JP2002515233A

JP2002515233A - ヒトＥＤＧ３ｓｂ遺伝子

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Publication number: JP2002515233A
Application number: JP2000549637A
Authority: JP
Inventors: ツイ，ピン
Original assignee: スミスクラインビーチャムコーポレーション
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2002-05-28
Also published as: US6130067A; US6344542B1; EP1077996A1; EP1077996A4; WO1999060019A1

Abstract

(57)【要約】 EDG3sbポリペプチドおよびEDG3sbポリヌクレオチドならびにかかるポリペプチドを組換え技法により生産する方法が開示されている。また、EDG3sbポリペプチドおよびEDG3sbポリヌクレオチドの治療における使用方法、ならびにそのための診断アッセイも開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターであ
る化合物を同定する際の使用、並びに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
生産方法に関する。

【０００２】発明の背景薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「機能性遺伝子科学」(functional genomics)、すなわちハイスループット（高
効率）のゲノムまたは遺伝子ベースの生物学に及んでいるからである。このアプ
ローチは「ポジショナルクローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急
速に取って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定
され、続いてその遺伝子地図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められ
るだろう。

【０００３】機能性遺伝子科学は、ハイスループットＤＮＡ配列決定技術および現在入手で
きる多くの分子生物学データベースから興味のもてそうな遺伝子配列を同定する
ための生物情報科学(bioinformatics)の様々なツールに大きく依存している。依
然として、まだ未解明の遺伝子およびその関連ポリペプチド／タンパク質を薬物
探索の標的として同定し特性づける必要性が存在している。

【０００４】多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝
達経路に関与しているタンパク質および／または第二メッセンジャー(例えばcAM
P)により媒介されるということはよく知られている(Lefkowitz,Nature, 1991,35
1：353−354)。本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路
に関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパク質と称される。これらのタンパ
ク質のいくつかの例としては、アドレナリンアゴニストおよびドーパミンの受容
体( Kobilka, B.K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1987,84：46−50；Kobilka
, B.K.ら、Science,1987，238：650−656；Bunzow,J.R.ら、Nature,1988,336：
783−787)、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質(例えばホスホリパ
ーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ)、アクチュエータ
ータンパク質(例えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼC)( Simon,
M.I.ら、Science,1991,252：802−8)の受容体のようなGPC受容体が挙げられる
。

【０００５】例えば、シグナル伝達の一つの形態においては、ホルモンが結合することによ
り細胞内で酵素アデニル酸シクラーゼが活性化される。ホルモンによるこの酵素
の活性化はヌクレオチドGTPの存在に依存する。GTPもまたホルモンの結合に影響
を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけて
いる。Ｇタンパク質はホルモン受容体により活性化されると、結合していたGDP
をGTPと交換することが示された。このGTP担持形態は次に活性化されたアデニル
酸シクラーゼに結合する。GTPからGDPへの加水分解はＧタンパク質自身によって
触媒され、Ｇタンパク質はその不活性な基底状態に戻る。したがって、Ｇタンパ
ク質はシグナルを受容体からエフェクターへ引き継ぐ中間物質として、およびシ
グナルの持続時間を制御する時計として機能し、2つの役割を果たしている。

【０００６】Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは７つの推
定上の膜貫通ドメインを有すると特徴付けられた。これらのドメインは細胞外、
または細胞質ループにより接続された膜貫通α−ヘリックスに相当すると考えら
れる。Ｇタンパク質共役受容体には、ホルモンやウイルス、増殖因子および神経
の受容体といった多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。

【０００７】Ｇタンパク質共役受容体(他には７TM受容体としても知られている)は、少なく
とも８つの異なる親水性ループをつなぐ、約20〜30アミノ酸からなる７つの保存
された疎水性の領域を含むと特徴付けられてきた。Ｇタンパク質共役受容体のフ
ァミリーには、精神病および神経障害の治療に用いる神経弛緩薬と結合するドー
パミン受容体を含む。このファミリーのメンバーの他の例としてはカルシトニン
、アドレナリン、エンドセリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリ
ン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシ
ン、内皮細胞分化遺伝子−1、ロドプシン、におい物質、およびサイトメガロウ
イルス受容体が含まれるが、これらに限らない。

【０００８】大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能性タンパク質の構造を安定化させて
いると考えられるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最
初の２つの細胞外ループの各々において1個有する。７つの膜貫通領域はTM1、TM
2、TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と称される。TM3はシグナル伝達に関与して
いる。

【０００９】システイン残基のリン酸化およびリピド化(パルミトイル化またはファルネシ
ル化)はいくつかのＧタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を及ぼすこと
ができる。大部分のＧタンパク質共役受容体はその3番目の細胞質ループおよび
／またはカルボキシ末端内にリン酸化部位を含むことが多い。β−アドレナリン
受容体のような数種のＧタンパク質共役受容体では、プロテインキナーゼＡおよ
び／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する
。

【００１０】いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位は数個の
Ｇタンパク質共役受容体膜貫通ドメインにより形成される親水性のソケット(soc
ket)を含み、このソケットはＧタンパク質共役受容体の疎水性残基に囲まれてい
ると考えられている。各々のＧタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性
の側は内部に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成していると仮定されてい
る。TM３はTM３アスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位を有するため、一
部のＧタンパク質共役受容体におけるリガンドの結合に関与してきた。TM５のセ
リン、TM６のアスパラギンおよびTM６またはTM７のフェニルアラニンまたはチロ
シンもまたリガンド結合に関与している。

【００１１】Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（ Johnson
ら、Endoc.Rev.,1989,10:317−331参照）。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トは特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的機能をモ
ジュレートする。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部
のＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質の共役を調節するために重要な機構で
あるとして同定された。Ｇタンパク質共役受容体は、哺乳動物宿主の非常に多く
の部位で見つかっている。過去15年に渡り、７回膜貫通（7TM）受容体を標的と
する350種類近くの治療薬が市場に出回り成功してきた。

【００１２】発明の概要本発明は、EDG3sb、特にEDG3sbポリペプチドおよびEDG3sbポリヌクレオチド、
組換え物質、並びにその生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は
、感染（例えば細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染(特にHIV
-1もしくはHIV-2により引き起こされる感染））、疼痛、癌、糖尿病、肥満、食
欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、
骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、卒中、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、片頭
痛、嘔吐、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、うつ病、せ
ん妄、痴呆、重度の精神遅滞を含む）、運動障害(ハンチントン病またはジル・
ド・ラ・トゥーレット症候群を含む）（以後まとめて「前記疾患」という）の治
療をはじめとする、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関す
る。他の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いてアゴニスト
およびアンタゴニスト／インヒビターを同定する方法、並びに同定された化合物
を用いてEDG3sb平衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに他の態
様において、本発明は不適当なEDG3sb活性またはEDG3sbレベルと関連した疾病を
検出するための診断アッセイに関する。

【００１３】発明の説明一つの態様において、本発明はEDG3sbポリペプチドに関する。この種のペプチ
ドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくと
も７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少な
くとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も
好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる
単離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２
のアミノ酸配列を含むものがある。

【００１４】本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたる配
列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なく
とも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好
ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の
同一性を有する単離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとし
ては配列番号２のポリペプチドがある。

【００１５】本発明の更なるペプチドには、配列番号１に含まれる配列を含んでなるポリヌ
クレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。

【００１６】本発明のポリペプチドはEDGファミリーのメンバーであると考えられる。それ
ゆえ、それらには興味がもてる。なぜなら、他のあらゆる遺伝子ファミリー以上
に、Ｇタンパク質共役受容体は医薬介入の標的となるからである。これらの特性
を以後「EDG3sb活性」または「EDG3sbポリペプチド活性」または「EDG3sbの生物
学的活性」という。これらの活性の中には、前記EDG3sbポリペプチドの抗原性お
よび免疫原性活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性
も含まれる。本発明のポリペプチドはEDG3sbの少なくとも１つの生物学的活性を
示すことが好ましい。

【００１７】本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌す
なわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列
、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。

【００１８】また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち同類アミノ酸置換（ある残基が性
質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違してい
るポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間；
塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、
数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が任意
の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好適である。

【００１９】本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。

【００２０】本発明の更なる態様において、本発明は、EDG3sbポリヌクレオチドに関する。
このようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同
一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも
９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでな
る単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の
同一性を有するポリペプチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一
性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリペ
プチドが最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号２
のポリペプチドをコードする配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含んでな
るポリヌクレオチドが挙げられる。

【００２１】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列に対して、その全コード領域にわたって、少なくとも７０％
の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９
０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチ
ド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少
なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくと
も９８〜９９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の
同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。

【００２２】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたる配列番号１
のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは
少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポ
リヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有する
ポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一性を有する
ものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド
が最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号１のポリ
ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号１のポリヌクレオチ
ドが挙げられる。

【００２３】本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオ
チドを提供する。

【００２４】配列番号１のヌクレオチド配列はEDG3(Songzhu Anら、FEBS Letters 417:279-
282, 1997)との相同性を示す。配列番号１のヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列で
あり、配列番号２のポリペプチドである378個のアミノ酸のポリペプチドをコー
ドするポリペプチドコード配列(ヌクレオチド番号1〜1137)を含む。配列番号２
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペ
プチドコード配列と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重）のため、や
はり配列番号２のポリペプチドをコードする、配列番号１に含まれる配列以外の
配列であってもよい。配列番号２のポリペプチドはEDGファミリーの他のタンパ
ク質と構造的に関連しており、EDG3(Songzhu Anら、FEBS Letters 417:279-282,
1997)との相同性および／または構造類似性を有する。

【００２５】本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのEDG3sb活性を有する。

【００２６】本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術により、ヒト胎盤の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーか
ら、ＥＳＴ分析（Adams, M.D.ら, Science (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D.
ら, Nature (1992) 355:632-634; Adams, M.D.ら, Nature (1995) 377 Supp:3-1
74）を用いて得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮ
Ａライブラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の
技法を用いて合成することもできる。

【００２７】本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態として、マーカー配列は、ｐＱ
Ｅベクター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1989) 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、
またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列
、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル
化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよ
い。

【００２８】本発明の更なる実施形態としては、数個、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜
３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または
付加されている、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体を
コードするポリヌクレオチドがある。

【００２９】配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一であるポリ
ヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有する
他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体(ortholog)をコ
ードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃ
ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして、または
核酸増幅（ＰＣＲ）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、
これらのヌクレオチド配列は基準のヌクレオチド配列と７０％、好ましくは８０
％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたは
プライマーはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上
を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブ
は３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００３０】本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体を
含む）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列または
その断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配
列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる方法
により得られる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である
。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミ
ド、５×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウ
ム (pH7.6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し
剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次い
でフィルターを 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄することを含む。かくして、本発明
は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用い
て、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーを
スクリーニングすることにより得られるポリヌクレオチドをも包含する。

【００３１】当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域が
そのｃＤＮＡの5'末端で短く切断されることから、単離されたｃＤＮＡ配列は不
完全であるだろう。それは逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロ
セシビティ」（processivity：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の
能力の尺度）が低く、第一鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを
完成させることができない。

【００３２】全長ｃＤＮＡを得るための、または短鎖ｃＤＮＡを伸長させるための、当業者
に公知で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ末端高速増幅法（Ｒ
ＡＣＥ）に基づいた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002,
1988を参照のこと）。例えばMarathonＴＭ技術(Clontech Laboratories Inc.)
により示されるような、上記技法の最近の改良により、より長いｃＤＮＡの検索
が大いに簡便化された。MarathonＴＭ技術では、所定の組織より抽出されたｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡを作製し、各末端に「アダプター」配列を連結する。続いて、
遺伝子特異的およびアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せ
を用いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡの「欠失」5'末端を増幅する。次
に、「nested」プライマー、すなわち増幅産物の内部にアニールするように設計
されたプライマー（典型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニールするア
ダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニールする遺
伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。その後、この反応の産
物をＤＮＡ塩基配列決定により解析し、この産物を既存のｃＤＮＡに直接結合す
るか、または5'プライマー設計用の新たな配列情報を用いて別の全長ＰＣＲを行
うことにより、全長ｃＤＮＡを構築することができる。

【００３３】本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、該
発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプ
チドの生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの
種のタンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。

【００３４】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチドの
導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986) および Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) などの多くの標準的な
実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適なこうした方
法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイク
ロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(b
allistic introduction)または感染などがある。

【００３５】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動
物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 293
、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。

【００３６】多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０のよ
うなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮
性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに
由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバク
テリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起
こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿
主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現
することができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いら
れる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入する
ことができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または
細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに
組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性
であっても、異種シグナルであってもよい。

【００３７】スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させよう
とする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。
該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。

【００３８】組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を
再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元す
ることが可能である。

【００３９】本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した発現により生
ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を
下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然変異がある個体を、さ
まざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができる。

【００４０】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用
してもよいし、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使ってゲノムＤＮＡを酵素的
に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる
。欠失および挿入突然変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイ
ズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識EDG3sbヌクレオチド
配列とハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマ
ッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別でき
る。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのＤＮＡ
断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ塩基配列決定によって
も検出できる（例えば、Myersら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。
特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮア
ーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Co
ttonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと）。別
の実施形態では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、
EDG3sbヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのア
レイ(array)を構築することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能
性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさ
まざまな問題を解きあかすために用いられている（例えば、M. Cheeら, Science
, Vol.274, pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００４１】診断アッセイは、前記の方法によりEDG3sb遺伝子の変異を検出することで、前
記疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、被験者か
ら得られたサンプルからポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルの異常な低下また
は増加を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低下
または増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例
：ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッティン
グ、その他のハイブリダイゼーション法のいずれかによりＲＮＡレベルで測定す
ることができる。宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドのようなタ
ンパク質のレベルを測定するアッセイ法は当業者によく知られている。こうした
アッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００４２】かくして、もう一つの態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列
）もしくはその断片、 (b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしく
はその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、を含んでなる診断用キットに関する。

【００４３】このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分
であることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさ、特
に、感染（例えば細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染(特にH
IV-1もしくはHIV-2により引き起こされる感染））、疼痛、癌、糖尿病、肥満、
食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉
、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、卒中、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、片
頭痛、嘔吐、精神病および神経系疾患（不安症、精神分裂症、躁鬱病、うつ病、
せん妄、痴呆、重度の精神遅滞を含む）、運動障害(ハンチントン病またはジル
・ド・ラ・トゥーレット症候群を含む)を診断するうえで有用である。

【００４４】また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置をターゲッティングし、その特定位置とハイブ
リダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成するこ
とは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一段階であ
る。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップされたら、その染色体上のその配
列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは
、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Unive
rsity Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見いだせる。そ
の後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解析（物理
的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。

【００４５】罹患個体と非罹患個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることがで
きる。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも
観察されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。

【００４６】本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。

【００４７】本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（
好ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製に
は、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる
。例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C., Nature (
1975) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら,
Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法 (Coleら, Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 19
85) などがある。

【００４８】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。

【００４９】前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。

【００５０】本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。

【００５１】本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの
Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製さ
れた可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトＩｇＧ、特に
ＩｇＧ１のＨ鎖の定常部が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特
定例では、血液凝固因子Ｘａで開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Ｆｃ部
分を簡単に除去できる。さらに、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学
的作製方法、並びに薬物スクリーニング、診断および治療におけるそれらの使用
に関する。また、本発明の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/2945
8 およびWO94/22914に見いだせる。

【００５２】本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。

【００５３】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または
増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量
容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供すること
ができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はまた、この製剤の免疫原性を増強するた
めのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のア
ジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが
、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５４】本発明のポリペプチドは、多くの病的状態、特に前記疾患を含めて、さまざま
な生物学的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激また
は抑制する化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。した
がって、更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または
抑制する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的
には、前記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニスト
が使用される。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラ
リーおよび天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同
定されたアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポ
リペプチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであっ
てよく、また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliga
nら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと
）。

【００５５】スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの不在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べる
ことによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的に
活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は、
候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり
、この混合物中のEDG3sb活性を測定し、そしてこの混合物のEDG3sb活性をスタン
ダードと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチドのア
ンタゴニストを同定するハイスループットスクリーニングアッセイでは、上記の
ようなＦｃ部分とEDG3sbポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使
用することができる(D. Bennettら, J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995) お
よびK. Johansonら, J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (1995)を参照のこと)
。

【００５６】別のスクリーニング技術は、受容体の活性化により引き起こされる細胞外pH変
化または細胞内カルシウム変化を測定する系における、本発明の受容体を発現す
る細胞(例えば、トランスフェクトしたCHO細胞)の使用を含む。この技術では、
化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させ得る。次に、第
２メッセンジャーの応答、例えばシグナル伝達、pH変化、またはカルシウム濃度
変化を測定し、その潜在的な化合物が受容体を活性化するか抑制するかを判定す
る。

【００５７】他の方法は、受容体により媒介されるｃAMPおよび／またはアデニル酸シクラ
ーゼの蓄積の阻害または刺激を測定することにより、受容体インヒビターをスク
リーニングするものである。こうした方法では、本発明の受容体を用いて真核細
胞をトランスフェクトして、その細胞表面に該受容体を発現させることを含む。
その後、cAMPの蓄積量を測定する。潜在的なアンタゴニストが該受容体に結合し
、これにより受容体の結合を阻害する場合は、受容体により媒介されるcAMPまた
はアデニル酸シクラーゼの活性レベルは低下するかまたは増加するだろう。本発
明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するための他の方法
は、米国特許第5,482,835号に記載されているような酵母ベースの技術である。

【００５８】また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に及ぼす添加化
合物の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例え
ば、当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬ
ＩＳＡアッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織
からのポリペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニスト
またはアゴニストともいう）の探索に用いることができる。

【００５９】膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：¹²⁵I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合さ
せ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など
）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分
光学のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペプ
チドまたは（存在するのであれば）その受容体への結合と競合する該ポリペプチ
ドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。か
かるアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている。

【００６０】潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、場
合により該ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があ
るオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、
酵素などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
（それゆえ該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。

【００６１】かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、 (a) 本発明のポリペプチド、 (b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 (c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または (d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、を含んでなり、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである
。このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成
分であることが理解されよう。

【００６２】当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 (a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 (b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの確実と思われる反応部
位または結合部位の三次元構造を想定し、 (c) 想定された反応部位または結合部位と結合または反応すると予想される候
補化合物を合成し、そして (d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター
であるか否かを調べる、ことを含んでなる。これは通常反復プロセスであることがさらに理解されよう。

【００６３】更なる態様において、本発明は、EDG3sbポリペプチド活性の過剰量と不足量の
いずれかに関係した、例えば、感染（例えば細菌感染、真菌感染、原生動物感染
およびウイルス感染(特にHIV-1もしくはHIV-2により引き起こされる感染））、
疼痛、癌、糖尿病、肥満、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不
全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、卒中、潰瘍、アレル
ギー、良性前立腺肥大、片頭痛、嘔吐、精神病および神経系疾患（不安症、精神
分裂症、躁鬱病、うつ病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞を含む）、運動障害(
ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群を含む)などの異常な
状態の治療法を提供する。

【００６４】該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を任意で製剤学上許容される担体と
ともに患者に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内因性の
ポリペプチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力
がまだある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このような競合
物質の典型的な例はEDG3sbポリペプチドの断片である。

【００６５】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性EDG3sbポリペプチドを
コードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で
産生されるか外部から投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（例えば
、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (遺伝
子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド), CRC
Press, Boca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560を
参照のこと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせん(トリプレックス)を
形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる（例えば、Leeら, Nucleic
Acids Res (1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Sc
ience (1991) 251:1360 を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与
することもできるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させることもできる。

【００６６】 EDG3sbおよびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、い
くつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に有効な量
の本発明ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト）を製剤
学上許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含ん
でなる。別法として、患者の関連細胞においてEDG3sbを内因的に産生させるため
に遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作す
る。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケ
ージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有
する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivo 細胞操作およびin v
ivo ポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー細胞を患者に投与する
。遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics, T Strachan and A
P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中のChapter 20, Gene Thera
py and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中
の引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の本発明のポリペプ
チドを適当な製剤学上の担体とともに投与することである。

【００６７】更なる態様において、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば、可
溶性形態の本発明ポリペプチド）、アゴニストもしくはアンタゴニストペプチド
、または小分子化合物を製剤学上許容される担体または賦形剤と共に含有する医
薬組成物を提供する。この種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これら
に限らない。本発明はさらに、上記の本発明組成物の１以上の成分を充填した１
以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチ
ドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、感染（例えば治療用化合
物と一緒に使用してもよい。

【００６８】医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入（注射）、典型的には静注である。
皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の
手段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経
粘膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を
腸溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である
。これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ
／または局在化させてもよい。

【００６９】必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与
量は患者の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が多様
であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は
広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与よりも高
い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当業界
でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整すること
ができる。

【００７０】治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより
、感染（例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子
工学的に操作する。その後、これらの細胞を患者に導入する。

【００７１】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてＧＣＣのような
公知の検索ツールにより配列データベースを検索することで最大限促進される。
したがって、更なる態様において、本発明は、配列番号１の配列を含んでなるポ
リヌクレオチドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドを保存した
コンピュータ読み取り可能媒体を提供する。

【００７２】以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。

【００７３】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。

【００７４】「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。

【００７５】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」に
は、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖
領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも
、またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合っ
たものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレ
オチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ
、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノ
シンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾を
行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在
するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びに
ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ま
た、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短
いポリヌクレオチドも包含する。

【００７６】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）
の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ
酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸
配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究
文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカル
ボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの
修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる
程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含ん
でいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のあ
る又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリ
ペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって
製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ
チジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチ
ル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミ
ル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング
、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のよ
うなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある（
例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Cre
ighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslational Cova
lent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York,
1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspective
s and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis for protein modificati
ons and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646; および R
attanら, “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging
", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。

【００７７】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および
末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体
は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプ
チドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一とな
るような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以
上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または付加
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくて
もよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように
天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であって
もよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突
然変異誘発法または直接合成により作製することができる。

【００７８】当技術分野で知られた「同一性」とは、場合によりポリペプチド配列またはポ
リヌクレオチド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性の
ことである。当技術分野ではまた、「同一性」は場合によりポリペプチド配列ま
たはポリヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このよう
な配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は公知の方法により難なく
算出することができ、こうした方法として、感染（例えば Computational Molec
ular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Bio
computing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Pre
ss, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,
A.M. and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Ana
lysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequen
ce Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press,
New York, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math.
, 48: 1073 (1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決
定するための方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計さ
れる。さらに、同一性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュータプログラ
ムに編集されている。２配列間の同一性を決定するコンピュータプログラム法と
しては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devereux, J.ら, Nucleic Acids Resear
ch 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschu
l, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)) があるが、これらに限らな
い。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから一般に入手可能
である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; A
ltschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。公知のSmith Waterman
アルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。

【００７９】ポリペプチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
（Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記の
パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default paramet
er) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。

【００８０】ポリヌクレオチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む：１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)；比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらは核酸比
較のためのデフォルトパラメーターである。

【００８１】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの「同一性」についての好適な意味は、
場合により下記(１)および（２）において提供される。

【００８２】（１）ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の基準配列に対して少なくと
も50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレオ
チド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。前記ポリヌク
レオチド配列は配列番号１の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、
ある整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも
１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを
含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配
列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在しても
よく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連
続するグループとして介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番
号１のヌクレオチドの総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を規定す
る整数を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことによ
り、すなわち、次式：ｎ_n ＜ｘ_n -（ｘ_n・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_nはヌクレオチド変異の数であり、ｘ_nは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは50％については0.50、60％について
は0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％
については0.90、95％については0.95、97％については0.97または100％につい
ては1.00であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ_nとｙの非整数の積は、
その積をｘ_nから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセ
ンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、それにより、こう
した変異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変させる
ことができる。

【００８３】例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号２の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が1
00％未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むこ
とができる。前記変異は少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トランジションお
よびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした
変異は基準ポリヌクレオチド配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末
端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の核酸の間に個々に、または基
準配列内に１以上の連続するグループとして介在することができる。核酸変異の
数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値
を規定する整数を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くこと
により、すなわち、次式：ｎ_n ＜ｘ_n -（ｘ_n・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_nはアミノ酸変異の数であり、ｘ_nは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ _n とｙの非整数の積は、その積をｘ_nから引く前に、最も近似する整数に切り下げ
る。

【００８４】（２）ポリペプチドの具体例は、配列番号２の基準配列に対して少なくとも50
、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリペプチドを含
んでなる単離されたポリペプチドをさらに含む。前記ポリペプチド配列は配列番
号２の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミ
ノ酸変異を含んでいてもよい。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠
失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群か
ら選択され、これらの変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ
末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の
アミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続したグループとして点
在することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそ
れぞれの（100で割った）同一性％値を規定する整数を掛け、その積を配列番号
２中のアミノ酸の総数から引くことにより、すなわち次式により求められる。

【００８５】ｎ_a ＜ｘ_a -（ｘ_a・ｙ）式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは50％については0.50、60％については0.60、70％については0.70、80％
については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.
95、97％については0.97または100％については1.00であり、・は乗法演算子を
表す記号であり、ｘ_aとｙの非整数の積は、その積をｘ_aから引く前に、最も近似
する整数に切り下げる。

【００８６】例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の基準配列と同一である
、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が100％
未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むことが
できる。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的およ
び非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、これらの
変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれ
らの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に
、または基準配列内に１以上の連続したグループとして点在することができる。
アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそれぞれの（100で割っ
た）同一性％値を規定する整数を掛け、その積を配列番号２中のアミノ酸の総数
から引くことにより、すなわち次式により求められる。

【００８７】ｎ_a ＜ｘ_a -（ｘ_a・ｙ）式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85
等であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ_aとｙの非整数の積は、その積
をｘ_aから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００８８】「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ
領域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が向上す
る（例えば、EP-A- 0232 262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとっては
、その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でＦｃ部分を除去するこ
とが望ましいだろう。

【００８９】本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。

【００９０】実施例実施例１：哺乳動物細胞における発現本発明の受容体を、ヒト胚腎293（HEK293）細胞または付着性dhfr CHO細胞の
いずれかにおいて発現させた。受容体の発現を最大にするために、ｐCDNまたは
ｐCDNA3ベクターへ挿入する前に、一般的には全ての５'および３'非翻訳領域（U
TRs）を受容体cDNAから取り除いた。これらの細胞をリポフェクションによって
個々の受容体cDNAによりトランスフェクトし、400 mg／mlのＧ418の存在下で選
択した。3週間の選択後に、個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖
させた。ベクターのみでトランスフェクトしたHEK293またはCHO細胞を陰性対照
として使用した。個々の受容体を安定して発現している細胞系を単離するために
、一般的に約24個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析により分析した。
受容体mRNAは、通常、分析したＧ418耐性クローンの約50％において検出可能で
あった。

【００９１】実施例２：結合アッセイおよび機能アッセイ用のリガンドバンク(bank) 200を越える推定上の受容体リガンドのバンクがスクリーニングのために集成
された。このバンクには以下のものが含まれる。すなわち、ヒトの７回膜貫通(7
TM)受容体を介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモ
カイン；ヒト7TM受容体の推定上のアゴニストでありうる、天然に存在する化合
物；非哺乳動物の生理活性ペプチド(哺乳動物の対応物は未だ同定されていない)
；および天然には見出せないが未知の天然リガンドと共に７TM受容体を活性化す
る化合物である。このバンクは結合アッセイと機能(すなわち、カルシウム、cAM
P、ミクロフィジオメーター( microphysiometer )、卵母細胞電気生理学など、
以下を参照)アッセイの両方を用いて、既知のリガンドに対する該受容体を最初
にスクリーニングするために使用された。

【００９２】実施例３：リガンド結合アッセイリガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるための直接的な方法を提供
し、また高処理量方式にも適用が可能である。受容体の精製リガンドを結合実験
のために高い比活性( 50−2000 Ci／mmol )で放射性標識した。次に、放射性標
識化のプロセスがその受容体に対するリガンドの活性を低下させないことを確か
めた。緩衝液、イオン、pHおよびヌクレオチドのような他のモジュレーターにつ
いてのアッセイ条件を最適化し、膜および全細胞の両受容体源についての実施可
能な生じうるシグナル対ノイズ比を確立した。これらのアッセイのために、特異
的受容体結合を、全結合放射能から、過剰の未標識競合リガンドの存在下で測定
した放射能を差し引いた値として定義した。可能であれば、２以上の競合リガン
ドを用いて残留する非特異的な結合を確定する。

【００９３】実施例４：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ本発明の受容体cDNAをコードする線状化プラスミドの鋳型からのキャップした
RNA転写物を、標準的な手法に従い、in vitroでRNAポリメラーゼを使用して合成
した。in vitroでの転写物を最終濃度0.2 mg／mlで水中に懸濁した。卵巣葉(ova
rian lobes)を成熟雌カエルから取り出し、ステージVの脱濾胞化卵母細胞を得て
、RNA転写物(10ng／卵母細胞)を微量注入装置を用いて50nlで単回注入した。２
つの電極電位クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応答した個々のアフリカ
ツメガエルの卵母細胞からの電流を測定した。室温でCa²⁺を含まないバース(Bar
th's)培地中で記録を行なった。このアフリカツメガエル系を使用して、活性化
用リガンドについての既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリーニング
することができる。

【００９４】実施例５：ミクロフィジオメトリックアッセイ多様な第二メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が放出される
。この酸は主として細胞内のシグナル伝達プロセスを活気づけるために必要な代
謝活性が増強した結果として産出される。この細胞を取り巻く培地におけるｐＨ
の変化は非常に小さいが、サイトセンサー( CYTOSENSOR )ミクロフィジオメータ
ー（ Mole cular Devices Ltd., Menlo Park,CA ）により検出できる。したがっ
て、このサイトセンサーは本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内シ
グナル伝達経路を利用するエネルギーに共役する受容体の活性化を検出すること
ができる。

【００９５】実施例６：抽出物／細胞上清スクリーニング多くの哺乳動物受容体が存在するが、今のところ同一動物種(cognate)の活性
化用リガンド(アゴニスト)は見つかっていない。したがって、これらの受容体を
活性化するリガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクには含まれていな
い可能性がある。よって、本発明の７TM受容体もまた、天然のリガンドを同定す
るために組織抽出物に対して機能的に(カルシウム、cAMP、ミクロフィジオメー
ター、卵母細胞電気生理学などの機能スクリーンを使用して)スクリーニングさ
れた。陽性の機能的な応答を示す抽出物を、活性化用リガンドが単離され同定さ
れるまで順次サブ分画することができる。

【００９６】実施例７：カルシウムおよびcAMP機能アッセイ HEK293細胞で発現された7TM受容体は、ＰＬＣおよびカルシウムの動員活性化
および／またはcAMPの刺激または阻害と機能的に共役することが示された。受容
体トランスフェクト細胞またはベクター対照細胞におけるHEK293細胞中の基礎カ
ルシウムレベルは、正常な100nM〜200nMの範囲で観察された。組換え受容体を発
現しているHEK293細胞を、fura２を添加し、一日で＞150個の選択したリガンド
または組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員について評価した。同
様に、組換え受容体を発現しているHEK293細胞を標準的なcAMP定量アッセイを用
いて、cAMP産生の刺激または阻害について評価した。一時的にカルシウムを動員
する、またはcAMPの変動を示すアゴニストをベクター対照細胞で試験し、このと
きの応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特有なものであるかど
うかを決定した。

【００９７】配列表フリーテキスト配列情報配列番号１配列番号２

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/20 ４Ｃ０５７ 1/20 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 ＡＦターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 FB08 4B024 AA01 AA11 BA43 BA63 CA01 CA07 GA11 HA01 HA12 4B063 QA08 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR56 QS33 QS34 QX02 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C057 DD01 KK30 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプ
チド。
【請求項２】配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含んでなる単離されたポリヌクレオチド、またはその単離されたポリヌクレオチ
ドに相補的なヌクレオチド配列。
【請求項３】請求項１に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項４】被験者を治療する方法であって、 (i) 該被験者が請求項１に記載のポリペプチドの活性または発現の増加を必要とする場合には、 (a) 前記ポリペプチドに対する治療上有効な量のアゴニストを被験者に投与すること、および／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを、in vivo で該ポリペプチド活性を産生させるような形態で被験者に提供すること、を含んでなり、 (ii)該被験者が請求項１に記載のポリペプチドの活性または発現の抑制を必要とする場合には、 (a) 前記ポリペプチドに対する治療上有効な量のアンタゴニストを被験者に投与すること、および／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核酸分子を被験者に投与すること、および／または (c) 前記ポリペプチドと、そのリガンド、基質、もしくは受容体について競合する治療上有効な量のポリペプチドを被験者に投与すること、を含んでなる、上記被験者を治療する方法。
【請求項５】被験者における請求項１に記載のポリペプチドの発現または
活性に関連した該被験者の疾病または該疾病への罹りやすさを診断する方法であ
って、 (a) 該被験者のゲノム内の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異が存在するか否かを調べること、および／または (b) 該被験者から得られたサンプル中の該ポリペプチド発現の存在または量を分析すること、を含んでなる方法。
【請求項６】請求項１に記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制する
化合物を同定するためのスクリーニング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質と、の結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質と、の結合を、標識競合物質の存在下で測定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べること、 (d) 候補化合物と、該ポリペプチドを含有する溶液と、を一緒にして混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定して、該混合物の活性をスタンダードと比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの産生に及ぼす効果を例えばELISAアッセイを用いて検出すること、よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法。
【請求項７】請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴ
ニスト。
【請求項８】下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在するとき請求項１に
記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含有する発現系。
【請求項９】宿主細胞が適当な培養条件下で配列番号２のアミノ酸配列を
含んでなるポリペプチドを産生するように、請求項８に記載の発現系を用いて細
胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含んでなる、組換え宿主細
胞の作製方法。
【請求項１０】請求項９に記載の方法により作製される組換え宿主細胞。
【請求項１１】配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発
現している請求項１０に記載の組換え宿主細胞の膜。
【請求項１２】請求項１０に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドを産生さ
せるのに十分な条件下で培養し、その培養培地から該ポリペプチドを回収するこ
とを含んでなる、前記ポリペプチドの生産方法。
【請求項１３】配列番号１のポリヌクレオチドを含んでなる単離されたポ
リヌクレオチド、またはその単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチ
ド配列。