DE60318240T2

DE60318240T2 - Verfahren zur expression von protein mit darin integrierter unnatürlicher aminosäure

Info

Publication number: DE60318240T2
Application number: DE60318240T
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Yokohama-shi YOKOYAMA; Mikako Yokohama-shi SHIROUZU; Ayako Yokohama-shi SAKAMOTO; Kensaku Yokohama-shi SAKAMOTO
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Riken Wako Saitama Jp
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2023-11-01
Also published as: JPWO2004039989A1; JP4467435B2; EP1557469A1; ATE381623T1; US20090286311A1; CA2503749A1; US20060234339A1; DE60318240D1; EP1557469B1; EP1557469A4; US7566555B2; US7666640B2; WO2004039989A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht natürlich auftretendes Aminosäure-inkorporierendes Protein-Expressionsverfahren, durch das eine nicht natürlich auftretende Aminosäure an einer erwünschten Stelle in einem Protein eingebaut wird, wie auch tierische Zellen, die zur Expression des vorher erwähnten Proteins verwendet werden.
Beschreibung von verwandtem Stand der Technik
Nicht natürlich auftretende Aminosäure-haltige Proteine (die auch als Alloproteine bezeichnet werden), worin ein Aminosäurerest an einer gewünschten Stellung in einem Protein durch eine andere Aminosäure als die 20 Aminosäuretypen substituiert ist, die üblicherweise an der Proteinsynthese beteiligt sind (als nicht natürlich auftretende Aminosäuren zu bezeichnen), bieten ein effektives Mittel zur Analyse der Funktion und Struktur von Proteinen.
Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen (auch als aaRS zu bezeichnen) sind Enzyme, die spezifisch Aminosäuren und tRNA binden und ausschließlich einiger Ausnahmen gibt es 20 Arten solcher Enzyme, korrespondierend zu jeder der 20 Arten von Aminosäuren, die für jede biologische Art in der Natur existieren. Da diese aaRS im wesentlichen für jede Aminosäure in den Zellen vorliegen, wird die Art der Aminosäure, die dem genetischen Code zugeordnet ist, bestimmt. Beispielsweise unterscheidet TyrRS, wobei es sich um eine Art aaRS handelt (einfach als TyrRS zu bezeichnen), Tyrosin-tRNA (zu bezeichnen als tRNA^Tyr) von der tRNA anderer Aminosäuren und bindet nur Tyrosin an tRNA^Tyr ohne eine Bindung anderer Aminosäuren.
Bekannte Verfahren zur Erzeugung von Alloproteinen im Stand der Technik bestehen aus einem Verfahren, das Alloproteine in Escherichia coli erzeugt (Koide, et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, Band 85, 1988, S. 6237–6241 (Dokument 1)) und einem Verfahren, das Alloproteine in einem zellfreien Translationssystem erzeugt (Noren, et al., Science, Band 244, 1989, S. 182–188 (Dokument 2)).
Um Proteine herzustellen, die 21 Arten von Aminosäuren enthalten, einschließlich nicht natürlich auftretenden Aminosäuren, und zwar mit großem Ertrag, ist es notwendig, ein künstliches genetisches Codesystem zu konstruieren, so dass tRNAs mit nicht natürlich auftretenden Aminosäuren durch spezifische aaRSs in einem System aminoacyliert werden, in dem die Translationsreaktion stattfindet.
Es ist notwendig, aaRS-tRNA-Paare zu finden, die den folgenden Bedingungen entsprechen, um ein solches künstliches genetisches Codesystem zu konstruieren:

(1) Die aaRS muss eine aaRS-Mutante sein, die spezifisch mit einer gewünschten, nicht natürlich auftretenden Aminosäure reagiert und nicht mit irgendeiner der üblichen 20 Arten von Aminosäuren und
(2) die tRNA muss einem Codon zugeordnet sein, dem keine der üblichen 20 Arten von Aminosäuren zugeordnet ist (wie z. B. ein Unsinncodon oder ein 4-Basencodon), muss nur von der vorher erwähnten aaRS-Mutante erkannt werden, die spezifisch für eine nicht natürlich auftretende Aminosäure ist und darf nicht von irgendeiner aaRS des Wirts erkannt werden (orthogonale tRNA).

Ein tRNA-Molekül, das eine nicht natürlich auftretende Aminosäure bindet und sie zu einem Unsinncodon auf der Boten-RNA (Suppressor-tRNA-Molekül) transportiert und ein Enzym, das eine nicht natürlich auftretende Aminosäure an ihr Suppressor-tRNA-Molekül (aaRs) bindet, kann verwendet werden, um ein genetisches Codesystem zu erzeugen, das diesen Bedingungen entspricht. Dieser Mechanismus wird von Wang, et al., Science, Band 292, 2001, S. 498–500 (Dokument 3) und Journal of the American Chemical Society, Band 124, 2002, S. 1836–1937 (Dokument 4) beschrieben.
Spezifische künstliche genetische Codesysteme, die auf diesem Mechanismus basieren, wurden in E. coli, wie auch in zellfreien Proteinsynthesesystemen unter Verwendung von Weizenkeimextrakt etabliert.
Es wurde nämlich über ein System zur Erzeugung von Proteinen, enthaltend eine nicht natürlich auftretende Aminosäure an einer willkürlich spezifizierten Stelle, in E. coli berichtet, das aus O-Methyltyrosin besteht, spezifisch inseriert, korrespondierend zu einem Ambercodon, durch Expression einer TyrRS-Mutante, die von Methanococcus jannaschii abstammt, verändert, um spezifisch O-Methyltyrosin zu aminoacylieren und einer Amber-Suppressor-tRNA, worin Tyrosin tRNA von demselben Mikroorganismus verändert wurde (Dokument 3).
Zusätzlich wurde eine aaRS zur Erzeugung eines Proteins, enthaltend eine nicht natürlich auftretende Aminosäure an einer willkürlichen Stelle in Weizenkeimextrakt, entwickelt (Kiga, et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, Band 99, 23. Juli 2002, S. 9715–9723 (Dokument 5)).
Auf diese Weise können, obwohl Alloprotein-Produktionssysteme in E. coli und zellfreien Proteinsynthesesystemen entwickelt wurden, diese nicht direkt in tierischen Zellen verwendet werden. Die zur Verwendung in E. coli entwickelten Moleküle können nämlich nicht in tierischen Zellen verwendet werden und zwar aufgrund der Eigenschaften der Moleküle selbst. Um Proteine zu synthetisieren, die eine nicht natürlich auftretende Aminosäure an einer willkürlich spezifizierten Stelle in tierischen Zellen enthalten, müssen geeignete Suppressor-tRNAs und aaRS, die für sowohl die Suppressor-tRNA als auch die nicht natürlich auftretende Aminosäure spezifisch ist, entwickelt werden und die Expression dieser Moleküle muss in tierischen Zellen realisiert werden.
Zusätzlich wird vorhergesagt, dass die vorher erwähnte aaRS, die in einem zellfreien Proteinsynthesesystem in Weizenkeimextrakt verwendet wird, dazu in der Lage ist, in tierischen Zellen unter Betrachtung ihrer Substratspezifität verwendet zu werden. Um diese aaRS zu verwenden, ist es jedoch notwendig, Suppressor-tRNA zu entwickeln, die damit kombiniert werden kann, zusammen mit dem Expressionssystem für diese tRNA.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Expression nicht natürlich auftretender Aminosäure-haltiger Proteine in tierischen Zellen und die Bereitstellung von DNA, einem Expressionsvektor und tierischen Zellen zur Expression des Proteins.
Die vorliegende Erfindung stellt die Expressionsverfahren, wie unten beschrieben, bereit.

(1) Expressionsverfahren für ein nicht natürlich auftretendes Aminosäure-haltiges Protein, umfassend: Expression von
(A) einer mutierten TyrRS, die ein Derivat einer TyrRS ist, die von E. coli abstammt, mit verstärkter Spezifität für ein nicht natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zu der Spezifizität für Tyrosin (bezeichnet als mutierte TyrRs), wobei die mutierte Tyrosyl-tRNA-Synthetase eine mutierte TyrRS der SEQ ID NO: 29 ist, worin die Stellung, korrespondierend zu Tyrosin (Y) an Position 37 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I) oder Alanin (A) substituiert ist und worin die Stellung, korrespondierend zu Glutamin (Q) an Position 195 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Alanin (A), Cystein (C), Serin (S) oder Asparagin (N) substituiert ist;
(B) Suppressor-tRNA, die von Bacillus stearothermophilus abstammt und dazu in der Lage ist, an das Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten TyrRS zu binden; und
(C) ein gewünschtes Proteingen, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat; in tierischen Zellen, wobei das Tyrosinderivat als Reaktion auf das erzeugte Unsinncodon eingebaut wird.
(2) Expressionsverfahren gemäß (1), wobei das Tyrosinderivat ein an Position 3 substituiertes Tyrosin oder ein an Position 4 substituiertes Tyrosin ist.
(3) Expressionsverfahren gemäß (1) oder (2), wobei die tierischen Zellen Säugerzellen sind.
(4) Ein nicht natürlich auftretendes Aminosäure-haltiges Protein-Erzeugungsverfahren, umfassend: das Gewinnen und Reinigen eines Proteins, exprimiert gemäß einem der Verfahren gemäß (1) bis (3) und (8) bis (10). Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die unten beschriebenen tierischen Zellen.
(5) Tierische Zellen, enthaltend:
(A) einen Expressionsvektor, der in tierischen Zellen eine mutierte TyrRS exprimiert, die ein Derivat einer TyrRS ist, die von E. coli abstammt, mit verstärkter Spezifität für ein nicht natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zu der Spezifizität für Tyrosin, wobei die mutierte Tyrosyl-tRNA-Synthetase eine mutierte TyrRS der SEQ ID NO: 29 ist, worin die Stellung, korrespondierend zu Tyrosin (Y) an Position 37 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I) oder Alanin (A) substituiert ist und worin die Stellung, korrespondierend zu Glutamin (Q) an Position 195 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Alanin (A), Cystein (C), Serin (S) oder Asparagin (N) substituiert ist;
(B) einen Expressionsvektor, der in den tierischen Zellen eine Suppressor-tRNA exprimiert, die von Bacillus stearothermophilus abstammt und dazu in der Lage ist, an das Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten TyrRS zu binden; und
(C) einen Expressionsvektor, der in den tierischen Zellen ein gewünschtes Proteingen exprimiert, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat; wobei das Tyrosinderivat an der Stelle der Unsinnmutation des Proteins eingebaut ist.
(6) Tierische Zellen gemäß (5), wobei das Tyrosinderivat ein an Position 3 substituiertes Tyrosin oder ein an Position 4 substituiertes Tyrosin ist.
(7) Tierische Zellen gemäß (5) oder (6), wobei es sich um Sängerzellen handelt.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung das folgende, unten beschriebene bereit.

(8) Expressionsverfahren gemäß (1) bis (3), wobei die Suppressor-Tyrosin-tRNA in einem Expressionsvektor umfaßt ist, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
(9) Expressionsverfahren gemäß (8), wobei der Expressionsvektor dazu in der Lage ist, von einer Kontrollsequenz exprimiert zu werden, die in tierischen Zellen erkannt wird, umfassend irgendeine der Sequenzen wie definiert in 8.
(10) Expressionsverfahren gemäß (9), wobei der Expressionsvektor neun Kopien von DNAs trägt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweisen, und zwar in derselben Richtung.
(11) Tierische Zellen gemäß (5) bis (7), wobei der Expressionsvektor von (B) dazu in der Lage ist, von einer Kontrollsequenz exprimiert zu werden, die in tierischen Zellen erkannt wird, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
(12) Tierische Zellen gemäß (11), wobei der Expressionsvektor neun Kopien von DNAs in derselben Richtung trägt, mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine erklärende Zeichnung, die ein Säugerzellsystem zum Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin als Reaktion auf ein Ambercodon in ein Proteingen darstellt. Obwohl das 3-Iod-L-Tyrosin (IY) auch vorliegt, mit L-Tyrosin (Y) in Medium, bindet sie an jede B. s. tRNA^Tyr (Bacillus stearothermophilus tRNA^Tyr), aufgrund einer spezifischen E. coli TyrRS, die in die Zellen eingeführt wurde.
2 zeigt die Sequenz und Struktur einer Suppressor-tRNA^Tyr, die von E. coli tRNA^Tyr abstammt und Suppressor-tRNA^Tyr, die von Bacillus stearothermophilus tRNA^Tyr abstammt. In 2 zeigt s⁴U 4-Thiouridin an, Gm zeigt 2'-O-Methylguanosin an, ms²t⁶A zeigt 2-Methyl-thio-N⁶-isopentyladenosin an, T zeigt 5-Methyluridin an, psi zeigt Pseudouridin an und m¹A zeigt 1-Methyladenosin an.
3 ist eine Zeichnung, die die Struktur eines Plasmids mit neun Kopien von Bacillus stearothermophilus Suppressor-tRNA^Tyr in Reihe darstellt.
Die 4A und 4B sind Fotografien von Gelen, erhalten von einem Western-Blot unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörpers zum Nachweis einer Amber-Suppression in CHO-Zellen.
Die 5A und 5B sind Fotografien von Western-Blots zum Nachweis einer Amber-Suppression.
Die 6A, 6B und 6C sind Grafiken, die die Ergebnisse einer LC-MS-Analyse von ras und ras(Am)-Produkten darstellen.
7 ist eine Fotografie eines Western-Blots einer induzierbaren Amber-Suppression für den Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin in das Ras-Protein.
8 ist eine Zeichnung, die eine Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Sequenzcode) von TyrRS (Wildtyp) von E. coli darstellt.
9 ist eine schematische Zeichnung von TetBst0, TetBst1 und TetBst2.
Die 10A und 10B zeigen die Ergebnisse eines Vergleichs der Suppressionseffizienz in den Beispielen der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionsverfahren für nicht natürlich auftretende Aminosäure-haltige Proteine, umfassend: die Expression in tierischen Zellen von:

(A) einer mutierten TyrRS, die ein Derivat von TyrRS ist, abstammend von E. coli, wie definiert in Anspruch 1 mit einer erhöhten Spezifität für ein nicht-natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zu der Spezifität für Tyrosin;
(B) Suppressor-tRNA, abstammend von Bacillus stearothermophilus, fähig zur Bindung an das Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten TyrRS; und
(C) ein gewünschtes Proteingen, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat; wobei das Tyrosinderivat an der Stellung der Protein-Unsinnmutation eingebaut wird.

Als nächstes wird eine detaillierte Beschreibung der mutierten TyrRS und der Suppressor-tRNA, die in dem Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bereitgestellt.
(1) Mutierte TyrRS
In der vorliegenden Erfindung wird eine erhöhte Substrataffinität für ein gewünschtes Tyrosinderivat im Vergleich zu Tyrosin bedeuten, dass der Aktivitätswert (Wert, erhalten durch Division der Reaktionsrate K_cat durch die Michealis-Konstante K_m) für das Ziel-Tyrosinderivat größer ist als der Aktivitätswert für Tyrosin. Obwohl der Aktivitätswert in einem in vitro-Assay gemessen werden kann, kann die relative Größenordnung des Aktivitätswerts auch aus genetischen Daten bestimmt werden.
Die mutierte TyrRS, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Derivat von TyrRS von E. coli, wie definiert in Anspruch 1, das spezifisch ein Tyrosinderivat erkennt, spezifisch Suppressor-tRNA erkennt, die in Kombination damit verwendet wird und die Suppressor-tRNA bildet, aminoacyliert mit dem Tyrosinderivat. Beispiele für E. coli beinhalten den Stamm K12 und den Stamm B.
Die TyrRS (Wildtyp), die von E. coli abstammt, reagiert nicht mit tRNA^Tyr von Eukaryonten, während die tRNA^Tyr, die von E. coli abstammt, nicht mit TyrRS von Eukaryonten reagiert.
Beispiele für das vorher erwähnte Tyrosinderivat beinhalten an Position 3 substituiertes Tyrosin und an Position 4 substituiertes Tyrosin mit einem Substituenten an Position 3 oder Position 4 der Phenylgruppe von Tyrosin.
Beispiele für an Position 3 substituiertes Tyrosin beinhalten 3-halogenierte Tyrosine, wie 3-Iodtyrosin und 3-Bromtyrosin. Zusätzlich beinhalten Beispiele für an Position 4 substituiertes Tyrosin 4-Acetyl-L-phenylalanin, 4-Benzoyl-L-phenylalanin, 4-Azido-L-phenylalanin, O-Methyl-L-Tyrosin und 4-Iod-L-phenylalanin.
Diese Aminosäuren können durch bekannte Verfahren hergestellt werden oder es können kommerziell zur Verfügung stehende Aminosäuren verwendet werden. Beispielsweise kann 4-Acetyl-L-phenylalanin gemäß dem Verfahren, wie beschrieben in Biochemistry, Band 42, S. 6735–6746, 2003, erzeugt werden. Zusätzlich können kommerziell erhältliche Produkte, erhalten von Bachem (Deutschland) für 4-Benzoyl-L-phenylalanin und 4-Azido-L-phenylalanin verwendet werden und kommerziell erhältliche Produkte, erhalten von Sigma (USA) können für O-Methyl-L-tyrosin und 4-Iod-L-phenylalanin verwendet werden.
Diese Aminosäuren sind selbst nicht natürlich auftretende Aminosäuren mit physiologischer Aktivität oder können als Ziel für ortsspezifische Markierungen von Proteinen verwendet werden. Beispielsweise ist daher ein Protein, enthaltend 3-halogeniertes Tyrosin, als Forschungsmaterial zur Analyse der Struktur und Funktion dieses Proteins nützlich, während Proteine, die andere Aminosäuren enthalten, ein Potenzial aufweisen können, ein Ziel für eine Arzneimittelentwicklung zu sein.
Die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 29) von TyrRS (Wildtyp) von E. coli ist in 8 unter Verwendung von Ein-Buchstaben-Symbolen für Aminosäuren dargestellt.
Das Gen, das die mutierte TyrRS, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, codiert, kann hergestellt werden, indem die Aminosäurereste, die vermutlich an der Erkennung von Tyrosyl-AMP durch das Enzym beteiligt sind, durch ein bekanntes Verfahren einer ortsgerichteten Mutagenese (später beschrieben) substituiert werden. Diese Aminosäuren sind in der Sequenz, wie dargestellt in 8 durch Bezugnahme auf die Aminosäuren identifiziert, die an der Tyrosyl-AMP-Erkennung in einer bekannten tertiären Struktur des Komplexes zwischen TyrRS und Tyrosyl-AMP beteiligt sind (beispielsweise Brick et al., J. Mol. Biol., Band 208, S. 83, 1988).

Die mutierte TyrRS, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine mutierte TyrRS von SEQ ID NO: 29, worin die Stellung, korrespondierend zu Tyrosin (Y) an Position 37 durch Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I) oder Alanin (A) substituiert ist und die Stellung, korrespondierend zu Glutamin (Q) an Position 195 durch Alanin (A), Cystein (C), Serin (S) oder Asparagin (N) substituiert ist (siehe Dokument 5). Ergebnisse, die demonstrieren, dass die Spezifität für 3-halogenierte Tyrosine durch diese Mutationen verstärkt sind, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt die Messung einer Aminoacylierungsreaktion durch Nachweis von anorganischem Phosphor unter Verwendung von Biomol Green (Funakoshi), basierend auf einer vereinfachten Version des Verfahrens von Lloyd et al., das die Menge an anorganischer Phosphorsäure quantifiziert, erzeugt durch Abbau von Pyrophosphorsäure, wobei es sich um eines der Reaktionsprodukte der Aminoacylierungsreaktion handelt, mit Pyrophosphatase (Lloyd, et al., Nucleic Acids Research, Band 23 (1995) S. 2286–2892). Tabelle 1 Aktivität von TyrRS-Varianten mit Tyrosin, 3-Iod-L-tyrosin

	Aminosäure			Aminosäure
Enzym	Tyrosin	3-Iod-L-tyrosin	Enzym	Tyrosin	3-Iod-L-tyrosin
Wildtyp (Y37, Q195)	+++	–	V37	+++	+++
A37A195	–	–	I37A195	+	+
A37C195	+	++	I37C195	–	–
A37N195	–	–	I37N195	–	–
A37S195	+	+	I37S195	–	–
V37A195	+	++	L37A195	+	–
V37C195	+	++	L37C195	+	+
V37N195	+	++	L37N195	+	–
V37S195	++	++	L37S195	–	–

+++: Aktivität, nachgewiesen mit einer Enzymkonzentration von 0,05 μM
++: Aktivität, nachgewiesen mit einer Enzymkonzentration von 0,25 μM
+: Aktivität, nachgewiesen mit einer Enzymkonzentration von 0,25 μM, obwohl die Aktivität niedriger ist als die durch ++ repräsentierte
–: Keine Aktivität nachgewiesen mit einer Enzymkonzentration von 0,25 μM

Basierend auf den Ergebnissen von Tabelle 1 sind insbesondere die Mutante, worin Position 37 Valin ist und Position 195 Cystein (hier zu bezeichnen als V37C195), die Mutante, worin Position 37 Valin und Position 195 Asparagin ist (zu bezeichnen als V37N195), die Mutante, worin Position 37 Valin und Position 195 Alanin ist (zu bezeichnen als V37A195) und die Mutante, worin Position 37 Alanin und Position 195 Cystein ist (zu bezeichnen als A37C195) besonders bevorzugt.
Als nächstes wird ein Verfahren unter Verwendung bekannter genetischer Manipulationsverfahren als Verfahren bevorzugt, das verwendet wird, um diese Mutanten zu erzeugen.
Beispielsweise werden die DNA-Sequenzen mit gewünschtem Aminosäureersatz mit den Primern amplifiziert, um diesen Ersatz zu erhalten und werden dann miteinander in das Gesamtlängengen für eine gewünschte mutierte aaRS verbunden. Diese aaRS kann einfach durch Expression in Wirtszellen wie E. coli hergestellt werden. Der in diesem Verfahren verwendete Primer hat 20 bis 70 Basen und vorzugsweise ungefähr 20 bis 50 Basen. Da dieser Primer in 1 bis 3 Basen mit der ursprünglichen Basensequenz vor der Veränderung eine Fehlpaarung aufweist, wird die Verwendung eines vergleichsweise längeren Primers von beispielsweise 20 Basen oder mehr bevorzugt.
Genauer gesagt wird das Fragment, amplifiziert durch PCR gemäß dem in Dokument 5 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der folgenden Primer (1) und (2), zusammen mit E. coli genomischer DNA für die PCR-Matrize mit NdeI und HindIII behandelt, gefolgt von einem Einbau dieses Fragments an der NdeI-HindIII-Stelle von pET26b zur Erzeugung des TyrRS-Expressionsvektors pRT-YRS. Die Verwendung von E. coli-genomischer DNA für die Matrize bedeutet, dass E. coli-Zellen, gesammelt von ungefähr 0,1 ml einer E. coli-Kultur, 10 Minuten auf 95°C erwärmt werden, bevor sie der PCR-Reaktionsmischung zugefügt werden.
Als nächstes wird eine Erklärung eines Beispiels für ein Verfahren zur ortsspezifischen Veränderung der Aminosäuren an den Positionen 37 und 195 bereitgestellt.
Zunächst werden Mutanten erzeugt, worin nur eine Aminosäure an Position 37 oder Position 195 substituiert ist. Die Primer (3) bis (8), die verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu erzeugen, die Mutanten codieren, worin eine Aminosäure jeweils an Position 37 und Position 195 substituiert sind, sind unten dargestellt.
Als nächstes werden Mutanten erzeugt, worin die Aminosäuren an den Positionen 37 und 195 beide substituiert sind.
Die DNA-Sequenz, die die Mutante mit beiden Substitutionen codiert, wird durch eine überlappende Extension unter Verwendung der Plasmide erzeugt, die die oben erwähnten mutierten Gene tragen, jeweils mit einer einzelnen Substitution an Position 37 oder 195 und wird dann zwischen den NdeI- und BamHI-Stellen von pET-YRS inseriert. Diese überlappende Verlängerung kann durch PCR mit den Primern (1) und (9) zur Amplifikation von zwei DNA-Fragmenten, die teilweise miteinander überlappen, durchgeführt werden. Diese Fragmente werden durch PCR mit den Primerpaaren (1) und (10) und (9) und (11) erhalten und zur Verwendung in der überlappenden Verlängerung gereinigt.
Jedes der in dem vorher erwähnten Prozess erhaltenen Gesamtlängen-mutierten DNA-Fragmente wird in die Stellungen der Matrizenfragmente innerhalb des Plasmids pET-YRS inseriert und in jeweils E. coli BLR (DE3) gemäß einem Transformationsverfahren entsprechend dem Verfahren von Hanahan (Hanahan, D., J. Mol. Bio., 166, 557–580) inseriert, mit Plasmiden, enthaltend das mutierte TyrRS-Gen. Mutierte TyrRS kann dann in E. coli durch Isolieren und Kultivieren von Transformanten, die jeweils ein Plasmid aufweisen, exprimiert werden.
Weiterhin ist das Verfahren, das verwendet wird, um mutierte TyrRS zu erzeugen, nicht auf das vorher erwähnte Verfahren begrenzt, sondern es können tatsächlich verschiedene genetische Manipulationstechnologien verwendet werden, einschließlich bekannter Punktmutationstechnologien und Verfahren zur Insertion veränderter Fragmente unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen.
(2) Suppressor-tRNA
Die Suppressor-tRNA, die in Kombination mit der vorher erwähnten mutierten TyrRS verwendet wird, entspricht den Anforderungen, einem Unsinncodon zugeordnet zu sein, wobei es sich um ein Codon handelt, das nicht den normalen 20 Arten von Aminosäuren zugeordnet ist, erkannt nur von der vorher erwähnten nicht natürlich auftretenden Aminosäurespezifischen TyrRS-Mutante, und nicht erkannt von irgendeiner aaRS des Wirts und dazu in der Lage, in eukaryontischen Zellen exprimiert zu werden.
Obwohl alle drei Unsinncodons UAG (amber), UAA (ochre) und UGA (opal) verwendbar sind, wird UAG (amber) vorzugsweise verwendet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überprüft, ob die von E. coli abstammende Suppressor-tRNA dazu geeignet wäre, mit einer mutierten TyrRS, abstammend von E. coli, kombiniert zu werden und haben versucht, diese E. coli-Suppressor-TRNA^Tyr in eukaryontischen Zellen zu exprimieren. Die Sequenz und Struktur von Suppressor-tRNA^Tyr, die von E. coli-tRNA^TYr abstammte, war bereits bekannt (M. Sprinzl, et al., Nucleic Acids Research, 17, 1–172 (1989)). Dies ist in 2 dargestellt.
Allgemein benötigt die Expression von tRNA in eukaryontischen Zellen zwei interne Promotoren innerhalb der tRNA codierenden Sequenz und ihre Konsensussequenzen sind als box A und box B bekannt. Die Konsensussequenz von box A (TRGCNNAGYNGG; SEQ ID NO: 13) korrespondiert zu TRGCNNAGY an den Positionen 8 bis 16 und GG an den Positionen 18 und 19 der tRNA, während die Konsensussequenz von box B zu GGTTCGANTCC an den Positionen 52 bis 62 korrespondiert (SEQ ID NO: 14). Diese Positionen sind in 2 umkreist. Die Konsensussequenz von box B kann auch AGTTCGANTCT (SEQ ID NO: 20) sein.
Wie in 2 dargestellt, enthält, obwohl die E. coli-Suppressor-tRNA^Tyr eine box B-Konsensussequenz in ihrer Sequenz aufweist, sie keine box A Konsensussequenz. Um dementsprechend diese E. coli-Suppressor-tRNA^Tyr in eukaryontischen Zellen zu exprimieren, wurden U9 und C10 durch A bzw. G substituiert, um eine Konsensussequenz von box A zu erzeugen (2) und die resultierenden Fehlpaarungsbasenpaare, G10 und G25, wurden durch eine G25C-Substitution korrigiert. Daraufhin konnte, wie in den später beschriebenen Vergleichsbeispielen dargestellt, keine Suppressoraktivität nachgewiesen werden, selbst in Kombination mit der vorher erwähnten mutierten E. coli TyrRS.
Da andererseits die Suppressor-tRNA^Tyr von Bacillus stearothermophilus, einem anderen Prokaryonten, ursprünglich eine box B und eine box A innerhalb ihrer Sequenz aufweist (M. Sprinzl, et al., Nucleic Acids Research, 17, 1–172 (1989)) (siehe 2), wurde angenommen, dass diese ohne weitere Veränderungen in Eukaryonten exprimierbar sein sollte.
Dann wurde die B. stearothermophilus Suppressor-tRNA^Tyr in einen Vektor für seine Einführung in tierische Zellen ohne Veränderungen kloniert. Sie wurde tatsächlich in tierischen Zellen exprimiert (siehe die später beschriebenen Beispiele) und zeigte eine Suppressionsaktivität in Kombination mit der vorher erwähnten E. coli TyrRS (siehe die später beschriebenen Beispiele).
Nämlich kann eine prokaryontische Suppressor-tRNA, die sich die Suppressoraktivität in ihrer Form mit einer box A-Sequenz und einer box B-Sequenz erhalten kann, eine Suppressoraktivität in Eukaryonten zeigen, wenn sie mit der vorher erwähnten E. coli-mutierten TyrRS kombiniert wird.
So ist die Suppressor-tRNA, die in dem Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Suppressor-tRNA, die von Bacillus stearothermophilus abstammt und kann an Tyrosinderivate in Gegenwart der vorher erwähnten mutierten TyrRS binden. Die Sequenzen dieser tRNA werden beschrieben in http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/trnabase oder
http://www.sfaff.uni-bayreuth.de/~btc914/search/.
Diese tRNAs haben eine Suppressor-tRNA-Sequenz, die in Prokaryonten wirkt, wie auch zwei interne Promotor-Konsensussequenzen, die in Eukaryonten erkannt werden und sind dazu in der Lage, an Tyrosinderivate in Gegenwart der vorher erwähnten mutierten TyrRS zu binden. Hier bedeutet "mit einer Suppressor-tRNA-Sequenz, die in Prokaryonten wirkt", dass diese Suppressor-tRNAs sind, die von einem Prokaryonten abstammen und sich ein Anticodon erhalten, das zu einem Unsinncodon komplementär ist (üblicherweise ein amber-Codon (UAG)) und eine dreidimensionale Struktur (L-förmige Struktur) zur Wirkung als Suppressor-tRNA. "Mit zwei internen Promotorsequenzen, die in Eukaryonten erkannt werden" bedeutet, dass diese Gene die vorher erwähnte box A-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 13) und box B-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 20) enthalten. "Fähig zur Bindung an Tyrosinderivate in Gegenwart der vorher erwähnten mutierten TyrRS" bedeutet, dass es sich um Suppressor-tRNA handelt, die von der mutierten TyrRS erkannt werden kann und Tyrosinderivate binden kann. Sie sind Suppressormutanten, abstammend von tRNA^Tyr, die an Tyrosin binden und Tyrosinderivate binden können und vorzugsweise an Position 3 substituiertes Tyrosin in Gegenwart von mutierter TyrRS.
(3) Expression von mutierter TyrRS und Suppressor-tRNA in tierischen Zellen
Jedes bekannte Expressionssystem kann verwendet werden, um mutierte TyrRS in tierischen Zellen zu exprimieren, wobei Beispiele hierfür kommerziell erhältliche pCDNA3.1 (Invitrogen), pAGE107 (Cytotechnology, 33 (1990)) und pAGE103 (J. Biochem. 101, 1307 (1987)) beinhalten. Suppressor-tRNA kann in tierischen Zellen unter Verwendung von jedem bekannten Vektor zum Klonieren in E. coli exprimiert werden, wobei ein Beispiel hierfür pBR322 ist (Sutcliffe, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737–3741 (1978)).
Ein Vektor kann zur induzierbaren Expression, falls nötig, für die mutierte TyrRS verwendet werden, wobei ein Beispiel hierfür der Vektor ist, der einen Tetracyclin-verantwortlichen Promotor trägt, kommerziell erhältlich von Clontech oder Invitrogen.
Beispiele für Verfahren zur Einführung des Vektors in die Zellen beinhalten die Elektroporation (Chu, Nucl. Acids Res. 15, 1311–1326 (1987)), das Calciumphosphatverfahren (Chen, Mol. Cell. Biol. 7, 2745–2752 (1987)) und die Lipofektion (Derijard, Cell 7, 1025–1037 (1994); Lamb, Nature Genetics 5, 22–30 (1993)).
(4) Proteine, in die die nicht natürlich auftretenden Aminosäuren eingebaut werden
Es gibt keine Begrenzungen für den Proteintyp, in den eine nicht natürliche auftretende Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung eingebaut wird. Dieses Protein kann jedes Protein sein, das exprimiert werden kann und es kann sich auch um ein rekombinantes Protein handeln.
In der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, ein Unsinncodon an der Stelle zu inserieren, an der die nicht natürlich auftretende Aminosäure eingebaut wird (dieses Unsinncodon ist ein amber-Codon, wenn die Suppressor-tRNA ein amber-Suppressor ist). Eine nicht natürlich auftretende Aminosäure wird dann spezifisch in diese Unsinncodon(amber-Codon)-Stelle eingebaut.
Obwohl es keine bestimmten Begrenzungen hinsichtlich des Verfahrens für eine ortsspezifische Insertion einer Mutation in ein Protein gibt und bekannte Verfahren verwendet werden können, kann es in geeigneter Weise in Übereinstimmung mit beispielsweise den von Hashiomoto-Gotoh, Gene 152, 271–275 (1995), Zoller, Methods Enzymol. 100, 468–500 (1983), Kramer, Nucleic Acids Res. 12, 9441–9465 (1984), Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492 (1985) oder Cellular Engineering Supplement, "New Cellular Engineering Experimental Protocols", Shujunsha, 241–248 (1993) beschriebenen Verfahren oder Methoden, die das "QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene) verwenden, durchgeführt werden.
Da die vorliegende Erfindung die Expression in tierischen Zellen ermöglicht, ermöglicht sie, dass nicht natürlich auftretende Aminosäuren in Proteine eingebaut werden, die nicht exprimiert wurden, nur in geringen Mengen exprimiert werden oder nicht einer Modifikation, folgend auf die Translation unterworfen werden konnten, als Ergebnis in E. coli oder zellfreien Proteinsystemen eine aktive Form zu werden. Eine Vielzahl solcher Proteine sind bei dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt; Beispiele für Proteine, in die die nicht natürlich auftretenden Aminosäuren eingebaut werden, beinhalten die menschliche Epithelwachstumsfaktor-Rezeptor-extrazelluläre Domäne (H. Ogiso, et al., Cell 110, 775–787 (2002)), das menschliche Groucho/TLEI-Protein (L. Pickeles, et al., Structure 10, 751–761 (2002)) und die Rattenmuskelspezifische Kinase (J. Till, et al., Structure 10, 1187–1196 (2002)), sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
Zusätzlich können gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht natürlich auftretende Aminosäuren auch in Glycoproteine, gebunden an Zuckerketten, eingebaut werden, da Alloproteine in tierischen Zellen exprimiert werden. Die Expressionssysteme mit tierischen Zellen, beinhaltet in dieser Erfindung, sind besonders zur Herstellung der Alloproteine mit Zuckerketten nützlich, zugefügt in einem nativen und gewünschten Muster, für den Fall, dass diese Proteine ein unnatürliches Muster für eine Zuckerkettenaddition aufweisen, wenn sie von zellfreien Translationssystemen hergestellt werden.
(5) Wirt
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die tierischen Zellen, die in dem Expressionsverfahren verwendet werden können, beinhaltet in der vorliegenden Erfindung, und in die die vorher erwähnte aaRS und Suppressor-tRNA und ein Proteingene mit einem Unsinncodon an der Stelle für eine nicht natürlich auftretende Aminosäure eingebaut werden können.
Säugerzelllinien für dieses Verfahren zur Expression rekombinanter Gene wurden etabliert und werden für die tierischen Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bevorzugt. Beispiele für nützliche Sauger-Wirtszelllinien beinhalten chinesische Hamsterovar- (CHO-) und COS-Zellen. Bestimmte Beispiele beinhalten die Affen-Nieren-CV1-Zellinie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), die menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder subklonierte 293-Zellen zum Wachstum in suspendierten Medien, Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)), chinesische Hamsterovarzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243–251 (1980)), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen (Hep G2 HB 8065) und Maus-Brustkrebs (MMT 060562, ATCC CCL 51). Da die Expressionssysteme für extragene Gene für diese Wirte etabliert wurden, liegt die Selektion der geeigneten Wirtszellen im technischen Wissen eines Fachmanns mit üblichen Fähigkeiten auf dem Gebiet.
Die Expression extragener Gene in diesen Wirtszellen kann gemäß den beispielsweise in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Eine Erklärung wird unter Bezugnahme auf 1 bereitgestellt, wie eine nicht natürlich auftretende Aminosäure in Proteine gemäß dem vorhergehenden Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung eingebaut werden kann. Der in 1 dargestellte Einschluss repräsentiert die Zellmembran einer Säugerzelle (z. B. chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO-Zellen)). Innerhalb der Zelle (innerhalb des Einschlusses) werden Suppressor-tRNA^Tyr (angezeigt als "B. s. tRNA^Tyr") und aaRS (angezeigt als "E. coli-mutierte TyrRS") aus ihren jeweiligen Expressionssystemen exprimiert. Die nicht natürlich auftretende Aminosäure, hier 3-Iod-L-Tyrosin, wird dem Medium zugefügt (außerhalb des Einschlusses).
Das 3-Iod-L-Tyrosin im Medium wird von der Zelle aufgrund der Aktivität der Zelle selbst aufgenommen und bindet aufgrund der Funktion der E. coli-mutierten TyrRS an B. s. tRNA^Tyr. Darauffolgend wird das 3-Iod-L-Tyrosin durch B. s. tRNA^Tyr zu den Ribosomen transportiert, wo diese Aminosäure verwendet wird, um ein Unsinncodon zu translatieren (hier ein UAG-Codon). Um ein Protein zu erzeugen, das 3-Iod-L-Tyrosin an einer gewünschten Position enthält, wird das Codon an dieser Position des Proteingens durch UAG ersetzt. Dieses Gen wird dann in der Zelle exprimiert.
Auf diese Weise ermöglicht es das Expressionsverfahren der vorliegenden Erfindung, in tierischen Zellen ein gewünschtes Protein zu exprimieren, worin ein Tyrosinderivat an einer gewünschten Position inkorporiert wurde.
Nämlich werden tierische Zellen mit:

(A) einem Expressionsvektor, der in tierischen Zellen mutierte TyrRS exprimiert, ein Derivat von TyrRS, abstammend von E. coli, wie definiert in Anspruch 1 mit einer erhöhten Spezifität für ein nicht natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zur Spezifität für Tyrosin,
(B) einem Expressionsvektor, der in den vorher erwähnten tierischen Zellen Suppressor-tRNA exprimiert, abstammend von Bacillus stearothermophilus, die an das vorher erwähnte Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten TyrRS binden kann und
(C) ein gewünschte Proteingen, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat;

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Produktionsverfahren für ein nicht natürlich auftretendes Aminosäure-haltiges Protein, wodurch Alloprotein gemäß dem vorher erwähnten Expressionsverfahren zur Gewinnung und Reinigung exprimiert wird.
Das exprimierte Protein kann aus dem Medium oder einem Wirtszelllysat gewonnen werden. Wenn es an eine Membran gebunden ist, kann es von der Membran unter Verwendung einer geeigneten Waschlösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatisches Aufbrechen getrennt werden. Die Zellen können durch verschiedene physikochemische Mittel, wie einem Einfrier-Auftau-Zyklus, Ultraschallbehandlung, mechanisches Zerkleinern oder durch Verwendung eines cytolytischen Mittels lysiert werden.
In dem Fall, das das exprimierte Protein ein unlösliches Aggregat bildet, kann dieses Aggregat mit einem Denaturierungsmittel für das Protein aufgelöst und dann einem Verfahren zur neuerlichen Faltung des denaturierten Proteins unterworfen werden, beispielsweise in einer Lösung ohne Denaturierungsmittel oder enthaltend das Denaturierungsmittel in einer zu niedrigen Konzentration für die Denaturierung des Proteins oder durch Dialyse.
Die Isolierung und Reinigung des Proteins kann durchgeführt werden, wobei die charakteristischen Eigenschaften des erzeugten Proteins mit in Betracht gezogen werden, indem man irgendeines der folgenden oder einige in Kombination einer Lösungsmittelextraktion, Fraktionspräzipitation unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, Aussalzen, Dialyse, Zentrifugalauftrennung, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Kristallisierung, Elektrophorese und andere Auftrennverfahren verwendet.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Suppressor-Tyrosin-tRNA in einem Expressionsvektor umfasst, umfassend DNA mit der folgenden Sequenz von SEQ ID NO: 1.
Diese Sequenz von SEQ ID NO: 1 ist eine künstliche Basensequenz, bestehend aus einer Leadersequenz des menschlichen tRNA-Gens (Basen 1 bis 55 von SEQ ID NO: 1), des tRNA^Tyr-Gens von B. stearothermophilus mit einem CUA-Anticodon (unterstrichener Teil: Basen 56 bis 137 von SEQ ID NO: 1), jedoch ohne die terminale CCA-Sequenz und einem Transkriptionsterminator (Basen 138 bis 167 von SEQ ID NO: 1) in diesem Codon.
DNA der Sequenz von SEQ ID NO: 1 kann in einen Replikationsvektor zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression inseriert werden. Verschiedene Arten von Vektoren können verwendet werden. Der Vektor kann sich in Form eines Plasmids, Cosmids, eines Viruspartikels oder eines Phagen befinden. Gewünschte Nukleinsäuresequenzen können in den Vektor durch verschiedene Techniken inseriert werden. Im allgemeinen wird DNA an einer geeigneten Restriktionsstelle unter Verwendung auf dem Gebiet bekannter Technologien inseriert. Es gibt keine Begrenzungen hinsichtlich der Verwendung von Vektorelementen; der Vektor beinhaltet typischerweise ein oder mehr Signalsequenzen, Replikationsursprünge, Markergene usw. Die Konstruktion eines geeigneten Vektors, enthaltend ein oder mehr dieser Elemente, ist eine bekannte Technologie für die üblichen Fachleuten auf dem Gebiet.
Suppressor-tRNA kann in tierischen Zellen durch Einführen dieses Expressionsvektors in tierische Zellen exprimiert werden. Da ein Vektor, der die Sequenz von SEQ ID NO: 1 enthält, eine box A, box B und 5'-Leasersequenz als regulatorische Sequenzen enthält, die in tierischen Zellen erkannt werden, wird, wenn der Vektor in tierische Zellen inseriert wird, die Suppressor-tRNA in den tierischen Zellen unter Verwendung dieser regulatorischen Sequenzen exprimiert werden, wenn der Vektor in tierische Zellen inseriert wurde.
So kann dieser Expressionsvektor nicht nur in dem vorher erwähnten Expressionsverfahren eines nicht natürlich auftretenden Aminosäure-haltigen Proteins verwendet werden, sondern er kann auch zur Gentherapie für Erkrankungen verwendet werden, die zu Unsinnmutationen in Beziehung stehen.
Ein Klonierungsvektor enthält eine Nukleinsäuresequenz, die eine Replikation des Vektors in ein oder mehr Wirtszellen ermöglicht. Zusätzlich kann ein Expressionsvektor eine solche Sequenz zur Replikation enthalten. Solche Sequenzen sind für verschiedene Arten von Bakterien, Hefen und Viren wohlbekannt. Verschiedene Arten von Virusursprüngen (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder PBV) sind für Klonierungsvektoren in Säugerzellen nützlich.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise selektierbare Marker. Typische Selektionsmarker beinhalten das Ampicillinresistenzgen, das Neomycinresistenzgen, das Zeocinresistenzgen, das DHFR-Gen und das Thymidinkinasegen. Geeignete Wirtszellen für den Fall der Verwendung von Wildtyp-DHFR sind CHO-Zelllinien, denen die DHFR-Aktivität fehlt; diese Zelllinie wurde, wie beschrieben von Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) erzeugt und gezüchtet.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für eine Proteinsynthese in kultivierten rekombinanten Wirbeltierzellen geeignet sind, werden in Gething, et al., Nature, 293:620–625 (1981) und Mantei, et al., Nature, 281:40–46 (1979) beschrieben.
Eine Genamplifikation und Expression kann für eine gegebene Probe analysiert werden, beispielsweise durch üblichen Southernblot, Northernblot für eine quantitative Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201–5205 (1980)), Dotblot (DNA-Analyse) oder in situ- Hybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde mit den hier bereitgestellten Sequenzen. Es kann auch ein Antikörper verwendet werden, der spezifisch Doppelstränge erkennen kann, einschließlich DNA-Doppelsträngen, RNA-Doppelsträngen und DNA-RNA-Hybrid-Doppelsträngen oder DNA-Protein-Doppelsträngen. Mit diesen Antikörpern, die markiert sein können, kann der Assay in dem Fall durchgeführt werden, dass der Doppelstrang an eine Oberfläche gebunden ist, so dass die Gegenwart eines Antikörpers, gebunden an diesen Doppelstrang, auf dieser Oberfläche nachgewiesen werden kann.
Die Genexpression kann auch durch ein solches immunologisches Verfahren, wie eine Zell-immunohistologische Färbung gemessen werden oder durch die auf Gewebesektionen anwendbaren, wie auch durch Zellkultur oder einen Flüssigassay, um die Expression eines Genprodukts direkt zu quantifizieren. Nützliche Antikörper für eine immunhistologische Färbung von flüssigen Proben können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper sein und sie können in jedem Säuger erzeugt werden.
Im folgenden wird eine detailliertere Erklärung der vorliegenden Erfindung, basierend auf ihren Beispielen, bereitgestellt; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt. In der vorliegenden Beschreibung ist die Gesamtheit der zitierten Dokumente für Referenzzwecke inkorporiert.
Beispiel 1 – Expression eines Proteins, enthaltend 3-Iodtyrosin
In dem gegenwärtigen Beispiel wurde ein Ras-Protein, worin das 32te Codon zu UAG substituiert wurde, in CHO-Zellen exprimiert, um ein Ras-Protein zu erzeugen, das an dieser Stelle 3-Iodtyrosin enthielt.
In dem gegenwärtigen Beispiel wurde, obwohl die Suppressor-tRNA konstitutiv exprimiert wird, die Expression von mutierter TyrRS, die an eine nicht natürlich auftretende Aminosäure bindet, induziert, indem dem Kulturmedium Tetracyclin zugefügt wurde.
(1) Suppressor-tRNA
Die Rasensequenz der B. s. tRNA^Tyr (167 Basen), die als Suppressor-tRNA verwendet wurde, ist unten dargestellt:
Diese Sequenz ist eine künstliche Rasensequenz, bestehend aus einer Leadersequenz des menschlichen tRNA-Gens (H. van Tol, et al., EMBO J. 6, 35–31 (1987)), dem tRNA^Tyr-Gen von B. stearothermophilus mit einem CUA-Anticodon (unterstrichener Teil), jedoch ohne die terminale CCA-Sequenz, und einem Transkriptionsterminator (H. van Tol, et al., EMBO J. 6, 35–31 (1987)) in dieser Reihenfolge.
Die einzelsträngige DNA, die diese SEQ ID NO: 1 besitzt, wurde in Form eines chemisch synthetisierten Produkts durch einen weit verbreitet verwendeten kommerziellen Service (Sigma Genosys Japan) chemisch synthetisiert, der PCR-Primer und andere einzelsträngige DNAs synthetisiert. Ein DNA-Fragment, das unter Verwendung dieser DNA als Matrize und der folgenden Primer (1) und (2) durch PCR amplifiziert wurde, wurde kloniert, indem mit EcoRI und HindIII gespalten wurde, gefolgt von einem Einbau von pBR322 an der EcoRI-HindIII-Stelle.
Primer (1): CACAGAATTCTCGGGAGCTGGAGAAAAAAAC (SEQ ID NO: 21)
Primer (2): CACAAAGCTTAGCGCTCCGGTTTTTCTGTG (SEQ ID NO: 22)
Neun Gencluster, für die das Suppressor-tRNA^Tyr-Gen von B. stearothermophilus in derselben Richtung kopiert war, wurde unter Verwendung der folgenden zwei Schritte konstruiert (3).
Zunächst wurde eine PCR, wie unten beschrieben, mit dem GeneAmp PCR-System 9700 (Applied Biosystems) durchgeführt, wobei drei unterschiedliche Primersets 1 bis 3 verwendet wurden, jeweils beinhaltend die Primer (1) und (2).
In der ersten Reaktion wurde ein Fragment mit einer Primer-Bindungsstelle pbs1 (SEQ ID NO: 15) stromaufwärts von der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und einer BstXI-1-Stelle (CCAGCAGACTGG: SEQ ID NO: 17) stromabwärts von dieser DNA durch Durchführung einer PCR unter normalen Reaktionsbedingungen unter Verwendung von Primer (1) des ersten Satzes erzeugt:
AGCGAGTGTTAACCCTGCCTAGCGCTCCGGTTTTTCTGTG (SEQ ID NO: 23)
und Primer (2) des ersten Satzes:
ACACACCCAGCAGACTGGCGGGAGCTGGAGAAAAAAAC (SEQ ID NO: 24).
In der zweiten Reaktion wurde ein Fragment mit einer BstXI-1-Stelle (SEQ ID NO: 17) stromaufwärts von der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und einer anderen BstXI-Stelle, CCAGCTTCCTGG (BstXI-2; SEQ ID NO: 18) stromabwärts von dieser Sequenz erzeugt, indem eine PCR unter normalen Reaktionsbedingungen durchgeführt wurde, wobei Primer (1) des zweiten Satzes:
ACACACCCAGCAGACTGGAGCGCTCCGGTTTTTCTGTG (SEQ ID NO: 25)
und Primer (2) des zweiten Satzes:
ACACACCCAGCTTCCTGGCGGGAGCTGGAGAAAAAAAC (SEQ ID NO: 26) verwendet wurden.
In der dritten Reaktion wurde ein Fragment mit einer BstXI-2-Stelle (SEQ ID NO: 18) stromaufwärts von der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und der Primer-Bindungsstelle pbs2 (SEQ ID NO: 16), stromabwärts von SEQ NO: 1 durch Durchführen einer PCR unter normalen Reaktionsbedingungen unter Verwendung von Primer (1) des dritten Satzes:
ACACACCCAGCTTCCTGGAGCGCTCCGGTTTTTCTGTG (SEQ ID NO: 27)
und Primer (2) des dritten Satzes:
CTGCGCGAATATCGTAGTCGCGGGAGCTGGAGAAAAAAAC (SEQ ID NO: 28) erzeugt.
Diese drei PCR-Produkte wurden miteinander unter Verwendung einer Ligase gemäß bekannten Technologien zur Erzeugung eines Unterclusters gekoppelt, umfassend drei Kopien des tRNA-Gens.
Dieser Untercluster wurde in Form eines Untercluster-Fragments amplifiziert, wozu die EcoRI-Stelle an einem Ende und die HindIII-Stelle am anderen Ende zugefügt wurden, wobei ein Primer mit einer EcoRI-Restriktionsstelle verwendet wurde, zugefügt zur Sequenz von pbs1 (SEQ ID NO: 15) und ein Primer mit einer HindIII-Restriktionsstelle, der der Sequenz von pbs2 zugefügt wurde (SEQ ID NO: 16).
Weiterhin wurde ein Fragment, zu dem HindIII- und EcoRI-Stellen an den Enden zugefügt wurden und ein Untercluster-Fragment, wozu EcoRI- und BamHI-Stellen an den Enden zugefügt wurden, auf ähnliche Weise erzeugt. Schließlich wurden drei Typen von Unterclustern mit unterschiedlichen Kombinationen von Restriktionsstellen erzeugt. Diese Untercluster 1 bis 3 wurden mit Ligase gekoppelt und dann in EcoRI- und BamHI-Stellen von pBR322 (Takara Shuzo) zur Erzeugung des Plasmids pBstRNA mit neun Kopien des B. stearothermophilus Suppressor-tRNA^Tyr-Gens kloniert.
Die Struktur des resultierenden klonierten Fragments ist in 3 dargestellt.
In 3 sind die Basensequenzen von pbs1, pbs2, BstX-1 und BstX-2 wie unten dargestellt:
Da das Plasmid pBstRNA neun Kopien des B. stearothermophilus Suppressor-tRNA^Tyr-Gens aufweist, kann die Menge des B. stearothermophilus Suppressor-TRNA^Tyr-Gens, das in tierischen Zellen exprimiert wird, angehoben werden und ist zur Expression von Alloproteinen in tierischen Zellen nützlich.
(2) Mutierte TyrRS
Die Basensequenz des E. coli mutierten TyrRS(als TyrRS(V37C195) zu bezeichnen)-Gens wird in Dokument 5 beschrieben.
In dem vorher erwähnten Verfahren wurde eine DNA-Sequenz, die eine in einer einzelnen Aminosäure substituierte Form codiert, worin eine einzelne Aminosäure an Position 37 oder 195 substituiert ist, unter Verwendung der vorher erwähnten Primer (3) bis (8) erzeugt. Die Primer (3) und (4) bewirken eine Veränderung von Position 37. Zusätzlich bewirken die Primer (5) bis (8) eine Veränderung der Position 195.
Als nächstes wurden zwei Fragmente mit Primerpaar (1) und (10) amplifiziert sowie Primerpaar (9) und (11) unter Verwendung des Plasmids, das eine in einer einzelnen Aminosäure substituierte TyrRS an Position 37 bzw. 195 codiert. Die beiden Fragmente wurden gereinigt und dann durch PCR unter Verwendung der Primer (1) und (9) gekoppelt.
Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pcDNA4/TO (Invitrogen) inseriert, um das Plasmid pEYSM1 zu erzeugen.
(3) Amber-Suppression in Säugerzellen
Die Transfektion wurde unter Verwendung von 0,5 bis 2 μg DNA für jedes Plasmid pro 35 mm Platte gemäß dem Lipofect AMINE 2000 (Gibco BRL)-Verfahren durchgeführt. Opti-MEM 1 (Gibco BRL) wurde für das Medium verwendet. Die Zellextrakte wurden 24 Stunden nach der Transfektion hergestellt und auf SDS-PAGE angewandt, gefolgt von einem Western-Blot unter Verwendung eines anti-FLAG2-Antikörpers (Sigma) und des ECL+-Immunnachweissystems (Amersham Pharmacia Biotech). Die Bandenintensität wurde unter Verwendung eines LAS-1000plus image analyzer (Fuji Film) gemessen. Die ras(Am)-Produkte und ein Wildtyp-ras-Produkt zum Vergleich (jeweils 0,5 μg) wurden jeweils gereinigt, wobei das anti-FLAG M2-Antikörper-Affinitätsgel (Sigma) verwendet wurde, und zwar aus 1 bis 5 Kulturplatten (Durchmesser: 100 mm). Darauf folgte eine Flüssigchromatographie-Elektronenspray-Massenanalyse (LC-MS) und ein Tandem-Massenanalyse-Sequenzieren.
(4) CHO-Y-Zellen
Um CHO-Y-Zellen zu erzeugen, die sich stabil TyrRS (V37C195) erhalten, wurden T-REX-CHO-Zellen, die konstitutiv Tetracyclin-Repressor-Proteine produzieren (Invitrogen) mit dem Plasmid pEYSM1 transfiziert. Die Transfektanten wurden in Medium selektiert, enthaltend 25 μg/ml Zeocin und die Expression von TyrRS (V37C195) in den selektierten Zellen in Gegenwart von 1 μg/ml Zeocin wurde überprüft, um CHO-Y-Zellen zu erhalten. Um Alloprotein zu synthetisieren, wurden die CHO-Y-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, enthaltend ras (Am) und das B. stearothermophilus-Suppressor-tRNA^Tyr-Gen. Tetracyclin (1 μg/ml) und 3-Iod-L-Tyrosin (0,3 mM) wurden dem Medium 24 Stunden nach der Transfektion zugefügt und ein Zellextrakt wurde nach weiteren 24 Stunden hergestellt.
(5) Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin am Amber-Codon
Die beiden folgenden Punkte wurden mit in die Betrachtung einbezogen, um 3-Iod-L-Tyrosin in ein Protein zu inkorporieren. Zunächst weisen Säugerzellen einen Transportmechanismus auf, durch den inhärent Aminosäuren und ihre verschiedenen Analoga aus der Umwelt aufgenommen werden. Zweitens erkennen Wildtyp-TyrRSe von Eukaryonten und Prokaryonten nicht 3-Iod-L-Tyrosin als Substrat. Daher leiden die Zellen nicht an einer Toxizität, die sich aus einem statistischen 3-Iod-L-Tyrosin-Einbau an Tyrosinpositionen ergibt. Mutierte TyrRS, die dazu in der Lage ist, 3-Iod-Tyrosin zu erkennen wird benötigt, um diese Aminosäure an die Suppressor-tRNA zu binden.
Wir verwendeten daher E. coli TyrRS (V37C195), von der berichtet wurde, dass sie effizient 3-Iod-L-Tyrosin erkennt (K_cat/K_m-Wert für die Aminosäureaktivierung = 3,3 × 10³/M/s) und Tyrosin in ausreichend niedriger Effizienz erkennt (K_cat/K_m-Wert = 3,2 × 10²/M/s). Weiterhin aktiviert TyrRS (V37C195) L-Tyrosin mit einer Effizienz, die ungefähr 10.000 mal niedriger liegt als der K_cat/K_m-Wert (2,3 × 10⁶/M/s) im Hinblick auf das Wildtyp-Enzym.
Die 5A und 5B sind Fotografien von Western-Blots für den Nachweis der amber-Suppression. 5A zeigt einen Western-Blot in Abwesenheit von 3-Iod-L-Tyrosin, während 5B ihn in Gegenwart von 3-Iod-L-Tyrosin zeigt. Das ras(Am)-Gen wurde in allen Spuren eingeführt. Die Wildtyp E. coli TyrRS (Spur 1 in A und B) oder TyrRS (V137C195) (Spur 2 in A und B) wurde in CHO-Zellen zusammen mit der B. stearothermophilus- Suppressor-tRNA^Tyr exprimiert. Gegenwart oder Abwesenheit von 3-Iod-L-Tyrosin (IY) und die Art der exprimierten TyrRS (wt für TyrRS Wildtyp und mut für TyrRS (V37C195) sind angegeben.
Wie in den 5A und 5B dargestellt, wurden Wildtyp-TyrRS und TyrRS (V37C195) jeweils in den CHO-Zellen zusammen mit B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr und dem ras(Am)-Gen exprimiert. Diese Enzyme wurden auf denselben Niveaus exprimiert. Obwohl eine amber-Suppression für beide Enzyme in Abwesenheit von 3-Iod-L-Tyrosin beobachtet wurde (5A), lag der Ertrag des ras(Am)-Produkts mit TyrRS (V37C195) bei nur 40% des Wildtyp-Enzyms. Die zeigt an, dass sogar in Abwesenheit von kompetitivem 3-Iod-L-Tyrosin, TyrRS (V37C195) L-Tyrosin erkennt und dies an der amtier-Stellung einbaut. Als nächstes wurde 3-Iod-L-Tyrosin dem Medium auf eine Endkonzentration von 0,3 mM zugefügt (L-Tyrosin war in der doppelten Konzentration vorhanden (5B)). Diese Konzentration von 3-Iod-L-Tyrosin hatte fast keine Wirkung auf die Zellreproduktion.
In Gegenwart von 3-Iod-L-Tyrosin wurde die Suppressionseffizienz mit TyrRS (V37C195) auf ein mit dem des Wildtyp-Enzyms vergleichbares Niveau verbessert. So wurde 3-Iod-L-Tyrosin von den Zellen effizient aufgenommen, um in das Protein inkorporiert zu werden, abhängig von TyrRS (V37C195).
(6) Bestätigung der Ras-Produkte
Um den Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin an der amber-Stellung (Position 32) zu bestätigen, wurde das ras-Produkt durch die Achromobacter-Protease I (Lys-C) abgebaut. Das resultierende Abbauprodukt in Form einer Peptidmischung wurde unter Verwendung eines Flüssigchromatographie-Massanalysators (LC-MS) analysiert. Dann wurde die an Position 32 eingebaute Aminosäure auf Basis der spezifischen durchschnittlichen Masse und der Elutionszeit in der Flüssigchromatographie identifiziert. Das Fragment, das zu der Sequenz von Serin an Position 17 zu Lysin an Position 42 korrespondierte, wurde als IY- und Y-Fragment gemäß der Gegenwart von Iodtyrosin bzw. Tyrosin an Position 32 bezeichnet.
Die 6A, 6B und 6C sind Grafiken, die die Ergebnisse einer LC-MS-Analyse der ras- und ras(Am)-Produkte darstellen.
6A zeigt die Ergebnisse einer Flüssigchromatographie, worin die ras(Am)-Fragmente (Chart A) und die ras-Fragmente (Chart B) basierend auf ihrer UV-Absorption nachgewiesen wurden.
6B zeigt die Ergebnisse der Massenspektrometrie für das TV-Fragment (Charts a und c) und Y-Fragment (Charts b und d) von dem ras(Am)-Produkt (Charts a und b) und ras-Produkt (Charts c und d). Das Y-Fragment besteht aus den Resten 17 bis 42 des Ras-Proteins (SALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRK), während das IY-Fragment ein 3-Iod-L-Tyrosin, substituierend das unterstrichene Y, aufweist.
6C zeigt die Ergebnisse einer Tandem-Massenspektrometrie des IY-Fragments. Die Teilsequenz in Richtung des C-terminalen Endes vom N-terminalen Ende besteht aus Val, Asp, Glu, Iodtyrosin und Asp.
Während der Analyse des ras(Am)-Produkts wurde das IY-Fragment stark ausgeprägt beobachtet (6B, Chart A), was einen effizienten Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin anzeigt. Die Teilsequenz dieses IY-Fragments, bestimmt durch Tandem-Massenspektrometrie, bestätigte, dass Iodtyrosin tatsächlich an Position 32 eingebaut wurde (6C). Andererseits wurde auch gezeigt, dass das Y-Fragment nicht nachgewiesen wurde (6B, Chart b); 3-Iod-L-Tyrosin inhibierte so den Einbau von L-Tyrosin an Position 32. Eine weitere Analyse der LC-MS-Daten zeigte an, dass andere normale Aminosäuren an dieser Position nicht eingebaut wurden. Der Einbau von Iodtyrosin an Position 32 wurde so durch LC-MS-Analyse bestätigt.
Demgegenüber wurde, obwohl das Y-Fragment für das ras (WT)-Produkt beobachtet wurde, synthetisiert in Gegenwart von 3-Iod-L-Tyrosin (Chart d), das IY-Fragment nicht beobachtet (6B, Chart c). Da 3-Iod-L-Tyrosin an der Stellung von Tyrosin durch irgendeinen Erkennungsfehler eingebaut werden würde, zeigt diese Beobachtung an, dass die intrinsische TyrRS in CHO-Zellen 3-Iod-L-Tyrosin nicht erkennt, noch dass TyrRS (V37C195) intrinsische tRNA^Tyr erkennt.
Wie in 6B dargestellt, wurde der Peak eines Peptids, das 3-Iod-L-Tyrosin enthält, nachgewiesen (6B(a)).
Andererseits ist es, wenn angenommen wird, dass das UAG-Codon zu einer anderen Aminosäure als 3-Iod-L-Tyrosin translatiert werden sollte, besonders wahrscheinlich, dass es in Tyrosin translatiert werden würde; tatsächlich wurde ein Peptid, das Tyrosin enthielt, nicht nachgewiesen (6B(b)). Zusätzlich wurden keinerlei Peptide, die erzeugt werden könnten, wenn das UAG-Codon in eine andere Aminosäure translatiert worden wäre, nachgewiesen.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass fast 100% des erzeugten Ras-Proteins 3-Iod-L-Tyrosin an der Stellung enthielt, die durch das UAG-Codon spezifiziert ist und dass die vorliegende Erfindung die erwarteten Wirkungen zeigt.
(7) Konditionierter Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin, kontrolliert durch die induzierbare Expression von mutierter TyrRS
Es wurde berichtet, dass E. coli GlnRS eine induzierte Suppression durch Expression von einem Tetracyclin-Kontrollpromotor in Säugern erzeugt. Wir erzeugten eine CHO-Zelllinie (bezeichnet als CHO-YS-Zellen), die sich stabil das TyrRS(V37C195)-Gen erhält, exprimiert von einer anderen Art eines Tetracyclin-kontrollierten Promotors. Das ras(Am)-Gen und das B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr-Gen wurden dann transient in die CHO-YS-Zellen eingefügt.
7 ist eine Fotografie eines Western-Blots einer induzierbaren amber-Suppression für den Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin durch das Ras-Protein. Das ras(Am)-Gen wurde in CHO-Y-Zellen eingeführt. Das ras(Am)-Gen wurde in CHO-Y-Zellen zusammen mit B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr (Spuren 1 bis 3) eingeführt. Spur 1 zeigt die Zugabe von Tetracyclin und von 3-Iod-L-Tyrosin an, Spur 2 die Zugabe von Tetracyclin ohne Zugabe von 3-Iod-L-Tyrosin und Spur 3 die Abwesenheit der Zugabe von Tetracyclin oder 3-Iod-L-Tyrosin.
Wie in 7 dargestellt, wurde TyrRS (V37C195) exprimiert, wenn Tetracyclin im Medium vorlag (7, Spuren 1 und 2), wurde jedoch in Abwesenheit eines Induktors nicht exprimiert (Spur 3). Das Expressionsniveau war doppelt so hoch wie das Niveau von TyrRS (V37C195), exprimiert von einem Plasmid, das transient in die Zellen eingeführt wurde. Das ras(Am)-Produkt wurde mit einer Suppressionseffizienz von 30% in Gegenwart von sowohl 3-Iod-L-Tyrosin als auch Tetracyclin nachgewiesen (Spur 1). Die Qualität des ras(Am)-Produkts wurde als identisch zur Qualität von ras(WT) angegeben, ähnlich erzeugt in CHO-Y-Zellen und der Qualität in der Gegenwart von TyrRS (V37C195) von einem Plasmid, analysiert durch LC-MS. Mehr als 95% des ras(Am)-Produkts enthielt 3-Iod-L-Tyrosin an der amber-Position, während 3-Iod-L-Tyrosin im ras(WT)-Produkt nicht nachgewiesen wurde.
Andererseits wurde das ras(Am)-Produkt kaum in Abwesenheit von 3-Iod-L-Tyrosin nachgewiesen (Spur 2) und wurde in Abwesenheit eines Induktors gar nicht nachgewiesen (Spur 3). Diese Beobachtungen zeigten an, dass der Einbau von 3-Iod-L-Tyrosin in das ras(Am)-Produkt effektiv durch Induktion der Expression von TyrRS (V37C195) durch Tetracyclin konditioniert wird. Ein Vergleich von 7 und 5A zeigt an, dass der Einbau von L-Tyrosin in Abwesenheit von 3-Iod-L-Tyrosin deutlich niedriger liegt als im Fall einer Expression von TyrRS (V37C195) von einem Plasmid. Dieses unerwartete Ergebnis wurde in drei oder mehr unabhängigen Beobachtungen beobachtet. Der Mechanismus, auf dem dieses Phänomen basiert, ist die Grundlage für weitere Forschungen.
Beispiel 2
(1) Suppressor-tRNA-induzierbares Expressionssystem
Die eukaryontische Transkription von tRNA involviert die Bildung eines Transkriptionskomplexes auf den Transkriptionspromotorsequenzen (Boxen A und B) innerhalb des tRNA-Gens. Wenn ein Proteinfaktor an die Sequenz direkt vor dem tRNA-Gen bindet, würde dieser Faktor die Expression der tRNA durch Behinderung der Bildung des Transkriptionskomplexes inhibieren. Kürzlich wurde die Expression von tRNA erfolgreich bei Hefe und Myxomyceten durch Einbau von tet0₁, wobei es sich um eine der Bindungssequenzen für den Tetracyclin-Bindungsrepressor handelt, direkt vor dem tRNA-Gen inhibiert (T. Dingerman, et al., EMBO Journal 11, 1487–1492 (1992); T. Dingerman, et al., Mol. Cell. Biol. 12, 4038–4045 (1992)). Die Konzentration des der Kulturflüssigkeit zugefügten Tetracyclins betrug zu diesem Zeitpunkt 15 bis 30 μg/ml.
In diesem Beispiel wurde ein Versuch unternommen, eine Expression bei niedrigerer Konzentration von Tetracyclin zu induzieren mit der Absicht, die Zytotoxizität zu reduzieren. Dementsprechend wurden drei Typen induzierter Expressionssysteme hergestellt, indem eine tet0₂-Sequenz inkorporiert wurde, die den Repressor stärker bindet, anstelle von tet0₁, direkt vor oder 10 oder 20 Basen stromaufwärts von dem Suppressor-tRNA-Gen (TetBst0 (Sequenz 1; SEQ ID NO: 30), TetBst1 (Sequenz 2; SEQ ID NO: 31), TetBst2 (Sequenz 3; SEQ ID NO: 32)).
Der erste unterstrichene Bereich zeigt die tet0₂-Sequenz, während der nächste unterstrichene Bereich das Suppressor-tRNA-Gen zeigt.
Der erste unterstrichene Bereich zeigt die tet0₂-Sequenz, während der nächste unterstrichene Bereich das Suppressor-tRNA-Gen zeigt.
Der erste unterstrichene Bereich zeigt die tet0₂-Sequenz, während der nächste unterstrichene Bereich das Suppressor-tRNA-Gen zeigt.
Suppressionseffizienzen zwischen diesen Sequenzen wurden zusammen mit den Sequenzen verglichen, bestehend aus drei Kopien von TetBst0 und TetBst1.
Die vorher genannten TetBst0, TetBst1 und TetBst2 wurden jeweils an die EcoRI-HindIII-Stelle des Plasmids pBR322 kloniert. Die Sequenzen, die aus drei Kopien von Sequenzen 1 (TetBst0) und 2 (TetBst1) bestanden, wurden ebenfalls ähnlich kloniert (9). Die Einführung der Plasmide in die kultivierten Zellen und der Nachweis der Suppressionsprodukte wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1(5) durchgeführt.
Die Expression der Suppressor-tRNA wurde durch Zugabe von Tetracyclin bei 1 μg/ml induziert, wodurch demonstriert wurde, dass die Tetracyclin-Konzentration vermindert werden kann. Dies ist zur Reduktion der Zytotoxizität nützlich.
Da die Suppressionseffizienz von TetBst2 niedriger lag als diejenige von TetBst1 (Daten nicht dargestellt), wurde die Suppressionseffizienz für TetBst0 und TstBst1 im Detail und für die Sequenzen, umfassend die drei Kopien von Sequenzen 1 und 2 (3 × TetBst0 und 3 × TetBst1) analysiert. Gleichzeitig wurde ein Vergleich auch zu dem Gen angestellt, das neun Kopien des amber-Suppressor-tRNA-Gens (BYR(CUA)), hergestellt in Beispiel 1, umfasste. Diese Ergebnisse sind in den 10A und 10B dargestellt.
Die jeweiligen Mengen des durch die amber-Mutante erzeugten Ras-Proteins sind in 10A dargestellt, während die Mengen des EGF-Rezeptors (EGFR), erzeugt durch die amber-Mutante, in 10B dargestellt sind. Die erzeugten Mengen wurden basierend auf den Bandenintensitäten der Western-Blots gemessen und wurden dann grafisch in Form ihrer Suppressionseffizienzen dargestellt. Die Grafiken wurden basierend auf jeweils drei Sätzen von experimentellen Daten erzeugt. Spur 1 zeigt die Mengen an Wildtyp-Ras-Protein und Wildtyp-EGFR wie erzeugt, die kein amber-Codon aufweisen und die anderen Suppressionseffizienzen wurden durch Zuordnung eines Wertes von 100 für diesen Wert quantifiziert. Da die Bandenintensität des Wildtyp-Proteins jedoch die Messgrenze überschritt und angenommen wird, dass sie tatsächlich 100 überschreitet, werden hier tatsächlich nur die Suppressionseffizienz von 9 × BYR(CUA) und ein Vergleich der Effizienzen von TetBst diskutiert. Auf der Basis anderer Experimente erwies es sich, dass die Suppressionseffizienzen der Ras-Mutante und der EGFR-Mutante von 9 × BYR(CUA) bei 24% bzw. 20% lagen (Sakamoto, et al., Nucleic Acids Research 30, 4692–4699 (2002)).
Es kann beobachtet werden, dass eine Suppression durch Zugabe von Tetracyclin mit 1 μg/ml induziert wird. Andererseits wird eine Suppression auch in einem bestimmten Ausmaß selbst in Abwesenheit einer Tetracyclin-Zugabe beobachtet. TetBst1 neigte zu einer höheren Suppressionseffizienz als TetBst0, drei Genkopien neigten zu einer höheren Suppressionseffizienz als eine einzelne Genkopie und dieselben Trends wurden in Abwesenheit von Tetracyclin ebenfalls beobachtet. Die Effizienz für 3 × TetBst1 war signifikant höher als diejenige für 9 × BYR(CUA) und ist vorteilhaft für die Produktion eines nicht natürlich auftretenden Aminosäure-haltigen Proteins. Eine fast vollständige Abwesenheit einer Suppression wurde beobachtet, wenn Tetracyclin nicht zugefügt wurde, für den Fall, dass TetBst0 × 1 verwendet wurde. Daher wird angenommen, dass die Verwendung von TetBst0 × 1 für eine Vermeidung einer Zytotoxizität besonders vorteilhaft ist.
Im allgemeinen konnte eine amber-Suppression eine Zytotoxizität in tierischen Zellen auslösen. Dementsprechend hat eine Suppression unter Verwendung einer Suppressor-tRNA, die konstitutiv exprimiert wird, die Möglichkeit der Erhöhung der Zahl von toten Zellen.
In Beispiel 1 wurde, obwohl die Suppressor-tRNA kontinuierlich exprimiert wird, die Expression von TyrRS, die nicht natürlich auftretende Aminosäuren bindet, durch Zugabe von Tetracyclin zur Kulturflüssigkeit induziert. Da tRNA nämlich eine Suppression nicht auslöst, außer sie bindet an eine Aminosäure, wurde die Zytotoxizität absichtlich durch Expression von TyrRS, nur wenn dieses Enzym zur Erzeugung von Protein, das nicht natürlich auftretende Aminosäuren enthält, benötigt wird, reduziert. Da es jedoch keine Garantie gibt, dass B. stearothermophilus Suppressor tRNA (Tyr) gar nicht von aaRS wie TyrRS innerhalb der Zellen erkannt wird, wird es mehr bevorzugt, auch eine Expression von Suppressor-tRNA, wie in dem vorliegenden Beispiel, zu induzieren.
Referenzbeispiel – Konstruktion des TyrRS-Gens und Reportergens
Ein FLAG tag (DYKDDDDK) wurde zu den C-terminalen Enden des mutierten TyrRS(V37C195)-Gens, ras-Gens und epithelialem Wachstumsfaktor-Rezeptor-Reportergen durch Amplifikation dieser Gene mit geeigneten PCR-Primern zugefügt. Die PCR-Produkte wurden jeweils in den Vektor pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen) kloniert, um sie in Säugerzellen zu exprimieren. Im Hinblick auf TyrRS (V37C195) wurde das PCR-Produkt ebenfalls in den Vektor pcDNA4/TO (Invitrogen) kloniert, um das Plasmid pRYSM1 für eine Tetracyclin-kontrollierte Expression zu erzeugen. Eine ortsgerichtete Mutagenese des ras-Gens wurde durch PCR unter Verwendung eines Mutation-induzierenden Primers durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde das Tyrosincodon an Position 1068 des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors zu einem amber-Codon mutiert. Der erste Methioninrest von grün fluoreszierendem Protein (cyanofluoreszierende Mutation) (Clontech) wurde durch ein kurzes Peptid substituiert, codiert durch:
ATGGGAACTAGTCCATAGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCGGTC (das amber-Codon ist unterstrichen) (SEQ ID NO: 19) und ein FLAG tag wurde dem C-terminalen Ende zugefügt. Das resultierende Gen wurde in den Vektor pcDNA3.1(Zeo(+) kloniert. Die Sequenz des konstruierten Gens wurde unter Verwendung des ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) bestätigt.
Eine Transfektion wurde gemäß dem LipofectAMIN 2000 (Gibco BRL)-Verfahren unter Verwendung von 0,5 bis 2 μg DNA für jeden der Reportergen-Expressionsvektoren, Suppressor-tRNA-Expressionsvektoren und E. coli TyrRS-Expressionsvektoren durchgeführt. Opti-MEM 1 (Gibco BRL) wurde für das Medium verwendet. Zellextrakte wurden 24 Stunden nach der Transfektion hergestellt und auf eine SDS-PAGE angewandt, gefolgt von einem Western-Blot unter Verwendung des anti-FLAG2-Antikörpers (Sigma) und des ECL+ Immunodetection System (Amersham Pharmacia Biotech). Die Bandenintensität wurde unter Verwendung des LAS-1000 Plus Image Analyzer (Fuji Film) (4A und 4B) gemessen.
Die 4A und 4B sind Fotografien des Gels von Western-Blots, erhalten unter Verwendung des anti-FLAG-Antikörpers, um die amber-Suppression in CHO-Zellen nachzuweisen.
In 4A, wurden FLAG tags jeweils zu dem Wildtyp ras-Gen (Spur 1) und ras(Am)-Gen (Spuren 2 bis 8) zugefügt und diese Gene wurden in die CHO-Zellen eingeführt. Menschliche Suppressor-tRNA^Tyr (Spur 3) oder E. coli TyrRS und E. coli Suppressor tRNA^Tyr (Spur 4) wurden in den CHO-Zellen exprimiert. B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr wurde in den CHO-Zellen zusammen mit E. coli TyrRS (Spuren 5 und 8) oder in Abwesenheit des Enzyms (Spur 7) exprimiert und selbst E. coli TyrRS allein wurde in den CHO-Zellen exprimiert (Spur 6). B. stearothermophilus Suppressor tRNATyr wurde von einem Plasmid exprimiert, das eine einzelne Kopie des Gens für diese tRNA aufwies (Spuren 5 und 7) sowie von einem Plasmid, das neun Kopien des Gens aufwies (Spur 8). Spur 1 enthielt 2,5 μg des Zellextrakts, während die Spuren 2 bis 8 das Vierfache dieser Menge des Zellextrakts enthielten.
In 4B wurden Gene, enthaltend das amber-Codon an Position 1068 (Spuren 1 bis 3) wie auch das Wildtyp EGFR-Gen (Spur 2) und das epitheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor-(EGFR)-Gen, wozu FLAG tags jeweils zugefügt worden waren, in CHO-Zellen eingeführt. Das B. stearothermophilus Suppressor tRNA^TYr und E. coli TyrRS-Paar wurde in den Zellen exprimiert (Spur 3). Die schwachen Banden, die auf dem Niveau von E. coli TyrRS in den Spuren 1 und 2 migrierten, korrespondierten zu endogenen Proteinen, die mit dem anti-FLAG-Antikörper reagierten.
Wie in 4A dargestellt, erwies es sich, dass die Coexpression von B. stearothermophilus Suppressor tRNA und E. coli TyrRS eine Suppression der amber-Mutation in ras(Am) mit einer Effizienz von 15% auslöste (4A, Spur 5). Diese Suppression trat in Abwesenheit dieser tRNA (Spur 6) oder von Enzym (Spur 7) nicht auf. Der Bedarf an E. coli TyrRS zur Suppression zeigt an, dass B. stearothermophilus Suppressor-tRNA^TYr durch endogene aaRS in Zellen nicht aminoacyliert wird. Andererseits beeinflusste die Expression von E. coli TyrRS von einem transient eingeführten Plasmid selbst kaum die Wachstumsrate von CHO-Zellen.
Die Suppressioneffizienz des tRNA^TYr-TyrRS-Paars war deutlich niedriger als die Effizienz menschlicher Suppressor tRNA^Tyr oder anderer Suppressor tRNAs, die in Säugerzellen wirken (20 bis 40%). Da die Suppressioneffizienz vermutlich durch Erhöhung der Kopienzahl des Suppressor tRNA-Gens verbessert werden würde, wurde ein Plasmid konstruiert, das neun Kopien des B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr-Gens aufwies und dieses Plasmid wurde in CHO-Zellen zusammen mit einem Plasmid mit einem E. coli TyrRS-Gen eingeführt. Im Ergebnis verbesserte sich die Suppressioneffizienz auf diese Weise auf 24% (4A, Spur 8). Dieser Wert ist vergleichbar mit demjenigen von menschlicher Suppressor tRNA^Tyr. Dieses Plasmid wurde darauffolgend verwendet, um B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr zu exprimieren.
Das Paar, bestehend aus B. stearothermophilus Suppressor tRNA^Tyr und E. coli TyrRS, löste eine Suppression der amber-Mutation in der menschlichen embryonalen Nieren-Zelllinie 293 mit derselben Effizienz wie in CHO-Zellen aus. Darüber hinaus wurde die amber-Mutation des epithelialen Wachstumsfaktor-Rezeptorgens mit einer Effizienz von 20% (4B) unterdrückt, während die amber-Mutation in dem Aequorea victoria grün fluoreszierenden Proteingen mit derselben Effizienz unterdrückt wurde.
Diese Gene und das ras(Am)-Gen haben unterschiedliche Codons, die das amber-Codon umgeben.
Vergleichsbeispiel – Bedarf an einer Expression eines prokaryontischen tRNA^Tyr-TyrRS-Paars für die Amber-Suppression in Säugerzellen
Die Expression von tRNA in Eukaryonten macht zwei interne Promotoren (Boxen A und B) innerhalb der RNA codierenden Sequenz nötig. Da E. coli tRNA^Tyr nur eine Box B enthält, wurde eine Box A durch Substitution von U9 und C10 durch A bzw. G erzeugt. Im Ergebnis wurde das resultierende fehlgepaarte Basenpaar, G10–G25 durch Substitution von G25 mit C korrigiert (hier zu bezeichnen als tRNA^Tyr (A9G10C25). Die Positionen 9, 10 und 25 von E. coli tRNA^Tyr sind an der dreidimensionalen Interaktion beteiligt und stützen eine L-förmige Struktur.
Die Sequenz von tRNA^Tyr (A9G10C25) mit einem CUA-Anticodon wurde an die 5'-flankierende Sequenz des menschlichen tRNA^Tyr-Gens gekoppelt. Das menschliche Suppressor tRNA^Tyr-Gen wurde auf dieselbe Weise wie bei der Kontrolle der amber-Suppression konstruiert. Um die amber-Suppression zu analysieren, wurde das Tyrosin-Codon an Position 32 in einem synthetischen ras-Gen, trunkiert von dem Wildtyp c-Ha-Ras zu einem amber-Codon mutiert. Um die Expression nachzuweisen, wurde ein FLAG-Peptid-tag den C-terminalen Enden der ras-Gene, ras(WT) und der amber-Mutante ras(Am) und dem C-terminalen Ende von E. coli TyrRS zugefügt.
Diese ras-Gene wurden in CHO-Zellen eingeführt und ihre Produkte wurden durch Western-Blot von Zellextrakten unter Verwendung des anti-FLAG-Antikörpers nachgewiesen (4A). Obwohl die Expression des ras(WT)-Gens in Abwesenheit von Suppressor-tRNA (Spur 1) nachgewiesen wurde, wurde eine Expression von ras(Am) nicht nachgewiesen (Spur 2). Diese zeigt an, dass die intrinsische Suppressoraktivität in den Zellen fehlt. Menschliche Suppressor-tRNA^Tyr löste eine Suppression der amber-Mutation in ras(Am) mit einer Effizienz von 26 aus, gemessen auf der Basis der Bandenintensität (Spur 3). Andererseits konnte E. coli tRNA^Tyr (A9G10C25), die ein CUA-Anticodon aufweist, eine Suppression zusammen mit Wildtyp TyrRS von E. coli (Spur 4) nicht auslösen. Als nächstes untersuchten wir eine andere E. coli Suppressor-tRNA^Tyr-Mutante unter Verwendung eines anderen Nukleotidsatzes, der eine Box A bilden konnte (G9G10C25). Diese tRNA war ebenfalls nicht dazu in der Lage, eine Suppression auszulösen. Auf diese Weise beeinträchtigte die Bildung von Box A in E. coli Suppressor tRNA^Tyr die Aktivität. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass E. coli tRNA^Tyr mit Box A nicht die dreidimensionale Struktur aufrechterhalten kann, was zu Beeinträchtigungen der tRNA-Reifung oder Aminoacylierung führt.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß dem in der vorliegenden Erfindung beinhalteten Expressionsverfahren können nicht natürlich auftretende Aminosäuren in ein gewünschtes Protein als Reaktion auf Unsinncodons in tierische Zellen eingebaut werden, die die vorher erwähnte Mutante von E. coli TyrRS exprimieren, die vorher erwähnte Suppressor-tRNA, abstammend von Bacillus stearothermophilus und das Gen, codierend für das gewünschte Protein mit Unsinncodons an den gewünschten Positionen. Die nicht natürlich auftretenden Aminosäuren werden durch die Zellen von dem Wachstumsmedium aufgenommen.
Früher waren nur E. coli-Zellen zur Erzeugung von Alloproteinen verfügbar, den Proteinen mit nicht natürlich auftretenden Aminosäuren an gewünschten Positionen. Die vorliegende Erfindung hat die Produktion solcher Proteine in tierischen Zellen ermöglicht. Tierische Zellen sind bessere Systeme als E. coli-Zellen für die Herstellung der Proteine von Tieren, einschließlich dem Menschen und würden so für die Herstellung von Alloproteine nützlich sein, die nur schwierig mit E. coli-Zellen herzustellen sind.
Es gibt verschiedene Anwendungen für Alloproteine. Durch Einbau von 3-Iodtyrosin oder 4-Iod-L-phenylalanin können Proteine das schwere Atom enthalten, das für eine Röntgenkristallografie nützlich ist oder können mit radioaktiven Iodatomen markiert werden. Insbesondere würden Iodatome die funktionelle und strukturelle Analyse der Proteine mit Iodatomen erleichtern, da dieses Atom ein charakteristisches Signal für die NMR-Spektroskopie ergibt.
Der Einbau von O-Methyltyrosin würde auch NMR-Analysen erleichtern, da gewünschte Positionen in einem Protein mit dem stabilen Isotop von Kohlenstoff in der Methylgruppe markiert werden können.
Der Einbau der nicht natürlich auftretenden Aminosäuren mit Acetylgruppen, wie 4-Acetylphenylalanin würde künstliche Modifikationen von Proteinen durch chemische Konjugation zwischen der Acetylgruppe, einer reaktiven Gruppe, eingeführt in die Proteine und einer Vielzahl chemischer Verbindungen mit gewünschten Eigenschaften und Struktur ermöglichen.
Es wurde berichtet, dass 4-Benzoyl-L-phenylalanin und 4-Azid-L-phenylalanin eine kovalente Bindung mit Molekülen in enger Nachbarschaft bei Aussetzung gegenüber Licht mit einer bestimmten Wellenlänge bilden (siehe z. B. J. Chin et al., Chem. Bio. Chem. 11, 1135–1137 (2002)). So ist es durch Einbau dieser Aminosäuren in dieses Protein möglich, unbekannte zelluläre Ziele nachzuweisen, die mit dem Protein von Interesse in Wechselwirkung treten.
Weiterhin zeigen einige Proteine mit nicht natürlich auftretenden Aminosäuren möglicherweise neue physiologische Eigenschaften, um sie der Entwicklung für neue Arzneimittel oder Arzneimittelzuführsysteme zu unterwerfen.
Iodtyrosin-haltige Proteine würden bei der Untersuchung der Zellsignalbildung aus den folgenden zwei Gründe nützlich sein. Erstens könnten einige Tyrosinkinasen (Enzyme, die Tyrosinreste in zellulären Proteinen phosphorylieren) Iodtyrosinreste phosphorylieren und die anderen könnten dies nicht tun. Die Substratspezifitäten dieser Kinasen könnten genetisch manipuliert werden, indem die strukturelle Kenntnis über diese Enzyme verwendet wird; die Kinasen, die dazu in der Lage sind, Iodtyrosine zu phosphorylieren, könnten manipuliert werden, nicht dazu in der Lage sein, während die anderen, die nicht dazu in der Lage sind, ähnlich manipuliert werden könnten, um mit Iodtyrosinen aktiv zu sein. Durch ortsspezifischen Einbau von Iodtyrosin in Proteine, zusammen mit der Einführung in Zellen der Kinasemutanten, die so manipuliert wurden, könnte man bestimmen, welche Kinase an der Phosphorylierung des Tyrosinrests von Interesse beteiligt ist.
Zweitens sind phosphorylierte Iodtyrosine in einem gewissen Ausmaß gegenüber Phosphatasen resistent, die die Phosphorylgruppe von den phosphorylierten Tyrosinresten entfernen und sind so zusammen mit Kinasen an dem regulären System beteiligt, basierend auf einer Protein-Phosphorylierung. Proteine mit phosphorylierten Iodtyrosinen könnten ihre Aktivität behalten, die auf dieser Phosphorylierung basiert und zwar für eine längere Zeit als Proteine mit phosphorylierten Tyrosinen, und zwar aufgrund der Resistenz des Iodtyrosins gegenüber Phosphatasen. So könnten die Wirkungen der verlängerten Aktivität eines Proteins auf zelluläre Aktivitäten analysiert werden, um die Funktion und Rolle dieses Proteins in der Zelle zu erhellen.
Zusätzlich erzielen die Systeme, die die Suppressor-tRNA in tierischen Zellen exprimieren, beinhaltet in der vorliegenden Erfindung, eine Unsinn-Suppression in diesen Zellen und haben so eine potenzielle Nützlichkeit bei der Gentherapie von Erkrankungen, bei denen Unsinnmutationen mit im Spiel sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionsverfahren für nicht natürlich auftretendes Aminosäure-haltiges Protein, umfassend: Expression von (A) einer mutierten Tyrosyl-tRNA-Synthetase, die ein Derivat einer Tyrosyl-tRNA-Synthetase ist, die von E. coli abstammt, mit verstärkter Spezifität für ein nicht natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zu der Spezifizität für Tyrosin, wobei. die mutierte Tyrosyl-tRNA-Synthetase eine mutierte TyrRS der SEQ ID NO: 29 ist, worin die Stellung, korrespondierend zu Tyrosin (Y) an Position 37 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I) oder Alanin (A) substituiert ist und worin die Stellung, korrespondierend zu Glutamin (Q) an Position 195 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Alanin (A), Cystein (C), Serin (S) oder Asparagin (N) substituiert ist; (B) Suppressor-Tyrosin-tRNA, die von Bacillus stearothermophilus abstammt und dazu in der Lage ist, an das Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten Tyrosyl-tRNA-Synthetase zu binden; und (C) ein gewünschtes Proteingen, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat; in tierischen Zellen, wobei das Tyrosinderivat als Reaktion auf das erzeugte Unsinncodon eingebaut wird.
Expressionsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Tyrosinderivat ein an Position 3 substituiertes Tyrosin oder ein an Position 4 substituiertes Tyrosin ist.
Expressionsverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die tierischen Zellen Säugerzellen sind.
Ein nicht natürlich auftretendes Aminosäure-haltiges Protein-Erzeugungsverfahren, umfassend: das Gewinnen und Reinigen eines Proteins, exprimiert gemäß einem der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 bis 10.
Tierische Zellen, enthaltend: (A) einen Expressionsvektor, der in tierischen Zellen eine mutierte Tyrosyl-tRNA-Synthetase exprimiert, die ein Derivat einer Tyrosyl-tRNA-Synthetase ist, die von E. coli abstammt, mit verstärkter Spezifität für ein nicht natürlich auftretendes Tyrosinderivat im Vergleich zu der Spezifizität für Tyrosin, wobei die mutierte Tyrosyl-tRNA-Synthetase eine mutierte TyrRS der SEQ ID NO: 29 ist, worin die Stellung, korrespondierend zu Tyrosin (Y) an Position 37 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I) oder Alanin (A) substituiert ist und worin die Stellung, korrespondierend zu Glutamin (Q) an Position 195 der Tyrosyl-tRNA-Synthetase, durch Alanin (A), Cystein (C), Serin (S) oder Asparagin (N) substituiert ist; (B) einen Expressionsvektor, der in den tierischen Zellen eine Suppressor-Tyrosin-tRNA exprimiert, die von Bacillus stearothermophilus abstammt und dazu in der Lage ist, an das Tyrosinderivat in Gegenwart der mutierten Tyrosyl-tRNA-Synthetase zu binden; und (C) einen Expressionsvektor, der in den tierischen Zellen ein gewünschtes Proteingen exprimiert, das eine Unsinnmutation an einer gewünschten Stelle durchlaufen hat; wobei das Tyrosinderivat an der Stelle der Unsinnmutation des Proteins eingebaut ist.
Tierische Zellen gemäß Anspruch 5, wobei das Tyrosinderivat ein an Position 3 substituiertes Tyrosin oder ein an Position 4 substituiertes Tyrosin ist.
Tierische Zellen gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei es sich um Säugerzellen handelt.
Expressionsverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Suppressor-Tyrosin-tRNA in einem Expressionsvektor umfaßt ist, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
Expressionsverfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Expressionsvektor dazu in der Lage ist, von einer Kontrollsequenz exprimiert zu werden, die in tierischen Zellen erkannt wird, umfassend irgendeine der Sequenzen wie definiert in Anspruch 8.
Expressionsverfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Expressionsvektor neun Kopien von DNAs trägt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweisen, und zwar in derselben Richtung.
Tierische Zellen gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Expressionsvektor von (B) dazu in der Lage ist, von einer Kontrollsequenz exprimiert zu werden, die in tierischen Zellen erkannt wird, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32.
Tierische Zellen gemäß Anspruch 11, wobei der Expressionsvektor neun Kopien von DNAs in derselben Richtung trägt, mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1.