JP2009519017A

JP2009519017A - 炎症性疾患の治療及び診断

Info

Publication number: JP2009519017A
Application number: JP2008544635A
Authority: JP
Inventors: ジュンリー; シアンジョンリー; ベルベルロサッコ
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2005-12-07
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2009-05-14
Also published as: EP1960792A2; CA2628401A1; US20080089881A1; WO2007067912A8; WO2007067912A3; WO2007067912A2

Abstract

組織障害におけるHM74及び/又はHM74Aのレベルを決定することによって、被験者が炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があるかを決定する方法。また、炎症性疾患の治療用化合物を同定する方法、炎症性疾患の治療方法、及び炎症性疾患を治療するための医薬組成物又は包装した製品も開示される。

Description

（関連出願）
この出願は、2005年12月７日に出願された米国仮出願第60/748313号の利益を主張する。

（背景）
HM74は1993年にヒト単球cDNAライブラリーのオーファンGPCRとして最初にクローン化された（Nomura H et al, 1993, Int Immunol. 5:1239-1249）。ヒトHM74はHM74及びHM74Aと命名される２つのアイソフォームを持つ。HM74はニコチン酸に対して低いアフィニティ受容体であるが、HM74Aはニコチン酸に対して高いアフィニティ受容体として作用する（Wise A et al J Biol Chem. 2003 278:9869-9874）。マウス欠乏PUMA-G（ヒトHM74Aのマウス類似体）では、遊離脂肪酸（FFA）及びトリグリセリド血漿レベルのニコチン酸誘導減少が排除され、PUMA-Gがインビボでニコチン酸の抗脂肪分解（anti-lipolytic）及び脂肪低下効果を媒介する（Nat Med. 2003 9:352-355）。ヒトHM74（配列番号１）及びヒトHM74A（配列番号２）のcDNA配列は非常に似ており、HM74Aは15ヌクレオチド置換及び５塩基挿入を有する。HM74及びHM74Aは同様のmRNA組織分布及び染色体位置を有することが示されている（Wise A et al J Biol Chem. 2003 278:9869-9874）。しかしながら、この研究での組織選択は正常組織に限定されていた。

我々は遺伝子発現研究により、HM74 mRNAが乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症のようないくつかの炎症性疾患の組織において顕著に誘導されることを明らかにした。ヒトHM74はHM74A（ニコチン酸に対して高アフィニティ）及びHM74（ニコチン酸に対して弱いアフィニティ）という２つのアイソフォームを持つ。各アイソフォームに対して特異的に設計されたTaqManプライマーにより、我々はHM74及びHM74Aがともに炎症を起こした炎症性腸疾患（IBD）クローンにおいて高く誘導され、HM74Aが活性化されたヒトTh2細胞において高く誘導されることを観測した。

（要約）
本発明は、炎症性疾患を治療するためのターゲットとしてGPCR遺伝子、HM74及び/又はHM74Aの使用に関するものである。

１つの態様では、本発明は、被験者が乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症及び過敏性腸症候群のような炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があるかを決定する方法である。１つの実施態様では、前記方法は被験者から組織サンプルを用意すること及び前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルを決定することを含む。前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルが健常者からのサンプルにおけるものよりも高い場合、それは、被験者が炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があることを示す。HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルはHM74（配列番号３）及び/又はHM74A（配列番号４）のmRNA若しくはタンパク質の量を測定することによって決定できる。mRNAレベルはインサイツハイブリダイゼーション、TaqManリアルタイムRT-PCR又はノーザンブロット解析のような技術的によく知られた方法によって決定できる。タンパク質レベルは、例えばウエスタンブロット解析によって決定できる。別の実施態様では、前記方法は被験者からサンプルを用意すること及び前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルを決定することを含む。前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルが健常者からのサンプルにおけるものよりも高い場合、それは、被験者が炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があることを示す。HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルは、例えばニコチン酸の結合を測定することによって、又はHM74/HM74Aのリガンド誘導活性化後にＧタンパク質サブユニットでのGDP-GTP交換を測定することによって決定できる。

別の態様では、本発明は、炎症性疾患の治療用化合物を同定する方法である。前記方法は、化合物を、HM74及び/又はHM74A遺伝子若しくはHM74及び/又はHM74A遺伝子産物を含む系（細胞系又は無細胞系）と接触させること及び前記系におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを決定することを含む。前記化合物の存在下でのHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルは、前記化合物の非存在下でのものよりも低い場合、前記化合物が炎症性疾患を治療するための候補であることを示す。そのような化合物はポリヌクレオチド、RNA干渉剤（interference agent）、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子のような任意の分子であってもよい。

炎症性疾患の治療方法も本発明の範囲内である。前記方法は、被験者に、被験者のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げるのに有効な量の化合物を投与することを含む。そのような化合物はポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子のような任意の分子であってもよい。この方法は本明細書に記載した手順を用いて炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性がある被験者を同定する前工程を含んでもよい。治療することができる炎症性疾患としては、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症又は過敏性腸疾患などが挙げられる。

本発明は、さらに薬剤として許容できる基剤と、被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルを下げる有効量の化合物とを含む医薬組成物である。前記化合物は、それを必要とする被験者に投与される場合、被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げる。したがって、本発明の医薬組成物は炎症性疾患を治療するために使用できる。

別の態様では、本発明は、容器と、被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げる有効量の化合物と、容器に付随し、かつ、炎症性疾患の治療用分子の投与方法を示す説明文とを含む包装した製品である。前記製品は、異なる投薬で経口デリバリー、静脈注入又は皮下投与により投与できる。

本発明の１又は２以上の実施態様の詳細は以下で説明される。本発明のその他の特徴、目的及び利点は詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

（詳細な説明）
本発明は、いくつかのGPCR遺伝子、HM74及びHM74Aが炎症性疾患組織細胞において上方制御されることを発見したことに基づいている。したがって、本発明はこれらのGPCR遺伝子をターゲットとすることによって炎症性疾患を診断及び治療する方法を提供する。

本発明の診断方法は、被験者から用意されたサンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを、健常者（すなわち、炎症性疾患を患っていない被験者）から用意されたサンプルにおけるものと比較することを含む。HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルが高いことは、被験者が炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があることを示す。例えば、被験者の遺伝子発現レベルが、下記実施例に記載される方法又は任意の類似の方法によって決定される場合に、健常者におけるものと顕著に異なる場合、被験者は炎症性疾患を患っているか、又はそれを発症する危険性があるとされる。本発明の方法は、そのままで、又は炎症性疾患を診断するためのその他の手順とともに使用できる。

HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルはmRNAレベル又はタンパク質レベルのいずれかで決定できる。組織サンプル中のmRNAレベルを測定する方法は技術的に公知である。mRNAレベルを測定するために、細胞を溶解し、溶解産物中又は溶解産物から精製又は半精製したRNA中のmRNAのレベルを、検出可能に標識された遺伝子特異的なDNA又はRNAプローブ及び定量的若しくは半定量的RT-PCRを用いるハイブリダイゼーション分析又は適切な遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるTaqManリアルタイムPCR法など（限定されない）の種々の方法のいずれかによって決定できる。あるいは、例えば組織切片又は溶解されていない細胞懸濁液及び検出可能に（例えば、蛍光又は酵素）標識されたDNA又はRNAプローブを用いて、定量的又は半定量的インサイツハイブリダイゼーション分析を行うことができる。mRNAを定量化するための追加の方法としては、RNA保護分析（RPA）及びSAGEなどが挙げられる。

組織サンプルにおけるタンパク質レベルを測定する方法も技術的に知られている。多くのそのような方法はターゲットタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）を使用する。そのような分析では、抗体自体又はそれに結合する２次抗体は検出可能に標識できる。あるいは、前記抗体はビオチンと結合でき、検出可能に標識されたアビジン(ビオチンに結合するポリペプチド）はビオチン化抗体の存在を検出するために使用できる。当業者によく知られるこれらのアプローチ（「多層サンドイッチ」分析など）の組み合わせは前記方法の感度を高めるために使用できる。これらのタンパク質測定分析のいくつか（例えば、ELISA又はウエスタンブロット）は細胞の溶解産物に適用でき、その他（例えば、免疫組織学的方法又は蛍光フローサイトメトリー）は組織断片又は溶解されていない細胞懸濁液に適用できる。標識の量を測定する方法は標識の性質に依存し、技術的によく知られている。適した標識としては、限定されないが、放射性核種（例えば、.sup.125I、.sup.131I、.sup.35S、.sup.3H又は.sup.32P）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はβ-ガラクトシダーゼ）、蛍光成分又はタンパク質(例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、GFP又はBFP）、又は発光成分（例えば、Quantum Dot Corporation（カリフォルニア州パロアルト）によって供給されるQdot（商標）ナノ粒子）などが挙げられる。その他の適した分析としては、定量的免疫沈降反応又は補体結合分析などが挙げられる。

HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルは、例えばニコチン酸の結合を測定することによって、又はHM74/HM74Aのリガンド誘導活性化後にＧタンパク質サブユニットでのGDP-GTP交換を測定することによって決定できる。Peltonen et al. (1998) Eur J Pharmacol 355, 275; Tunaru et al (2003) Nature Medicine 9, 352-355; Wise et al, (2003) J Biol Chem 278, 9869-9874を参照のこと。

本発明は、また系におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを減少させる分子（例えば、ポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、抗体若しくはその変異体、又は非ペプチジル小分子）を同定及び製造する方法を提供する。このようにして同定された分子は、例えば炎症性疾患を治療するために使用できる。

技術的に知られているコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて、候補分子を得ることができる。そのようなライブラリーとしては、ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能性を有するが、酵素分解に耐性がある新規な非ペプチド骨格をも有する分子のライブラリー）、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、解析（deconvolution）又はアフィニティークロマトグラフィー選択によって得られる合成ライブラリー及び「ワンビーズワンコンパウンド」ライブラリーなどが挙げられる。例えば、Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37, 2678-2685及びLam (1997) Antiinflammatory diseases Drug Des 12, 145を参照のこと。

分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術において、例えばDeWitt et al. (1993) PNAS USA 90, 6909; Erb et al. (1994) PNAS USA 91, 11422; Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37, 2678; Cho et al. (1993) Science 261, 1303; Carrell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33, 2059; Carell et al. (1994) Angew Chem Int Ed Engl 33, 2061; 及びGallop et al. (1994) J Med Chem 37, 1233において見つけることができる。モノクローナル及びポリクローナル抗体並びにそれらの断片の製造方法も技術的に知られている。例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照のこと。用語「抗体」には、無処置の分子及びその断片、例えばHM74及び/又はHM74Aに存在するエピトープの決定基に結合できるFab、F(ab')2及びFvが含まれる。

分子ライブラリーは溶液中で（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13, 412-421）、又はビーズ（Lam (1991) Nature 354, 82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364, 555-556）、バクテリア（米国特許第5223409号）、胞子（米国特許第5223409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) PNAS USA 89, 1865-1869）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249, 386-390; Devlin (1990) Science 249, 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS USA 87, 6378-6382; Felici (1991) J Mol Biol 222, 301-310; 及び米国特許第5223409号）上で提供できる。

被験者においてHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを減らす分子を同定するために、HM74及び/若しくはHM74A遺伝子又はHM74及び/若しくはHM74A遺伝子産物（mRNA又はタンパク質）を含む系を候補化合物と接触させ、HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを、候補化合物の非存在下と比較して評価される。細胞系では、細胞（例えば、炎症性疾患細胞）は、HM74及び/若しくはHM74Aを自然に発現する細胞であってもよく、又は例えば異種プロモータと融合したHM74及び/若しくはHM74A遺伝子を有することによって、若しくは異種遺伝子に融合したHM74及び/若しくはHM74Aプロモータを有することによって組換えHM74及び/若しくはHM74A遺伝子を発現することを改変された細胞であってもよい。HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルは、下記の実施例に記載される方法又は技術的によく知られたその他の任意の方法に従って決定できる。HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルが、候補分子の存在下で、候補化合物の非存在下におけるものよりも少ない場合、候補分子は炎症性疾患を治療するのに有用であると同定される。

本発明は、さらに炎症性疾患の治療方法を提供する。治療される被験者は、例えば上述の方法によって被験者から調製されたサンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを決定することによって、同定されてもよい。HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルが、前記被験者からのサンプルにおいて、健常者からのサンプルにおけるものよりも高い場合には、前記被験者は、前記被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げる有効量の化合物による治療の候補である。この方法は、単独で、又はその他の薬剤若しくは治療と組み合わせて、行ってもよい。

用語「治療」は、障害、障害の兆候、障害に伴う病状、若しくは障害になりやすい傾向を治癒する（cure）、緩和する（alleviate）、軽減する（relieve）、治療する（remedy）、予防する、又は改善する目的で、被験者（炎症性疾患を有する）へ組成物を投与することとして定義される。「有効量」は、例えば上述のように、治療される被験者において、医学的に望ましい結果を得ることができる組成物の量である。

１つのインビボアプローチでは、治療用組成物（例えば、上述のように同定された化合物を含む組成物）を被験者に投与する。一般に、前記分子は、薬剤として許容できる基剤（例えば、生理食塩水）に懸濁され、そして経口若しくは静脈内注入によって投与され、又は皮下、筋肉内、鞘内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、胃内、気管内、若しくは肺内に注入若しくは移植される。炎症性疾患の治療のために、前記化合物を炎症性疾患組織に直接送達できる。

要求される投薬は、投与経路の選択；調合物の性質；被験者の疾患の性質；被験者のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別；投与されるその他の薬剤；並びに主治医の判断に依存する。適した投薬は0.01〜100mg/kgの範囲である。必要な投薬における幅広いバリエーションは、入手可能な化合物の種類及び種々の投与経路の異なる効率の観点から予想されるべきである。例えば、経口投与は、静脈内注入による投与よりも高い投薬を必要とすることが予想される。これらの投薬のレベルにおけるバリエーションは、技術的によく理解されているように最適化のための経験による標準的な決まった手順を用いて調整できる。適した送達媒体（例えば、高分子微粒子又は移植可能な医療用具）に前記化合物を封入することは、送達の効率（特に、経口送達のための）を高める。前記化合物が難溶性である場合、公知の界面活性剤材料を使用して前記化合物の溶解性を高めてもよい。例えば、Li et al.の米国特許出願公開第2006/0068007号（参照により本明細書に組み込まれるものとし、界面活性剤材料として変性ビタミンE TPGSを記載する）を参照のこと。

あるいは、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスHM74及び/又はHM74A RNAをコードする核酸配列を含むもの）を、例えば技術的に知られた生分解性高分子微粒子又はマイクロカプセル送達医療用具の使用によって、被験者に送達できる。核酸の摂取を達成する別の方法は、標準方法によって調製されるリポソームを用いることである。ベクターを、単独でこれらの送達媒体に組み込むことができ、又は組織特異的抗体と同時に組み込むこともできる。あるいは、プラスミドからなる分子複合体又は静電気力若しくは共有結合力によってポリ-L-リジンに結合された別のベクターを調製できる。ポリ-L-リジンは、ターゲット細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する（Cristiano et al. (1995) J Mol Med 73, 479）。あるいは、技術的に知られている組織特異的転写制御因子（TRE）の使用によって、組織特異的ターゲティングを達成することができる。筋肉内、皮内又は皮下部への「裸のDNA」（すなわち、送達媒体のない）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。

上述のポリヌクレオチドは、RNA干渉剤（すなわち、二本鎖含有（duplex-containing）RNA又はそれをコードするDNA配列（RNA干渉によりHM74及び/又はHM74Aの発現を阻害する）であってもよい。RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）がメッセンジャーRNAの相同
配列特異的分解を指示するプロセスである。哺乳動物細胞では、RNAiは、宿主のインターフェロン応答性を活性化することなしに、低分子干渉RNA（siRNA）の19〜21個のヌクレオチド二本鎖によって誘発できる。RNAiは特定の遺伝子の発現を抑えるので、遺伝子の異常に高い発現レベルによって生じる疾患を治療するために使用できる。二本鎖含有RNAは技術的によく知られた方法によって合成できる。例えば、Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19、Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59、Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45及びBrennanの米国特許第6001311号を参照のこと。それは、また発現ベクターから転写でき、標準方法を用いて分離できる。

上述のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）では、RNAi剤又はアンチセンスHM74及び/又はHM74A RNAをコードする核酸配列は、プロモータ又はエンハンサ-プロモータコンビネーションに動作可能に結合される。エンハンサは、時間、位置及びレベルで発現特異性を与える。プロモータと異なり、エンハンサは、転写開始部位からの可変距離に位置する場合、機能することができるが、プロモータが存在することを条件とする。エンハンサは、また転写開始部位の下流に位置することができる。

適した発現ベクターとしては、プラスミド及びウイルスベクター、中でも例えばヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒ワクシニアウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどが挙げられる。

ポリヌクレオチドは薬剤として許容できる基剤中で投与できる。医術でよく知られるように、被験者のための投薬は、被験者の体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、総体的な健康並びに同時に投与されるその他の薬剤などの多くの因子に依存する。投薬は変えることができるが、ポリヌクレオチドの投与のための好ましい投薬は、ポリヌクレオチド分子の約10⁶〜10¹²コピーである。この投与量は、必要に応じて繰り返し投与することができる。投与経路は上述のいずれであってもよい。

薬剤として許容できる基剤並びに被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを減らすのに有効な量の化合物を含む医薬組成物もまた本発明の範囲内である。前記医薬組成物は炎症性疾患を治療するために使用できる。薬剤として許容できる基剤としては、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、並びに等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。前記分子は、また前記化合物の目的とする用途（すなわち、炎症性疾患の治療）を示すためのラベル又は広告（insert）の付いた容器に詰めることができる。

本発明の分子は、従来の方法を利用する異なる投与経路のための投薬形態に調合できる。例えば、それは、カプセル、ゲル密封又は経口投与のための錠剤に調合できる。カプセルは、ゼラチン又はセルロースのような薬剤として許容できる標準材料を含むことができる。錠剤は、リガンドと固形基剤及び滑剤との混合物を圧縮することによる従来の方法に従って調合できる。固形基剤の例としては、スターチ及び糖ベントナイトなどが挙げられる。

前記分子は、また結合剤（例えば、タクトース又はマンニトール）、従来の充填剤及び錠剤化剤を含む硬シェル錠剤又はカプセルの形態で投与できる。医薬組成物は、非経口経路により投与することができる。非経口剤形の例としては、水溶液、等張食塩水若しくは５％グルコースの活性化剤、又はその他のよく知られた薬剤として許容できる賦形剤などが挙げられる。サイクロデキストリン又は当業者によく知られたその他の可溶化剤は、治療剤の送達のための医薬品賦形剤として利用できる。

本発明の組成物の効力は、インビトロ及びインビボの両方で評価することができる。例えば、前記組成物は、インビトロでHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げるその能力について試験することができる。インビボ研究のために、前記組成物は動物（例えば、動物モデル）に注入でき、次いで炎症性疾患に対するその効果が入手される。前記結果に基づいて、適切な投薬範囲及び投与経路が決定できる。

いかの特定の実施例は、単なる実例と解釈されるべきであり、決して開示の残りの部分を限定するものと解釈されるべきではない。さらに詳細に説明しなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書で引用されたすべての文献は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれるものとする。

（実験）
実施例１：
潰瘍性大腸炎患者及び健常者ドナーからのヒト結腸組織の遺伝子発現プロフィール研究を行うために、我々はアフィメトリクスの遺伝子チップ技術（ヒトU133チップ）を利用した。HM74が潰瘍性大腸炎患者からの炎症を起こした結腸組織において高く誘導されることを、我々は観測した。炎症性腸疾患（IBD）患者及び健常者ドナー（９人のクローン病患者、17人の潰瘍性大腸炎患者、211人の健常者）からの結腸組織のさらなる統計的分析は、HM74がクローン病結腸において4.4倍（p値 0.002）誘導され、潰瘍性大腸炎結腸において2.5倍（p値 0.006）誘導されることを示した。アフィメトリクスのチップ上のオリゴヌクレオチドプローブ（プローブID 205220_at）はヒトHM74及びHM74Aを検出する。どのHM74アイソフォームがIBDで誘導されるかを同定するために、我々はHM74又はHM74A用にデザインされた特異的TaqManプライマー及びプローブを用いてTaqManリアルタイムRT-PCRを行った。図１に示されるように、HM74及びHM74Aはともに潰瘍性大腸炎患者からの炎症を起こした結腸組織において発現されるが、健常者の結腸では発現されない。さらに、遺伝子チップデータ（プローブID 205220_at）は、HM74/74Aの発現が乾癬患者からの炎症を起こした皮膚組織において健常者の皮膚組織又は病変のない乾癬の皮膚組織よりも高く誘導されることを示す（図２）。さらに、HM74/74A mRNA発現も健常者ドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）と比較してヒト多発性硬化症患者からのPBMCにおいて誘導される（図３）。HM74/HM74Aは、またヒト一次単球及び好中球においてバクテリア及びLPSによって高く誘導され（図４）、これは単球及び好中球における炎症反応を媒介するその機能を示唆している。HM74又はHM74A用にデザインされた特異的TaqManプライマー及びプローブを用いて、我々はヒトTh1及びTh2 CD4⁺ T細胞においてTaqManリアルタイムRT-PCR解析を行った。図５に示されるように、HM74（HM74Aではない）は抗-CD3又は抗-CD3/抗-CD28刺激によってヒトTh1及びTh2細胞において顕著に誘導される。HM74 mRNAの刺激は、Th2細胞において、Th1細胞においてよりも高い（図５）。HM74及びHM74A発現の解離はこれまで報告されていない。まとめると、HM74及びHM74Aは、炎症性細胞及び炎症性疾患において高く誘導され、炎症性腸疾患、乾癬及び多発性硬化症などの炎症性疾患のための格好の標的として働く。HM74/HM74AはGタンパク質共役受容体であるため、低分子アゴニスト又はアンタゴニストは抗炎症及び免疫抑制効果を有することができる。

全RNA単離：製造業者（QIAGEN）の説明書に従ってRNeasy Kits及びRNase-Free DNase Set Protocolを用いて、組織又は細胞サンプルから全細胞のRNAを単離した。

TaqManプローブ及びプライマー：Primer Express 1.5 Software（Applied Biosystems）を用いて、PCRプライマー及びTaqManプローブをデザインした。TaqManプローブは、5'末端でレポーター蛍光色素FAM（6-カルボキシフルオレセイン）及び3'末端で蛍光色素失活剤TAMRA（6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン）で標識された。TaqMan PCR定量化前に、熱サイクル中の通常のPCR条件の下で、PCRプライマーの特異性を試験した。

逆転写：TaqMan逆転写試薬を用いて、MicroAmp反応チューブ中で各RNAサンプルについてRT反応を行った。各反応チューブは、１×TaqMan RTバッファー、5.5mMのMgCl₂、500μMの各dNTP、2.5μMのRandom Hexamers又はオリゴ-d(T)₁₆プライマー、0.4U/μlのRNaseインヒビター及び1.25U/μlのMultiScribe Reverse Transcriptaseを含む50μlの容量中に500ngの全RNAを含む。25℃で10分間、48℃で40分間及び95℃で５分間、RT反応を行った（注：25℃で10分間のインキュベーションは、最適な結果を得るためにランダムヘキサマー又はオリゴ-d(T)₁₆プライマーを用いたRT反応に必要である）。次いで、RT反応混合物をPCR増幅の直接の使用のために４℃で置かれ、又は後で用いるために-20℃で保管される（これらの２つの異なる温度の保管で、同様の結果が予想される）。

標準曲線の作成：ターゲット転写物のコピー数を決定するために、ヒトゲノムDNA（Clontech）を用いて標準曲線を生成した。ヒト２倍体ゲノムの分子量［３×10⁹bp＝３×10⁹×660（M.W.）＝２×10¹²ｇ］に従ってゲノムDNA鋳型のコピー数を計算し、次いで１μg/μlのゲノムDNAを、アボガドロ数（１mol＝6.022×10²³分子）をもとに2.4×10⁶のコピー数に変換した。ゲノムDNAを連続的に５×10⁵〜５×10⁰のコピー数の範囲に希釈した（各回10倍）。各サンプルを３回行い、R_n（レポーター色素放出と消光色素放出の量の比）及びC_t（threshold cycle）値を各反応から平均した。

TaqManリアルタイム定量的PCR：TaqManリアルタイム検出の原理は、蛍光発生的5'ヌクレアーゼアッセイに基づく。熱安定AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼをPCR増幅のために用いた。MicroAmp Optical 96−Well Reaction Plate（Applied Biosystems）においてリアルタイムRT-PCRを行った。各ウエルは、２μlの各RT産物（20ngの全RNA）、１×TaqManバッファーＡ、5.5mMのMgCl₂、200μMのdATP/dCTP/dGTP、400μMのdUTP、200nMのプライマー（フォワード及びリバース）、100nMのTaqManプローブ、0.01Ｕ/μlのAmpErase及び0.025Ｕ/μlのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを25μlの全容量中に含んでいた。試薬の充填の完了後、各ウエルをMicroAmp Opticalキャップ（Applied Biosystems）により密閉した。増幅条件は50℃で２分（cDNAに組み込まれたウラシルを除去するためのAmpErase UNGインキュベーションについて）、95℃で10分（AmpliTaq Gold活性化について）及び95℃で15分間、60℃で１分間の40サイクルであった。すべての反応は、試験サンプル、標準及び鋳型のないコントロールについて、ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemで行った。Sequence Detector V 1.6プログラムを用いて、それらを３回行った。各反応で得られた値からR_n及びC_tを平均した。標準における鋳型の既知のコピー数に対してC_tをプロットすることにより「標準曲線」を作成した。標準曲線に従って、すべての未知のサンプルについてのコピー数を自動的に得た。

mRNA発現レベルの規格化：各サンプルにおけるmRNAのコピー数をそのC_t値に基づいてそのプラスミドDNA標準曲線を用いて計算した。次いで、試験サンプル間のRT効率及びRNA完全性の相違により、結果における変異性を最小にするために、コピー数をGapdhに規格化した。
定量的RT-PCRで使用したプライマー配列
HM74 プライマー
HM74_F
配列: 5'-ACTACTATGTGCGGCGTTCAGAC-3'

HM74_R
配列: 5'-GGCGGTTCATGGCAAACA-3'

HM74 TaqMan^TM プローブ:
HM74_T
配列: 5'FAM-ACCAGCCGGCAAGGGATGTCC-TAMRA3'

HM74A プライマー
HM74A_F
配列: 5'-ACAACTATGTGAGGCGTTGGGA-3'

HM74A_R
配列: 5'-TGGCGGTTCATAGCCAACA-3'

HM74A TaqMan^TM プローブ:
HM74A_T
配列: 5'FAM-ATCAGCCGGCAAGGGATGTCC-TAMRA3'

（結果）
我々は、HM74が潰瘍性大腸炎患者からの炎症を起こした結腸組織において高く誘導されることを観測した。炎症性腸疾患（IBD）患者及び健常者ドナー（９人のクローン病患者、17人の潰瘍性大腸炎患者、211人の健常者）からの結腸組織のさらなる統計的解析により、HM74がクローン病の結腸で4.4倍（p値は0.002）及び潰瘍性大腸炎の結腸で2.5倍（p値は0.006）誘導されたことが示された。図１に示されるように、HM74及びHM74Aはともに潰瘍性大腸炎患者からの炎症を起こした結腸組織において発現されたが、健常者の結腸からは発現されなかった。図５に示されるように、HM74（HM74Aではない）はヒトTh1及びTh2細胞において抗-CD3又は抗-CD3/抗-CD28刺激により顕著に誘導される。

（その他の実施態様）
本明細書に開示された特徴のすべては、任意に組み合わせてもよい。本明細書に開示された各特徴は、同じ、等価な、又は同様の目的を提供する別の特徴によって置き換えてもよい。したがって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示された各特徴は、単に一般的な一連の等価な、又は同様の特徴の例である。

先の記載から、当業者は、容易に本発明の必須の特徴を確かめることができ、その意図及び範囲から離れることなしに、種々の用法及び条件に適合する本発明の種々の変化及び改良を行うことができる。したがって、その他の実施態様も特許請求の範囲の請求項の範囲内である。

TaqManリアルタイムRT-PCR解析による正常又はIBD（潰瘍性大腸炎患者）の結腸組織におけるHM74及びHM74AのmRNA発現。 HM74/HM74A mRNA発現はヒト乾癬患者の炎症を起こした皮膚組織において誘導される。 HM74/HM74A mRNA発現はヒト多発性硬化症患者の抹消血単核細胞（PBMC）において誘導される。 HM74/HM74Aはヒト一次単球及び好中球において異なる刺激によって誘導される。ヒトTh1及びTh2細胞におけるHM74及びHM74A mRNA発現（TaqMan）。

Claims

被験者が炎症性疾患を患っているか、又は炎症性疾患を発症する危険性があるかを決定する方法であって、以下を含む前記方法。
（１）被験者から組織サンプルを用意し、前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベル若しくはタンパク質活性レベルを決定し；
（２）前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベル若しくはタンパク質活性レベルを、健常者からの組織サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベル若しくはタンパク質活性レベルと比較し；及び
（３）被験者からの前記サンプル中のHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベル若しくはタンパク質活性レベルが健常者からの前記サンプルのものよりも高い場合、これが、被験者が炎症性疾患を患っているか、又は炎症性疾患を発症する危険性があることを示す。
炎症性疾患が乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症又は過敏性腸症候群である、請求項１記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルが前記サンプル中のHM74 mRNA及び/又はHM74A mRNAの量を測定することによって決定される、請求項１記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルが前記サンプル中のHM74タンパク質及び/又はHM74Aタンパク質の量を測定することによって決定される、請求項１記載の方法。
前記タンパク質が配列番号３及び/又は配列番号４によって定義されるものである、請求項４記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルがニコチン酸の結合を測定することによって決定される、請求項１記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルがHM74/HM74Aのリガンド誘導活性化後にＧタンパク質サブユニットでのGDP-GTP交換を測定することによって決定される、請求項１記載の方法。
さらに、前記被験者の炎症性疾患を治療することを含み、前記治療は、前記被験者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現又はタンパク質活性レベルを下げるのに有効な量の化合物を前記被験者に投与することを含む、請求項１記載の方法。
前記化合物がポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子である、請求項８記載の方法。
炎症性疾患の治療用化合物を同定する方法であって、以下を含む前記方法。
（１）化合物を、HM74及び/若しくはHM74A遺伝子又はHM74及び/若しくはHM74A遺伝子産物を含む系と接触させ、前記化合物の存在下での前記系におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現又はタンパク質活性レベルを決定し；
（２）工程（１）で得られたHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを、前記化合物の非存在下での前記系におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルと比較し；及び
（３）前記化合物の存在下での前記系におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルが前記化合物の非存在下でのものよりも低い場合、これが、前記化合物が炎症性疾患の治療に有用であることを示す。
前記化合物がポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子である、請求項１０記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルが前記サンプル中のHM74 mRNA及び/又はHM74A mRNAの量を測定することによって決定される、請求項１０記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現レベルが前記サンプル中のHM74タンパク質及び/又はHM74Aタンパク質の量を測定することによって決定される、請求項１０記載の方法。
前記タンパク質が配列番号３及び/又は配列番号４によって定義されるものである、請求項１３記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルがニコチン酸の結合を測定することによって決定される、請求項１０記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aのタンパク質活性レベルがHM74/HM74Aのリガンド誘導活性化後にＧタンパク質サブユニットでのGDP-GTP交換を測定することによって決定される、請求項１０記載の方法。
HM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げるのに有効な化合物の、炎症性疾患の治療用薬剤の製造のための使用。
前記化合物がポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子である、請求項１７記載の使用。
炎症性疾患が乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症又は過敏性腸症候群である、請求項１７記載の使用。
薬剤として許容できる基剤と、患者におけるHM74及び/又はHM74Aの遺伝子発現若しくはタンパク質活性レベルを下げる有効量の化合物とを含む医薬組成物。
前記化合物がポリヌクレオチド、RNA干渉剤、アンチセンスRNA、siRNA、抗体若しくはその変異体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド又は非ペプチジル分子である、請求項２０記載の医薬組成物。
容器と、請求項２０記載の医薬組成物と、容器に付随し、かつ、炎症性疾患の治療用組成物の投与方法を示す説明文とを含む包装した製品。