfindung rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele für isolierte DNA-Moleküle umfassen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen enthalten sind, oder (teilweise oder im Wesentlichen) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in-vivo- oder in-vitro-RNA-Transkripte der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin solche synthetisch hergestellten Moleküle.
  • Isolierte Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen DNA-Moleküle, die ein in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestelltes offenes Leseraster (ORF) umfassen; DNA-Moleküle, die die codierende Sequenz für den in 1 (SEQ ID Nr. 2) dargestellten rδNt-Rezeptor umfassen, und DNA-Moleküle, die eine Sequenz umfassen, die von den oben beschriebenen im Wesentlichen verschieden ist, die aber aufgrund einer Degeneration dennoch den rδNt-Rezeptor codiert. Der genetische Code ist im Fachgebiet natürlich wohlbekannt. Somit wäre die Erzeugung solcher degenerierter Varianten für einen Fachmann Routine.
  • In einem anderen Aspekt macht die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle verfügbar, die das rδNt-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die vom cDNA-Klon codiert wird, der in dem als ATCC-Hinterlegungsnr. PTA-1136 am 28 Dezember 1999 hinterlegten Plasmid enthalten ist, codieren. Vorzugsweise codiert das Nucleinsäuremolekül das reife Polypeptid, das vom oben beschriebenen, hinterlegten cDNA-Klon codiert wird. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Nucleinsäuremolekül verfügbar gemacht, das das rδNt-Polypeptid oder das rδNt-Polypeptid, dem das N-terminale Methionin fehlt, codiert. Die Erfindung macht auch ein isoliertes Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidstruktur oder die Nucleotidstruktur der im oben beschriebenen, hinterlegten Klon enthaltenen rδNt-cDNA oder ein Nucleinsäuremolekül mit einer zu den obigen Sequenzen komplementären Sequenz verfügbar. Solche isolierten Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, sind durch eine in situ erfolgende Hybridisierung mit Chromosomen als Sonden für die Genkartierung und zum Nachweis der Detektion des rδNt-Gens in humanem Gewebe, zum Beispiel mittels der Northern-Blot-Analyse, brauchbar.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Fragmente der isolierten hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle. Ein Fragment eines isolierten Nucleinsäuremoleküls mit der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA oder der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) soll Fragmente mit einer Länge von wenigstens etwa 15 nt und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 20 nt und immer noch mehr bevorzugt wenigstens 30 nt und sogar noch mehr bevorzugt von wenigstens 40 nt sein, die als die hier beschriebenen Diagnosesonden und Primer brauchbar sind. Natürlich sind gemäß der vorliegenden Erfindung größere Fragmente mit einer Länge von etwa 50–1550 nt und noch mehr bevorzugt Fragmente mit einer Länge von wenigstens etwa 600 nt auch brauchbar, so wie Fragmente, die der Nucleotidsequenz der hinterlegten oder in 1 dargestellten (SEQ ID Nr. 1) cDNA überwiegend, wenn nicht vollständig, entsprechen. Ein Fragment mit einer Länge von wenigstens 20 nt soll zum Beispiel Fragmente sein, die 20 oder mehr benachbarte Basen aus der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA oder der in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellten Nucleotidsequenz einschließen.
  • Bevorzugte Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung umfassen Nucleinsäuremoleküle, die Folgendes codieren: ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne des rδNt-Rezeptors (über die vorhergesagt ist, dass sie aus den Aminosäureresten von etwa 23 bis etwa 147 in 1 besteht (oder den Aminosäureresten von etwa 23 bis etwa 147 in SEQ ID Nr. 2)) umfasst; ein Polypeptid, das die Transmembrandomäne des rδNt-Rezeptors umfasst (über die vorhergesagt ist, dass sie aus den Aminosäureresten von etwa 148 bis etwa 416 in 1 (oder den Aminosäureresten von etwa 148 bis etwa 416 in SEQ ID Nr. 2)) besteht; und ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne des rδNt-Rezeptors umfasst, wobei alle oder ein Teil der Transmembrandomäne deletiert ist. Wie oben bei der Leader-Sequenz sind die Aminosäurereste, aus denen die extrazelluläre und die transmembrane Domäne des rδNt-Rezeptors besteht, vorhergesagt worden. Somit können, wie für einen Durchschnittsfachmann ersichtlich wäre, die Aminosäurereste, aus denen diese Domänen bestehen, in Abhängigkeit von den zur Definition einer jeden Domäne verwendeten Kriterien leicht (z.B. um etwa 1 bis etwa 15 Aminosäurereste) variieren.
  • Bevorzugte Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung umfassen auch Nucleinsäuremoleküle, die epitoptragende Bereiche des rδNt-Rezeptorproteins codieren. Wie ein Fachmann wissen würde, kann eine Nucleinsäuresequenz zur Vorhersage der darin codierten Polypeptidsequenz verwendet werden. Solche Informationen können dann zur Vorhersage von Antigendeterminanten im Polypeptid, die mit den entsprechenden Polynucleotidbereichen, die die durch die Analyse identifizierten Antigendeterminanten codieren, in Beziehung gesetzt werden können, verwendet werden. Verfahren zur Vorhersage der Antigendeterminanten eines Polypeptids sind im Fachgebiet wohlbekannt.
  • Verfahren zur Bestimmung anderer solcher epitoptragender Bereiche des rδNt-Proteins sind ausführlich unten beschrieben.
  • In einem anderen Aspekt macht die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül verfügbar, das ein Polynucleotid umfasst, das unter strengen Hybridisierungsbedingungen mit einem Teil des oben beschriebenen Polynucleotids in einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung, zum Beispiel den cDNA-Klonen, die in den ATCC-Hinterlegungsnummern PTA-1136, PTA-1138, PTA-1139, PTA-1140, PTA-1142, PTA-1137 oder PTA-1141 enthalten sind, hybridisiert. "Strenge Hybridisierungsbedingungen" sollen eine über Nacht erfolgende Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,6), 5 × Denhard-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA umfasst, gefolgt von einem Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C, bedeuten.
  • Ein Polynucleotid, das an einem "Teil" eines Polynucleotids hybridisiert, soll ein Polynucleotid (entweder DNA oder RNA) bezeichnen, das an wenigstens etwa 15 Nucleotide (nt) und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 20 nt, immer noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 30 nt und sogar noch mehr bevorzugt etwa 30–70 nt des Bezugs-Polynucleotids hybridisiert. Diese sind als Diagnosesonden und Primer brauchbar, wie oben und ausführlicher unten diskutiert ist.
  • Mit einem Teil eines Polynucleotids beispielsweise "mit einer Länge von wenigstens 20 nt" sind 20 oder mehr benachbarte Nucleotide der Nucleotidse quenz des Bezugs-Polynucleotids (z.B. der hinterlegten DNA oder der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) gemeint.
  • Natürlich wäre ein Polynucleotid, das nur an der Poly-A-Sequenz (wie dem 3'-terminalen Poly-(A)-Trakt der in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellten rδNt-Rezeptor-cDNA oder an einem komplementären Stück von T- (oder U-)Resten hybridisiert, nicht in ein zur Hybridisierung eines Teils einer Nucleinsäure der Erfindung verwendetes Polynucleotid der Erfindung eingeschlossen, weil ein solches Polynucleotid an jedem Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das ein Poly(A)-Stück oder dessen Ergänzung (z.B. praktisch jeder doppelsträngige cDNA-Klon) enthält.
  • Wie aufgeführt ist, können ein rδNt-Polypeptid codierende Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen einschließen, die die Aminosäuresequenz der reifen Polypeptide als solche codieren; die codierende Sequenz für die reifen Polypeptide und zusätzliche Sequenzen wie diejenigen, die die Leader- oder sekretorische Sequenz der Aminosäure codieren, wie eine Pre- oder Pro- oder Prepro-Proteinsequenz; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die oben erwähnten zusätzlichen codierenden Sequenzen zusammen mit zusätzlichen, nicht codierenden Sequenzen einschließlich beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Introns und nicht codierende 5'- und 3'-Sequenzen wie die transkribierten, nicht translatierten Sequenzen, die eine Rolle bei der Transkription, der mRNA-Verarbeitung einschließlich Spleiß- und Poyladenylierungsignalen, zum Beispiel der Ribosomenbindung und Stabilität von mRNA, spielen; eine zusätzliche codierende Sequenz, die für zusätzliche Aminosäuren wie diejenigen, die zusätzliche Funktionalitäten ergeben, codiert. Somit kann die das Polypeptid codierende Sequenz mit einer Markersequenz wie einer Sequenz, die ein Peptid codiert, das die Reinigung des verschmolzenen Polypeptids erleichtert, verschmolzen werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Marker-Aminosäuresequenz ein Hexahistidinpeptid wie die Markierungssubstanz, die u.a. in einem pQE-Vektor (Qiagen Inc.) zur Verfügung steht, wobei viele davon kommerziell verfügbar sind. Wie beispielsweise in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821–824 (1989) beschrieben ist, ermöglicht zum Beispiel Hexahistidin eine zweckmäßige Reinigung des Fusionsproteins. Die Markierungssubstanz "HA" ist ein weiteres zur Reinigung brauchbares Peptid, das einem Epitop entspricht, das vom Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt, das von Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) beschrieben worden ist. Wie unten diskutiert ist, umfassen andere solche Proteine den am Amino- oder C-Terminus verschmolzenen rδNt-Rezeptor.
  • Die vorliegende Erfindung macht weiterhin Varianten der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, die Teile, Analoge oder Derivate des rδNt-Rezeptors codieren, verfügbar. Varianten wie eine natürliche, allele Variante können natürlich vorkommen. Mit einer "allelen Variante" ist eine von mehreren alternativen Formen eines Gens gemeint, die einen gegebenen Genort auf einem Chromosom eines Organismus einnimmt, Genes II, B. Lewin, Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985). Nicht natürlich auftretende Varianten können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Mutagenesetechniken hergestellt werden.
  • Solche Varianten umfassen diejenigen, die durch Nucleotidsubstitutionen, Deletionen oder Additionen, die ein oder mehrere Nucleotide betreffen können, erzeugt werden. Die codierenden Bereiche, die nicht codierenden Bereiche oder beide Bereiche der Varianten können geändert werden. Änderungen in den codierenden Bereichen können konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen erzeugen. Besonders bevorzugt von diesen sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und die Aktivitäten des rδNt-Rezeptors oder von Teilen davon nicht ändern. Auch bevorzugt in dieser Hinsicht sind konservative Substitutionen.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zu wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit (a) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid mit voller Länge mit der vollständigen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 einschließlich der vorhergesagten Leader-Sequenz codiert; (b) einer Nucleotidsequenz, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2, aber ohne das N-terminate Methionin codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die den reifen rδNt-Rezeptor (Polypeptid mit voller Länge, wobei der Leader entfernt wurde) mit der Aminosäuresequenz in den Positionen von etwa 23 bis etwa 435 in SEQ ID Nr. 2; (d) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid mit voller Länge mit der vollständigen Aminosäuresequenz einschließlich des Leaders, die von dem in der ATCC-Hinterlegung Nr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird, codiert; (e) einer Nucleotidsequenz, die den reifen rδNt-Rezeptor mit der Aminosäuresequenz, die von dem in der ATCC-Hinterlegung Nr. 97883 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird, codiert; (f) einer Nucleotidsequenz, die die extrazelluläre Domäne des rδNt-Rezeptors codiert; (g) einer Nucleotidsequenz, die die Transmembran-Domäne des rδNt-Rezeptors codiert; (h) einer Nucleotidsequenz, die die extrazelluläre Domäne des rδNt-Rezeptors codiert, wobei die gesamte Transmembran-Domäne oder ein Teil davon deletiert ist, und (i) einer Nucleotidsequenz, die zu jeder der Nucleotidsequenzen in (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) oder (h) komplementär ist.
  • Mit einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zu wenigstens 95% "identisch" mit einer ein rδNt-Polypeptid codierenden Bezugs-Nucleotidsequenz ist, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids mit der Bezugssequenz identisch ist mit der Ausnahme, dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen auf jeweils 100 Nucleotide der den rδNt-Rezeptor codierenden Bezugs-Nucleotidsequenz aufweisen kann. Mit anderen Worten können zum Erhalt eines Polynucleotids mit einer Nucleotidsequenz, die zu wenigstens 95% mit einer Bezugs-Nucleotidsequenz identisch ist, bis zu 5% der Nucleotide in der Bezugssequenz deletiert oder durch ein anderes Nucleotid substituiert sein, oder die Anzahl der Nucleotide bis zu 5% der Gesamtnucleotide in der Bezugssequenz kann in die Bezugssequenz insertiert sein. Diese Mutationen der Bezugssequenz können an der 5'- oder 3'-terminalen Position der Bezugs-Nucleotidsequenz oder an einer beliebigen Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, wobei sie entweder einzeln zwischen Nucleotide in der Bezugssequenz oder in ein oder mehreren benachbarten Gruppen innerhalb der Bezugssequenz eingestreut sind.
  • In praktischer Hinsicht kann die Identität von wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% beispielsweise mit den in 1 dargestellten Nucleotidsequenzen oder mit der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA-Clone auf herkömmliche Weise mit Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bei Bestfit wird der lokale Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981) verwendet, um das beste Homologiesegment zwischen zwei Sequenzen zu finden. Bei der Verwendung von Bestfit oder einem anderen Sequenzausrichtungsprogramm zur Bestimmung, ob eine spezielle Sequenz zum Beispiel zu 95% mit einer Bezugssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung identisch ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentwert der Identität über die volle Länge der Bezugs-Nucleotidsequenz berechnet wird und alle Homologielücken von bis zu 5% der Gesamtzahl der Nucleotide in der Bezugssequenz zugelassen werden.
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die zu wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellten Nucleinsäuresequenz oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA unabhängig davon; ob diese ein Polypeptid mit einer rδNt-Rezeptoraktivität codieren, identisch sind. Dies ist so, weil sogar dann, wenn ein spezielles Nucleinsäuremolekül ein Polypeptid mit einer rδNt-Rezeptoraktivität nicht codiert, ein Fachmann immer noch wissen würde, wie das Nucleinsäuremolekül beispielsweise als Hybridisierungssonde oder als Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu verwendet wäre. Verwendungen der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, bei denen ein Polypeptid mit einer rδNt-Rezeptoraktivität nicht codiert wird, umfassen unter anderem (1) die Isolation des rδNt-Rezeptorgens oder von allelen Varianten davon in einer cDNA-Bank, (2) die in-situ-Hybridisierung (z.B. "FISH") an Metaphasen-Ausstriche von Chromosomen zum Erhalt einer präzisen chromosomalen Position des rδNt-Rezeptorgens gemäß der Beschreibung in Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988), und (3) die Northern-Blot-Analyse zur Erfassung der mRNA-Expression des rδNt-Rezeptors in speziellen Geweben.
  • Bevorzugt sind aber Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzen, die zu wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellten Nucleinsäuresequenz oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA identisch sind, die tatsächlich ein Polypeptid mit einer rδNt-Rezeptoraktivität codieren. Mit "ein Polypeptid mit einer rδNt-Rezeptoraktivität" sind Polypeptide gemeint, die eine Aktivität aufweisen, die der in einem speziellen biologischen Assay gemessenen rδNt-Rezeptoraktivität der Erfindung ähnlich, aber nicht notwendigerweise identisch damit sind. Zum Beispiel kann die rδNt-Rezeptoraktivität unter Anwendung von kompetitiven Bindungsexperimenten von markiertem PTH oder PTHrP an Zellen, die den hier beschriebenen Kandidat für ein rδNt-Polypeptid exprimieren, gemessen werden.
  • Jede den rδNt-Rezeptor exprimierende Zelllinie oder Varianten davon kann zur Untersuchung der Ligandbindung und der Aktivierung des zweiten Messengers gemäß der Beschreibung in den Beispielen 3 und 4 verwendet werden. Natürlich erkennt ein Durchschnittsfachmann sofort, dass aufgrund der Degeneration des genetischen Codes eine große Anzahl von Nucleinsäuremolekülen mit einer Sequenz, die zu wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA oder mit der in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellten Nucleinsäuresequenz identisch sind, ein Polypeptid "mit einer rδNt-Rezeptoraktivität" codieren. Tatsächlich ist dies dem Fachmann klar, auch ohne dass er den oben beschriebenen Vergleichsassay durchführt, klar, weil degenerierte Varianten dieser Nucleotidsequenzen alle dasselbe Polypeptid codieren. Weiterhin ist im Fachgebiet anerkannt, dass bei solchen Nucleinsäuremolekülen, die keine degenerierten Varianten sind, eine vernünftige Anzahl auch ein Polypeptid mit einer rδNt-Proteinaktivität codiert. Dies ist so, weil der Fachmann sich über Aminosäuresubstitutionen, die die Proteinfunktion entweder mit einer geringeren oder ohne jede Wahrscheinlichkeit signifikant beeinflussen (wobei z.B. eine aliphatische Aminosäure durch eine zweite aliphatische Aminosäure substituiert wird), vollständig im Klaren ist.
  • Zum Beispiel wird eine Anleitung bezüglich der Herstellung von phänotypisch stillen Aminosäuresubstitutionen in J. U. Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306–1310 (1990) gegeben, wo die Autoren darauf hinweisen, dass Proteine für Aminosäuresubstitutionen überraschend tolerant sind.
  • b) Vektoren und Wirtszellen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren genetisch verändert sind, und die Herstellung von rδNt-Polypeptiden oder Fragmenten davon durch Rekombinationstechniken.
  • Die Polynucleotide können an einem Vektor vereinigt werden, der einen selektierbaren Marker zur Vermehrung in einem Wirt enthält. Gewöhnlich wird ein Plasmidvektor in einen Niederschlag wie einen Calciumphosphat-Niederschlag oder in einen Komplex mit einem geladenen Lipid eingeführt. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann in vitro unter Verwendung einer zweckmäßigen Verpackungs-Zelllinie verpackt und dann in Wirtszellen transduziert werden.
  • Das DNA-Insert sollte an einen zweckmäßigen Promotor wie den Promotor Phage Lambda, PL, die Promotoren E. coli lac, trp und tac, die frühen und späten SV40-Promotoren und die Promotoren von retroviralen LTR, um einige zu nennen, operativ gebunden sein. Andere geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Die Expressionskonstruktionen enthalten weiterhin Stellen zur Initiierung, Beendigung und – im transkribierten Bereich – eine Ribosomen-Bindungsstelle zur Translation. Der codierende Bereich der reifen, von den Konstruktionen exprimierten Transkripten umfasst vorzugsweise eine Translation, die am Beginn initiiert, und ein Terminationscodon (UAA, UGA oder UAG), das am Ende des zu translatierenden Polypeptids zweckmäßig positioniert ist.
  • Wie angegeben ist, umfassen die Expressionsvektoren vorzugsweise wenigstens einen selektierbaren Marker. Solche Marker umfassen Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycinbeständigkeit für eine eukaryotische Zellkultur und Gene mit einer Resistenz gegen Tetracyclin oder Ampicillin zur Kultivierung von E. coli und anderen Bakterien. Repräsentative Beispiele für zweckmäßige Wirte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterienzellen wie E.-coli-, Streptomyces- und Salmonella-typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen; Insektenzellen wie Drosophila-S2- und Spodoptera-Sf9-Zellen; tierische Zellen wie CHO-, COS- und Bowes-Melanomzellen und Pflanzenzellen. Zweckmäßige Kulturmedien und Bedingungen für die oben beschriebenen Wirtszellen sind im Fachgebiet bekannt.
  • Unter den Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt sind, sind pQE70, pQE60 und pQE-9, erhältlich von Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich von Stragagene, und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich von Pharmacia. Unter den bevorzugten eukaryotischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich von Stratagene, und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich von Pharmacia. Andere geeignete Vektoren sind für den Fachmann leicht ersichtlich.
  • Die Einführung der Konstruktion in die Wirtszelle kann mittels einer Calciumphosphat-Transfektion, einer durch DEAE-Dextran vermittelten Transfektion, einer durch kationisches Lipid vermittelten Transfektion, eine Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Methoden bewirkt werden. Solche Methoden sind in vielen standardmäßigen Laborhandbüchern wie Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986), beschrieben.
  • Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form wie einem Fusionsprotein exprimiert werden und kann nicht nur Sekretionssignale, sondern auch zusätzliche Bereiche mit heterologen Funktionen einschließen. Zum Beispiel kann ein Bereich für zusätzliche Aminosäuren, insbesondere geladene Aminosäuren, am N-Terminus des Polypeptide hinzugefügt werden, um die Stabilität und Persistenz in der Wirtszelle während der Reinigung oder während einer anschließenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Darüber hinaus können zur Erleichterung der Reinigung Peptidreste dem Polypeptid hinzugeführt werden. Solche Bereiche können vor der endgültigen Herstellung des Polypeptids entfernt werden. Die Hinzufügung von Peptidresten zu Polypeptiden u.a. zur Erzeugung einer Sekretion oder Exkretion, zur Verbesserung der Stabilität und zur Erleichterung der Reinigung sind im Fachgebiet übliche und routinemäßige Techniken. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfasst einen heterologen Immunoglobulin-Bereich, der zur Löslichmachung von Proteinen nützlich ist. Zum Beispiel offenbart EP-A-0 464 533 (kanadisches Gegenstück 2045869) Fusionsproteine, die verschiedene Teile des konstanten Bereichs von Immunoglobulinmolekülen zusammen mit einem anderen humanen Protein oder einen Teil davon umfassen. In vielen Fällen ist der Fc-Teil in einem Fusionsprotein zur Verwendung in der Therapie und der Diagnose vollständig vorteilhaft und führt somit beispielsweise zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften (EP-A-0 232 262). Andererseits wäre es für manche Verwendungen wünschenswert, dazu in der Lage zu sein, den Fc-Teil nach der auf die beschriebene vorteilhafte Weise erfolgten Expression, Detektion und Reinigung des Fusionsproteins zu deletieren. Dies ist der Fall, wenn sich herausstellt, dass der Fc-Teil ein Hindernis bei der Verwendung bei Therapie und Diagnose ist, zum Beispiel, wenn das Fusionsprotein als Antigen für Immunisierungen verwendet werden soll. Beim Auffinden von Medikamenten, beispielsweise humanen Proteinen, ist der hIL5-Rezeptor mit Fc-Teilen zum Zweck von Screening-Assays mit hohem Durchsatz zur Identifizierung von Antagonisten von hIL-5 fusioniert worden. Siehe D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, Band 8:52–58 (1995) und K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, Band 270, Nr. 16: 9459–9471 (1995).
  • Der rδNt-Rezeptor kann aus rekombinanten Zellkulturen durch wohlbekannte Methoden einschließlich der Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, der Säureextraktion, der Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, der Phosphocellulose-Chromatographie, der Chromatographie unter Ausnutzung der hydrophoben Wechselwirkung, der Affinitätschromatographie, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Lectin-Chromatographie gewonnen und gereinigt werden. Am meisten bevorzugt wird die Hochleistungs-Flüssigchromatographie ("HPLC") zur Reinigung verwendet. Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auf natürliche Weise gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die durch rekombinante Techniken aus einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt einschließlich beispielsweise Bakterien-, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem in einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nichtglycosyliert sein. Darüber hinaus können Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch einen anfänglich modifizierten Methioninrest, in einigen Fällen als Ergebnis von wirtsvermittelten Vorgängen, einschließen.
  • c) rδNt-Polypeptide und -Fragmente
  • Die Erfindung macht weiterhin ein isoliertes rδNt-Polypeptid mit der von den hinterlegten cDNA oder der Aminosäuresequenz in 1 (SEQ ID Nr. 2) codierten Aminosäuresequenz oder ein Peptid oder Polypeptid, das einen Teil der obigen Polypeptide umfasst, verfügbar.
  • Im Fachgebiet ist anerkannt, dass einige Aminosäuresequenzen des rδNt-Rezeptors variiert werden können, ohne dass dies eine signifikante Auswirkung auf die Struktur oder Funktion des Proteins hat. Wenn solche Sequenzunterschiede beabsichtigt sind, sollte nicht außer Acht gelassen werden, dass es kritische Bereiche auf dem Protein gibt, die die Aktivität bestimmen. Somit umfasst die Erfindung weiterhin Variationen des rδNt-Rezeptors, die eine wesentliche rδNt-Rezeptoraktivität zeigen oder die Bereiche des rδNt-Proteins wie die unten diskutierten Proteinbereiche einschließen. Solche Mutanten schließen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Typsubstitutionen ein. Wie oben angegeben ist, kann eine Anleitung dazu, welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phänotypisch still sind, in J. U. Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306–1310 (1990) gefunden werden.
  • Somit kann das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von 1 (SEQ ID Nr. 2) oder desjenigen, das von den hinterlegten cDNA codiert wird, (i) eines, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste durch einen konservierten oder nichtkonservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einen konservierten Aminosäurerest) substituiert sind, und wobei ein solcher substituierter Aminosäurerest vom genetischen Code codiert sein kann oder auch nicht, oder (ii) eines, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen, oder (iii) eines, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung wie einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertsdauer des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol) fusioniert ist, oder (iv) eines, in dem zusätzliche Aminosäuren wie ein IgG-Fc-Fusionsbereichspeptid oder eine Leader- oder Sekretions-Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Proproteinsequenz verwendet wird, mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, sein. Gemäß der Lehren hier werden solche Fragmente, Derivate und Analoge als in den Rahmen des Fachwissens fallend betrachtet.
  • Von besonderem Interesse sind Substitutionen von geladenen Aminosäuren mit einer anderen geladenen Aminosäure und mit neutralen oder negativ geladenen Aminosäuren. Letzteres führt zu Proteinen mit einer verminderten positiven Ladung zur Verbesserung der Merkmale des rδNt-Proteins. Die Verhinderung einer Aggregation ist hochgradig wünschenswert. Eine Aggregation von Proteinen führt nicht nur zu einem Aktivitätsverlust, sondern kann auch bei der Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen problematisch sein, weil diese immunogen sein können. (Pinckhard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331–340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838–845 (1987); Cleland et al., Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307–377 (1993)).
  • Der Ersatz von Aminosäuren kann auch die Selektivität der Bindung an Rezeptoren auf der Zelloberfläche ändern. Ostade et al., Nature 361: 266–268 (1993) beschreiben bestimmte Mutationen, die zur selektiven Bindung von TNF-α an nur eine der beiden bekannten Typen von TNF-Rezeptoren führen. Somit kann der rδNt-Rezeptor der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen entweder aus natürlichen Mutationen oder aus einer Manipulation des Menschen einschließen.
  • Wie aufgeführt ist, sind Änderungen vorzugsweise minderer Art, wie konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen (siehe Tabelle 1). TABELLE 1. Konservative Aminosäuresubstitutionen
    Figure 00260001
  • Aminosäuren im rδNt-Protein der vorliegenden Erfindung, die für die Funktion wesentlich sind, können durch im Fachgebiet bekannte Methoden wie die ortsspezifische Mutagenese oder die Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)) identifiziert werden. Mit dem letzteren Verfahren werden einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt. Die resultierenden Mutantenmoleküle werden dann auf die biologische Aktivität wie die Rezeptorbindung oder die in-vitro-Proliferationsaktivität getestet. Für die Ligand-Rezeptor-Bindung kritische Stellen können auch durch eine Strukturanalyse wie die Kristallisation, die magnetische Kernresonanz oder die Photoaffinitätsmarkierung (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904 (1992) und de Vos et al., Science 255: 306–312 (1992) bestimmt werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in isolierter Form verfügbar gemacht. Mit einem "isolierten Polypeptid" ist ein Polypeptid gemeint, das aus seiner nativen Umgebung entfernt ist. Somit wird ein Polypeptid, das innerhalb einer rekombinanten Wirtszelle hergestellt und/oder darin enthalten ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert betrachtet. Ein "isoliertes Polypeptid" sollen auch Polypeptide sein, die aus einer rekombinanten Wirtszelle teilweise oder im Wesentlichen gereinigt worden sind. Zum Beispiel kann eine rekombinant produzierte Version des antimikrobiellen Peptid-Polypeptids durch das in Smith and Johnson, Gene 67: 31–40 (1988) beschriebene einstufige Verfahren im Wesentlichen gereinigt werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in isolierter Form verfügbar gemacht und sind vorzugsweise im Wesentlichen gereinigt. Eine rekombinant hergestellte Version des rδNt-Rezeptors kann durch das in Smith and Johnson, Gene 67: 31–40 (1988) beschriebene einstufige Verfahren im Wesentlichen gereinigt werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch das Polypeptid, das von der hinterlegten rδNt-cDNA einschließlich des Leaders codiert wird, das Polypeptid, das von der hinterlegten rδNt-cDNA ohne den Leader (d.h. das reife Protein) codiert wird, das Polypeptid von 1 (SEQ ID Nr. 2) einschließlich des Leaders, das Polypeptid von 1 (SEQ ID Nr. 2) ohne den Leader, die extrazelluläre Domäne, die Transmembrandomäne, ein Polypeptid, das die Aminosäuren von etwa 1 bis etwa 435 in SEQ ID Nr. 2 umfasst, und ein Polypeptid, das die Aminosäuren von etwa 2 bis etwa 435 in SEQ ID Nr. 2 umfasst, sowie Polypeptide, die zu wenigstens 95%, noch mehr bevorzugt zu wenigstens 96%, 97%, 98% oder 99% mit den oben beschriebenen Polypeptiden identisch sind, und sie umfassen auch Teile solcher Polypeptide mit wenigstens 30 Aminosäuren und noch mehr bevorzugt 50 Aminosäuren.
  • Mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu wenigstens beispielsweise 95% mit einer Bezugs-Aminosäuresequenz eines rδNt-Polypeptids "identisch" ist, ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Bezugssequenz mit derjenigen Ausnahme identisch ist, dass die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureänderungen auf jeweils 100 Aminosäuren der Bezugsaminosäure des rδNt-Rezeptors einschließen kann. In anderen Worten können zum Erhalt eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 95% mit einer Bezugs-Aminosäuresequenz identisch ist, bis zu 5% der Aminosäurereste in der Bezugssequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert sein, oder die Anzahl der Aminosäuren bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste in der Bezugssequenz kann in die Bezugssequenz insertiert sein. Diese Änderungen der Bezugssequenz können an der amino- oder der carboxyterminalen Position der Bezugs-Aminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen entweder einzeln in die Reste der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren benachbarten Gruppen innerhalb der Bezugssequenz eingefügt sein.
  • In praktischer Hinsicht kann die Identität von wenigstens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% beispielsweise mit der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 2) mit der von den hinterlegten cDNA-Clonen codierten Aminosäuresequenz auf herkömmliche Weise mit Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bei der Verwendung von Bestfit oder einem anderen Sequenzausrichtungsprogramm zur Bestimmung, ob eine spezielle Sequenz zum Beispiel zu 95% mit einer Bezugssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung identisch ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentwert der Identität über die volle Länge der Bezugs-Aminosäuresequenz berechnet wird und alle Homologielücken von bis zu 5% der Gesamtzahl der Aminosäurereste in der Bezugssequenz zugelassen werden.
  • 2. Agonisten und Antagonisten der rδNt-Rezeptoraktivität
  • Die funktionelle Charakterisierung der biologischen Eigenschaften des rδNt-Rezeptors der Erfindung und von dessen Derivaten können mittels Bioassays erfolgen, bei denen die ligandenstimulierte cAMP-Akkumulation gemessen wird.
  • A. Assay zum Nachweis einer Akkumulation von cyclischem AMP in Zellen, die nach einer Einwirkung von Testverbindungen den rδNt-Rezeptor exprimieren
  • Die intrazelluläre cAMP-Akkumulation wird gemäß der obigen Beschreibung (Abou-Samra et al., J. Biol. Chem. 262: 1129, 1986) gemessen. Den rδNt-Rezeptor exprimierende Zellen, die in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen gezogen wurden, wurden mit einem Kulturmedium gespült, das 0,1% BSA und 2 mM IBMX enthielt. Die Zellen werden dann 60 min lang bei 21°C mit einer Testverbindung inkubiert. Der Überstand wird entfernt, und die Zellen werden sofort gefroren, indem die gesamte Platte in Trockeneispulver gestellt wird. Intrazelluläre cAMP wird extrahiert, indem die Zellen in 1 ml einer 50 mM HCl aufgetaut werden, und mittels eines speziellen Radioimmunoassays unter Verwendung eines anti-cAMP-Antikörpers (z.B. Sigma, St. Louis, Mo) analysiert. Ein cAMP-Analogon (2'-O-Monosuccinyladenosin-3':5'-cyclischer-Monophosphattyrosylmethylester, erhalten von Sigma), der als Tracer für cAMP verwendet wird, wird mittels des Chloramin-T-Verfahrens iodiert. Freies Iod wird entfernt, indem das iodierte cAMP-Analogon auf einer C18-Sep-pak-Patrone (Waters, Milford, Mass.) adsorbiert wird. Nach dem Waschen mit dH2O wird das iodierte cAMP-Analogon mit 40% Acetonitril (ACN) und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) aus der Sep-pak-Patrone eluiert. Das iodierte cAMP-Analogon wird lyophilisiert, in 1 ml 0,1%igem TFA rekonstituiert und in eine HPLC-Säule mit einer reversierten C18-Phase (Waters) injiziert. Die Säule wird mit 10% ACN in 0,1% TFA äquilibriert und mit einem Gradienten aus 10–30% ACN in 0,1% TFA eluiert. Dies ermöglicht die Abtrennung des monoiodierten cAMP-Analogons vom nichtiodierten cAMP-Analogon. Der Tracer ist bei einer Lagerung bei –20°C bis zu 4 Monate lang stabil. Der für den Assay verwendete Standard, Adenosin-3':5'-cyclisches Monophosphat, kann von Sigma bezogen werden. Proben (1–10 82 l HCl-Extrakte) oder Standards (0,04–100 fmol/Röhrchen) werden in 50 mM Na-Acetat (pH-Wert 5,5) verdünnt und mit 10 μl einer Mischung aus Triethylamin und Essigsäureanhydrid (2:1, auf das Volumen bezogen) acetyliert. Nach der Acetylierung wird cAMP-Antiserum (100 μl) aus einer in PBS (pH-Wert 7,4), 5 mM EDTA und 1% normalem Kaninchenserum hergestellten Vorratslösung (1:4000) zugegeben. Der Tracer wird in PBS (pH-Wert 7,4) mit 0,1% BSA verdünnt und zugegeben (20 000 cpm/Röhrchen). Der Assay wird bei 4°C über Nacht inkubiert. Der gebundene Tracer wird ausgefällt, indem 100 μl Ziegen-Antikaninchen-Antiserum (1:20 in PBS) und 1 ml 7%iges Polyethylenglycol (Molmasse 5000–6000) zugegeben werden und 30 min lang bei 4°C bei 2000 U./min zentrifugiert wird. Der Überstand wird entfernt, und die gebundene Radioaktivität wird mit einem γ-Zähler (Micromedic) gezählt. Zur Berechnung der cAMP-Daten werden Logit-Berechnungen in Excel-Tabellenblättern durchgeführt. Normalerweise beträgt die Assayempfindlichkeit 0,1 fmol/Röhrchen, und die Standardkonzentration, die 50% des Tracers verdrängt, beträgt 5 fmol/Röhrchen.
  • B. Screening von Verbindungen unter Verwendung eines rδNt-Rezeptor-Bindungsassays
  • Zusätzlich zum unten beschriebenen cAMP-Akkumulationsassay ist es möglich, dass Verbindungen iodiert und in einem Assay auf der Grundlage eines Radiorezeptors in vorrübergehend mit rδNt transfizierten COS-Zellen verwendet werden. COS-7-Zellen werden in 15-cm-Platten in DMEM, 10 %igem, durch Wärme inaktiviertem FBS, 10 mg/l Gentamicin bis zu einer Konfluenz von 80–90% gezogen. 24 h nach der Transfektion mittels des DEAE/Dextran-Verfahren (Sambrook et al., s.o.) mit 1–2 μg Plasmid-DNA werden die Zellen mit Trypsin behandelt und in Kunststoffschalen mit mehreren Vertiefungen (Durchmesser 16 oder 35 mm, Costar, Cambridge, Mass.) mit einer Zellkonzentration von 5 × 104 Zellen/cm2 erneut ausplattiert.
  • Nach der Transfektion nahm die Zellanzahl nur leicht zu. Nach einer Fortsetzung der Kultivierung für weitere 48 h werden Radiorezeptor-Assays durchgeführt. Das Kulturmedium wird unmittelbar vor Beginn von Untersuchungen durch einen 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM KCl, 0,5% durch Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum (GIBCO) enthaltenden Puffer ersetzt. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden Untersuchungen mit Zellen durchgeführt, die in diesem Puffer 4 h lang bei 15°C mit 4 × 105 cpm/ml (9,6 × 1011 M) mit 125I-markiertem [Ala1]PTH(1-14)-Amid oder mit 125I-markiertem [Nle8]PTH(1-14) inkubiert sind.
  • C. Screening auf PTH-1-Rezeptorantagonisten und -agonisten
  • Der rδNt-Rezeptor der Erfindung kann unter Verwendung des cAMP-Akkumulationsassays zum Screenen auf Verbindungen verwendet werden, die agonistisch oder antagonistisch für die PTH-Reaktion sind. Den PTH-1-Rezeptor auf der Zellenoberfläche exprimierende Zellen werden mit nativem PTH(1-84) 5–60 min lang bei 37°C in Gegenwart von 2 mM IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin, Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Die cyclische AMP-Akkumulation wird mit einem speziellen, oben beschriebenen Radioimmunoassay gemessen. Eine Testverbindung, die mit nativem PTH(1-84) hinsichtlich der Bindung am rδNt-Rezeptor konkurriert und somit die Wirkung von nativem PTH(1-84) auf die cAMP-Akkumulation hemmt, wird als kompetitiver Antagonist bezeichnet. Eine solche Verbindung wäre zur Behandlung von Hyperkalzämie brauchbar.
  • Umgekehrt wird eine Testverbindung, die mit nativem PTH(1-84) hinsichtlich der Bindung an den rδNt-Rezeptor nicht konkurriert, dennoch aber eine Aktivierung der cAMP-Akkumulation durch natives PTH(1-84) (vermutlich durch ein Blockieren der Rezeptor-Aktivierungsstelle) blockiert, als nichtkonkurrierender Antagonist betrachtet. Eine solche Verbindung wäre zur Behandlung von Hyperkalzämie brauchbar.
  • Ein Kandidat für eine Verbindung, die mit nativem PTH(1-84) hinsichtlich der Bindung an den rδNt-Rezeptor konkurriert und die die cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder beim Fehlen von nativem PTH(1-84) stimuliert, ist ein kompetitiver Agonist. Ein Kandidat für die Verbindung, die mit nativem PTH(1-84) hinsichtlich der Bindung an den rδNt-Rezeptor nicht konkurriert und dennoch die cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder beim Fehlen von nativem PTH(1-84) stimuliert oder eine höhere cAMP-Akkumulation als diejenige, die bei einer PTH-Verbindung beobachtet wird, stimuliert, würde als nichtkompetitiver Agonist betrachtet.
  • Somit wird in einem weiteren Aspekt ein Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob ein Agonist oder Antagonist als Kandidat dazu fähig ist, eine zelluläre Reaktion auf PTH oder PTHrP zu verstärken oder zu hemmen, verfügbar gemacht. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen von Zellen, die das rδNt-Polypeptid exprimieren, mit einem Kandidaten für die Verbindung und dem PHT- oder PTHrP-Liganden, der Untersuchung einer zellulären Reaktion und dem Vergleich der zellulären Reaktion mit einer standardmäßigen zellulären Reaktion, wobei der Standard untersucht wird, wenn ein Kontakt mit dem Liganden in Abwesenheit des Kandidaten für die Verbindung hergestellt wird, wobei eine gegenüber dem Standard verstärkte zelluläre Reaktion darauf hindeutet, dass der Kandidat für die Verbindung ein Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalstoff-Stoffwechselweges ist, und eine im Vergleich zum Standard verminderte zelluläre Reaktion darauf hindeutet, dass der Kandidat für die Verbindung ein Antagonist des Ligand/Rezeptor-Signalstoff-Stoffwechselweges ist. Mit "Untersuchung einer zellulären Reaktion" ist eine qualitative oder quantitative Messung einer zellulären Reaktion auf einen Kandidat für eine Verbindung und/oder ein PTH oder PTHrP (z.B. eine Akkumulation von cyclischem AMP) gemeint. Mittels der Erfindung kann eine das δNt-Polypeptid exprimierende Zelle mit entweder einem körpereigenen oder körperfremden verabreichten PTH oder PTHrP in Kontakt gebracht werden.
  • Beispiele
  • Allgemeine Verfahren
  • Peptide: Peptide wurden von der Biopolymer Synthesis Facility am Massachusetts General Hospital (Boston, MA) unter Anwendung der Festphasenchemie mit Fmoc- (N-(9-Fluorenyl)methoxycarbonyl)-Schutzgruppen und einer TFA-vermittelten Spaltung und von Schutzgruppen befreit. Alle Peptide waren C-terminal amidiert. Die PTH(1-14)-Analoga wurden in einer Mehrfachpeptid-Synthesevorrichtung (Advanced Chemtech, Modell 396 MBS) im 0,025-mM-Maßstab synthetisiert. Die vervollständigten Peptide wurden durch Adsorption an einer C18-Patrone (Sep-Pak) entsalzt und dann mittels Reversed-Phase-HPCL auf der Grundlage von C18, MALDI-Massenspektrometrie und Aminosäureanalyse analysiert. Das PTH(1-34)-Kontrollpeptid, [Nle8,21,Tyr34]rPTH-(1-34)NH2, und das PTHrP(7-34)-Antagonistpeptid, [Leu11,D-Trp12]hPTHrP(7-34)NH2, wurden in einer Synthesevorrichtung von Applied Biosystems (Modell 431A) im 0,1-mM-Maßstab hergestellt, mittels Reversed-Phase-HPCL auf der Grundlage von C18 gereinigt und wie oben beschrieben charakterisiert. Konzentrierte Vorratslösungen von Peptiden, 10 mM für PTH(1-14)-Analoge und 0,3 mM für PTHrP(7-34) und PTH(1-34), wurden in 10 mM Essigsäure hergestellt, mittels Säurehydrolyse und Aminosäuresanalyse quantifiziert und bei –80°C aufbewahrt.
  • Zellkultur und DNA-Transfektion: COS-7- und HKRK-B7-Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagleschem Medium (DMEM), das in einer angefeuchteten, 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre mit fötalem Rinderserum (10%), Penicillin G (20 Einheiten/ml), Streptomycinsulfat (20 μg/ml) und Amphotericin B (0,05 μg/ml) versetzt worden war, bei 37°C kultiviert. 24 bis 16 h vor einem Assay wurden Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen in einen Inkubator mit zugeführter Feuchtigkeit, der 5% CO2 enthielt und auf 33°C eingestellt war, verbracht. Vorratslösungen von EGTA/Trypsin und Antibiotika stammten von GIBCO; das fötale Rinderserum stammte von den Hyclone Laboratories (Logan, UT). Die Derivatisierung und Charakterisierung der Zelllinie HKRK-B7 durch eine stabile Transfektion von LLC-PK1-Zellen mit einem Plasmid auf der Grundlage von pCDNA-1 (In Vitrogen, San Diego, CA), das den hPTH-1-Rezeptor codierte, wurde zuvor beschrieben (H. Takasu und F. Bringhurst, Endocrinoloy, im Druck (1998)). Diese Zellen exprimieren PTH-1-Rezeptoren bei einer Oberflächendichte von etwa 1 × 106 PHT-Bindungsstellen pro Zelle. Die HKRK-B7-Zellen wurden 24 bis 72 h, nachdem die Zellen-Monoschicht Konfluenz erreicht hatte, für funktionelle Assays verwendet.
  • Für Untersuchungen mit den intakten und gestutzten Ratten-PHT-1-Rezeptoren wurden vorrübergehende Transfektionen von COS-7-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran wie zuvor beschrieben (C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem. 272: 28861–28868)) durchgeführt. Die Konstruktion und anfängliche Charakterisierung der Plasmide auf der Grundlage von pCDNA-1, die entweder den intakten oder den gestutzten Ratten-PHT-1-Rezeptor codieren, ist zuvor beschrieben worden (C. Lee et al., Endocrinology 135(4): 1488–1495)). Der intakte Rezeptor (rWT-HA) enthält statt der Reste 93–101 der extrazellulären Domäne ein HA-Epitoptag mit neun Aminosäuren; dieses Epitoptag beeinflusst die Rezeptorfunktion nicht (C. Lee et al., Endocrinology 135(4): 1488–1495)). Der gestutzte Ratten-PHN-1-Rezeptor (rδNt) wird für die Exonen E1 bis Exon G (Reste 26 bis 181) deletiert. Unter der Annahme, dass die Spaltung der Signalpeptidase zwischen Ala-22 und Tyr-23 erfolgt (H. Nielsen et al., Protein Engineering 10: 1–6 (1997), wird vorhergesagt, dass die Reste am N-Terminus von rδNt (F. Dautzenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 4941–4946 (1998); M. Holtmann et al., J. Biol. Chem. 270: 14394–14398 (1995); V. DeAlmeida und K. Mayo, Mol. Endo. 12: 750–765 (1998)) mit Glu-182 verbunden sind (3). COS-7-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen transfiziert, wenn die Zellen eine Konfluenz von 85–95% aufwiesen, wobei 200 ng Plasmid-DNA verwendet wurden, die mittels Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Gradientenzentrifugation für jede Vertiefung gereinigt worden waren. Assays wurden 72 bis 96 h nach der Transfektion durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wurden etwa ~20% der COS-7-Zellen transfiziert und exprimierten etwa 5 × 106 Oberflächen-PTH- Rezeptorzellen pro Zelle (C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem. 272: 28861–28868)).
  • Intrazelluläre cyclische AMP: Transfizierte COS-7- oder HKRK-B7-Zellen wurden mit 500 ml Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,7, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaC12, 5% durch Wärme inaktiviertes Pferdeserum, 0,5% durch Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum) und 200 ml IBMX-Puffer (DMEM, das 2 mM IBMX, 1 mg/ml fötales Rinderserumalbumin, 35 mM Hepes-NaOH, pH-Wert 7,4) und 100 ml bindenden Puffer, dem verschiedene Mengen an Peptid zugegeben wurden, gespült. Die Platten wurden 60 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Puffer wurde dann abgezogen, und die Zellen wurden auf Trockeneis gefroren, mit 0,5 ml einer 50 mM HCl behandelt und erneut gefroren. Nach dem Auftauen wurde das Lysat um das 30-fache in dH2O verdünnt, und ein Aliquot wurde unter Verwendung eines unmarkierten cAMP als Standard mittels eines bestimmten Radioimmunoassays auf den cAMP-Gehalt analysiert.
  • Für cAMP-Inhibierungsassays wurden transfizierte COS-7-Zellen einmal mit 500 ml Bindungspuffer gespült, und 200 ml IBMX-Puffer und 100 ml Bindungspuffer oder den Antagonisten [leu11,D-Trp12]hPTHrP(7-34)NH2 (10 mM) enthaltender Bindungspuffer wurden zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 ml Bindungspuffer, der PTH(1-14) oder PTH(1-34) (Agonistpeptid) enthielt, zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 30 min fortgesetzt. Die Zellen wurden dann lysiert, und intrazelluläre cAMP-Konzentrationen wurden wie oben beschrieben gemessen.
  • Beispiel 1
  • Wirkung von PTH(1-14) in stabilen Zellen
  • Aminoterminale Peptidfragmente auf der Grundlage der Ratten-PTH-Sequenz, deren Länge von PTH(1-9) bis PTH(1-15) reichte, wurden synthetisiert und auf die Aktivität in einer von LLC-PK1 stammenden Zelllinie mit der Bezeichnung HKRK-B7, die hohe Konzentrationen (1 × 106 Rezeptoren/Zelle) des clonierten humanen PTH-1-Rezeptors (H. Takasu und F. Bringhurst, Endocrinology, im Druck (1998)) stabil exprimiert, gestestet. Wie in 1A veranschaulicht ist, übertrug das intakte Kontrollpeptid PTH(1-34) eine 50-fache Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen in Bezug auf den Basis-cAMP-Konzentration, und der bestimmte EC50 für diese Reaktion betrug ~2 nM bei PH(1-13), und bei kürzeren Fragmenten wurde eine geringe oder gar keine Erhöhung der cAMP-Akkumulation beobachtet (1A). Zwei der aminoterminalen Fragmente, PTH(1-14) und PTH(1-15), stimulierten die cAMP-Bildung um etwas das 20-fache gegenüber der Basiskonzentration, obwohl die für diese Aktivierung erforderlichen Dosen um fünf bis sechs Größenordnungen höher als diejenige Dosis war, die für PTH(1-34) erforderlich war. Die Reaktion auf diese aktiven Peptide hing vom transfizierten PTH-Rezeptor ab, weil parentale Zellen, die PTH-Rezeptoren nicht exprimieren, den verwandten Calcitoninrezeptor aber exprimieren, sprachen auf PTH(1-34) oder PTH(1-14) nicht an (2B).
  • Beim intakten Rezeptor war die Wirkung von PTH(1-14) um etwa fünf Größenordnungen schwächer als diejenige von PTH(1-34). Diese verminderte Wirkung ist nicht überraschend, weil dem PTH(1-14)-Peptid wichtige rezeptorbindende Reste fehlen, die sich im PTH(15-34)-Bereich in der PTH(15-34)-Domäne befinden (S. R. Nussbaum et al., J. Biol. Chem. 255: 10183–10187 (1980); T. ). Gardella et al., Endocrinology 132(5): 2024–2030 (1993); M. P. Caulfield et al., Endocrinology 127: 83–87 (1990) und A.-B. Abou-Samra et al., Endocrinology 125: 2215–2217 (1989)). Konsistent damit wurde unmarkiertes PTH(1-14) zu schwach gebunden, um eine Detektion in unseren standardmäßigen kompetitiven Bindungsassays, bei denen radioiodiertes rRPH(1-34) als Tracer-Ligand verwendet wurde, zu ermöglichen, und darüber hinaus konnten wir auch eine direkte Bindung des radiomarkierten PTH(1-14)-Analogous mit den in dieser Untersuchung verwendeten intakten oder gestutzten Rezeptoren nicht nachweisen (Daten nicht aufgeführt).
  • Beispiel 2
  • Alanin-Scanning on PTH(1-14)
  • Um Reste im PTH(1-14)-Fragment zu identifizieren, die eine Rolle bei der Aktivierung des Adenylylcyclase-Signalstoff-Stoffwechselweg spielen, wurde ein Alanin-Scanning-Ansatz verwendet. 13 verschiedene, alaninsubstituierte Ratten-PTH(1-14)-Analoge wurden synthetisiert und auf die Fähigkeit zur Stimulierung einer cAMP-Bildung in HKRK-B7-Zellen getestet (2). Das mit den monosubstituierten Analogen erhaltene Aktivitätsprofil zeigte, dass Reste im Bereich 1–9 ein relativ intolerantes Segment des Peptids bildeten, während Reste im Bereich 10–14 ein vergleichsweise tolerantes Segment bildeten. Somit ergaben mit Ausnahme von Ser-3 und Ala-1 (wobei es sich um den nativen aminoterminalen Rest von Ratten-PTH handelt) die meisten Alaninsubstitutionen im Bereich 1–9 Peptide, die kaum aktiv oder inaktiv waren. Im Gegensatz dazu ergab jede Alaninsubstitution im Bereich 10–14 Peptide mit Aktivitäten, die mit denjenigen von nativem Ratten-PTH(1-14) vergleichbar waren. Die Aktivität des am Alanin 3 substituierten Peptids korreliert gut mit vorherigen Untersuchungen an PTH(1-34)-Analoga, die zeigten, dass Aminosäuren mit kleinen Seitenketten an dieser Stelle toleriert werden (F. E. Cohen et al., J. Biol. Chem. 266: 1997–2004 (1991)).
  • Beispiel 3
  • Wirkung des rδNt-Rezeptors mit kleinen Liganden
  • Bei den Experimenten wurden COS-7-Zellen verwendet, die entweder mit dem intakten Ratten-PTH-1-Rezeptor (rWT-HA, 4A) oder mit einem gestutzten Ratten-PTH-1-Rezeptor, bei dem der größte Teil der aminoterminalen, extrazellulären Domäne deletiert war (rδNt, 4B), transfiziert waren. Bei COS-7-Zellen, die rWT-HA, PTH(1-34) und PTH(1-14) exprimierten, wurden cAMP-Reaktionen übertragen, die den Reaktionen, die bei HKRK-B7-Zellen gesehen wurden, ähnlich waren: PTH(1-14) stimulierte eine 15-fache Bildung von cAMP, aber mit einer Wirkung, die um vier bis fünf Größenordnungen schwächer als diejenige von PTH(1-34) war (3C). Beide Peptide stimulierten auch die Bildung von cAMP in Zellen, die mit rδNt transfiziert waren, wobei die Wirkung von PTH(1-14) aber nur um zwei Größenordnungen schwächer als diejenige von PTH(1-34) mit diesem gestutzten Rezeptor war. Diese Änderung der relativen Wirkung der beiden Liganden konnte auf eine 100-fache Abnahme der Wirkung mit PTH(1-34) mit rδNt im Vergleich zu seiner Wirkung mit rWT-HA statt auf eine Verschiebung der Wirkung von PTH(1-14), die gleich stark wie diejenige der beiden Rezeptoren war (vergleiche die Felder C und D von 4), zurückgeführt werden.
  • Obwohl es in dieser Untersuchung kein direktes Maß für die Rezeptorexpression gab, ist es nicht wahrscheinlich, dass die 100-fache Verminderung der Wirkung, die PTH(1-34) mit rδNt im Vergleich zu rWT-HA aufwies, auf eine Verminderung der Oberflächenexpression des gestutzten Rezeptors zurückzuführen ist, weil PTH(1-14) mit rδNt und rWT-HA (4, C und D) eine äquivalente Aktivität aufwies. Dies lässt vermuten, dass die beiden Rezeptoren mit etwa gleichen Konzentrationen exprimiert werden. Die verminderte Aktivität von PTH(1-34) mit rδNt spiegelt daher am wahrscheinlichsten einen Verlust wichtiger Bindungswechselwirkungen wider, die normalerweise (R. Jüppner et al., Science 254: 1024–1026 (1991). J. Guo. et al., Endocrinology 136: 3884–3891 (1995); K.A. Hruska, J. Clin. Invest. 79: 230–239 (1987); H.J. Donahue. et al., J. Biol. Chem. 263: 13522–13527 (1988); L.F. Kolakowski, GCRDb: A G-protein-coupled receptor Database Receptors and Channels 2: 1–7 (1994); H. Jüppner et al., Endocrinology 134: 879–884 (1994); C. Lee et al., Mol. Endo. P: 1269–1278 (1995); P. Turner et al., Single Mutations Allow the PTH-2 Receptor to Respond to PTHrP, J. Bone Min. Res. 12. Supplement 1, Abstract #121 (1997); F. Dautzenberg et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 4941–4946 (1998), M. Holtmann et al., J. Biol. Chem. 270: 14394–14398 (1995); V. DeAlmeida et al., Mol. Endo. 72: 750–765 (1998); 5. Stroop et al., Biochem. 34: 1050–1057 (1994); A. Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3644–3649 (1997); A. Bisello et al., J. Biol. Chem. 275: 22498–22505 (1998); C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem. 271: 26469–26472 (1996); T. J. Gardella et al., Endocrinology 135: 1186–1194 (1994); M. Mannstadt et al., J. Biol. Chem. 275: 16890–16896 (1998); H. Takasu und F. Bringhurst, Endocrinology, im Druck (1998); C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem 272: 28861–28868 (1997); C. Lee et al., Endocrinology J. 35(4): 1488–1495 (1994)) zwischen der Domäne des Liganden und der aminoterminalen Domäne des Rezeptors (K. Jüppner et al., Endocrinology 754: 879–884 (1994); C. Bergwitz et al., ). Biol. Chem. 271: 16469–26472 (1996); M. Mannstadt et al., ). Biol. Chem. 275: 16890–16896 (1998)) auftreten. Das Fehlen selbiger Bindungswechselwirkungen könnte auch die Unfähigkeit von PTHrP(7-34), als Antagonist mit rδNt zu fungieren, erklären (siehe 7B).
  • Beispiel 4:
  • Der rδNt-Rezeptor tritt mit denselben funktionellen PTH(1-14)-Resten wie ein intakter PTH-1-Rezeptor in Wechselwirkung
  • Es wurden Experimente entworfen, um zu testen, ob sich die PTH(1-14)-Reste, die zur Funktion mit dem gestutzten Rezeptor erforderlich sind, von denjenigen unterscheiden, die zur Funktion mit dem intakten Rezeptor erforderlich sind. Unter Verwendung des Alanin-Scannin-Satzes von PTH(1-14)-Analoga wurde in Experimenten die cAMP stimulierende Aktivität für die beiden Ratten-PTH-1-Rezeptoren in COS-7-Zellen getestet. Wie in den 5A und 5B veranschaulicht ist, spiegelten die mit rδNt erhaltenen Aktivitätsprofile die mit rWT-HA erhaltenen wider, weil Ser-3 und der Bereich 10–14 des Peptids mutationstolerant waren, während die Reste 2 und 4–9 mutationsintolerant waren (4A und B). Daher ist derselbe Satz von funktionellen Resten in PTH(1-14), der für die Wechselwirkung mit dem intakten PTH-1-Rezeptor erforderlich ist, auch für die Wechselwirkung mit der Kerndomäne des Rezeptors erforderlich.
  • Beispiel 5
  • Spezifität von gestutzten Liganden und PTH-Rezeptoren
  • Um zu testen, ob PTH(1-14) und rδNt die zweckmäßige Erkennungsspezifität für den entsprechenden Stammliganden beibehielten, wurden Kreuzreaktivkitätsexperimente unter Verwendung von Sekretinliganden und dem geclonten Rattensekretinrezeptor durchgeführt. Mit dem Sekretinrezeptor transfizierte COS-7-Zellen wiesen eine 50-fache Erhöhung von cAMP-Konzentrationen als Reaktion auf Sekretin(1-27) (1 mM) auf, reagierten aber weder auf PTH(1-34) (1 mM) noch auf PTH(1-14) (100 mM) (5C). rδNt exprimierende Zellen reagierten auf PTH(1-34) und PTH(1-14), aber nicht auf Sekretin(1-27) (1 mM) oder Sekretin(1-13) (1 mM) (5B). Somit scheint die Erkennungsspezifität von PTH(1-14) und rδNt diejenige der intakten Stammmoleküle zu replizieren. Bei diesen Untersuchungen wurde kein Hinweis für eine relaxierte Spezifität gefunden (6). Es ist auch wert, darauf hinzuweisen, dass PTH(1-14) die endogenen, in LLC-PK1-Zellen exprimierten Calcitonin-Rezeptoren nicht aktivierte.
  • Beispiel 6
  • Die rδNt-Stimulation wird vom Inhibitor [Leu11,D-Trp12]hPTHrP(z-34)NH2 nicht beeinflusst
  • Zur Bestimmung, ob [Leu11,D-Trp12]hPTHrP(z-34)NH2, ein potenter kompetitiver Antagonist der Wirkung von PTH(1-34) (R. F. Nutt et al., Endocrinology 127: 491–493 (1990)) die Fähigkeit von PTH(1-14) zur Stimulierung der Bildung von cAMP in COS-7-Zellen, die entweder rWT-HA oder rδNt exprimieren, blockieren kann (6). Mit rWT-HA verminderte das Inhibitorpeptid die Wirksamkeit sowohl von PTH(1-14) als auch von PTH(1-34) um bis zu 70% im Vergleich zu den Reaktionen, die von diesen Agonisten in Abwesenheit des Inhibitors verursacht werden (6A). Im Gegensatz dazu hatte PTHrP(7-34) nur eine geringe oder gar keine Auswirkung auf die Fähigkeit von PTH(1-34) oder PTH(1-14), die Erzeugung von cAMP in rδNt exprimierenden Zellen zu stimulieren.
  • Die Fähigkeit von PTHr(7-34), der Wirkung von PTH(1-14) auf den intakten Rezeptor entgegenzuwirken (6A), lässt vermuten, dass die von diesen beiden Liganden eingenommenen Rezeptorstellen überlappen. Diese Überlappung könnte die Ligandenreste 7–14 und einen Teil im Kernbereich des Rezeptors betreffen. Bindende Wechselwirkungen, die zwischen den Figurenresten (7–34) und dem Kernbereich des Rezeptors auftreten könnten, sind jedoch zu schwach, um einen effektiven Antagonismus in Abwesenheit der aminoterminalen, extrazellulären Rezeptordomäne zu ermöglichen.
  • Diese Befunde belegen, dass ein viel kleinerer Bereich von PTH(1-34) als zuvor angenommen eine Rezeptoraktivierung stimulieren kann und dass der aminoterminale Teil des PTH-Hormons mit dem Kernbereich des die sieben Transmembranhelices und Verbindungsschleifen enthaltenden Rezeptors in Wechselwirkung tritt, wie zuvor für intakte PTH-Liganden und Rezeptoren hypothetisch angenommen wurde (C. Lee et al., Mol. Endo. P. 1269–1278 (1995); A. Bisello et al., J. Biol. Chem. 275:22498–22505 (1998); C. Bergwitz et al, J. Biol. Chem. 271: 26469–26472 (1996); T. J. Gardella et al, Endocrinology 135: 1186–1194 (1994); C. Bergwitz et al, J. Biol. Chem. 272: 28861–28868; T. Gardella et al., J. Biol. Chem. 277: 12820–12825 (1996)). Weiterhin ist diese Komponente der Wechselwirkung für die Signalisierung des Rezeptors ausreichend. Die Hypothese, dass der Bereich 15–34 von PTH an der aminoterminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors bindet, schließt die Möglichkeit nicht aus, dass diese Domäne, die als solche die Bildung von cAMP nicht stimuliert (Daten nicht angegeben) auch etwas Bindungsenergie durch eine Wechselwirkung mit dem Kernbereich des Rezeptors beisteuert. Tatsächlich könnte die um das ~100-Fache größere Potenz, die PTH(1-34) mit rδNt im Vergleich zur Potenz von PTH(1-14) mit diesem Rezeptor aufweist (4D), sehr wohl auf solche Wechselwirkungen zurückzuführen sein. Wir können aber nicht die alternative Möglichkeit ausschließen, dass die Domäne 15–34 die Eigen-Signalaktivität des Segments(1-14) verstärkt, indem sie beispielsweise eine begünstigte Sekundärstruktur im aminoterminalen Bereich des Liganden stabilisiert. Speziellere Informationen über die von PTH genutzten Rezeptor-Erkennungsstellen und die Struktur des rezeptorgebundenen Liganden sind zur Unterscheidung zwischen diesen Möglichkeiten erforderlich.
  • Einige Erkennungsdeterminanten sind in der aminoterminalen, extrazellulären Domäne, den extrazellulären Schleifen und den Transmembran-Helices der B-Familie von Rezeptoren (P. Turner et al., Single Mutations Allow the PTH-2 Receptor to Respond to PTHrP, J. Bone Min. Res. 12, Supplement 1. Abstract #121 (1997), F. Dautzenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 4941–4946 (1998), M. Holtmann et al., J. Biol. Chem. 270: 14394–14398 (1995), T. J. Gardella et al., Endrocrinology 135: 1186–1194 (1994); C. Bergwitz et al., J. Biol. Chem. 272: 28861–28868; P. R. Turner et al., J. Biol. Chem. 271(16): 9205–9208 (1996)), identifiziert worden.
  • Ein Unterscheidungsmerkmal der Rezeptoren der B-Familie ist die aminoterminale, extrazelluläre Domäne, die relativ groß ist und eine Anzahl von konservierten Resten einschließlich sechs Cysteinen enthält. Somit ist es interessant, dass diese Domäne des PTH-1-Rezeptors für die ligandenabhängige Signaltransduktion nicht wesentlich ist, was durch die Ergebnisse mit dem rδNt-Rezeptor bewiesen wird.
  • Mehrere andere Berichte über andere Rezeptoren der Familie B bieten zusätzliche Beweise dafür, um vermuten zu lassen, dass die aminoterminalen, extrazellulären Domänen dieser Rezeptoren für die funktionale Expression möglicherweise nicht wesentlich sind. Große aminoterminale Deletionen im Calcitoninrezeptor (C. Unson et al., J. Biol. Chem. 270: 27720–27727 (1995)) und im Rezeptor des Wachstumshormon freisetzenden Faktors (V. DeAlmedia und K. Mayo, Mol. Endo. 12: 750–765 (1998)) waren mit der Expression kompatibel, wie durch immunologische Methoden untersucht wurde, und ein Glucagon-Rezeptor, dem die aminoterminale Domäne fehlt und der eine aktivierende Mutation in der Helix 2 enthält (HR-178), wies eine konstitutive cAMP signalisierende Aktivität auf (S. Hjorth et al., Mol. Endo. 12: 78–86 (1998)). In diesen Untersuchungen wurde aber ein Beweis dafür, dass der gestutzte Rezeptor mit dem Liganden in Wechselwirkung treten könnte, wie wir dies für den PTH-1-Rezeptor gefunden haben, nicht mitgeteilt. In einer separaten Untersuchung des Lutropin-Rezeptors, eines Rezeptors der Gruppe A, der das große humane Glycohormon, Choriogonadotropin, bindet, wurde beobachtet, dass eine Deletion der großen aminoterminalen, extrazellulären Domäne einen Rezeptor ergab, der eine cAMP-Reaktion auf hohe hCG-Dosen übertragen konnte (I. H. Ji und T. H. Ji, J. Biol. Chem. 266(20): 13076–13079 (1991)).
  • Dass die Aktivität von PTH(1-14) durch die Deletion der aminoterminalen Rezeptordomäne nicht beeinflusst wurde, lässt vermuten, dass das Peptid hauptsächlich mit dem Kernbereich des Rezeptors in Wechselwirkung tritt. Dieser Schluss wird durch die an PTH(1-14) durchgeführten Alaninscanning-Experimente unterstützt, bei denen das Profil von toleranten und intoleranten Resten, das bei rδNt beobachtet wurde, fast dasselbe wie dasjenige war, das mit dem intakten Rezeptor (4) erhalten wurde. Bei jedem Rezeptor bildeten die Reste im Bereich 10–14 des Liganden ein tolerantes Segment, während die Reste im Bereich 1–9 mit Ausnahme von 1 und 3 ein intolerantes Segment bildeten. Dieses im Zusammenhang mit dem PTH(1-14)-Fragment beobachtete Muster von kritischen und nichtkritischen Resten stellt eine enge Entsprechung zu den Mustern dar, die zuvor in Untersuchungen von PTH-Analoga mit längeren Längen gefunden wurden (F. E. et al., J. Biol. Chem. 266: 1997–2004 (1991); F. Gombert et al. in "Peptides: Chemistry, Structure and Biology Proceedings of the 14th American Peptide Symposium June 18–23, P. Kaumaya und R. Hodges, Hrsg., S. 661–662, Mayflower Scientific Limited, Kingswinford, GB (1996); T. J. Gardella et al., J. Biol. Chem. 266: 13141–13146 (1991)). SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (5)

  1. Verfahren zum Screenen nach einem Agonisten oder Antagonisten der PTH-Rezeptoraktivität, das folgendes aufweist: (a) Inkontaktbringen von Zellen mit einer Testverbindung, wobei die vorerwähnten Zellen ein rδNt-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz exprimieren, welche zu mindestens 95% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe bestehend aus (i) der Aminosäuresequenz des rδNt-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 1 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (ii) der Aminosäuresequenz des rδNt-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 2 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (iii) der Aminosäuresequenz des rδNt-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 23 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (iv) der Aminosäuresequenz des rδNt-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz besitzt, die von dem in der ATCC Hinterlegung Nr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Klon codiert wird, (v) der Aminosäuresequenz des reifen rδNt-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz an Positionen besitzt, die von dem in der ATCC Hinterlegung Nr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Klon codiert werden, ausgewählt ist, und (b) Messung der biologischen Reaktion der vorerwähnten Zellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die vorerwähnte biologische Reaktion die cAMP-Akkumulation ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der vorerwähnte Agonist ein Peptid ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der vorerwähnte Antagonist ein Peptid ist.
  5. Verfahren zum Screenen nach einem Agonisten oder Antagonisten der PTH-Rezeptoraktivität, das folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen von Zellen mit einer Testverbindung, wobei die vorerwähnten Zellen ein rδNt-Polypeptid exprimieren, wobei die vorerwähnten Zellen ein Polynucleotid enthalten, das eine Polynucleotidsequenz besitzt, welche zu mindestens 95% identisch mit einer Sequenz ist, die aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid codiert, welche die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 1 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (ii) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid codiert, welche die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 2 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (iii) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid codiert, welche die vollständige Aminosäuresequenz an den Positionen von ungefähr 23 bis ungefähr 435 in SEQ ID NO:2 besitzt, (iv) einer Nucleotidsequenz, die das rδNt-Polypeptid codiert, welche die vollständige Aminosäuresequenz besitzt, die von dem in der ATCC Hinterlegung Nr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Klon codiert wird, (v) einer Nucleotidsequenz, die das reife rδNt-Polypeptid codiert, welche die vollständige Aminosäuresequenz an Positionen besitzt, die von dem in der ATCC Hinterlegung Nr. PTA-1136 enthaltenen cDNA-Klon codiert werden ausgewählt ist, und (b) Messung der biologischen Reaktion der vorerwähnten Zellen.
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