DE69027025T2 - Testverfahren für und behandlung von autoimmunkrankheiten - Google Patents
Testverfahren für und behandlung von autoimmunkrankheitenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft im allgemeinen Fortschritte, die auf dem Gebiet der Prognose, Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen gemacht wurden. Insbesondere betrifft die Erfindung bestimmte Assays auf, und die folgliche Behandlung von Autoimmunerkrankungen, basierend auf der hier vorgenommenen Identifizierung und Charakterisierung eines einzigartigen Fehlers im Ionenkanal, von dem gefunden wurde, daß der mit abnormalen T-Zellen, die mit solchen Erkrankungen verknüpft sind, assoziiert ist. Assays, prognostische Marker und therapeutische Modalitäten für solche Autoimmunerkrankungszustände werden definiert und beschrieben.
- Autoimmunerkrankungen sind wegen der beträchtlichen Morbidität, die sie weltweit verursachen, Gegenstand weitverbreiteter Presseaufmerksamkeit. Autoimmunerkrankungen umfassen rheumatoide Arthritis, Typ-1-Diabetes-mellitus (insulinabhängig), multiple Sklerose, Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, verschiedene Bindegewebserkrankungen, experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), um einige aufzuführen. Beträchtliche Forschung wurde unternommen und wird gegenwärtig noch unternommen, nicht nur, um eine Behandlung oder Prophylaxe gegen solche zerstörerischen Krankheiten zu entwickeln, sondern auch um die zugrundeliegende Ätiologie bzw. Ätiologien zu studieren, so daß ein besseres Verständnis bezüglich gemeinsamer Nenner, sofern vorhanden, gewonnen werden kann, die direkter einen Angriffsplan zu deren Besiegung focussieren würden.
- Es wird angenommen, daß in den meisten Fällen Autoimmunerkrankungen das Ergebnis abnormaler Zellen des Immunsystems sind, die Zielgewebe entweder durch direkte Abtötung oder durch Bildung von Autoantikörpern zerstören. Man kann sich beispielsweise auf historische Autoimmunerkrankungen focussieren. Eine derartige ist der sogenannte systemische Lupus erythematodes (SLE). Bei SLE produzieren abnormale B-Lymphozyten Anti-DNA-Antikörper, die positiv geladen sind und sich auf den negativ geladenen Nierenzellen aggregieren, wodurch Entzündung und Nephritis hervorgerufen werden, was für SLE symptomatisch ist. Bei Diabetes mellitus zerstören abnormale T-Zellen systematisch die pankreatischen Inselzellen, so daß sie sich als unfähig erweisen, Insulin zu produzieren, was ein notwendiges Hormon für metabolische Ausgeglichenheit in einem Organismus ist. Bei multipler Sklerose zerstören abnormale T-Zellen vermutlich das Myelin-Grundprotein, eine Hauptkomponente der Nervenzellen, was systematisch bestimmte Nervenzellen zerstört, was ein Spektrum von neurologischen Symptomen verursacht. Bei den bisher untersuchten Autoimmunerkrankungen scheint ein gemeinsames Muster abnormaler Zellen des Immunsystems aufzutreten, die Substanzen produzieren, die entweder bestimmte Zielgewebe zerstören oder behindern, was Symptome verursacht, die für diesen Krankheitszustand eindeutig sind.
- Die gegenwärtige Behandlung für diese Erkrankungen bleibt auf einem empirischen Level und basiert auf der Hervorrufung einer allgemeinen Immunsuppression, entweder mit Steroiden oder anderen immunsuppressiven Arzneimitteln. Diese therapeutische Annäherung ist auch mit anderen Problemen einschließlich assoziierter schwerer Nebenwirkungen belastet. Ferner dient sie nur der Verzögerung des natürlichen Fortschreitens dieser Autoimmunerkrankungen. Eine effektive therapeutische Behandlung, abgesehen von einer Heilung, ist jenseits der gegenwärtig verfügbaren medizinischen Technologie. Die Fehler im Immunsystem, die zu diesen verschiedenen Autoimmunerkrankungen führen, sind nicht gut verstanden, trotz der ausgedehnten Forschung, die auf diesem Gebiet stattfand. Vergleiche beispielsweise Theofilopoulos, et al., Adv. Immunol, 37, 269 (1985).
- Die Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung von verschiedenen Mausmodellen, die einen beträchtlichen Einblick in die Pathogenese der Erkrankungszustände lieferten, obwohl die klinischen Syndrome und die immunologischen Abnormalitäten von Stamm zu Stamm beträchtlich variieren, was sie zu alles anderem als perfekten Studien macht. So wurde ein gemeinsamer zugrundeliegender zellulärer oder molekularer Defekt, der all diesen Erkrankungen gemeinsam ist, noch nicht identifiziert, selbst wenn es in der Tat sogar einen Vorschlag auf dem gegenwärtig vorhandenen Fachgebiet gibt.
- Untersuchungen durch mehrere Forscher zeigten, daß die Injektion von Antikörpern gegen CD4&spplus;CD8&supmin;-T-Zellen das Einsetzen bestimmter Autoimmunerkrankungen bei bestimmten Mausmodellen verhütet und in einigen Fällen verzögert. Vergleiche Theofilopoulos et al., Adv. Immunol. 37 269 (1985); Wofsy et al., J. Exp. Med. 161, 378 (1985); Wofsy et al., J. Immunol. 136, 4554 (1986), Wofsy et al., J. Immunol. 134, 852 (1985), Santoro et al., J. Exp. Med. 167, 1713 (1988); Waldor et al., Science 227, 415 (1985); Ranges et al., J. Exp. Med. 162, 1105 (1985); Christadoss et al., J. Immunol. 136, 2437 (1986); und Sriram et al., J. Immunol. 136, 4464 (1986). Diese Behandlung führt auch zur Reduktion einer Subpopulation der CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen. Als kumulative Wirkung können diese Daten auf einem gemeinsamen zugrundeliegenden Mechanismus, der durch CD4&spplus;CD8&supmin;-T-Zellen und/oder CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen vermittelt wird, hinweisen. Vergleiche Santoro, et al., J. Exp. Med. 167, 1713 (1988).
- Vorhandene Beweise können weiter Gründe bezüglich der Rolle, die die CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen bei der Induktion von SLE beispielsweise spielen, nahelegen. Erstens induzieren diese Zellen aus an SLE erkrankten Mäusen die B- Zellen zur Sekretion von pathogenen Anti-DNA-Autoantikörpern in vitro, wohingegen die gleichen Zellen aus normalen Mäusen oder aus Prä-Autoimmun-Mäusen diese Eigenschaft nicht zeigen. Datta, et al., J. Exp. Med. 165, 1252 (1987); Sainis et al., J. Immunol. 140, 2215 (1988). Zweitens wird das Einsetzen von SLE bei Mäusen, die eine schwere Lymphproliferation solcher Zellen infolge der Expression der autosomal rezessiven Mutationen lpr oder gld besitzen, stark beschleunigt. Vergleiche Theofilopoulos, et al., a.a.O . . Drittens besitzen Patienten mit SLE-Nephritis eine expandierte CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellpopulation in ihrem Blut, die die Sekretion von Autoantikörpern induziert. Shivakumar et al., FASEB J. 3 A492 (Nr. 1548). (Febr., 1989) und Datta, Federation of American Societies for Experimental Biology Summer Conference on Autoimmunity at Saxton's River, Vermont, 3.-8. Juli 1988. In der Summe können diese Daten nahelegen, daß CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen auf gewisse Weise eine Autoimmunerkrankung vermitteln, die zu der Entwicklung der Erkrankung beiträgt. Jedoch wurde bis jetzt kein Marker oder Veränderung oder Fehler der für die abnormalen CD4&supmin; CD8&supmin;-T-Zellen im Zusammenhang mit Autoimmunität einzigartig ist, identifiziert.
- Es wurde früher berichtet, daß die Expression des K&spplus;-Kanals bei proliferierenden CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen bei Mäusen mit lpr-Mutationen dramatisch verändert wurde. Chandy, et al., Science 233, 1197 (1986). Diese Forschung führte zur Assoziation eines abnormalen Musters der Expression des Ionenkanals bei einem zu SLE neigenden genetischen Defekt bei Zellen des Immunsystems in Assoziation mit abnormaler Lymphproliferation.
- Die nächste Stufe war die Bestimmung, ob das gleiche abnormale Expressionsmuster für Zellen von Mäusen beobachtet werden konnte, die keine genetische Prädisposition für SLE besaßen, wie die Mausmodelle von Chandy, et al., a.a.O. So entwickelten gemäß Grissmer, et al., Journal of Immunology 141, 1137 (1988) Mausmodelle, die nicht zu SLE neigen, ähnliche abnormale Expressionsmuster, die mit dem Einsetzen von SLE und Lymphproliferation assoziiert sind. Während so in Chandy, et al., a.a.O. eine abnormale Überexpression von Typ 1 K&spplus;-Kanälen bei zu SLE neigenden Mausmodellen als eine lpr-mutationsabhängige Abnormalität des Immunsystems galt, zeigte bei Grissmer, et al., a.a.O. eine ähnliche Proliferation von Typ 1 K&spplus;-Kanälen bei Mäusen mit zwei unterschiedlichen Mutationen (lpr und gld) entweder, daß eine solche Überexpression irgendwie mit SLE als solchem assoziiert war, oder mit einfachen Lymphproliferationssymptomen assoziiert war. Vergleiche auch Lewis, et al., Science 239, 771 (1988) und DeCoursey, et al., Nature 307, 465 (1984).
- Theofilopoulos, et al., in Advances in Immunology 37, 269 (1985), ein Übersichtsartikel, schlägt vor, daß das Erkrankungsprofil bei den lpr- und gld-Mausmodellen keiner bekannten Variante von menschlichem SLE ähnelt. Theofilopoulos, et al. schlägt vor, daß ein klares Korrelationsmodell notwendig ist.
- Es ist somit eine Aufgabe auf dem Fachgebiet, Versuche mit repräsentativeren Modellen durchzuführen, um festzustellen, ob, und sofern wie, abnormale Immunzellproliferation und Ionenkanalexpression ätiologisch mit Autoimmunerkrankungen verbunden ist.
- Daher konzentrierte sich die vorliegende Aufmerksamkeit auf den Ionenkanal selbst. Drei Typen von Ionenkanaltypen, die pharmakologisch und elektrophysiologisch klassifiziert wurden, wurden identifiziert, die sogenannten n-, n'- und l-Typen. T-Zellen in den peripheren lymphoiden Geweben werden für die erfindungsgemäßen Zwecke in die relevanten Typen CD4&spplus;CD8&supmin;, CD4&supmin;CD8&spplus;, CD4&supmin; CD8&supmin; charakterisiert. Man nimmt an, daß die CD4&spplus;CD8&supmin;-Zellen etwa 20 n-Kanäle pro Zelle exprimieren und vermutlich keine n'- und l-Kanäle besitzen. Man nimmt an, daß die CD4&supmin;CD8&spplus;-T-Zellen etwa 20 n'- und l-Kanäle pro Zelle und keine n-Kanäle besitzen, und man nimmt an, daß die CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen etwa 20 Kanäle pro Zelle exprimieren, wobei alle drei Typen repräsentiert sind. Bei einer normalen Immunantwort, die eine Induktion der Aktivität, beispielsweise durch Mitogene, wiederspiegelt, werden die n-Kanaltypen bis zum 10fachen in den Zellen, die aktiviert werden, erhöht. Die normalen T-Zellen zeigen bei Stimulation durch Mitogene als eine normale Immunantwort eine Erhöhung der Anzahl der n-Kanäle. Die Blockierung dieser n-Kanäle, beispielsweise mit Tetraethylammonium (TEA), würde dazu dienen, eine Immunantwort herabzuregulieren und effektiv zu blockieren. Abnormale T-Zellen können auch Gegenstand einer ähnlichen Blockierung sein. Jedoch werden solche abnormalen T-Zellen durch doppelt negative CD4&supmin;CD8&supmin;-Zellen repräsentiert, was eine Proliferation von Typ-1-Kanälen manifestiert, die an der Induktion von Autoimmunerkrankungszuständen beteiligt zu sein scheinen. Typ-l-K&spplus;-Kanäle sind nicht anwendungsabhängig, schließen sich rascher nach der Repolarisation als die n- Kanäle und sind gegenüber Blockierung, beispielsweise durch TEA, empfindlicher. Es war die Aufgabe der vorliegenden Forschung, ein Bindeglied, sofern vorhanden, und damit einer Ätiologie zwischen abnormaler Ionenkanalexpression in Immunzellen und den systemischen Symptomen einer Autoimmunerkrankung herzustellen.
- Das Schwellenexperiment, das die vorstehend genannte Bindung herstellte, wurde mit Mausmodellen durchgeführt, die für menschlichen SLE repräsentativ sind, d. h. den Mausmodellen NZBxNZW, NZBxSWR, BXSB-Yaa und MRL-&spplus;/&spplus;. An diesen Modellen wurde gefunden, daß im Falle von SLE als einem Beispiel einer Autoimmunerkrankung das einzigartige Muster der Typ-l-K&spplus;-Kanalexpression bei CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen eher mit dem Einsetzen von SLE assoziiert war als daß es das Ergebnis einer abnormalen Lymphproliferation war. So wurde das Bindeglied hergestellt, das die Möglichkeit beseitigte, daß die Beobachtungen aus früheren Untersuchungen einfach für die lymphproliferative Autoimmunerkrankung symptomatisch waren.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung und Charakterisierung einer Ätiologie von Autoimmunerkrankungen, dargestellt durch SLE, Typ-1 Diabetes mellitus, experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE), und anderen, d. h. all diese Autoimmunerkrankungen zeigen die Anwesenheit von abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen, die große Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Ionenkanälen exprimieren. So verläuft eine derartige Kanalexpression parallel mit der Fähigkeit, Autoimmunität zu induzieren. Nach der Herstellung eines solchen Bindeglieds als Grundaussage dem vorliegenden Erfindung folgt logisch, daß die vorliegende Erfindung mehrere sich daraus ergebende Gesichtspunkte betrifft: 1) einen Assay zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen durch Messung der relativen Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen in abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen, wie in dem unabhängigen Anspruch 4 definiert, 2) einen Assay zum Test extrinsischer Substanzen auf ihre Fähigkeit, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle in abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T- Zellen zu modulieren, wie im unabhängigen Anspruch 1 definiert, 3) die Verwendung eines ausgewählten identifizierten extrinsischen Materials zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung nützlich ist, wie in dem unabhängigen Anspruch 7 definiert ist, und 4) ein, wie im unabhängigen Anspruch 16 definiertes Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine solche ausgewählte identifizierte extrinsische Substanz enthält, und die im unabhängigen Anspruch 17 definierte Verwendung einer nach diesem Verfahren erhaltenen Zusammensetzung.
- So beruht die vorliegende Erfindung auf der Identifizierung und Charakterisierung eines diagnostischen Markers für Autoimmunerkrankungen, was zu einem diagnostischen und therapeutischen Ziel für solche Erkrankungen führt. Diese Grundlage ermöglicht die Identifikation der Ätiologie eines gegebenen Autoimmunerkrankungszustands, eines Assays zum Nachweis des Vorhandenseins des Markers, eines Assays zur Identifikation (selektiver) Modulatoren des Markers, geeignete Modulatoren, die durch einen solchen Assay identifiziert werden und therapeutische Modalitäten, die auf solchen Modulatoren (Arzneimitteln) basieren und/oder spezifische Antikörper, die gegen Typ-l-K&spplus;- Kanäle abnormaler CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen erzeugt wurden.
- So ermöglicht die Quintessenz der vorliegenden Erfindung ihrerseits die Schlußfolgerung, daß die identifizierten erhöhten Anzahlen von Typ-l-K&spplus;- Kanälen in abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen durch ein Verfahren erforscht werden kann, bei dem man extrinsische Substanzen mit einer modulierenden Wirkung auf solche Kanäle untersucht, wobei ein in-vitro-System bereitgestellt wird, das erhöhte Typ-l-K&spplus;-Kanäle abnormaler CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen enthält, solche Zellen mit einer oder mehreren aus einer Batterie von Testsubstanzen mit dem vermutlichen Potential, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle zu modulieren, stimuliert, die Wirkung der Testmaterialien auf die genannten l-K&spplus;-Kanäle untersucht und Kandidaten auswählt, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle modulieren können.
- Der Assay zur Bestimmung des Vorliegens einer Autoimmunerkrankung gemäß der Erfindung umfaßt die Bereitstellung von T-Zellen, die K&spplus;-Kanäle enthalten, aus einem Testindividuum, die Identifikation abnormaler T-Zellen aus der Population der bereitgestellten T-Zellen, die Messung der relativen Anzahlen der Typ-l-K&spplus;-Kanäle der abnormalen Zellen und die Bestimmung, ob die genannten Typ-l-K&spplus;-Kanäle erhöht oder normal sind.
- Das aus einer erfindungsgemäßen extrinsischen Substanz gemäß der Erfindung hergestellte Arzneimittel kann zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet werden, die durch das Symptom erhöhter Anzahlen von Typ-l-K&spplus;- Kanälen in abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen des Immunsystems des Organismus, der die Autoimmunerkrankung zeigt, gekennzeichnet sind, indem man den Organismus und/oder das Immunzellsystem mit dem genannten Arzneimittel, das eine modulierende Wirkung auf die genannten Typ-l-K&spplus;-Kanäle besitzt, wie Substanzen, die gegebenenfalls über das vorstehend beschriebene Assaysystem identifiziert wurden, in Kontakt bringt. Insbesondere können Autoimmunerkrankungen, wie vorstehend beschrieben, selektiv ohne die Störung von Typ-n- und -n'-Ionenkanal-Expression, die für eine normale Immunantwort charakteristisch ist, wie vorstehend beschrieben, mit beispielsweise Tetraethylammonium (TEA) oder einem anderen selektiven Modulator, der über den vorstehend beschriebenen Assay definiert und gegebenenfalls ausgewählt wurde, behandelt werden.
- Die Erfindung betrifft somit die Identifizierung, Handhabung und Kontrolle von Autoimmunerkrankungen einschließlich:
- (1) der Verwendung als prognostisches Mittel, beispielsweise durch Herstellen reaktiver Antikörper gegen die Typ-l-K&spplus;-Kanäle und Messen deren Anzahlen, und/oder
- (2) selektives Absuchen nach bevorzugt selektiven Modulatoren von Typ-l-K&spplus;-Kanälen zur Verwendung als Diagnosereagens, und/oder
- (3) Blockierung, Verzögerung und selektive Eliminierung der Typ-l- K&spplus;-Kanäle zur Verwendung als Arzneimittel.
- Bezüglich der vorstehenden Ausführungen wird in Betracht gezogen, daß man einen reaktiven Antikörper mit einem Zelltoxin verknüpfen könnte, so daß der Antikörper einen Typ-l-K&spplus;-Kanal einer fehlerhaften CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zelle (die für eine Autoimmunerkrankung verantwortlich ist) lokalisieren würde und daran binden würde und dadurch das Zelltoxin, z. B. Ricin, in enge Nachbarschaft zu der abnormalen Zielzelle mit folglicher cytotoxischer Aktivität bringen würde. Man könnte Psoralen zur Abbildung der fehlerhaften Zielzellen mit anschließender Aktivierung zu einem Cytotoxin verwenden.
- Die vorliegende Erfindung wird hier unter Verwendung von Mausmodellen, die für die menschliche Ätiologie repräsentativ sind, erläutert. Der Beweis dafür liegt in der Tatsache, daß (1) CD4&supmin;CD8&supmin;-Zelltypen in allen untersuchten Systemen abnormale, eine Autoimmunerkrankung verursachende Zellen induzieren, und (2) Typ-l-K&spplus;-Kanäle bekanntlich bei Menschen vorkommen. Vergleiche Shapiro et al., Biophysical Journal L3, 550a, Nr. W-Pos203 (1988). Durch die Erfindung wurde unter Verwendung von solchen Mausmodellen ein etabliertes Bindeglied von erhöhten Typ-l-K&spplus;-Kanälen in abnormalen T-Zellen mit Autoimmunerkrankungen gefunden. Daher läßt sich die vorliegende Erfindung auf Immunsysteme mit CD4- und CD8-T-Zellen, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle tragen, wie sie beispielsweise bei Menschen gefunden werden, übertragen.
- Die vorliegende Erfindung wird anhand von charakteristischen Mausmodellen näher erläutert, die mit geeigneter Korrelation und Übersetzung in das menschliche System ergeben, daß Typ-l-K&spplus;-Kanäle in abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen beim Einsetzen einer gegebenen Autoimmunerkrankung erhöht sind. Erläuternd für die getesteten Autoimmunerkrankungen sind SLE, Typ-1-Diabetes und EAE, alle anhand der charakteristischen Mausmodelle. Weil die vorliegende Forschung auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung, wie eine Autoimmunerkrankung zu testen, zu diagnostizieren und zu behandeln ist, so gut fundiert ist, wird ein Fachmann gut genug wissen, wie solche Bemühungen unter Verwendung des menschlichen Systems durchzuführen sind, wenn es möglich ist, auf diese Weise ohne Störung durch regulatorische Beeinträchtigungen fortzuschreiten.
- Fig. 1 K&spplus;-Kanalexpression in von der Milz und Lymphknoten abgeleiteten CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen bei normalen Mäusen und Mäusen mit SLE, Typ-1- Diabetes mellitus oder experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE; ein Modell für multiple Sklerose).
- Fig. 2 K&spplus;-Kanalexpression in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus der Milz und aus Lymphknoten bei jungen und alten SLE-Mäusen.
- Fig. 3 Gesamte K&spplus;-Ströme in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen bei normalen Mäusen (links) und Mäusen mit Collagen-Arthritis (rechts). Oben, die K&spplus;- Ströme wurden mit 200 msek depolarisierenden Pulsen bis 40 mV aus einem Haltepotential von -80 mV hervorgerufen. Das Pulsintervall betrug 1 sek, um die kumulative (gebrauchsabhängige) Inaktivierung zu testen. Es wird auf die unterschiedliche Stromskala hingewiesen. Unten, Leckströme wurden durch Spannungsstufen bis -60 und -30 mV nach einem 15-msek-Vorpuls von 40 mV stimuliert. Es wird auf die unterschiedliche Strom- und Zeitskala hingewiesen.
- Fig. 4 Maximale K&spplus;-Leitfähigkeit (gK) von CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen: a, , , bedeutet n-, l-, n'-K&spplus;-Kanaltypen. Diese Daten sind als Mittelwert ± SA gezeigt. b, Prozentsatz der Zellen mit gK > 1000 pS von Typ-l-K&spplus;- Leitfähigkeit. Die Daten für normale Mäuse wurden aus C3H, C57BL, BALB/c, und DBA/1-LACJ (ohne Injektion) vereinigt.
- Fig. 5 Maximale K&spplus;-Leitfähigkeit (gK) von CD4&spplus;CD8&supmin;- und CD4&supmin;CD8&spplus;- T-Zelluntergruppen bei normalen Mäusen und Mäusen mit Collagen-Arthritis. Δ, , bedeuten n-, l- n'-K&spplus;-Kanaltypen.
- Fig. 6 Maximale K&spplus;-Leitfähigkeit (gK) von CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen in DBA/1-LACJ-Mäusen ohne Injektion, BALB/c-Mäusen, denen hitzeinaktiviertes E. coli injiziert wurde, und DBA/1-LACJ-Mäusen, denen CFA injiziert wurde, jeweils am Tag -26, -62 und -26, -26 und -2. Der Tag O bezeichnet den Tag, an dem die elektrophysiologischen Versuche durchgeführt wurden. Δ, , bedeuten n-, l-, n'-K&spplus;-Kanaltypen
- Der Ausdruck "extrinsische Substanz" bzw. "extrinsisches Material" bedeutet jede Einheit, die nicht üblicherweise bezüglich der Typ-l-K&spplus;-Kanäle und/oder abnormaler T-Zellen vorhanden ist oder darin funktioniert und diese beeinflußt. So besitzt der Ausdruck eine funktionelle Definition und umfaßt solche identifizierten Einheiten wie Hormone, Toxine, Wachstumsfaktoren/Cytokine; sekundärbotenmodulierende Substanzen, organische Verbindungen und anorganische Verbindungen, Mittel, die direkt auf den l-Kanal durch Wirkung auf intrazelluläre Sekundärboten oder andere Kanäle, oder das Membranpotential oder Rezeptoren einwirken; Zelltypen als Ziel von Typ-l-K&spplus;-Kanälen oder abnormalen CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen, gentechnische Produkte, die auf l-Kanäle oder auf CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen einwirken; oder bakterielle oder virale Substanzen, die auf CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen mit vielen l-Kanälen einwirken.
- Der Ausdruck "modulierende Wirkung" oder "Eigenschaften" oder grammatikalische Äquivalente umfassen sowohl eine aktive als auch eine passive Einwirkung auf Typ-l-K&spplus;-Kanäle und/oder abnormale T-Zellen. Diese umfassen ohne Beschränkung die Blockierung des Kanals oder der Funktion des Kanal proteins bzw. der Kanalproteine, Verringerung der Anzahl der Ionenkanäle pro Zelle und Verwendung von Sekundärzellen bzw. einer Sekundärzelle oder eines Sekundärkanals bzw. Sekundärkanälen, um auf eine primäre abnormale Zelle einzuwirken.
- Der Ausdruck "Überwachen" in Bezug auf die Wirkung von Testsubstanzen auf Typ-l-K&spplus;-Kanäle und/oder abnormale T-Zellen umfaßt jedes Verfahren, das bekanntlich die Wirkung einer Testsubstanz auf die Kanäle/Zellen mißt oder dafür entwickelt wurde. Diese umfassen ohne Beschränkung die Messung des Stroms, die Messung des Membranpotentials, die Messung des K&spplus;-Stroms, beispielsweise mit radioaktiven Tracern, die Messung der K&spplus;-Konzentration und die Messungen der indirekten Folgen auf andere Rezeptoren, Sekundärboten und/oder Kanäle.
- Der Ausdruck "Autoimmunerkrankung" geht über die klassische Definition hinaus und soll daher jeden Erkrankungszustand erfassen, bei dem die CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen als Helferzellen wirken, beispielsweise, um das Immunsystem zur Destruktion von Zellen des Organismus zu induzieren.
- Die folgenden Beispiele erläutern Substanzen und Verfahren, die bei dem folgenden experimentellen Vorgehen verwendet wurden. Die Fig. 1 zeigt die maximale K&spplus;-Leitfähigkeit, gK, von CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus normalen Mäusen und Mäusen mit einem genetisch bestimmten SLE- oder Typ-1-Diabetes mellitus.
- Eine Gigaohm-Siegelspannung-Klammertechnik wurde verwendet [Hamill et al., Pflugers Arch. 391, 85 (1981)]. Die Zellen wurden getrennt und, wie nachstehend beschrieben, angefärbt. Die maximalen K&spplus;-Leitfähigkeiten (gK) von CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen wurden aus dem maximalen Spitzen-K&spplus;-Strom, der bei +40 mV (Haltepotential -80 mV) hervorgerufen wurde, bestimmt, wobei eine Potentialumkehr für K&spplus; von -80 mV angenommen wurde. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur (220 bis 26ºC) durchgeführt. Die untersuchten Zellen wurden in Ringer-Lösung (in mM) getränkt: 160 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl&sub2;, 1 CaCl&sub2;, 2 MgCl&sub2; und 10 K-HEPES (pH 7,4). Die Klammerpipette enthielt 134 KF, 11 K&sub2;-EGTA, 1,1 CaCl&sub2;, 2 MgCl&sub2;, und 10 K-HEPES (pH 7,2). Jeder Punkt gibt einen gK-Wert in einer einzelnen Zelle wieder, ausgenommen diejenigen mit den Balken, die die Mittelwerte ± SA der zuvor beschriebenen Daten wiedergeben. Die Daten aus C3H (n=12), C3H-lpr (n=22), C3H-gld (n=26) und MRL-lpr (n=31) entstammen Grissmer et al., J. Immunol. 141, 1137 (1988) bzw. Chandy et al., Science 233, 1197 (1986)2, und sind zum Vergleich in die Graphik aufgenommen. Drei Typen von spannungsgesteuerten K&spplus;-Kanälen (n,l,n') werden von Maus-T-Zellen exprimiert, die durch elektrophysiologische und pharmakologische Kriterien unterschieden werden können. DeCoursey et al., J. Gen. Physiology 89, 379 (1987).
- Der gK-Wert von CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen aus drei jungen MRL-&spplus;/&spplus;-Mäusen vor dem Einsetzen einer klinisch symptomatischen Erkrankung und zwei alten MRL- +/+-Mäusen mit Lupusnephritis (Proteinurie: > 2000 mg Protein/dl) wurde, wie vorstehend im Zusammenhang mit Fig. 1 beschrieben, bestimmt. Jeder Punkt gibt den gK-Wert in einer einzelnen Zelle wieder, ausgenommen diejenigen mit den Balken, die die Mittelwerte ± SA von zuvor berichteten Daten wiedergeben (Grissmer et al., J. Immunol. 141, 1137 (1988) und Chandy et al., Science 233, 1197 (1986)). Siehe Fig. 2.
- CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus der Milz aus Mäusen mit klinisch offensichtlichem SLE (MRL-+/+, NZBxSWR, NZBxNAW, BXSB-Männchen) zeigen zahlreiche Typ-l-K&spplus;-Kanäle/Zellen (Fig. 1) mit einem durchschnittlichen gK-Wert von 4550±254 pS (Mittelwert ± SEM, n=76). Die Teilung des gK-Wertes durch die Leitfähigkeiten des einzelnen Kanals [Lewis et al., Science, 239, 771 (1988)] ergibt eine Abschätzung von 100-200 Typ-l-K&spplus;-Kanälen. Frühere Daten zur K&spplus;- Kanalexpression in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus C3H-lpr-(gK: 5223±565 pS; Mittelwert±SA, n=22), C3H-gld (gK: 5092±503 pS, Mittelwert±SA, n=26), MRL-lpr (gK: 4600±600 pS, Mittelwert£mSA, n=31)-Mäusen [Grissmer et al., J. Immunol. 141, 1137 (1988) und Chandy et al., Science 233, 1197 (1986)] sind zum Vergleich angegeben. Gelegentlich wurden Zellen mit kleinen Anzahlen von Typ-n- K&spplus;-Kanälen beobachtet. Diese können normale Zellen darstellen. Im Gegensatz dazu exprimieren CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus der Milz und aus den Lymphknoten von normalen Mäusen (C57BL, BALB/c), die im Alter von 1 bis 19 Monaten variieren, Typ n-, l- oder n' K&spplus; Kanäle mit einem niedrigen durchschnittlichen gK-Wert von 458±63 pS (Mittelwert±SEM, n=39), was etwa 10-20 K&spplus;-Kanälen/Zelle entspricht. So zeigen CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus jedem Mausmodell für SLE eine abnormal erhöhte Anzahl der Typ-l-K&spplus;-Kanäle, was aus den (so gekennzeichneten) Lupusmodellen anzeigt, daß die Veränderung mit der Erkrankung verknüpft ist.
- Abgesehen von den Maus-SLE-Modellen ist der nichtfettsüchtige diabetische (NOD) Mausstamm ein weiteres genetisch determiniertes Mausmodell für Autoimmunerkrankungen [Makino et al., Exp. Anim. 29, 1 (1980) und Hattori et al., Science 231, 733 (1986)]. Diese Mäuse entwickeln spontan Typ-1-Diabetesmellitus. CD4&spplus;CD8&supmin;- und CD4&supmin;CD8-T-Zellen waren an der Pathogenese dieser Erkrankung beteiligt [Miller et al., Nature 307, 465 (1984), O'Neil et al., J. Immunol. 140, 52 (1988) und Koike et al., Diabetes 36 539 (1987)]. Die Rolle der CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen wurde nicht untersucht. CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T- Zellen aus der Milz von NOD-Mäusen mit klinisch offensichtlichem Typ-1-Diabetes-mellitus zeigten große Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen mit einem durchschnittlichen gK-Wert von 579511253 pS (Mittelwert±SEM, n=21), was etwa 200 Typ-l-K&spplus;-Kanälen/Zelle entspricht. Dieses Muster der K&spplus;-Kanalexpression ist fast mit dem in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus SLE-Mäusen identisch, was einen gemeinsamen Mechanismus der dem Typ-1-Diabetes-mellitus und SLE unterliegt, anzeigt. Eine relativ größere Fraktion von Milz-CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen (421) bei Mäusen mit Typ-1-Diabetes-mellitus zeigte einen niedrigeren gK-Wert als der bei SLE-Mäusen beobachtete (4/76). Dieser Unterschied in der K&spplus;-Kanalexpression in der Milz kann die organspezifische Natur der Autoimmunerkrankungen in Typ-1-Diabetes-mellitus anzeigen, die in erster Linie auf die Bauchspeicheldrüse begrenzt sind, und die systemischen Autoimmunerscheinungen bei SLE.
- Da Maus-SLE und Typ-1-Diabetes-mellitus genetisch determinierte Erkrankungen sind, kann eine Veränderung der K&spplus;-Kanalexpression von Geburt an vorhanden sein. Um diese Frage anzugehen, wurde ein Vergleich von K&spplus;-Kanalexpression in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen von jungen und alten MRL-+/+-Mäusen vorgenommen. Die CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus jungen MRL-+/+-Mäusen zeigten eine Größenordnung weniger K&spplus;-Kanäle (gK: 295±91 pS, Mittelwert±SEM, n=11, 10 Kanäle/Zelle), verglichen mit den älteren MRL-+/+ (gK: 5306±518 pS; Mittelwert±SEM, n=18; 200 Kanäle/Zelle) mit klinischen Erscheinungen von Lupusnephritis (Fig. 2). Die früheren Daten zu den CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus jungen gesunden C3H-lpr-(gK: 324±67 pS; Mittelwert±SEM, n=17; 12 Kanäle/Zelle)-Mäusen sind zum Vergleich angegeben. Das Muster der K&spplus;-Kanal- Expression in Autoimmunmäusen vor dem Einsetzen einer klinisch symptomatischen Erkrankung ähnelt dem in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus normalen Mäusen (vergleiche Fig. 1 und 2). Diese Daten zeigen, daß eine abnormale K&spplus;-Kanalexpression in CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen einer Entwicklung der Erkrankung parallel läuft und die Fähigkeit dieser Zellen widerspiegelt, die Sekretion von pathogenen Anti-DNA-Autoantikörpern zu induzieren.
- Die experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) gilt als ein Modell für die menschliche multiple Sklerose. Mäusen, denen Myelin-Grundprotein inokuliert wurde, entwickelten innerhalb 1 bis 2 Wochen eine Paralyse (akute EAE). Einige dieser Mäuse erholten sich und entwickelten dann eine chronisch wiederkehrende Erkrankung (chronische EAE), die der menschlichen multiplen Sklerose sehr ähnelt. CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen aus der Milz wurden aus Mäusen mit chronischer EAE isoliert, und ihre K&spplus;-Kanalexpression wurde untersucht. Eine größere Häufigkeit von Zellen zeigte große Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen, verglichen mit normalen Mäusen. Dieses Muster der K&spplus;- Kanalexpression ähnelt dem in CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-Zellen aus Mäusen mit SLE und Typ-1-Diabetes-mellitus, was einen gemeinsamen Grundmechanismus dieser drei unterschiedlichen Autoimmunerkrankungen zeigt. Ein größerer Anteil von CD4&supmin; CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-Zellen hatte normale Anzahlen von K&spplus;-Kanälen/Zelle, verglichen mit Mäusen mit SLE. Der Autoimmunprozeß bei chronischer EAE ist in erster Linie auf das Nervensystem beschränkt, und Veränderungen in der Milz sind nicht so offensichtlich wie bei SLE, der primär eine systemische Autoimmunerkrankung ist, bei dem der hauptsächliche Autoimmunprozeß in der Milz stattfindet.
- Andere Untergruppen von T-Lymphozyten (CD4&spplus;CD8&supmin; oder CD4&supmin;CD8&spplus;) aus erkrankten männlichen BXSB-Mäusen und aus C3H-lpr-, C3H-gld-Mäusen zeigten kleine Anzahlen von Typ-l-, -n- oder -n'-K&spplus;-Kanälen, wie phänotypisch identische Zellen aus normalen Mäusen. Normale Mitogen-aktivierte T-Zellen exprimieren 200 Typ-n-K&spplus;-Kanäle/Zelle [DeCoursey et al., J. Gen. Physiol. 89 405 (1987)], im Gegensatz zu den zahlreichen Typ-l-K&spplus;-Kanälen, die von CD4&supmin;CD8&supmin;- Thy&supmin;1.2&spplus;-T-Zellen bei Mäusen mit SLE und Typ-1-Diabetes-mellitus offensichtlich sind. Diese Daten zeigen, daß reichliche Typ-l-K&spplus;-Kanalexpression eine einzigartige Besonderheit erkrankter CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen ist und sich von dem Muster der K&spplus;-Kanalexpression in normalen Mitogen-induzierten T-Zellen unterscheidet.
- Die K&spplus;-Kanäle wurden auf der Basis ihrer Inaktivierungseigenschaften, der Kinetiken ihres Kanalschlusses und ihrer Empfindlichkeit, durch Tetraethylammonium (TEA&spplus;) blockiert zu werden, identifiziert. Typische Typ-n- K&spplus;-Kanäle sind gebrauchsabhängig, d. h. sie zeigen eine kumulative Inaktivierung durch wiederholte depolarisierende Pulse. Die Gebrauchsabhängigkeit wurde durch Messung der Abnahme der Größe des Spitzen-K&spplus;-Stroms, der durch einen wiederholten depolarisierenden Puls mit 200 msek Dauer pro sek hervorgerufen wurde, bestimmt. Typ-n-K&spplus;-Kanäle schließen sich auch langsam nach der Repolarisierung mit einer Zeitkonstante von etwa 30 msek bei -60 mV und werden durch TEA&spplus; blockiert (KD = 8 mM). Typ-l-K&spplus;-Kanäle sind nicht gebrauchsabhängig, schließen sich nach Repolarisierung mit einer Zeitkonstante von 2 msek bei -60 mV rascher und sind viel empfindlicher gegenüber einer Blockierung durch TEA&spplus; (KD = 0,1 mM). Typ-n-K&spplus;-Kanäle sind nicht gebrauchsabhängig, schließen sich langsam wie die Typ-n-K&spplus;-Kanäle nach Repolarisation, aber sind weniger empfindlich gegenüber einem Verschluß durch TEA&spplus; (KD 100 mM).
- Für die vorstehenden Versuche wurden die Mäuse in dem Vivarium bei U.C. Irvine untergebracht und entsprechend den Richtlinien des Instituts versorgt. Die Mäuse wurden mit Metofan leicht anästhesiert und durch Zervix-Dislokation getötet. Die Milz wurde entnommen und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt. Die Zellen wurden dreimal mit RPMI-1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, Utah), gewaschen. Die Zellen wurden in einer Dichte von 10·10&sup6; Zellen/ml resuspendiert, und die T-Zellen wurden von den Nicht-T-Zellen durch eine Säule mit Nylonwolle getrennt. Die Zellen wurden dreimal in Medium gewaschen und in einer Dichte von 1-2 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden wie folgt angefärbt: die Zellen wurden zuerst 30 Minuten lang auf Eis mit Ratte-Anti- Maus-CD4- und Ratte-Anti-Maus-CD8-Antikörperninkubiert, dreimal in Medium gewaschen, 30 Minuten lang auf Eis mit Phycoerythrin-konjugiertem Ziege-Anti- Ratte-IgG (affinitätsgereinigt und bezüglich Maus-Ig adsorbiert) inkubiert, dreimal in Medium gewaschen, 30 Minuten lang auf Eis mit fluoreszeiniertem Ratte-Anti-Maus-Thy-1.2 inkubiert, dreimal in Medium gewaschen und dann in einer Dichte von 2 · 10&sup6; Zellen/ml in Medium resuspendiert. Die Zellen wurden dann, wie in der Legende zu Fig. 1 beschrieben, mit einem Spannungsgradienten versehen. Die CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-T-Zellen wurden als grüne Zellen identifiziert. Andere T-Zellen (CD4&spplus;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;, CD4&supmin;CD8&spplus;-Thy-1.2&spplus;) waren gelb und die B-Zellen und Monozyten (CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&supmin;) waren ungefärbt.
- Die verwendeten Mäuse waren: C57B: 6 und 19 Monate; BALB/c: 1 und 7 Monate; BXSB-männlich: 2 Mäuse im Alter von 4 Monaten; NZBxNZW: 2 Mäuse im Alter von 6 Monaten, eine im Alter von 9 Monaten; NZBxSWR; 3 Mäuse im Alter von 7 bis 8 Monaten; alte MRL-+/+: 2 Mäuse älter als 20 Monate; NOD-Mäuse: 6 und 9 Monate; junge MRL-+/+: 6, 10 und 12 Monate.
- a) Töten der Mäuse: Mäuse mit Autoimmunerkrankungen (beispielsweise mit systemischen Lupus erythematodes oder Typ-1-Diabetes-mellitus) wurden menschlich durch Zervix-Dislokation nach leichter Anästhesie mit Metofan getötet.
- b) Isolieren von T-Zellen aus Milz, Thymus oder Lymphknoten: die Milz, der Thymus und die Lymphknoten werden dem Tier entnommen und Einzelzellsuspensionen werden durch Zerquetschen des Organs mit dem Lauf einer Spritze durch einen Maschendraht hergestellt. Die Zellen werden dann dreimal mit einem zellunterstützenden Medium, z. B. RPMI-1640-Medium, das mit hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (10%), l-Glutamin (1 mM) und geeigneten Antibiotika (z. B. Penicillin/Streptomycin) supplementiert ist, gewaschen. Die Zellen werden dann gezählt und in einer Konzentration von 10 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. 50 · 10&sup6; Zellen werden dann auf eine Säule aus Nylonwolle gegeben, um die T-Zellen von den anderen Blutzellen, wie zuvor in Grissmer et al., J. Immunol., 41, 1137 (1988) beschrieben, abzutrennen.
- e) Anfärbung: Die T-Zellen werden mit Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörpern in der Kälte für eine geeignete Zeitspanne (z. B. 20 bis 30 Minuten) inkubiert, in dem vorstehend beschriebenen RPMI-1640-Medium gewaschen, in der Kälte mit einem geeigneten Farbstoff-konjugierten zweiten Antikörper (z. B. Phycoerythrin-konjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper) inkubiert, in dem vorstehend beschriebenen Medium gewaschen und in der Kälte mit einem geeigneten Farbstoff-konjugierten T-zellspezifischen Antikörper (z. B. Fluorescein-konjugiertes Anti-Thy-1.2 oder Anti-CD3 oder Anti-T-Zell-Rezeptor) inkubiert, mit dem vorstehend beschriebenen Medium gewaschen und dann in einer Konzentration von 1 bis 5 · 10&sup6; Zellen/ml in Medium resuspendiert und für die nachstehend beschriebenen Versuche verwendet. Die CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen werden dann unter dem Fluoreszens-Mikroskop als Zellen, die T-zellspezifische Moleküle, wie Thy-1.2, Cd3 oder T-Zell-Rezeptoren exprimieren und nicht die CD4- oder CD8-Moleküle exprimieren, identifiziert.
- Ähnliche Varianten werden verwendet, um erfindungsgemäß CD4&supmin;CD8&supmin;-T- Zellen in anderen Tiermodellen einschließlich Menschen, die die CD4- und CD8- Moleküle im Immunsystem exprimieren, zu isolieren, zu identifizieren und für die Forschung zu bewerten.
- a) Trennung der Zellen aus Blut: Blut von Patienten mit Autoimmunerkrankungen, z. B. systemischem Lupus erythematodes, wird gewonnen. Mononukleäre Zellen werden von dem Blut in einem Dichtegradienten, z. B. Ficoll®-Hypaque, abgetrennt. Die mononukleären Zellen werden mit dem vorstehend beschriebenen Medium gewaschen, und die T-Zellen werden entweder nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit der Säule mit Nylonwolle oder durch Rosettenbildung mit Schaf-Erythrozyten, wie in Chandy et al., J. Exp. Med. 160, 369 (1984) beschrieben, oder nach jedem anderen verfügbaren Standardverfahren isoliert. Die T-Zellen werden auf ähnliche Weise aus verfügbaren lymphoiden Geweben isoliert.
- b) Anfärbung: die Zellen werden, wie vorstehend beschrieben, zuerst mit Anti-CD4 und Anti-CD8, anschließend mit einem geeigneten zweiten Farbstoff-konjugierten Antikörper, z. B. einem Phycoerythrin-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper, anschließend mit einem geeigneten Farbstoff-konjugierten T-zellspezifischen Antikörper, beispielsweise Fluorescein-konjugiertem Anti-CD3 oder Anti-CD2 oder einem Anti-T-Zell-Rezeptor oder Anti-Leu-2, angefärbt. Die CD4&supmin;CD8&supmin;-T-Zellen werden unter dem Fluoreszens-Mikroskop dann als Zellen, die T-zellspezifische Moleküle, wie CD3 oder CD2 oder Leu-1 oder T-Zell-Rezeptoren exprimieren und nicht CD4- oder CD8-Moleküle exprimieren, identifiziert.
- Die Zellen werden in eine Aufzeichnungskammer gegeben, und die CD4&supmin; CD8&supmin;-T-Zellen werden in geeigneter Weise mit einem Umkehrphasen-Mikroskop unter Fluoreszenslicht, wie vorstehend beschrieben, identifiziert. In Fällen, in denen die überwiegende Population der T-Zellen CD4&supmin;CD8&supmin; ist, beispielsweise in lpr- und gld-Mäusen oder CD4&supmin;CD8&supmin;-Zellinien, kann eine Anfärbung nicht erforderlich sein, um die Zellen zu identifizieren. Diese Zellen werden elektrophysiologisch unter Verwendung der Spannungs-Klammertechnik (Hamill et al., Pflugers Arch. 391, 85 (1981)) untersucht.
- a) Lösungen: Die untersuchten Zellen werden in normaler Säuger-Ringer-Lösung getränkt (160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,0 mM CaCl&sub2;, 1,0 mM MgCl&sub2;, 5 mM HEPES, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH; 290 bis 320 mosm). Andere Lösungen zur Anfärbung von Zellen können auch verwendet werden. Die Spannungspipette enthält eine geeignete Lösung, beispielsweise 134 mM KF, 11 mM EGTA, 1 mM CaCl&sub2;, 2 mM MgCl&sub2;, 5 mM HEPES, eingestellt auf pH 7,2 mit KOH; 285 bis 310 mosm.
- b) Identifikation der Typ-l-K&spplus;-Kanäle: Durch Variieren der Spannung über die Membran werden spannungsgesteuerte Ionenkanäle geöffnet, und die Ionenbewegung durch diese Kanäle wird als Ionenstrom gemessen. Mehrere unterschiedliche Kanaltypen wurden unter Verwendung einer Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken charakterisiert (Hille B: Ionic channels of excitable membranes, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984)). Diese Kanäle unterscheiden sich auf der Basis elektrophysiologischer und pharmakologischer Kriterien. Die Typ-l-K&spplus;-Kanäle werden in den spannungsgeklammerten Zellen auf der Grundlage ihrer Inaktivierungseigenschaften, der Kinetik des Kanalschlusses, der Empfindlichkeit gegenüber einer Blockierung durch TEA&spplus;, der Amplitude des einzelnen Kanals und der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, wie ausführlich von DeCoursey et al., J. Gen. Physiol. 89, 379 (1987) beschrieben, identifiziert.
- c) Arzneimittel-Testung: Nach Identifikation der l-Typ-K&spplus;-Kanäle wird die Badlösung ausgetauscht und durch eine Lösung, die das Arzneimittel von Interesse enthält, ersetzt. Die Wirkung des Arzneimittels auf die Typ-l- K&spplus;-Kanäle wird elektrophysiologisch, beispielsweise durch Veränderungen der Inaktivierungseigenschaften oder der Kinetiken des Kanal-Schlusses oder der Blockierung oder der Verschiebung der Spannungsabhängigkeit oder Aktivierung oder Veränderung der Amplitude eines einzelnen Kanals etc. überwacht. Die gleichen Verfahren werden verwendet, um eine Batterie von Testsubstanzen an der gleichen Zelle oder an anderen Zellen, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle enthalten, zu untersuchen. Die Selektivität dieses Arzneimittels gegenüber Typ-l-K&spplus;-Kanälen wird durch Testen der Wirkung dieser Testsubstanzen auf andere Ionenkanaltypen, beispielsweise Typ-n-K&spplus;-Kanäle in T-Zellen, bestimmt. Arzneimittel, die die Typ-l-K&spplus;-Kanäle selektiv und mit großer Stärke modulieren, werden identifiziert.
- d) Herstellung von Antikörpern gegen Typ-l-K&spplus;-Kanäle: Die Gene, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle codieren, werden durch DNA-Rekombinations-Standardtechniken, wie in Weir et al., Handbook of Experimental Immunology, Bd. 3 (1986) und anderen verfügbaren Dokumenten beschrieben, isoliert. Diese Gene werden als Matrizen verwendet, um Typ-l-K&spplus;-Kanalproteine oder -peptide herzustellen, die als Antigene oder zur Herstellung von Antikörpern gegen Typ-l-K&spplus;-Kanäle verwendet werden. Ein zweites Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen Typ-l-K&spplus;-Kanäle wird mit Zellen, die große Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen exprimieren, durch Isolieren der Zelloberflächenproteine dieser Zellen und Verwendung dieser Proteine als Antigene zur Herstellung von Antikörpern angewendet. Die Antikörper werden auf ihre Fähigkeit (a) Typ-l-K&spplus;-Kanäle elektrophysiologisch zu beeinflussen, wie vorstehend beschrieben, oder (b) ihre Fähigkeit, Zellen, die Typ-l-K&spplus;-Kanäle exprimieren, wenn die Antikörper an ein Zelltoxin konjugiert sind oder wenn die Antikörper an die Zelle in Gegenwart von Komplement binden, oder (c) die Fähigkeit, Radioisotop- oder Farbstoff- oder enzymgekoppelte Antikörper an diese Zellen zu binden, wobei die Bindung fluoreszensmikroskopisch durch Fluoreszens-Zellsortierung durch Radioaktivitätszählung oder durch enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) oder durch andere geeignete Techniken überwacht wird, abgesucht.
- e) Arzneimittel- und/oder Antikörper-Testung bei einer Autoimmunerkrankung: Arzneimittel oder Antikörper, die durch die vorstehend beschriebenen Assays als selektiv für Typ-l-K&spplus;-Kanäle identifiziert wurden, werden in vivo auf ihre Wirksamkeit in geeigneten Tiermodellen getestet, beispielsweise auf ihre Fähigkeit, das Einsetzen und die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen zu verzögern oder Autoimmunerkrankungen umzukehren. Der Verabreichungsweg der Arzneimittel/Antikörper kann oral, parenteral oder rektal sein, und das Arzneimittel könnte allein als Hauptwirkstoff oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder Antikörpern und in regelmäßigen Intervallen oder als einzelner Bolus oder als kontinuierliche Infusion in Standarddosierungen verabreicht werden. Die vorstehend beschriebenen Arzneimittel oder Antikörper werden auch in in vitro-Assays, beispielsweise auf ihre Fähigkeit, die B-Zellen bei Autoimmunpatienten oder in Tiermodellen zur Sekretion von Autoantikörpern zu stimulieren, getestet.
- f) Ein Behandlungsprotokoll: Die durch die vorstehend beschriebenen Assays identifizierten Arzneimittel oder Antikörper werden auf Sicherheit bei Menschen gemäß den Bundesrichtlinien getestet. Diese vorstehend beschriebenen Arzneimittel oder Antikörper werden in Standardformulierungen Patienten mit Autoimmunerkrankungen wieder entweder oral, parenteral, rektal, allein oder in Kombination, in regelmäßigen Intervallen oder als einzelner Bolus oder als kontinuierliche Infusion zur Modulierung der Typ-l-K&spplus;-Kanäle in den CD4&supmin;CD8&supmin;- T-Zellen verabreicht, um dadurch ihre abnormale zusätzliche Helferfunktion außer Kraft zu setzen und den Verlauf der Autoimmunerkrankung zu beeinflussen.
- Männliche DBA-J/Lac-J-Mäuse wurden von dem Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen. Ihnen wurde intradermal in der Nähe der Schwanzbasis 100 µg hochgereinigtes Hühnercollagen vom Typ II, das in vollständigem Freund'schem- Adjuvans (CFA) emulgiert war und zusätzlich Mycobactrium butyricum (Difco) enthielt, injiziert. Die Collagen/CFA-Emulsion wurde durch Zugabe von 1 Volumen modifiziertes CFA (30 µg M. butyricum pro 50 µl 0,01 N Essigsäure) hergestellt. Die Tiere wurden mit 100 µl dieses Gemisches unter Verwendung einer 26-Gauge-Nadel immunisiert. Eine Gruppe von Kontrolltieren wurde nicht injiziert, und einer anderen Gruppe wurde modifiziertes CFA ohne Collagen injiziert. Die Pfotendicke wurde mit einer Schnelltaster-Schiene mit konstanter Spannung gemessen. Das Typ-II-Collagen wurde aus sternalem Knorpel von Hühnern nach etablierten Methoden, Miller, Biochemistry 10, 1652 (1971), hergestellt.
- E. coli (ATCC 8739, Wildtyp) wurde in einem Manton-Gaulin-Homogenisator bei 4,19.108 Pa (6000 psi) 5 min lang homogenisiert und 30 min lang bei 60ºC hitzeinaktiviert. Die Bakterien wurden dann auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml Stammlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingestellt. BALB/c-Mäuse wurden dann intraperitoneal mit 1 ml Lösung, die 0,5 ml Antigen (15 µg E. coli) in PBS und 0,5 ml CFA enthielt, immunisiert. Die Mäuse erhielten Auffrischinjektionen von Antigen (15 µg E. coli) und unvollständigem Freundschem-Adjuvans 4 und 6 Wochen später. Die Mäuse wurden 1 Woche nach der zweiten Auffrischimmunisierung getötet.
- (2) Antikörper: PE-konjugierte-Anti-CD4 (L3T4), FITC-konjugierte- Anti-CD8, FITC-konjugierte-Anti-Thy-1,2, Anti-CD4- und anti-CD8-Antikörper wurden von Becton Dickinson (Mountain View, CA) bezogen. PE-konjugiertes Ziege-Anti-Ratte-IgG (affinitätsgereinigt) und gegen Maus-IgG absorbiert, wurden von Caltag (Rupp und Bowman, Tustin, CA) bezogen.
- (3) Abtrennung der T-Zellen: Die Mäuse wurden getötet und einzellige Suspensionen wurden aus der Milz hergestellt. Die T-Zellen wurden durch Passage durch eine Säule mit Nylonwolle angereichert. Die Zellen wurden dann in RPMI-1640-Medium, das mit 10% hitzeinaktiviertem FCS (Hyclone, Logan, UT) und 2 mM l-Glutamin (Medium) supplementiert war, suspendiert.
- (4) Anfärbung: Die Zellen (2 · 10&sup6;) wurden mit einer geeigneten Verdünnung von Anti-CD4-PE und Anti-CD8-FITC 30 min lang auf Eis inkubiert, 3mal mit dem Medium gewaschen und in 1 ml Medium resuspendiert. Die angefärbten Zellen wurden in Glaskammern plattiert und CD4&spplus;CD8&supmin; (erscheint orange) und CD4CD8&spplus;-T-Zellen (grün) wurden durch Epifluoreszens-Mikroskopie identifiziert. Um die DN-T-Zellen zu identifizieren, wurden die Zellen mit Anti-CD4 und Anti-CD8 30 min lang auf Eis inkubiert, 3mal mit Medium gewaschen, mit PE-markiertem Ziege-Anti-Ratte-IgG 30 min lang auf Eis inkubiert, 5mal mit Medium gewaschen, mit FITC-markiertem-Anti-Thy-1.2 30 min lang auf Eis inkubiert, 3mal mit Medium gewaschen und dann in 1 ml Medium resuspendiert. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop sichtbar gemacht und drei Populationen waren offensichtlich: CD4&supmin;CD8&supmin;-Thy-1.2&spplus;-Zellen erschienen grün, CD4&spplus;CD8&supmin;-Thy- 1.2&spplus;- und CD4&supmin;CD8&spplus;-Thy-1.2&spplus;-Zellen erschienen gelb und B-Zellen und Makrophagen waren ungefärbt. Diese Färbungsprotokolle beeinträchtigen nicht die Kanalexpression (Chandy et al., Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771); Grissmer et al., (1988), J. Immunol. 141, 1137). In den meisten Versuchen waren die Kammern mit Polylysin (0,25 mg/ml) beschichtet, um die Adhäsion der Zellen an das Gefäß zu verbessern. Dieses Verfahren veränderte die Kanalexpression, verglichen mit Zellen, die in nichtbeschichtete Kammern platiert wurden, nicht.
- (5) Elektrophysiologie: Nach phänotypischer Identifikation durch Epifluoreszens-Mikroskopie wurden einzelne T-Zellen bei Raumtemperatur (220 bis 26ºC) spannungsgeklammert. Einzelheiten der verwendeten Giga-Ohm-Spannungsklammer-Technik sind an anderer Stelle beschrieben (Chandy, et al. Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771); Grissmer et al. (1988) J. Immunol. 141, 1137); Chandy et al. (1986) Science 233, 1197; Cahalan, et al. (1985) J. Physiol. 358, 197).
- Lösungen: Die untersuchten Zellen wurden in normaler Säuger-Ringer- Lösung getränkt, die enthielt (in mM): 160 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl&sub2;, 1 CaCl&sub2; und 5 Na-HEPES (pH 7,4). Die Spannungspipette enthielt 134 KF, 11 K&sub2;-EGTA, 1,1 CaCl&sub2;, 2 MgCl&sub2; und 10 K-HEPES (pH 7,2). In Tetraethylammoniumchlorid(TEA&spplus;)haltigen Ringerlösungen war NaCl durch die geeignete Konzentration an TEA&spplus; ersetzt, wodurch die Osmoralität konstant gehalten wurde. Die Badlösung konnte während der Aufzeichnungen durch Badperfusion ausgetauscht werden.
- Identifikation des K&spplus;-Kanaltyps: Die K&spplus;-Kanäle wurden auf der Basis ihrer Inaktivierungseigenschaften, Kinetiken des Kanalschlusses und der Empfindlichkeit gegenüber Blockierung durch TEA&spplus; (Chandy et al., Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771; Grissmer et al. (1988), J. Immunol. 141, 1137; Chandy et al. (1986), Science 233, 1197; DeCoursey, et al. (1987), J. Gen. Physiol. 89, 379; DeCoursey, et al. (1987), J. Gen. Physiol. 89, 405). Typ-n-K&spplus;-Kanäle sind gebrauchsabhängig, schließen sich langsam nach Repolarisation mit einer Zeitkonstante von etwa 30 msek bei -60 mV und werden durch TEA&spplus; (KD = 8 mM) blockiert. Die Typ-l-K&spplus;-Kanäle sind nicht gebrauchsabhängig, schließen sich bei Repolarisation mit einer Zeitkonstante von 2 msek bei -60 mV rascher und sind viel empfindlicher gegenüber einer Blockierung durch TEA&spplus; (KD = 0,1 mM). Die Typ-n-K&spplus;-Kanäle sind nicht gebrauchsabhängig, schließen sich langsam, wie die Typ-n-K&spplus;-Kanäle nach Repolarisation, aber sind weniger empfindlich gegenüber einer Blockierung durch TEA&spplus; (KD -100 mM).
- Bestimmung der maximalen K&spplus;-Leitfähigkeit (gK) und der Anzahl der K&spplus;-Kanäle pro Zelle. Die gK wurde aus dem größten in jeder Zelle aufgezeichneten K&spplus;-Strom berechnet. Ein Umkehrpotential von -80 mV wurde verwendet, um den gK-Wert zu berechnen (Cahalan, et al., J. Physiol. 358, 197 (1985)). Die Anzahl der K&spplus;-Kanäle pro Zelle wurde durch Teilen von gK durch die Leitfähigkeiten des einzelnen Kanals des geeigneten Kanaltyps berechnet. Die Leitfähigkeiten des einzelnen Kanals betragen 18, 27 und 17 pS für n, l bzw. n' (Chandy, et al. Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771); Grissmer, et al. (1988) J. Immunol. 141, 1137).
- DN-T-Zellen aus Mäusen mit Collagen-Arthritis besitzen abnormal große Anzahlen an Typ-l-K&spplus;-Kanälen. Die Fig. 3 zeigt die auswärtigen K&spplus;- Ströme in DN-T-Zellen aus normalen DBA/1-LacJ-Mäusen und Mäusen mit Collagen- Arthritis. Bei den im oberen Teil der Abbildung gezeigten Versuchen wurde die Abnahme der Größe des durch eine wiederholte (1/s) depolarisierende Spannungsstufe von -80 mV bis +40 mV für eine Dauer von 200 msek hervorgerufenen K&spplus;-Stroms gemessen. Diese Eigenschaft der K&spplus;-Kanäle, die als gebrauchsabhängig bezeichnet wird, ist für Typ-n-K&spplus;-Kanäle charakteristisch, aber nicht für Typ l oder n'. Eine weitere Besonderheit der Typ-n-K&spplus;-Kanäle ist ihre Schließungskinetik während der Membranhyperpolarisation nach einer anfänglichen Periode der Depolarisation. Diese als Desaktivierung oder Leckströme bezeichnete Eigenschaft ist im unteren Teil der Fig. 3 gezeigt. In diesen Untersuchungen wurde das Membranpotential bei -80 mV gehalten, dann stufenweise auf +40 mV für eine Dauer von 15 msek erhöht, um alle Kanäle zu öffnen und dann stufenweise auf entweder -30 oder -60 mV reduziert. Die Typ-n- und -n'- Kanäle schließen sich langsam (die Zeitkonstanten für das Schließen betragen 75 msek und 40 msek bei -30 mV bzw. -60 mV), wohingegen sich die l-K&spplus;-Kanäle rasch schließen (die Zeitkonstanten für das Schließen betragen 6 msek und 2 msek bei -30 mV bzw. -60 mV).
- Normale DN-T-Zellen (linker Abschnitt der Fig. 3) besitzen kleine K&spplus;-Ströme, die gebrauchsabhängig (oben) sind, langsame Desaktivierungskinetiken (unten) zeigen und durch 10 mM TEA&spplus; (nicht gezeigt) zur Hälfte blockiert werden, was anzeigt, daß sie kleine Anzahlen von Typ-n-K&spplus;-Kanälen exprimieren. DN-T-Zellen aus erkrankten Mäusen besitzen große K&spplus;-Ströme (rechter Teil der Fig. 3), die nicht gebrauchsabhängig sind (oben), rasche Desaktivierungskinetiken zeigen (unten) und durch 0,1 mM TEA&spplus; zur Hälfte blockiert werden (nicht gezeigt), was anzeigt, daß diese Zellen reichlich Typ-l-K&spplus;-Kanäle exprimieren.
- Die Fig. 4a zeigt die maximale K&spplus;-Leitfähigkeit oder gKmax, von DN- T-Zellen aus der Milz von normalen und erkrankten Mäusen, und die Fig. 4b zeigt den Anteil der Zellen mit großen Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen an. Die Obergrenze für den gK-Wert von DN-T-Zellen aus normalen DBA/I-LacJ-Mäusen ist 1000 Picosiemens (pS) mit einem Durchschnitt von 299±78 pS. Der gK-Wert von DN-T-Zellen aus drei anderen normalen Mausstämmen (C3H-HeJ, BALB/c und C57BL) sind zum Vergleich gezeigt (gK = 405±53 pS; Mittelwert±53 pS; Mittelwert ± SEM; n = 51), Diese Daten zeigen an, daß normale DN-T-Zellen ungefähr 10 bis 20 K&spplus;-Kanäle/Zelle der Typen n, l oder n' exprimieren. In deutlichem Gegensatz dazu zeigten 14 von den 34 DN-T-Zellen aus erkrankten DBA/1-LacJ-Mäusen, die mit Typ-II-Collagen immunisiert worden waren, einen gK-Wert von größer als 1000 pS (Fig. 4a und 4b), und die Kanäle in diesen Zellen gehörtem ausschließlich dem Typ l an, durchschnittlich 180 Kanäle/Zelle. Interessanterweise gab es weniger DN-T-Zellen, die große Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen zeigten, bei DBA/I-LacJ-Mäusen, die mit Typ-II-Collagen immunisiert worden waren (3/25) und ohne offensichtliche klinische Anzeichen einer Arthritis (Fig. 4a und 4b) waren, verglichen mit Mäusen mit offensichtlicher Erkrankung. Diese Daten zeigen, daß die Erhöhung der Typ-l-K&spplus;-Kanalexpression in DN-T-Zellen mit der Entwicklung einer Collagen-Arthritis parallel verläuft.
- Andere T-Zell-Untergruppen aus erkrankten Mäusen behalten ihr normales Expressionsmuster bei. Die Fig. 5 zeigt den gK-Wert von Helfer- (CD4&spplus;CD8-)- und cytotoxischen (CD4&supmin;CD8&spplus;)-T-Zellen aus normalen und erkrankten Mäusen. Die CD4&spplus;CD8&supmin;-T-Zellen sowohl aus normalen als auch erkrankten Mäusen zeigten eine kleine Anzahl von K&spplus;-Kanälen (durchschnittlich 10 bis 20 Kanäle pro Zelle), die vorrangig dem Typ n angehörten. Die CD4&supmin;CD8&spplus;-T-Zellen aus Mäusen mit Collagen-Arthritis zeigten kleine Anzahlen von Typ-n' oder l-K&spplus;- Kanälen, wie ihre phänotypischen Gegenstücke aus normalen Mäusen. So scheint die Erhöhung der Anzahlen der Typ-l-K&spplus;-Kanäle, die mit dieser Erkrankung assoziiert ist, eine auf DN-T-Zellen beschränkte Besonderheit zu sein.
- Reichliche Typ-l-K&spplus;-Kanalexpression in DN-T-Zellen ist keine Besonderheit einer generalisierten Immunantwort in vivo. Um zu unterscheiden, ob die erhöhten Anzahlen von Typ-l-K&spplus;-Kanälen in DN-T-Zellen für Autoimmunstörungen einzigartig waren, oder ob dies eine generalisierte Immunantwort in vivo wiederspiegelte, wurden DN-T-Zellen aus mit entweder hitzeinaktiviertem E. coli oder CFA immunisierten Mäusen untersucht (Fig. 6). Die Mäuse erhielten entweder eine CFA-Immunisierung (26 Tage vor den Spannungs-Klammerversuchen) oder Auffrischdosen von CFA entweder 62 oder 26 Tage vor oder 26 und 2 Tage vor den Spannungs-Klammerversuchen. Die DN-T-Zellen aus diesen Mäusen besaßen kleine Anzahlen an Typ n-, l- oder n'-Kanälen, unabhängig davon, ob sie eine Immunisierung oder Auffrischdosen erhielten. Da durch Mitogene in vitro-aktivierte T-Zellen sich vergrößern (einen durchschnittlichen Membranwiderstand von > 2 pF, entsprechend einem Zelldurchmesser > 8 µm, besitzen) wurden die gK-Werte von großen (> 2 pF) und kleinen (< 2 pF) DN-T- Zellen von CFA-immunisierten Mäusen verglichen. Der gK-Wert von großen Zellen (580 ± 170 pS; Mittelwert±SA; n= 5) unterschied sich nicht signifikant von dem von kleinen Zellen (500±275 pS; Mittelwert±SA; n = 27). Auf ähnliche Weise zeigen auch DN-T-Zellen aus mit hitzeinaktiviertem E. coli-immunisierten Mäusen kleine Anzahlen von K&spplus;-Kanälen von einem der drei Typen. Insgesamt zeigen diese Daten, daß die Expression einer hohen Anzahl von Typ-l-K&spplus;-Kanälen durch DN-T-Zellen mit den Symptomen von Autoimmunerkrankungen assoziiert ist.
- Untersuchungen mit der Spannungsklammer-Aufzeichnungstechnik zeigten die Anwesenheit von drei unterschiedlichen Typen von spannungsgesteuerten K&spplus;- Kanälen in Maus-T-Zellen (Chandy, et al. Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771); Grissmer et al. (1988) J. Immunol. 141, 1137); Chandy et al. (1986) Science 233, 1197). Diese als n, n' und l bezeichneten Kanäle können auf der Grundlage von biophysikalischen und pharmakologischen Kriterien unterschieden werden. Helfer&supmin; und cytotoxische T-Zellen können auf der Grundlage ihres Musters der K&spplus;-Kanalexpression unterschieden werden. CD4&spplus;CD8&supmin;-(Helfer)-T-Zellen zeigen etwa 20 bis 100 Typ-n-K&spplus; Kanäle, wohingegen CD4&supmin;CD8&spplus;-(cytotoxische)-T-Zellen 20 bis 200 Typ-l-K&spplus; Kanäle (Chandy et al., Eur. J. Immunol. (im Druck); Lewis und Cahalan (1988), Science 239, 771; Grissmer, et al. (1988) J. Immunol. 141, 1137) zeigen. Mitogen-aktivierte T-Zellen exprimieren etwa 20mal mehr K&spplus;-Kanäle als unstimulierte Zellen, die ausschließlich dem Typ n angehören (22). Ruhende DN-T-Zellen besitzen kleine Anzahlen eines dieser Kanaltypen (Chandy, et al. Eur. J. Immunol.,(im Druck), Grissmer, et al. (1988) J. Immunol. 141, 1137). Eine reichliche Typ-l-K&spplus;-Kanalexpression ist ein Marker für DN-T-Zellen, die mit Mäuse-SLE, Typ-1-Diabetes-mellitus oder chronischer EAE assoziiert sind; andere T-Zelluntergruppen aus Mäusen mit diesen Autoimmunerkrankungen behalten ihr normales Muster der K&spplus;-Kanalexpression bei. Hier wurden die Beobachtungen der Erfinder auf Mäuse mit Typ-II-Collagen-Arthritis, einer Autoimmunstörung, die viele immunologische Besonderheiten mit SLE, Typ-1-Diabetes und chronischer EAE gemeinsam hat, ausgedehnt.
- Eine im wesentlichen große Fraktion an DN-T-Zellen aus Mäusen und aktiver Typ-II-Collagen-Arthritis zeigt erhöhte Anzahlen an Typ-l-K&spplus;-Kanälen. Im Gegensatz dazu zeigen phänotypisch ähnliche Zellen aus normalen Mäusen (Fig. 3 und 4) oder aus mit CFA oder hitzeinaktiviertem E. coli-immunisierten Mäusen (Fig. 6) oder mit Typ-II-Collagen-inokulierten Mäusen ohne Anschein einer aktiven Erkrankung kleine Anzahlen an K&spplus;-Kanälen, die den Typen n, n' oder l angehören können. Das Muster der K&spplus;-Kanalexpression in Helfer- (CD4&spplus;CD8&supmin;)- und cytotoxischen-(CD4&supmin;CD8&spplus;)-T-Zellen aus arthritischen Mäusen ähnelt sehr dem ihrer phänotypischen Äquivalente in normalen Mäusestämmen. So scheint veränderte K&spplus;&supmin;Expression ein Marker für DN-T-Zellen, die mit vier getrennten Autoimmunstörungen zusammenhängen, zu sein.
- Jüngste Berichte zeigen, daß gamma/delta-DN-T-Zellen auf mykobakterielle Antige ansprechen und sich bei Lepra-Hautläsionen, Haut-Leishmaniose und rheumatoider Gelenkarthritis (Modlin, et al. (1989), Nature 339, 544); Holishitz, et al. (1989), Nature 339, 226) anreichern. Durch Induktion der Aggregation von Monozyten können diese DN-T-Zellen zu entzündlichen Prozessen beitragen (Modlin, et al. (1989), Nature 339, 544). Es wurde berichtet, daß alpha/beta-TCR&spplus;-DN-T-Zellen als Helferzellen wirken und autoreaktive B-Zellen zur Sekretion pathogener Anti-DNA-Antikörper induzieren (Datta, et al. (1987), J. Exp. Med. 165, 1252); Sainis und Datta (1988), J. Immun. 140, 2215). Es wurde auch beschrieben, daß DN-T-Zellen die orale Toleranz beseitigen (Kitamura, et al. (1987), J. Immunol. 139, 3251). Zusammengefaßt zeigen diese Beobachtungen, daß DN-T-Zellen offensichtlich eine signifikante Rolle bei biologisch relevanten Immunantworten besitzen und offensichtlich an den Mechanismen beteiligt sind, die zu der Gewebszerstörung, die man bei Autoimmunerkrankungen findet, führen. Die Aktivierung über einen Stoffwechselweg, der sich von dem, der durch Mitogene oder Antigene getriggert wird, unterscheidet (z. B. E. coli oder CFA), kann eine reichliche Expression von Typ-l- K&spplus;-Kanälen auf DN-T-Zellen induzieren, unabhängig von dem TCR-Typ, den sie auf ihrer Zelloberfläche zeigen.
Claims (17)
1. Assay zum Screenen und Identifizieren extrinsischer
Materialien mit einer Modulationswirkung auf Typ-l-K&spplus;-
Kanäle von abnormalen doppelt-negativen (CD&supmin;&sub4;CD&supmin;&sub8;)
T-Zellen, die einen Überschuß an l-K&spplus;-Kanälen zeigen, verbunden
mit einer Autoimmunkrankheit, umfassend die Stufen:
a) Schaffung einer Kultur aus abnormalen
doppeltnegativen T-Zellen, abnormal weil sie
einzigartige K&spplus;-Kanaländerungseigenschaften zeigen von
einer Autoimmunkrankheit und damit verbunden und
charakterisiert durch eine erhöhte Zahl von
Typl-K&spplus;-Kanälen,
b) Behandlung der Zellkultur mit einem oder
mehreren Testmaterialien einer Serie, die die Typ-l-
K&spplus;-Kanäle davon potentiell modulieren können,
c) Überwachen der Wirkung der Testmaterialien auf
die Typ-l-K&spplus;-Kanäle und
d) Auswahl von chemischen Stoffen von der Serie von
Testmaterialien, die die Typ-l-K&spplus;-Kanäle
modulieren können.
2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Überwachung der Stufe c) durch Messung des
elektrischen Stroms durch die K&spplus;-Kanäle, die mit dem Testmaterial
befeuchtet sind, erfolgt.
3. Assay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Auswahl der Stufe d) auf Testmaterial, das wenig oder
weniger als normal elektrischen Strom durch die Typ-l-K&spplus;
Kanäle induziert, oder auf der Änderung der Intensität
eines Membranpotential-Erkennungsfarbstoffs oder eines
Calciumerkennungsfarbstoffs beruht.
4. Assaysystem zur Bestimmung des Vorhandenseins eines
Zustands einer Autoimmunkrankheit in einem Individuum,
umfassend die Stufen:
a) Bereitstellung von T-Zellen, die K&spplus;-Ionenkanäle
enthalten, von einem Testindividuum,
b) Identifizierung abnormaler doppelt-negativer T-
Zellen, die einen Überschuß an Typ-l-K&spplus;-Kanälen
zeigen, von der Population der T-Zellen der
Stufe a),
c) Messung der relativen Zahlen der Typ-l-K&spplus;-Kanäle
der in Stufe b) identifizierten Zellen und
d) Bestimmung, ob die Typ-l-K&spplus;-Kanäle, verglichen
mit normal, erhöht sind.
5. Assay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
die Messung der Stufe c) durch Messung des elektrischen
Stroms durch die Typ-l-K&spplus;-Kanäle erfolgt.
6. Assay nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
die Bestimmung der Stufe d) auf der Messung des
elektrischen Stroms durch Typ-l-K&spplus;-Kanäle oder auf der Intensität
der Farbstoffärbung in einer normalen, phänotypisch
ähnlichen T-Zelle erfolgt.
7. Verwendung eines extrinsischen Materials für die
Herstellung eines Arzneimittels, das für die Behandlung einer
Autoimmunkrankheit nützlich ist, wobei das extrinsische
Material eine Modulationswirkung auf Typ-l-K&spplus;-Kanäle in
abnormalen doppelt-negativen T-Zellen zeigt, die einen
Überschuß an Typ-l-K&spplus;-Kanälen zeigen und mit einer
Autoimmunkrankheit verbunden sind.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Material mit einem Cytotoxin konjugiert ist und
einen abnormalen doppelt-negativen,
T-Zellen-Typ-l-spezifischen Antikörper für die Lokalisierung der abnormalen
doppelt-negativen T-Zellen aufweist.
9. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Material Tetraethylammonium ist.
10. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Autoimmunkrankheit systemischer Lupus
erythematodes ist.
11. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Autoimmunkrankheit Typ-l-Diabetes-mellitus ist.
12. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Autoimmunkrankheit kollagenrheumatoide Arthritis
ist.
13. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Autoimmunkrankheit Multiple sklerose
(EAE-Enzephalomyelitis) ist.
14. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Autoimmunkrankheit Myasthenia gravis ist.
15. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Material ein chemischer Stoff ist, der
entsprechend dem Assay nach Anspruch 1 identifiziert wurde.
16. Verfahren zur Verarbeitung eines chemischen Stoffes,
der entsprechend dem Assay nach Anspruch 1 ausgewählt
wurde, bei der Herstellung einer Zusammensetzung, die den
chemischen Stoff als wesentliche Komponente enthält, wobei
die Zusammensetzung nützlich ist, wenn sie in vivo mit
abnormalen doppelt-negativen T-Zellen, die einen Überschuß
an Typ-l-K&spplus;-Kanälen enthalten, des Immunsystems in Kontakt
kommt, ihre Modulationseigenschaften zu vermitteln.
17. Verwendung einer Zusammensetzung erhalten nach dem
Verfahren nach Anspruch 16 für die Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit.
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