DE10102722A1 - Verfahren und Testsystem zum Auffinden von Nervenzell-schützenden Substanzen - Google Patents
Verfahren und Testsystem zum Auffinden von Nervenzell-schützenden SubstanzenInfo
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Abstract
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems beeinflussen, das die folgenden Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einem potenziellen Wirkstoff, und b) Bestimmen der Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der Probe.
Description
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von
pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Zellen des
zentralen Nervensystems beeinflussen, das die folgenden Schritte umfaßt: a)
Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff, und b)
Bestimmen der Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der Probe.
Obwohl ausdifferenzierte Neuronen zu den am längsten lebenden Zelltypen in
Säugern gehören, sterben undifferenzierte Nervenzellen in großer Zahl während
der Entwicklung des Nervensystems. Desweiteren ist das Absterben von
neuronalen Zellen ein wesentliches Charakteristikum von akuten und chronischen
neurodegenerativen Erkrankungen. Die Frage, wie Nervenzellen sterben, ist in
allen Einzelheiten bislang noch nicht ausreichend verstanden.
Jedoch ist bekannt, daß Nervenzellen, ähnlich wie alle anderen Zellen, für ihr
Überleben eine trophische Unterstützung benötigen.
Es ist auch bekannt, daß Nervenzellen, gleichgültig ob sie sensorische oder
motorische Funktion haben, nur in Anwesenheit einer Anzahl von sogenannter
neurotropher Faktoren überleben können. Diese neurotrophen Faktoren stellen
Mitglieder unterschiedlicher Familien dar. Zu ihnen gehören die Neurotrophine,
wie beispielsweise der brain derived neurotrophic factor (BDNF), der ciliary
neurotrophic factor (CNTF), neurotrophin-3 (NT-3) und der nerve growth factor
(NGF) (Kaplan und Miller, Curr. Opin. Neurobiol. 10: 381-291, 2000), der
Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) (Mama und Klein, Nat. Neurosci. 2: 213-
217, 1999) und der Gliacell Derived Neurotrophic Factor (GDNF) (Balok et al.
Curr. Opin. Neurobiol. 10: 103-110, 2000).
Derartige neurotrophe Faktoren wirken durch Bindung an und Aktivierung von
Tyrosinphosphokinaserezeptoren. Von diesen Rezeptoren wird das Aktivierungs
signal über im Zytoplasma vorhandene signaltransduzierende Proteine in den
Zellkern übertragen. Mehrere Signalübertragungswege sind hierbei in Neuronen
bekannt. Zu ihnen gehört der PI-3K-AKT-Signalübertragungsweg und der Ras-
Raf-Übertragungsweg. Beide Aktivierungswege sind vernetzt durch aktiviertes
RAS, ein Protein, welches in dem Raf-Übertragungsweg eine Schlüsselrolle
einnimmt (Yuan und Yankner, Nature 407: 802-809, 2000). Zusätzliche Raf-
abhängige Signalübertragungswege sind der Bag-1-C-Raf Signalweg (Wang et al.,
PNAS USA 93: 7063-7068, 1996) und der Rap-1-B-Raf-AMP Signalweg (Grewal
et al., J. Biol. Chem. 275: 3722-3728, 2000).
Ein wesentliches Ergebnis der Aktivierung von neuronalen Zellen und Gliazellen
durch neurotrophe Faktoren ist die verstärkte Expression von intrazellulären
Proteinen, welche die Zellen vor dem kontrollierten Zelltod schützen (Newmeyer
und Green, Neuron 21: 653-655, 1998; Wiese et al., Nature Neurosci. 2: 978-893,
1999). Zu diesen Proteinen zählen die Inhibitoren der IAP/ITA Familie,
insbesondere IAP-1, IAP-2, x-IAP und Survivin. Proteine der IAP/ITA Familie
hemmen die Aktivierung von Procaspase-9 (Deveraux et al., EMBO J. 17: 2215-
2223 (1998), die ihrerseits aktiviert wird durch Cytochrome-C und Apaf 1. Des
weiteren hemmen Proteine der IAP/ITA Familie die Funktion der aktivierten
Caspasen-3, -6 und -7 und können auch hierdurch die durch diese Enzyme
bewirkte Apoptose inhibieren (Devereaux et al., Nature 388: 300-304, 1997; Roy
et al. EMBO J. 16: 6914-6925, 1997).
Akt hat drei zelluläre Isomere, von denen Akt-3 besonders in Neuronen exprimiert
ist (Datta et al., Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999). Für den Raf-
Signalübertragungsweg in Säugerzellen spielen drei unterschiedliche Raf-Proteine
eine besondere Rolle: C-Raf (auch Raf-1 genannt), A-Raf und B-Raf. Von B-Raf
existieren mehrere durch unterschiedliches Splicen entstandenen Formen. In
Zellen des zentralen Nervensystems kann vorwiegend B-Raf und C-Raf-Protein
nachgewiesen werden, weniger A-Raf-Protein (Morice et al., Eur. J. Neurosci. 11:
1995-2006, 1999).
B-Raf und C-Raf sind nicht nur in Neuronen, sondern auch in Gliazellen
nachzuweisen (Mikaly et al., Brain Res. 27: 225-238, 1993; Mikaly und Rapp,
Acta Histochem. 96: 155-164, 1994).
Obwohl relativ gut geklärt ist, wie Neurotrophine und/oder Membrandepolarisati
on Signaltransduktionswege aktivieren, die das Überleben von Nervenzellen
sichern, ist weitgehend fraglich, welche Mechanismen bei neurodegenerativen
Erkrankungen zum Sterben von Nervenzellen führen. Experimentelle Untersu
chungen (Übersicht bei Yuan und Yankner, Nature 407: 802-809, 2000) geben
Anhaltspunkte, daß das Sterben von Nervenzellen ausgelöst werden kann durch
- - die relative Aktivierung von proapoptotischen Faktoren innerhalb der Nervenzelle, beispielsweise durch mangelnde Phosphorylierung und Inaktivie rung von proapoptotischen Proteinen (Bad, besonders jedoch von Bax) im Rahmen der AKT- und/oder Raf-Signaltransduktionswege
- - die mangelnde Aktivierung (beispielsweise im Rahmen des Raf- Signaltransduktionsweges) von Transkriptionsfaktoren, welche die Transkrip tion von Genen aktivieren, welche antiapoptotische Proteine (z. B. Bcl-2, besonders jedoch Bcl-XL) exprimieren
- - die Schädigung von Mitochondrien mit der Freisetzung von Cytochrome C und der Aktivierung von proapoptotischen Enzymen (Caspasen) beispielswei se durch abnormale Proteinstrukturen oder Aggregate
- - durch Aktivierung von proapoptotischen Signalkaskaden durch Neurotrophine beispielsweise über den Neurotrophin-Rezeptor p75 NTR
- - durch oxidative Schädigungen, NO-Überproduktion oder durch enzymatische Fehlfunktionen, z. B. durch Mutationen der Superoxiddismutase (SOD).
In Anbetracht dieser vielfältigen Möglichkeiten für das Sterben von Nervenzellen
war es bislang äußerst schwierig, Modellsysteme zu etablieren, mit Hilfe derer
Substanzen gezielt gesucht und geprüft werden konnten, welche den Sterbeprozeß
von Nervenzellen hemmen.
Überraschend wurde nun gefunden, daß das durch neurotrophe Faktoren bewirkte
Überleben von sensorischen und motorischen Neuronen von der intrazellulären
Anwesenheit des Signalproteins B-Raf abhängt. Nervenzellen ohne B-Raf sterben
trotz Anwesenheit von neurotrophen Faktoren. Dagegen überleben Nervenzellen,
welche B-Raf aber nicht C-Raf exprimieren, in Anwesenheit von neurotrophen
Faktoren gleichgut wie Nervenzellen, die sowohl B-Raf wie auch C-Raf besitzen
(sogenannte normale (= Wildtyp) Nervenzellen). Grundlage dieser Erfindung ist
somit der überraschende Befund, daß ein funktionsfähiges (d. h. enzymatisch
aktives) B-Raf für das Überleben von Nervenzellen notwendig ist. Des weiteren
ist ein überraschender Befund, daß in Nervenzellen mit fehlender B-Raf-Aktivität
die Expression der antiapoptotischen Proteine der IAP/ITA Familie, beispielswei
se von IAP-1, IAP-2 und x-IAP, deutlich vermindert ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Auffinden von pharma
kologisch aktiven Wirkstoffen, welche die Funktion von Zellen des zentralen
Nervensystems beeinflussen, das die folgenden Schritte umfaßt: a) Inkontaktbrin
gen einer Probe mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff, und b) Bestimmen
der Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der Probe.
Unter "Funktionen" von Zellen des zentralen Nervensystems wird beispielsweise
die Reizleitung sowie alle daran beteiligten biochemischen und/oder elektroche
mischen Prozesse verstanden. Desweiteren umfaßt der Begriff Funktion von
Zellen auch das Überleben der Zellen. Das Absterben von Zellen des zentralen
Nervensystems kann beispielsweise durch Testverfahren, die Apoptose nachwei
sen, beobachtet werden. Solche Testverfahren sind beispielsweise "Tunnel-
Assay" (Gavrielli et al., J. Cell Biol., 119: 493-501. 1992, Gold et al., Lab. Invest.
71: 219-225, 1994), Chromatinfragmentierung (Götz et al., Hum. Mol. Genet.
9: 2479-2489, 2000), Zählung von überlebenden und absterbenden Nervenzellen
(Arakawa et al., J. Neurosci. 10, 3507-3515, 1990), die Verwendung von
Testsubstanzen zur Quantifizierung des Zelltods in Zellkultur (Uliasz und Hewett,
J. Neurosci. Methods 100, 157-163, 2000), Quantifizierung der Expression von
Zelltod-assoziierten Genen in Nervenzellen, wie beispielsweise Cyline (Timsit et
al., Eur. J. Neurosci. 11, 263-278, 1999) und Bestimmung des neuronalen
Zelltods nach Zugabe von Aß (Iwasaki et al., Mol. Psych. 1, 65-71, 1996) oder
nach Induktion von oxidativem Stress (Manev et al., Exp. Neurol. 133, 198-206,
1995).
Zellen des zentralen Nervensystems im Sinne der vorliegenden Erfindung sind
Gliazellen oder neuronale Zellen, beispielsweise sensorische und sympathische
neuronale Zellen, motorische neuronale Zellen, cholinerge Neurone des basalen
Vorderhirns, dopaminerge Nervenzellen des Mittelhirns (Substantia nigra),
Körnerzellen und Purkinje-Zellen des Kleinhirns und des Hippocampus, retinale
Ganglienzellen und Photorezeptoren sowie neuronale Stammzellen.
Das Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff
umfaßt beispielsweise jede Form des Mischens, wobei sowohl die Probe zu dem
potentiellen Wirkstoff hinzugefügt werden kann als auch der potentielle Wirkstoff
zur Probe. Die Probe und/oder der potentielle Wirkstoff können dabei jeweils als
Feststoff, Lösung, Suspension, Aufschlemmung oder an eine feste Phase
gebunden vorliegen. Wenn es sich bei der Probe mit der (die) potentiellen
Wirkstoff(en) in Kontakt gebracht werden, um Zellen handelt, umfaßt der Schritt
des Inkontaktbringens auch im Stand der Technik bekannte Verfahren, die das
Einführen von Substanzen in intakte Zellen erlauben, wie beispielsweise
Infektion, Transfektion und/oder Transformation. Diese Verfahren sind besonders
bevorzugt, wenn es sich bei dem potentiellen Wirkstoff um nackte DNA, Viren,
Viroide, Virosomen und/oder Liposomen handelt, wobei die Liposomen oder
Virosomen auch geeignet sind, neben einem potentiell wirksamen Nukleinsäure
molekül weitere potentielle Wirkstoffe mit der Probe in Kontakt zu bringen. Dem
Fachmann sind eine Reihe weiterer Methoden bekannt, die dazu dienen,
potentielle Wirkstoffe in Zellen einzuführen.
Ein potentieller Wirkstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jede
molekulare Spezies sein, wie beispielsweise ein Peptid (zwischen 1 bis 50
Aminosäuren), ein Protein (mehr als 50 Aminosäuren), ein Peptoid, ein Oligo-
oder Polysaccharid, eine Nukleinsäure, ein Monomer wie beispielsweise ein
Homo- oder Heterozyklus, ein Lipid, ein Steroid und ähnliches. Grundsätzlich
kann jede chemische Substanz oder Substanzmischung ein potentieller Wirkstoff
sein, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird. Die Konzentrati
on des potentiellen Wirkstoffs muß jedoch so gewählt sein, daß die Beeinflussung
der Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der Probe nicht einfach auf der
Lyse der Zellen beruht, wenn die Probe eine Zelle ist, oder auf der Denaturierung
von Raf, insbesondere B-Raf, beruht, wenn die Probe ein Protein oder eine
Proteinmischung ist. Dementsprechend sind beispielsweise Guanidin-HCl-
Lösung, Harnstofflösung und starke Detergenzien, in Konzentrationen in denen
sie Zellen lysieren und/oder Proteine denaturieren, keine potentiellen Wirkstoffe
im Sinne dieser Erfindung.
Eine Probe im Sinne dieser Erfindung ist beispielsweise mindestens eine Zellen,
mindestens ein Zellextrakte, mindestens eine Proteinmischungen und/oder
mindestens eine Mischungen enthalten Raf Protein, insbesondere B-Raf oder
aktiviertes B-Raf, oder einen Teil davon. Die Zellen umfassen beispielsweise pro-
und eukaryotische Zellen, insbesondere Zellen, die als Wildtyp-Zellen Raf,
insbesondere B-Raf exprimieren. In Zellen, die als Wildtyp-Zellen nicht oder nur
in geringerem Maße Raf exprimieren, kann durch dem Fachmann bekannte
Methoden Raf-Protein exprimiert werden. Solche Methode umfassen beispiels
weise Infektion, Transfektion oder Transformation von Zellen mit Vektoren, die
Nukleinsäuren enthalten, die für Raf, insbesondere B-Raf, oder Teile davon
kodieren. Eine bevorzugte Probe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden kann, ist eine Zelle, die eine reduzierte oder keine Raf-
Aktivität, insbesondere B-Raf-Aktivität hat. Eine solche Zell kann beispielsweise
aus heterozygoten oder homozygoten Raf-Knock-out-Mäusen gewonnen werden.
Solche Zellen sind dann beispielsweise für a-raf, b-raf oder c-raf (-/-) oder (+/-).
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte Zellen sind aus
heterozygoten oder homozygoten Raf-Knock-out-Mäusen bzw. Mäuseembryonen
gewonnene Neuronen oder neuronale Stammzellen. Derartige Zellen können
beispielsweise aus b-raf (-/-) defizienten Mäusen gewonnen werden (Wojnowski
et al., Nature Genetics 16: 293-297, 1997).
Desweiteren umfaßt der Begriff Probe auch Zellextrakte, die beispielsweise aus
einer der vorangehend aufgeführten Zellen mit dem Fachmann bekannten
Standardverfahren gewonnen werden können, geeignete Verfahren umfassen sind
aber nicht beschränkt auf "freeze thawing", "sonification" oder "French
pressing". Gegebenenfalls kann ein solcher Zellextrakt in weiteren Schritten
aufgearbeitet bzw. aufgereinigt werden. Bevorzugte Schritte umfassen beispiels
weise Präzipitations-, Filtrations- und chromatographische Verfahrensschritte.
Geeignete chromatographische Verfahren sind dem Fachmann bekannt und
umfassen beispielsweise Anionen- bzw. Kationenaustauschchromatographie,
Affinitätschromoatographie und/oder Größenausschlußchromatographie.
Desweiteren kann die Probe auch eine Mischung gereinigter oder rekombinanter
Proteine enthaltend Raf, insbesondere B-Raf und/oder eine Proteinmischung sein,
die zusätzlich weitere Komponenten enthält, beispielsweise Komponenten, die für
die Bestimmung der Aktivität von B-Raf verwendet werden können, wie
beispielsweise Substrate von Raf, Puffer, Detergentien, Proteaseinhibitoren NTPs
und/oder geeignete Metallionen. Das in der Probe enthaltene Raf-Protein kann B-
Raf-Protein, C-Raf-Protein und gegebenenfalls auch A-Raf-Protein, insbesondere
jedoch B-Raf-Protein, sein. Vorzugsweise ist das in der Probe enthaltene Raf-
Protein ein aktiviertes Raf-Protein, d. h. es hat gegenüber dem wt Raf-Protein eine
erhöhte Serin-/Threoninphosphokinaseaktivität. Raf-Protein wird beispielsweise
durch reversible Phosphorylierung aktiviert. Eine konstitutive Aktivierung ist
jedoch auch durch die Einführung von Mutationen möglich, geeignete Mutationen
betreffen beispielsweise den N-terminalen Bereich des Enzyms, insbesondere in
C-Raf-1 die Mutationen von 259Ser zu 259Ala und die Mutation der analogen
Positionen in B-Raf bzw. Mutationen innerhalb der CR2 Region, Insertion von
Linkerstrukturen in diesen Bereich oder Deletion des kompletten N-Terminus von
Raf-1 (Daum et al. TIBS 19, 474-480, 1994; Morrison und Cutler, Curr. Op. Cell.
Biol. 9, 174-179, 1997).
Das Bestimmen der Aktivität von Raf in der Probe ist durch eine Reihe direkter
und indirekter Nachweisverfahren möglich. Die jeweils geeigneten Verfahren
hängen von der Natur der Probe ab. In Zellen wird die Aktivität von Raf zum
einem durch die Menge des in der Zelle exprimierten Rafs bestimmt und zum
anderen durch die Menge des aktivierten Rafs. Die Aktivierung der Transkription
der für Raf-Protein, insbesondere B-Raf-Protein, kodierenden Gene kann
beispielsweise durch die Bestimmung der Menge der Raf-mRNA erfolgen. Im
Stand der Technik bekannte Standardverfahren zur Bestimmung der Raf-mRNA
Menge umfassen beispielsweise DNA-Chip-Hybridisierung, RT-PCR, "Primer"-
Extension und "RNA-Protection". Des weiteren kann die Bestimmung der Raf-
Aktivität, die auf der Induktion oder Repression der Transkription des (der)
jeweiligen Raf-Gens(e) beruht auch durch die Kopplung des Raf-Promotors an
geeignete Reportergenkonstrukte erfolgen. Beispiele für geeignete Reportergene
sind das Chloramphenicol-Transferasegen, das "Green-fluorescent-protein" (GFP)
und Varianten davon, das Luciferase-Gen und das Renilla-Gen. Der Nachweis der
Steigerung der Expression von Raf-Proteinen kann jedoch auch auf Proteinebene
erfolgen, wobei in diesem Fall die Menge des Proteins beispielsweise durch gegen
Raf-Protein gerichtete Antikörper nachgewiesen wird. Die Änderung der Aktivität
des Raf-Proteins kann jedoch auch auf verstärkte oder erniedrigte Phosphorylie
rung bzw. Dephosphorylierung des Proteins zurückgeführt werden. Beispielswei
se wird die B-Raf-Kinase durch Phosphorylierung der 598Thr- und 601Ser-Reste
reguliert (Zhang B. H. und Guan K. L. EMBO J. 19: 5429, 2000). Die Änderung
der Phosphorylierung von B-Raf-Proteinen kann beispielsweise durch Antikörper
nachgewiesen werden, die gegen phosphoryliertes Threonin bzw. Serin gerichtet
sind.
Da Raf-Proteine Serin-/Threoninkinasen sind, kann die Aktivität der Raf-Proteine
auch über ihre enzymatische Aktivität bestimmt werden. Das Protein MEK ist
beispielsweise ein Substrat von B-Raf und der Grad der Phosphorylierung von
MEK erlaubt die Bestimmung der B-Raf-Aktivität in der Probe. Gleichermaßen
kann die Phosphorylierung anderer Substrate (wie z. B. MBP und Peptide, die
durch Raf spezifisch phosphoriliert werden (Salh et al., Anticancer Res. 19, 731-
740, 1999, Bondzi et al., Oncogene 19, 5030-5033, 2000)) der Raf-Proteine zur
Bestimmung der jeweiligen Aktivität herangezogen werden. Da Raf Teil einer
Signalkaskade ist, in der eine Reihe von Kinasen jeweils durch eine übergeordnete
Kinase phosphoryliert und aktiviert werden, läßt sich die Aktivität von Raf auch
durch die Bestimmung des Phosphorylierungsgrades jeder Raf nachgeordneten
Kinase bestimmen. Dieser sogenannten "map kinase-pathway" führt unter
anderem auch zur gezielten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und dadurch
zur transkriptionellen Aktivierung von Genen, so daß sich die Aktivität von Raf
indirekt durch die Messung der Aktivierung dieser Zielgene bestimmen läßt. Zu
diesen Zielgenen gehören beispielsweise die Gene, die für die Familie der
IAP/ITA-Proteine kodieren. Somit kann die Bestimmung der Aktivität von Raf
auch durch die Bestimmung der Aktivierung von IAP/ITA-Proteinen, insbesonde
re der Aktivierung von IAP-1, IAP-2, x-IAP und Survivin erfolgen. Für die
Bestimmung der Aktivierung der Zielgene eignen sich die vorangehend
aufgeführten Verfahren.
Handelt es sich bei der Probe beispielsweise um ein Zellextrakt, eine Proteinmi
schung und/oder eine Mischung enthaltend Raf, insbesondere B-Raf, oder ein Teil
davon, richtet sich die Bestimmung der Aktivität hauptsächlich auf die Bestim
mung der Modifikation des Raf-Proteins selbst und der sich daraus ergebenden
Änderung der enzymatischen Aktivität des Raf-Proteins, unter Verwendung der
vorangehend bereits beschrieben Methoden. Bevozugte Methoden umfassen die
Bestimmung der Phosphorylierung der unmittelbaren Substrate von Raf, wie
beispielsweise MEK, wobei hier beispielsweise der Einbau von 32P in MEK oder
die Phosphorylierung über ein Aktivierungs-spezifischen MEK-Antikörper, der
nur phosphoryliertes MEK erkennt, (Bondzi C. et al. Oncogene 19: 5030-5033,
2000)) erfolgen kann. Eine weitere Möglichkeit besteht beispielsweise in der
Verwendung eines gekoppelten Assays, der die bereits vorangehend beschriebene
Signaltransduktionskaskade nutzt und die Aktivität von Raf anhand der Phospho
rylierung von Raf nachgeordneten Substraten, wie beispielsweise basischem
Myelin, mißt (Bondzi et al., Oncogene 19, 5030-5033, 2000).
Potentielle Wirkstoffe, die die Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der
Probe im Vergleich zu der unbehandelten Probe (Kontrolle) verstärken oder
hemmen, gelten gemäß dieser Erfindung als pharmakologisch aktive Wirkstoffe,
die die Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems beeinflussen. Ein
pharmakologisch aktiver Wirkstoffe, der die Funktion von Zellen des zentralen
Nervensystems beeinflußt, verändert die Aktivität von Raf gegenüber der
Kontrolle um mehr als 10%, vorzugsweise jedoch um mindestens 50%, um
mindestens 100%, noch bevorzugter um mindestens 500%.
In einer weiteren Ausführungsform kann sich an den Schritt a) eine Inkubation
speriode anschließen, die abhängig von der Probe unterschiedlich lang sein kann.
Wenn es sich bei der Probe um Zellen handelt, wird die Aktivität (Schritt b) nach
ca. einer Stunde bis 100 Tagen, vorzugsweise nach ca. 1 Tag bis 50 Tage noch
bevorzugter nach ca. 3 Tagen bis 10 Tagen, insbesondere nach 3 Tagen bestimmt.
Wenn es sich bei der Probe nicht um Zellen handelt, kann die Aktivität beispiels
weise in einem Zeitraum von ca. 0 Sekunden (Messung der Aktivität unmittelbar
beim Inkontaktbringen) bis 20 Tage bestimmt werden. Vorzugsweise beträgt der
Zeitraum für die Inkubation nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem
potentiellen Wirkstoff jedoch ca. 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150 oder 180 min.
(McDonald et al., Analyt. Biochem. 268, 318-329, 1999).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens,
enthält die Probe mindestens eine Zelle, mindestens ein Zellextrakt, mindestens
eine Protein-Mischung und/oder eine Mischung enthaltend Raf, insbesondere
aktiviertes Raf oder ein Teil davon. Ein für die Durchführung des erfindungsge
mäßen Verfahrens geeigneter Teil eines Raf-Proteins, kann noch phosphoryliert
werden und/oder kann noch auf des jeweilige Substrate, wie beispielsweise MEK,
als Serien- und/oder Threoninkinase wirken kann. Die Bestimmung eines
geeigneten Teils von Raf ist unter Verwendung von beispielsweise MEK als Raf
Substrat oder von Raf-Kinase-Kinase (Kinuya M et al. (2000) Biol. Pharm Bull.
23: 1158-62) zur Phosphorylierung von Raf mit Standardverfahren möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die
Zelle eine Gliazelle oder eine neuronale Zelle, insbesondere ein sensorische
neuronale Zelle, eine motorische neuronale Zelle, eine neuronale Stammzelle oder
ein Neuron ist, wobei ein Neuron, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden kann, beispielsweise aus neuronalen Stammzellen in Zellkultur
differenziert werden kann (Vescovi und Snyder, Brain Pathol. 9, 569-598, 1999).
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität
von Raf in der Zelle über eine Veränderung der Überlebensrate der Zelle
bestimmt. Dies ist von besonderen Interesse bei Zellen, die beispielsweise auf
Grund einer Mutation eine reduzierte oder keine Raf-Aktivität besitzen und die
deshalb in Anwesenheit oder Abwesenheit von neurotrophen Faktoren eine
verringerte Überlebensrate im Vergleich den jeweiligen wt-Zellen besitzen.
Insbesondere Zellen, die für b-raf (-/-) sind, haben selbst in Anwesenheit
neurotropher Faktoren eine deutlich verkürzte Überlebensrate gegenüber wt-
Zellen. Eine Verlängerung der Überlebensrate dieser Zellen nach Inkubation mit
mindestens einem potentiellen Wirkstoff dient dabei als indirektes Mittel der
Bestimmung der Aktivität von Raf.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden als Probe sensorische und/oder spinale, motorische neuronale Zellen aus
b-raf (-/-) oder c-raf (-/-) defizienten Mäuseembryonen jeweils aus der Paarung
von b-raf oder c-raf heterozygoten Mäusen eingesetzt. Darüber hinaus können
von diesen Mäuseembryonen neurale Stammzellen aus Gehirn und Rückenmark
isoliert, in Zellkultur propagiert und zu Nervenzellen differenziert werden. Die
Zugabe von geeigneten neurotrophen Faktoren (beispielsweise GDNF, BDNF,
CNTF zu motorischen Neuronen und NGF zu sensorischen Neuronen) führt zum
Überleben von c-raf defizienten Nervenzellen, jedoch nicht zum Überleben von b-
raf defizienten Nervenzellen. Ähnliche Untersuchungen können mit Nervenzellen
durchgeführt werden, die von neuralen Stammzellen aus b-raf (-/-) und/oder c-raf
(-/-) Mäusen isoliert wurden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden jeweils der
(die) gleiche(n) potentielle(n) Wirkstoff(e) zum einen mit c-raf (-/-) defizienten
Zellen und zum anderen mit b-raf (-/-) defizienten Zellen in Kontakt gebracht und
bestimmt, ob in Anwesenheit dieses(er) Prüfsubstanz(en) b-raf (-/-) defiziente
Nervenzellen überleben.
Diese indirekte Bestimmung erlaubt es auch, pharmakologische Wirkstoffe
aufzufinden, die in Zellen mit verringerter Raf-Aktivität oder ohne nachweisbare
Raf-Aktivität, in eine der Raf-Kinase nachgeordnete Signalübertragungsreaktio
nen eingreifen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird
die Aktivität von Raf in der Probe durch die Menge des Raf-Proteins, die Menge
der für Raf kodierende Nukleinsäuren und/oder die enzymatische Aktivität von
Raf direkt oder indirekt bestimmt. Geeignete Verfahren sind bereits im vorange
henden beschrieben worden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden
jeweils der (die) gleiche(n) potentielle(n) Wirkstoff(e) zum mit einem Zellextrakt
oder mit einer Proteinmischung enthaltend C-Raf oder mit gereinigtem oder mit
rekombinanten C-Raf und zum anderen mit einem Zellextrakt oder einer
Proteinmischung enthaltend B-Raf oder mit gereinigtem oder mit rekombinanten
B-Raf in Kontakt gebracht und jeweils die Aktivität von C-Raf und B-Raf
bestimmt. Ein bevorzugter pharmakologischer Wirkstoff beeinflußt die Aktivität
von B-Raf stärker als die Aktivität von C-Raf. Eine stärkere Beeinflussung liegt
dann vor, wenn der Effekt auf die Aktivität auf B-Raf mindestens ca. 2-fach, mehr
bevorzugt ca. 4-fach, insbesondere ca. 10-fach größer ist als der Effekt auf die
Aktivität von C-Raf.
Ein weiterer Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren, in
dem in einem weiteren Schritt die Aktivität und/oder Menge von IAP-1, IAP-2, x-
IAP und/oder Survivin in der Probe bestimmt wird. Vorzugsweise ist in diesem
Verfahren die Probe eine Zelle. Die Bestimmung der Aktivität und/oder Menge
von IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin kann auf Proteinebene durch
Antikörper und/oder auf Nukleinsäureebene, wie vorangehend beschrieben,
erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die
Probe kompartimentalisiert, beispielsweise auf einer Mikrotiterplatte mit 96, 348
oder 1552 Vertiefungen. Solche Mikrotiterplatten werden bereits routinemäßig in
vollautomatischen, massivparallelen Testverfahren eingesetzt, die es erlauben in
kurzer Zeit hunderttausende verschiedene potentielle Wirkstoffe zu testen.
Grundsätzlich ist jede Kompartimentalisierung geeignet, die es ermöglicht, die
Wirkung des mit der Probe in Kontakt gebrachten potentiellen Wirkstoffs
räumlich zu beschränken, so daß die Auswirkung des jeweilig verwendeten
potentiellen Wirkstoffs auf die Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, in der
Probe bestimmt werden kann. Die Probe kann kovalent oder nicht-kovalent mit
der Oberfläche des Probenträgers, wie beispielsweise einer Mikrotiterplatte,
verknüpft sein oder in Lösung, Suspension oder Aufschlämmung vorliegen.
Neben den im Stand der Technik bekannten verschiedenen Mikrotiterplattenfor
maten, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind
jedoch auch planare oder beispielsweise durch Vertiefungen oder Kanäle
strukturierte Probenträger geeignet. Der Probenträger kann beispielsweise aus
Glas, Silizium, Metall oder Kunststoff sein.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist
mindestens ein potentieller Wirkstoff kovalent oder nicht-kovalent mit einem
Probenträger verknüpft, wobei die Oberfläche des Probenträgers vorzugsweise in
Form von Vertiefung, Kanälen oder auch planar strukturiert ist. Die Probe wird
dann mit dem immobilisierten potentiellen Wirkstoff in Kontakt gebracht und die
Aktivität von Raf, insbesondere von B-Raf, in der Probe an der jeweiligen
Immobilisierungsstelle des (der) potentiellen Wirkstoff(e) bestimmt. Beispiels
weise kann mit nach Standardverfahren hergestellten Proteinchips, die beispiels
weise aus WO 89/10977, WO 90/15070, WO 95/35505 und US 5,744,305
bekannt sind, ein Proteinchip hergestellt werden, der an der Oberfläche unter
schiedliche Peptidfragmente enthält, deren Einfluß auf die Aktivität von
beispielsweise Raf-Protein, vorzugsweise gereinigtes B-Raf-Protein, getestet
werden kann. Gleichermaßen können auch auf einer Oberfläche durch im Stand
der Technik bekannte kombinatorisch-chemische Verfahren eine Vielzahl
verschiedener chemische Substanzen erzeugt werden, deren Wirkung auf die
Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, durch das erfindungsgemäße Verfahren
untersucht werden kann.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein
Verfahren, bei dem sich an die Bestimmung der Aktivität von B-Raf in der Probe
ein oder mehrere weitere Schritte anfügen, in denen der pharmakologisch aktive
Wirkstoff isoliert wird. Dies ist insbesondere dann von Interesse, wenn es sich bei
dem potentiellen Wirkstoff um eine Mischung von Wirkstoffen handelt, wie sie
beispielsweise in Pflanzenextrakten oder Extrakten aus Mikroorganismen
gefunden werden. Der (die) weitere(n) Schritt(e), die verwendet werden können,
um aus einer komplexen Substanzmischung einen pharmakologisch aktiven
Wirkstoff zu isolieren, sind im Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren
umfassen beispielsweise Präzipitations-, Kristallisations-, chromatographische
und Separationsverfahren, die beispielsweise auf differenzieller Löslichkeit der
Einzelkomponenten in unterschiedlichen Lösungsmitteln beruhen. Nach jedem
Isolationsschritt kann erneut die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch Inkontaktbrin
gen mit einer Probe und das Bestimmen der Aktivität von Raf in der Probe
erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der
pharmakologisch aktiver Wirkstoff in einem weiteren Schritt konfektioniert.
Nachdem gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein pharmakologisch aktiver
Wirkstoff bestimmt und/oder isoliert worden ist, kann dieser pharmakologisch
aktive Wirkstoff mit dem Fachmann bekannten Methoden, die beispielsweise
Modifikation mit Halogenen, insbesondere mit Fluor oder Chlor, und/oder
kombinatorisch chemische Ansätze umfassen, modifiziert werden und erneut in
dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden, wobei die Aktivität von
Raf in der Probe des modifizierten pharmakologisch aktiven Wirkstoffes mit der
Aktivität von Raf in der Probe bei Verwendung des Ausgangswirkstoffes
verglichen wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein pharma
kologisch aktiver Wirkstoff der durch eines der vorangehend beschriebenen
Verfahren aufgefunden wird. Besonders bevorzugt sind pharmakologische aktive
Wirkstoffe, die die Aktivität von Raf, insbesondere B-Raf, verstärken, wobei eine
Veränderung der Überlebensrate der Zellen des zentralen Nervensystems eine
besonders bevorzugte Wirkung des (der) pharmakologisch aktiven Wirkstoffs(en)
ist. Vorzugsweise verstärken oder hemmen die pharmakologisch aktiven
Wirkstoffe, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung aufgefunden
worden sind, die Aktivität von B-Raf, nicht jedoch von C-Raf oder A-Raf.
Zur Auffindung von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, die die Aktivität von
B-Raf beeinflussen, vorzugsweise verstärken oder hemmen, nicht jedoch die von
C-Raf, können zur Kontrolle Zellen eingesetzt werden, denen das c-raf-Gen fehlt.
Derartige Zellen können beispielsweise aus c-raf (-/-) defizienten Mäusen
gewonnen werden (Wojnowski et al., Mech. Dev. 76: 11-149, 1998).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur in vitro
Analyse der Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß die Aktivität von Raf, insbesondere von B-Raf, IAP-1,
IAP-2, x-IAP und/oder Survivin in den Zellen und/oder Zellextrakten bestimmt
wird. Zu diesem Zweck werden Zellen des zentralen Nervensystems aus dem
Patienten entnommen. Diese Zellen können nun unmittelbar auf die Aktivität der
vorangehend beschriebenen Proteine getestet werden, wobei entweder eines der
vorangehend beschriebenen Verfahren auf die Zelle selbst oder auf aus der Zelle
gewonnene Zellextrakte angewendet wird. Desweiteren ist es möglich, die aus
dem Patienten isolierten Zellen zu kultivieren, wobei im Stande der Technik
bekannte Verfahren zur Kultivierung von Zellen des zentralen Nervensystems
angewendet werden können. Dies ist beispielsweise wünschenswert, wenn die
Zahl der isolierten Zellen des zentralen Nervensystems gering ist und/oder die
Analyse nicht unmittelbar nach der Entnahme der Zellen stattfinden kann. Die
Kultivierung erlaubt es zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt die Aktivität der
vorangenannten Proteine entweder direkt in den Zellen und/oder Zellextrakten zu
bestimmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnostikum zur in
vitro Analyse der Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems, das
mindestens ein Mittel zum Nachweis der Aktivität von Raf, insbesondere von B-
Raf, IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin enthält.
Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum enthält beispielsweise ein oder mehrere
DNA-Oligonukleotidpaare, die die Vervielfältigung (PCR) von DNA-
Fragmenten, insbesondere cDNA-Fragmenten, die für die Proteine Raf,
insbesondere B-Raf, IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin kodieren, erlauben.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Diagnostikum enthält ein DNA-Sondenpaar
zum Nachweis der Aktivität von B-Raf und ein weiteres Sondenpaar zum
Nachweis der Aktivität von A-Raf, C-Raf, IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder
Survivin. Weitere erfindungsgemäße Diagnostika der vorliegenden Erfindung
umfassen beispielsweise Antikörper, die gegen Raf, insbesondere B-Raf, IAP-1,
IAP-2, x-IAP, Survivin, aktiviertes Raf, insbesondere aktiviertes B-Raf und/oder
ein Protein, daß direkt oder indirekt von Raf aktiviert wird, wie beispielsweise
MEK, gerichtet ist. Ein bevorzugter Gegenstand des erfindungsgemäßen
Diagnostikums besteht aus mindestens zwei Antikörpern, ausgewählt aus den
vorgenannten Antikörpern. Bevorzugte Kombinationen sind hierbei ein
Antikörper gegen B-Raf und gegen aktiviertes B-Raf, gegen aktiviertes B-Raf und
IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem zum
Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, die die Funktion von Zellen
des zentralen Nervensystems beeinflussen. Das Testsystem enthält:
- a) mindestens eine Probe, insbesondere mindestens eine Zelle, mindestens einen Zellextrakt, mindestens eine Proteinmischung und/oder mindestens eine Mischung enthaltend Raf, vorzugsweise aktiviertes Raf, oder einen Teil davon; und
- b) mindestens ein Mittel zum Nachweis der Raf-Aktivität, insbesondere der B-Raf-Aktivität.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Testsystems ist die Probe komparti
mentalisiert, beispielsweise auf einer Mikrotiterplatte mit 96, 348 oder 1552
Vertiefungen. Solche Mikrotiterplatten werden bereits routinemäßig in vollauto
matischen, massivparallelen Testverfahren eingesetzt. Grundsätzlich ist jede
Kompartimentalisierung geeignet, die es ermöglicht, die Wirkung des mit der
Probe in Kontakt gebrachten potentiellen Wirkstoffs räumlich zu beschränken, so
daß die Auswirkung des jeweilig verwendeten potentiellen Wirkstoffs auf die
Aktivität von Raf in der Probe bestimmt werden kann. Die Probe kann kovalent
oder nicht-kovalent mit der Oberfläche des Probenträgers, wie beispielsweise
einer Mikrotiterplatte, verknüpft sein oder in Lösung, Suspension oder Auf
schlämmung vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel zur
Behandlung von Erkrankung, die mit einer Störung der Funktion von Zellen des
zentralen Nervensystems einhergehen, wobei das Arzneimittel Raf, insbesondere
B-Raf, und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe enthält. Das
Arzneimittel kann beispielsweise Raf-Protein und/oder für Raf-Protein kodierende
DNA-Abschnitte enthalten. Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe sind beispielsweise
Proteaseinhibitoren, Detergenzien, Puffer, virale Vektoren, wie z. B. rekombinante
Adenoviren (Gravel et al., Nature Med. 3: 765-770, 1997), Transfektionsreagenzi
en, wie z. B. Lipofektamine und Substanzen mit vergleichbarer Wirkungsweise
(Götz et al., Hum. Mol. Genet. 9: 2479-2489, 2000) oder Pufferreagenzien für den
Transfer von Expressionsvektoren in Zellen mit transienter Membranpermeabili
sierung (Wiese et al., Nature Neurosci. 2: 978-983, 1999).
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bei Störungen
der Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems verwendet, die durch eine
Verringerung der Überlebensrate der Zellen charakterisiert sind, wie beispielswei
se Cerebrale Ischemie (Schlaganfall), Amylotrophe Lateralsklerose (ALS),
Alsheimer Erkrankung, Nerv-Läsionen, Multiple Sklerose, Morbus Parkinson,
Diabetische Neuropathie, Spinale Muskelatrophie Prionenerkrankungen, wie z. B.
Creutzfeld-Jakob Desease (CJD).
Ein bevorzugtes Arzneimittel der vorliegenden Erfindung enthält Raf, insbesonde
re B-Raf, in einem Vektor. Der Begriff Vektor im Sinne der vorliegenden
Erfindung betrifft Plasmidvektoren, insbesondere episomalreplizierende
Plasmidvektoren, virale Vektoren, wobei geeignete virale Vektoren beispielsweise
Herpesviren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren, Papilloma Viren oder HIV 1
sind oder von diesen Viren abgeleitet sind. Dem Fachmann sind eine Reihe
weiterer Vektoren bekannt, die gleichermaßen zum Transfer von Raf-Protein,
insbesondere B-Raf-Proteinen und/oder zum Transfer von Nukleinsäuren, die für
Raf-Protein kodieren, insbesondere für B-Raf, geeignet sind, wie beispielsweise
Liposomen, Virosomen, Fusionsproteine mit z. B. Antennapedia (Thoren et al.,
FEBS Lett. 482: 265-268, 2000) oder HIV-TAT (Arese et al., J. Immunol. 166:
1380-1388, 2001).
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung nur näher beschreiben, ohne sie zu
beschränken.
b-raf (+/-) heterozygote oder c-raf (+/-) heterozygote Elterntiere wurden
rückgekreuzt (Wojnowski et al., Mech. Dev. 76: 141-149, 1998; Nature Genet.
16: 293-297, 1997). Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die homozygot
waren für b-raf (-/-) oder c-raf (-/-), wurden spinale Motoneurone mit Hilfe der
Panningtechnik (Metzger et al., J. Neurosci. 18: 1735-1742, 1998) unter
Verwendung eines monoklonalen Ratte-anti p75-Antikörpers (Chemicon,
Hofheim, Deutschland) isoliert. Hierzu wurden die ventrolateralen Teile des
lumbalen Rückenmarks mechanisch zerkleinert, in Hepespuffer-Lösung
(enthaltend 10 µM 2-Mercaptoethanol) übertragen und mit Trypsin (0,05%, 10 min)
inkubiert. Die Einzelzellsuspension im Überstand wurde in eine mit dem anti
p75-Antikörper beschichteten Kulturschale überführt und bei Raumtemperatur für
30 min. inkubiert.
Nachfolgend wurden die einzelnen Kulturschalen gewaschen, anschließend die
anhaftenden Zellen von der Kulturplatte durch 0,8% Kochsalzlösung enthaltend
35 mM KCl und 1 µM 2-Mercaptoethanol abgelöst.
Die so gewonnen Zellen wurden in einer Dichte von 2000 Zellen/cm2 in
Kulturplatten (Greiner, Nürtingen, Deutschland), die mit Polyornithin und
Laminin vorbeschichtet waren, ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C in
Neurobasalmedium (Life Technologies, ergänzt mit B27-Supplement, 10%
Pferdeserum, 500 µM Glutamax und 50 µg/ml Apotransferrin) und in einer 5%
CO2 Atmosphäre gehalten. 50% des Zellkulturmediums wurden am Tag 1 und
nachfolgend jeden 2. Tag ersetzt.
Die Analyse der mRNA für IAP-1, IAP-2, x-IAP und t-IAP (Survivin) wurde mit
Hilfe der RT-PCR durchgeführt. RNA wurde mittels Trizol-Reagenz (Life-
Technologies, Karlsruhe) isoliert und je 10 ng Gesamt-RNA wurde für eine RT-
PCR Reaktion eingesetzt. Die Primer-Sequenzen zur Amplifikation von IAP-1,
IAP-2, x-IAP und t-IAP (Survivin) waren wie folgt: IAP-1f: 5'-
TACTACATAGGACCTGGAGA-3', IAP-1r: 5'-CCCACCATCACAGCAAAA-
3' Anlagerungstemperatur: 55°C; IAP-2f: 5'-GGAGAAGAAAATGCTGACCC-
3', IAP-2r: 5'-GCTTGTAAGGGTATCTGTGT-3' Anlagerungstemperatur 55°C;
x-IAPf: 5'-TGCAAGAGCTGGATTTTATG-3', x-IAPr: 5'-CCCGATCTGGCA
GCTGTACC-3' Anlagerungstemperatur 55°C; t-IAP (SURVIVIN), tIAPf: 5'-CCA
GAT CTG GCA GCT GTA CC-3' und tIAPr: 5'-GCC AGC TGC TCA ATT
GAC TG-3', Anlagerungstemperatur 64°C. Als Kontrolle für die Integrität der
RNA wurde ein Teil der β-Actin mRNA mit folgenden Primern amplifiziert: β-
actinf: 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3', β-actinr 5'-CTCTTTAATGT
CACGCACGATTTC-3', Anlagerungstemperatur 64°C. Die RT-PCR wurde
entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit Random-Hexamer Primern
durchgeführt. Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: 94°C, 30 sec,
indizierte Anlagerungstemperatur, 1 min. 72°C, 1 min. IAP-1 und t-IAP
(Survivin) wurden für 33 and 35 Zyklen, IAP-2 und x-IAP für 28 und 30 Zyklen
und β-actin für 26 und 28 Zyklen. Die RT-PCR an RNA von E 12.5-Gehirnen von
b-raf und c-raf +/- Verpaarungen ergab eine deutliche Verminderung um
durchschnittlich 60% bzw. 55% für IAP-1 bei b-raf und c-raf -/- Embryonen im
Vergleich zur Wildtyp Kontrolle, von 52% für IAP-2 bei b-raf -/- und 46% für
x-IAP bei b-raf -/- Embryonen im Vergleich zur Wildtyp Kontrolle.
Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die homozygot waren für b-raf (-/-)
oder c-raf (-/-), wurden des weiteren sensorische Neurone isoliert. Hierzu wurden
dorsale Wurzelganglien isoliert, in PBS und mit Trypsin (0,05% in Hepespuffer)
für 30 min. inkubiert. Die Trypsinverdauung wurde durch Zugabe von L15-
Medium enthaltend 10% Pferdeserum gestoppt und nachfolgend die Zellen in
Kulturplatten für 3-4 Stunden ausplattiert. Zellen im Überstand wurden zentrifu
giert (10 min. 400 g) und das Zellsediment genauso wie bereits für spinale
Motoneurone beschrieben im Neurobasalmedium gehalten.
Neurale Stammzellen werden aus dem Gehirn von normalen, b-raf (-/-) oder c-raf
(-/-) defizienten Mausembryonen isoliert. Der Bereich des Vorderhirns wird unter
einem Präparationsmikroskop entnommen, in weiter entwickelten Embryonen
auch der Bereich des Hippocampus und der periventrikulären Zone. Diese
Gehirnareale werden dann in 200 µl HBSS (Hanks balanced salt solution (HBSS,
Life Technologies, Karlsruhe), transferiert, mit 0,1% Trypsin (Endkonzentration
in HBSS) für 10 min bei 37°C, inkubiert, die Reaktion mit 0,1% Trypsin-Inhibitor
(Trypsin-Inhibitor aus egg yolk sack (Sigma, Deisenhofen), Stammlösung: 1% in
HBSS/25 mM HEPES) Endkonzentration in HBSS abgestoppt. Dann werden die
Zellen 10x mit einer 200 µl Pipette trituriert und in Medium [(Neurobasal-
Medium (Life Technologies), B27 Supplement (Life Technologies Stock 50x, EK
1x) Glutamax II (Life Technologies Stock 100x, EK 1x), basicFGF (20 ng/ml),
EGF (20 ng/ml)l] in ein Volumen von 5 ml überführt. Die dissoziierten Zellen
werden in Sarstedt Schalen (50 ml) kultiviert (Brutschrank, 37°C, 5% CO2
feuchtigkeitsgesättigte Atmosphäre), das Medium alle zwei Tage gewechselt. Die
Zellen wachsen als Embroid Bodies und attachieren nicht, daher werden die
Zellen zum Mediumwechsel in ein Falcon-Röhrchen überführt und 5 min bei 400 g
zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellsediment trituriert und
in frisches Medium aufgenommen. Spätestens nach 3 Passagen bilden sich große
Embroid Bodies, die trypsiniert (s. o.) und in niedriger Zelldichte (max. 10000
Zellen/Platte) auf 10 cm Schalen (Sarstedt) plattiert werden können. Einzelzellen
werden dann gepickt und zunächst in 96er Platten, später in 24er und 12 well
Platten expandiert. Diese Einzelzellklone neuraler Stammzellen können dann auf
ihre Differenzierungskapazität hin untersucht werden und anschließend in
Testverfahren eingesetzt werden.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, werden die Zellen auch als Linien
etabliert und für spätere Experimente eingefroren und gelagert.
Das Einfrieren der neuralen Stammzellen erfolgt nach Standardprotokoll, d. h.
nach der Zentrifugation werden die Zellen in Medium mit 10% DMSO
aufgenommen und mit 1 C/min zunächst auf -86°C abgekühlt (im MrFrosti) um
dann im flüssigen N2 bei -186°C gelagert zu werden.
Zu Motoneuronen wurden als neurotrophische Faktoren GDNF, BDNF und CNTF
(jeweils 1 ng/ml) und zu sensorischen Neuronen NGF (1 ng/ml) hinzugegeben. In
Kontrollkulturen normaler Embryonen überlebten[? basierend auf Adhärenz?]
nach 3 Tagen ohne Zugabe der jeweiligen neurotrophen Wachstumsfaktoren nur
ca. 10-25% der Zellen, mit Zugabe der jeweiligen Wachstumsfaktoren jedoch
etwa 70% der ursprünglich eingesäten neuronalen Zellen. Während neuronale
Zellkulturen von c-raf (-/-), c-raf (+/-) oder b-raf (+/-) defizienten Embryonen
diesbezüglich keinen Unterschied zu Kulturen von normalen Embryonen
aufwiesen, konnte kein Effekt neurotropher Faktoren auf das Überleben von
Motoneuronen oder sensorischen Neuronen von b-raf (-/-) defizienten Embryonen
nachgewiesen werden. Bei b-raf (-/-) defizienten Neuronen lag die Überlebensrate
nach 3 Tagen Zellkultur mit oder ohne neurotrophe Faktoren bei Werten, die
kleiner als 3% der eingesäten Neuronen waren.
Diese Ergebnisse zeigen, daß B-Raf ein entscheidendes signaltransduzierendes
Protein für das Überleben von sensorischen wie auch motorischen Nervenzellen
ist.
Somit können Nervenzellen, die beispielsweise mit der oben angeführten Methode
gewonnen sind, für die Suche nach Substanzen benutzt werden, welch Nerven
zellen vor Zelltod schützen.
Hierzu werden b-raf (-/-), b-raf (+/-), c-raf (-/-) defiziente und normale motori
sche Neuronen und sensorische Neuronen wie oben beschrieben gewonnen, in
Zellkulturen ausgesät und mit der Prüfsubstanz versetzt. Nervenzell-schützende
Substanzen sind in der Lage, das Absterben von b-raf (-/-) Neuronen zu
verhindern, ohne das Überleben von b-raf (+/-), c-raf (-/-) oder normalen
Neuronen zu beeinträchtigen.
Zur modellhaften Prüfung des Verfahrens wurden sensorische neuronale Zellen
mit einem Plasmid (pCDNA3), das den offenen Leserahmen des B-Raf Gens
enthielt (Wojnowski et al. Mech. Dev. 91: 97-104, 2000), oder mit einem LacZ-
Expressionsplasmid mit der von Wiese et al. (Nature Neurosci. 2: 987-983, 1999)
angegebenen Methode transfiziert und das Überleben der so transfizierten
Neuronen in der Zellkultur ermittelt.
Während nicht-transfizierte und mit dem LacZ-Expressionsplasmid transfizierte
b-raf (-/-) defiziente Neuronen in Zellkultur mit und ohne neurotrophe Faktoren
starben, erwiesen sich b-raf (-/-) defiziente Neuronen, die mit einem das b-raf Gen
enthaltene Plasmid transfiziert wurden, als überlebensfähig. Immunfluoreszens
untersuchungen an überlebenden b-raf (-/-) defizienten neuronalen Zellen, die mit
einem das b-raf Gen enthaltenden Plasmid transfiziert worden waren, ergaben mit
einem für das B-Raf Protein spezifischen Antikörper (Sithanandam et al.,
Oncogene 5: 1775-1780, 1990), daß diese Zellen das B-Raf Protein enthielten.
Diese Untersuchungen zeigen, daß durch eine geeignete Wirksubstanz (Plasmide
kodierend für B-Raf) b-raf (-/-) defiziente neuronale Zellen vor dem Absterben
geschützt werden können, dieses Verfahren somit geeignet ist für die Auffindung
von Nervenzell-schützenden Substanzen.
Claims (15)
1. Verfahren zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, welche
die Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems beeinflussen, das die
folgenden Schritte umfaßt:
- a) Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einem potentiellen Wirk stoff; und
- b) Bestimmen der Aktivität von B-Raf in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe mindestens eine Zelle, minde
stens einen Zellextrakt, mindestens eine Proteinmischung und/oder eine Mi
schung enthaltend B-Raf, insbesondere aktiviertes B-Raf, oder einen Teil da
von, enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine Gliazelle; eine neuronale
Zelle, insbesondere eine sensorische, sympathische oder motorische neuro
nale Zelle; eine neuronale Stammzelle; ein Neuron, insbesondere ein choli
nerges Neuron des basalen Vorderhirns, eine dopaminerge Nervenzelle des
Mittelhirns, eine Körnerzelle eine Purkinje-Zelle des Kleinhirns oder des
Hippocampus; eine retinale Ganglienzelle oder ein Photorezeptor ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die Zelle eine redu
zierte oder keine B-Raf Aktivität hat.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aktivität von B-Raf
in der Zelle über eine Veränderung der Überlebensrate der Zelle bestimmt
wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aktivität von B-Raf
in der Probe durch die Menge des B-Raf-Proteins, die Menge der für B-Raf
kodierenden Nukleinsäuren und/oder die enzymatische Aktivität von B-Raf
direkt oder indirekt bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in einem weiteren Schritt
die Aktivität von IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin bestimmt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in einem weiteren Schritt
der pharmakologisch aktive Wirkstoff isoliert wird.
9. Wirkstoff, der durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, auf
gefunden wird.
10. Verfahren zur in vitro Analyse der Funktion von Zellen des zentralen Nerven
systems, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität von B-Raf, IAP-1, IAP-2,
x-IAP und/oder Survivin in den Zellen und/oder Zellextrakten bestimmt wird.
11. Diagnostikum zur in vitro Analyse der Funktion von Zellen des zentralen
Nervensystems, enthaltend mindestens ein Mittel zum Nachweise der Akti
vität von B-Raf, IAP-1, IAP-2, x-IAP und/oder Survivin.
12. Testsystem zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, wel
che die Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems beeinflussen, ent
haltend:
- a) mindestens eine Probe; und
- b) mindestens ein Mittel zur Bestimmung von B-Raf Aktivität in der Probe.
13. Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Störung der
Funktion von Zellen des zentralen Nervensystems einhergehen, enthaltend B-
Raf und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
14. Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei die Störung der Funktion von Zellen
des zentralen Nervensystems durch eine Verringerung der Überlebensrate der
Zellen charakterisiert ist.
15. Arzneimittel nach Anspruch 13 oder 14, wobei B-Raf in einem Vektor ent
halten ist.
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