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Adulte
neuronale Stammzellen wurden bereits aus verschiedenen Regionen
des Gehirns isoliert (zur Übersicht
siehe (Gage FH, 2000, Science, 287, 1433–1438; Ostenfeld T and Svendsen
CN, 2003, Adv Tech Stand Neurosurg, 28, 3–89)), unter anderem auch dem
Hippocampus des Säugergehirns
(Eriksson PS et al., 1998, Nat Med, 4, 1313–1317; Gage FH et al., 1995,
Proc Natl Acad Sci USA, 92, 11879–11883; Johansson CB et al.,
1999, Exp Cell Res, 253, 733–736).
Diese Zellen besitzen, im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen,
nicht mehr das Potenzial, zu allen Zelltypen des Körpers zu
differenzieren (Totipotenz); sie können jedoch zu den verschiedenen
im Gehirn vorkommenden Zelltypen differenzieren (Pluripotenz). Dabei
erfahren sie wesentliche morphologische und funktionelle Veränderungen
(van Praag H et al., 2002, Nature, 415, 1030–1034).
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Durch
die Verwendung von neuronalen Stammzellen können ethische Probleme, wie
sie bei der Verwendung von embryonalen Stammzellen in der Medizin
bzw. der Biotechnologie auftreten, umgangen werden (Heinemann T
and Honnefelder L, 2002, Bioethics, 16, 530–543).
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Andere
Methoden der Differenzierung und selektiven Anreicherung neuronaler
Zellen enthalten kompliziertere Differenzierungsprotokolle (Björklund A
and Lindvall O, 2000, Nat Neurosci, 3, 537–544; Björklund A and Lindvall O, 2000,
Nature, 405, 892–893,
895.; Cameron HA et al., 1998, J Neurobiol, 36, 287–306.; McKay
R, 2000, Nature, 406, 361-364.).
So müssen
z.B. beim Fluorescence-Aided Cell Sorting (FACS) die Zellen spezifische
Marker exprimieren, damit sie mit einem fluoreszierenden Antikörper markiert
und dann von den unmarkierten Zellen beim Durchlaufen einer Glaskapillare
getrennt werden können.
Auch können
die Zellen-durch diese Art der Durchflußzytometrie Schaden nehmen.
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Auch
führen
andere selektiven Zellkulturmedien zu einer geringen Ausbeute an
differenzierten Neuronen (Wachs FP, Couillard-Despres S, Engelhardt
M, Wilhelm D, Ploetz S, Vroemen M, Kaesbauer J, Uyanik G, Klucken
J, Karl C, Tebbing J, Svendsen C, Weidner N, Kuhn HG, Winkler 3,
Aigner L, High efficacy of clonal growth and expansion of adult
neural stem cells. Lab Invest. 2003, 83: 949-62. Das Differenzierungsmonitoring ist
ebenfalls oftmals schwierig.
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Die
bisher beschriebenen Methoden zur Stammzelldifferenzierung, bzw.
zur in vitro Differenzierung von neuronalen Stammzellen oder von
diesen abgeleiteten Zellen, weisen somit mindestens einen oder mehrere
der folgenden Nachteile auf:
- – die Verfahren
sind nicht hochdurchsatz-fähig
- – die
Verwendung embryonaler Stammzellen bringt große ethische Probleme mit sich
- – die
Differenzierungsprotokolle sind kompliziert
- – die
Ausbeute an differenzierten Zellen ist gering
- – das
Monitoring der Differenzierung ist schwierig
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Aufgabe
der Erfindung ist es, die wesentlichen Nachteile der bekannten Verfahren
zu beseitigen oder zumindest zu minimieren.
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Eine
Lösung
der gestellten Aufgabe ist das Verfahren zur in vitro Differenzierung
neuronaler Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteter
Zellen, umfassend a) das in Kontakt bringen der Zellen mit einer
Substanz, die eine Reaktion des Wnt-Signaltransduktionswegs inhibiert und
b) das Kultivieren dieser Zellen unter Bedingungen, die eine Vermehrung
und/oder Differenzierung der Zellen ermöglichen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
differenzieren die neuronalen Stammzellen, bzw. die von neuronalen
Stammzellen abgeleiteten Zellen zu gehirnzellenähnlichen Zellen.
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Einen
wichtigen Signalweg für
die Entwicklung und Differenzierung von Zellen stellt der Wnt-Signalweg
dar (Gerhart J, 1999, Teratology, 60, 226–239.; Peifer M and Polakis
P, 2000, Science, 287, 1606–1609, siehe
auch 6). Er ist in der Ontogenese und Embryogenese
u. a. für
die posteriore Verlagerung der Neuralplatte und die Mittelhirn-
und Kleinhirnentwicklung zuständig
(Sokol SY, 1999, Curr Opin Genet Dev, 9, 405–410). Außerdem spielt Wnt eine wichtige
Rolle in der Spezifizierung neuronaler Zelltypen (Interneurone)(Muroyama
Y et al., 2002, Genes Dev, 16, 548–553) und agiert als Faktor
für die
Selbsterneuerung von Stammzellen (Katoh M, 2002, Int J Mol Med,
10, 683–687.;
Song X and Xie T, 2002, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 14813–14818.).
In embryonalen Stammzellen führt
die Inhibition des Wnt-Signalweges zur neuronalen Differenzierung
dieser Zellen (Aubert J et al., 2002, Nat Biotechnol, 20, 1240–1245.).
In hämatopoetischen Stammzellen
ist der Wnt-Signalweg zur Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung
und Proliferation beschrieben (Reya T et al., 2003, Nature, 423,
409–414.;
Lako M et al., 2001, Mech Dev, 103, 49–59.; Willert K et al., 2003, Nature,
423, 448–452.)) Über Effekte
der Wnt-Wirkung in Stammzellen, die aus dem adulten Gehirn isoliert werden,
liegen bislang aber keine Erkenntnisse vor.
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Der
Wnt-Signalweg umfasst komplex regulierte Signalketten (Gerhart J,
1999, Teratology, 60, 226–239.).
Durch Bindung eines Wnt-Signalmoleküls an den spezifischen Rezeptor
kommt es zu einer Inhibition des Signalvermittlers Dsh (Dishevelled),
das wiederum die Glykogen-Sythase-Kinase-3 (GSK-3)(Woodgett JR,
2001, Sci STKE, 2001, RE12) inhibiert. Diese phosphoryliert in Interaktion
mit Axin und APC (Adenomatöses
Polyposis Coli Protein) (Kielman MF et al., 2002, Nat Genet, 32,
594–605)
den Transkriptionskofaktor beta-Catenin, das in unphosphoryliertem
Zustand über
den Transkriptionsfaktor Tcf/Lef1 die Transkription im Zellkern
beeinflussen kann. Phosphoryliertes beta-Catenin dagegen wird ubiquitiniert
und im Proteasom abgebaut.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Inhibierung einer Reaktion des Wnt-Signaltransduktionsweges
durch eine Inhibierung der Glykogen-Sythase-Kinase-3. Dies kann
durch den Inhibitor Genistein geschehen.
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Optional
kann eine Konzentrationsbestimmung von β-Catenin, einem Protein des
Wnt-Signaltransduktionsweges,
und (im phosphorylierten Zustand) Produkt der Glykogen-Sythase-Kinase-3,
erfolgen. Die Konzentration kann dann mit der entsprechenden Konzentration
des Proteins in einer unbehandelten Vergleichzelle verglichen werden.
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Weitere
Ausführungsformen
der Erfindung betreffen Zellen, erhältlich nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren,
einen neurologischen Gewebeersatz, der diese Zellen aufweist, sowie
pharmazeutische Mittel (Medikamente), welche diese Zellen enthalten.
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Außerdem betrifft
die vorliegende Erfindung Screeningverfahren zur Identifizierung
von Substanzen, die den Wnt-Signaltransduktionsweg hemmen und so
zur Differenzierung von neuronalen Stammzellen und von neuronalen
Stammzellen abgeleiteten Zellen geeignet sind, sowie Medikamente,
die diese Substanzen enthalten.
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Alle
erfindungsgemäßen Medikamente
können
zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen verwendet werden,
welche durch die Modulation der Aktivität oder Menge eines Proteins
des Wnt-Signaltransduktionsweges positiv beeinflusst werden können. Vor
allem zählen
zu diesen Krankheiten Erkrankungen, bei denen, direkt oder indirekt,
Gehirnzellen absterben.
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Ferner
betrifft die Erfindung die Verwendung von neuronalen Stammzellen,
welche entweder ein Protein exprimieren, das eine Reaktion des Wnt-Signaltransduktionsweges
inhibieren kann, oder welche ein Protein dieses Stoffwechselweges
nicht, inaktiv oder vermindert exprimieren, zur in vitro Differenzierung
neuronaler Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteter
Zellen.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung Kits zur in vitro Differenzierung von neuronalen
Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteten Zellen.
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Der
Begriff „Differenzierung" bezeichnet im Rahmen
der vorliegenden Erfindung den, im Vergleich mit der Ausgangszelle,
zunehmenden Erwerb oder Besitz von einer oder mehreren Charakteristika
oder Funktionen.
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Der
Ausdruck „Stammzelle" charakterisiert
eine Zelle, die proliferiert, sich selbst erneuert und die Fähigkeit
zur. Differenzierung beibehält.
Umfasst sind hierbei auch Progenitorzellen. Der Begriff "neuronale Stammelle" wird für eine aus
dem Zentralnervensystem isolierte Zelle verwendet, die zu Proliferation,
Selbsterneuerung und Differenzierung unter Hervorbringung von Gehirnzellphänotypen
fähig ist.
Eine „von
neuronalen Stammzellen abgeleitete Zelle" ist dann eine gehirnzellenähnliche
Zelle, die trotzdem noch das Potential zur Differenzierung besitzt,
und aus einer (hypothetischen) neuronalen Stammzelle hervorgegangen
ist.
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Die
neuronalen Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteten
Zellen sind dabei bevorzugt Säugerzellen,
wobei der Begriff auch Affen, Schweine, Schafe, Ratten, Mäuse, Kühe, Hunde
etc. umfasst. Bevorzugt ist das Säugetier ein Mensch. Die verwendeten
Zellen können
frisch oder zuvor gefroren worden sein, bzw. einen früheren Kultur
entstammen.
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Die
Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert. Diverse Medien
sind kommerziell erhältlich, einschließlich Neurobasal-Medium,
DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's
Medium), Ex vivo Serum freies Medium, Iscove's Medium, etc.. Geeignete Antibiotika
(z.B. Penicillin und Streptomycin) zur Verhinderung von bakteriellem
Wachstum bzw. andere Zusätze
wie Heparin, Glutamin, B27, EGF, FGF2 oder fetales Kälberserum
können
hinzugefügt
werden.
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Nach
dem Animpfen des Mediums werden die Kulturen unter Standardbedingungen,
meist bei 37°C in
einer 5%igen CO2-Atmosphäre kultiviert. Frisches Medium
kann in geeigneter Weise zugeführt
werden, zum Teil durch Entfernen eines Teils des Mediums und Ersatz
durch frisches Medium. Verschiedenste handelsübliche Systeme wurden zur Beseitigung
von nachteiligen Stoffwechselprodukten bei der Kultivierung von Säugerzellen
entwickelt. Durch Einsatz dieser Systeme kann das Medium als kontinuierliches
Medium aufrechterhalten werden, so dass die Konzentration diverser
Inhaltsstoffe relativ konstant oder innerhalb eines vorgegebenen
Bereichs bleibt.
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Der
Wnt-Signaltransduktionsweg ist dem Fachmann bekannt (Gerhart J,
1999, Teratology, 60, 226–239.;
Peifer M and Polakis P, 2000, Science, 287, 1606–1609, siehe auch 6).
Weitere Reaktionsschritte des Wnt-Signaltransduktionsweges, weitere
den Signaltransduktionsweg beeinflussende Rezeptoren bzw. neue,
an den bereits bekannten Reaktionsschritten beteiligte Proteine
sind ebenfalls als Bestandteil des Wnt-Signaltransduktionsweges im Sinne dieser
Erfindung anzusehen.
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„Inhibieren" oder „Inhibition" ist im Zusammenhang
mit der Modulation einer Reaktion des Wnt-Signaltransduktionsweges
weit auszulegen, und umfasst die teilweise, im Wesentlichen vollständige oder
vollständige,
auf unterschiedlichste zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung
oder Blockierung einer Reaktion des Signaltransduktionsweges. Dabei
ist mit statistischer Wahrscheinlichkeit ein signifikanter Unterschied
zu der entsprechenden Reaktion einer unbehandelten Vergleichszelle
erkennbar.
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Dem
Fachmann sind verschiedenste Strategien geläufig, um die genannten Reaktionen
in gewünschter
Weise zu beeinflussen. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Strategie besteht
in der Verwendung einer Substanz, welche ein Protein des Wnt-Signaltransduktionsweges
selber inhibiert oder gezielt eine wesentliche Eigenschaft desselben
vermindert. Entsprechende Substanzen sind dem Fachmann bekannt,
beispielsweise Substrat-Analoga, welche mit dem ursprünglichen
Substrat konkurrieren, aber nur geringfügig bzw. nicht umgesetzt werden
und so dass jeweilige Enzym blockieren. Weiterhin könnte es
sich bei einer solchen Substanz auch um einen Antikörper handeln.
Eine andere erfindungsgemäße Vorgehensweise
umfasst die Verwendung einer „antisense"-Nukleinsäure, welche
ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil eines „sense"-Stranges einer für ein Protein
des Wnt-Signaltransduktionsweges codierenden Nukleinsäure komplementär ist. Die
Herstellung derartiger „antisense"-Nukleinsäuren auf
biologische oder enzymatisch/chemische Weise ist dem Fachmann geläufig. In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine entsprechende Inhibition auch über eine Beeinflussung von
regulativen Elementen, z.B. durch spezifische DNA-bindende Faktoren,
erfolgen, welche die Expression des Zielgens modulieren. Regulative
Elemente sind beispielsweise Promotoren, Enhancer, „locus control
regions", Silencer
oder jeweils Teile davon. Bevorzugt kann auch durch "RNA interference" (RNAi) mittels doppelsträngiger RNA
ein Regulierung hervorgerufen werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
differenzieren die neuronalen Stammzellen zu gehirnzellenähnlichen
Zellen. „Gehirnzellenähnliche
Zellen" sind dabei
dadurch charakterisiert, dass sie wesentliche morphologische bzw.
funktionale Merkmale von Gehirnzellen aufweisen. Eine solche Zelle
exprimiert bestimmte Markerproteine, beispielsweise exprimiert eine
neuronenähnliche
Zelle mindestens eines der Markerproteine β3-Tubulin,
MAP2a oder MAP2b. Eine astrocytenähnliche Zelle exprimiert GFAP,
während
eine oligodendrocytäre
Zelle OCT und/oder 04 exprimiert. Weiterhin weist eine gehirnzellenähnliche
Zelle eine typische Form auf und ähnelt in ihrer Morphologie
dabei einer Gehirnzelle, z.B. durch die typischen Fortsätze. Neuronenähnliche
Zellen können
außerdem
Aktionspotentiale bilden und besitzen ein Membranpotential.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine weitere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei
der gegebenenfalls als weiterer Schritt eine Bestimmung der Konzentration
eines Proteins des Wnt-Signaltransduktionswegs erfolgt. Dazu wird
die Menge des Proteins quantifiziert und mit der Menge desselben
Proteins in einer unbehandelten Vergleichsszelle, bei der keine
Reaktion des Wnt-Signaltransduktionsweges inhibiert wurde, verglichen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
handelt es sich bei dem Protein, dessen Konzentration bestimmt wird,
um β-Catenin. β-Catenin
wird im Zuge des Wnt-Signaltransduktweges phosphoryliert, phosphoryliertes β-Catenin
wird ubiquitiniert und im Proteasom abgebaut. Die Anwesenheit einer
größeren Menge
des Proteins (verglichen mit einer unbehandelten Vergleichsprobe)
zeigt also eine Inhibierung des Wnt-Signaltransduktionsweges an.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Bestimmung der Protein-, insbesondere der β-Catenin-Konzentration
durch einen Antikörper.
Ein β-Cateninspezifischer
Antikörper
ist kommerziell erhältlich
(Chemicon International, Temecula, USA).
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Der
Begriff „Antikörper" wird im Bezug auf
diese Erfindung im weitesten Sinne verstanden, und schließt monoklonale
Antikörper,
polyklonale Antikörper,
humane oder humanisierte Antikörper,
rekombinante Antikörper,
single chain Antikörper,
synthetische Antikörper
sowie Antikörperfragmente
(z. B. Fab, F(ab)2 und Fv)
ein, solange sie die gewünschte
biologische Aktivität
aufweisen. Die Antikörper
oder Fragmente können
allein oder in Mischungen verwendet werden. Die Herstellung dieser
Antikörper
ist dem Fachmann geläufig.
Zum Zwecke der Detektion wird ein solcher Antikörper bevorzugt mit einer detektierbaren
Verbindung markiert sein.
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Bevorzugt
erfolgt die Inhibierung der Reaktion des Wnt-Signaltransduktionswegs
durch eine Inhibierung der Glykogen-Synthase-Kinase-3.
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Inhibierung
bedeutet auch in diesem Zusammenhang eine teilweise, im Wesentlichen
vollständige oder
vollständige,
auf unterschiedlichste zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung
oder Blockierung einer Reaktion des Signaltransduktionsweges, und
ist weit auszulegen.
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Ein(er)
oder mehrere Inhibitor(en) zur Inhibierung der Glykogen-Synthase-Kinase-3
kann/können
bevorzugt ausgewählt
sein aus der Gruppe der Kinase-Inhibitoren, Estrogen-Analoga, Phytoestrogene,
Corticoide oder Salze, insbesondere 4-Benzyl-2-methyl-1,2,4-thiazolidine-3,5-dion,
2-Thio(3-iodobenzyl)-5-(1-pyridyl)-[1,3,4]-oxadiazol, 3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dion,
3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pynole-2,5-dion,
Lithiumsalze und der Berryliumsalze. Außerdem können auch Alkali- bzw. Erdalkalimetalle
als Inhibitoren fungieren. Ferner können modifizierte Formen der
oben genannten Inhibitoren verwendet werden,
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird als entsprechender Inhibitor der Glykogen-Synthase-Kinase-3
Genistein eingesetzt.
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Dabei
wird Genistein in einer zur Inhibition geeigneten Konzentration
verwendet, bevorzugt in einer Konzentration von 10–250 μmol/l, besonders
bevorzugt in einer Konzentration von 40–60 μmol/l. Weniger bevorzugt ist
eine Konzentration von 250 μmol
bis 1 mmol.
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Bevorzugt
kann die Inhibierung der Reaktion des Wnt-Signaltransduktionswegs
auch durch mindestens einen Antagonisten des Rezeptors „Frizzled" erfolgen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung bezieht sich "Antagonist" auf eine Substanz,
die wirksame physiologische Transmitter bzw. deren Analoga von einem
Rezeptor verdrängen
kann, jedoch nicht zur Auslösung einer
physiologischen Reaktion und Signalweitergabe befähigt ist,
und somit den Rezeptor blockiert.
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Ein
alternativer Weg zur Entwicklung von den erfindungsgemäßen Antagonisten
besteht im rationalen Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign,
Spektrum-Verlag,
Heidelberg). Hierbei wird die Struktur oder eine Teilstruktur des
Rezeptors benutzt, um mittels Molecular Modelling Programmen Strukturen zu
finden, für
die sich eine hohe Affinität
an den Rezeptor vorhersagen lässt.
Diese Substanzen werden synthetisiert und dann auf ihre Wirkung
getestet.
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Bevorzugt
kann der mindestens eine Antagonist des Rezeptors „Frizzled" ausgewählt sein
aus der Gruppe der Secreted Frizzle related Proteins (sFRP), Dickkopf
(Dkk), Wnt, Fzd, Frat, Nkd, VANG1/STB2, ARHU/WRCH1, ARHV/WRCH2,
GIPC2, GIPC3, betaTRCP2/FBXW1B, SOX17, TCF-3, WIF-1, Cerberus, Sizzled,
Crescent, Coco, Soggy, Kremen und low-density-lipoprotein-receptor-related
proteins (LRP).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei den von neuronalen Stammzellen
abgeleiteten Zellen, die als „Ausgangspunkt" der Verfahren verwendet
werden, um Zellen ausgewählt
aus der Gruppe der Neuroblastom-Zellen, PC12-Zellen, Zellen neuronaler Primärkulturen
und 293-Zellen.
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Ferner
betrifft die Erfindung Zellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt wurden (erhältlich
sind) sowie einen neurologischen Gewebeersatz, der solche Zellen
enthält.
Von einem Patienten durch Biopsie isolierte Zellen werden dazu nach
einem der erfindungsgemäßen Verfahren
gezüchtet
und dann in diesen oder einen anderen Patienten reimplantiert. Es
ist auch möglich,
Zellen anderer Säugetiere
als Menschen für
diesen Zweck zu nehmen, etwa Zellen von Affen, Schweinen, Schafen,
Ratten, Mäusen,
Kühen, Hunden
etc.. Die Transplantation von in vitro differenzierten embryonalen
Zellen ist ein etabliertes Verfahren. Auch undifferenzierte neuronale
Progenitoren wurden bereits transplantiert Zusätzlich ist eine Beeinflussung des
Wachstumsverhaltens adulter neuronaler Stammzellen in vivo durch
die erfindungsgemäßen Medikamente
in den beschriebenen Anwendungsformen möglich.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft (Screening-) Verfahren
zum Auffinden und zur Identifizierung von Substanzen, die den Wnt-Signalweg
hemmen und zur Differenzierung von neuronalen Stammzellen, bzw.
von neuronalen Stammzellen abgeleiteten Zellen, geeignet sind. Ein
solches Verfahren kann folgende Schritte umfassen:
- c) das in Kontakt bringen der Zellen mit der Substanz,
- d) das Bestimmen der β-Catenin-Konzentration
in den Zellen,
- e) das Vergleichen mit einer geeigneten Vergleichszelle, und
- f) das Nachweisen der Differenzierung der Zellen.
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Zum
Zweck der Auffindung dieser Substanzen können auch direkte oder indirekte
Detektionsverfahren verwendet werden, wie Sie dem Fachmann zur Auffindung
von Interaktionspartnern geläufig
sind. Diese Verfahren umfassen beispielsweise
- • Antikörperselektionstechniken
- • eine
Reihe von Verfahren, die unter dem Begriff „Yeast-N-Hybrid" Systeme zusammengefasst werden, z. B.
das Yeast-2-Hybrid-System
- • Phagen-Display-Systeme
- • Immunopräzipitationen
- • Imuno-Assays
wie ELISA oder Western-Blot
- • Reporter-Testsysteme
- • Durchmustern
von Bibliotheken niedermolekularer Verbindungen
- • „Molecular
modelling" unter
Verwendung von struktur-Informationen
der Wnt-Signaltransduktionsproteine
- • Microarray
- • Proteinarray
- • Antikörperarray
- • Massenspektrometrie-
bzw. HPLC-basierte Screeningsysteme.
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Die
in diesen Verfahren gefundenen Interaktionspartner werden anschließend auf
ihre Fähigkeit
hin untersucht, den Wnt-Signalweg zu hemmen und zur Differenzierung
von neuronalen Stammzellen zu führen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von Medikamenten
zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Krankheiten, die durch Modulation
der Aktivität
oder Menge eines Proteins des Wnt-Signaltransduktionswegs positiv
beeinflusst werden können.
Insbesondere zählen
zu diesen Krankheiten Erkrankungen oder Beschwerden, die direkt
oder indirekt den Tod von Gehirnzellen zur Folge haben.
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Die
erfindungsgemäßen Medikamente
können
dabei entweder nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Zellen,
und/oder Substanzen, die eine Reaktion des Wnt-Signaltransduktionswegs
inhibieren, insbesondere Inhibitoren der Glykogen-Synthase-Kinase-3
und/oder Antagonisten des Rezeptors Frizzled und/oder Antikörper gegen
Proteine des Wnt-Signalstransduktionswegs enthalten.
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Die
Wirkstoffe werden in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht,
welche sich routinemäßig, gemäß Techniken
zur Ermittlung des Dosierungsbereiches, von einem Fachmann auf dem
relevanten Arbeitsgebiet bestimmen lässt.
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Bei
den Krankheiten kann es sich beispielsweise um zerebrale Fehlbildungen
und zerebrale Entwicklungsstörungen
wie infantile Zerebralparesen, Fehlbildungen des kraniozervikalen Übergangs
oder dysrhaphische Syndrome handeln. Außerdem zählen zu diesen Kranheiten degenerative
und atropische Prozesse des Gehirns und des Rückenmarks, wie senile und präsenile Hirnatropien,
beispielweise Morbus Alzheimer, Morbus Binswanger oder Morbus Pick.
Auch Stammganglienerkrankungen wie Morbus Huntington und HDL2, Chorea,
Athesose und Dystonie gehören
zu den Erkrankurgen, welche mittels der erfindungsgemäßen Medikamente
behandelt werden können.
Weiterhin seien spongioformen Enzephalopathien genannt, sowie Pyramidenbahn-
und Vorderhorndegenerationen, beispielsweise Amyothrophe Lateralsklerose,
spinale Muskelatropie und progressive Bulbärparalyse genannt. Ebenfalls
kann es sich um degenerative Ataxien, wie Morbus Friedreich, Morbus
Refsum oder spinocerebelläre
AtaxienTyp1-25 handeln. Ferner sind metabolischen und toxische Prozesse
des Gehirns und des Rückenmarks,
wie heriditäre
Stoffwechselerkrankungen des Aminosäuren-, Lipid-, Kohlenhydrat-
und Metallionen-Stoffwechsels insbesondere Morbus Wilson durch die
erfindungsgemäßen Medikamente
behandelbar. Weiterhin seien Multiple Sklerose und andere Entmarkungskrankheiten des
zentralen und periphären
Nervensystems, Gehirn und Rückenmarkstumore
und traumatische Schädigungen
des Nervensystems aufgezählt.
Auch Durchblutungsstörungen
des Gehirns und des Rückenmarks,
insbesondere Hirninfarkte und andere Formen des Schlaganfalls sowie
Muskelerkrankungen, die auf eine Schädigung des Nervensystems beruhen
insbesondere posttraumatischen Muskelatropien sind durch die erfindungsgemäßen Medikamente
behandelbar.
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Weiterhin
bevorzugt sind Modifikationen oder Formulierungen der erfindungsgemäßen Medikamente, durch
die die Fähigkeit
die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, erhöht wird, bzw. sich der Verteilungskoiffizient zum
Hirngewebe hin verschiebt. Beispiele für solche Modifikationen sind
die Addition einer Proteintransduktionsdomäne (ptd) oder von tat-Sequenzen. Außerdem können Kernlokalisationssequenzen
(NLS) bzw. Kerntranslokationssequenzen (NTS) verwendet werden.
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Ebenso
bevorzugt ist die Zugabe aller Substanzen zu den erfindungsgemäßen Medikamenten,
durch die ihre therapeutische Wirkung unterstützt wird. Dieser Effekt kann
dabei kumulativ, oder überadditiv
sein. Für diesen
Zweck geeignet sind z.B. Substanzen mit neuroprotektiven Eigenschaften,
wie Erythropoietin, BDNF, VEGF, CTNF, GCSF und GMCSF und Entzündungsbeeinflussende
Medikamente.
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Die
erfindungsgemäßen Medikamente
lassen sich gemäß den im
Fachgebiet verfügbaren
Standardverfahren formulieren. So kann beispielsweise ein pharmazeutisch
unbedenklicher Trägerstoff
(oder Hilfsstoff) zugegeben werden. Geeignete Träger- bzw. Hilfsstoffe sind
dem Fachmann geläufig.
Bei dem Träger-
oder Hilfsstoff kann es sich um ein festes, halbfestes oder flüssiges Material
handeln, das als Vehikel oder Medium für den wirksamen Bestanteil
dient. Dem Fachmann mit Normalwissen auf dem Gebiet der Herstellung
von Zusammensetzungen ist es leicht möglich, die geeignete Verabreichungsform
und -art je nach dem jeweiligen Eigenschaften des ausgewählten Wirkstoffes,
der zu behandelnden Erkrankung bzw. des zu behandelnden Krankheitszustands,
dem Stadium der Erkrankung sowie anderen relevanten Umständen auszuwählen (Remington's Phannaceutical
Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). Der Anteil und die Beschaffenheit
des pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoffs werden
durch Löslichkeit
und die chemischen Eigenschaften des ausgewählten Wirkstoffes festgelegt.
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Die
Medikamente werden besonders bevorzugt durch direkte interzerebrale
Injektion in das Gehirn oder als intraventrikuläre Injektion verabreicht. Vorzugsweise
können
sie auch intravenös,
als Tablette oder als Nasenspray verabreicht werden. Auch ein Gentransfer
durch modifizierte Adenoviren ist ein bevorzugter Gegenstand der
Erfindung.
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Ferner
betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum Auffinden und zur
Identifizierung von Substanzen (Screeningverfahren) zum Nachweis
von gehirnzellenähnlichen
Zellen und Gehirnzellen, umfassend die Verfahrensschritte
- i) das Bestimmen der Konzentration von β-Catenin,
und
- ii) das Vergleichen der bestimmten Konzentration aus i) mit
der β-Catenin-Konzentration
einer geeigneten Vergleichszelle.
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Als
Vergleichszelle kann hier ebenfalls wieder eine nicht mit der entsprechenden
Substanz behandelte Zelle herangezogen werden. Bei einer besonderen
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Bestimmung der Konzentration von β-Catenin durch einen Antikörper.
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Ferner
betrifft die Erfindung die Verwendung von β-Catenin als diagnostischem
Marker zur Identifizierung von gehirnzellenähnlichen Zellen und Gehirnzellen.
Der Nachweis kann auch, unter anderem, durch einen Antikörper erfolgen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine rekombinante, neuronale
Stammzelle bzw. eine von einer neuronalen Stammzelle abgeleitete
Zelle. Diese Zellen enthalten ein Nukleinsäurekonstrukt, das für ein Polypeptid
codiert, welches zur Inhibierung einer Reaktion des Wnt-Signaltransduktionsweges
führt.
Die Zellen werden zur in vitro Differenzierung der Stammzellen zu
gehirnzellenähnlichen
Zellen eingesetzt.
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Das
Nukleinsäurekonstrukt
beinhaltet dabei eine für
ein inhibitorisch wirkendes Protein codierende Nukleinsäure unter
der Kontrolle eines Promotors. Der Promotor kann hierbei jeder bekannte
Promotor sein, der in der Wirtszelle, in die das Nukleinsäurekonstrukt
eingebracht werden soll, aktiv ist, d.h. in dieser Wirtszelle die
Transkription des nachgeschalteten Proteins aktiviert Der Promotor
kann hierbei ein konstitutiver Promotor sein, welcher das nachgeschaltete
Protein ständig
exprimiert, oder ein nicht-konstitutiver Promotor, der nur zu definierten
Zeitpunkten im Laufe der Entwicklung oder unter bestimmten Umständen exprimiert.
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Das
erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt
kann gegebenenfalls weitere Kontrollsequenzen enthalten. Unter einer
Kontrollsequenz wird eine beliebige Nukleotidsequenz verstanden,
die die Expression des inhibitorischen Polypeptides beeinflusst,
wie insbesondere der Promotor, eine Operatorsequenz, d.h. die DNA-Bindungsstelle für einen
Transkriptionsaktivator oder einen Transkriptionsrepressor, eine
Terminator-Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz oder eine Ribosomenbindungsstelle.
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Außerdem kann
das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt
eine Nukleinsäuresequenz
enthalten, durch die der Vektor sich in der betreffenden Wirtszelle
replizieren kann. Solche Nukleotidsequenzen werden in der Regel „origin
of replication" (deutsch:
Replikationswsprung) genannt. Beispiele für solche Nukleotidsequenzen
sind der SV40-Replikationsursprung,
der in Säugetier-Wirtszellen
zum Einsatz kommt.
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Das
Nukleinsäurekonstrukt
kann weiterhin einen oder mehrere Selektionsmarker enthalten. Unter
einem Selektionsmarker versteht man ein Gen, welches unter der Kontrolle
eines Promotors steht und welches für ein Protein codiert, das
einen physiologischen Defekt der Wirtszelle komplementiert. Selektionsmarker
stellen insbesondere das Gen codierend für die Dihydrofolat Reduktase
(DHFR) dar, oder auch ein Gen, welches die Resistenz gegen Antibiotika,
wie insbesondere Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Blasticidin,
Gentamycin, Chloramphenicol, Neomycin oder Hygromycin bewirkt.
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Eine
große
Anzahl von rekombinanten Vektoren zur Expression eines Zielproteins
in Wirtszellen ist nach dem Stand der Technik bekannt, viele von
ihnen sind auch kommerziell erhältlich.
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Außerdem kann
das inhibitorisch wirkende Protein auch als Fusionsprotein exprimiert
werden. Dabei wird dem zu exprimierenden Protein eine Anzahl von
Aminosäuren
N- oder C-terminal angefügt.
Diese können beispielsweise
die Funktion haben, die Expression des rekombinanten Proteins zu
steigern, seine Löslichkeit zu
verbessern, dessen Aufreinigung zu erleichtern oder dessen Nachweisbarkeit
zu ermöglichen.
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Weiterhin
kann die Zelle mit dem Nukleinsäurekonstrukt
stabil oder transient transfiziert worden sein.
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Transfektion
oder Transformation meint jegliche An von Verfahren, die zur Einbringung
einer Nukleinsäuresequenz
in einen Organismus verwendet werden kann. Für diesen Vorgang steht eine
Vielzahl von Methoden zur Verfügung
(siehe auch Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual.,
2end ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y., 1989).
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Unter
einer transienten Transformation wird das Einbringen eines Nukleinsäurekonstruktes
in eine Zelle verstanden, wobei sich das Nukleinsäurekonstrukt
nicht in das Genom der transformierten Zelle integriert. Bei einer
stabilen Transformation dagegen erfolgt eine Integration des Nukleinsäurekonstrukts,
bzw. von Teilen des Konstruktes, in das Genom der transformierten
Zelle.
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Ferner
betrifft die Erfindung die Differenzierung einer rekombinanten,
neuronalen Stammzelle, in der mindestens ein Protein des Wnt-Signaltransduktionswegs
nicht exprimiert wird, inaktiv exprimiert wird oder, im Vergleich
mit der entsprechenden Wildtyp-Stammzelle, vermindert exprimiert
wird, zu gehirnzellenähnlichen Zellen.
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Bevorzugterweise
ist dabei mindestens ein für
ein Protein des Wnt-Signaltransduktionswegs
codierendes Gen oder ein an der Expression dieses Gens beteiligter
DNA-Abschnitt komplett deletiert ist, teilweise deletiert ist oder
weist eine Mutation auf.
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„Mutationen" umfassen dabei Substitutionen,
Additionen oder Deletionen eines oder mehrerer Nukleotide. Unter „Substitution" ist der Austausch
einer oder mehrerer Nukleotide durch ein oder mehrere Nukleotide zu
verstehen. „Addition" bezeichnet das Hinzufügen von
einem oder mehreren Nukleotiden. „Deletion" ist das Entfernen eines oder mehrer
Nukleotide.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur in vitro Differenzierung
von neuronalen Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteten
Zellen, umfassend eine rekombinante, neuronale Stammzelle, die ein
Nukleinsäurekonstrukt
zur Expression eines Proteins umfasst, das eine Reaktion des Wnt-Signaltransduktionswegs
inhibieren kann.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur in vitro Differenzierung
von neuronalen Stammzellen und von neuronalen Stammzellen abgeleiteten
Zellen, umfassend eine rekombinante, neuronalen Stammzelle, in der
mindestens ein Protein des Wnt-Signaltransduktionswegs
nicht exprimiert wird, inaktiv exprimiert wird oder, im Vergleich
mit der entsprechenden Wildtyp-Stammzelle, vermindert exprimiert
wird.
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Bei
in beiden Kits enthaltenen Zellen wurden bereits zuvor ausführlich beschrieben.
Ferner können
die Kits weitere Gegenstände
uns Substanzen umfassen, wie Versuchsarileitungen, Medien, Medienzusätze, etc..
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird durch die Zeichnung näher
erläutert:
Sie
zeigt in
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1 ein
zweidimensionales Elektropherogramm, in dem ein Proteinextrakt aus
adulten neuronalen Stamm- und Progenitorzellen nach isoelektrischem
Punkt (1. Dimension) und Molekulargewicht (2. Dimension) aufgetrennt
ist. Identifizierte Proteinspots des Wnt-Signalweges sind gekennzeichnet. Die
Proteinspots wurden zur Identifizierung ausgestanzt und massenspektrometrisch
untersucht,
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2 die
semiquantitativen Veränderungen
der in 1 dargestellten und identifizierten Proteine vor und
nach dem Differenzierungsprotokoll,
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3 Ergebnisse
der funktionellen Analyse des Wnt-Signalweges in differenzierten
und undifferenzierten adulten neuronalen Stamm- und Progenitorzellen
mit Hilfe des Western Blots. Beta-Catenin wurde durch spezifische
Antikörper
in den Proteinextrakten aus adulten neuronalen Stamm- und Progenitorzellen sichtbar
gemacht. (A) zeigt Ergebnisse für
undifferenzierte Zellen, ohne Blockade des Wnt-Signalweges, (B) für undifferenzierte
Zellen, mit Blockade des Wnt-Signalweges durch Genistein, (C) für die Negativkontrolle, (D)
für differenzierte
Zellen, ohne Blockade des Wnt-Signalweges, (E) differenzierte Zellen,
mit Blockade des Wnt-Signalweges durch Genistein,
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4 die
semiquantitative Darstellung der Ergebnisse aus 3.
Die Expression von β-Catenin kann nach
Gabe von Genistein etwa um Faktor 2 gesenkt werden,
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5 diferenzierte
neuronale Stamm- und Progenitorzellen in der Zellkultur nach dem
Differenzierungsprotokoll, und in
-
6 eine
schematische Darstellung des Wnt-Signaltransduktionsweges.
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Beispiel 1: Identifizierung
des Wnt-Signalwegs in neuronalen Stamm- und Progenitorzellen
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Aus
kultivierten neuronalen Stamm- und Progenitorzellen wird ein Proteinextrakt
isoliert, in dem durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese Proteine
des Wnt-Signalweges identifiziert werden.
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Neuronale
Stammzellen werden aus Hippokampus, Bulbus olfaktorius und Subventrikulärzone aus dem
Gehirn 4-6 Wochen alter Ratten in einem dem Fachmann bekannten Verfahren
isoliert (Gage FH et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 11879-11883; Gage FH et
al., 2000, WO2000047718A1,; Ray J et al., 1993, Proc Natl Acad Sci
USA, 90, 3602–3606;
Reynolds BA and Weiss S, 1992, Science, 255, 1707–1710.; Weiss
S et al., 1994, WO1994009119A1). Dazu werden die Gehirne entnommen
und in 50 ml eiskalter Dulbeccos phosphat-gepufferter Salzlösung (DPBS)
supplementiert mit 4.5 g/l Glukose (DPBS/Glc) gewaschen. Die genannten
Hirnregionen aus 6 Tieren werden disseziert, in 10 ml DPBS/Glc gewaschen
und für
5 min bei 1600 g und 4°C
zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wird das Gewebe
mechanisch zerkleinert. Die Gewebsstücke werden mit DPBS/Glc-Medium
für 5 min
bei 800 g gewaschen und die drei Pellets in 0.01% (w/v) Papain,
0.1% (w/v) Dispase II (neutrale Protease), 0.01% (w/v) DNase I,
und 12.4 mM MnSO4 in Hank's Balanced
Salt Solution (HBSS) resuspendiert. Das Gewebe wird mit Plastikpipettenspitzen
trituriert und für
40 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Lösung alle 10 min durchmischt
wird. Die Lösung
wird für
5 min bei 800 g und 4°C
zentrifugiert und die Pellets drei Mal in 10 ml DMEM-Ham's F-12-Medium supplementiert mit
2 mM L-Glutamin, 100 IE/ml Penicillin und 100 IE/ml Streptomycin
gewaschen. Die Pellets werden in 1 ml Neurobasal-Medium supplementiert
mit B27 (Invitrogen, Karlsruhe), 2 mM L-Glutamin, 100 IE/ml Penicillin
und 100 IE/ml Streptomycin, 20 ng/ml Endothelial Growth Factor (EGF),
20 ng/ml Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) und 2 μg/ml Heparin
resuspendiert. Die Zellen werden unter sterilen Bedingungen in geeigneten
Kulturschalen (BD Falcon, Heidelberg) in einer Konzentration von
25,000–100,000
Zellen/ml ausgebracht. Die Kulturschalen werden bei 37°C in einer
5%-igen CO2-Atmosphäre
inkubiert. Das Kulturmedium wird ein Mal pro Woche gewechselt, wobei
etwa zwei Drittel ersetzt werden und ein Drittel als konditioniertes
Medium beibehalten wird.
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Für die zweidimensionale
Gelelektrophorese werden die Stamm- und Progenitorzellen nach 5
Passagen von jeweils etwa 14 Tagen 3 Mal in 300 mosmol/l Tris-HCl
-Saccharose, pH 7.4, gewaschen und in einem Probenpuffer bestehend
aus 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 0.5% (v/v) Triton X-100,
0.5% (v/v) IPG buffer pH 3-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden),
100 mM DTT and 1.5 mg/mL Complete protease inhibitor (Roche, Mannheim,
Germany) für
1 hour bei Raumtemperatur in einem Orbitalschüttler lysiert. Das Lysat wird
dann bei 21000 x g für
30 min zentrifugiert und der Proteingehalt des Überstandes nach der Bradfordmethode
bestimmt (Bradford MM, 1976, Anal Biochem, 72, 248–254).
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Die
zweidimensionale Gelelektrophorese wird nach Standardprotokollen
ausgeführt
(Görg A
et al., 2000, Electrophoresis, 21, 1037–1053). Proben von 500 μg werden
zur isoelektrischen Fokussierung auf 18 cm lange, nicht-lineare
pH 3-10 Gradienten-IEF-Gelstreifen
aufgetragen (Amersham Bioscience, Freiburg, Germany). Nach 12 h
Schwellzeit bei 30 V werden 200 V für 1 h, 500 V für 1 h und
1000 V für
1 h angelegt.
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Danach
wird die Spannung auf 8000 V erhöht
und über
12 h konstant gehalten. Daraus ergeben sich 100300 Vh auf dem IPGphor
IEF System (Amersham Bioscience, Freiburg, Germany) für die isoelektrische Fokussierung.
Die Trennung in der zweiten Dimension wird in 12.5% Polyacrylamid-Gelen
in Gegenwart von 10% SDS vollzogen. An die Gele (180 × 200 × 1.5 mm3)
werden 30 mA für
30 min und 100 mA für
etwa 4 h in einer wassergekühlten
vertikalen Elektrophoresekammer angelegt (OWL Scientific, Woburn,
MA, USA). Die Gele werden nach einem modifizierten Protokoll (Blum
H et al., 1987, Electrophoresis, 8, 93–99) mit Silbernitrat gefärbt, um
die Proteine sichtbar zu machen. Diese Methode ist kompatibel mit
einer sich anschliessenden Massenspektrometrie. Die Gele werden
dann eingescannt und die Bilder densitometrisch vermessen mit der speziellen
Software Phoretix 2D Professional (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle-upon-Tyne, UK). Nach einer
Hintergrundkorrektur werden die Proteinpunkte des Wnt-Signalweges nach
optischer Dichte und Volumen vermessen. Die Proteine werden durch
Massenspektrometrie identifiziert (Proteosys AG, Mainz). (1)
-
Beispiel 2: Nachweis der
Regulation der identifizierten Proteine in neuronalen Stamm- und
Progenitorzellen durch Differenzierung in vitro
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Die
Differenzierung der adulten neuronalen Stammzellen wird durch Entzug
der Wachstumsfaktoren EGF und bFGF aus dem Medium und Zusatz von
fetalem Kälberserum
(FCS) ausgelöst.
Dazu werden die Zellen aus den Kulturschalen entnommen, in Kulturmedium
für 10
min bei 800 g und 4°C
zentrifugiert und drei Mal in 10 ml DPBS bei 800 g und 4°C gewaschen.
Die Zellen werden enzymatisch vereinzelt und in einer neuen Kulturschale
in 4 ml Neurobasal-Medium supplementiert mit B27 (Invitrogen, Karlsruhe),
2 mM L-Glutamin, 100 IE/ml Penicillin und 100 IE/ml Streptomycin
und 2 μg/ml
Heparin resuspendiert. Zusätzlich
werden dem Medium 5% fetales Kälberserum
zugesetzt. Die Zellen wurden unter sterilen Bedingungen in geeigneten
Kulturschalen (BD Falcon, Heidelberg) in einer Konzentration von
25,000–100,000
Zellen/ml ausgebracht. Die Kulturschalen werden bei 37°C in einer
5%-igen CO2-Atmosphäre für zwei Tage inkubiert.
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Die
in vitro differenzierten Zellen werden mittels der zwei-dimensionalen
Elektrophorese (s.o., Bsp. 1) untersucht und die Ergebnisse für die optischen
Dichten der Proteinpunkte mit denen für undifferenzierte Zellen mit
statistischen Testverfahren verglichen. Dazu wird ein t-Test nach
Student verwendet, ein Signifikanzniveau von p < 0.05 wird als statistisch signifikant
angesehen. Dabei konnten die Proteine Pontin 52, Proteasom-Untereinheit
alpha-1 und Proteasom-Untereinheit alpha-6 (Tabelle 1) als reguliert
exprimiert identifiziert werden (2).
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Beispiel 3: Nachweis der
Regulation von beta-Catenin nach Differenzierung und Inhibition
des Wnt-Signalweges
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Für die Inhibition
des Wnt-Signalweges wird der unspezifische Kinaseinhibitor Genistein
in einer Konzentration von 50 μM
zugesetzt, um die Wirkung der Glykogen-Synthase-Kinase 3 (GSK-3) zu inhibieren (Murase
S et al., 2002, Neuron, 35, 91–105.).
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Danach
wird ein Proteinextrakt (s.o., Beispiel 1) angefertigt und das Protein
beta-Catnin durch eindimensionale Gelelektrophorese und Western
Blotting identifiziert (3, 4).
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Die
Proteinextrakte der adulten neuronalen Stammzellen werden zunächst in
Läimmli-Puffer bestehend
aus 2% (w/v) Natriumdodecylsulfat, 10% (v/v) Glycerol, 100 mM Dithiothreitol,
60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.001% Bromphenolblau und 5% 2-Mercaptoethanol in
einem 12% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und durch das „semi-dry
blotting„-Verfahren
(Kyhse-Andersen J, 1984, J Biochem Biophys Methods, 10, 203–209.) auf eine
Nitrozellulosemembran (Optitran BA-583, 0.2 μm, Schleicher & Schnell, Dassel)
aufgebracht. Die Membran wird mit einem geeignet Reagenz inkubiert,
um unspezifische Antikörperbindungen
zu unterdrücken,
für 1 h
inkubiert (Seablock, Pierce, Rockford, IL, USA) und dann über Nacht
bei 4°C
mit dem Erstantikörper
(beta-Catenin, 1 : 5000, BD Biosciences, Heidelberg) in TBST aus
60 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5 und 0.1% (v/v) Tween 20 inkubiert.
Am folgenden Tag werden die Membranen 3 × 5 min in TBST gewaschen und der
Zweitantikörper
(ImmunoPure Rabbit Anti-Mouse IgG, (H + L), Peroxidase Conjugated,
Pierce, Rockford, IL, USA) in einer Verdünnung von 1 : 20.000 in TBST,
für 2 h
aufgebracht. Die Antikörperbindung
wird durch Chemilumineszenz-Signale nachgewiesen. Die Chemilumineszenz-Signale
werden unter Verwendung eines geeigneten Substrates (SuperSignal
West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) für 30 s auf Röntgenfilmen
aufgenommen. Die Röntgenfilme
werden entwickelt und densitometrisch vermessen. Die Ergebnisse
für undifferenzierte
Zellen ohne Inhibition des Wnt-Pfades, undifferenzierte Zellen mit
Inhibition des Wnt-Pfades, differenzierte Zellen ohne Inhibition
des Wnt-Pfades und differenzierte Zellen mit Inhibition des Wnt-Pfades
wurden verglichen (4). Dabei findet sich eine etwa
zweifache Reduktion der beta-Catenin-Expression in den Zellen mit
Inhibition des Wnt-Pfades.