DE69832053T2

DE69832053T2 - Humane Polypeptide und Poylnucleotide mit einer Homologie zum Testis-spezifischen Angiotensin konvertierenden Enzyms

Info

Publication number: DE69832053T2
Application number: DE69832053T
Authority: DE
Inventors: Christopher D. Harlow Southan; Nicola Harlow Burgess
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: JPH11318472A; EP0974664A2; DE69832053D1; CA2248987A1; EP0974664B1; EP0974664A3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polypeptide und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, ihre Verwendung zur Identifizierung von Verbindungen, bei denen es sich um Agonisten, Antagonisten und/oder Inhibitoren handeln kann, welche bei einer Therapie potenziell nützlich sind, sowie die Herstellung solcher Polypeptide und Polynucleotide.
Hintergrund der Erfindung
Der Prozess der Entdeckung von Arzneistoffen erfährt derzeit eine fundamentale Revolution, da er die „funktionelle Genomik" mit übernimmt, das heißt die auf Genom- oder Genbasis beruhende Biologie mit hohem Durchsatz. Dieser Ansatz als ein Mittel zur Identifizierung von Genen und Genprodukten als therapeutischen Zielorten löst rasch frühere Ansätze ab, die auf „positionellem Clonieren" basierten. Ein Phänotyp, das heißt eine biologische Funktion oder eine genetische Erkrankung, wird identifiziert, und diese werden dann bis zu dem verantwortlichen Gen zurückverfolgt und zwar auf Grundlage seiner Position in der genetischen Karte.
Die funktionelle Genomik stützt sich stark auf DNA-Sequenzierungs-Technologien mit hohem Durchsatz und auf die zahlreichen Werkzeuge der Bioinformatik, um Gensequenzen von potenziellem Interesse in den vielen nun verfügbaren molekularbiologischen Datenbanken zu identifizieren. Es besteht ein fortwährender Bedarf an der Identifizierung und der Charakterisierung weiterer Gene und ihrer entsprechenden Polypeptide/Proteine als Zielorte für die Entdeckung von Arzneistoffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft MPROT15, insbesondere MPROT15-Polypeptide und MPROT15-Polynucleotide, sowie rekombinante Materialien und Verfahren zur ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten/Inhibitoren unter Verwendung der Materialien, die durch die Erfindung bereit gestellt werden, welche zur Behandlung von Bluthochdruck, Kardiomyopathien, Schlaganfall, Herzerkrankungen, Neurodegeneration, Alzheimer-Krankheit sowie Krankheiten, die mit der Prozessierung von Peptidhormonen oder Cytokinen verbunden sind, nützlich sein könnten, hierin nachstehend als „die Krankheiten" neben anderen bezeichnet.
Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung MPROT15-Polypeptide. Solche Peptide umfassen isolierte Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz enthalten, welche mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und am stärksten bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 2 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 2 aufweist. Solche Polypeptide umfassen diejenigen, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 enthalten.
Weitere Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte Polypeptide, deren Aminosäuresequenz mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und am stärksten bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 2 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 2 aufweist. Solche Polypeptide umfassen das Polypeptid der SEQ ID NO: 2.
Weitere Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte Polypeptide, die durch ein Polynucleotid codiert werden, das die in der SEQ ID NO: 1 enthaltene Sequenz aufweist.
Von den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung nimmt man an, dass sie Mitglieder der Metalloproteasen-Polypeptidfamilie sind. Sie sind deshalb von Interesse, weil Metalloproteasen entscheidende Rollen bei einigen Krankheitspathologien spielen. Daher kann das Entwerfen von oder die Suche nach selektiven Protease-Antagonisten oder – Agonisten zur Entwicklung von neuen Arzneistoffen führen (Seife, C., Science 277, 1602–1603). Diese Eigenschaften werden hierin nachstehend als „MPROT15-Aktivität" oder als „MPROT15-Polypeptid-Aktivität" oder als „biologische Aktivität von MPROT15" bezeichnet. Ebenfalls mit eingeschlossen in diese Aktivitäten sind antigene und immunogene Aktivitäten dieser MPROT15-Polypeptide, insbesondere die antigenen und immunogenen Aktivitäten des Polypeptids der SEQ ID NO: 2. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist bevorzugt mindestens eine biologische Aktivität von MPROT15 auf.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Form des „reifen" Proteins vorliegen oder können Teil eines größeren Proteins sein, wie z. B. eines Vorläufers (precursor) oder eines Fusionsproteins. Es ist oft vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz mit einzuschließen, die Sekretions- oder Leader-Sequenzen enthält, sowie Pro-Sequenzen, Sequenzen, welche bei der Aufreinigung helfen; wie z. B. mehrfache Histidin-Reste, oder eine zusätzliche Sequenz für die Stabilität während der rekombinanten Herstellung.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Varianten der vorstehend erwähnten Polypeptide, das heißt Polypeptide, die sich gegenüber der Referenz durch konservative Aminosäureaustausche unterscheiden, wobei ein Rest durch einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt wird. Typischerweise erfolgen solche Austausche zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu, zwischen Asn und Gln und zwischen den basischen Resten Lys und Arg oder den aromatischen Resten Phe und Tyr. Besonders bevorzugt werden Varianten, in denen mehrere, 5–10, 1–5, 1–3, 1–2 oder 1 Aminosäure(n) in beliebiger Kombination ausgetauscht, deletiert oder zugefügt wurden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auf jede geeignete Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide umfassen isolierte, natürlich vorkommende Polypeptide, über rekombinante Verfahren hergestellte Polypeptide, synthetisch hergestellte Polypeptide oder Polypeptide, die über eine Kombination dieser Verfahren hergestellt wurden. Die Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind im Fachgebiet wohlbekannt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung MPROT15-Polynucleotide. Solche Polynucleotide umfassen isolierte Polynucleotide, die eine Nucleotidsequenz enthalten, welche ein Polypeptid codiert, das mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 2 aufweist. In dieser Hinsicht werden Polypeptide, die mindestens 97 % Identität aufweisen, stark bevorzugt, während solche mit mindestens 98–99 % Identität noch stärker bevorzugt werden, und solche mit mindestens 99 % Identität am stärksten bevorzugt werden. Solche Polynucleotide umfassen ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz enthält, die in der SEQ ID NO: 1 enthalten ist, welche das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert.
Weitere Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte Polynucleotide, welche eine Nucleotidsequenz enthalten, die mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität mit der SEQ ID NO: 1 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 1 aufweist. In dieser Hinsicht werden Polynucleotide, die mindestens 97 % Identität aufweisen, stark bevorzugt, während solche mit mindestens 98–99 % Identität noch stärker bevorzugt werden, und solche mit mindestens 99 % Identität am stärksten bevorzugt werden. Solche Polynucleotide umfassen ein Polynucleotid, welches das Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 sowie das Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 enthält.
Die Erfindung stellt auch Polynucleotide bereit, die zu allen der vorstehend beschriebenen Polynucleotide komplementär sind.
Die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 weist Homologie mit dem Testisspezifischen Angiotensin konvertierenden Enzym aus der Maus auf (Howard et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4294–4302, 1990). Die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 ist eine cDNA-Sequenz und umfasst eine ein Polypeptid codierende Sequenz (Nucleotid 1 bis 2413), die ein Polypeptid von 805 Aminosäuren codiert, das Polypeptid der SEQ ID NO: 2. Die Nucleotidsequenz, die das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert, kann mit der in SEQ ID NO: 1 enthaltenen, ein Polypeptid codierenden Sequenz identisch sein, oder es kann eine andere Sequenz als diejenige sein, die in der SEQ ID NO: 1 enthalten ist, welche aufgrund der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes ebenfalls das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert. Das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 ist strukturell mit anderen Proteinen der Metalloproteasen-Familie verwandt, wobei es eine Homologie und/oder eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem menschlichen Testis-spezifischen Angiotensin konvertierenden Enzym aufweist (Ehlers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(20), 7741–7745, 1989).
Von den bevorzugten Polypeptiden und Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass sie unter anderem ähnliche biologische Funktionen/Eigenschaften mit den zu ihnen homologen Polypeptiden und Polynucleotiden besitzen. Weiterhin besitzen die bevorzugten Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung mindestens eine MPROT15-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls partielle oder andere Polynucleotid- und Polypeptidsequenzen, welche noch vor der Bestimmung der entsprechenden Volllängen-Sequenzen der SEQ ID NO: 1 und der SEQ ID NO: 2 identifiziert wurden.
Demgemäß stellt in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotid bereit, das:

(a) eine Nucleotidsequenz umfasst, die mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 3 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 3 aufweist;
(b) eine Nucleotidsequenz besitzt, die mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 3 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 3 aufweist;
(c) das Polynucleotid der SEQ ID NO: 3; oder
(d) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 4 aufweist; sowie das Polynucleotid der SEQ ID NO: 3.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid bereit, das:

(a) eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und am stärksten bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 4 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 4 aufweist;
(b) eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 70 % Identität, bevorzugt mindestens 80 % Identität, noch bevorzugter mindestens 90 % Identität, aber noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität und am stärksten bevorzugt mindestens 97–99 % Identität mit der SEQ ID NO: 4 über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 4 aufweist;
(c) die Aminsäuresequenz der SEQ ID NO: 4 umfasst; und
(d) das Polypeptid der SEQ ID NO: 4 darstellt; sowie Polypeptide, die durch ein Polynucleotid codiert werden, das die in der SEQ ID NO: 3 enthaltene Sequenz umfasst.

Die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 und die Peptidsequenz, die durch sie codiert wird, wurden aus EST (Expressed Sequence Tag, kurze exprimierte Sequenzbereiche/cDNAs) -Sequenzen abgeleitet. Fachleute werden bemerken, dass unausweichlich einige Nucleotidsequenz-Lesefehler in den EST-Sequenzen vorhanden sind (vergleiche Adams, M.D. et al., Nature 377 (Zusatzband) 3, 1995). Dementsprechend unterliegen die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 und die durch sie codierte Peptidsequenz den gleichen innewohnenden Einschränkungen hinsichtlich der Sequenzgenauigkeit. Weiterhin umfasst die Peptidsequenz, die durch die SEQ ID NO: 3 codiert wird, einen Bereich der Identität oder der engen Homologie und/oder der engen strukturellen Ähnlichkeit (zum Beispiel ein konservierter Aminosäureunterschied) mit dem am nächsten homologen oder strukturell ährilichen Protein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Standard-Clonierungs- und Durchmusterungs-Verfahren aus einer cDNA-Genbank erhalten werden, die von mRNA aus den Zellen der menschlichen Haut abgeleitet wurde, und zwar unter Verwendung der Expressed Sequence Tag (EST)-Analyse (Adams, M.D. et al., Science (1991) 252:1651–1656; Adams, M.D. et al., Nature (1992) 355:632–634; Adams, M.D. et al., Nature (1995) 377, Zusatzband 3, 5.174). Die Polynucleotide der Erfindung können auch aus natürlichen Quellen erhalten werden, wie z. B. genomischen DNA-Genbanken, oder sie können unter Verwendung wohlbekannter und kommerziell erhältlicher Verfahren synthetisiert werden.
Wenn die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung für die rekombinante Herstellung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann das Polynucleotid die codierende Sequenz für das reife Polypeptid selbst umfassen; oder die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im Leseraster mit anderen codierenden Sequenzen umfassen, wie z. B. solchen, die eine Leader- oder eine sekretorische Sequenz, eine Prä-, oder Pro- oder eine Präpro-Proteinsequenz codieren, oder andere Fusionspeptid-Anteile. Zum Beispiel kann eine Markersequenz codiert sein, welche die Aufreinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexa-Histidin-Peptid, wie es in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821–824 beschrieben wird, oder es handelt sich um eine HA-Markierungssequenz. Das Polynucleotid kann ebenfalls nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen enthalten, wie z. B. transkribierte, nicht-translatierte Sequenzen, Spleiß- und Polyadenylierungs-Signale, Ribosomen-Bindestellen und Sequenzen, die die mRNA stabilisieren.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Polynucleotide, die Polypeptid-Varianten codieren, welche die Aminsäuresequenz der SEQ ID NO: 2 enthalten, und in denen mehrere, zum Beispiel 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 1 bis 2 oder 1 Aminosäurerest(e) in beliebiger Kombination ausgetauscht, deletiert oder hinzugefügt worden sind.
Polynucleotide, die identisch oder ausreichend identisch mit der Nucleotidsequenz sind, die in der SEQ ID NO: 1 enthalten ist, können als Hybridisierungs-Sonden für die cDNA oder die genomische DNA oder als Primer für eine Nucleinsäuren-Amplifikations-(PCR)-Reaktion verwendet werden, um Volllängen-cDNAs und genomische Clone zu isolieren, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, sowie, um cDNA- und genomische Clone anderer Gene zu isolieren (einschließlich Genen, die paraloge Gene aus menschlichen Quellen, sowie orthologe und paraloge Gene aus anderen Arten als dem Menschen codieren), die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu der SEQ ID NO: 1 aufweisen. Typischerweise sind diese Nucleotidsequenzen mit dem Referenz-Gen zu 70 % identisch, bevorzugt zu 80 % identisch, noch bevorzugter zu 90 % identisch und am stärksten bevorzugt zu 95 % identisch. Die Sonden oder die Primer umfassen im Allgemeinen mindestens 15 Nucleotide, bevorzugt mindestens 30 Nucleotide, und sie können mindestens 50 Nucleotide besitzen. Besonders bevorzugte Primer besitzen zwischen 20 und 25 Nucleotide. Besonders bevorzugte Sonden besitzen zwischen 30 und 50 Nucleotide.
Ein Polynucleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch ein Verfahren erhalten werden, welches den Schritt der Durchmusterung einer geeigneten Genbank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde umfasst, welche die Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder eines Fragments davon besitzt; und der Isolierung von Volllängen-cDNA- und genomischen Clonen, die diese Polynucleotidsequenz enthalten. Solche Hybridisierungsverfahren sind den Fachleuten wohlbekannt. Bevorzugte stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen die Über-Nacht-Inkubation bei 42 °C in einer Lösung umfassend: 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung_; 10 % Dextransulfat und 20 Mikrogramm/ml denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA; gefolgt von einer Waschung der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65 °C.
Erfahrene Fachleute werden wissen, dass in vielen Fällen eine isolierte cDNA-Sequenz unvollständig ist, das heißt, dass der Bereich, der das Polypeptid codiert, am 5'-Ende der cDNA verkürzt ist. Dies ist eine Folge der reversen Transkriptase, eines Enzyms mit einer innewohnenden niedrigen „Prozessivität" (ein Maß für die Fähigkeit des Enzyms, während der Polymerisierungsreaktion an der Matrize angeheftet zu bleiben), wodurch es nicht in der Lage ist, eine vollständige DNA-Kopie der mRNA während der Synthese des ersten cDNA-Stranges durchzuführen.
Es sind mehrere Verfahren verfügbar und den Fachleuten wohlbekannt, um Volllängen-cDNAs oder verlängerte kurze cDNAs zu erhalten, wie zu Beispiel solche, die auf dem Verfahren der raschen Amplifikation von cDNA-Enden (Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)) basieren (vergleiche zum Beispiel mit Frohman et al., PNAS USA 85, 8998–9002, 1988). Neuere Modifizierungen dieses Verfahrens, wie zum Beispiel durch die Marathon^TM-Technologie (Clontech Laboratories, Inc.), haben die Suche nach längeren cDNAs signifikant vereinfacht. Bei der Marathon^TM-Technologie werden cDNAs, die von der aus einem gewählten Gewebe extrahierten mRNA hergestellt worden sind, mit einer „Adaptor"-Sequenz an jedem Ende ligiert. Dann wird eine Nucleinsäure-Amplifikation (PCR) durchgeführt, um das „fehlende" 5'-Ende der cDNA unter Verwendung einer Kombination von Gen-spezifischen und Adaptor-spezifischen Oligonucleotid-Primern zu amplifizieren. Anschließend wird die PCR-Reaktion unter Verwendung von verschachtelten ("nested") Primern wiederholt, das heißt von Primern, die so entworfen wurden, dass sie sich innerhalb des amplifizierten Produkts anlagern (typischerweise ein Adaptor-spezifischer Primer, der sich weiter zum 3'-Ende hin an der Adaptorsequenz anlagert, und eines Gen-spezifischen Primers, der sich weiter zum 5'-Ende hin an der bekannten Gensequenz anlagert). Die Produkte dieser Reaktion können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert werden, und es kann eine Volllängen-cDNA konstruiert werden, dies erfolgt entweder durch die direkte Verbindung des Produkts mit der bereits vorliegenden cDNA, um eine vollständige Sequenz zu erhalten, oder durch die Durchführung einer getrennten Volllängen-PCR unter Verwendung der neuen Sequenzinformation zum Entwerfen des 5'-Primers.
Die rekombinanten Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren aus genetisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden, die Expressionssysteme enthalten. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynucleotid oder Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die genetisch mit solchen Expressionssystemen verändert wurden; sowie die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Verfahren. Es können auch zellfreie Translationssysteme verwendet werden; um solche Proteine unter Verwendung der RNAs herzustellen, welche aus DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden.
Für die rekombinante Herstellung können die Wirtszellen genetisch verändert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon für die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einzubauen. Das Einbringen von Polynucleotiden in Wirtszellen kann durch Verfahren erfolgen, die in vielen, Standard-Labor-Handbüchern beschrieben werden, wie z. B. in Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) und in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Solche Verfahren umfassen zum Beispiel bevorzugt Calciumphosphat-Transfektion, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Transvection, Mikroinjektion, durch kationische Lipide vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape-Loading, ballistische Einbringung oder Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte umfassen Bakterienzellen, wie z. B. Streptococci-, Staphylococci-, E. coli-, Streptomyces- und Bacillus subtilis-Zellen; Pilzzellen, wie z. B. Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen, wie z. B. Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen, wie z. B. CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, HEK 293- und Bowes-Melanomzellen sowie Pflanzenzellen.
Es kann eine Vielzahl von Expressionssystemen verwendet werden, zum Beispiel chromosomale, episomale und aus Viren stammende Systeme, wie z. B. Vektoren, die abgeleitet wurden aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposons, aus Hefe-Episomen, aus Insertions-Elementen, aus chromosomalen Elementen der Hefe, aus Viren, wie z. B. Baculoviren, Papova-Viren, wie z. B. SV40, Vaccinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpest-Viren, Pseudorabies-Viren und Retroviren, sowie von Vektoren, die aus Kombinationen davon abgeleitet wurden, wie z. B. solche, die aus genetischen Elementen von Plasmiden und Bakteriophagen stammen, wie z. B. Cosmide und Phagemide. Das Expressionssystem kann Kontrollregionen enthalten, die die Expression sowohl regulieren als auch induzieren. Im Allgemeinen kann jedes beliebige System oder jeder Vektor verwendet werden, das/der in der Lage ist, ein Polynucleotid aufrecht zu erhalten, zu vermehren oder zu exprimieren, um ein Polypeptid in einem Wirt herzustellen. Die geeignete Nucleotidsequenz kann in ein Expressionssystem durch irgendeines aus einer Vielzahl von wohlbekannten und Routineverfahren eingebaut werden, wie zum Beispiel solchen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (vorstehend) angeführt werden. In das gewünschte Polypeptid können geeignete Sekretionssignale eingebaut werden, um die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung zu ermöglichen. Diese Signale können in dem Polypeptid bereits vorhanden sein, oder es kann sich um heterologe Signale handeln.
Wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei Durchmusterung-Testansätzen exprimiert werden soll, wird im Allgemeinen bevorzugt, dass das Polypeptid an der Zelloberfläche hergestellt wird. In diesem Fall können die Zellen vor der Verwendung bei dem Durchmusterungs-Testansatz geerntet werden. Wenn das Polypeptid in das Medium ausgeschieden wird, kann das Medium gewonnen werden, um das Polypeptid zu gewinnen und es zu reinigen. Wenn es intrazellulär hergestellt wird, müssen die Zellen zuerst lysiert werden, bevor das Polypeptid gewonnen werden kann.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekominanten Zellkulturen über wohlbekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, diese umfassen Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie. Am stärksten wird die hoch-auflösende Flüssig-Chromatographie (high performance liquid chromatography) zur Aufreinigung eingesetzt. Es können wohlbekannte Verfahren zur Neufaltung von Proteinen verwendet werden, um die aktive Konformation wieder herzustellen, wenn das Polypeptid im Verlauf der intrazellulären Synthese, der Isolierung oder der Reinigung denaturiert wurde.
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die chromosomale Lokalisierung wertvoll. Die Sequenz kann zielgerichtet an einen bestimmten Ort auf einem individuellen menschlichen Chromosom gelenkt werden und dort hybridisieren. Die Kartierung relevanter Sequenzen auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Gen-assoziierten Krankheiten. Nachdem eine Sequenz an einem exakten chromosomalen Ort kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz in dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden. Solche Daten finden sich zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online verfügbar über die John-Hopkins-Universität, Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die in der gleichen chromosomalen Region kartiert wurden, wird dann durch Kopplungsanalyse (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Die Unterschiede in der cDNA- oder in der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen kann ebenfalls bestimmt werden. Wenn eine Mutation bei einigen oder bei allen der betroffenen Individuen, aber nicht bei irgendwelchen normalen Individuen beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, dass die Mutation die Ursache der Krankheit darstellt.
Das Gen der vorliegenden Erfindung kartiert auf dem menschlichen Chromosom Xp22.
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Lokalisation in Geweben wertvoll. Solche Verfahren erlauben die Bestimmung von Expressionsmustern der menschlichen MPROT15-Polypetide in Geweben durch den Nachweis der mRNAs, die sie codieren. Diese Verfahren umfassen in situ-Hybridisierungs-Verfahren und Nucleotid-Amplifizierungs-Verfahren, wie z. B. die PCR. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen liefern Hinweise auf die normalen Funktionen der Polypeptide im Organismus. Darüber hinaus liefern vergleichende Untersuchungen des normalen Expressionsmusters der menschlichen MPROT15-mRNAs mit denjenigen von mRNAs, die durch ein menschliches MPROT15-Gen codiert werden, wertvolle Einblicke in die Rolle der mutierten menschlichen MPROT15-Polypeptide, oder in die unangemessene Expression der normalen menschlichen MPROT15-Polypeptide bei Krankheiten. Eine solche unangemessene Expression kann zeitlicher, räumlicher oder einfach nur quantitativer Natur sein.
Die Polypeptide der Erfindung oder Fragmente oder Analoga davon, sowie Zellen, die sie exprimieren, können auch als Immunogene verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung immunspezifisch sind. Der Begriff „immunspezifisch" bedeutet, dass die Antikörper eine wesentlich höhere Affinität für die Polypeptide der Erfindung aufweisen, verglichen mit ihrer Affinität gegenüber anderen verwandten Polypeptiden des Fachgebiets.
Antikörper, die gegen Polypeptide der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, können durch die Verabreichung der Polypeptide oder der die Epitope tragenden Fragmente, Analoga oder Zellen an ein Tier, bevorzugt ein nicht menschliches Tier, unter Verwendung von Routinevorschriften erhalten werden. Zur Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, das Antikörper liefert, die durch eine kontinuierliche Kultur von Zelllinien produziert werden können. Beispiele umfassen das Hybridom-Verfahren (Köhler, G. und Milstein, C., Nature (1975) 256:495–497), das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zellen-Hybridom-Vefahren (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77–96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Verfahren zur Herstellung von Einzelketten-Antikörpern, wie z. B. diejenigen; die im U.S.-Patent-Nr. 4,946,778 beschrieben werden, können ebenfalls angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen Polypeptide dieser Erfindung herzustellen. Es können auch transgene Mäuse oder andere Organismen, einschließlich anderer Säuger, verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper können verwendet werden, um Clone, die das Polypeptid exprimieren, zu isolieren oder zu identifizieren, oder, um die Polypeptide durch Affinitäts-Chromatographie zu reinigen.
Antikörper gegen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, „die Krankheiten" neben anderen zu behandeln.
Die Polypeptide der Erfindung können auch in einem Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem Säuger verwendet werden, das die Impfung des Säugers mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, welches dazu geeignet ist, Antikörper herzustellen und/oder eine T-Zellen-Immunantwort hervorzurufen, um das Tier vor den hierin vorstehend erwähnten „Krankheiten" neben anderen zu schützen.
Die Polypeptide der Erfindung können auch in einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Säuger verwendet werden, das die Bereitstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung über einen Vektor umfasst, der in vivo die Expression des Polynucleotids steuert und das Polypeptid codiert, um eine solche Immunantwort hervorzurufen und einen Antikörper herzustellen und das Tier vor Krankheiten zu schützen.
Die Polypeptide der Erfindung können ebenfalls in einer immunologischen oder einer Impfstoff-Formulierung (Zusammensetzung) verwendet werden, die, wenn sie in einen Säugerwirt eingebracht wird, eine Immunantwort in diesem Säuger gegen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung hervorruft, wobei die Zusammensetzung ein Polypeptid oder ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Impfstoff-Formulierung kann weiterhin einen geeigneten Träger umfassen. Da ein Polypeptid im Magen gespalten werden kann, wird es bevorzugt parenteral verabreicht (zum Beispiel durch subcutane, intramuskuläre, intravenöse oder intradermale Injektion). Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bacteriostatika und gelöste Stoffe, welche die Formulierung gegenüber dem Blut des Empfängers isotonisch machen, enthalten können; sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, welche Suspendierungsmittel oder Verdickungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in Einzeldosen- oder in Mehrfachdosen-Behältern vorliegen, zum Beispiel als versiegelte Ampullen und Gefäße, und sie können in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt werden, was nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers kurz vor der Verwendung erforderlich macht. Die Impfstoff-Formulierung kann ebenfalls Adjuvanzien-Systeme zur Verstärkung der Immunogenität der Formulierung umfassen, wie z. B. Öl-in-Wasser-Systeme und andere Systeme, die im Fachgebiet bekannt sind. Die Dosierung wird von der spezifischen Aktivität des Impfstoffs abhängen und kann leicht durch Routineexperimente bestimmt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind für eine oder mehrere biologische Funktionen verantwortlich, einschließlich einem oder mehreren Krankheitszuständen, insbesondere für „die Krankheiten", die hierin vorstehend erwähnt wurden. Daher ist es wünschenswert, Durchmusterungsverfahren zu entwerfen, um Verbindungen zu identifizieren, die die Funktion des Polypeptids stimulieren oder hemmen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen bereit, das dazu dient, diejenigen zu identifizieren, die die Funktion des Polypeptids stimulieren oder hemmen. Im Allgemeinen können Agonisten oder Antagonisten für therapeutische und vorbeugende Zwecke für solche „Krankheiten", wie sie hierin vorstehend erwähnt wurden, verwendet werden. Die Verbindungen können aus einer Vielzahl von Quellen identifiziert werden, zum Beispiel aus Zellen, zellfreien Präparaten, chemischen Banken und natürlichen Produktgemischen. Bei den auf diese Weise identifizierten Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren kann es sich um natürliche oder um modifizierte Substrate, Liganden, Rezeptoren, Enzyme usw. je nachdem des Polypeptids handeln, oder es können strukturelle oder funktionelle Mimetika davon sein (vergleiche Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991)).
Das Durchmusterungsverfahren kann einfach aus der Messung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung an das Polypeptid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid enthalten, oder an ein Fusionsprotein davon, erfolgen, und zwar mit Hilfe einer Markierung, die direkt oder indirekt mit der Kandidaten-Verbindung assoziiert ist. Alternativ kann das Durchmusterungsverfahren eine Konkurrenzreaktion mit einem markierten Konkurrenten umfassen. Mit diesen Durchmusterungsverfahren kann weiterhin ausgetestet werden, ob die Kandidaten-Verbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder durch Hemmung des Polypeptids erzeugt wurde, und zwar unter Verwendung von Nachweissystemen, die für die Zellen geeignet sind, welche das Polypeptid enthalten. Inhibitoren der Aktivierung werden im Allgemeinen in Gegenwart eines bekannten Agonisten ausgetestet, und es wird die Wirkung auf die Aktivierung durch den Agonisten bei Anwesenheit der Kandidaten-Verbindung beobachtet. Bei Durchmusterungsverfahren auf inverse Agonisten oder Inhibitoren können konstitutiv aktive Polypeptide bei Abwesenheit eines Agonisten oder eines Inhibitors verwendet werden, und zwar indem man untersucht, ob die Kandidaten-Verbindung zur Hemmung der Aktivierung des Polypeptids führt. Des weiteren können die Durchmusterungsverfahren einfach nur den Schritt des Mischens einer Kandidaten-Verbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält, umfassen, um ein Gemisch zu bilden, des Messens der MPROT15-Akitivtät in dem Gemisch und des Vergleichens der MPROT15-Aktivität des Gemisches mit einem Standard. Es können ebenfalls Fusionsproteine, wie z. B. solche, die aus dem Fc-Anteil und dem MPROT15-Polypeptid hergestellt wurden, wie hierin vorstehend beschrieben wurde, für Durchmusterungs-Testansätze mit hohem Durchsatzvermögen verwendet werden, um Antagonisten für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu identifizieren (vergleiche D.
Bennett et al., J. Mol. Recognition 8:52–58 (1995) und K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270(16):9459–9471 (1995)).
Die Polynucleotide, Polypeptide und Antikörper gegen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, Durchmusterungsverfahren zum Nachweis der Wirkung von zugeführten Verbindungen auf die Produktion der mRNA und des Polypeptids in Zellen zu entwerfen. Zum Beispiel kann ein ELISA-Testansatz zur Messung sezernierter oder mit Zellen assoziierter Mengen des Polypeptids konstruiert werden, und zwar unter Verwendung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern in Standardverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind. Dies kann dazu verwendet werden, Mittel aus in geeigneter Weise manipulierten Zellen oder Geweben zu entdecken, die die Produktion des Polypeptids hemmen oder verstärken (auch Antagonisten, beziehungsweise Agonisten genannt).
Das Polypeptid kann verwendet werden, um membrangebundene oder lösliche Rezeptoren, wenn überhaupt vorhanden, zu identifizieren, und zwar über Standard-Rezeptor-Bindungsverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind. Diese umfassen z. B. Liganden-Bindungs- und Vernetzungs-Testansätze, bei denen das Polypeptid mit einem radioaktiven Isotop (zum Beispiel ¹²⁵I) markiert, chemisch modifiziert (zum Beispiel biotinyliert) oder mit einer Peptidsequenz fusioniert wird, die zum Nachweis oder zur Reinigung geeignet ist, und mit einer Quelle des möglichen Rezeptors (Zellen, Zellmembranen, Zellüberstände, Gewebeextrakte, Körperflüssigkeiten) inkubiert wird, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere Verfahren umfassen biophysikalische Verfahren, wie z. B. die Oberflächen-Plasmon-Resonanz und die Spektroskopie. Diese Durchmusterungsverfahren können auch verwendet werden, um Agonisten und Antagonisten des Polypeptids zu identifizieren, die mit der Bindung des Polypeptids an seinen Rezeptor konkurrieren, wenn er überhaupt vorhanden ist. Standardverfahren zur Durchführung solcher Testansätze sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Beispiele für potenzielle Polypeptid-Antagonisten umfassen Antikörper oder in einigen Fällen Oligonucleotide oder Proteine, die mit den Liganden, Substraten, Rezeptoren, Enzymen usw. je nachdem des Polypeptids, eng verwandt sind, wie z. B. ein Fragment der Liganden, Substrate, Rezeptoren, Enzyme usw.; oder kleine Moleküle, die an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden, aber keine Antwortreaktion hervorrufen, so dass die Aktivität des Polypeptids verhindert wird.
Fachleute werden rasch erkennen, dass ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung auch bei einem Verfahren zum auf der Struktur basierenden Entwerfen (design) eines Agonisten, Antagonisten oder eines Inhibitors des Polypeptids verwendet werden kann, und zwar durch:

(a) zuerst dem Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des Polypeptids;
(b) dem Ableiten/Berechnen aus der dreidimensionalen Struktur der wahrscheinlichsten reaktiven Stelle(n) oder der Bindestelle(n) eines Agonisten, Antagonisten oder Inhibitors;
(c) der Synthese von Kadidaten-Verbindungen, von denen vorhergesagt werden kann, dass sie an die abgeleitete Bindestelle binden oder mit der abgeleiteten reaktiven Stelle reagieren; und
(d) dem Austesten, ob es sich bei den Kandidaten-Verbindungen tatsächlich um Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren handelt.

Weiterhin wird angenommen, dass es sich hierbei normalerweise um einen iterativen Vorgang handelt.
Agonisten oder Antagonisten, die unter Verwendung des Durchmusterungsverfahrens der Erfindung identifiziert wurden, können bei der Behandlung abnormaler Zustände nützlich sein, wie zum Beispiel Bluthochdruck, Kardiomyopathien, Schlaganfall, Herzerkrankungen, Neurodegeneration, Alzheimer-Krankheit und Krankheiten, die mit der Prozessierung von Peptidhormonen oder von Cytokinen verbunden sind, die entweder mit einer überschüssigen oder einer schwachen Expression der MPROT15-Polypeptid-Aktivität in Beziehung stehen.
Wenn sich die Aktivität des Polypeptids im Überschuss befindet, sind mehrere Ansätze verfügbar. Ein Ansatz umfasst die Verabreichung einer Inhibitorverbindung (Antagonist) an ein Subjekt, das deren bedarf, wie hierin vorstehend beschrieben, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, in einer Menge, die ausreicht, um die Funktion des Polypeptids zu hemmen, zum Beispiel durch die Blockierung der Bindung von Liganden, Substraten, Rezeptoren, Enzymen usw. oder durch die Hemmung eines sekundären Signals, wodurch der abnormale Zustand abgemildert wird. Bei einem anderen Ansatz können lösliche Formen des Polypeptids verabreicht werden, die aber immer noch in der Lage sind, an den Liganden, das Substrat, die Enzyme, die Rezeptoren usw. in Konkurrenz mit dem endogenen Polypeptid zu binden. Typische Beispiele solcher Konkurrenten umfassen Fragmente des MPROT15-Polypeptids.
Zur Behandlung abnormaler Zustände, die mit einer schwachen Expression von MPROT15 und seiner Aktivität in Beziehung stehen, sind ebenfalls mehrere Ansätze verfügbar. Ein Ansatz umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung an ein Subjekt, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung aktiviert, d. h. einen Agonisten wie vorstehend beschrieben, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, um so den abnormalen Zustand abzumildern.
Agonisten oder Antagonisten können in Arzneimitteln verwendet werden, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids umfassen, wie z. B. die lösliche Form eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, ein Agonisten/Antagonisten-Peptid oder eine niedermolekulare Verbindung, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Solche Träger umfassen Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon, sind aber nicht auf diese beschränkt. Polypeptide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können alleine oder zusammen mit anderen Verbindungen, wie z. B. therapeutischen Verbindungen, angewendet werden.
Die Zusammensetzung kann dem Weg der Verabreichung angepasst werden, d. h. zum Beispiel einem systemischen oder einem oralen Weg. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung umfassen die Injektion, wobei es sich typischerweise um eine intravenöse Injektion handelt. Es können andere Wege der Injektion, wie z. B. der subcutane, intramuskuläre oder intraperitoneale verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung umfassen die Verabreichung über die Schleimhaut oder die Haut unter Verwendung von Durchdringungsmitteln, wie z. B. Gallensalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergenzien. Darüber hinaus kann, wenn ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer darmlöslichen oder in einer verkapselten Formulierung formuliert werden kann, eine orale Verabreichung ebenfalls möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann auch äußerlich und/oder lokal in Form von Salben, Pasten, Gelen und Ähnlichem erfolgen.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids oder den anderen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, dem Weg der Verabreichung, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustandes des Subjekts und der Beurteilung durch den behandelnden Arzt ab. Geeignete Dosierungen liegen jedoch im Bereich von 0,1–100 μg/kg des Subjekts. Im Hinblick auf die Vielzahl der verfügbaren Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Wege der Verabreichung werden jedoch große Variationen hinsichtlich der benötigen Dosierungen erwartet. Zum Beispiel wird von der oralen Verabreichung erwartet, dass sie höhere Dosen erfordert, als eine Verabreichung über intravenöse Injektion. Abweichungen von diesen Dosierungsmengen können unter Verwendung empirischer Standardverfahren zur Optimierung eingestellt werden, wie im Fachgebiet bekannt ist.
Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis bestimmter Ausdrücke zu erleichtern, die hierin vorstehend oft verwendet wurden.
„Antikörper", wie hierin verwendet, umfasst polyclonale und monoclonale Antikörper, Chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab- oder einer anderen Immunglobulin-Expressions-Genbank.
„Isoliert" bedeutet verändert „durch die Hand des Menschen" gegenüber dem natürlichen Zustand. Wenn eine „isolierte" Zusammensetzung oder ein Stoff in der Natur vorkommt, wurde sie/er verändert oder aus ihrer/seiner natürlichen Umgebung entfernt, oder beides. Zum Beispiel ist ein Polynucleotid oder ein Polypeptid, das in einem lebenden natürlich Tier vorkommt, nicht „isoliert", aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das von den mit ihm im natürlichen Zustand zusammen existierenden Materialien getrennt worden ist, ist „isoliert", in dem Sinn wie der Ausdruck hierin verwendet wird.
„Polynucleotid" bezieht sich auf beliebige Polyribonucleotide oder Polydesoxyribonucleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder um modifizierte RNA oder DNA handeln kann. „Polynucleotide" umfassen ohne Einschränkung einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die aus einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger Bereiche besteht, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die aus einem Gemisch einzel- und doppelsträngiger Bereiche besteht, Hybridmoleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig sein können oder typischerweise doppelsträngig sind, oder aus einem Gemisch von einzel- und doppelsträngigen Bereichen bestehen. Darüber hinaus bezieht sich „Polynucleotid" auch auf dreisträngige Bereiche, die RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA umfassen. Der Begriff „Polynucleotid" umfasst auch DNAs oder RNAs, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten, und DNA oder RNAs mit Grundgerüsten, die aus Gründen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurden.
„Modifizierte" Basen umfassen zum Beispiel tritylierte Basen und ungewöhnliche Basen, wie z. B. Inosin. An der DNA oder der RNA kann eine Vielzahl von Modifizierungen vorgenommen werden, daher schließt „Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynucleotiden mit ein, wie sie typischerweise in der Natur gefunden werden, sowie die chemischen Formen der DNA und der RNA, wie sie für Viren und Zellen charakteristisch sind. „Polynucleotid" umfasst auch relativ kurze Polynucleotide, die oft als Oligonucleotide bezeichnet werden.
„Polypeptid" bezieht sich auf beliebige Peptide oder Proteine, die zwei oder mehrere Aminosäuren umfassen und die untereinander durch Peptidbindungen oder durch modifizierte Peptidbindungen verbunden sind, d. h. Peptid-Isostere. „Polypeptid" bezieht sich sowohl auf kurze Ketten, die üblicherweise als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Ketten, die im Allgemeinen als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere Aminosäuren als die 20 von Genen codierten Aminosäuren enthalten. „Polypeptide" umfassen Aminosäuresequenzen, die entweder durch natürliche Vorgänge, wie z. B. post-translationale Prozessierung, oder durch chemische Modifizierungsverfahren, die alle im Fachgebiet wohlbekannt sind, modifiziert wurden. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten und in detaillierteren Monographien sowie in der umfangreichen Forschungsliteratur gut beschrieben. Modifizierungen können an beliebigen Orten in einem Polypeptid auftreten, einschließlich dem Peptid-Grundgerüst, den Aminosäure-Seitenketten und den Amino- oder den Carboxyl-Enden. Es wird angenommen, dass die gleiche Art der Modifikation zu dem gleichen oder zu variierenden Graden an mehreren Stellen in einem bestimmten Polypeptid vorliegen kann. Ein bestimmtes Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide können als Folge einer Ubiquitinylierung verzweigt sein, und sie können cyclisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Cyclische, verzweigte oder verzweigte cyclische Polypeptide können durch post-translationale natürliche Prozesse entstehen, oder sie können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Die Modifikationen umfassen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, Biotinylierung, kovalente Anheftung von Flavin, kovalente Anheftung eines Häm-Restes, kovalente Anheftung eines Nucleotids oder eines Nucleotid-Derivats, kovalente Anheftung eines Lipids oder eines Lipid-Derivats, kovalente Anheftung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Cyclisierung, Bildung von Disulfidbrücken, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, durch Transfer-RNA vermittelte Hinzufügung von Aminosäuren an Proteine, wie z. B. Arginylierung und Ubiquitinylierung (vergleiche zum Beispiel: Proteins – Structure and Molecular Properties, 2. Ausgabe, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12, in: Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., „Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626–646 und Rattan et al., „Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663:48–62).
„Variante" bezieht sich auf ein Polynucleotid oder ein Polypeptid, das sich von einem Referenz-Polynucleotid oder -Polypeptid unterscheidet, aber die wesentlichen Eigenschaften beibehalten hat. Eine typische Variante eines Polynucleotids unterscheidet sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen, dem Referenz-Polynucleotid. Die Veränderungen in der Nucleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch das Referenz-Polynucleotid codiert wird, verändern oder auch nicht. Veränderung eines Nucleotids können zu Aminosäureaustauschen, Hinzufügungen, Deletionen, Fusionen oder Verkürzungen in dem Polypeptid führen, welches durch die Referenz-Sequenz codiert wird, wie nachstehend diskutiert wird. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen, dem Referenz-Polypeptid. Im Allgemeinen sind die Unterschiede so begrenzt, dass die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Bereichen identisch sind. Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch einen oder mehrere Austausche, Hinzufügungen, Deletionen in beliebiger Kombination unterscheiden. Ein ausgetauschter oder inserierter Aminosäurerest kann durch den genetischen Code codiert sein, oder auch nicht. Eine Variante eines Polynucleotids oder eines Polypeptids kann natürlich vorkommen, wie z. B. eine allelische Variante, oder es kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich vorkommt. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynucleotiden und Polypeptiden können durch Mutageneseverfahren oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
„Identität", wie sie im Fachgebiet bekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynucleotidsequenzen, wie sie durch einen Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Im Fachgebiet bedeutet „Identität" auch den Grad der Verwandtschaft von Sequenzen zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, je nachdem, wie durch die Übereinstimmung zwischen Bereichen solcher Sequenzen bestimmt wird. „Identität" und „Ähnlichkeit" können leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschließlich denjenigen, die beschrieben wurden in: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A.M. und Griffin, H.G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991 und Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988), sind aber nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität sind so entworfen, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen ergeben. Verfahren zur Bestimmung der Identität und der Ähnlichkeit sind in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen verschlüsselt. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung der Identität und der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen umfassen das GCG-Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990), sind aber nicht auf diese beschränkt. Das BLASTX-Programm ist öffentlich erhältlich von NCBI und anderen Quellen (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990)). Es kann auch der wohlbekannte Smith-Waterman-Algorithmus verwendet werden, um die Identität zu bestimmen.
Die bevorzugten Parameter zum Vergleich von Polypeptidsequenzen umfassen die Folgenden:

1) Algorithmus: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443–453 (1970) Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915–10919 (1992) Gap Penalty („Strafe für Lücke"): 12 Gap Length Penalty („Strafe für Lückenlänge"): 4

Ein Programm, das mit diesen Parametern verwendet werden kann, ist öffentlich als das „Gap"-Progamm von der Genetics Computer Group, Madison, WI erhältlich. Die vorstehend erwähnten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (sowie „ohne Strafe" für Lücken am Ende).
Die bevorzugten Parameter zum Vergleich von Polynucleotidsequenzen umfassen die Folgenden:

1) Algorithmus: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443–453 (1970) Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen (matches) = +10, keine Übereinstimmung (mismatch) = 0 Gap Penalty („Strafe für Lücke") : 50 Gap Length Penalty („Strafe für Lückenlänge"): 3 Verfügbar als: Das „Gap"-Progamm von der Genetics Computer Group, Madison, WI. Dies sind die Standardparameter für Nucleinsäurevergleiche.

Zum Beispiel kann eine Polynucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit der Referenz-Sequenz der SEQ ID NO: 1 identisch sein, das heißt 100% identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl Nucleotidveränderungen im Vergleich zu der Referenz-Sequenz enthalten. Solche Veränderungen werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: mindestens eine Nucleotid-Deletion, einen Nucleotid-Austausch, einschließlich einer Transition und einer Transversion, oder eine Nucleotid-Insertion, wobei diese Veränderungen an den 5'- oder den 3'-terminalen Positionen der Referenz-Nucleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, und wobei sie entweder individuell zwischen den Nucleotiden der Referenz-Sequenz eingestreut oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppe(n) in der Referenzsequenz liegen können. Die Anzahl der Nucleotidveränderungen wird durch Multiplikation der Gesamtanzahl der Nucleotide in der SEQ ID NO: 1 mit dem numerischen Prozentsatz der entsprechenden Prozent Identität (geteilt durch 100) und der Subtraktion dieses Produkts von der Gesamtanzahl der Nucleotide in der SEQ ID NO: 1 bestimmt; oder: nn ≤ xn – (xn·y),wobei n_n die Anzahl der Nucleotidveränderungen darstellt, x_n die Gesamtanzahl der Nucleotide in der SEQ ID NO: 1 darstellt, und y ist zum Beispiel 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 % usw., und wobei jedes beliebige nicht ganzzahlige Produkt von x_n und y auf die nächste ganze Zahl abgerundet wird, bevor es von x_n subtrahiert wird. Veränderungen einer Polynucleotidsequenz, die das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert, können Nonsense-, Missense- oder Leseraster-Mutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Polypeptid verändern, das nach solchen Veränderungen durch das Polynucleotid codiert wird.
In ähnlicher Weise kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung mit der Referenz-Sequenz der SEQ ID NO: 2 identisch sein, das heißt 100 % identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl Aminosäureveränderungen im Vergleich zu der Referenz-Sequenz umfassen, so dass die Identität weniger als 100 % beträgt. Solche Veränderungen werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mindestens einer Aminosäure-Deletion, einem Aminosäure-Austausch, einschließlich eines konservativen und eines nicht konservativen Austausches, oder einer Aminosäure-Insertion, wobei diese Veränderungen an den amino- oder carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebigen Stellen zwischen diesen endständigen Positionen auftreten können, und wobei sie entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenz-Sequenz eingestreut oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppe(n) innerhalb der Referenzsequenz liegen können. Die Anzahl der Aminosäureveränderungen für einen bestimmten Prozent-Wert der Identität wird durch die Multiplikation der Gesamtanzahl der Aminosäuren in der SEQ ID NO: 2 mit dem numerischen Prozentwert der entsprechenden Prozent Identität (geteilt durch 100) und der Subtraktion dieses Produkts von der Gesamtanzahl der Aminosäuren in der SEQ ID NO: 2 bestimmt; oder: na ≤ xa – (xa·y),wobei n_a die Anzahl der Aminosäureveränderungen darstellt, x_a die Gesamtanzahl der Aminosäuren in der SEQ ID NO: 2 darstellt, und y ist zum Beispiel 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % usw., und wobei jedes beliebige nicht ganzzahlige Produkt von x_a und y auf die nächste ganze Zahl abgerundet wird, bevor es von x_a subtrahiert wird.
„Homolog" ist ein generischer Begriff, der im Fachgebiet verwendet wird, um anzuzeigen, dass eine Polynucleotid- oder eine Polypeptidsequenz einen hohen Grad an Sequenzverwandtschaft mit einer bestimmten Sequenz aufweist. Eine solche Verwandtschaft kann durch die Bestimmung des Grades der Identität und/oder der Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen, die verglichen werden, quantifiziert werden, wie hierin vorstehend beschrieben wurde. Unter diesen generischen Begriff fallen die Begriffe „Ortholog", der ein Polynucleotid oder ein Polypeptid bedeutet/definiert, das ein funktionelles Äquivalent eines Polynucleotids oder eines Polypeptids in einer anderen Art darstellt, und „Paralog", der eine funktionell ähnliche Sequenz bedeutet/definiert, wenn innerhalb dergleichen Art betrachtet.
„Fusionsprotein" bezieht sich auf ein Protein, das durch zwei, oft nicht miteinander verwandte, fusionierte Gene oder Fragmente davon codiert wird. In einem Beispiel offenbart EP-A-O 464 Fusionsproteine, die unterschiedliche Anteile der konstanten Region von Immunglobulin-Molekülen zusammen mit anderen menschlichen Proteinen oder Teilen davon enthalten. In vielen Fällen ist die Verwendung der Immunglobulin-Fc-Region als Teil eines Fusionsproteins zur Verwendung bei einer Therapie und bei der Diagnose vorteilhaft und führt zum Beispiel zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften [vergleiche z. B. EP-A 0232 262]. Andererseits wäre es für einige Verwendungen wünschenswert, wenn man in der Lage ist, den Fc-Anteil zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein exprimiert, nachgewiesen und gereinigt worden ist.
SEQUENZINFORMATION SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:4 bezieht sich auf die Aminosäuresequenz, die als "Query" ("Anfrage") bezeichnet ist

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 2 aufweist.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz eine Identität von mindestens 95% aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.
Isoliertes Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2.
Isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 2 aufweist; oder eine Nucleotidsequenz, die zu dem isolierten Polynucleotid komplementär ist.
Isoliertes Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 1 aufweist, oder eine Nucleotidsequenz, die zu dem isolierten Polynucleotid komplementär ist.
Isoliertes Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei die Identität mindestens 95% ist.
Isoliertes Polynucleotid ausgewählt aus: (a) einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert; und (b) dem Polynucleotid von SEQ ID NO: 1, oder eine Nucleotidsequenz, die zu dem isolierten Polynucleotid komplementär ist.
Expressionssystem, umfassend ein Polynucleotid, das in der Lage ist, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 zu produzieren, wenn das Expressionssystem in einer kompatiblen Wirtszelle vorliegt.
Wirtszelle, umfassend das Expressionssystem gemäß Anspruch 9 oder eine Membran hiervon, das/die das Polypeptid gemäß Anspruch 1 exprimiert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, umfassend das Züchten einer Wirtszelle gemäß Anspruch 10 unter Bedingungen, die ausreichend sind für die Herstellung des Polypeptids, und das Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Antikörper, der für das Polypeptid gemäß Anspruch 1 immunspezifisch ist.
Verfahren zur Durchmusterung, um Verbindungen zu identifizieren, die die Funktion des Polypeptids gemäß Anspruch 1 stimulieren oder inhibieren, das ein Verfahren umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Messen der Bindung einer Kandidatenverbindung an das Polypeptid (oder an die Zellen oder Membranen, die das Polypeptid tragen) oder an ein Fusionsprotein hiervon unter Verwendung einer Markierung, die mit der Kandidatenverbindung direkt oder indirekt assoziiert ist; (b) Messen der Bindung einer Kandidatenverbindung an das Polypeptid (oder an die Zellen oder Membranen, die das Polypeptid tragen) oder an ein Fusionsprotein hiervon in Anwesenheit eines markierten Kompetitors; (c) Nachweisen, ob die Kandidatenverbindung ein Signal auslöst, das durch Aktivierung oder Inhibierung des Polypeptids erzeugt wird, unter Verwendung von Detektionssystemen, die für die Zellen oder Zellmembranen, die das Polypeptid tragen, geeignet sind; (d) Mischen einer Kandidatenverbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 enthält, um eine Mischung zu erhalten, Messen der Aktivität des Polypeptids in der Mischung und Vergleichen der Aktivität der Mischung mit einem Standard; oder (e) Nachweisen der Wirkung einer Kandidatenverbindung auf die Produktion von mRNA, die das Polypeptid codiert, und des Polypeptids in Zellen, beispielsweise unter Verwendung eines ELISA-Tests.
Isoliertes Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem isolierten Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit SEQ ID NO: 3 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 3 aufweist; (b) einem isolierten Polynucleotid, umfassend das Polynucleotid gemäß SEQ ID NO: 3; (c) dem Polynucleotid von SEQ ID NO: 3; oder (d) einem isolierten Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4 aufweist.
Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4 aufweist; (b) einem Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 eine Identität von mindestens 70% über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4 aufweist; (c) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst; (d) einem Polypeptid, das das Polypeptid von SEQ ID NO: 4 ist; oder (e) einem Polypeptid, das von einem Polynucleotid codiert wird, das die in SEQ ID NO: 3 enthaltene Sequenz umfasst.