DE69738466T2

DE69738466T2 - STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE METHIONYL tRNS SYNTHETASE

Info

Publication number: DE69738466T2
Application number: DE69738466T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Jane Malvern LAWLOR
Original assignee: Replidyne Inc
Current assignee: Cardiovascular Systems Inc
Priority date: 1996-04-18
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2017-04-19
Also published as: EP0898577A1; EP1947106A1; US20090092592A1; DE69738466D1; GB9607999D0; US6294175B1; US6001601A; EP0898577B1; JP2000508543A; WO1997039012A1; DK0898577T3; EP0898577A4

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der UK-Anmeldung Nummer 9607999.1 , eingereicht am 18. April 1996.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynukleotide und Polypeptide und deren Herstellung und Verwendung sowie deren Varianten, Agonisten und Antagonisten und deren Verwendungen. Insbesondere betrifft die Erfindung in dieser sowie in anderer Hinsicht neue Polynukleotide und Polypeptide der Methionyl-tRNA-Synthetase-Familie, im folgenden bezeichnet mit "metS".
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Streptokokken bilden eine medizinisch wichtige Gattung von Mikroben, von denen bekannt ist, daß sie verschiedene Typen von Erkrankungen in Menschen, einschließlich beispielsweise Otitis media, Konjunktivitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, Sinusitis, Pleuraempyem und Endokarditis, und insbesondere Meningitis, wie beispielsweise Infektion der Zerebrospinalflüssigkeit, verursachen. Seit seiner Isolierung vor mehr als 100 Jahren ist Streptococcus pneumoniae eine der intensiver untersuchten Mikroben. Beispielsweise basierte ein Großteil unseres frühen Verständnisses, wonach DNA tatsächlich das genetische Material ist, auf der Arbeit von Griffith und von Avery, Macleod und McCarty, die diese Mikrobe verwendeten. Trotz der umfangreichen Forschung mit S. pneumoniae bleiben viele Fragen betreffend die Virulenz dieser Mikrobe bestehen. Es ist besonders bevorzugt, Streptokokkengene und -Genprodukte als Ziele für die Entwicklung von Antibiotika zu verwenden.
Die Häufigkeit von Streptococcus pneumoniae-Infektionen ist in den vergangenen 20 Jahren drastisch gestiegen. Dies wurde dem Aufkommen mehrfach antibiotikaresistenter Stämme und einer wachsenden Population von Menschen mit geschwächtem Immunsystem zugeschrieben. Es ist nicht mehr unüblich, Streptococcus pneumoniae-Stamme zu isolieren, die gegen einige der oder alle Standardantibiotika resistent sind. Dies hat eine Nachfrage sowohl nach neuen antimikrobiellen Mitteln als auch nach diagnostischen Tests für diesen Organismus geschaffen.
Die t-RNA-Synthetasen spielen eine primäre Rolle in der Proteinsynthese gemäß folgendem Schema: Enzym + ATP + AA ⇔ Enzym.AA-AMP + PPi Enzym.AA-AMP + t-RNA ⇔ Enzym + AMP + AA-t-RNA worin AA eine Aminosäure ist.
Eine Hemmung dieses Prozesses führt zu einer Reduzierung der Mengen an geladener t-RNA, und dies löst eine Kaskade von Antworten, bekannt als die stringente Antwort, aus, deren Ergebnis die Induzierung eines Ruhezustands in dem Organismus ist. Selektive Inhibitoren von bakterieller t-RNA-Synthetase als solche besitzen ein Potential als antibakterielle Mittel. Ein Beispiel hierfür ist Mupirocin, welches ein selektiver Inhibitor von Isoleucyl-t-RNA-Synthetase ist. Weitere t-RNA-Synthetasen werden derzeit als mögliche antibakterielle Ziele untersucht, wobei dieser Vorgang durch die Isolierung der Synthetase in hohem Maße unterstützt wird.
Es besteht ganz klar ein Bedarf nach Faktoren, wie den neuen Verbindungen der Erfindung, die den Vorteil besitzen, daß sie geeignet sind, um Verbindungen hinsichtlich antibiotischer Aktivität zu screenen. Solche Faktoren eignen sich auch, um deren Rolle bei der Pathogenese von Infektion, Dysfunktion und Erkrankung zu bestimmen. Es besteht auch ein Bedarf nach der Identifizierung und Charakterisierung solcher Faktoren und deren Antagonisten und Agonisten, die bei der Prävention, Linderung oder Korrektur von Infektionen, Dysfunktionen oder Erkrankungen eine Rolle spielen können.
Die Polypeptide der Erfindung besitzen Aminosäuresequenzhomologie zu einem bekannten Bacillus stearothermophilus-Methionyl-tRNA-Synthetase-Protein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, Polypeptide bereitzustellen, die durch Homologie zwischen der in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] aufgeführten Aminosäuresequenz und einer bekannten Aminosäuresequenz oder Sequenzen von anderen Proteinen, wie Bacillus stearothermophilus-Methionyl-tRNA-Synthetase-Protein, als neue metS-Polypeptide identifiziert wurden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Polynukleotide, die metS-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier mit metS bezeichnete Polypeptid codieren, bereitzustellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die metS-Polypeptide, welche die in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] aufgeführte Sequenz umfassen, die ein Gen voller Länge enthält, oder eine Variante davon codiert.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein neues metS-Protein von Streptococcus pneumoniae, welches die Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] umfaßt, oder eine Variante davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches ein reifes Polypeptid codiert, das durch den in dem hinterlegten Stamm enthaltenen Streptococcus pneumoniae-0100993-Stamm exprimierbar ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle, die metS, insbesondere Streptococcus pneumoniae-metS, codieren, einschließlich mRNAs, cDNAs, genomischer DNAs, bereitgestellt. Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und diese umfassende Zusammensetzungen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke, insbesondere für die genetische Immunisierung, bereitgestellt. Zu den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gehören natürlich vorkommende allele Varianten von metS und dadurch codierte Polypeptide.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert neue Polypeptide von Streptococcus pneumoniae, die hierin mit metS bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und diese umfassende Zusammensetzungen.
Zu den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gehören Varianten von metS-Polypeptid, die durch natürlich vorkommende Allele des metS-Gens codiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung der vorgenannten metS-Polypeptide bereitgestellt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Inhibitoren solcher Polypeptide, die als antibakterielle Mittel nützlich sind, einschließlich beispielsweise Antikörper, bereitgestellt.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Produkte, Zusammensetzungen und Verfahren zur Feststellung der metS-Expression, der Behandlung von Erkrankungen, wie beispielsweise Otitis media, Konjunktivitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, Sinusitis, Pleuraempyem und Endokarditis, und insbesondere Meningitis, wie beispielsweise Infektion der Zerebrospinalflüssigkeit, zum Testen von genetischen Abweichungen und zum Verabreichen eines metS-Polypeptids oder -Polynukleotids an einen Organismus, um eine immunologische Antwort auf ein Bakterium, insbesondere ein Streptococcus pneumoniae-Bakterium, auszulösen, bereitgestellt.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses und weiterer Aspekte der Erfindung werden Polynukleotide bereitgestellt, die insbesondere unter stringenten Bedingungen an metS-Polynukleotidsequenzen hybridisieren.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen metS-Polypeptide bereitgestellt.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die an ein Polypeptid oder Polynukleotid der Erfindung binden oder in anderer Weise damit Wechselwirken und eine Aktivität eines Polypeptids oder Polynukleotids der Erfindung hemmen oder aktivieren, bereitgestellt, wobei die Verfahren folgendes umfassen: Inkontaktbringen eines Polypeptids oder Polynukleotids der Erfindung mit einer zu screenenden Verbindung unter solchen Bedingungen, die eine Bindung oder eine andere Wechselwirkung zwischen der Verbindung und dem Polypeptid oder Polynukleotid erlauben, um die Bindung oder die andere Wechselwirkung mit der Verbindung zu beurteilen, wobei eine solche Bindung oder Wechselwirkung mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die in der Lage ist, ein detektierbares Signal in Reaktion auf die Bindung oder Wechselwirkung des Polypeptids oder Polynukleotids mit der Verbindung bereitzustellen, und Bestimmen, ob die Verbindung an das Polypeptid oder Polynukleotid bindet oder in anderer Weise damit wechselwirkt und eine Aktivität des Polypeptids oder Polynukleotids aktiviert oder hemmt, indem das Vorliegen oder Nichtvorliegen eines Signals, welches durch die Bindung oder Wechselwirkung der Verbindung an bzw. mit dem Polypeptid oder Polynukleotid erzeugt wird, detektiert wird.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden metS-Agonisten und -Antagonisten, insbesondere bakteriostatische oder bakterizide Agonisten und Antagonisten, bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen, die ein metS-Polynukleotid oder ein metS-Polypeptid umfassen, für die Verabreichung an eine Zelle oder an einen multizellulären Organismus, bereitgestellt.
Verschiedene Veränderungen und Modifikationen der offenbarten Erfindung ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet leicht beim Lesen der nachfolgenden Beschreibungen und beim Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenlegung.
GLOSSAR
Die nachfolgenden Definitionen werden angegeben, um das Verständnis bestimmter, hier häufig verwendeter Begriffe zu erleichtern.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die transformiert oder transfiziert wurde oder die zur Transformation oder Transfektion durch eine exogene Polynukleotidsequenz in der Lage ist.
"Identität", wie auf dem Gebiet bekannt, ist ein Verhältnis zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynukleotidsequenzen, bestimmt durch Vergleichen der Sequenzen. Auf dem Gebiet bezeichnet "Identität" auch den Grad an Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- bzw. Polynukleotidsequenzen, bestimmt durch die Übereinstimmung zwischen Abschnitten solcher Sequenzen. "Identität" und "Ähnlichkeit" können mittels bekannter Verfahren, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung auf diejenigen, die beschrieben sind in (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Hsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hsg., M. Stockton Press, New York, 1991, und Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), leicht berechnet werden. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Identität sind so ausgestaltet, daß sie die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen kodifiziert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen umfassen ohne Beschränkung hierauf das GCG-Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASIA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403–410 (1990). Das BLAST X-Programm ist von NCBI und anderen Quellen öffentlich erhältlich (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990). Beispielsweise ist mit einem Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die beispielsweise wenigstens 95% "Identität" zu einer Vergleichsnukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt, gemeint, daß die Nukleotidsequenz des Polynukleotids zu der Vergleichssequenz identisch ist, mit der Ausnahme, daß die Polynukleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro 100 Nukleotide der Vergleichsnukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 enthalten kann. Mit anderen Worten, um ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz mit wenigstens 95% Identität zu einer Vergleichsnukleotidsequenz zu erhalten, können bis zu 5% der Nukleotide in der Vergleichssequenz deletiert oder mit einem anderen Nukleotid substituiert werden, oder eine Anzahl an Nukleotiden von bis zu 5% aller Nukleotide in der Vergleichssequenz kann in die Vergleichssequenz eingebracht werden. Diese Mutationen der Vergleichssequenz können an den 5- oder 3-terminalen Positionen der Vergleichsnukleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, eingefügt entweder einzeln zwischen Nukleotiden in der Vergleichssequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppe(n) innerhalb der Vergleichssequenz. Analog dazu bedeutet ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit beispielsweise wenigstens 95% Identität zu einer Vergleichsaminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids zu der Vergleichssequenz identisch ist, mit der Ausnahme, daß die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureveränderungen pro 100 Aminosäuren der Vergleichsaminosäure von SEQ ID NO: 2 enthalten kann. Mit anderen Worten, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 95% Identität zu einer Vergleichsaminosäuresequenz zu erhalten, können bis zu 5% der Aminosäurereste in der Vergleichssequenz deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert werden, oder eine Anzahl an Aminosäuren von bis zu 5% aller Aminosäurereste in der Vergleichssequenz kann in die Vergleichssequenz eingebracht werden. Diese Veränderungen der Vergleichssequenz können an den amino- oder carboxyterminalen Positionen der Vergleichsaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, eingefügt entweder einzeln zwischen Resten in der Vergleichssequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppe(n) innerhalb der Vergleichssequenz.
"Isoliert" bedeutet "von Menschenhand verändert" gegenüber dem natürlichen Zustand, d. h. wenn es in der Natur vorkommt, wurde es gegenüber seiner ursprünglichen Umgebung verändert oder daraus entfernt oder beides. Beispielsweise ist ein Polynukleotid oder ein Polypeptid, welches in einem lebenden Organismus natürlich vorkommt, nicht "isoliert", jedoch ist das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, wenn es von den gleichzeitig existierenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt ist, "isoliert", wie der Begriff hier verwendet wird.
"Polynukleotid(e)" bezieht sich im allgemeinen auf irgendein Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. "Polynukleotid(e)" umfassen ohne Beschränkung einzel- und doppelstrangige DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelstrangigen Regionen oder einzel-, doppel- oder dreifachstrangigen Regionen ist, einzel- und doppelstrangige RNA und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelstrangigen Regionen ist, Hybridmoleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelstrangige oder, was typischer ist, doppelstrangige oder dreifachstrangige Regionen oder ein Gemisch aus einzel- und doppelstrangigen Regionen sein können. Zusätzlich bezieht sich "Polynukleotid", wie es hier verwendet wird, auf dreifachstrangige Regionen, die RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA umfassen. Die Stränge in solchen Regionen können von demselben Molekül oder von verschiedene Molekülen stammen. Die Regionen können die Gesamtheit von einem oder mehreren der Moleküle umfassen, sie umfassen jedoch typischer nur eine Region von einigen der Moleküle. Eines der Moleküle einer dreifach-helikalen Region ist oft ein Oligonukleotid. Wie er hier verwendet wird, umfaßt der Begriff "Polynukleotid(e)" auch DNAs oder RNAs wie oben beschrieben, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Somit sind DNAs oder RNAs mit Rückgraten, die aus Stabilitäts- oder anderen Gründen modifiziert wurden, "Polynukleotid(e)" in dem Sinne, wie der Begriff hier verwendet wird. Darüber hinaus sind DNAs oder RNAs, die unübliche Basen, wie Inosin, oder modifizierte Basen, wie tritylierte Basen, umfassen, um nur zwei Beispiele zu nennen, Polynukleotide, wie der Begriff hier verwendet wird. Es versteht sich, daß eine große Vielzahl von Modifikationen an DNA und RNA vorgenommen wurden, die vielen nützlichen Zwecken dienen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Der Begriff "Polynukleotid(e)", wie er hier verwendet wird, umfaßt solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynukleotiden sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen, einschließlich beispielsweise einfachen und komplexen Zellen, charakteristisch sind. "Polynukleotid(e)" umfaßt auch kurze Polynukleotide, die oft als Oligonukleotid(e) bezeichnet werden.
"Polypeptid(e)" bezieht sich auf jedes Peptid oder Protein, welches zwei oder mehrere Aminosäuren umfaßt, die miteinander durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen verbunden sind. "Polypeptid(e)" bezieht sich sowohl auf kurze Ketten, üblicherweise bezeichnet als Peptide, Oligopeptide und Oligomere, als auch auf längere Ketten, die im allgemeinen als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere Aminosäuren als die 20 gencodierten Aminosäuren enthalten. "Polypeptid(e)" umfassen diejenigen, die entweder durch natürliche Prozesse, wie Prozessierung und andere posttranslationale Modifikationen, aber auch durch chemische Modifikationstechniken modifiziert wurden. Solche Modifikationen sind in Grundlagentexten und in detaillierten Monographien sowie in umfangreicher Forschungsliteratur gut beschrieben, und sie sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Es versteht sich, daß derselbe Modifikationstyp in dem gleichen oder in variierendem Umfang an mehreren Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorliegen kann. Auch kann ein gegebenes Polypeptid viele Typen von Modifikationen enthalten. Modifikationen können an irgendeiner Stelle in einem Polypeptid, einschließlich dem Peptidrückgrat, den Aminosäureseitenketten und den Amino- oder Carboxyltermini, auftreten. Modifikationen umfassen beispielsweise Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung eines Häm-Rests, kovalente Anbindung eines Nukleotids oder eines Nukleotidderivats, kovalente Anbindung eines Lipids oder eines Lipidderivats, kovalente Anbindung von Phosphatidylinositol, Vernetzung, Zyklisierung, Bildung von Disulfidbindung, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Verarbeitung, Phosphorylierung, Prenylierung, Razemisierung, Glycosylierung, Lipidanbindung, Sulfatation, Gamma-Carboxylierung von L-Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, Selenoylierung, Sulfatation, transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren zu Proteinen, wie Arginylierung, und Ubiquitinierung. Siehe beispielsweise PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Aufl., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993), und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Hsg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992). Polypeptide können verzweigt oder zyklisch mit oder ohne Verzweigung sein. Zyklische, verzweigte und verzweigte ringförmige Polypeptide können aus natürlichen posttranslationalen Prozessen resultieren und können ebenso durch vollständig synthetische Verfahren hergestellt werden.
Eine "Variante(n)", wie der Begriff hier verwendet wird, ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, welches sich von einem Vergleichspolynukleotid bzw. -polypeptid unterscheidet, jedoch wesentliche Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von einem anderen, einem Vergleichspolynukleotid. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, welches durch das Vergleichspolynukleotid codiert wird, verändern oder nicht verändern. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -trunkierungen in dem durch die Vergleichssequenz codierten Polypeptid führen, wie unten diskutiert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen, einem Vergleichspolypeptid. Im allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, so daß die Sequenzen des Vergleichspolypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Vergleichspolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder eingefügter Aminosäurerest kann ein durch den genetischen Code codierter Aminosäurerest sein oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende, wie z. B. eine allele Variante, sein, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlich vorkommt. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken, durch direkte Synthese und durch andere rekombinante Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue metS-Polypeptide und -Polynukleotide, wie unten ausführlicher beschrieben. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynukleotide einer neuen metS von Streptococcus pneumoniae, die durch Aminosäuresequenzhomologie mit Bacillus stearothermophilus-Methionyl-tRNA-Synthetase-Polypeptid verwandt ist. Die Erfindung betrifft insbesondere metS mit den in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] bzw. Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] aufgeführten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen und die metS-Nukleotidsequenzen der DNA in dem hinterlegten Stamm und dadurch codierte Aminosäuresequenzen. TABELLE 1 metS-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen (A) Sequenzen der Streptococcus pneumoniae-metS-Polynukleotidsequenz [SEQ ID NO: 1]

(B) metS-Polypeptidsequenz, abgeleitet von der Polynukleotidsequenz in dieser Tabelle [SEQ ID NO: 2]

(C) Polynukleotidsequenz-Ausführungsformen [SEQ ID NO: 1]

(D) Polypeptidsequenz-Ausführungsformen [SEQ ID NO: 2]

(E) Sequenzen der Streptococcus pneumoniae-metS-Polynukleotid-ORF-Sequenz [SEQ ID NO: 3]
(F) metS-Polypeptidsequenz, abgeleitet von der Polynukleotid-ORF-Sequenz in dieser Tabelle [SEQ ID NO: 4]
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Streptococcus pneumoniae-0100993-Stamm enthielt, wurde bei National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (hier "NCIMB"), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, am 11. April 1996 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 40794. Die Hinterlegung wurde bei der Hinterlegung als Streptococcus pneumoniae 0100993 bezeichnet. Am 17. April 1996 wurde eine Streptococcus pneumoniae-0100993-DNA-Bibliothek in E. coli in ähnlicher Weise bei der NCIMB hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 40800.
Der hinterlegte Streptococcus pneumoniae-Stamm wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stamms" bezeichnet.
Der hinterlegte Stamm enthält das metS-Gen in voller Länge. Die Sequenz der in dem hinterlegten Stamm enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz des dadurch codierten Polypeptids sind im Falle jeglichen Konflikts mit irgendeiner Beschreibung von Sequenzen hierin maßgeblich.
Die Hinterlegung des hinterlegten Stamms erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren. Der Stamm wird bei Ausgabe eines Patentes der Öffentlichkeit unwiderruflich und ohne Einschränkung oder Bedingung zugänglich gemacht. Der hinterlegte Stamm wird lediglich aus Gründen der Bequemlichkeit für Fachleute auf dem Gebiet bereitgestellt und ist kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung für die Umsetzbarkeit erforderlich ist, wie sie beispielsweise unter 35 U.S.C. § 112 gefordert wird.
Eine Lizenz kann ist möglicherweise erforderlich, um den hinterlegten Stamm und davon abgeleitete Verbindungen herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und hierdurch wird keine solche Lizenz gewährt.
Polypeptide
Die Polypeptide der Erfindung umfassen das Polypeptid aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] (insbesondere das reife Polypeptid) sowie Polypeptide und Fragmente, insbesondere diejenigen, die die biologische Aktivität von metS besitzen, und auch diejenigen, die wenigstens 70% Identität zu einem Polypeptid aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] oder dem relevanten Teil, vorzugsweise wenigstens 80% Identität zu einem Polypeptid aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] und noch bevorzugter wenigstens 90% Ähnlichkeit (bevorzugter wenigstens 90% Identität) zu einem Polypeptid aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] und noch mehr bevorzugt wenigstens 95% Ähnlichkeit (noch bevorzugter wenigstens 95% Identität) zu einem Polypeptid aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] besitzen, und sie umfassen auch Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids im allgemeinen wenigstens 30 Aminosäuren und bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren enthält.
Die Erfindung umfaßt auch Polypeptide mit der in Tabelle 1 (D) [SEQ ID NO: 2] aufgeführten Formel, wobei am Aminoterminus X Wasserstoff ist und am Carboxylterminus Y Wasserstoff oder ein Metall ist, R₁ und R₂ irgendein Aminosäurerest sind und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist. Jeder Abschnitt von Aminosäureresten, der mit irgendeiner der R-Gruppen bezeichnet ist, wobei R größer als 1 ist, kann entweder ein Heteropolymer oder ein Homopolymer, bevorzugt ein Heteropolymer, sein.
Ein Fragment ist ein variantes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die insgesamt die gleiche ist wie ein Teil der, jedoch nicht wie die gesamte Aminosäuresequenz der vorgenannten Polypeptide. Wie auch bei metS-Polypeptiden können Fragmente "frei stehend" oder innerhalb eines größeren Polypeptids, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als eine einzelne kontinuierliche Region, ein einzelnes größeres Polypeptid, umfaßt sein.
Bevorzugte Fragmente umfassen beispielsweise Trunkierungspolypeptide, die einen Teil der Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] oder von Varianten davon aufweisen, wie z. B. eine kontinuierliche Abfolge von Resten, die den Aminoterminus umfaßt, oder eine kontinuierliche Abfolge von Resten, die den Carboxylterminus umfaßt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung in einer Wirtszelle, insbesondere ein Streptococcus pneumoniae, sind auch bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Fragmente, die gekennzeichnet sind durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften, wie Fragmente, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen, Biegungs- und Biegungen bildende Regionen, Spiral- und Spiralen bildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen bildende Regionen, Substratbindungsregionen und Regionen mit hohem antigenen Index umfassen.
Ebenfalls bevorzugt sind biologisch aktive Fragmente, welche diejenigen Fragmente sind, die Aktivitäten von metS vermitteln, einschließlich derjenigen mit einer ähnlichen Aktivität oder einer verbesserten Aktivität oder mit einer verringerten unerwünschten Aktivität. Ebenfalls umfaßt sind diejenigen Fragmente, die in einem Tier, insbesondere in einem Menschen, antigen oder immunogen sind. Besonders bevorzugt sind Fragmente, die Rezeptoren oder Domänen von En zymen umfassen, die eine Funktion verleihen, die für die Lebensfähigkeit von Streptococcus pneumoniae oder die Fähigkeit, Erkrankung in einem Individuum, insbesondere in einem Menschen, zu initiieren oder aufrechtzuerhalten, wesentlich ist.
Varianten, die Fragmente der Polypeptide der Erfindung sind, können verwendet werden, um das korrespondierende Polypeptid voller Länge durch Peptidsynthese herzustellen; daher können diese Varianten als Zwischenprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide in voller Länge verwendet werden.
Polynukleotide
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, einschließlich des Gens voller Länge, welches das metS-Polypeptid mit einer aus Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] abgeleiteten Aminosäuresequenz codiert, und damit eng verwandte Polynukleotide und Varianten davon.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie z. B. einer in Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 1 und 3] aufgeführten Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, welches metS-Polypeptid codiert, unter Verwendung von standardmäßigen Klonierungs- und Screeningverfahren, wie denjenigen zum Klonieren und Sequenzieren von chromosomalen DNA-Fragmenten aus Bakterien unter Verwendung von Streptococcus pneumoniae-0100993-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalten eines Klons voller Länge, erhalten werden. Beispielsweise wird, um eine Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie beispielsweise eine in Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 1 und 3] angegebene Sequenz, zu erhalten, typischerweise eine Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Streptococcus pneumoniae 0100993 in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radioaktiv markierten Oligonukleotid, vorzugsweise einem 17-mer oder länger, abgeleitet von einer Teilsequenz, sondiert. Klone, die DNA tragen, die identisch zu der der Sonde ist, können dann unter stringenten Bedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzieren der einzelnen so identifizierten Klone mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Sequenz hergestellt wurden, ist es dann möglich, die Sequenz in beiden Richtungen zu verlängern, um die volle Gensequenz zu bestimmen. Geeigneterweise wird eine solche Sequenzierung unter Verwendung von denaturierter doppelstrangiger DNA, hergestellt aus einem Plasmidklon, durchgeführt. Geeignete Techniken werden von Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben (siehe insbesondere "Screening by Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70"). Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde das in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] aufgeführte Polynukleotid in einer DNA-Bibliothek aufgefunden, die von Streptococcus pneumoniae 0100993 abgeleitet war.
Die in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] aufgeführte DNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein codiert, welches in etwa die in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] aufgeführte An zahl an Aminosäureresten aufweist, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht, welches unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Molekulargewichtswerten von Aminosäureresten berechnet werden kann. Das Startcodon der DNA in Tabelle 1 ist Nukleotid Nummer 1, und das letzte Codon, das eine Aminosäure codiert, ist Nummer 1995, wobei das Stopcodon das nächste Codon ist, das auf dieses letzte Codon, welches eine Aminosäure codiert, folgt.
metS gemäß der Erfindung ist mit anderen Proteinen der Methionyl-tRNA-Synthetase-Familie strukturell verwandt, wie durch die Ergebnisse der Sequenzierung der DNA, die metS des hinterlegten Stamms codiert, gezeigt wird. Das Protein zeigt unter den bekannten Proteinen die größte Homologie zu Bacillus stearothermophilus-Methionyl-tRNA-Synthetase-Protein. metS aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] besitzt über seine gesamte Länge etwa 58% Identität zu und über seine gesamte Länge etwa 76% Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz von Bacillus stearothermophilus-Methionyl-tRNA-Synthetase-Polypeptid.
Die Erfindung liefert eine Polynukleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge identisch zu der codierenden Sequenz in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] ist. Die Erfindung liefert ebenfalls die codierende Sequenz für das reife Polypeptid oder ein Fragment davon an sich sowie die codierende Sequenz für das reife Polypeptid oder ein Fragment im Leserahmen mit einer weiteren codierenden Sequenz, wie denjenigen, die eine Leitsequenz oder eine Sekretionssequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präproproteinsequenz codieren. Das Polynukleotid kann auch nicht-codierende Sequenzen enthalten, einschließlich beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale, Ribosombindungsstellen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns, Polyadenylierungssignale und zusätzliche codierende Sequenzen, die zusätzliche Aminosäuren codieren. Beispielsweise kann eine Markersequenz codiert werden, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids vereinfacht. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexa-Histidinpeptid, wie es in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821–824 (1989) beschrieben wird, oder eine HA-Markierung (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Polynukleotide der Erfindung umfassen ohne Beschränkung hierauf auch Polynukleotide, die ein Strukturgen und dessen natürlich assoziierte Sequenzen, die die Genexpression steuern, umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist das Polynukleotid, welches die Nukleotide 1 bis 1995 umfaßt, wie in SEQ ID NO: 1 von Tabelle 1 aufgeführt, und welches das metS-Polypeptid codiert.
Die Erfindung umfaßt auch Polynukleotide der in Tabelle 1 (C) [SEQ ID NO: 1] aufgeführten Formel, wobei am 5'-Ende des Moleküls X Wasserstoff ist und am 3'-Ende des Moleküls Y Wasserstoff oder ein Metall ist, R₁ und R₂ irgendein Nukleinsäurerest sind und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist. Jeder Abschnitt der Nukleinsäurereste, die mit einer der R-Gruppen bezeichnet sind, wobei R größer als 1 ist, kann entweder ein Heteropolymer oder ein Homopolymer, bevorzugt ein Heteropolymer, sein.
Der Ausdruck "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz beinhalten, welche ein Polypeptid der Erfindung, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und spezieller ein Polypeptid der Streptococcus pneumoniae-metS mit der in Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] aufgeführten Aminosäuresequenz, codiert. Der Ausdruck umfaßt auch Polynukleotide, die eine einzelne kontinuierliche Region oder diskontinuierliche Regionen, die das Polypeptid codieren (beispielsweise unterbrochen durch integrierte Phagen oder eine Insertionssequenz oder Editing), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die auch codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können, beinhalten.
Die Erfindung betrifft des weiteren Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten des Polypeptids mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] codieren. Varianten, die Fragmente der Polynukleotide der Erfindung sind, können verwendet werden, um erfindungsgemäße Polynukleotide voller Länge zu synthetisieren.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die metS-Varianten codieren, welche die Aminosäuresequenz des metS-Polypeptids aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 2] haben, worin mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 Aminosäurerest(e) oder kein Aminosäurerest (in irgendeiner Kombination) substituiert, deletiert oder addiert sind. Hiervon sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten von metS nicht verändern, besonders bevorzugt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die über ihre gesamte Länge zu wenigstens 70% identisch zu einem Polynukleotid sind, welches metS-Polypeptid mit einer in Tabelle 1 [SEQ ID NOs: 2 und 4] aufgeführten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die zu solchen Polynukleotiden komplementär sind. Alternativ sind Polynukleotide, die eine Region umfassen, welche über ihre gesamte Länge zu wenigstens 80% identisch zu einem Polynukleotid ist, welches metS-Polypeptid des hinterlegten Stamms codiert, und dazu komplementäre Polynukleotide am meisten bevorzugt. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide mit wenigstens 90% Identität zu denselben über ihre gesamte Länge besonders bevorzugt, und von diesen besonders bevorzugten Polynukleotiden sind diejenigen mit wenigstens 95% besonders bevorzugt. Weiterhin sind von denen mit wenigstens 95% diejenigen mit wenigstens 97% stark bevorzugt, und hiervon sind diejenigen mit wenigstens 98% und wenigstens 99% besonders stark bevorzugt, wobei die mit wenigstens 99% die bevorzugteren sind.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, welche im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität beibehalten wie das reife Polypeptid, codiert durch die DNA aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1].
Die Erfindung betrifft weiterhin Polynukleotide, die an die hierin oben beschriebenen Sequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung insbesondere Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen an die hierin oben beschriebenen Polynukleotide hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Ausdrücke "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen", daß eine Hybridisierung nur stattfindet, wenn wenigstens 95% und bevor zugt wenigstens 97% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Ein Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt'sche Lösung, 10% Dextransulfat und 20 Mikrogramm/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA umfaßt, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei etwa 65°C. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind gut bekannt und werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY, (1989), dort insbesondere Kapitel 11, beispielhaft beschrieben.
Die Erfindung liefert auch ein Polynukleotid, welches im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz besteht, die durch Screenen einer geeigneten Bibliothek, die das vollständige Gen für eine Polynukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ausgeführt ist, enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die die Sequenz der in SEQ ID NO: 1 aufgeführten Polynukleotidsequenz oder eines Fragments davon hat, und Isolieren der DNA-Sequenz erhältlich ist. Fragmente, die zum Erhalten eines solchen Polynukleotids geeignet sind, umfassen beispielsweise Sonden und Primer, die hier an anderer Stelle beschrieben sind.
Wie hier zusätzlich im Hinblick auf Polynukleotidtests der Erfindung diskutiert, können beispielsweise Polynukleotide der Erfindung, wie oben diskutiert, als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs voller Länge und genomische Klone, die metS codieren, zu isolieren und um cDNA und genomische Klone anderer Gene, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem metS-Gen besitzen, zu isolieren. Solche Sonden umfassen im allgemeinen wenigstens 15 Basen. Vorzugsweise weisen solche Sonden wenigstens 30 Basen auf und können wenigstens 50 Basen aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden weisen wenigstens 30 Basen auf und weisen 50 Basen oder weniger auf.
Beispielsweise kann die codierende Region des metS-Gens durch Screenen unter Verwendung der in SEQ ID NO: 1 bereitgestellten DNA-Sequenz isoliert werden, um eine Oligonukleotidsonde zu synthetisieren. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die zu der eines Gens der Erfindung komplementär ist, wird dann verwendet, um eine Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu screenen, um zu bestimmen, an welche Mitglieder der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können beispielsweise als Forschungsreagenzien und Materialien zum Ermitteln von Behandlungen und diagnostischen Mitteln für Erkrankung, insbesondere Erkrankung von Menschen, verwendet werden, wie hierin unter Bezugnahme auf Polynukleotidtests weiter diskutiert wird.
Polynukleotide der Erfindung, die von den Sequenzen von SEQ ID NOs: 1 und/oder 2 abgeleitete Oligonukleotide sind, können in den Verfahren wie hierin beschrieben, jedoch bevorzugt für PCR verwendet werden, um zu bestimmen, ob die hier identifizierten Polynukleotide insgesamt oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es ist anerkannt, daß solche Sequenzen auch bei der Diagnose des Stadiums der Infektion und des Typs der Infektion, die das Pathogen erlangt hat, von Nutzen sind.
Die Erfindung liefert auch Polynukleotide, die ein Polypeptid codieren, welches das reife Protein ist, plus zusätzliche amino- oder carboxyterminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids (wenn die reife Form beispielsweise mehr als eine Polypeptidkette aufweist). Solche Sequenzen können unter anderem bei der Verarbeitung eines Proteins von einer Vorläufer- zu einer reifen Form eine Rolle spielen, sie können Proteintransport erlauben, sie können die Halbwertszeit des Proteins verlängern oder verkürzen oder sie können die Manipulation eines Proteins für Tests oder für die Herstellung vereinfachen. Wie es im allgemeinen in vivo der Fall ist, können die zusätzlichen Aminosäuren durch zelluläre Enzyme von dem reifen Protein weg verarbeitet werden.
Ein Vorläuferprotein, welches die reife Form des Polypeptids, fusioniert mit einer oder mehreren Prosequenzen, hat, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktive Vorläufer im allgemeinen aktiviert. Einige der oder alle Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Im allgemeinen werden solche Vorläufer als Proproteine bezeichnet.
Zusammengefaßt kann ein Polynukleotid der Erfindung die folgenden codieren: ein reifes Protein, ein reifes Protein plus eine Leitsequenz (was als ein Präprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leitsequenzen eines Präproteins sind, oder ein Präproprotein, welches ein Vorläufer eines Proproteins ist, mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen, die im allgemeinen während der Verarbeitungsstufen, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen, entfernt werden.
Vektoren, Wirtszellen, Expression
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung gentechnisch verändert wurden, sowie die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung mittels rekombinanter Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs, abgeleitet von den DNA-Konstrukten der Erfindung, herzustellen.
Für die rekombinante Herstellung können Wirtszellen gentechnisch so verändert werden, daß Expressionssystems oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung darin aufgenommen sind. Die Einbringung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann bewerkstelligt werden durch Verfahren, die in vielen standardmäßigen Laborhandbüchern, wie Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben werden, wie z. B. Calciumphosphatasetransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, kationische lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape Loading, ballistische Einbringung und Infektion.
Repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten umfassen Bakterienzellen, wie Streptokokken-, Staphylokokken-, Enterokokken-, E. coli-, Streptomyces- und Bacillus subtilis-Zellen, Pilzzellen, wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen, Insektenzellen, wie Drosophila-S2- und Spodoptera-Sf9-Zellen, Tierzellen, wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3- BHK-, 293- und Bowes-Melanom-Zellen, und Pflanzenzellen.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden, um die Polypeptide der Erfindung herzustellen. Solche Vektoren umfassen unter anderem chromosomale, episomale und von Virus abgeleitete Vektoren, z. B. Vektoren, abgeleitet von Baterienplasmiden, von Bakteriophagen, von Transposons, von Hefeepisomen, von Insertionselementen, von Hefe-chromosomalen Elementen, von Viren, wie Baculoviren, Papovaviren, wie SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren und Retroviren, und Vektoren, abgeleitet von Kombinationen davon, wie z. B. diejenigen, die von genetischen Elementen von Plasmid und Bakteriophagen, wie Cosmiden und Phagemiden, abgeleitet sind. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren und auslösen. Im allgemeinen kann jedes System oder jeder Vektor, das bzw. der geeignet ist, um Polynukleotide zu vermehren oder zu exprimieren und/oder ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren, für die Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die geeignete DNA-Sequenz kann durch irgendeine aus einer Vielzahl gut bekannter und routinemäßiger Techniken, wie beispielsweise durch diejenigen, die in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (oben), aufgeführt werden, in das Expressionssystem eingebracht werden.
Für die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums, ins Periplasma oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid aufgenommen werden. Diese Signale können für das Polypeptid endogen sein, oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der Erfindung können durch gut bekannte Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphozellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie, aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden. Am meisten bevorzugt wird für die Reinigung Hochleistungsflüssigchromatographie verwendet. Gut bekannte Techniken für die Proteinneufaltung können verwendet werden, um eine aktive Konformation wiederherzustellen, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Diagnostische Tests
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung der metS-Polynukleotide der Erfindung zur Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion von metS in einem Eukaryoten, insbe sondere einem Säuger und speziell einem Menschen, liefert ein diagnostisches Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung. Eukaryoten (hier auch "Individuum (Individuen)"), insbesondere Säuger und speziell Menschen, die mit einem Organismus infiziert sind, welcher das metS-Gen umfaßt, können auf Nukleinsäureebene durch eine Vielzahl von Techniken detektiert werden.
Nukleinsäuren für die Diagnose können aus den Zellen und Geweben eines infizierten Individuums, wie Knochen, Blut, Muskeln, Knorpel und Haut, erhalten werden. Genomische DNA kann direkt für die Detektion verwendet werden, oder sie kann unter Verwendung von PCR oder einer anderen Vervielfältigungstechnik vor der Analyse enzymatisch vervielfältigt werden. RNA oder cDNA kann auf die gleiche Weise verwendet werden. Unter Verwendung von Vervielfältigung kann eine Charakterisierung der Spezies und des Stamms eines in einem Individuum vorliegenden Prokaryoten durch eine Analyse des Genotyps des Prokaryotengens vorgenommen werden. Deletionen und Insertionen können anhand einer Veränderung in der Größe des vervielfältigten Produkts im Vergleich zu dem Genotyp einer Vergleichssequenz detektiert werden. Punktmutationen können durch Hybridisieren von vervielfältigter DNA an markierte metS-Polynukleotidsequenzen identifiziert werden. Völlig übereinstimmende Sequenzen können durch RNase-Verdau oder anhand von Unterschieden bei den Schmelztemperaturen von fehlgepaarten Doppelsträngen unterschieden werden. DNA-Sequenzunterschiede können auch anhand von Veränderungen in der elektroforetischen Mobilität der DNA-Fragmente in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel oder durch direkte DNA-Sequenzierung detektiert werden. Siehe z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuklease-Schutz-Tests, wie RNase- und S1-Schutz, oder ein chemisches Spaltungsverfahren erkannt werden. Siehe z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397–4401 (1985).
Zellen, die Mutationen oder Polymorphismen im Gen der Erfindung tragen, können auch auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Techniken detektiert werden, um beispielsweise eine Serotypisierung zu gestatten. Beispielsweise kann RT-PCR verwendet werden, um Mutationen zu detektieren. Es ist besonders bevorzugt, RT-PCR in Kombination mit automatisierten Detektionssystemen, wie beispielsweise GeneScan, zu verwenden. RNA oder cDNA kann auch für denselben Zweck, PCR oder RT-PCR, verwendet werden. Beispielsweise können PCR-Primer, die zu einer metS codierenden Nukleinsäure komplementär sind, verwendet werden, um Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Beispiele repräsentativer Primer sind unten in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Primer für die Vervielfältigung von metS-Polynukleotiden
Die Erfindung liefert weiterhin diese Primer, worin 1, 2, 3 oder 4 Nukleotide vom 5'- und/oder dem 3'-Ende entfernt wurden. Diese Primer können unter anderem dazu verwendet werden, die metS-DNA, die aus einer von einem Individuum abgeleiteten Probe isoliert wurde, zu vervielfältigen. Die Primer können verwendet werden, um das Gen, das aus einem infizierten Individuum isoliert wurde, zu vervielfältigen, so daß das Gen dann verschiedenen Techniken zur Ermittlung der DNA-Sequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der DNA-Sequenz detektiert und dazu verwendet werden, Infektion zu diagnostizieren und das infektiöse Mittel zu serotypisieren und/oder zu klassifizieren.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren von Erkrankung, bevorzugt von bakteriellen Infektionen, bevorzugter Infektionen durch Streptococcus pneumoniae, und am meisten bevorzugt Otitis media, Konjunktivitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, Sinusitis, Pleuraempyem und Endokarditis, und am meisten bevorzugt Meningitis, wie beispielsweise Infektion der Zerebrospinalflüssigkeit, wobei das Verfahren umfaßt, daß man aus einer von einem Individuum abgeleiteten Probe ein erhöhtes Expressionsniveau von Polynukleotid mit der Sequenz aus Tabelle 1 [SEQ ID NO: 1] bestimmt. Eine gesteigerte oder verringerte Expression von metS-Polynukleotid kann unter Verwendung irgendeines der auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren für die Quantifizierung von Polynukleotiden, wie beispielsweise Vervielfältigung, PCR, RT-PCR, RNase-Schutz, Northern-Blotten und andere Hybridisierungsverfahren, gemessen werden.
Zusätzlich kann ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung zum Detektieren einer Überexpression von metS-Protein im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um beispielsweise das Vorliegen einer Infektion zu detektieren. Testtechniken, die verwendet werden können, um die Mengen eines metS-Proteins in einer von einem Wirt abgeleiteten Probe zu bestimmen, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Solche Testverfahren umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA-Tests.
Antikörper
Die Polypeptide der Erfindung oder Varianten davon oder diese exprimierende Zellen können als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die für solche Polypeptide immunspezifisch sind. "Antikörper", wie der Begriff hier verwendet wird, umfaßt monoklonale und polyklonale Antikörper, chimäre, einzelkettige, simianisierte Antikörper und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab-Immunglobulin-Expressionsbibliothek.
Antikörper, die gegen die Polypeptide der Erfindung erzeugt wurden, können durch Verabreichen der Polypeptide oder Epitop-tragenden Fragmente, Analoga oder Zellen an ein Tier, vorzugsweise an ein nicht menschliches Wesen, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann jede auf dem Gebiet bekannte Technik verwendet werden, die Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zellinien kulturen hergestellt wurden. Beispiele umfassen verschiedene Techniken, wie z. B. diejenigen in Kohler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Techniken für die Herstellung von einzelkettigen Antikörpern ( US-Patent Nr. 4,946,778 ) können so ausgestaltet werden, daß einzelkettige Antikörper zu Polypeptiden dieser Erfindung hergestellt werden. Ebenso können transgene Mäuse oder andere Organismen, wie andere Säuger, verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren.
Alternative Phagen-Display-Techniken können verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten gegenüber dem Polypeptid entweder aus Repertoires von PCR-vervielfältigten v-Genen von Lymphozyten von Menschen, die daraufhin gescreent wurden, ob sie Anti-metS besitzen, oder aus nativen Bibliotheken auszuwählen (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552–554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779–783). Die Affinität dieser Antikörper kann auch durch Kettenneukombination verbessert werden (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624–628).
Wenn zwei Antigenbindungsdomänen vorhanden sind, kann jede Domäne gegen ein anderes Epitop gerichtet sein – bezeichnet mit "bispezifische" Antikörper.
Die oben beschriebenen Antikörper können verwendet werden, um Klone zu isolieren oder zu identifizieren, die die Polypeptide exprimieren, um die Polypeptide mittels Affinitätschromatographie zu reinigen.
Somit können unter anderem Antikörper gegen metS-Polypeptid verwendet werden, um Infektionen, insbesondere bakterielle Infektionen und speziell Otitis media, Konjunktivitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, Sinusitis, Pleuraempyem und Endokarditis, und insbesondere Meningitis, wie beispielsweise eine Infektion der Zerebrospinalflüssigkeit, zu behandeln.
Polypeptidvarianten umfassen antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten, die einen bestimmten Aspekt dieser Erfindung bilden. Der Ausdruck "antigenisch äquivalentes Derivat", wie er hier verwendet wird, umfaßt ein Polypeptid oder dessen Äquivalent, welches von bestimmten Antikörpern spezifisch erkannt wird, welche, wenn sie gegen das Protein oder Polypeptid gemäß der Erfindung gerichtet sind, die unmittelbare physikalische Wechselwirkung zwischen Pathogen und Säugerwirt stören. Der Ausdruck "immunologisch äquivalentes Derivat", wie er hier verwendet wird, umfaßt ein Peptid oder dessen Äquivalent, welches, wenn es in einer geeigneten Formulierung zum Erzeugen von Antikörpern in einem Wirbeltier verwendet wird, die Antikörper veranlaßt, daß sie die unmittelbare physikalische Wechselwirkung zwischen Pathogen und Säugerwirt stören.
Das Polypeptid, wie z. B. ein antigenisch oder immunologisch äquivalentes Derivat oder ein Fusionsprotein davon, wird als ein Antigen verwendet, um eine Maus oder ein anderes Tier, wie eine Ratte oder ein Huhn, zu immunisieren. Das Fusionsprotein kann dem Polypeptid Stabilität bereitstellen. Das Antigen kann beispielsweise mittels Konjugation mit einem immunogenen Trägerprotein, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), verbunden werden. Alternativ kann ein mehrfach antigenes Peptid, welches mehrere Kopien des Proteins oder Polypeptids enthält, oder ein antigenisch oder immunologisch äquivalentes Polypeptid davon ausreichend antigen sein, um die Immunogenizität zu verbessern und so die Verwendung eines Trägers zu umgehen.
Vorzugsweise ist der Antikörper oder die Variante davon modifiziert, um ihn bzw. sie in dem Individuum weniger immunogen zu machen. Wenn beispielsweise das Individuum ein Mensch ist, kann der Antikörper am meisten bevorzugt "humanisiert" sein, wobei die die Komplementarität bestimmende(n) Region(en) des von Hybridom abgeleiteten Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurde(n), wie es beispielsweise beschrieben ist in Jones, P. et al. (1986), Nature 321, 522–525, oder Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266–273.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung bei der genetischen Immunisierung verwendet bevorzugt ein geeignetes Zuführverfahren, wie die direkte Injektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. 1992, 1: 363; Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. 1963: 4, 419), die Zuführung von DNA, die mit spezifischen Proteinträgern komplexiert ist (Wu et al., J. Biol. Chem. 1989: 264, 16985), die Copräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS, 1986: 83, 9551), die Einkapselung von DNA in verschiedene Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science 1989: 243, 375), Teilchen-Bombardement (Tang et al., Nature 1992, 356: 152; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. 1993, 12: 791) und die in vivo-Infektion unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS 1984: 81, 5849).
Antagonisten und Agonisten – Tests und Moleküle
Die Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um die Bindung von Kleinmolekülsubstraten und -liganden beispielsweise in Zellen, zellfreien Präparaten, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktgemischen zu bestimmen. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate und Liganden sein oder sie können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein. Siehe z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991).
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um diejenigen zu identifizieren, die die Wirkung von metS-Polypeptiden oder -Polynukleotiden verstärken (Agonisten) oder blockieren (Antagonisten), insbesondere diejenigen Verbindungen, die bakteriostatisch und/oder bakterizid sind. Das Screeningverfahren kann Techniken mit hohem Durchsatz umfassen. Beispielsweise werden, um ein Screening hinsichtlich Agonisten oder Antagonisten durchzuführen, ein synthetisches Reaktionsgemisch, ein zelluläres Kompartiment, wie eine Membran, eine Zellhülle oder eine Zellwand oder ein Präparat von irgendeinem davon, welches metS-Polypeptid und ein markiertes Substrat oder einen Liganden eines solchen Polypeptids umfaßt, in Abwesenheit oder in Gegenwart eines Kandidatenmoleküls, welches ein metS-Agonist oder -Antagonist sein kann, inkubiert. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, das metS-Polypeptid zu agonisieren oder zu antagonisieren, wird in der verringerten Bindung des markierten Liganden oder der verringerten Herstellung eines Produkts aus einem solchen Substrats widergespiegelt. Moleküle, die ohne Folge binden, d. h. ohne die Wirkungen von metS-Polypeptid zu induzieren, sind mit größter Wahrscheinlichkeit gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und die Geschwindigkeit der Produkterzeugung aus Substrat steigern, sind Agonisten. Die Detektion der Geschwindigkeit oder des Niveaus der Produkterzeugung aus Substrat kann unter Verwendung eines Reportersystems gesteigert werden. Reportersysteme, die in dieser Hinsicht von Nutzen sein können, umfassen ohne Beschränkung hierauf kolorimetrisch markiertes Substrat, umgewandelt in Produkt, ein Reportergen, das auf Veränderungen in metS-Polynukleotid- oder -Polypeptidaktivität reagiert, und auf dem Gebiet bekannte Bindungstests.
Ein weiteres Beispiel eines Tests für metS-Antagonisten ist ein kompetitiver Test, der metS und einen potentiellen Antagonisten mit metS-Bindungsmolekülen, rekombinanten metS-Bindungsmolekülen, natürlichen Substraten oder Liganden oder Substrat- oder Ligandenmimetika unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitionstest vereinigt. metS kann markiert sein, beispielsweise durch Radioaktivität oder eine kolorimetrische Verbindung, so daß die Anzahl an metS-Molekülen, die an ein Bindungsmolekül gebunden sind oder in Produkt umgewandelt wurden, präzise bestimmt werden kann, um die Effektivität des potentiellen Antagonisten festzustellen.
Potentielle Antagonisten umfassen kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper, die an ein Polynukleotid oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch dessen Aktivität hemmen oder ausschalten. Potentielle Antagonisten können auch kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie ein eng verwandtes Protein oder ein Antikörper, das bzw. der an dieselben Stellen auf einem Bindungsmolekül, wie z. B. ein Bindungsmolekül, bindet, ohne metS-induzierte Aktivitäten zu induzieren, sein, wodurch die Wirkung von metS verhindert wird, indem eine Bindung von metS verhindert wird.
Potentielle Antagonisten umfassen ein kleines Molekül, welches an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch eine Bindung an zelluläre Bindungsmoleküle verhindert wird, so daß eine normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele kleiner Moleküle umfassen ohne Beschränkung hierauf kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle. Weitere potentielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle (siehe Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), für eine Beschreibung dieser Moleküle). Bevorzugte potentielle Antagonisten umfassen mit metS verwandte Verbindungen und Varianten von metS.
Jede der hier bereitgestellten DNA-Sequenzen kann bei der Ermittlung und Entwicklung von antibakteriellen Verbindungen verwendet werden. Das codierte Protein kann bei Expression als Ziel für das Screening von antibakteriellen Arzneimitteln verwendet werden. Zusätzlich können die DNA-Sequenzen, die die aminoterminalen Regionen des codierten Proteins codieren, oder Shine-Delgarno- oder andere die Translation vereinfachende Sequenzen der jeweiligen mRNA verwendet werden, um Antisense-Sequenzen zu konstruieren, um die Expression der interessierenden codierenden Sequenz zu steuern.
Die Erfindung liefert auch die Verwendung des Polypeptids, des Polynukleotids oder des Inhibitors der Erfindung, um die anfängliche physikalische Wechselwirkung zwischen einem Pathogen und einem Säugerwirt zu stören, die für die Folgekrankheiten einer Infektion verantwortlich ist. Insbesondere können die Moleküle der Erfindung wie folgt verwendet werden: bei der Prävention einer Adhäsion von Bakterien, insbesondere gram-positiven Bakterien, an extrazellulären Säuger-Matrixproteinen auf Verweilvorrichtungen oder an extrazellulären Matrixproteinen in Wunden, um die metS-Protein-vermittelte Säugerzellinvasion zu blockieren, beispielsweise durch Initiieren von Phosphorylierung von Säuger-Tyrosinkinasen (Rosenshine et al., Infect. Immun. 60: 2211 (1992), um die bakterielle Adhäsion zwischen extrazellulären Säuger-Matrixproteinen und bakteriellen metS-Proteinen, die Gewebeschäden hervorrufen, zu blockieren, und um die normale Progression der Pathogenese in Infektionen, die anders als durch die Implantation von Verweilvorrichtungen oder durch andere chirurgische Techniken initiiert wurden, zu blockieren.
Die Antagonisten und Agonisten der Erfindung können beispielsweise verwendet werden, um Otitis media, Konjunktivitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Meningitis, Sinusitis, Pleuraempyem und Endokarditis und insbesondere Meningitis, wie beispielsweise Infektion der Zerebrospinalflüssigkeit, zu hemmen und zu behandeln.
Impfstoffe
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Individuum, insbesondere einem Säuger, welches umfaßt, daß man das Individuum mit metS oder einem Fragment oder einer Variante davon, die bzw. das geeignet ist, um Antikörper und/oder eine T-Zell-Immunantwort zu erzeugen, inokuliert, um das Individuum vor einer Infektion, insbesondere einer bakteriellen Infektion und speziell einer Streptococcus pneumoniae-Infektion, zu schützen. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, wobei eine solche immunologische Antwort die bakterielle Replikation verlangsamt. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Individuum, welches umfaßt, daß man einem solchen Individuum einen Nukleinsäurevektor zuführt, um die Expression von metS oder einem Fragment oder einer Variante davon zu steuern, um metS oder ein Fragment oder eine Variante davon in vivo zu exprimieren, um eine immunologische Antwort zu induzieren, wie beispielsweise um Antikörper und/oder eine T-Zell-Immunantwort, einschließlich beispielsweise Zytokin-erzeugender T-Zellen oder zytotoxischer T-Zellen, zu erzeugen, um das Individuum vor Erkrankung zu schützen, ganz gleich, ob diese Erkrankung bereits in dem Individuum etabliert ist oder nicht. Eine Art der Verabreichung des Gens erfolgt durch beschleunigtes Einbringen des Gens in die gewünschten Zellen als eine Beschich tung auf Partikeln oder auf andere Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, eine modifizierte Nukleinsäure oder ein DNA/RNA-Hybrid umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die, wenn sie in ein Individuum, welches in sich eine immunologische Antwort induzieren kann oder bereits hat, eingebracht wird, eine immunologische Antwort in einem solchen Individuum auf eine metS oder ein daraus codiertes Protein induziert, wobei die Zusammensetzung eine rekombinante metS oder ein daraus codiertes Protein umfaßt, welche(s) DNA umfaßt, die ein Antigen von metS oder des daraus codierten Proteins codiert und exprimiert. Die immunologische Antwort kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität oder zellulärer Immunität haben, wie sie sich beispielsweise aus CTL- oder CD4+-T-Zellen ergibt.
Ein metS-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Co-Protein fusioniert werden, welches selbst womöglich keine Antikörper erzeugt, jedoch das erste Protein stabilisieren und ein fusioniertes Protein erzeugen kann, das immunogene und schützende Eigenschaften besitzt. Das so fusionierte rekombinante Protein umfaßt vorzugsweise weiterhin ein antigenes Co-Protein, wie Lipoprotein D aus Hemophilus influenzae, Glutathion-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase, relativ große Co-Proteine, die das Protein löslich machen und die Herstellung und Reinigung desselben vereinfachen. Darüber hinaus kann das Co-Protein als ein Adjuvans im Sinne einer Bereitstellung einer generalisierten Stimulation des Immunsystems dienen. Das Co-Protein kann entweder an den Amino- oder den Carboxyterminus des ersten Proteins angehängt sein.
Durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren bereitgestellt, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulatorische DNA-Sequenzen umfassen, wie beispielsweise diejenigen, die beschrieben sind in Sato, Y. et al. Science 273: 352 (1996).
Durch diese Erfindung werden ebenfalls Verfahren bereitgestellt, die das beschriebene Polynukleotid oder bestimmte Fragmente davon verwenden, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen von bakteriellen Zelloberflächenproteinen in DNA-Konstrukten codieren, die in solchen genetischen Immunisierungsexperimenten in Tiermodellen einer Infektion mit Streptococcus pneumoniae verwendet werden, und diese sind besonders nützlich zum Identifizieren von Proteinepitopen, die in der Lage sind, eine prophylaktische oder therapeutische Immunantwort hervorzurufen. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung von monoklonalen Antikörpern von besonderem Wert aus dem notwendigen Organ des Tiers erlaubt, die erfolgreich einer Infektion widerstehen oder diese ausräumen, für die Entwicklung von prophylaktischen Mitteln oder therapeutischen Behandlungen von bakterieller Infektion, insbesondere Streptococcus pneumoniae-Infektion, in Säugern, insbesondere Menschen.
Das Polypeptid kann als ein Antigen zum Impfen eines Wirts verwendet werden, um spezifische Antikörper zu erzeugen, die vor einer Invasion von Bakterien schützen, indem sie bei spielsweise die Anhaftung von Bakterien an geschädigtem Gewebe blockieren. Beispiele von Gewebeschäden umfassen Wunden in Haut oder Bindegewebe, die z. B. durch mechanische, chemische oder thermische Schädigung oder durch Implantation von Verweilvorrichtungen verursacht wurden, oder Wunden in den Schleimhautmembranen, wie dem Mund, den Brustdrüsen, der Harnröhre oder der Vagina.
Die Erfindung umfaßt auch eine Impfstofformulierung, die ein immunogenes rekombinantes Protein der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt. Da das Protein im Magen aufgebrochen werden kann, wird es bevorzugt parenteral verabreicht, einschließlich beispielsweise einer subkutanen, intramuskulären, intravenösen oder intradermalen Verabreichung. Formulierungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch mit der Körperflüssigkeit, vorzugsweise dem Blut, des Individuums machen können, und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel enthalten können. Die Formulierungen können in Dosiseinheits- oder Mehrfachdosenbehältern präsentiert werden, wie beispielsweise in versiegelten Ampullen und Phiolen, und sie können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Die Impfstofformulierung kann auch Adjuvanssysteme umfassen, um die Immunogenizität der Formulierung zu steigern, wie beispielsweise Öl-in-Wasser-Systeme und andere auf dem Gebiet bekannte Systeme. Die Dosierung ist von der spezifischen Aktivität des Impfstoffs abhängig und kann durch routinemäßige Experimente leicht bestimmt werden.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte metS-Proteine beschrieben wurde, versteht es sich, daß dies auch Fragmente des natürlich vorkommenden Proteins und ähnliche Proteine mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen abdeckt, die die Methionyl-tRNA-Synthetase-Aktivität des rekombinanten Proteins nicht wesentlich beeinträchtigen.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die das Polynukleotid oder die Polypeptide, wie oben diskutiert, oder deren Agonisten oder Antagonisten umfassen. Die Polypeptide der Erfindung können in Kombination mit einem nicht-sterilen oder sterilen Träger oder Trägern zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen, wie beispielsweise einem pharmazeutischen Träger, der für die Verabreichung an ein Subjekt geeignet ist, verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen beispielsweise ein Mediumadditiv oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff. Solche Träger können ohne Beschränkung hierauf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon umfassen. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus geeignet sein. Die Erfindung betrifft weiterhin diagnostische und pharmazeutische Pakete und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, der bzw. die mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der vorgenannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt ist bzw. sind.
Polypeptide und andere Verbindungen der Erfindung können alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie therapeutischen Verbindungen, verwendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede wirkungsvolle und bequeme Weise verabreicht werden, einschließlich beispielsweise unter anderem einer Verabreichung auf topischem, oralem, analem, vaginalem, intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subkutanem, intranasalem oder intradermalem Weg.
In der Therapie oder als Prophylaxe kann das aktive Mittel als eine injizierbare Zusammensetzung, beispielsweise als eine sterile wäßrige Dispersion, die vorzugsweise isotonisch ist, an ein Individuum verabreicht werden.
Alternativ kann die Zusammensetzung für die topische Anwendung beispielsweise in Form von Salben, Cremes, Lotionen, Augensalben, Augentropfen, Ohrentropfen, Mundspülungen, imprägnierten Verbänden und Nahtmaterial und Aerosolen formuliert werden und kann geeignete konventionelle Zusatzstoffe, einschließlich beispielsweise Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, um die Penetration des Arzneimittels zu unterstützen, und Aufweichungsmitteln in Salben und Cremes, enthalten. Solche topische Formulierungen können auch kompatible konventionelle Träger, beispielsweise Creme- oder Salbenbasen und Ethanol oder Oleylalkohol für Lotionen, enthalten. Solche Träger können etwa 1% bis etwa 98%, bezogen auf das Gewicht der Formulierung, ausmachen; gewöhnlicher machen sie bis zu etwa 80%, bezogen auf das Gewicht der Formulierung, aus.
Für die Verabreichung an Säuger und insbesondere an Menschen wird erwartet, daß die tägliche Dosismenge des aktiven Mittels 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg, typischerweise um 1 mg/kg, beträgt. Auf jeden Fall bestimmt der Arzt die tatsächliche Dosis, die für ein Individuum am besten geeignet ist, und diese variiert mit dem Alter, dem Gewicht und dem Ansprechen des bestimmten Individuums. Die obigen Dosen sind beispielhaft für den Durchschnittsfall. Es kann natürlich Einzelfälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche vorzuziehen sind, und solche liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Verweilvorrichtungen umfassen chirurgische Implantate, prothetische Vorrichtungen und Katheter, d. h. Vorrichtungen, die in den Körper eines Individuums eingebracht werden und für einen längeren Zeitraum in Position bleiben. Solche Vorrichtungen umfassen beispielsweise künstliche Gelenke, Herzklappen, Schrittmacher, Gefäßersätze, Gefäßkatheter, Zerebrospinalflüssigkeitskammern, Urinkatheter, Katheter für die kontinuierliche ambulante Peritonealdialyse (CAPD).
Die Zusammensetzung der Erfindung kann mittels Injektion verabreicht werden, um eine systemische Wirkung gegen relevante Bakterien kurz vor dem Einsetzen einer Verweilvorrichtung zu erzielen. Die Behandlung kann nach dem chirurgischen Eingriff während der Verweilzeit der Vorrichtung im Körper fortgesetzt werden. Zusätzlich könnte die Zusammensetzung auch ver wendet werden, um die perioperative Abdeckung auf jegliche chirurgische Technik zu erweitern, um bakterielle Wundinfektionen, insbesondere Streptococcus pneumoniae-Wundinfektionen, zu verhindern.
Viele orthopädische Chirurgen berücksichtigen, daß bei Menschen mit Gelenkprothesen eine antibiotische Prophylaxe vor einer Zahnbehandlung, die eine Bakteriämie erzeugen könnte, in Betracht gezogen werden sollte. Eine späte tiefe Infektion ist eine schwerwiegende Komplikation, die manchmal zu einem Verlust der Gelenkprothese führt und mit einem signifikantem Maß an Morbidität und Mortalität einhergeht. Es kann daher möglich sein, die Verwendung des aktiven Mittels als einen Ersatz für prophylaktische Antibiotika in dieser Situation auszuweiten.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen Therapie können die Zusammensetzungen dieser Erfindung im allgemeinen als Wundbehandlungsmittel, um eine Adhäsion von Bakterien an Matrixproteinen, die in Wundgewebe freiliegen, zu verhindern, und für die prophylaktische Verwendung bei der Zahnbehandlung als Alternative zu oder zusammen mit einer antibiotischen Prophylaxe verwendet werden.
Alternativ kann die Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden, um eine Verweilvorrichtung unmittelbar vor dem Einsetzen darin zu waschen. Das aktive Mittel liegt vorzugsweise in einer Konzentration von 1 μg/ml bis 10 mg/ml zum Ausspülen von Wunden oder zum Waschen von Verweilvorrichtungen vor.
Eine Impfstoffzusammensetzung liegt geeigneterweise in injizierbarer Form vor. Konventionelle Adjuvanzien können verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken. Eine geeignete Dosierungseinheit zum Impfen beträgt 0,5–5 Mikrogramm/kg an Antigen, und eine solche Dosis wird vorzugsweise 1- bis 3-mal und in einem Intervall von 1–3 Wochen verabreicht. Mit dem angegebenen Dosierungsbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen bei den Verbindungen der Erfindung beobachtet, die deren Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
BEISPIELE
Die untenstehenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind und für diese Routine darstellen, mit Ausnahme der Stellen, an denen es ausführlich anders beschrieben ist. Die Beispiele sind veranschaulichend, beschränken die Erfindung jedoch nicht.
Beispiel 1 Stammselektion, Bibliothekherstellung und Sequenzierung
Das Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz wurde aus einer Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Streptococcus pneumoniae in E. coli erhalten. Die Sequenzierungsdaten von zwei oder mehreren Klonen, die überlappende Streptococcus pneumoniae-DNAs enthielten, wurden verwendet, um die zusammenhängende DNA-Sequenz in SEQ ID NO: 1 zu konstruieren. Bibliotheken können durch Routineverfahren, wie beispielsweise durch die Verfahren 1 und 2 unten, hergestellt werden.
Gesamtzell-DNA wird aus Streptococcus pneumoniae 0100993 gemäß Standardverfahren isoliert und durch eines der beiden Verfahren größenfraktioniert.
Verfahren 1
Gesamtzell-DNA wird durch Hindurchleiten durch eine Nadel, um sie gemäß Standardverfahren Größenfraktionierung zu unterziehen, mechanisch geschert. DNA-Fragmente mit einer Größe von bis zu 11 kbp werden durch Behandlung mit Exonuklease und DNA-Polymerase stumpfendig gemacht, und EcoRI-Linker werden hinzugefügt. Fragmente werden in den Vektor Lambda ZapII ligiert, der mit EcoRI geschnitten wurde, die Bibliothek wird mittels Standardverfahren verpackt, und E. coli wird mit der verpackten Bibliothek infiziert. Die Bibliothek wird mittels Standardverfahren vervielfältigt.
Verfahren 2
Gesamtzell-DNA wird mit einem Restriktionsenzym oder einer Kombination von Restriktionsenzymen, das geeignet ist bzw. die geeignet sind, um eine Reihe von Fragmenten zum Klonieren in Bibliothekenvektoren (z. B. RsaI, PalI, AluI, BshI2351) zu erzeugen, teilweise hydrolysiert, und solche Fragmente werden gemäß Standardverfahren größenfraktioniert. EcoRI-Linker werden an die DNA ligiert, und die Fragmente werden dann in den Vektor Lambda ZapII, der mit EcoRI geschnitten wurde, ligiert, die Bibliothek wird mittels Standardverfahren verpackt, und E. coli wird mit der verpackten Bibliothek infiziert. Die Bibliothek wird mittels Standardverfahren vervielfältigt.
Beispiel 2 metS-Charakterisierung
Die enzymvermittelte Aufnahme von radioaktiv markierter Aminosäure in tRNA kann durch das Aminoacylierungsverfahren, welches die Aminosäuren-tRNA als Trichloressigsäurepräzipitierbare Radioaktivität von radioaktiv markierter Aminosäure in Gegenwart von tRNA und ATP mißt, gemessen werden (Hughes, J., Mellows, G. und Soughton, S. 1980, FEBS Letters, 122: 322–324). Somit können Inhibitoren von Methionyl-tRNA-Synthetase durch eine Reduktion der Trichloressigsäure-präzipitierbaren Radioaktivität im Vergleich zur Kontrolle detektiert werden. Alternativ kann die durch tRNA-Synthetase katalysierte teilweise PPi/ATP-Austauschreaktion, die die Bildung von radioaktiv markiertem ATP aus PPi mißt, verwendet werden, um Methionyl-tRNA-Synthetase-Inhibitoren zu detektieren (Calender, R. & Berg, P., 1966, Biochemistry, 5, 1681–1690). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid, umfassend ein Polynukleotid, welches einen Bereich umfaßt, der über seine Gesamtlänge zu wenigstens 80% identisch ist mit einem Polynukleotid, das das metS-Polypeptid des hinterlegten Stamms Streptococcus pneumoniae 0100993 (NCIMB) codiert, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid codiert, das Methionyl-tRNA-Synthetase-Aktivität aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid RNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargelegt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die Nukleotide 1 bis 1995, die in SEQ ID NO: 1 dargelegt sind.
Polynukleotid nach Anspruch 2, welches ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 umfaßt.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 1.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, bei dem man: aus der Wirtszelle von Anspruch 8 ein Polypeptid exprimiert, das von der DNA codiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines metS-Polypeptids oder -Fragments, bei dem man einen Wirt nach Anspruch 8 unter Bedingungen kultiviert, die geeignet sind für die Produktion des Polypeptids oder Fragments.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 zu wenigstens 70% identisch ist, wobei das Polypeptid eine Methionyl-tRNA-Synthetase-Aktivität aufweist.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2 dargelegt ist.
Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 11.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 11 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Erkrankung, die in Verbindung steht mit der Expression oder der Aktivität des Polypeptids nach Anspruch 11, in einem Individuum, bei dem man: (a) eine Nukleinsäuresequenz erfaßt, die das Polypeptid codiert, und/oder (b) die Gegenwart oder die Menge des Polypeptids in einer von dem Individuum abgeleiteten Probe analysiert.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die mit einer Aktivität des Polypeptids nach Anspruch 11 Wechselwirken und diese hemmen oder aktivieren, bei dem man: eine Zusammensetzung, die das Polypeptid umfaßt, mit der zu untersuchenden Verbindung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine Wechselwirkung zwischen der Verbindung und dem Polypeptid ermöglichen, um die Wechselwirkung einer Verbindung zu bestimmen, wobei diese Wechselwirkung mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die in der Lage ist, ein erfaßbares Signal als Reaktion auf die Wechselwirkung des Polypeptids mit der Verbindung bereitzustellen, und bestimmt, ob die Verbindung mit einer Aktivität des Polypeptids wechselwirkt und diese aktiviert oder hemmt, indem man das Vorliegen oder das Fehlen eines Signals, das durch die Wechselwirkung der Verbindung mit dem Polypeptid erzeugt wird, erfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 11 oder den Antikörper nach Anspruch 13 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 11 oder eines Fragments oder einer Variante davon, welche(s) Methionyl-tRNA-Synthetase-Aktivität aufweist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Säugetier, die geeignet ist, um eine Antikörper- und/oder T-Zell-Immunantwort hervorzubringen, um das Tier gegenüber bakteriellen Infektionen zu schützen.
Verwendung eines Nukleinsäurevektors, um die Expression des metS-Polypeptids nach Anspruch 11 oder eines Fragments oder einer Variante davon hinsichtlich des Exprimierens des metS-Polypeptids oder eines Fragments oder einer Variante davon zu steuern für die Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Säugetier, um eine immunologische Antwort zu induzieren, um eine Antikörper- und/oder T-Zell-Immunantwort hervorzubringen, um das Tier gegenüber bakteriellen Infektionen zu schützen.