【発明の詳細な説明】
HM74A受容体
発明の分野
本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターであ
る化合物を同定する際の使用、並びに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
生産方法に関する。
発明の背景
薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「機能性遺伝子科学」(functional genomics)、すなわちハイスループット（高
効率）のゲノムまたは遺伝子ベースの生物学に及んでいるからである。このアプ
ローチは「ポジショナルクローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急
速に取って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定
され、続いてその遺伝子地図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められ
るだろう。
機能性遺伝子科学は、現在入手できる多くの分子生物学データベースから興昧
のもてそうな遺伝子配列を同定するための生物情報科学(bioinformatics)の様々
なツールに大きく依存している。依然として、まだ未解明の遺伝子およびその関
連ポリペプチド／タンパク質を薬物探索の標的として同定し特性づける必要性が
存在している。
多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝
達経路に関与しているタンパク質および／または第二メッセンジャー（例えばｃ
ＡＭＰ）により媒介されるということはよく知られている(Lefkowitz,Nature,19
91,351：353−354)。本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含
む経路に関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパク質と称される。これら
のタンパク質のいくつかの例としては、アドレナリン作動薬およびドーパミンの
受容体(Kobilka,B.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84：46−50；Kobilka,B
.K.ら、Science,1987,238：650−656；Bunzow,J.R.ら、Nature,1988,336：783−
787)、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質(例えばホスホリパーゼ
Ｃ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ)、アクチュエータータ
ンパク質(例えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼC)(Simon,M.I.
ら、Science,1991,252：802−8)の受容体のようなGPC受容体が挙げられる。
例えば、シグナル伝達の一つの形態においては、ホルモンが結合することによ
り細胞内で酵素アデニル酸シクラーゼが活性化される。ホルモンによるこの酵素
の活性化はヌクレオチドGTPの存在に依存する。GTPもまたホルモンの結合に影響
を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけて
いる。Ｇタンパク質はホルモン受容体により活性化されると、結合していたＧＤ
ＰをＧＴＰと交換することが示された。このＧＴＰ担持形態は次に活性化された
アデニル酸シクラーゼに結合する。GTPからGDPへの加水分解はＧタンパク質自身
によって触媒され、Ｇタンパク質はその不活性な基底状態に戻る。したがって、
Ｇタンパク質はシグナルを受容体からエフェクターへ引き継ぐ中間物質として、
およびシグナルの持続時間を制御する時計として機能し、２つの役割を果たして
いる。
Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは７つの推
定上の膜貫通ドメインを有すると特徴付けられた。これらのドメインは細胞外、
または細胞質ループにより接続された膜貫通α−ヘリックスに相当すると考えら
れる。Ｇタンパク質共役受容体には、ホルモンやウイルス、増殖因子および神経
の受容体といった多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。
Ｇタンパク質共役受容体(他には７ＴＭ受容体としても知られている)は、少な
くとも８つの異なる親水性ループをつなぐ、約20〜30アミノ酸からなる７つの保
存された疎水性の領域を含むと特徴付けられてきた。Ｇタンパク質共役受容体の
ファミリーには、精神病および神経障害の治療に用いる神経弛緩薬と結合するド
ーパミン受容体を含む。このファミリーのメンバーの他の例としてはカルシトニ
ン、アドレナリン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチ
ルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、
オプシン、内皮細胞分化遺伝子−１、ロドプシン、におい物質、およびサイトメ
ガロウイルス受容体が含まれるが、これらに限らない。
大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能性タンパク質の構造を安定化させて
いると考えられるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最
初の２つの細胞外ループの各々において１個有する。７つの膜貫通領域はＴＭ1
、ＴＭ2、ＴＭ3、ＴM4、ＴＭ5、ＴＭ6、およびＴＭ7と称される。ＴＭ3はシグナ
ル伝達に関与している。
システイン残基のリン酸化およびリピド化(パルミトイル化またはファルネシ
ル化)はいくつかのＧタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を及ぼすこと
ができる。大部分のＧタンパク質共役受容体はその３番目の細胞質ループおよび
／またはカルボキシ末端内にリン酸化部位を含むことが多い。β−アドレナリン
受容体のような数種のＧタンパク質共役受容体では、プロテインキナーゼＡおよ
び／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する
。
いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位は数個の
Ｇタンパク質共役受容体膜貫通ドメインにより形成される親水性のソケット(soc
ket)を含み、このソケットはＧタンパク質共役受容体の疎水性残基に囲まれてい
ると考えられている。各々のＧタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性
の側は内部に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成していると仮定されてい
る。ＴＭ３はＴＭ３アスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位を有するため
、一部のＧタンパク質共役受容体におけるリガンドの結合に関与してきた。ＴＭ
５のセリン、ＴＭ６のアスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニ
ンまたはチロシンもまたリガンド結合に関与している。
Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る（Johnson
ら、Endoc.Rev.,1989,10:317−331参照）。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トは特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学的機能をモ
ジュレートする。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部
のＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質の共役を調節するために重要な機構で
あるとして同定された。Ｇタンパク質共役受容体は、哺乳動物宿主の非常に多く
の部位で見つかっている。過去15年に渡り、７回膜貫通（7ＴＭ）受容体を標的
とする350種類近くの治療薬が市場に出回り成功してきた。
発明の概要
本発明は、HM74A、特にHM74AポリペプチドおよびHM74Aポリヌクレオチド、組
換え物質、並びにその生産方法に関する。もう一つの態様において、本発明は、
細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にHIV−１またはHIV
−２により引き起こされる感染といった感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲
不振；過食；喘息；パーキンソン病：急性心不全；低血圧：高血圧；閉尿；骨粗
しょう症；狭心症；心筋梗塞；卒中；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺肥大；偏
頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、抑うつ、譫妄、痴呆および重症の精神
遅滞を含む精神及び神経障害：およびハンチントン症またはジル・ド・ラ・トゥー
レット症候群のような運動障害（以後まとめて「前記疾患」という）の治療をは
じめとする、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。他
の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いてアゴニストおよび
アンタゴニスト／インヒビターを同定する方法、並びに同定された化合物を用い
てHM74A平衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに他の態様にお
いて、本発明は不適当なHM74A活性またはHM74Aレベルと関連した疾病を検出する
ための診断アッセイに関する。
発明の説明
一つの態様において、本発明はHM74Aポリペプチドに関する。この種のペプチ
ドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくと
も７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少な
くとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ま
しくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離
されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドには配列番号２のアミノ
酸配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。
本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたる配
列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なく
とも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好まし
くは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一
性を有する単離されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがある。
本発明の更なるぺプチドには、配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含ん
でなるポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる
。
本発明のポリペプチドはケモカインファミリーのメンバーであると考えられる
。それゆえ、それらには興昧がもてる。なぜなら、本発明は多くの生物学的発現
および疾病の発現に関与している遺伝子のプリン性７ＴＭ受容体ファミリーにさ
らなるメンバーを加えるものだからである。さらに、Ｇタンパク質共役受容体は
、他のいかなる遺伝子ファミリーにまさって、医薬介入の標的となるものである
。これらの特性を以後「HM74A活性」または「HM74Aポリペプチド活性」または「
HM74Aの生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記HM74Aポリペプチド
の抗原活性および免疫活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原活性および免
疫活性も含まれる。本発明のポリペプチドはHM74Aの少なくとも１つの生物学的
活性を示すことが好ましい。
本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌す
なわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列
、または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。
また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala，Val，Le
uおよびIleの間；SerとThrの間；酸性残基AspとGluの間；AsnとGlnの間；塩基性
残基LysとArgの間；または芳香族残基PheとTyrの間で起こる。特に、数個、５〜
１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が
任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好適である。
本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。
本発明の更なる態様において、本発明は、HM74Aポリヌクレオチドに関する。
このようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたる配列番号２のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同
一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも
９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでな
る単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の
同一性を有するポリペプチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一
性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリペ
プチドが最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号２
のポリペプチドをコードする配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含んでな
るポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列に対して、その全コード領域にわたって、少なくとも７０％
の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９
０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチ
ド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少
なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくと
も９８〜９９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも９９％の
同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。
本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたる配列番号１
のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは
少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポ
リヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有する
ポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも９８〜９９％の同一性を有する
ものがより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド
が最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号１のポリ
ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号１のポリヌクレオチ
ドが挙げられる。
本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオ
チドを提供する。
配列番号１のヌクレオチド配列はHM74(Nomura,H.,Nlelsen,B.W.およびMatsush
ima,K.J.Int.Immunol.5,1239-1249(1993))との相同性を示す。配列番号１のヌク
レオチド配列はｃＤＮＡ配列であり、配列番号２のポリペプチドである363個の
アミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリペプチドコード配列(ヌクレオ
チド番号61〜1149)を含む。配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドコード配列と同一であっても、遺
伝子コードの重複性（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコード
する、配列番号１に含まれる配列以外の配列であってもよい。配列番号２のポリ
ペプチドはケモカインファミリーの他のタンパク質と構造的に関連しており、HM
74(Nomura,H.,Nielsen,B.W.およびMatsushima,K.J.Int.Immunol.5,1239-1249(19
93))との相同性および／または構造類似性を有する。
本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのHM74A活性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術により、ヒト胎盤ＤＮＡの細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラ
リーから、発現配列タグ(ＥＳＴ)分析（Adams,M.D.ら，Science（1991）252:165
1-1656;Adams,M.D.ら，Nature(1992)355:632-634;Adams,M.D.ら,Nature（1995）
377 Supp:3-174）を用いて得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチド
はゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、商業
的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐＱＥベクタ
ー(Qiagen，Inc.)により提供されかつGentzら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1
989）86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨ
Ａタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例えば
、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナ
ル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
本発明の更なる具体例としては、数個、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３
個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付
加されている、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドがある。
配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一であるポリ
ヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有する
他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体(ortholog)をコ
ードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃ
ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして、または
核酸増幅（ＰＣＲ）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、
これらのヌクレオチド配列は基準のヌクレオチド配列と７０％、好ましくは８０
％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたは
プライマーはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上
を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブ
は３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。
本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体を
含む）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列またはその断片を有
する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を含む全長
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる方法により得られ
る。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。好ましいス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、５×SSC（
150mM NaCl,15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×
Denhardt溶液、10%デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサケ精子
ＤＮＡを含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを0.
1×SSC中約６５℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番号１の配
列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることにより得
られるポリヌクレオチドをも包含する。
当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域が
そのｃＤＮＡの5'末端で短く切断されることから、単離されたｃＤＮＡ配列は不
完全であるだろう。それは逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロ
セシビティ」（processivity：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の
能力の尺度）が低く、第一鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを
完成させることができない。
全長ｃＤＮＡを得るための、または短鎖ｃＤＮＡを伸長させるための、当業者
に公知で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ末端高速増幅法（Ｒ
ＡＣＥ）に基づいた方法がある（例えば、Frohmanら，PNAS USA 85，8998-9002
，1988を参照のこと）。例えばMarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)に
より示されるような、上記技法の最近の改良により、より長いｃＤＮＡの検索が
大いに簡便化された。MarathonTM技術では、所定の組織より抽出されたｍＲＮＡ
からｃＤＮＡを作製し、各末端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝
子特異的およびアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用
いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡの「欠失」5'末端を増幅する。次に、
「nested」プライマー、すなわち増幅産物の内部にアニールするように設計され
たプライマー（典型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニールするアダプ
ター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニールする遺伝子
特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。その後、この反応の産物を
ＤＮＡ塩基配列決定により解析し、この産物を既存のｃＤＮＡに直接結合して完
全な配列とするか、または5'プライマー設計用の新たな配列情報を用いて別の全
長ＰＣＲを行うことにより、全長ｃＤＮＡを構築することができる。
本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、該
発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプ
チドの生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの
種のタンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。
組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチドの
導入は、Davisら，Basic Methods in Molecular Biology（1986）およびSambroo
kら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)などの多くの標準的な実
験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適なこうした方法
として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジエクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレ
ーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(bal
listic introduction)または感染などがある。
適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大胴菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動
物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 293
、Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、例えば、
染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バ
クテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由
来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０の
ようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバ
クテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を
起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。一般的に、
宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発
現することができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら，Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual（前掲）に記載されるような、日常的に用い
られる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入す
ることができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また
は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチド
に組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因
性であっても、異種シグナルであってもよい。
スクリーニングアッセイで使用するため本発明のポリペプチドを発現させよう
とする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。
該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に用いられ
る。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは
、タンパク質を再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメー
ションを復元することが可能である。
本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した発現により生
ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を
下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然変異がある個体を、さ
まざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができる。
診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用
してもよいし、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使ってゲノムＤＮＡを酵素的
に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる
。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化
により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識HM74Aヌクレオチド配列とハ
イブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二
重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また
、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのＤＮＡ断片の電
気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ塩基配列決定によっても検出で
きる（例えば、Myersら，Science（1985）230:1242を参照のこと）。特定位置で
の配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよび
Ｓ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら，Pr
oc．Natl．Acad．Sci．USA（1985）85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様
では、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行うため、HM74Aヌク
レオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイ(array
)を構築することができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、
遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問
題を解きあかすために用いられている（例えば、M．Cheeら，Science，Vol.274
，pp.610-613（1996）を参照のこと）。
診断アッセイは、前記の方法によりHM74A遺伝子の変異を検出することで、前
記疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、被験者か
ら得られたサンプルからポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルの異常な低下また
は増加を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低下
または増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例
：ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッティン
グ、その他のハイブリダイゼーション法のいずれかによりＲＮＡレベルで測定す
ることができる。宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドのようなタ
ンパク質のレベルを測定するために使用できるアッセイ法は当業者によく知られ
ている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ
、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリー分
析などがある。
かくして、もう一つの態様において、本発明は、
(a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配
列）もしくはその断片、
(b) (a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
(c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もし
くはその断片、または
(d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対
する抗体、
を含んでなる診断用キットに関する。
このようなキットにおいて、（a）、（b）、（c）または（d）が実質的な構成
成分であることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさ
、特に細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、特にHIV−１ま
たはHIV−２により引き起こされる感染といった感染症；疼痛：癌：糖尿病、肥
満：食欲不振：過食；喘息；パーキンソン病：急性心不全；低血圧：高血圧；閉
尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；卒中；潰瘍；アレルギー；良性の前立腺
肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、抑うつ、譫妄、痴呆および重
症の精神遅滞を含む精神及び神経障害；およびハンチントン症またはジル・ド・
ラ・トゥーレット症候群のような運動障害またはこれらへの罹りやすさ等を診断
するうえで有用である。
また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的にターゲッティングし、その特定位置
とハイブリダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作
成することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一
段階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップされたら、その染色体上
のその配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種の
データは、例えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopki
ns University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能）中に見いだ
せる。その後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解
析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。
罹患個体と非罹患個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることがで
きる。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも
観察されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。
本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（
好ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製に
は、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる
。例を挙げると、ハイブリドーマ法(Kohler，G.およびMilstein，C.，Nature（1
975）256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozborら，I
mmunology Today（1983）4:72）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら，Mon
oclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R．Liss，Inc.，198
5）などがある。
本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。
前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。
本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの
Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製さ
れた可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトＩｇＧ、特に
ＩｇＧ１のＨ鎖の定常部が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特
定例では、血液凝固因子Ｘａで開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Ｆｃ部
分を簡単に除去できる。さらに、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学
的作製方法、並びに薬物スクリーニング、診断および治療におけるそれらの使用
に関する。また、本発明の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質技術の例は国際特許出願WO94/29458
およびWO94/22914に見いだせる。
本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivoで本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。
本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または
増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量
容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供すること
ができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのア
ジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュバ
ント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが、ルー
チンな実験操作により簡単に決定できる。
本発明のポリペプチドは、多くの病的状態、特に前記疾患を含めて、さまざま
な生物学的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激また
は抑制する化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。した
がって、更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または
抑制する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的
には、前記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニスト
が使用される。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラ
リーおよび天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同
定されたアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポ
リペプチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであっ
てよく、また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliga
nら，Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)を参照のこと）
。
スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの不在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べる
ことによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的に
活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は、
候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり
、この混合物中のHM74A活性を測定し、そしてこの混合物のHM74A活性をスタンダ
ードと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチドのアン
タゴニストを同定するハイスループットスクリーニングアッセイでは、上記のよ
うなＦｃ部分とHM74Aポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用
することができる(D．Bennettら，J．Mol．Recognition，8:52-58（1995）およ
びK．Johansonら，J．Biol．Chem.，270(16):9459-9471(1995)を参照のこと)。
あるスクリーニング技術では、受容体の活性化により生じる細胞外のｐＨ変化
や細胞内カルシウムの変化を測定する系で、本発明の受容体を発現する細胞(例
えば、トランスフェクトされたCHO細胞)を使用することを含む。この技法では、
化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞に接触させることができる
。次に、第二メッセンジャーの応答(例えば、シグナル伝達、ｐＨ変化、または
カルシウムレベルの変化)を測定し、候補化合物が受容体を活性化するかまたは
阻害するかどうかを決定する。
他の方法は、受容体により媒介されるｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シク
ラーゼの蓄積の阻害または刺激を測定することにより受容体インヒビターをスク
リーニングするものである。こうした方法では、本発明の受容体を用いて真核細
胞をトランスフェクトして、その細胞表面に受容体を発現させることを含む。次
いでこの細胞を本発明の受容体の存在下で候補アンタゴニストにさらし、ｃＡＭ
Ｐの蓄積量を測定する。候補アンタゴニストが該受容体に結合し、これにより受
容体の結合を阻害する場合は、受容体により媒介されるｃＡＭＰまたはアデニル
酸シクラーゼの活性レベルは低下するかまたは増加するだろう。
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するための別
の方法として、米国特許第5,482,835号に記載の酵母ベースの技術がある。
また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの産生に及ぼす添加化
合物の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例え
ば、当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬ
ＩＳＡアッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織
からのポリペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニスト
またはアゴニストともいう）の探索に用いることができる。
膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：125I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合さ
せ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など
）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分
光学のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペプ
チドまたは（存在するのであれば）その受容体への結合と競合する該ポリペプチ
ドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。ス
クリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている
。
本発明のポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場
合には、該ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があ
るオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、
酵素などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
（それゆえ該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。
かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、
(a) 本発明のポリペプチド、
(b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、
(c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または
(d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、
を含んでなり、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである
。
このようなキットにおいて、（a）、（b）、（c）または(d)が実質的な構成成
分であることが理解されよう。
当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、
(a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、
(b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの確実と思われる反応
部位または結合部位の三次元構造を想定し、
(c) 想定された反応部位または結合部位と結合または反応すると予想される
候補化合物を合成し、そして
(d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビタ
ーであるか否かを調べる、
ことを含んでなる。これは通常相互作用プロセスであることがさらに理解されよ
う。
更なる態様において、本発明は、HM74Aポリペプチド活性の過剰量と不足量の
いずれかに関係した、例えば細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス
感染、特にHIV−１またはHIV−２により引き起こされる感染といった感染症；疼
痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過食；喘息：パーキンソン病；急性心不全；
低血圧；高血圧；閉尿；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；卒中；潰瘍；アレル
ギー；良性の前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁鬱病、抑うつ、
譫妄、痴呆および重症の精神遅滞を含む精神及び神経障害；およびハンチントン
症またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群のような運動障害などの異常な状態の
治療法を提供する。
該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに
患者に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内因性のポリペ
プチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力がまだ
ある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このような競合物質の
典型的な例はHM74Aポリペプチドの断片である。
さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性HM74Aポリペプチドを
コードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で
産生されるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（例えば、
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(遺伝子
発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド)，CRC P
ress，Boca Raton，FL（1988）中のO'Connor，J．Neurochem（1991）56:560を参
照のこと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌク
レオチドを供給することもできる（例えば、Leeら，Nucleic Acids Res（1979）
6:3073;Cooneyら，Science（1988）241:456;Dervanら，Science（1991）251:136
0を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、
関連オリゴマーをin vivoで発現させることもできる。
HM74Aおよびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、い
くつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に有効な量
の本発明ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト）を製剤
学上許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含ん
でなる。別法として、患者の関連細胞においてHM74Aを内因的に産生させるため
に遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作す
る。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケ
ージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有
する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivo細胞操作およびin vi
voポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー細胞を患者に投与する。
遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics，T Strachan and A P
Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)中のChapter 20，Gene Therapy a
nd other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引
用文献)を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の本発明のポリペプチド
を適当な製剤学上の担体とともに投与することである。
更なる態様において、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば、可
溶性形態の本発明ポリペプチド）、アゴニストもしくはアンタゴニストペプチド
、または小分子化合物を製剤学上許容される担体または賦形剤と共に含有する医
薬組成物を提供する。この種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これら
に限らない。本発明はさらに、上記の本発明組成物の１以上の成分を充填した１
以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチ
ドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物と一
緒に使用してもよい。
医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入（注射）、典型的には静注である。
皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の
手段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経
粘膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を
腸溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である
。これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ
／
または局在化させてもよい。
必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与
量は患者の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が多様
であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は
広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与よりも高
い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当業界
でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整すること
ができる。
治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより
、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivoで遺伝子工学的
に操作する。その後、これらの細胞を患者に導入する。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてＧＣＧのような
公知の検索ツールにより配列データベースを検索することで最大限促進される。
したがって、更なる態様において、本発明は、配列番号１の配列を含んでなるポ
リヌクレオチドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドを保存した
コンピュータ読み取り可能媒体を提供する。
以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。
本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」に
は、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖
領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも
、またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合っ
たものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレ
オチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ
、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノ
シンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾を
行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在
するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びに
ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ま
た、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短
いポリヌクレオチドも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オ
リゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）
の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ
酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ酸
配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究
文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカル
ボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの
修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる
程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含ん
でいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のあ
る又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリ
ペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によって
製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ
チジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチ
ル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミ
ル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング
、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のよ
うなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある（
例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，T.E．Creigh
ton，W.H．Freeman and Company，New York，1993;Posttranslational Covalent
Modification of Proteins，B.C．Johnson編，Academic Press，New York，198
3中のWold，F.，Post-translational Protein Modifications:Perspectives and
Prospects，pgs．1-12;Seifterら，“Analysis for protein modifications an
d nonprotein cofactors"，Meth Enzymol（1990）182:626-646;およびRattanら
，“Protein Synthesis:Post-translational Modifications and Aging"，Ann N
Y Acad Sci（1992）663:48-62を参照のこと）。
本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および
末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体
は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプ
チドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一とな
るような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以
上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または付加
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくて
もよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように
天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であって
もよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突
然変異誘発法または直接合成により作製することができる。
当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関連性
の程度を意味する。「同一性」は公知の方法により難なく算出することができ、
こうした方法として、例えばComputational Molecular Biology，Lesk，A.M.編
，Oxford University Press，New York，1988;Biocomputing:Informatics and G
enome Projects，Smith，D.W．編，Academic Press，New York，1993;Computer
Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M．and Grlffin，H.G．編，H
umana Press，New Jersey，1994:Sequence Analysis in Molecular Biology，vo
n HeinJe，G.，Academic Press，1987;Sequence Analysis Primer，Gribskov，M
．and Devereux，J．編，M Stockton Press，New York，1991;およびCarillo，H
．and Lipman，D.，SIAM J．Applied Math.，48:1073（1988）に記載された方法
があるが、これらに限らない。同一性を決定するための方法は、検討する配列間
で最大級のマッチが得られるように設計される。さらに、同一性を決定する方法
は一般に入手可能なコンピュータプログラムに編集されている。２配列間
の同一性を決定するコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッ
ケージ(Devereux，J．ら，Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、ＢＬＡ
ＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul，S.F．ら，J．Molec．Biol．
215:403-410(1990)）があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは
ＮＣＢＩおよび他のソースから一般に入手可能である(BLAST Manual，Altschul
，S.ら，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894;Altschul，S.ら，J．Mol．Biol．21
5:403-410(1990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用す
ることができる。
ポリペプチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む：
１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch，J．Mol．Biol．48:443-453（1970）比
較マトリックス：BLOSSUM62、Hentikoff and Hentikoff，Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA，89:10915-10919（1992）
ギャップペナルティー：12
ギャップ長ペナルティー：４
これらのパラメーターと共に役に立つプログラムはGenetics Computer Group
（Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記の
パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default paramet
er)である（末端ギャップのペナルティーは無し）。
ポリヌクレオチド配列を比較するためのパラメーターは次のものを含む：
１）アルゴリズム：Needleman & Wunsch，J．Mol．Biol．48:443-453(1970)；
比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：50
ギャップ長ペナルティー：３
これらのパラメーターと共に役に立つプログラムはGenetics Computer Group(
Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらは核酸比
較のためのデフォルトパラメーターである。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの「同一性」についての好適な意味は、
場合により下記(１)および（２）において提供される。
（１） ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の基準配列に対して少なくと
も50、
60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレオチド配
列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。前記ポリヌクレオチ
ド配列は配列番号１の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整
数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個の
ヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）
または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'
もしくは3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基
準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグ
ループとして介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌ
クレオチドの総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け、その積を
配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式：
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎnはヌクレオチド変異の数であり、ｘnは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは50％については0.50、60％について
は0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％
については0.90、95％については0.95、97％については0.97または100％につい
ては1.00であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘnとｙの非整数の積は、
その積をｘnから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセ
ンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、それにより、こう
した変異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変させる
ことができる。
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号２の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が1
00％未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むこ
とができる。前記変異は少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トランジションお
よびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした
変異は基準ポリヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置、またはこれらの末端
位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の核酸の間に個々に、または
基準配列内に１以上の連続するグループとして介在することができる。核酸変異
の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％
値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すな
わち、次式：
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎnはアミノ酸変異の数であり、ｘnは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘn
とｙの非整数の積は、その積をｘnから引く前に、最も近似する整数に切り下げ
る。
（２） ポリペプチドの具体例は、配列番号２の基準配列に対して少なくとも50
、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリペプチドを含
んでなる単離されたポリペプチドをさらに含む。前記ポリペプチド配列は配列番
号２の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミ
ノ酸変異を含んでいてもよい。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠
失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群か
ら選択され、これらの変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ
末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中の
アミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続したグループとして点
在することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそ
れぞれの（100で割った）同一性％の数値を掛け、その積を配列番号２中のアミ
ノ酸の総数から引くことにより、すなわち次式により求められる。
ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ）
式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは50％については0.50、60％については0.60、70％については0.70、80％
については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.
95、97％については0.97または100％については1.00であり、・は乗法演算子を
表す記号であり、ｘaとｙの非整数の積は、その積をｘaから引く前に、最も近似
する整数に切り下げる。
例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の基準配列と同一である
、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が100％
未満となるように基準配列に対してある整数個までのアミノ酸変異を含むことが
できる。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的およ
び非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、これらの
変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれ
らの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に
、または基準配列内に１以上の連続したグループとして点在することができる。
アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそれぞれの（100で割っ
た）同一性％の数値を掛け、その積を配列番号２中のアミノ酸の総数から引くこ
とにより、すなわち次式により求められる。
ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ）
式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85
等であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘaとｙの非整数の積は、その積
をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ
領域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が向上す
る（例えば、EP-A-0232262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとっては、
その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でＦｃ部分を除去すること
が望ましいだろう。
本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。
実施例
HM74ＥＳＴを潜在的な７ＴＭ受容体として一般のデータベースより同定した。
オリゴヌクレオチド(5')を、クローンの5'および3'末端部に設計した。5'プライ
マーは(CGCCACTTTGCTGGAGCATTCACTAGG)(配列番号３)であり、3'プライマーは(AG
TTTCCCTAAATCAGATTCTCTGAATC)(配列番号４)であった。これらのオリゴを用いて
、ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型として1.3kbの5'断片をPCR増幅した。このPCR断片をp
CR2.1ベクター中にサブクローニングし、配列を決定した。HM74Aのヌクレオチド
配列と発表されたHM74との比較により、該クローンの3'末端部に15個のヌクレオ
チドの差異ならびに5個のヌクレオチドの挿入が認められた。さらにアミノ酸配
列同士を比較することにより、HM74Aと発表されたHM74との間には15個のアミノ
酸に違いのあることがわかった。さらに、該クローンの3'末端部における5個の
ヌクレオチドの挿入により、異なる3'コード配列が生じた。HM74Aは発表されたH
M74に対して97.7％の同一性を有する363個のアミノ酸から構成される。クローニ
ング手順を２回行うことによりアミノ酸配列中の変化を確認した。正確な開始メ
チオニンを確認するために、全コード領域と5'非翻訳領域とを含有するｃＤＮＡ
クローン１つをヒト胎盤ＰＡＰＡ−ｃＤＮＡライブラリーを用いて単離した。こ
のクローンの配列分析により、最初の開始メチオニンの前に終結コドンが存在す
ることが示された。
実施例１：哺乳動物細胞における発現
本発明の受容体を、ヒト胚腎293（HEK293）細胞または付着性dhfr CHO細胞の
いずれかにおいて発現させた。受容体の発現を最大にするために、pCDNまたはpC
DNA3ベクターへ挿入する前に、一般的には全ての5'および3'非翻訳領域（UTRs）
を受容体ｃＤＮＡから取り除いた。これらの細胞をリポフェクチンを用いて個々
の受容体ｃＤＮＡによりトランスフェクトし、400mg／mlのG418の存在下で選択
した。３週間の選択後に、個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖さ
せた。ベクターのみでトランスフェクトしたHEK293またはCHO細胞を陰性対照と
して使用した。個々の受容体を安定して発現している細胞系を単離するために、
一般的に約24個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析により分
析した。受容体ｍＲＮＡは、通常、分析したＧ418耐性クローンの約50％におい
て検出可能であった。
実施例２：結合アッセイおよび機能アッセイ用のリガンドバンク(bank)
200を越える推定上の受容体リガンドのバンクがスクリーニングのために集成
された。このバンクには以下のものが含まれる。すなわち、ヒトの７回膜貫通(7
TM)受容体を介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモ
カイン：ヒト７ＴＭ受容体の推定上のアゴニストでありうる、天然に存在する化
合物；非哺乳動物の生理活性ペプチド(哺乳動物の対応物は未だ同定されていな
い)；および天然には見出せないが未知の天然リガンドと共に７ＴＭ受容体を活
性化する化合物である。このバンクは結合アッセイと機能(すなわち、カルシウ
ム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター(microphysiometer)、卵母細胞電気生理
学など、以下を参照)アッセイの両方を用いて、既知のリガンドに対する該受容
体を最初にスクリーニングするために使用された。
実施例３：リガンド結合アッセイ
リガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるための直接的な方法を提供
し、また高処理量方式にも適用が可能である。受容体の精製リガンドを結合実験
のために高い比活性(50−2000Ci／mmol)で放射性標識した。次に、放射性標識化
のプロセスがその受容体に対するリガンドの活性を低下させないことを確かめた
。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドのような他のモジュレーターについ
てのアッセイ条件を最適化し、膜および全細胞の両受容体源についての実施可能
な生じうるシグナル対ノイズ比を確立した。これらのアッセイのために、特異的
受容体結合を、全結合放射能から、過剰の未標識競合リガンドの存在下で測定し
た放射能を差し引いた値として定義した。可能であれば、２以上の競合リガンド
を用いて残留する非特異的な結合を確定する。
実施例４：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ
本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状化プラスミドの鋳型からのキャップ
したＲＮＡ転写物を、標準的な手法に従い、in vitroでＲＮＡポリメラーゼを使
用して合成した。in vitroでの転写物を最終濃度0.2mg／mlで水中に懸濁した。
卵巣葉(ovarian lobes)を成熟雌カエルから取り出し、ステージVの脱濾胞化卵母
細胞を得て、ＲＮＡ転写物(10ng／卵母細胞)を微量注入装置を用いて50nlで単回
注入した。２つの電極電位クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応答した個
々のアフリカツメガエルの卵母細胞からの電流を測定した。室温でCa2+を含まな
いバース(Barth's)培地中で記録を行なった。このアフリカツメガエル系を使用
して、活性化用リガンドについての既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をス
クリーニングすることができる。
実施例５：ミクロフィジオメトリックアッセイ
多様な第二メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が放出される
。この酸は主として細胞内のシグナル伝達プロセスを活気づけるために必要な代
謝活性が増強した結果として産出される。この細胞を取り巻く培地におけるｐＨ
の変化は非常に小さいが、サイトセンサー(CYTOSENSOR)ミクロフィジオメーター
（Mole cular Devices Ltd.，Menlo Park,CA）により検出できる。したがって、
このサイトセンサーは本発明のＧタンパク質共役型受容体のような、細胞内シグ
ナル伝達経路を利用するエネルギーに共役する受容体の活性化を検出することが
できる。
実施例６：抽出物／細胞上清スクリーニング
多くの哺乳動物受容体が存在するが、今のところ同一動物種(cognate)の活性
化用リガンド(アゴニスト)は見つかっていない。したがって、これらの受容体を
活性化するリガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクには含まれていな
い可能性がある。よって、本発明の７ＴＭ受容体もまた、天然のリガンドを同定
するために組織抽出物に対して機能的に(カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジ
オメーター、卵母細胞電気生理学などの機能スクリーンを使用して)スクリーニ
ングされた。陽性の機能的な応答を示す抽出物を、活性化用リガンドが単離され
同定されるまで順次サブ分画することができる。
実施例８：カルシウムおよびｃＡＭＰ機能アッセイ
HEK293細胞で発現された７ＴＭ受容体は、ＰＬＣおよびカルシウムの動員活性
化および／またはｃＡＭＰの刺激または阻害と機能的に共役することが示された
。受容体トランスフェクト細胞またはベクター対照細胞におけるHEK293細胞中の
基礎カルシウムレベルは、正常な100nM〜200nMの範囲で観察された。組換え受容
体を発現しているHEK293細胞を、fura２を添加し、一日で＞150個の選択したリ
ガンドまたは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員について評価し
た。同様に、組換え受容体を発現しているHEK293細胞を標準的なｃＡＭＰ定量ア
ッセイを用いて、ｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価した。一時的にカ
ルシウムを動員する、またはｃＡＭＰの変動を示すアゴニストをベクター対照細
胞で試験し、このときの応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特
有なものであるかどうかを決定した。
配列情報
配列番号１
配列番号２
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/14
1/08 3/04
1/14 3/10
3/04 9/04
3/10 9/10
9/04 9/12
9/10 11/06
9/12 13/02
11/06 13/08
13/02 19/10
13/08 21/00
19/10 25/04
21/00 25/06
25/04 25/14
25/06 25/16
25/14 25/18
25/16 25/22
25/18 25/24
25/22 25/28
25/24 31/04
25/28 31/10
31/04 31/12
31/10 33/02
31/12 35/00
33/02 37/08
35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705
37/08 16/28
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15
16/28 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 リ，シャオトン
アメリカ合衆国 19333 ペンシルベニア
州，デボン，シュガータウン ロード
332，アパートメント ビー41ビー
(72)発明者 ベルグスマ，デルク，ジェイ.
アメリカ合衆国 19312 ペンシルベニア
州，ベルウィン，アイリッシュ ロード
271
(72)発明者 ムーニー，ジェフリー，エル.
アメリカ合衆国 19468 ペンシルベニア
州，ライムリック，ウィングド フット
コート 143
(72)発明者 ゲレラ，ステファニー，エフ.
アメリカ合衆国 19106 ペンシルベニア
州，フィラデルフィア，ヴァイン ストリ
ート 313，アパートメント 505