DE60117788T2

DE60117788T2 - Menschliche wingless-ähnliche gene

Info

Publication number: DE60117788T2
Application number: DE60117788T
Authority: DE
Inventors: Klaus DÜCKER
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-05-01
Also published as: CA2407959C; ATE319739T1; EP1278770B1; US20030175805A1; US7033770B2; WO2001083543A1; DE60117788D1; EP1278770A1; JP2003531635A; CA2407959A1; ES2258090T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polypeptide und Polynukleotide, die Polypeptide kodieren, die hier im Folgenden manchmal als "wingless/int 8 D (Wnt-8D)" bezeichnet werden, ihre Verwendung zur Diagnose und Identifikation von Verbindungen, die Agonisten, Antagonisten sein können, die potenziell zur Therapie einsetzbar sind, und die Herstellung solcher Polypeptide und Polynukleotide.
Hintergrund der Erfindung
Das Arzneistoffentdeckungsverfahren macht zurzeit eine grundlegende Revolution durch, da es "funktionelle Genomik" beinhaltet, d.h. Biologie auf Genom- oder Genbasis mit hohem Durchsatz. Dieser Ansatz als Mittel zur Identifikation von Genen und Genprodukten als Therapieziele tritt schnell an die Stelle früherer Ansätze auf Basis der "Positionsklonierung". Ein Phänotyp, der eine biologische Funktion oder genetische Erkrankung ist, wird identifiziert und anschließend auf Basis seiner Genkartenposition bis zu dem verantwortlichen Gen zurückverfolgt.
Die funktionelle Genomik ist stark von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien und den verschiedenen Werkzeugen der Bioinformatik abhängig, um Gensequenzen von potenziellem Interesse aus den vielen inzwischen verfügbaren Molekularbiologie-Datenbanken zu identifizieren. Es besteht ein ständiger Bedarf an der Identifizierung und Charakterisierung weiterer Gene und der mit ihnen zusammenhängenden Polypeptide/Proteine als Ziele für die Arzneistoffentdeckung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Wnt-8D, insbesondere Wnt-8D-Polypeptide und Wnt-8D-Polynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese Polypeptide und Polynukleotide sind hinsichtlich Behandlungsverfahren für bestimmte Erkrankungen von Inte resse, einschließlich Asthma, Alzheimer, Krebs, Kardiomyopathien, Depression, Schizophrenie, allgemeiner psychotischer Störungen, Ischämie, Schlaganfall, Wundheilung, Nierenerkrankungen, Lungenstörungen, aberranter Apoptose, Geweberemodellierung, Stammzelltherapien, im Folgenden als "erfindungsgemäße Erkrankungen" bezeichnet, aber nicht auf diese beschränkt. Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten (z.B. Inhibitoren) unter Verwendung der durch die Erfindung bereitgestellten Materialien und zur Behandlung von Zuständen, die mit einem Wnt-8D-Ungleichgewicht einhergehen, mit den identifizierten Verbindungen. Unter noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Assays zum Nachweis von Erkrankungen, die mit unangemessener Wnt-8D-Akitivität oder unangemessenen Wnt-8D-Spiegeln einhergehen.
Beschreibung der Erfindung
Unter einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Wnt-8D-Polypeptide. Zu diesen Polypeptiden gehören:

(a) ein Polypeptid, das von einem Polynukleotid kodiert wird, das SEQ ID NO 1 enthält;
(b) ein Polypeptid, enthaltend eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2;
(c) ein Polypeptid, enthaltend die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2;
(d) ein Polypeptid mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2;
(e) die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2; und
(f) ein Polypeptid mit einer oder enthaltend eine Polypeptidsequenz, die einen Identitätsindex von 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 oder 0,99 verglichen mit der Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 hat;
(g) Fragmente und Varianten dieser Polypeptide in (a) bis (f).

Es wird angenommen, dass erfindungsgemäße Polypeptide Mitglieder der wingless/int-Polypeptidfamilie sind. Das Maus-int-1-Gen wurde ursprünglich als Locus identifiziert, der durch Insertion des Maus-Brustkrebs-Virus (mouse mammary tumor virus) aktiviert wird. Klonierung und Sequenzierung des Mausgens zeigte dessen hohen Grad an Homologie zum Drosophila-Segmentpolaritätsgen wingless, einem Gen, das an der Musterbildung in Segmenten der sich entwickelnden Fliege beteiligt ist (Mc-Mahon A.P. und Moon R.T., Development 107 Suppl., 161–167, 1989). In den letzten Jahren hat man erkannt, dass int-1 und Wingless zu einer großen Familie verwandter Glykoproteine gehören, die man in Vertebraten und Invertebraten findet. Mit dieser Kenntnis wurden Mitglieder dieser Familie mit einer Verschmelzung von int und Wingless als Wnts neu bezeichnet.
Die Wnt-Signalgebung reguliert die Zellproliferation und -differenzierung in so verschiedenen Spezies, wie Nematoden, Fliegen, Fröschen und Menschen (eine Übersicht siehe in Cadigan, K.M. und Nusse, R., Genes & Dev. 11, 3286–3305, 1997). Die Wnt-Erkennung wird von Mitgliedern der der frizzled-7TM-Domäne-Rezeptorfamilie vermittelt. Cytoplasmatisch wird das Signal über ein komplexes Proteincluster übertragen, das neben anderen Proteinen dishevelled, Axin, GSK-3, adenomatöse Polyposis Coli (APC), β-Catenin/Armadillo und Mitglieder der HMG-Proteinfamilie LEF/TCF enthält (für eine neuere Übersicht der wnt-Signalgebung wird auf Pfeifer, M. und Polakis, P., Science 287, 1606–1609, 2000 verwiesen).
Eine Vielzahl experimenteller Ergebnisse deutet auf verschiedene menschliche Erkrankungen, bei denen eine aberrante wnt-Signalgebung identifiziert wurde. Der deutlichste Erkrankungszusammenhang besteht zwischen wnt-Signalgebung und Krebs. Das Protoonkogen int-1 wurde aufgrund seines bewertbaren Phänotyps identifiziert, bei dem es sich um eine virusinduzierte ektopische Expression handelt, die zu Brustdrüsentumoren führt. Folglich wurden Wnt2, Wnt4, Wnt7b und Wnt10b mit humanen Brustkarzinomen in Zusammenhang gebracht (Huguet, E.L. et al., Cancer Res. 54, 2615–2621, 1994; Bui, T.D. et al., Oncogene 14, 1249–1253, 1997). Humane Kolorektalkrebserkrankungen wurden ebenfalls deutlich mit aberranter wnt-Signalgebung in Zusammenhang gebracht, obwohl diese Tumoren recht oft mit Mutationen nicht in einem wnt-Gen (oder dessen aberranter Expression), sondern in Komponenten der stromabwärts gelegenen intrazellulären Signalübertragungskaskade einhergehen (hauptsächlich Mutationen in APC oder β-Cateninen; Smith, K. et al., Br. J. Cancer 81, 496–502, 1999; Laurent-Puig P. et al., Eur. J. Cancer Prev. Suppl, S39–47, 1999). Inzwischen wurde eine aberrante wnt-Signalgebung in Tumorgeweben von Lunge, Brust, Prostatakarzinomen, Melanomen (Iozzo, R.V. et al., Cancer Res. 55, 3495–3499, 1995), Medulloblastomen (Huang, H. et al., Am. J. Pathol. 156, 433–437, 2000), sporadischem Hepatoblastom (Satoh, S. et al., Nat. Genet. 24, 245–250, 2000; Jeng, Y. et al., Cancer Lett. 152, 45–51, 2000) oder Endometriumtumoren (Bui, T.D. et al., Br. J. Cancer 75, 1131–1136, 1997) gefunden. Interessanterweise zeigen Dkk-Gene -bekannte sezernierte Inhibitoren der wnt-Signalgebung – einen hohen Expressionsspiegel in differenzierten Geweben und sind in Tumorgeweben herunterreguliert (Wang, J. et al., Oncogene 19, 1843–1848, 2000; Tsuji, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 20–24, 2000), was die Rolle der wnt-Signalgebung bei der Proliferation weiter unterstützt.
Neben diesem Krebszusammenhang spielt die wnt-Signalgebung eine grundlegende Rolle bei der Entwicklung. Daher könnten viele Geweberemodellierungsvorgänge beim Erwachsenen durch die Signalkaskade beeinflusst sein. Eine Funktion der wnt-Signalgebung wurde zum Beispiel für die Myogenese (eine Übersicht siehe bei Cossu, G. et al., EMBO J. 18, 6867–6872, 1999), die Herz- (Jaspard, B. et al., Mech. Dev. 90, 263–267, 2000) und die Nierenentstehung (Vainio, S.J. et al., Int. J. Dev. Biol. 43, 419–423, 1999), die Hirnentwicklung sowie axonale Remodellierung und Synaptogenese (Salinas, P.C. et al., Biochem. Soc. Symp. 65, 101–109, 1999; Burden, S.J. et al., Cell 100, 495–497, 2000) gezeigt. Interessanterweise scheint die wnt-Signalgebung im versagenden Nerzen abge schwächt zu sein (Schuhmann, H. et al., Cardiovasc. Res. 45, 720–728, 2000).
Ein weiterer Aspekt der wnt-Signalgebung ist ihr möglicher Zusammenhang mit psychotischen Störungen. Lithiumionen werden seit mehr als 100 Jahren zur Behandlung von Depression verwendet (siehe eine neuere Übersicht in Williams, R.S. und Harwood, A.J., Trends Pharmacot. Sci. 21, 61–64, 2000 und den Bezugsstellen darin). Obwohl die molekulare Wirkung dieser Therapie immer noch unbekannt ist, wurden Hinweise zusammengetragen, dass die Hemmung einer cytoplasmatischen Kinase, Glykogensynthasekinase-3β (GSK3β) das eigentliche Ziel der Lithiumionen darstellen könnte (Chen, G. et al., J. Neurochem. 72, 1327–1330, 1999). Eine Hemmung genau dieser Kinase ist eine der Hauptaktivitäten der wnt-Signalgebung und stützt die Idee, dass eine aberrante wnt-Signalgebung an bipolaren Störungen beteiligt ist. Diese Annahme wird durch einen indirekten Ansatz weiter unterstützt, bei dem die chromosomalen Orte einiger Mitglieder des wnt-Signalgebungsweges Regionen zugeordnet wurden, von denen bekannt ist, dass sie eine Empfänglichkeit für bipolare Störung und Schizophrenie sowie Störungen mit Ursprung in der neuronalen Entwicklung tragen (Rhoads, A.R. et al., Mol. Psychiatry 4, 437–442, 1999). Die GSK-3β-Funktion wird nach wnt-Signalgebung gehemmt, was zu erhöhten Spiegeln von β-Catenin im Cytoplasma und im Kern führt, wo es die Genexpression in Verbindung mit Mitgliedern der HMG-Proteingruppe (siehe oben) stimuliert. Interessanterweise behauptet eine neuere Veröffentlichung, dass die cytoplasmatischen Cateninspiegel in den Subregionen CA3 und CA4 des Hippocampus bei schizophrenen Patienten verringert sind (Cotter, D. et al., Neuroreport 9, 1379–1383, 1998).
Die biologischen Eigenschaften von Wnt-8D werden im Folgenden als "biologische Aktivität von Wnt-8D" oder "Wnt-8D-Aktivität" bezeichnet. Vorzugsweise zeigt ein erfindungsgemäßes Polypeptid mindestens eine biologische Aktivität von Wnt-8D.
Erfindungsgemäße Polypeptide beinhaltet auch Varianten der vorstehend genannten Polypeptide, einschließlich aller allelischen Formen und Spleißvarianten. Solche Polypeptide unterscheiden sich von dem Bezugspolypeptid durch Insertionen, Deletionen und Substitutionen, die konservativ oder nicht-konservativ sein können, oder jede Kombination davon. Besonders bevorzugte Varianten sind solche, in denen mehrere, zum Beispiel von 50 bis 30, von 30 bis 20, von 20 bis 10, von 10 bis 5, von 5 bis 3, von 3 bis 2, von 2 bis 1 oder 1 Aminosäure(n) in einer beliebigen Kombination inseriert, substituiert oder deletiert ist/sind.
Bevorzugte Fragmente von erfindungsgemäßen Polypeptiden beinhalten ein Polypeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 30, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO 2, oder ein Polypeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 30, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, um die die Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO 2 gekürzt ist oder die aus dieser deletiert sind. Bevorzugte Fragmente sind biologisch aktive Fragmente, die die biologische Aktivität von Wnt-8D vermitteln, einschließlich solcher mit einer ähnlichen Aktivität oder einer verbesserten Aktivität oder mit einer verringerten unerwünschten Aktivität. Ebenfalls bevorzugt sind solche Fragmente, die in einem Tier, insbesondere einem Menschen, antigen oder immunogen sind.
Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide können zur Herstellung des entsprechenden Volllängenpolypeptids mittels Peptidsynthese eingesetzt werden; daher können diese Varianten als Zwischenprodukte zur Herstellung der erfindungsgemäßen Volllängenpolypeptide eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können die Form des "reifen" Proteins haben oder ein Teil eines größeren Proteins, wie eines Vorläufers oder eines Fusionsproteins, sein. Es ist oft vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leader-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, zum Beispiel mehrere Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz für die Stabilität während der rekombinanten Herstellung enthält.
Erfindungsgemäße Polypeptide können auf jede geeignete Weise, zum Beispiel durch Isolation aus natürlich vorkommenden Quellen, aus gentechnisch veränderten Wirtszellen, die Expressionssysteme (s.u.) ent halten, oder durch chemische Synthese, zum Beispiel unter Verwendung automatisierter Peptidsynthesizer, oder eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind im Stand der Technik bekannt.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Wnt-8D-Polynukleotide. Zu diesen Polynukleotiden gehören:

(a) ein Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1;
(b) ein Polynukleotid, enthaltend das Polynukleotid mit SEQ ID NO 1;
(c) ein Polynukleotid mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1;
(d) das Polynukleotid mit SEQ ID NO 1;
(e) ein Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(f) ein Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(g) ein Polynukleotid mit einer Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(h) ein Polynukleotid, das das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(i) ein Polynukleotid mit einer oder enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die einen Identitätsindex von 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 oder 0,99 verglichen mit der Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1 hat;
(j) ein Polynukleotid mit einer oder enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptidsequenz kodiert, die einen Identitätsindex von 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 oder 0,99 verglichen mit der Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 hat; und

Polynukleotide, die Fragmente und Varianten der obengenannten Polynukleotide sind oder die zu obengenannten Polynukleotiden über deren gesamte Länge komplementär sind.
Bevorzugte Fragmente von erfindungsgemäßen Polynukleotiden beinhalten ein Polynukleotid, enthaltend eine Nucleotidsequenz mit mindestens 15, 30, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus der Sequenz mit SEQ ID NO 1, oder ein Polynukleotid, enthaltend eine Sequenz mit mindestens 30, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, um die die Sequenz mit SEQ ID NO 1 verkürzt ist oder die aus dieser deletiert sind.
Bevorzugte Varianten von erfindungsgemäßen Polynukleotiden sind u.a. Spleißvarianten, allelische Varianten und Polymorphismen, einschließlich Polynukleotiden mit einem oder mehreren Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs).
Erfindungsgemäße Polynukleotide beinhalten auch Polynukleotide, die Polypeptidvarianten kodieren, die die Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO 2 enthalten und in denen mehrere, zum Beispiel von 50 bis 30, von 30 bis 20, von 20 bis 10, von 10 bis 5, von 5 bis 3, von 3 bis 2, von 2 bis 1 oder 1 Aminosäurerest(e) inseriert, substituiert oder deletiert, in einer beliebigen Kombination, sind.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide bereit, die RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind. Folglich wird ein RNA-Polynukleotid bereitgestellt, das:

(a) ein RNA-Transkript der DNA-Sequenz enthält, die das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(b) das RNA-Transkript der DNA-Sequenz ist, die das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert;
(c) ein RNA-Transkript der DNA-Sequenz mit SEQ ID NO 1 enthält; oder
(d) das RNA-Transkript der DNA-Sequenz mit SEQ ID NO 1 ist;

Die Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1 zeigt Homologie zu MMWNT8DPT (Bouillet, P. et al., Direktsubmissionsgenbank; unveröffentlicht). Die Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1 ist eine cDNA-Sequenz, die das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert. Die Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert, kann identisch zu der polypeptidkodierenden Sequenz mit SEQ ID NO 1 sein oder kann eine andere Sequenz als SEQ ID NO 1 sein, die infolge der Redundanz (Degeneration) des genetischen Codes auch das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert. Das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 ist mit anderen Proteinen der wingless/int-Familie verwandt, die Homologie und/oder Strukturähnlichkeit zu MWN8D_MOUSE besitzen (Bouillet, P. et al., Mech. Dev. 58, 141–152, 1996).
Von bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptiden und Polynukleotiden wird erwartet, dass sie u.a. ähnliche biologische Funktionen/Eigenschaften wie ihre homologen Polypeptide und Polynukleotide besitzen. Ferner haben bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide und Polynukleotide mindestens eine Wnt-8D-Aktivität.
Erfindungsgemäße Polynukleotide können unter Verwendung von Standard-Klonierungs- und Screeningtechniken aus einer cDNA-Bank erhalten werden, die von mRNA in Zellen von humanem Knochenmark, Hirn, Colon, Herz, Niere, Lunge, Muskel, Niere, Pankreas, Prostata, Uterau und Embryonalgewebe stammt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Erfindungsgemäße Polynukleotide können auch aus natürlichen Quellen erhalten werden, wie genomischen DNA-Banken, oder können unter Verwendung bekannter und kommerziell erhältlicher Techniken synthetisiert werden.
Wenn erfindungsgemäße Polynukleotide zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden verwendet werden, kann das Polynukleotid die kodierende Sequenz für das reife Protein selbst oder die kodierende Sequenz für das reife Polypeptid im Leserahmen mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten, beispielsweise solchen, die eine Leader- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz oder andere Fusionspeptidanteile kodieren. Zum Beispiel kann eine Markersequenz kodiert sein, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexa-Histidin-Peptid, wie es in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821–824 beschrieben wird, oder eine HA-Markierung. Das Polynukleotid kann auch nicht-kodierende 5'- und 3'-Sequenzen enthalten, wie transkribierte, untranslatierte Sequenzen, Spleiß- und Polyadenylierungssignale, Ribosomenbindungsstellen und Sequenzen, die mRNA stabilisieren.
Polynukleotide, die identisch mit einer Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1 sind oder ausreichende Identität dazu besitzen, können als Hybridisierungssonden für cDNA und genomische DNA oder als Primer für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion (zum Beispiel PCR) verwendet werden. Solche Sonden und Primer können zur Isolation von Volllängen-cDNAs und genomischen Klonen, die erfindungsgemäße Polypeptide kodieren, und zur Isolation von cDNA- und genomischen Klonen anderer Gene (einschließlich Genen, die Paraloge aus humanen Quellen und Orthologe und Paraloge aus anderen Spezies als Mensch kodieren) verwendet werden, die eine große Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO 1, üblicherweise mindestens 95% Identität, besitzen. Bevorzugte Sonden und Primer enthalten gewöhnlich mindestens 15 Nukelotide, vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide, und können mindestens 50, wenn nicht mindestens 100 Nukleotide enthalten. Besonders bevorzugte Sonden haben zwischen 30 und 50 Nukleotiden. Besonders bevorzugte Primer haben zwischen 20 und 25 Nucleotiden.
Ein Polynukleotid, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einschließlich Homologen aus anderen Spezies als Mensch, kodiert, kann durch ein Verfahren mit den Schritten Screenen einer Bank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz SEQ ID NO 1 oder einem Fragment davon, vorzugsweise mit mindestens 15 Nukleotiden; und Isolieren von Volllängen-cDNA- und genomischen Klonen, die die Polynukleotidsequenz enthalten, erhalten werden. Solche Hybridisierungstechniken sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte stringente Hybridisierungsbedingungen beinhalten Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die Folgendes enthält: 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 Mikrogramm/ml denaturierte und gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C. Somit beinhaltet die vorliegende Erfindung auch isolierte Polynukleotide, vorzugsweise mit einer Nucleotidsequenz von mindestens 100, die mittels Screening einer Bank unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz SEQ ID NO 1 oder einem Fragment davon, vorzugsweise von mindestens 15 Nukleotiden, erhalten werden.
Der Fachmann erkennt, dass in vielen Fällen eine isolierte cDNA-Sequenz dahingehend unvollständig sein wird, dass die Region, die das Polypeptid kodiert, nicht über die gesamte Länge bis zum 5'-Terminus reicht. Dies ist eine Folge der reversen Transkriptase, eines Enzyms mit einer inhärent niedrigen "Prozessivität" (einem Maß für die Fähigkeit des Enzyms, während der Polymerisationsreaktion an die Matrize gebunden zu bleiben), die dabei versagt, eine DNA-Kopie der mRNA-Matrize bei der Erststrang-cDNA-Synthese zu vervollständigen.
Es gibt mehrere verfügbare und dem Fachmann bekannte Verfahren zur Gewinnung von Volllängen-cDNAs oder zur Verlängerung kurzer cDNAs, zum Beispiel solche auf Basis des Verfahrens der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (rapid amplification of cDNA ends, RACE) (siehe beispielsweise Frohman et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 8998–9002, 1988). Neuere Modifikationen der Technik, wie zum Beispiel durch die Marathon- (Warenzeichen) Technologie (Clontech Laboratories Inc.) veranschaulicht, haben die Suche nach längeren cDNAs signifikant vereinfacht. Bei der Marathon- (Warenzeichen) Technologie werden cDNAs aus mRNA, die aus einem gewählten Gewebe extrahiert wurde, und einer an jedes Ende ligierten "Adapter"-Sequenz hergestellt. Dann wird eine Nukleinsäureamplifikation (PCR) durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der cDNA unter Verwendung einer Kombination genspezifischer und adapterspezifischer Oligonukleotidprimer zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung von "geschachtelten" Primern wiederholt, d.h. Primern, die derart gestaltet sind, dass sie innerhalb des amplifizierten Produkts hybridisieren (üblicherweise ein adapterspezifischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz hybridisiert, und ein genspezifischer Primer, der weiter 5' in der bekannten Gensequenz hybridisiert). Die Produkte dieser Reaktion können dann mittels DNA-Sequenzierung analysiert werden, und eine Volllängen-cDNA kann entweder durch Verknüpfen des Produkts direkt mit der bestehenden cDNA unter Bildung einer vollständigen Sequenz oder mittels Durchführen einer getrennten Volllängen-PCR unter Verwendung der neuen Sequenzinformation für die Gestaltung des 5'-Primers konstruiert werden.
Erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren aus gentechnisch veränderten Wirtszellen, die Expressionssysteme enthalten, hergestellt werden. Also betrifft die vorliegende Erfindung unter einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder erfindungsgemäße Polynukleotide enthalten, Wirtszellen, die mit solchen Expressionssystemen gentechnisch verändert sind, und die Produktion von erfindungsgemäßen Polypeptiden durch Rekombinationstechniken. Auch zellfreie Translationssysteme können unter Verwendung von RNAs, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten stammen, zur Herstellung solcher Proteine eingesetzt werden.
Zur rekombinanten Produktion können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, so dass sie Expressionssysteme oder Teile davon für erfindungsgemäße Polynukleotide enthalten. Polynukleotide können in Wirtszellen durch Verfahren eingebracht werden, die in vielen Standard laborhandbüchern beschrieben sind, wie Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) und Sambrook et al. (s.o.). Bevorzugte Verfahren zum Einbringen von Polynukleotiden in Wirtszellen sind u.a. beispielsweise Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, durch kationisches Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "Scrape Loading", ballistisches Einbringen oder Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte sind u.a. Bakterienzellen, wie Streptococci, Staphylococci, E. coli-, Streptomyces- und Bacillus subtilis-Zellen; Pilzzellen, wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen, wie Drosophila-S2- und Spodoptera-Sf9-Zellen; tierische Zellen, wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, HEK-293- und Bowes-Melanomzellen, sowie Pflanzenzellen.
Eine große Vielzahl an Expressionssystemen kann verwendet werden, beispielsweise chromosomale, episomale und von Viren stammende Systeme, z.B. Vektoren, die von bakteriellen Plasmiden, von Bakteriophagen, von Transposons, von Hefe-Episomen, von Insertionselementen, von chromosomalen Hefe-Elementen, von Viren, wie Baculoviren, Papovaviren, wie SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabiesviren und Retroviren stammen, und Vektoren, die von Kombinationen von diesen stammen, beispielsweise solche, die von genetischen Elementen von Plasmiden und Bakteriophagen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie hervorrufen. Gewöhnlich kann jedes System oder jeder Vektor verwendet werden, das/der in der Lage ist, ein Polynukleotid zur Produktion eines Polypeptids in einem Wirt zu erhalten, weiterzugeben oder zu exprimieren. Die geeignete Polynukleotidsequenz kann in ein Expressionssystem durch jede von einer Vielzahl bekannter und Routinetechniken eingebracht werden, wie beispielsweise die in Sambrook et al. (s.o.) dargestellten. Geeignete Sekretionssignale können in das gewünschte Polypeptid eingebracht werden, damit die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, das Periplasma oder die extrazelluläre Umgebung möglich ist. Bei diesen Signalen kann es sich um endogene Signale im Polypeptid oder heterologe Signale handeln.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid für die Verwendung in Screening-Assays exprimiert werden soll, ist gewöhnlich bevorzugt, dass das Polypeptid an der Oberfläche der Zelle produziert wird. In diesem Fall können die Zellen vor der Verwendung bei dem Screening-Assay geerntet werden. Wenn das Polypeptid in das Medium sezerniert wird, kann das Medium gewonnen werden, um das Polypeptid zu gewinnen und zu reinigen. Wenn es intrazellulär produziert wird, müssen die Zellen zuerst lysiert werden, bevor das Polypeptid gewonnen wird.
Erfindungsgemäße Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie. Am stärksten bevorzugt wird zur Reinigung Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt. Bekannte Techniken zur Rückfaltung von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während intrazellulärer Synthese, Isolation und/oder Reinigung denaturiert wurde.
Erfindungsgemäße Polynukleotide können als diagnostische Reagenzien zum Nachweis von Mutationen in dem damit zusammenhängenden Gen verwendet werden. Der Nachweis einer mutierten Form des Gens, das durch das Polynukleotid mit SEQ ID NO 1 in der cDNA- oder der genomischen Sequenz gekennzeichnet ist, die mit einer Dysfunktion einhergeht, liefert ein diagnostisches Werkzeug, das zur Diagnose einer Erkrankung oder Empfänglichkeit für eine Erkrankung beitragen oder diese definieren kann, die sich aus einer Unterexpression, Überexpression oder veränderten räumlichen oder zeitlichen Expression des Gens ergibt. Individuen mit Mutationen in dem Gen können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl an Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, ermittelt werden.
Nukleinsäuren zur Diagnose können aus den Zellen eines Individuums, beispielsweise aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie oder Autopsiematerial, erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden oder kann unter Verwendung von PCR, vorzugsweise RT-PCR, oder anderen Amplifizierungstechniken vor der Analyse enzymatisch amplifiziert werden. Auch RNA oder cDNA kann auf ähnliche Weise eingesetzt werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp ermittelt werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung amplifizierter DNA an markierte Wnt-8D-Nucleotidsequenzen identifiziert werden. Perfekt zueinander passende Sequenzen können von Mismatch-Duplexen durch RNAse-Verdau oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen unterschieden werden. Ein DNA-Sequenzunterschied kann auch durch Veränderungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel oder durch direkte DNA-Sequenzierung nachgewiesen werden (siehe zum Beispiel Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Sequenzänderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nukleaseschutz-Assays, wie RNase- und S1-Schutz, oder durch das chemische Spaltungsverfahren aufgedeckt werden (siehe Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85:4397–4401).
Ein Array von Oligonukleotidsonden, die die Wnt-8D-Polynukleotidsequenz oder Fragmente davon enthalten, kann konstruiert werden, um ein effizientes Screening von z.B. genetischen Mutationen durchzuführen. Solche Arrays sind vorzugsweise hochdichte Arrays oder Grids. Arraytechnologieverfahren sind bekannt und von allgemeiner Anwendbarkeit und können zur Untersuchung einer Vielzahl von Fragen der Molekulargenetik, einschließlich Genexpression, genetischer Verknüpfung und genetischer Variabilität, verwendet werden, siehe zum Beispiel M. Chee et al., Science, 274, 610–613 (1996) und darin zitierte, weitere Bezugsstellen.
Der Nachweis anomal verringerter oder erhöhter Spiegel der Polypeptid- oder mRNA-Expression kann ebenfalls zur Diagnose oder Bestimmung der Empfänglichkeit eines Individuums für eine erfindungsgemäße Erkrankung verwendet werden. Verringerte oder erhöhte Expression kann auf RNA-Ebene unter Verwendung jedes der im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Quantifizierung von Polynukleotiden gemessen werden, wie beispielsweise Nukleinsäureamplifikation, zum Beispiel PCR, RT-PCR, RNAse-Schutz, Northern-Blot und andere Hybridisierungsverfahren. Assaytechniken, die zur Bestimmung der Spiegel eines Proteins, wie des erfindungsgemäßen Polypeptids, in einer Probe verwendet werden können, die von einem Wirt stammt, sind dem Fachmann bekannt. Diese Assayverfahren sind u.a. Radioimmunassays, Konkurrenzbindungsassays, Western-Blot-Analyse und ELISA-Assays.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung unter einem anderen Aspekt ein Diagnosekit, das Folgendes enthält:

(a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, vorzugsweise das Nukleotid mit SEQ ID NO 1 oder ein Fragment oder RNA-Transkript davon;
(b) eine zu derjenigen von (a) komplementäre Nukleotidsequenz;
(c) ein erfindungsgemäßes Polypeptid, vorzugsweise das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 oder ein Fragment davon; oder
(d) einen Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid, vorzugsweise gegen das Polypeptid mit SEQ ID NO 2.

Man erkennt, dass in jedem solchen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine wesentliche Komponente enthalten können. Dieses Kit findet u.a. bei der Diagnose einer Erkrankung oder Empfänglichkeit für eine Erkrankung, insbesondere von erfindungsgemäßen Erkrankungen, Anwendung.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen sind für Chromosomenlokalisationsstudien wertvoll. Die Sequenz wird spezifisch an eine bestimmte Stelle auf einem einzelnen humanen Chromosom dirigiert und kann damit hybridisieren. Die erfindungsgemäße Kartierung relevanter Sequenzen auf Chromosomen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Kor relation solcher Sequenzen mit einer mit einem Gen zusammenhängenden Erkrankung. Wenn eine Sequenz auf einer genauen chromosomalen Stelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit Genkartendaten korreliert werden. Solche Daten findet man beispielsweise in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online erhältlich über Johns Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankungen, die in der gleichen chromosomalen Region kartiert wurden, werden dann mittels Verknüpfungsanalyse (gemeinsame Vererbung physikalisch benachbarter Gene) identifiziert. Genaue Positionen auf humanen Chromosomen können für eine genomische Sequenz (ein Genfragment usw.) unter Verwendung von Radiation-Hybrid- (RH-) Kartierung bestimmt werden (Walter, M., Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., und Goodfellow, P., (1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes, Nature Genetics 7, 22–28). Eine Reihe von RH-Panels ist von Research Genetics (Huntsville, AL, USA) erhältlich, z.B. das Gene-Bridge4-RH-Panel (Hum Mol Genet 1996 März; 5(3):339–46, A radiation hybrid map of the human genome. Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN). Zur Bestimmung des chromosomalen Ortes eines Gens unter Verwendung dieses Panels werden 93 PCRs unter Verwendung von Primern durchgeführt, die von dem Gen von Interesse auf RN-DNAs gestaltet werden. Jede dieser DNAs enthält zufällige Humangenomfragmente, die in einem Hamster-Hintergrund (Human/Hamster-Hybridzelllinien) aufrechterhalten werden. Diese PCRs führen zu 93 Bewertungen, die das Vorliegen oder Fehlen des PCR-Produkts von dem Gen von Interesse anzeigen. Diese Bewertungen werden mit Bewertungen verglichen, die unter Verwendung von PCR-Produkten von genomischen Sequenzen bekannter Position erzeugt werden. Dieser Vergleich erfolgt unter http://www.genome.wi.mit.edu/. Das erfindungsgemäße Gen kartiert auf das humane Chromosom 5q31–5q33 (D5S500–D5S436).
Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen sind ferner wertvolle Werkzeuge für Gewebeexpressionsstudien. Solche Studien gestatten die Bestimmung von Expressionsmustern von erfindungsgemäßen Poly nukleotiden, die einen Hinweis auf die Expressionsmuster der kodierten Proteine in Geweben durch Nachweis der mRNAs, die sie kodieren, geben kann. Die verwendeten Techniken sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten In-situ-Hybridisierungstechniken an Klone, die auf einem Grid angeordnet sind, wie cDNA-Mikroarray-Hybridisierung (Schena of al., Science, 270, 467–470, 1995 und Shalon et al., Genome Res, 6, 639–645, 1996), und Nukleotidamplifikationstechniken, wie PCR. Ein bevorzugtes Verfahren verwendet die von Perkin Elmer erhältliche TAQMAN- (Warenzeichen) Technologie. Die Ergebnisse aus diesen Studien können einen Hinweis auf die normale Funktion des Polypeptids im Organismus erbringen. Zusätzlich können Vergleichsstudien des normalen Expressionsmusters von mRNAs mit demjenigen von mRNAs, die von einer alternativen Form des gleichen Gens (beispielsweise mit einer Veränderung im Polypeptidkodierungspotenzial oder einer regulatorischen Mutation) kodiert werden, wertvolle Einblicke in die Rolle der erfindungsgemäßen Polypeptide oder deren unangemessener Expression bei Erkrankung liefern. Eine solche unangemessene Expression kann zeitlicher, räumlicher oder einfach quantitativer Art sein.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden in Knochenmark, Hirn, Colon, Herz, Niere, Lunge, Muskel, Niere, Pankreas, Prostata, Uterus und Embryonalgewebe exprimiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper. Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder ihre Fragmente oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogene zur Produktion von Antikörpern verwendet werden, die für erfindungsgemäße Polypeptide immunspezifisch sind. Der Begriff "immunspezifisch" bedeutet, dass die Antikörper eine erheblich größere Affinität zu den erfindungsgemäßen Polypeptide als zu anderen verwandten Polypeptiden des Standes der Technik haben.
Gegen erfindungsgemäße Polypeptide erzeugte Antikörper können durch Verabreichen der Polypeptide oder von epitoptragenden Fragmenten oder Zellen an ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches Tier, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede Technik verwendet werden, die Antikörper liefert, die von kontinuierlichen Zelllinienkulturen produziert werden. Beispiele sind u.a. die Hybridomtechnik (Köhler, G. und Milstein, C., Nature (1975) 256:495–497), die Triomtechnik, die humane B-Zellhybridomtechnik (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77–96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Techniken zur Produktion einkettiger Antikörper, wie der im U.S.-Patent Nr. 4,946,778 beschriebenen, können auch an die Produktion einkettiger Antikörper gegen erfindungsgemäße Polypeptide angepasst werden. Auch transgene Mäuse oder andere Organismen, einschließlich anderer Säuger, können zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper können zur Isolation oder Identifikation von Klonen, die das Polypeptid exprimieren, oder zur Reinigung der Polypeptide mittels Affinitätschromatographie eingesetzt werden. Antikörper gegen erfindungsgemäße Polypeptide können auch zur Behandlung von u.a. erfindungsgemäßen Erkrankungen eingesetzt werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide und Polynukleotide können auch als Impfstoffe verwendet werden. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung unter einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Säuger, welches das Impfen des Säugers mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid beinhaltet, das zur Erzeugung einer Antikörper- und/oder T-Zell-Immunantwort, einschließlich beispielsweise cytokinproduzierender T-Zellen oder cytotoxischer T-Zellen, angemessen ist, so dass das Tier vor Erkrankung geschützt ist, ungeachtet dessen, ob die Erkrankung in dem Individuum bereits besteht oder nicht. Eine Immunantwort in einem Säuger kann auch durch ein Verfahren induziert werden, das das Zuführen eines erfindungsgemäßen Polypeptides über einen Vektor beinhaltet, der in vivo die Expression des Polynukleotids dirigiert und das Polypeptid kodiert, so dass eine derartige Immunantwort zur Produktion von Antikörper zum Schutz des Tieres vor erfindungsgemäßen Erkrankungen induziert wird. Eine Weise zur Verabreichung des Vektors ist, ihn als Beschichtung auf Partikeln oder anderweitig beschleunigt in die gewünschten Zellen einzubringen. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, eine modifizierte Nukleinsäure oder ein DNA-RNA-Hybrid enthalten. Zur Verwendung als Impfstoff wird ein Polypeptid oder ein Nukleinsäurevektor gewöhnlich als Impfstoffformulierung (-zusammensetzung) bereitgestellt. Die Formulierung kann ferner einen geeigneten Träger enthalten. Weil ein Polypeptid im Magen abgebaut werden kann, wird es vorzugsweise parenteral (zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder intradermale Injektion) verabreicht. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen sind u.a. wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des Empfängers isotonisch machen; sowie wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel oder Verdickungsmittel enthalten können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern dargereicht werden, beispielsweise in verschlossenen Ampullen und Gefäßen, und können in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Die Impfstoffformulierung kann auch Adjuvanssysteme zur Verstärkung der Immunogenität der Formulierung enthalten, wie Öl-in-Wasser-Systeme und andere im Stand der Technik bekannte Systeme. Die Dosierung hängt von der spezifischen Aktivität des Impfstoffs ab und kann durch Routineexperimente leicht bestimmt werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide haben eine oder mehrere biologische Funktionen, die bei einem oder mehreren Erkrankungszuständen, insbesondere den hier vorstehend genannten erfindungsgemäßen Erkrankungen, relevant sind. Daher ist es vorteilhaft, Verbindungen zu identifizieren, die die Funktion oder den Spiegel des Polypeptids stimulieren oder hemmen. Folglich stellt die vorliegende Erfindung unter einem weiteren Aspekt ein Verfahren für das Screening von Verbindungen bereit, um solche zu identifizieren, die die Funktion oder den Spiegel des Polypeptids stimulieren oder hemmen. Solche Verfahren identifizieren Agonisten oder Antagonisten, die zu therapeutischen und prophylaktischen Zwecken bei solchen erfindungsgemäßen Erkrankungen, wie hier vorstehend erwähnt, eingesetzt werden können. Verbindungen können aus einer Vielzahl von Quellen identifiziert werden, zum Beispiel Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Banken, Sammlungen chemischer Verbindungen und Naturproduktgemischen. Die derart identifizierten Agonisten oder Antagonisten können, je nachdem, natürliche oder modifizierte Substrate, Liganden, Rezeptoren, Enzyme usw. des Polypeptids, ein Struktur- oder Funktionsmimetikum davon (siehe Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Kapitel 5 (1991)) oder ein kleines Molekül sein.
Das Screening-Verfahren kann einfach die Bindung einer Kandidatenverbindung an das Polypeptid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid tragen, oder an ein Fusionsprotein davon mithilfe einer Markierung, die direkt oder indirekt mit der Kandidatenverbindung verbunden ist, messen. Alternativ kann das Screening-Verfahren das Messen oder (qualitative oder quantitative) Nachweisen der konkurrierenden Bindung der Kandidatenverbindung an das Polypeptid gegen einen markierten Konkurrenten (z.B. Agonisten oder Antagonisten) beinhalten. Ferner können diese Screening-Verfahren unter Verwendung von Nachweissystemen, die für die das Polypeptid tragenden Zellen angemessen sind, testen, ob die Kandidatenverbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder Hemmung des Polypeptids erzeugt wird. Inhibitoren der Aktivierung werden gewöhnlich in Gegenwart eines bekannten Agonisten getestet, und die Wirkung auf die Aktivierung durch den Agonisten durch die Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird beobachtet. Ferner können die Screening-Verfahren einfach die Schritte des Mischens einer Kandidatenverbindung mit einer Lösung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, unter Bildung eines Gemischs, des Messens einer Wnt-8D-Aktivität in dem Gemisch und des Vergleichens der Wnt-8D-Aktivität des Gemischs mit einem Kontrollgemisch, das keine Kandidatenverbindung enthält, beinhalten.
Erfindungsgemäße Polypeptide können bei herkömmlichen Screening-Verfahren mit niedriger Kapazität und auch bei Hochdurchsatz-Screening-(HTS-) Formaten eingesetzt werden. Diese HTS-Formate beinhalten nicht nur die bekannte Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 und, seit neuerem, 384 Vertiefungen, sondern auch neu aufkommende Verfahren, wie das von Schullek et al., Anal Biochem., 246, 20–29 (1997) beschriebene Nanovertiefungsverfahren.
Fusionsproteine, beispielsweise solche, die aus einem Fc-Abschnitt und einem Wnt-8D-Polypeptid, wie hier vorstehend beschrieben, hergestellt sind, können ebenfalls für Hochdurchsatz-Screening-Assays zur Identifizierung von Antagonisten für das erfindungsgemäße Polypeptid verwendet werden (siehe D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52–58 (1995) und K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459–9471 (1995)).
Screening-Techniken
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper gegen das Polypeptid können auch zur Konfiguration von Screening-Verfahren zum Nachweis der Wirkung zugegebener Verbindungen auf die Produktion von mRNA und Polypeptid in Zellen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein ELISA-Assay zum Messen sezernierter oder mit Zellen verbundener Spiegel an Polypeptid unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren konstruiert werden. Dies kann zur Entdeckung von Mitteln, die die Polypeptidproduktion hemmen oder verstärken, (auch als Antagonst bzw. Agonist bezeichnet) aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann zur Identifikation membrangebundener oder löslicher Rezeptoren, wenn vorhanden, durch im Stand der Technik bekannte Standard-Rezeptor-Bindungstechniken verwendet werden. Dazu gehören Ligandenbindungs- und Vernetzungsassays, wobei das Polypeptid mit einem radioaktiven Isotop (zum Beispiel ¹²⁵I) markiert, chemisch modifiziert (zum Beispiel biotinyliert) oder an eine Peptidsequenz fusioniert wird, die sich zum Nachweis oder zur Reinigung eignet, und mit einer Quelle des mutmaßlichen Rezeptors (Zellen, Zellmembranen, Zellüberstände, Gewebeextrakte, Körperflüssigkeiten) inkubiert wird, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Verfahren beinhalten biophysikalische Techniken, wie Oberflächen-Plasmonresonanz und Spektroskopie. Diese Screening-Verfahren können auch zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten des Polypeptids verwendet werden, die mit der Bindung des Polypeptids an seine Rezeptoren, wenn vorhanden, konkurrieren. Standardverfahren zur Durchführung solcher Assays sind im Stand der Technik bekannt.
Beispiele für Antagonisten erfindungsgemäßer Polypeptide sind u.a. Antikörper oder, in einigen Fällen, Oligonukleotide oder Proteine, die, je nachdem, mit den Liganden, Substraten, Rezeptoren, Enzymen usw. des Polypeptids nah verwandt sind, z.B. ein Fragment der Liganden, Substrate, Rezeptoren, Enzyme usw.; oder ein kleines Molekül, das an das erfindungsgemäße Polypeptid bindet, aber keine Reaktion auslöst, so dass die Aktivität des Polypeptids verhindert wird.
Screening-Verfahren können auch die Verwendung von Transgentechnologie und Wnt-8D-Gen beinhalten. Die Technik zur Konstruktion transgener Tiere ist gut etabliert. Zum Beispiel kann das Wnt-8D-Gen durch Mikroinjektion in den männlichen Pronukleus befruchteter Oozyten, retroviralen Transfer in Prä- oder Postimplantationsembryonen oder Injektion von beispielsweise durch Elektroporation genetisch modifizierten embryonalen Stammzellen in Wirtsblastozysten eingebracht werden. Besonders geeignete transgene Tiere sind so genannten "Knock-in"-Tiere, wobei ein tierisches Gen durch das humane Äquivalent im Genom des Tiers ersetzt worden ist. Transgene Knock-in-Tiere eignen sich für Arzneistoffentdeckungsverfahren, zur Zielvalidierung, wobei die Verbindung für das humane Ziel spezifisch ist. Andere geeignete transgene Tiere sind so genannte Knock-out-Tiere, bei denen die Expression des tierischen Orthologs eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das von einer endogenen DNA-Sequenz in einer Zelle kodiert wird, teilweise oder vollständig beseitigt wird. Das Gen-Knock-out kann auf spezifische Zellen oder Gewebe zielgerichtet sein, kann infolge der Beschränkungen der Technologie nur in bestimmten Zellen oder Geweben auftreten oder kann in allen oder im Wesentlichen allen Zellen des Tiers auftreten. Die Tiertransgentechnologie bietet auch ein Gesamt-Tier-Expressionskloniersystem, wobei eingebrachte Gene so exprimiert werden, dass große Mengen an erfindungsgemäßen Polypeptiden erhalten werden.
Screening-Kits für die Verwendung bei den vorstehend beschriebenen Verfahren bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Diese Screening-Kits enthalten:

(a) ein erfindungsgemäßes Polypeptid;
(b) eine rekombinante Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert;
(c) eine Zellmembran, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert; oder
(d) einen Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid;

Man erkennt, das in jedem derartigen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine wesentliche Komponente enthalten können.
Glossar
Die folgenden Definitionen werden zum leichteren Verständnis bestimmter Begriffe bereitgestellt, die hier vorstehend häufig verwendet wurden.
"Antikörper", wie hier verwendet, beinhaltet polyklonale und monoklonale Antikörper, chimäre, einkettige und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab- oder Immunglobulinexpressionsbank.
"Isoliert" bedeutet "durch die Hand eines Menschen aus seinem Naturzustand verändert", d.h. wenn es in der Natur vorkommt, wurde es verändert oder aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt oder beides. Zum Beispiel ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Organismus vorkommt, nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, getrennt von den gleichzeitig mit ihm vorkommenden Materialien seines Naturzustands, ist "isoliert", so wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das durch Transformation, genetische Manipulation oder durch irgendein anderes Rekombinationsverfahren in einen Organismus eingebracht wird, "isoliert", sogar wenn es immer noch in dem Organismus vorliegt, wobei der Organismus lebendig oder nicht-lebendig sein kann.
"Polynukleotid" betrifft allgemein jedes Polyribonukleotid (RNA) oder Polydesoxyribonukleotid (DNA), das unmodifizierte oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. "Polynukleotide" beinhalten, ohne Beschränkung, einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die eine Mischung von einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die eine Mischung von einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybridmoleküle, die DNA und RNA enthalten, die einzelsträngig oder üblicher doppelsträngig oder eine Mischung von einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann. Zusätzlich betrifft "Polynukleotid" dreisträngige Regionen, die RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA enthalten. Der Begriff "Polynukleotid" beinhaltet auch DNAs oder RNAs, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten, und DNAs oder RNAs mit Grundgerüsten, die wegen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert sind. "Modifizierte" Basen sind u.a. beispielsweise tritylierte Basen und ungewöhnliche Basen, wie Inosin. Eine Vielzahl von Modifikationen kann an DNA und RNA vorgenommen werden; also beinhaltet "Polynukleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynukleotiden, wie man sie üblicherweise in der Natur findet, sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen charakteristisch sind. "Polynukleotid" beinhaltet auch relativ kurze Polynukleotide, die oft als Oligonukleotide bezeichnet werden.
"Polypeptid" betrifft jedes Polypeptid, das zwei oder mehr Aminosäuren enthält, die durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen miteinander verbunden sind, d.h. Peptidisostere. "Polypeptid" betrifft sowohl kurze Ketten, die allgemein als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, und längere Ketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere Aminosäuren, als die 20 von Genen kodierten Aminosäuren enthalten. "Polypeptide" beinhalten Aminosäuresequenzen, die entweder durch natürliche Vorgänge, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Modifizierungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert sind. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten und in detaillierteren Monographien sowie in einer umfangreichen Forschungsliteratur beschrieben. Modifikationen können überall in einem Polypeptid, einschließlich dem Peptidgrundgerüst, der Aminosäureseitenketten und der Amino- oder Carboxyltermini, vorkommen. Man erkennt, dass der gleiche Typ der Modifikation im gleichen oder in unterschiedlichen Graden an mehreren Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorkommen kann. Ferner kann ein gegebenes Polypeptid viele Typen von Modifikationen enthalten. Polypeptide können infolge von Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können, mit oder ohne Verzweigung, zyklisch sein. Zyklische, verzweigte und verzweigte zyklische Polypeptide können sich aus posttranslationalen natürlichen Vorgängen hervorgegangen sein oder durch Syntheseverfahren hergestellt werden. Zu den Modifikationen gehören Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, Biotinylierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Einheit, kovalente Bindung eines Nukleotids oder Nukleotidderivats, kovalente Bindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatidylinositol, Vernetzung, Zyklisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Hinzufügung von Aminosäuren an Proteine, wie Arginylierung und Ubiquitinierung (siehe beispielsweise Proteins-Structure and Molecular Properties, 2. Aufl., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1–12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626–646, 1990, und Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci, 663, 48–62, 1992).
"Fragment" einer Polypeptidsequenz betrifft eine Polypeptidsequenz, die kürzer als die Bezugssequenz ist, aber im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das Bezugspolypeptid beibehält. "Fragment" einer Polynukleotidsequenz betrifft eine Polynukleotidsequenz, die kürzer als die Bezugssequenz mit SEQ ID NO 1 ist.
"Variante" betrifft ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von dem Bezugspolynukleotid oder -polypeptid unterscheidet, aber dessen wesentliche Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von dem Bezugspolynukleotid. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines von dem Bezugspolynukleotid kodierten Polypeptids verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, Fusionen und Verkürzungen in dem von der Bezugssequenz kodierten Polypeptid führen, wie vorstehend erläutert. Eine übliche Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von dem Bezugspolypeptid. Im allgemeinen sind Veränderungen beschränkt, so dass die Sequenzen des Bezugspolypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Bezugspolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Insertionen, Deletionen in beliebiger Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code kodiert wird, oder nicht. Übliche konservative Substitutionen sind u.a. Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe und Tyr. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann natürlich vorkommend sein, wie ein Allel, oder kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich vorkommt. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder direkte Synthese hergestellt werden. Ebenfalls unter die Varianten fallen Polypeptide mit einer oder mehreren posttranslationalen Modifikationen, zum Beispiel Glycosylierung, Phosphorylierung, Methylierung, ADP-Ribosylierung und dergleichen. Ausführungsformen beinhalten Methylierung der N-terminalen Aminosäure, Phosphorylierungen von Serinen und Threoninen und Modifikation C-terminaler Glycine.
"Allel" betrifft eine oder mehrere alternative Formen eines Gens, die an einem gegebenen Locus im Genom vorkommen.
"Polymorphismus" betrifft eine Variation in der Nukleotidsequenz (und der kodierten Polypeptidsequenz, wenn anwendbar) an einer gegebenen Position im Genom innerhalb einer Population.
"Einzelnukleotidpolymorphismus" (single nucleotide polymorphism, SNP) betrifft das Auftreten von Nukleotidvariabilität an einer einzelnen Nukleotidposition im Genom innerhalb einer Population. Ein SNP kann innerhalb eines Gens oder in intergenischen Regionen des Genoms auftreten. SNPs können unter Verwendung von allelspezifischer Amplifikation (ASA) getestet werden. Für das Verfahren werden mindestens 3 Primer benötigt. Ein gemeinsamer Primer wird in reverser Orientierung komplementär zu dem untersuchten Polymorphismus verwendet. Dieser gemeinsame Primer kann zwischen 50 und 1500 bp von der polymorphen Base entfernt liegen. Die anderen beiden (oder mehr) Primer sind miteinander identisch, ausgenommen dass die endständige 3'-Base variabel ist, so dass sie zu einem der zwei (oder mehreren) Allele passt, die den Polymorphismus bilden. Zwei (oder mehr) PCR-Reaktionen werden dann an Proben-DNA durchgeführt, wobei jede den gemeinsamen Primer und einen der allelspezifischen Primer verwendet.
"Spleißvariante", wie hier verwendet, betrifft cDNA-Moleküle, die von RNA-Molekülen hergestellt werden, die ursprünglich von der gleichen genomischen DNA-Sequenz transkribiert werden, aber einem alternativen RNA-Spleißen unterzogen wurden. Alternatives RNA-Spleißen tritt auf, wenn ein primäres RNA-Transkript, gewöhnlich zur Entfernung von Introns, einem Spleißen unterzogen wird, was zur Produktion von mehr als einem RNA-Molekül führt, von denen jedes eine andere Aminosäuresequenz kodiert. Der Begriff Spleißvariante betrifft auch die von den vorstehenden cDNA-Molekülen kodierten Proteine.
"Identität" spiegelt eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynukleotidsequenzen wider, die mittels Vergleichen der Sequenzen ermittelt wird. Im Allgemeinen betrifft Identität eine genaue Nukleotid-zu-Nukleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Entsprechung der beiden Polynukleotid- bzw. der beiden Polypeptidsequenzen über die Länge der verglichenen Sequenzen.
"% Identität" – Bei Sequenzen, bei denen es keine genaue Entsprechung gibt, wird "% Identität" bestimmt. Gewöhnlich werden die beiden zu vergleichenden Sequenzen aneinander ausgerichtet, so dass maximale Korrelation zwischen den Sequenzen erhalten wird. Dies kann auch das Einführen von "Lücken" in einer oder beiden Sequenzen beinhalten, um den Grad der Ausrichtung (Alignment) zu erhöhen. % Identität kann über die gesamte Länge jeder der verglichenen Sequenzen bestimmt werden (so genanntes globales Alignment), was besonders für Sequenzen der gleichen oder sehr ähnlicher Länge geeignet ist, oder über kürzere definierte Längen (so genanntes lokales Alignment), was sich für Sequenzen ungleicher Länge besser eignet.
"Ähnlichkeit" ist ein weiteres, komplizierteres Maß für die Beziehung zwischen zwei Polypeptidsequenzen. Im Allgemeinen bedeutet "Ähnlichkeit" einen Vergleich zwischen den Aminosäuren von zwei Polypeptidketten, wobei Rest mit Rest verglichen wird und nicht nur genaue Entsprechungen zwischen Paaren von Resten, einem von jeder der verglichenen Sequenzen, berücksichtigt werden (wie bei der Identität), sondern auch, wenn es keine genaue Entsprechung gibt, ob bezogen auf die Evolution ein Rest ein wahrscheinlicher Ersatz für den anderen ist. Mit dieser Wahrscheinlichkeit ist eine "Bewertung" verbunden, aus der dann "% Ähnlichkeit" der beiden Sequenzen bestimmt werden kann.
Verfahren zum Vergleich der Identität und Ähnlichkeit von zwei oder mehreren Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt. So können zum Beispiel Programme, die im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devereux J et al., Nucleic Acids Res, 12, 387–395, 1984, von Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA erhältlich) verfügbar sind, zum Beispiel die Programme BESTFIT und GAP, zur Bestimmung von % Identität zwischen zwei Polynukleotiden und % Identität und % Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen verwendet werden. BESTFIT verwendet den "lokale Homologie"-Algorithmus von Smith und Waterman (J Mol Biol, 147, 195–197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482–489, 1981) und findet die beste Einzelregion mit Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen. BESTFIT eignet sich mehr für den Vergleich von zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidsequenzen mit unterschiedlicher Länge, wobei das Programm annimmt, dass die kürzere Sequenz ein Teil der längeren ist. Dagegen richtet GAP zwei Sequenzen aneinander aus und findet eine "maximale Ähnlichkeit" gemäß dem Algorithmus von Neddleman und Wunsch (J Mol Biol, 48, 443–453, 1970). GAP eignet sich mehr für den Vergleich von Sequenzen, die etwa die gleiche Länge haben und bei denen ein Alignment über die gesamte Länge erwartet wird. Vorzugsweise betragen die Parameter "Lücken-Gewicht" und "Längen-Gewicht", die in jedem Programm verwendet werden, 50 und 3 für Polynukleotidsequenzen bzw. 12 und 4 für Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise werden % Identitäten und Ähnlichkeiten bestimmt, wenn die beiden verglichenen Sequenzen optimal aneinander ausgerichtet sind.
Andere Programme zur Bestimmung von Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel die BLAST-Programmfamilie (Altschul S F et al., J Mol Biol, 215, 403–410, 1990, Altschul S F et al., Nucleic Acids Res., 25:389–3402, 1997, vom National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, USA erhältlich und auf der Homepage des NCBI unter www.ncbi.nlm.nih.gov verfügbar) und FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63–99, 1990; Pearson W R und Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444–2448, 1988, als Teil des Wisconsin Sequence Analysis Package erhältlich).
Vorzugsweise wird die BLOSUM62-Aminosäuresubstitutionsmatrix (Henikoff Sund Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915–10919, 1992) bei Polypeptidsequenzvergleichen und auch, wenn Nukleotid sequenzen vor dem Vergleich zunächst in Aminosäuresequenzen translatiert werden, verwendet.
Vorzugsweise wird das Programm BESTFIT zur Bestimmung von % Identität einer in Frage kommenden Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz in Bezug auf eine Bezugspolynukleotid- oder -polypeptidsequenz verwendet, wobei die angefragte und die Bezugssequenz optimal aneinander ausgerichtet werden und die Parameter des Programms als Standardwert eingestellt, wie hier vorstehend beschrieben.
"Identitätsindex" ist ein Maß für die Sequenzverwandtschaft, die zum Vergleich einer Kandidatensequenz (Polynukleotid oder Polypeptid) mit einer Bezugssequenz verwendet werden kann. So ist zum Beispiel ein Kandidatenpolynukleotid mit beispielsweise einem Identitätsindex von 0,95 verglichen mit einer Bezugspolynukleotidsequenz identisch mit der Bezugssequenz, ausgenommen dass die Kandidatenpolynukleotidsequenz durchschnittlich bis zu fünf Unterschiede pro jeweils 100 Nukleotide der Bezugssequenz aufweisen kann. Diese Unterschiede werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus mindestens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht. Diese Unterschiede können an 5'- oder 3'terminalen Positionen der Bezugspolynukleotidsequenz oder an einer beliebigen Stelle zwischen diesen endständigen Positionen entweder einzeln verteilt unter den Nukleotiden in der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Bezugssequenz auftreten. Anders gesagt, können, damit eine Polynukleotidsequenz mit einem Identitätsindex von 0,95 verglichen mit einer Bezugspolynukleotidsequenz erhalten wird, durchschnittlich bis zu 5 in jeweils 100 Nukleotiden der Bezugssequenz deletiert, substituiert oder inseriert sein, oder jede Kombination davon, wie hier vorstehend beschrieben. Das Gleiche gilt mutatis mutandis für andere Werte des Identitätsindex, beispielsweise 0,96, 0,97, 0,98 und 0,99.
Ebenso ist für ein Polypeptid eine Kandidatenpolypeptidsequenz mit beispielsweise einem Identitätsindex von 0,95 verglichen mit einer Bezugspolypeptidsequenz identisch mit der Bezugssequenz, ausge nommen dass die Polypeptidsequenz durchschnittlich bis zu fünf Unterschiede pro jeweils 100 Aminosäuren der Bezugssequenz enthalten kann. Solche Unterschiede werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus mindestens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativer und nicht-konservativer Substitution, oder -insertion besteht. Diese Unterschiede können an den amino- oder carboxyterminalen Positionen der Bezugspolypeptidsequenz oder an einer beliebigen Stelle zwischen diesen endständigen Positionen entweder einzeln verteilt unter den Aminosäuren in der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Bezugssequenz auftreten. Anders gesagt, können, damit eine Polypeptidsequenz mit einem Identitätsindex von 0,95 verglichen mit einer Bezugspolypeptidsequenz erhalten wird, durchschnittlich bis zu 5 in jeweils 100 Nukleotiden der Bezugssequenz deletiert, substituiert oder inseriert sein, oder jede Kombination davon, wie hier vorstehend beschrieben. Das Gleiche gilt mutatis mutandis für andere Werte des Identitätsindex, beispielsweise 0,96, 0,97, 0,98 und 0,99.
Die Beziehung zwischen der Anzahl an Nukleotid- oder Aminosäureunterschieden und dem Identitätsindex kann in der folgenden Gleichung ausgedrückt werden: na ≤ xa – (xa·I),worin:

n_a: die Anzahl an Nukleotid- oder Aminosäureunterschieden ist,
x_a: die Gesamtzahl an Nukleotiden oder Aminosäuren in SEQ (D NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 ist,
I: der Identitätsindex ist,
·: das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und

_a

"Homolog" ist ein generischer Begriff, der auf dem Fachgebiet verwendet wird, um darauf hinzuweisen, dass eine Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz einen hohen Grad an Sequenzverwandtschaft mit einer Bezugssequenz besitzt. Diese Verwandtschaft kann durch Bestimmung des Grades an Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen, wie hier vorstehend definiert, quantifiziert werden. Unter den generischen Begriff fallen die Begriffe "Ortholog" und "Paralog". "Ortholog" betrifft ein Polynukleotid oder Polypeptid, das das funktionelle Äquivalent des Polynukleotids oder Polypeptids in einer anderen Spezies ist. "Paralog" betrifft ein Polynukleotid oder Polypeptid, das innerhalb der gleichen Spezies funktionell ähnlich ist.
"Fusionsprotein" betrifft ein Protein, das von zwei nicht verwandten, fusionierten Genen oder Fragmenten davon kodiert wird. Beispiele sind in US 5541087 , 5726044 offenbart. Im Fall von Fc-Wnt-8D ist der Einsatz einer Immunglobulin-Fc-Region als Teil eines Fusionsproteins vorteilhaft zur Durchführung der funktionellen Expression von Fc-Wnt-8D oder Fragmenten von Wnt-8D, um pharmakokinetische Eigenschaften eines solchen Fusionsproteins zu verbessern, wenn es zur Therapie eingesetzt wird, und um ein dimeres Wnt-8D zu erzeugen. Das Fc-Wnt-8D-DNA-Konstrukt enthält in 5'- nach 3'-Richtung eine Sekretionskassette, d.h. eine Signalsequenz, die den Export aus einer Säugerzelle auslöst, DNA, die ein Fragment der Immunglobulin-Fc-Region kodiert, als Fusionspartner und eine DNA, die Wnt-8D oder Fragmente davon kodiert. Bei einigen Anwendungen ist es wünschenswert, dass man die intrinsischen funktionellen Eigenschaften (Komplementbindung, Fc-Rezeptor-Bindung) durch Mutieren der funktionellen Fc-Stellen verändern kann, während der Rest des Fusionsproteins unberührt bleibt, oder den Fc-Teil nach der Expression vollständig deletieren kann.
SEQUENZPROTOKLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus einer der Gruppen bestehend aus: (a) einem isolierten Polypeptid, das von einem Polynukleotid kodiert wird, das SEQ ID NO 1 enthält; (b) einem isoliertem Polypeptid, enthaltend eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2; (c) einem isolierten Polypeptid mit mindestens 95% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2; und (d) der Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, enthaltend die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, das die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 ist.
Isoliertes Polynukleotid, ausgewählt aus einer der Gruppen, bestehend aus: (a) einem isolierten Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz mit mindestens 95% Identität zur Polynukleotidsequenz mit SEQ ID NO 1; (b) einem isolierten Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zum Polynukleotid mit SEQ ID NO 1; (c) einem isolierten Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 kodiert. (d) einem isolierten Polynukleotid mit einer Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptidsequenz mit mindestens 95% Identität zur Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO 2 kodiert; (e) einem Polynukleotid, das das RNA-Äquivalent eines Polynukleotids von (a) bis (d) ist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem isolierten Polynukleotid, enthaltend das Polynukleotid mit SEQ ID NO 1; (b) dem isolierten Polynukleotid mit SEQ ID NO 1; (c) einem isolierten Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, die für das Polypeptid mit SEQ ID NO 2 kodiert; und (d) einem isolierten Polynukleotid, das für das Polynukleotid mit SEQ ID NO 2 kodiert.
Expressionssystem, enthaltend ein Polynukleotid, das ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodieren kann, wenn sich der Expressionsvektor in einer kompatiblen Wirtszelle befindet.
Rekombinante Wirtszelle, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 6, oder eine Membran davon, die das Polypeptid nach Anspruch 1 exprimiert.
Verfahren zur Produktion eines Polypeptids nach Anspruch 1, enthaltend den Schritt Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids ausreichen, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Anzuchtmedium.
Fusionsprotein, bestehend aus der Immunglobulin Fc-Region und einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Antikörper, der für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 immunspezifisch ist.
Screening-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Funktion oder den Spiegel an Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 stimulieren oder hemmen, enthaltend ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) quantitatives oder qualitatives Messen oder Nachweis der Bindung einer Kandidatenverbindung an das Polypeptid (oder an die Zellen oder Membranen, die das Polypeptid exprimieren) oder eines Fusionsproteins davon mit Hilfe einer Markierung, die direkt oder indirekt an die Kandidatenverbindung gebunden ist; (b) Messen der Konkurrenz der Bindung einer Kandidatenverbindung an das Polypeptid (oder an die Zellen oder Membranen, die das Polypeptid exprimieren) oder an ein Fusionsprotein davon, in der Gegenwart eines markierten Kompetitors; (c) Testen, ob die Kandidatenverbindung ein Signal ergibt, das durch Aktivierung oder Hemmung des Polypeptids erzeugt wird, mit Hilfe von Nachweissystemen, die sich für die Zellen oder Zellmembranen, die das Polynukleotid exprimieren, eignen; (d) Mischen einer Kandidatenverbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, so dass man ein Gemisch erhält, Messen der Aktivität des Polypeptids in dem Gemisch und Vergleichen der Aktivität des Gemischs mit einem Kontrollgemisch, das keine Kandidaten-Verbindung enthält; oder (e) Nachweis der Wirkung einer Kandidatenverbindung auf die Herstellung von mRNA, die für das Polypeptid kodiert oder von Polypeptid in Zellen, beispielsweise mit Hilfe eines BLISA-Tests und (f) Herstellen der Verbindung nach biotechnologischen oder chemischen Standardtechniken.