JP4467435B2 - 非天然型チロシン誘導体組み込みタンパク質の発現方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質中の所望の部位に、非天然型アミノ酸を取りこませて、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質を発現させる方法、並びに上記タンパク質を発現させるために用いるＤＮＡ、発現ベクター、及び動物細胞に関する。

タンパク質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常のタンパク質合成に関わる２０種類以外のアミノ酸（以下、非天然型アミノ酸という）で置換した、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質（以下、アロタンパク質ともいう）は、タンパク質の機能・構造解析の有効な手段となり得る。

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、ａａＲＳという）はアミノ酸とｔＲＮＡとを特異的に結合させる酵素であり、生物種ごとに、一部の例外を除き天然に存在する２０種類のアミノ酸それぞれに対応して２０種類存在する。細胞内にはこのようなａａＲＳが基本的にアミノ酸ごとに存在することで、遺伝暗号に割り当てられるアミノ酸の種類が決まっている。例えば、ａａＲＳの一つであるＴｙｒＲＳ（以下、ＴｙｒＲＳという）は、チロシンｔＲＮＡ（以下、ｔＲＮＡ^Ｔｙｒという）を他のアミノ酸のｔＲＮＡから識別してこれにチロシンにしか結合させず、他のアミノ酸とは結合させない。

アロタンパク質を生産するための手法としては、従来より、大腸菌内で生産する方法［コイデ（Ｋｏｉｄｅ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＵＳＡ、第８５巻、１９８８年、ｐ．６２３７−４１（文献１）］、及び無細胞翻訳系で生産する方法［ノーレン（Ｎｏｒｅｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４４巻、１９８９年、ｐ．１８２−８（文献２）］が知られていた。

非天然アミノ酸を含む２１種類のアミノ酸を含んだタンパク質をさらに大量に調製するためには、非天然型アミノ酸を結合するｔＲＮＡが、翻訳反応を行なう系の中で専用のａａＲＳによってアミノアシル化される人工遺伝暗号系を構築することが必要である。

このような人工遺伝暗号系の構築のためには、以下の条件を満たす、ａａＲＳ・ｔＲＮＡの組を見出すことが必要である：
（１）ａａＲＳは、通常の２０種類のアミノ酸のいずれかではなく、所望の非天然型アミノ酸と特異的に反応するａａＲＳ変異体であること；
（２）ｔＲＮＡは、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないコドン（例えば、ナンセンスコドンまたは４塩基コドンなど）に割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸特異的なａａＲＳ変異体にのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ）ものであること。

このような条件を満たす、人工遺伝暗号系として、非天然型アミノ酸を結合してメッセンジャーＲＮＡ上のナンセンス・コドンまで運搬する分子（サプレッサーｔＲＮＡ分子）と、サプレッサーｔＲＮＡ分子に非天然型アミノ酸を結合させる酵素（ａａＲＳ）を用いることができる。このメカニズムについては、［ワング（Ｗａｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２９２巻、２００１年、ｐ．４９８−５００（文献３）］及び［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、第１２４巻、２００２年、ｐ．１８３６−１８３７（文献４）］に記載されている。
そして、このメカニズムによる、具体的な人工遺伝暗号系が、大腸菌内の系、及び小麦胚芽抽出液を利用した無細胞タンパク質合成系で確立されている。

すなわち、大腸菌において、任意の指定する部位に非天然型アミノ酸を含有するタンパク質を生産するシステムとしては、Ｏ−メチルチロシンを特異的にアミノアシル化するように改変したメタノコッカスジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のＴｙｒＲＳ変異体と、同生物由来のチロシンｔＲＮＡを改変したアンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現させ、Ｏ−メチルチロシンがアンバーコドンに対応して特異的に導入されることが報告されている（文献３）。
また、任意の部位に非天然型アミノ酸を含有するタンパク質を小麦胚芽抽出液中で生産するためのａａＲＳが開発されている［キガ（Ｋｉｇａ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＵＳＡ、第９９巻、２００２年７月２３日、ｐ．９７１５−９７２３（文献５）］。

このように、大腸菌や無細胞タンパク質合成系では、アロタンパク質生産系が開発されてきたが、これらをそのまま動物細胞内に用いることはできない。すなわち、大腸菌用に開発されたこれらの分子は、いずれもそれらの分子の性質そのものによって動物細胞内では使用することはできない。動物細胞内で任意の指定する部位に非天然型アミノ酸を含有したタンパク質を合成するためには、別途、適当なサプレッサーｔＲＮＡと、このサプレッサーｔＲＮＡ分子と非天然型アミノ酸の両方に特異的なａａＲＳを開発し、かつ、動物細胞内においてそれら分子の発現が実現されなければならない。

また、上記小麦胚芽抽出液中での無細胞タンパク合成系で用いられたａａＲＳは、その基質特異性から考えて動物細胞内で使用可能であると予想された。しかし、使用するためには、組み合わせるべきサプレッサーｔＲＮＡとその発現系の開発が必要であった。

本発明は、動物細胞内における、非天然アミノ酸組み込みタンパク質の発現方法、並びに上記タンパク質を発現させるために用いるＤＮＡ、発現ベクター、及び動物細胞を提供することを目的とする。

本発明は、下記の発現方法を提供する。
（１） （Ａ）大腸菌由来のＴｙｒＲＳの変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異ＴｙｒＲＳ（以下、変異ＴｙｒＲＳという）と、
（Ｂ）上記変異ＴｙｒＲＳの存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子
とを動物細胞中で発現させて、上記タンパク質のナンセンス変異の位置に上記チロシン誘導体を取りこませることを特徴とする、非天然型チロシン誘導体組み込みタンパク質の発現方法。
（２）上記チロシン誘導体が、３位置換チロシンまたは４位置換チロシンである（１）項に記載の発現方法。
（３）（Ｂ）サプレッサーｔＲＮＡがバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサプレツサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒである（１）又は（２）項に記載の発現方法。
（４）（Ａ）変異ＴｙｒＲＳが、ＴｙｒＲＳの３７位チロシン及び１９５位グルタミンに相当する位置に改変を受けた変異ＴｙｒＲＳである（１）〜（３）のいずれか一項に記載の発現方法。
（５）（Ａ）変異ＴｙｒＲＳが、ＴｙｒＲＳの３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）により置換され、かつＴｙｒＲＳの１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、またはアスパラギン（Ｎ）で置換された変異ＴｙｒＲＳである（４）項に記載の発現方法。
（６）動物細胞が哺乳類細胞である（１）〜（５）項のいずれか一項に記載の発現方法。

また、本発明は下記のタンパク質製造方法も提供する。
（７）（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法にしたがって発現させたタンパク質を回収し、精製することを特徴とする、非天然型チロシン誘導体が取りこまれたタンパク質の製造方法。

また、本発明は下記の動物細胞も提供する。
（８）（Ａ）大腸菌由来のＴｙｒＲＳの変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異ＴｙｒＲＳを動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）上記変異ＴｙｒＲＳの存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子を上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
とを含有し、上記タンパク質のナンセンス変異の位置に上記チロシン誘導体を取りこませることができる動物細胞。
（９）上記チロシン誘導体が、３位置換チロシンまたは４位置換チロシンである（８）項に記載の動物細胞。
（１０）（Ｂ）サプレッサーｔＲＮＡがバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒである（８）又は（９）項に記載の動物細胞。
（１１）（Ａ）変異ＴｙｒＲＳが、ＴｙｒＲＳの３７位チロシン及び１９５位グルタミンに相当する位置に改変を受けた変異ＴｙｒＲＳである（８）〜（１０）項のいずれか一項に記載の動物細胞。
（１２）（Ａ）変異ＴｙｒＲＳが、ＴｙｒＲＳの３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）により置換され、かつＴｙｒＲＳの１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、またはアスパラギン（Ｎ）で置換された変異ＴｙｒＲＳである（１１）項に記載の動物細胞。
（１３）哺乳類細胞である（８）〜（１２）項のいずれか一項に記載の動物細胞。

また本発明は、下記のＤＮＡ及び発現ベクターも提供する。
（１４）配列番号１、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選ばれる一の配列を有するＤＮＡ。
（１５）動物細胞内で認識される制御配列から発現可能に、配列番号１、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選ばれる一の配列を含有してなる発現ベクター。
（１６）配列番号１の配列を有するＤＮＡが同方向に９個配列されてクローン化された、（１５）記載の発現ベクター。

本発明の発現方法は、
（Ａ）原核生物由来のＴｙｒＲＳの変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異ＴｙｒＲＳと、
（Ｂ）上記変異ＴｙｒＲＳの存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子
とを動物細胞中で発現させて、上記タンパク質のナンセンス変異の位置にチロシン誘導体を取りこませることを特徴とする、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の発現方法である。

次に、本発明の発現方法で用いられる、変異ＴｙｒＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡについて詳述する。

（１）変異ＴｙｒＲＳ
本発明において、チロシンよりも所望のチロシン誘導体に対する基質親和性が高められたとは、目的のチロシン誘導体に対する活性値（反応速度Ｋ_ｃａｔをミカエリス定数Ｋ_ｍで割った値）が、チロシンに対する活性値よりも大きいものをいう。活性値はインビトロのアッセイによって測定できるが、遺伝学的なデータから活性値の相対的な大きさを判定することもできる。

本発明で用いられる変異ＴｙｒＲＳは、アミノ酸として、チロシン誘導体を特異的に認識し、かつｔＲＮＡとして、併用するサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して、チロシン誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができる大腸菌由来ＴｙｒＲＳの変異体である。大腸菌としては、Ｋ１２株、Ｂ株を挙げることができる。

大腸菌由来のＴｙｒＲＳ（野生型）は、真核生物のｔＲＮＡ^Ｔｙｒと反応せず、大腸菌由来のｔＲＮＡ^Ｔｙｒは真核生物のＴｙｒＲＳと反応しない。

上記チロシン誘導体としては、チロシンのフェニル基の３位または４位に置換基を有する３位置換チロシン、４位置換チロシンが挙げられる。
３位置換チロシンとしては、３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシンなどの、３−ハロゲン化チロシンが挙げられる。また４位置換チロシンとしては、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられる。

これらのアミノ酸は、公知の方法で作製することができ、あるいは市販のものを利用することができる。例えば、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンは、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４２巻、６７３５−６７４６頁、２００３年に記載の方法に従って作製することができる。また、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンと４−アジド−Ｌ−フェニルアラニンはＢａｃｈｅｍ社（ドイツ）より、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンと４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンはＳｉｇｍａ社（米国）より市販されているものを用いることができる。

これらはそれ自体で生理活性を有する非天然型アミノ酸であり、タンパク質の部位特異的ラベルの標的ともなるので、例えば、３−ハロゲン化チロシンを組み込んだタンパク質は、タンパク質機能・構造解析の材料として有用であり、また創薬のターゲットともなる可能性がある。

大腸菌のＴｙｒＲＳ（野生型）のアミノ酸配列（配列番号２９）を１文字表記で図８に示す。
本発明に用いられる変異ＴｙｒＲＳは、例えば、すでに知られている他のＴｙｒＲＳとチロシルＡＭＰの複合体との３−Ｄ構造データ（例えば、Ｂｒｉｃｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、第２０８巻（１９８８）ｐ．８３に記載されている３−Ｄ構造データ）から得られるチロシルＡＭＰを認識する位置を参照した上で、図８の配列の中で、チロシン誘導体を認識する変異を導入すべき位置を推定して、後述する周知の部位特異的に変異を導入する方法により、得ることができる。

そして、好ましくは、本発明に用いられる変異ＴｙｒＲＳとしては、この配列の中で、少なくとも、３７位のチロシン（Ｙ）と１９５位のグルタミン（Ｑ）に相当する位置を他のアミノ酸で部位特異的に置換して、３−ハロゲン化チロシンへの特異性を付与した変異体が挙げられる（文献５参照）。

さらに好ましくは、３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）により置換され、かつ１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン（Ｎ）で置換されたものを用いることができる。これらの変異により３−ヨード−Ｌ−チロシンへの特異性が高められることを検証した結果を、表１に示す。表１は、アミノアシル化反応の反応産物の１つであるピロリン酸をピロホスファターゼで分解して生産される無機リン酸を定量するロイドらの方法（Ｌｌｏｙｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ２３（１９９５）ｐｐ２８８６−２８９２）を簡略化し、無機リンをＢｉｏｍｏｌ ｇｒｅｅｎ（フナコシ）を使用して検出することで、アミノアシル化反応の測定を行なったものである。

中でも、表１の結果から、３７位がバリンで１９５位がシステイン（Ｖ３７Ｃ１９５と称する）の変異体、３７位がバリンで１９５位がアスパラギン（Ｖ３７Ｎ１９５と称する）の変異体、３７位がバリンで１９５位がアラニン（Ｖ３７Ａ１９５と称する）の変異体、３７位がアラニンで１９５位がシステイン（Ａ３７Ｃ１９５と称する）の変異体が特に好ましい。

次に、これらの変異体を製造する方法としては、公知の遺伝子操作技術により行なうのが好ましい。例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡを増幅させて、増幅させたＤＮＡ断片を結合させて、全長のａａＲＳの変異体をコードするＤＮＡを得て、これを大腸菌などの宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。この方法において使用するプライマーとしては２０〜７０塩基、好ましくは２０〜５０塩基程度である。このプライマーは改変前の元の塩基配列とは１〜３塩基がミスマッチとなるので、比較的長いもの、例えば２０塩基以上のものを使用するのが好ましい。

より具体的に示すと、文献５に記載された方法にしたがって、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型とし、次のプライマー（１）、（２）を用いたＰＣＲによって増幅した断片を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、ｐＥＴ２６ｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込むことで、ＴｙｒＲＳの発現ベクターｐＲＴ−ＹＲＳを作製する。大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型にするとは、０．１ｍＬ程度の大腸菌培養液から回収した大腸菌を９５℃で１０分間加熱したものをＰＣＲ反応液に加えることである。

次に３７位及び１９５位のアミノ酸を部位特異的に改変する方法の一例を説明する。
まず、３７位または１９５位の１箇所のみのアミノ酸の置換体を作製する。３７位及び１９５位それぞれの１個のアミノ酸の置換体をコードするＤＮＡ配列を作製するために使用するプライマー（３）から（８）は以下の通りである。

ＭはＣまたはＡを示し、ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴを示す。

次に、３７位及び１９５位の両方のアミノ酸が改変された二アミノ酸置換体を作製する。
上記の工程で作製した３７位および１９５位それぞれの一アミノ酸置換体をコードするプラスミドから、プライマーを用いたオーバーラップ・エクステンション法で二アミノ酸置換体をコードするＤＮＡ配列を作製し、ｐＥＴ−ＹＲＳのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入する。オーバーラップ・エクステンション法はプライマー（１）と（１０）の組、プライマー（９）と（１１）の組をそれぞれ用いて増幅した２つの断片を精製し、これらとプライマー（１）と（９）を用いたＰＣＲで増幅することによって行なうことができる。

上記工程で得られた完全な変異ＤＮＡフラグメントの各々を、プラスミドｐＥＴ−ＹＲＳ内のテンプレートフラグメントのもとの位置に挿入し、変異ＴｙｒＲＳ遺伝子を含むプラスミドで、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ（Ｊ．Ｍｉｏ．Ｂｉｏ．，１６６，５５７−５８０））に準じた形質転換法により、各々大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）に導入する。各々のプラスミドを有する形質転換体を単離し培養することにより、変異ＴｙｒＲＳを大腸菌内で発現させることができる。

さらに、変異ＴｙｒＲＳを製造する方法としては、上記方法に限定されるものではなく、公知のポイントミューテーション技術や、制限酵素により改変断片を導入する方法等、種々の遺伝子操作技術を使用することができる。

（２）サプレッサーｔＲＮＡ
上記変異ＴｙｒＲＳと組み合わせて使用される、サプレッサーｔＲＮＡは、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸特異的なＴｙｒＲＳ変異体にのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ）という要件を備え、かつ真核細胞中で発現しなければならない。
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。

本発明者らは、まず、上記大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳと組み合わせるサプレッサーｔＲＮＡとしては、同じ大腸菌由来のものが適していると考え、この大腸菌由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒを、真核細胞内で発現させることを考えた。大腸菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒの配列及び構造は、すでに知られている（Ｍ．Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，１−１７２（１９８９））。これを図２に示す。

一般に、真核細胞でのｔＲＮＡの発現は、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモーターを必要とし、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ボックスＡのコンセンサス配列（ＴＲＧＣＮＮＡＧＹＮＧＧ；配列番号１３）は、８位〜１６位のＴＲＧＣＮＮＡＧＹと１８位〜１９位のＧＧであり、ボックスＢのコンセンサス配列は５２位〜６２位のＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ（配列番号１４）であり、図２において○で囲んだ配列である。またボックスＢのコンセンサス配列は、ＡＧＴＴＣＧＡＮＴＣＴ（配列番号２０）でもよい。

図２に示すように、大腸菌サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒは、配列内にボックスＢコンセンサス配列は有しているが、ボックスＡコンセンサス配列は含まない。よって、この大腸菌サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒを真核細胞内で発現させるために、Ｕ９とＣ１０をＡとＧで各々置換し、ボックスＡのコンセンサス配列を作製し（図２）、これに伴い生じるミスマッチ塩基対、Ｇ１０−Ｇ２５は、Ｇ２５Ｃ置換で修正した。すると、後述の比較例で示すように、上記変異大腸菌由来ＴｙｒＲＳと組み合わせても、サプレッション活性を示さないことがわかった。

これに対し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒでは、原核生物由来であるが、そのサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ配列内にボックスＢとボックスＡを内部に有している（Ｍ．Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，１−１７２（１９８９））（図２参照）ことに着目し、なんら改変を加えなくても真核生物内で発現させることができると考えた。

そして実際に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒを改変せずに動物細胞で導入するためのベクターにクローン化して動物細胞に導入したところ、動物細胞中での発現が確認された（後述の実施例参照）。そして、上記大腸菌のＴｙｒＲＳと組み合わせて、サプレッション活性を示すことを確認した（後述の実施例参照）。

すなわち、ボックスＡ配列とボックスＢ配列を有した形で、サプレッサー活性を保持できる原核生物のサプレッサーｔＲＮＡは、上記大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳと組み合わせて、真核生物内でサプレッサー活性を有することができることを見出した。
したがって、本発明の発現方法に用いられるサプレッサーｔＲＮＡは、上記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡである。これらのｔＲＮＡの配列については、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｌｉｂ．ｍｅｄ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ＲＮＡｍｏｄｓ／ｔｒｎａｂａｓｅ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｆｆ．ｕｎｉ−ｂａｙｒｅｕｔｈ．ｄｅ／〜ｂｔｃ９１４／ｓｅａｒｃｈ／に記載されている。

これらは、原核生物中で機能するサプレッサーｔＲＮＡの配列を有し、かつ内部に真核生物において認識される２つの内部プロモーターコンセンサス配列を有し、上記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能なサプレッサーｔＲＮＡである。ここで、「原核生物中で機能するサプレッサーｔＲＮＡの配列を有」するとは、原核生物由来のサプレッサーｔＲＮＡであって、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するための、ナンセンスコドン（通常アンバーコドン（ＵＡＧ））に相補的なアンチコドン及び立体構造（Ｌ型構造部分）を保持していることを意味する。また、「内部に真核生物において認識される２つの内部プロモーター配列を有」するとは、上記ボックスＡのコンセンサス配列（配列番号１３）とボックスＢのコンセンサス配列（配列番号１４または配列番号２０）を内部に含むことを意味する。また、「上記変異ＴｙｒＲＳの存在下でチロシン誘導体と結合可能」とは、変異ＴｙｒＲＳにより特異的に認識されてチロシン誘導体と結合することができるサプレッサーｔＲＮＡであり、通常チロシンと結合するｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサー変異体で、チロシン誘導体、好ましくは３位置換チロシンと結合可能なものが用いられる。

バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｌｉｂ．ｍｅｄ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ＲＮＡｍｏｄｓ／ｔｒｎａｂａｓｅ／、登録番号ＤＹ１５４０；Ｅ．Ｆ．Ｗａｗｒｏｕｓｅｋら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，３６９４−３７０２参照）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｌｉｂ．ｍｅｄ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ＲＮＡｍｏｄｓ／ｔｒｎａｂａｓｅ／、登録番号ＤＹ１１４０；Ｙ．Ａｎｄａｃｈｉら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７３９８−７４０２参照）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｌｉｂ．ｍｅｄ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ＲＮＡｍｏｄｓ／ｔｒｎａｂａｓｅ／、登録番号ＤＹ１４８０；Ｃ．Ｇｒｅｅｎ、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５，５０９１−５０９６参照）が挙げられ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡが用いられる。

（３）変異ＴｙｒＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡの動物細胞中での発現
変異ＴｙｒＲＳを動物細胞中で発現させるためには、いかなる公知の発現系でも用いることができ、例えば市販のｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３，（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，１３０７（１９８７）］などを用いることができる。また、サプレッサーｔＲＮＡはいかなる公知の大腸菌クローニング用ベクターを用いても動物細胞内で発現させることができる。例えば、ｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，３７３７−３７４１（１９７８））などを用いることができる。

変異ＴｙｒＲＳについては、必要に応じて、誘導発現可能なベクターを用いることができ、たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社などから市販されている、テトラサイクリン応答プロモーターを用いることができる。

細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法（Ｃｈｕ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、リポフェクション法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３））などが挙げられる。

（４）非天然型アミノ酸を組み込ませるためのタンパク質
本発明で非天然型アミノ酸を組み込ませるタンパク質の種類は、限定されるものではなく、発現可能ないかなるタンパク質でもよく、異種の組換えタンパク質でもよい。
本発明において非天然型アミノ酸を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）を導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。

タンパク質に部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６（１９８４），Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４８８−４９２（１９８５）、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。

本発明は動物細胞内で発現させることができるので、これまで、大腸菌や無細胞タンパク質系では、発現しない、あるいは発現量が低い、または活性型となるための翻訳後の修飾を受けることができないようなタンパク質へ、非天然型アミノ酸を取りこませることができる。このようなタンパク質としては、当業者には種々のものが知られているが、例えば、ヒト上皮成長因子受容体細胞外ドメイン（Ｈ．Ｏｇｉｓｏら、Ｃｅｌｌ，１１０，７７５−７８７（２００２））、ヒトＧｒｏｕｃｈｏ／ＴＬＥ１タンパク質（Ｌ．Ｐｉｃｋｅｌｅｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １０，７５１−７６１（２００２））、ラット筋肉特異的キナーゼ（Ｊ．Ｔｉｌｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １０，１１８７−１１９６（２００２））などについて、非天然型アミノ酸を取りこんだアロタンパク質を合成することができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の方法においては、動物細胞内でアロタンパク質を発現させるので、糖鎖と結合した糖タンパク質に非天然型アミノ酸を取りこませることもできる。特に、無細胞タンパク質系における糖鎖付加のパターンが、本来のパターンと異なるようなタイプの糖タンパク質の場合には、本発明の動物細胞内での系は、目的の（本来の）パターンの糖鎖が付加されたアロタンパク質を得るための有効な手段と考えられる。

（５）宿主
本発明の別の態様は、本発明の発現方法に用いることのできる、組換え動物細胞であって、上記ａａＲＳ、サプレッサーｔＲＮＡ及び非天然型アミノ酸を取りこませたい位置にアンバー変異を導入した所望のタンパク質遺伝子を導入した動物細胞である。

本発明に用いられる、宿主の動物細胞としては、遺伝子組換え系が確立されている、哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。これらの宿主は、各々発現系が確立されており、適切な宿主細胞の選択は、当業者の技術範囲内である。
これらは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などに記載された方法に準じて行なうことができる。

次に、上記この本発明の発現方法によって、非天然型アミノ酸取りこみタンパク質が発現する様子を、図１に従って説明する。図１の枠は、動物細胞（例えばＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ細胞（以下、ＣＨＯ細胞））の細胞膜を表している。細胞内（枠の内側）では、サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（“Ｂ．ｓ．ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ”と表示）とａａＲＳ（“Ｅ．ｃｏｌｉ変異体ＴｙｒＲＳ”と表示）がそれぞれの発現系から発現している。非天然型アミノ酸である３−ヨード−Ｌ−チロシンは培地（枠の外側）中に加えられる。

培地中の３−ヨード−Ｌ−チロシンは細胞自身の働きで細胞内に取り込まれ、大腸菌変異体ＴｙｒＲＳの働きによってＢ．ｓ．ｔＲＮＡ^Ｔｙｒに結合する。その後、３−ヨード−Ｌ−チロシンは、Ｂ．ｓ．ｔＲＮＡ^Ｔｙｒによってリボソーム上に運ばれて、ナンセンス・コドン（ここでは，ＵＡＧコドン）の翻訳に用いられる。望みの任意の位置に３−ヨード−Ｌ−チロシンを含有するタンパク質を生産するためには、タンパク質の遺伝子の該当位置のコドンをＵＡＧに置換した後に、この遺伝子を細胞内で発現させる。

こうして、本発明の発現方法によれば、動物細胞内において、目的の位置にチロシン誘導体が組み込まれた目的のタンパク質を発現させることができる。

すなわち、（Ａ）大腸菌由来のＴｙｒＲＳの変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異ＴｙｒＲＳを動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
（Ｂ）上記変異ＴｙｒＲＳの存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子
とを有する動物細胞を、その動物細胞の増殖に適した培地（例えば、ＣＨＯ細胞の場合、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）など）に目的のチロシン誘導体を添加した培地で、適当な条件でインキュベートする。例えば、ＣＨＯ細胞の場合は、３７℃程度の温度で、２４時間程度、インキュベートする。培地内のチロシン誘導体の添加量は、０．１−３ｍＭ程度、好ましくは０．３ｍＭ程度とする。

本発明の別の態様は、上記の発現方法にしたがって発現させたタンパク質を回収し、精製する、非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法である。
発現したアロタンパク質は、培地又は宿主細胞溶解物から回収し得る。もし膜に結合しているならば、それは適当な洗剤溶液（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を用いて又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。細胞は、凍結−融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。

さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まない、またはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、タンパク質の立体構造を形成させることができる。

タンパク質の単離・精製としては、生産したタンパク質特有の性質に基づき、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈澱、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行なうことができる。

本発明の別の態様は、下記の配列番号１の配列を有するＤＮＡである。

この配列番号１の配列は、ヒトのｔＲＮＡ遺伝子のリーダー配列（配列番号１の塩基１〜５５）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子のアンチコドン部分をＣＵＡに置換した上で、末端のＣＣＡ配列を削った塩基配列（下線部；配列番号１の塩基５６〜１３７）、および転写ターミネーター（配列番号１の塩基１３８〜１６７）をこの順番に連結した人工的な塩基配列である。

配列番号１の配列を有するＤＮＡは、クローニングのため（そのＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクターに挿入し得る。各種のベクターが利用可能である。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とし得る。その適切な核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１以上のシグナル配列、複製の起点、マーカー遺伝子などを含む。これらの１以上の構成要素を含む適当なベクターの構築は、当業者に周知の技術である。

この発現ベクターを動物細胞中に導入することにより、サプレッサーｔＲＮＡを動物細胞中で発現させることができる。すなわち、配列番号１の配列を含むベクターは、動物細胞内で認識される制御配列として、ボックスＡ、Ｂ及び５’側のリーダー配列を有しているので、ひとたびベクターが動物細胞内に導入されれば、これらの制御配列から、当該サプレッサーｔＲＮＡが動物細胞中で発現させることができる。

したがって、この発現ベクターは、上記非天然型アミノ酸取りこみタンパク質の発現方法に用いることが可能であるばかりでなく、動物細胞中のナンセンス変異のサプレッションを可能にするので、ナンセンス変異に関連する疾患などの遺伝子治療に用いられる可能性がある。

クローニングベクターは、選択した宿主細胞の１以上の中でそのベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。また、発現ベクターはそのような配列を含んでもよい。そのような配列は、各種の細菌、酵母、及びウイルスについて良く知られている。各種のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。

発現及びクローニングベクターは、典型的に選択可能マーカを含む。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子又はチミジンキナーゼ遺伝子などである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適当な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）によって記載されるように製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨＯ細胞系である。

組換え脊椎動物細胞培養における合成への適合のために好適な更に他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）などに記載されている。

遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供した配列に基づいて、適切に標識したプローブを用いて、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特異的二本鎖を認識できるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良く、且つ該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本鎖の形成において、該二本鎖に結合した抗体の存在が検出できるように表面に結合される場合、実行し得る。

あるいは遺伝子発現は、細胞の免疫組織学的染色又は組織切片のような免疫学的方法及び遺伝子生成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のアッセイによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染色のために有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物においても作製し得る。

以下、実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書において、引用した文献は、その全体が参照としてここに取り込まれるものとする。

実施例１：３−ヨードチロシン組み込みタンパク質の発現
本実施例では、３２番目のコドンをＵＡＧに置換したＲａｓタンパク質遺伝子をＣＨＯ細胞内で発現させて、該当部位に３−ヨードチロシンを含有したＲａｓタンパク質を生産した。
本実施例では、サプレッサーｔＲＮＡを恒常的に発現させる一方で、これに非天然型アミノ酸を結合させる変異ＴｙｒＲＳについては、テトラサイクリンを培養液に加えることで発現誘導を行なった。
（１）サプレッサーｔＲＮＡ
サプレッサーｔＲＮＡとして用いたＢ．ｓ．ｔＲＮＡ^Ｔｙｒの遺伝子（１６７残基）の塩基配列は以下の通りである。

この配列は、ヒトのｔＲＮＡ遺伝子のリーダー配列（Ｈ．ｖａｎ Ｔｏｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．６，３５−３１（１９８７））と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子のアンチコドン部分をＣＵＡに置換した上で、末端のＣＣＡ配列を削った塩基配列（下線部）、および転写ターミネーター（Ｈ．ｖａｎ Ｔｏｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．６，３５−３１（１９８７））をこの順番に連結した人工的な塩基配列である。
この配列番号１の配列を有する一本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲプライマーなどの一本鎖ＤＮＡの合成を行なう、広く利用されている商業的サービス（シグマ・ジェノシス・ジャパン株式会社）によって化学合成品として得た。このＤＮＡを鋳型にして、次の（１）（２）の２つのプライマーを用いたＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込むことでクローン化を行なった。

そして、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子が同じ方向に９つコピーした遺伝子クラスターを以下の２つのステップにより構築した（図３）。
まず、３つの異なるプライマーセット１〜３のプライマー（１）（２）をそれぞれ用いて、以下の通りのＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。
第１の反応は、
第１セットのプライマー（１）：

第１セットのプライマー（２）：

を用いて、通常の反応条件にてＰＣＲを行ない、配列番号１の配列を有するＤＮＡの上流に、プライマー結合部位ｐｂｓ１（配列番号１５）を、このＤＮＡの下流に、ＢｓｔＸＩ−１部位（ＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧ：配列番号１７）を有する断片を作製した。
第２の反応は、
第２セットのプライマー（１）：

第２セットのプライマー（２）：

を用いて通常のＰＣＲに用いられる反応条件にてＰＣＲを行ない、配列番号１の配列を有するＤＮＡの上流に、ＢｓｔＸＩ−１部位（配列番号１７）を、このＤＮＡの下流に、他のＢｓｔＸＩ部位、ＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧ（ＢｓｔＸＩ−２；配列番号１８）を有する断片を作製した。
第３の反応は、
第３セットのプライマー（１）：

第３セットのプライマー（２）：

を用いて通常のＰＣＲに用いられる反応条件にてＰＣＲを行ない、配列番号１の配列を有するＤＮＡの上流に、ＢｓｔＸＩ−２部位（配列番号１８）、下流に他のプライマー結合部位ｐｂｓ２（配列番号１６）を有する断片を作製した。
これら３つのＰＣＲ産物は、公知の技術によって、リガーゼを用いて互いに連結して、ｔＲＮＡ遺伝子の３つのコピーからなるサブクラスターを作製した。
このサブクラスターを、ｐｂｓ１（配列番号１５）の配列にＥｃｏＲＩ制限部位を生成するための配列が付加されたプライマーと、ｐｂｓ２（配列番号１６）の配列にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成するための配列が付加されたプライマーを用いて、両端部に、各々、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ１部位が付加されたサブクラスターの断片として、増幅した。
さらに、同様にして、両端に各々ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位が付加された断片、両端に各々ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位が付加されたサブクラスターの断片を、作製した。こうして、最終的に、制限部位の異なる組み合わせを有する３つのタイプのサブクラスターを作製した。これらのサブクラスター１〜３を、リガーゼによって互いに連結し、さらにｐＢＲ３２２（宝酒造株式会社）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位の中にクローン化して、９コピーのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を有するプラスミドｐＢｓｔＲＮＡを作製した。

得られたクローン化断片の構造を図３に示す。
図３において、ｐｂｓ１、ｐｂｓ２、ＢｓｔＸ−１、およびＢｓｔＸ−２の塩基配列は次の通りである。

プラスミドｐＢｓｔＲＮＡは、９コピーのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を有するので、動物細胞内でのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子の発現量を高めることができ、動物細胞内で非天然型タンパク質を発現させるために有用である。

（２）変異ＴｙｒＲＳ
大腸菌変異体ＴｙｒＲＳ（以下、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）という）の遺伝子の塩基配列は、文献５に記載されている。
上述の方法で、３７位または１９５位のそれぞれのアミノ酸の１個が置換された一アミノ酸置換体をコードするＤＮＡ配列を、上記プライマー（３）から（８）を用いて作製した。プライマー（３）及び（４）は、３７位の改変のためのものである。またプライマー（５）から（８）は１９５位の改変のためのものである。
ついで、３７位および１９５位それぞれの一アミノ酸置換体をコードするプラスミドから、プライマー（１）と（１０）の組、プライマー（９）と（１１）の組をそれぞれ用いて増幅した２つの断片を精製し、これらのプライマー（１）と（９）を用いたＰＣＲで増幅することによって、２つの断片を連結した。
ＰＣＲ増幅物を、ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチプルクローニング部位に挿入してプラスミドｐＥＹＳＭ１を作製した。

（３）哺乳類細胞でのアンバーサプレッション
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の方法に従って、３５ｍｍプレート当たり、各プラスミドについて０．５−２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクションを行なった。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ １（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を、培地として用いた。細胞抽出物を、トランスフェクションの２４時間後に調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、抗−ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）と、ＥＣＬ＋免疫検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてウェスタンブロッティングを行なった。バンドの強度をイメージアナライザー、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いて測定した。ｒａｓ（Ａｍ）産物及び比較のための野生型ｒａｓ産物（各０．５μｇ）を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１から５の培養プレート（１００ｍｍ径）で各々精製した。液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）とタンデム質量分析シークエンシングを行なった。

（４）ＣＨＯ−Ｙ細胞
ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）を安定に保持するＣＨＯ−Ｙ細胞を創るため、テトラサイクリンリプレッサータンパク質を構成的に生産するＴ−ＲＥＸ−ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プラスミドｐＥＹＳＭ１でトランスフェクトした。トランスフェクタントは、２５μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地で選択し、１μｇ／ｍｌの存在下で、選択した細胞の、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）の発現を調べて、ＣＨＯ−Ｙ細胞を得た。アロタンパク質の合成のために、ＣＨＯ−Ｙ細胞は、ｒａｓ（Ａｍ）とＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、テトラサイクリン（１μｇ／ｍｌ）と３−ヨード−Ｌ−チロシン（０．３ｍＭ）を培地に添加し、さらに２４時間後に細胞抽出物を調製した。

（５）アンバーコドンに対する、３−ヨード−Ｌ−チロシン取りこみ
３−ヨード−Ｌ−チロシンのタンパク質中への取りこみのために、以下の２つの点を考慮した。第１に、哺乳類細胞は、周囲の環境から、本来のアミノ酸と、それらの種々のアナログを取りこむ、輸送機構を有している。第２に、真核生物と原核生物からの野生型のＴｙｒＲＳはいずれも、基質として３−ヨード−Ｌ−チロシンを認識しない。したがって、３−ヨード−Ｌ−チロシンは、おそらく、チロシンの位置に誤った取り込みによる毒性を有していないが、３−ヨード−チロシンを認識できる変異のＴｙｒＲＳは、そのサプレッサーｔＲＮＡへの付着に必要である。
我々は、３−ヨード−Ｌ−チロシンを効率的に認識し（アミノ酸活性化のためのＫ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は、３．３×１０^３／Ｍ／ｓ）、チロシンを十倍低い効率で認識する（Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は、３．２×１０^２／Ｍ／ｓ）ことが報告されている、大腸菌ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）を用いた。さらに、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）は、野生型酵素についてのＫ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値（２．３×１０^６／Ｍ／ｓ）と比べて、Ｌ−チロシンを１００００倍低い効率で活性化する。

図５Ａ及び図５Ｂは、アンバーサプレッションの検出のためのウェスタンブロットの写真である。図５Ａは、３−ヨード−Ｌ−チロシン非存在下、図５Ｂは３−ヨード−Ｌ−チロシン存在下である。すべてのレーンで、ｒａｓ（Ａｍ）遺伝子が導入された。野生型の大腸菌ＴｙｒＲＳ（ＡとＢのレーン１）またはＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）（ＡとＢのレーン２）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒとともに、ＣＨＯ細胞内で発現した。３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ）の存在または非存在、及び発現したＴｙｒＲＳのタイプはｗｔ（ＴｙｒＲＳ野生型）、ｍｕｔ（ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５））で表示した。
図５Ａ及び図５Ｂに示すように、野生型のＴｙｒＲＳとＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）は、各々、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒと、ｒａｓ（Ａｍ）遺伝子とともにＣＨＯ細胞で発現した。これらの酵素は、同様のレベルで発現した。３−ヨード−Ｌ−チロシン（図５Ａ）の非存在下で、両方の酵素についてアンバーサプレッションが観察されたが、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）のｒａｓ（Ａｍ）産物の収率は、野生型酵素の４０％に過ぎなかった。このことは、競合する３−ヨード−Ｌ−チロシンの非存在下でも、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）は、やはりＬ−チロシンを認識し、アンバー位置にそれを取りこむことを示す。ついで、３−ヨード−Ｌ−チロシンを最終濃度０．３ｍＭになるように培地に添加した（Ｌ−チロシンはそれの２倍の濃度で含んでいた（図５Ｂ））。３−ヨード−Ｌ−チロシンのこの濃度は、細胞増殖に、ほとんど影響を与えなかった。
３−ヨード−Ｌ−チロシンの存在下で、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）のサプレッション効率は、野生型酵素に匹敵するレベルまで改善され、３−ヨード−Ｌ−チロシンが細胞により効率的に取りこまれ、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）による認識を介してタンパク質中に組み込まれたことを示唆した。

（６）Ｒａｓ産物の確認
３−ヨード−Ｌ−チロシン取りこみを確認し、それがアンバー位置（３２位）を占めることを確認するために、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）によって分解し、その分解産物であるペプチド混合物を液体クロマトグラフィー質量分析機（ＬＣ−ＭＳ）によって解析した。ついで、３２位に取りこまれたアミノ酸をマスクロマトグラフィーで、特異的平均質量と、液体クロマトグラフィーにおける溶出時間について解析した（各々、Ｓｅｒ１７からＬｙｓ４２までの領域に相当し、ヨードチロシンとチロシンを３２位に含む２つの断片（各々、ＩＹとＹ断片と称する））。

図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃは、ｒａｓ及びｒａｓ（Ａｍ）産物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
図６Ａは、ｒａｓ（Ａｍ）断片（チャートａ）及びｒａｓ産物（チャートＢ）について、ＵＶスペクトルで検出した液体クロマトグラフィーの結果である。
図６Ｂは、ｒａｓ（Ａｍ）産物（チャートａ及びｂ）及びｒａｓ産物（チャートｃ及びｄ）からの、ＩＹ断片について（チャートａ及びｃ）及びＹ断片（チャートｂ及びｄ）の質量スペクトルの結果である。Ｙ断片はＲａｓタンパク質の残基１７−４２（ＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫ）からなり、ＩＹ断片は下線のＹが３−ヨード−Ｌ−チロシンに置換されたものである。
図６Ｃは、ＩＹ断片のタンデム質量スペクトルの結果である。Ｎ末端からＣ末端方向の部分配列は、Ｖａｌ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、ヨードチロシン及びＡｓｐである。

ｒａｓ（Ａｍ）産物の分析において、ＩＹ断片は強く観察され（図６Ｂ、チャートＡ）、３−ヨード−Ｌ−チロシンの効率的取りこみを示した。タンデム質量スペクトルによって決定されたこのＩＹ断片の部分配列は、ヨードチロシンが３２位に実際に取りこまれたことを確認した（図６Ｃ）。他方、Ｙ断片は検出されず（図６Ｂ、チャートｂ）、３−ヨード−Ｌ−チロシンが、３２位でのＬ−チロシンの取りこみを阻害したことを示した。ＬＣ−ＭＳデータのさらなる分析は、他の正規のアミノ酸がこの位置に取りこまれなかったことを示した。ヨードチロシンが３２位を示すことは、こうして、ＬＣ−ＭＳ分析により評価された。これに対して、３−ヨード−Ｌ−チロシンの存在下で合成されたｒａｓ（ＷＴ）産物については、Ｙ断片は観察された（チャートｄ）が、ＩＹ断片は観察されなかった（図６、チャートｃ）。このことは、いずれの誤認識も、チロシンの位置に３−ヨード−Ｌ−チロシンを取りこむであろうから、ＣＨＯ細胞中の内因性のＴｙｒＲＳは、３−ヨード−Ｌ−チロシンを認識せず、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）は内因性のｔＲＮＡ^Ｔｙｒを認識しないことを示している。

図６Ｂに示すように、３−ヨード−Ｌ−チロシンを含有するペプチドのピークが検出された（図６Ｂ（ａ））。他方、もしＵＡＧコドンが３−ヨード−Ｌ−チロシン以外のアミノ酸に翻訳されているとするとチロシンに翻訳される可能性が最も高いが、チロシンを含むペプチドは検出されなかった（図６Ｂ（ｂ））。同様に、ＵＡＧコドンが他のアミノ酸に翻訳されると生じるはずのペプチドは一切検出されなかった。
この解析結果は、生産されたＲａｓタンパク質のほぼ１００％が、ＵＡＧコドンによって指定された位置に３−ヨード−Ｌ−チロシンを含有していることを示しており、本発明が期待通りの効果を与えることが示された。

（７）変異体ＴｙｒＲＳの誘導可能な発現により制御される３−ヨード−Ｌ−チロシンの条件取りこみ
大腸菌ＧｌｎＲＳは、テトラサイクリン制御プロモーターから哺乳類で発現し、誘導サプレッションをおこす。我々は、他のタイプのテトラサイクリン制御プロモーターから発現する、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）遺伝子を安定に保持するＣＨＯセルライン（ＣＨＯ−ＹＳ細胞と称する）を創出した。ｒａｓ（Ａｍ）遺伝子とＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子をついで、ＣＨＯ−ＹＳ細胞中に一時的に導入した。

図７は、Ｒａｓタンパク質の３−ヨード−Ｌ−チロシンの取りこみについて、誘導可能なアンバーサプレッションのウェスタンブロットの写真である。ｒａｓ（Ａｍ）遺伝子は、ＣＨＯ−Ｙ細胞に導入された。ｒａｓ（Ａｍ）遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒともに（レーン１−３）ＣＨＯ−Ｙ細胞に導入された。レーン１は、テトラサイクリンと３−ヨード−Ｌ−チロシン添加、レーン２はテトラサイクリンを添加し、３−ヨード−Ｌ−チロシン無添加、レーン３はテトラサイクリンも３−ヨード−Ｌ−チロシンも添加していないことを、それぞれ示す。
図７に示すように、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）は、テトラサイクリンが培地に存在するときに発現した（図７、レーン１及び２）が、インデューサーなしでは発現しなかった（レーン３）。発現レベルは、一時的に細胞中に導入したプラスミドから発現したＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）のレベルの２倍であった。３−ヨード−Ｌ−チロシンとテトラサイクリンの両方の存在下で、サプレッション効率３０％でｒａｓ（Ａｍ）産物を検出した（レーン１）。ｒａｓ（Ａｍ）産物の品質は、ＣＨＯ−Ｙ細胞中に同様に生産されるｒａｓ（ＷＴ）の品質とともに、ＬＣ−ＭＳにより分析し、プラスミドからのＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）下の品質と同一であることが示された。９５％を上回るｒａｓ（Ａｍ）産物が、アンバー位置に３−ヨード−Ｌ−チロシンを含み、３−ヨード−Ｌ−チロシンは、ｒａｓ（ＷＴ）産物中で検出されなかった。

他方、３−ヨード−Ｌ−チロシン非存在下で（レーン２）、ｒａｓ（Ａｍ）産物は、ほとんど検出されず、インデューサー非存在下では（レーン３）検出されなかった。これらの観察は、テトラサイクリンが、ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）発現の誘導を介して、ｒａｓ（Ａｍ）産物内への３−ヨード−Ｌ−チロシン取りこみを有効に条件づけることを示した。図７と図５Ａとの比較は、３−ヨード−Ｌ−チロシンの非存在下でＬ−チロシン取りこみが、プラスミドからＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）が発現した場合に比べて、著しく低いことを示す。この予想外の結果は、３回以上の独立した実験で観察された。この現象がいかなる機構に基づくものかについては、さらなる研究の課題である。

実施例２：
（１）サプレッサーｔＲＮＡの誘導発現系
真核生物のｔＲＮＡは、遺伝子内部に転写プロモーター配列（ボックスＡ、Ｂ）を持つ転写複合体がｔＲＮＡ遺伝子上に形成されるが、このときｔＲＮＡ遺伝子の直前の配列に結合するタンパク質因子があるとき、この因子は転写複合体の形成を妨げてｔＲＮＡの発現を阻害する。これまでに、酵母、及び粘菌において、テトラサイクリン結合性抑制因子の結合配列の１つであるｔｅｔＯ_１を、ｔＲＮＡ遺伝子の直前に組み込んで、ｔＲＮＡの発現抑制に成功していた（Ｔ．ディンガーマン他、エンボ・ジャーナル、１１巻、１４８７−１４９２頁、１９９２年；Ｔ．ディンガーマン他、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、１２巻、４０３８−４０４５頁、１９９２年）。このとき培養液に添加するテトラサイクリンの濃度は１５〜３０μｇ／ｍＬであった。

本実施例では、細胞毒性の低減化を意図してより低いテトラサイクリンの濃度で発現誘導を行なうことを試みた。そのためにｔｅｔＯ_１でなく、抑制因子をより強く結合する配列ｔｅｔＯ_２をサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の直前、１０塩基上流、または２０塩基上流に組み込んで誘導発現系を３通り作製した（ＴｅｔＢｓｔ０（配列１；配列番号３０）、ＴｅｔＢｓｔ１（配列２；配列番号３１）、ＴｅｔＢｓｔ２（配列３；配列番号３２）。

初めの下線部はｔｅｔＯ_２配列、次の下線部はサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子である。

初めの下線部はｔｅｔＯ_２配列、次の下線部はサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子である。

初めの下線部はｔｅｔＯ_２配列、次の下線部はサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子である。
これらのサプレッション効率を比較し、ＴｅｔＢｓｔ０、ＴｅｔＢｓｔ１については、それぞれ３コピーの配列を並べたものも作製して比較した。
上記ＴｅｔＢｓｔ０、ＴｅｔＢｓｔ１、ＴｅｔＢｓｔ２を、それぞれプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。配列の１，２をそれぞれ３つ並べた配列も同様である（図９）。プラスミドの培養細胞への導入方法と、サプレッション産物の検出は、実施例１（５）と同様に行なった。
１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン添加でサプレッサーｔＲＮＡの発現が誘導され、テトラサイクリン濃度を減らすことができた。これは細胞毒性を低減化するために有用である。

ＴｅｔＢｓｔ２は、ＴｅｔＢｓｔ１よりもサプレッション効率は低かったので（データ示さず）、ＴｓｔＢｓｔ０及びＴｅｔＢｓｔ１について、３コピー並べたもの（３×ＴｅｔＢｓｔ０、３×ＴｅｔＢｓｔ１）も含めて、サプレッション効率を詳細に解析した。同時に、実施例１（１）で作製したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子（ＢＹＲ（ＣＵＡ））を９個並べた遺伝子との比較も行なった。結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。
図１０Ａには、Ｒａｓタンパク質、図１０ＢにはＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のそれぞれのアンバー変異体の生産量を、ウェスタンブロットのバンド強度から測定し、それをサプレッション効率としてグラフ化した。それぞれ３回の実験データに基づいて、グラフを作成した。レーン１はアンバーコドンを有しない野生型Ｒａｓタンパク質、野生型ＥＧＦＲの生産量を示しており、この値を１００として他のサプレッション効率を数値化した。しかし、野生型タンパク質のバンド強度は、測定限界値を超えていて、実際には１００を超える値であると推測されるので、ここでは９×ＢＹＲ（ＣＵＡ）のサプレッション効率と、ＴｅｔＢｓｔの効率の比較だけを議論する。他の実験から、９×ＢＹＲ（ＣＵＡ）によるＲａｓ変異体、ＥＧＦＲ変異体のサプレッション効率は、それぞれ２４％、及び２０％とわかっている（サカモトら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、３０巻、４６９２−４６９９、２００２年）。

１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの添加で、サプレッションが誘導されることがわかる。一方、添加しないときにも、サプレッションはある程度観察される。ＴｅｓＢｓｔ０よりもＴｅｔＢｓｔ１の方が、遺伝子コピー数が１つよりも３つの方が、サプレッション効率がより高い傾向が見られ、テトラサイクリン非添加時のサプレッションも同じ傾向を示す。３×ＴｅｔＢｓｔ１の効率の方が、９×ＢＹＲ（ＣＵＡ）よりも有意に高く、非天然型アミノ酸含有タンパク質の生産に有利である。テトラサイクリン非添加時にサプレッションがほとんど起きないのは、ＴｅｔＢｓｔ０×１を用いた場合であり、ＴｅｔＢｓｔ０×１を用いることが細胞毒性の回避には最も有利であると考えられる。

一般に、動物細胞に対して、アンバー・サプレッションは細胞毒性を示す。このために恒常的に発現するサプレッサーｔＲＮＡを用いてサプレッションを行なうと、死細胞の数が増大する可能性がある。
実施例１では、サプレッサーｔＲＮＡを恒常的に発現させる一方で、これに非天然型アミノ酸を結合させるＴｙｒＲＳについては、テトラサイクリンを培養液に加えることで発現誘導を行なった。すなわち、ｔＲＮＡはアミノ酸を結合しないとサプレッションを引き起こさないので、非天然型アミノ酸を含有するタンパク質の生産に必要な時間だけＴｙｒＲＳを発現させることで、細胞毒性を軽減することを意図したものである。しかし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）が細胞内のＴｙｒＲＳなどのａａＲＳから全く認識されないという保証はないので、本実施例のごとく、サプレッサーｔＲＮＡも併せて発現誘導を行なうことがより好ましい。

［参考例］
ＴｙｒＲＳ遺伝子とレポーター遺伝子の構築
変異ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）遺伝子、ｒａｓ遺伝子及び上皮成長因子受容体レポーター遺伝子のＣ末端に、適当なＰＣＲプライマーでこれらの遺伝子を増幅することにより、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加した。ＰＣＲ産物は、各々、哺乳類細胞での発現のために、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＴｙｒＲＳ（Ｖ３７Ｃ１９５）について、ＰＣＲ産物も、ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、テトラサイクリン制御発現のためのプラスミドｐＲＹＳＭ１を作製した。ｒａｓ遺伝子の部位特異的変異を、変異誘発性プライマーを用いたＰＣＲで行なった。同様に、上皮成長因子受容体の１０６８位のチロシンコドンを、アンバーコドンに変異した。緑色蛍光タンパク質（シアノ蛍光変異）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の第１のメチオニン残基を、

にコードされている短いペプチドに置換し、さらにＦＬＡＧタグを、Ｃ末端に付加した。得られた遺伝子を、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）にクローン化した。構築された遺伝子の配列を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて確認した。

ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の方法に従って、３５ｍｍプレート当たり、各レポーター遺伝子発現ベクター、および各サプレッサーｔＲＮＡ発現ベクター、大腸菌ＴｙｒＲＳ発現ベクターのそれぞれについて、０．５−２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクションを行なった。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ １（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を、培地として用いた。細胞抽出物を、トランスフェクションの２４時間後に調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、抗−ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）と、ＥＣＬ＋免疫検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてウェスタンブロッティングを行なった。バンドの強度をイメージアナライザー、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士フィルム）を用いて測定した（図４Ａ及び図４Ｂ）。

図４Ａ及び図４Ｂは、ＣＨＯ細胞中のアンバー変異を検出するための、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットのゲルの写真である。
図４Ａにおいて、野生型ｒａｓ遺伝子（レーン１）またはｒａｓ（Ａｍ）遺伝子（レーン２−８）は、それぞれＦＬＡＧタグが付加されて、ＣＨＯ細胞内に導入されたものである。ヒトサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（レーン３）または大腸菌ＴｙｒＲＳと大腸菌サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（レーン４）はＣＨＯ細胞内で発現した。この酵素は、ＦＬＡＧタグも有している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒは、大腸菌ＴｙｒＲＳとともに（レーン５及び８）、または酵素なしで（レーン７）、ＣＨＯ細胞内で発現し、大腸菌ＴｙｒＲＳ単独でもＣＨＯ細胞内で発現した（レーン６）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒは、１コピーの遺伝子を有するプラスミド（レーン５及び７）から、９コピーの遺伝子を有するプラスミド（レーン８）から、発現した。レーン１は、２．５μｇの細胞抽出物をのせたものであり、レーン２−８はその４倍量の細胞抽出物をのせたものである。
図４Ｂにおいて、各々ＦＬＡＧタグが付加された、１０６８位にアンバーコドンを含む（レーン１−３）、及び野生型ＥＧＦＲ遺伝子（レーン２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子をＣＨＯ細胞に導入した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒと大腸菌ＴｙｒＲＳペアは細胞中で発現した（レーン３）。レーン１と２で大腸菌ＴｙｒＲＳのレベルで移った弱いバンドは、抗ＦＬＡＧ抗体に反応した内因性タンパク質由来である。

図４Ａに示すように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡと大腸菌ＴｙｒＲＳの共発現が、１５％の効率でｒａｓ（Ａｍ）中のアンバー変異のサプレッションをおこすことを見出した（図４Ａ、レーン５）。このサプレッションは、このｔＲＮＡ（レーン６）または酵素（レーン７）のいずれかの非存在下では起こらなかった。サプレッションのための大腸菌ＴｙｒＲＳの必要性は、ＢａｃｉｌｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒが、細胞中の内因性のａａＲＳによってアミノアシル化されないことを示す。他方で、一時的にトランスフェクトされたプラスミドからの、大腸菌ＴｙｒＲＳの発現は、それ自体、ＣＨＯ細胞の成長速度に殆ど影響を与えない。

この異種の系での、ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ・ＴｙｒＲＳのペアのサプレッション効率は、ヒトサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒの効率または、哺乳類細胞で働く（２０−４０％）他のサプレッサーｔＲＮＡｓの効率よりも、著しく低かった。サプレッション効率は、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を増加させる事により改善できるため、９コピーのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を有するプラスミドを構築し、ＣＨＯ細胞に、大腸菌ＴｙｒＲＳ遺伝子を有するプラスミドとともに導入した。こうして２４％までサプレッション効率を改善した（図４Ａ、レーン８）。この値は、ヒトサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒに匹敵するものである。この後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒの発現のためにこのプラスミドを用いた。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒと大腸菌ＴｙｒＲＳとのペアは、ヒト胚性腎２９３細胞アンバー変異を、ＣＨＯ細胞中での効率と同様にサプレッションをおこした。さらに、上皮成長因子受容体遺伝子のアンバー変異は、効率２０％でサプレッションを受けた（図４Ｂ）が、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ緑蛍光タンパク質遺伝子中のアンバー変異は、同じ効率でサプレッションを受けた。
これらの遺伝子とｒａｓ（Ａｍ）遺伝子は、アンバーコドンの周囲に、異なるコドンを有している。

［比較例］
哺乳類細胞中のアンバーサプレッションに対する、原核生物のｔＲＮＡ^Ｔｙｒ・ＴｙｒＲＳペアの発現の必要性
真核細胞でのｔＲＮＡの発現は、ＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモーター（ボックスＡとＢ）を必要とする。大腸菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ配列は、ボックスＢしか含まないため、Ｕ９とＣ１０をＡとＧで各々置換し、ボックスＡを作製した（図２）。その結果得られたミスマッチ塩基対、Ｇ１０−Ｇ２５は、Ｇ２５をＣに置換して修正した（以下、ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（Ａ９Ｇ１０Ｃ２５）という）。大腸菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒの９位、１０位、２５位は、３次元の相互作用に関与しており、Ｌ型構造を支えている。

ＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（Ａ９Ｇ１０Ｃ２５）の配列を、ヒトｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子の５’フランキング配列に結合した。ヒトサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子は、アンバーサプレションのコントロールと同様に構築した。アンバーサプレッションを解析するため、野生型ｃ−Ｈａ−Ｒａｓについてトランケートした、合成ｒａｓ遺伝子中の３２位のチロシンコドンをアンバーコドンに変異した。発現を検出するため、ＦＬＡＧペプチドタグを、ｒａｓ遺伝子、ｒａｓ（ＷＴ）、そのアンバー変異体ｒａｓ（Ａｍ）のＣ末端と、大腸菌ＴｙｒＲＳのＣ末端に添加した。
これらのｒａｓ遺伝子を、ＣＨＯ細胞に導入し、それらの産物を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた、細胞抽出物のウェスタンブロットにより検出した（図４Ａ）。サプレッサーｔＲＮＡの非存在下で、ｒａｓ（ＷＴ）遺伝子の発現が検出されたが（レーン１）、ｒａｓ（Ａｍ）の発現は検出されなかった（レーン２）。これは、細胞内部の固有のサプレッサー活性の欠如を示している。ヒトサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒは、バンドの強度（レーン３）で検出されるように、ｒａｓ（Ａｍ）中のアンバー変異を、２６％の効率で、サプレッションをおこした。他方で、ＣＵＡアンチコドンを有する大腸菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（Ａ９Ｇ１０Ｃ２５）は、大腸菌からの野生型のＴｙｒＲＳとともに、サプレッションを起さなかった（レーン４）。ついで、我々は、ボックスＡ（Ｇ９Ｇ１０Ｃ２５）を生成することができる他のヌクレオチドのセットを用いて、他の大腸菌サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ変異体を調べた。このｔＲＮＡもサプレッションをおこすことができなかった。このように、大腸菌サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ変異体のボックスＡの生成は、サプレッション活性を損ねた。これは、おそらく３次構造が維持できずに、ｔＲＮＡの成熟またはアミノアシル化の阻害をおこしたためであると考えられた。

本発明の発現方法によれば、大腸菌由来の上記変異ＴｙｒＲＳと、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来の上記サプレッサーｔＲＮＡとを発現させた動物細胞において、さらにナンセンス・コドンを人為的に導入した遺伝子を発現させることで、培地中から細胞内に取り込まれた非天然型アミノ酸をナンセンス・コドンの部位に含有したタンパク質を生産することができる。

従来は、生物が培地から取り込んだ非天然型アミノ酸を任意の指定された部位に含有したタンパク質を生産する有効なシステムとしては、大腸菌を用いたシステムしか存在しなかったが、本発明によれば、非天然型アミノ酸を特定の部位に含有したタンパク質を動物細胞で調製することが容易である。ヒトを含めた動物のタンパク質を発現させるには、大腸菌よりも動物細胞が適しており、大腸菌では調製が難しいタンパク質で、非天然型アミノ酸を含有したタンパク質を生産することが可能である。

非天然型アミノ酸をタンパク質に導入する効用は様々であるが、３−ヨードチロシンや４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンを導入すると、タンパク質のエックス線結晶解析のための重原子置換の導入や、放射活性のあるヨード原子でタンパク質をラベルすることが可能である。特に、ヨウ素原子は、ＮＭＲによる構造解析において、特徴的なシグナルを発するので、ヨウ素原子を所望の場所に取りこませたタンパク質は、タンパク質の機能及び構造解析の効率化を可能とする。

Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンについても、メチル基に同位体炭素原子を導入しておけば、タンパク質の指定の位置を同位体原子によって標識することができ、ＮＭＲによるタンパク質の解析に役立つと考えられる。

また、アセチル基は反応性の高い官能基であることから、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンなどの、アセチル基を含有する非天然型アミノ酸を導入すると、所望の分子構造を持つ化合物を、この官能基を介してタンパク質の所望の位置に共有結合することができ、さらに多様な修飾が可能となる。

また、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどは、特定の波長の光を照射することで、近くに存在する分子と共有結合を生じるという性質を有していることが知られている（例えば、Ｊ．チンら、ケムバイオケム（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ）、第１１巻、２００２年、ｐ．１１３５−１１３７参照）。したがって、これらの非天然型アミノ酸をタンパク質の所定の位置に導入すれば、そのタンパク質と相互作用している細胞内の未知の物質の検出が可能となると考えられる。

さらに、これらの非天然型アミノ酸取りこみタンパク質は、それ自体で、新たな生理活性を有する物質となり得るので、新薬またはドラックデリバリーシステムの開発にも有用であると考えられる。

さらに、次の２つの理由によって、ヨードチロシン組み込みタンパク質は、細胞情報伝達系の解析に役立つ可能性がある。

第１に、タンパク質中のチロシン残基をリン酸化する酵素（チロシン・リン酸化酵素）は、ヨードチロシン残基をリン酸化できないか、リン酸化できるかのいずれかである。リン酸化できない酵素は、立体構造に基づいた改変を行なうことでリン酸化できるようになる可能性がある。一方、リン酸化できる酵素は、立体構造に基づいた改変を行なうことで、リン酸化できなくなる可能性がある。調べたい部位のチロシン残基をヨードチロシンに置換し、これらの酵素改変体を細胞内で発現させたときに、リン酸化が起きるかどうかを観察することで、当該チロシン残基のリン酸化にこの酵素がかかわっているか否かを判定できる可能性がある。

第２に、タンパク質のチロシン残基から、リン酸基を除去する酵素（脱リン酸化酵素）は、リン酸化酵素と協同してタンパク質の活性制御を行なっているが、リン酸化されたヨードチロシンは脱リン酸化されにくいため、リン酸化によって活性化されたタンパク質の活性を長く持続させる可能性がある。この結果として生起する細胞内現象を観察することで、当該タンパク質のリン酸化が細胞機能において果たす役割を解析することができる。

また、本発明のサプレッサーｔＲＮＡ発現ベクターは、動物細胞中のナンセンス変異のサプレッションを可能にするので、ナンセンス変異に関連する疾患などの遺伝子治療に用いられる可能性がある。

図１は、アンバーコドンに相当する、３−ヨード−Ｌ−チロシンのタンパク質への取りこみのための、哺乳類細胞系を示す説明図である。３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ）は、培地中に、Ｌ−チロシン（Ｙ）とともにあるが、細胞中に取りこまれた後、特異的な大腸菌変異ＴｙｒＲＳにより、Ｂ．ｓ．ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ）に結合する。 図２は、大腸菌ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒの配列及び構造を示す。図２において、ｓ^４Ｕは４−チオウリジン、Ｇｍは２’−Ｏ−メチルグアノシン、ｍｓ^２ｔ^６Ａは２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、Ｔは５−メチルウリジン、Ψはシュードウリジン、ｍ^１Ａは１−メチルアデノシンを示す。 図３は、直列に９コピーのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒを有するプラスミドの構成を示した図である。 図４Ａと図４Ｂは、ＣＨＯ細胞中のアンバー変異を検出するための、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットのゲルの写真である。 図５Ａと図５Ｂは、アンバーサプレッションの検出のためのウェスタンブロットの写真である。 図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃは、ｒａｓ及びｒａｓ（Ａｍ）産物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すグラフである。 図７は、Ｒａｓタンパク質の３−ヨード−Ｌ−チロシンの取りこみについて、誘導可能なアンバーサプレッションのウェスタンブロットの写真である。 図８は、大腸菌のＴｙｒＲＳ（野生型）のアミノ酸配列（１文字表記）を示す図である。 図９は、ＴｅｔＢｓｔ０、ＴｅｔＢｓｔ１、及びＴｅｔＢｓｔ２の概略図である。 図１０Ａと図１０Ｂは、本発明の実施例において、サプレッション効率を比較した結果を示す図である。

Claims (16)

1. （Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素と、
   （Ｂ）上記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ）属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡと、
   （Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子
   とを動物細胞中で発現させて、上記タンパク質のナンセンス変異の位置に上記チロシン誘導体を取りこませることを特徴とする、非天然型チロシン誘導体組み込みタンパク質の発現方法。
2. 上記チロシン誘導体が、３位置換チロシンまたは４位置換チロシンである、請求の範囲第１項記載の発現方法。
3. 上記（Ｂ）サプレッサーｔＲＮＡがバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡである請求の範囲第１項または第２項に記載の発現方法。
4. （Ａ）変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位チロシン及び１９５位グルタミンに相当する位置に改変を受けた変異ＴｙｒＲＳである請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の発現方法。
5. （Ａ）変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）により置換され、かつチロシルｔＲＮＡ合成酵素の１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、またはアスパラギン（Ｎ）で置換された変異ＴｙｒＲＳである請求の範囲第４項に記載の発現方法。
6. 上記動物細胞が、哺乳類細胞である請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか一項に記載の発現方法。
7. 請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか一項に記載の方法にしたがって発現させたタンパク質を回収し、精製することを特徴とする、非天然型チロシン誘導体組み込みタンパク質の製造方法。
8. （Ａ）大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体であって、チロシンに対する特異性に比べて非天然型のチロシン誘導体に対する特異性が高められた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素を動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
   （Ｂ）上記変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で上記チロシン誘導体と結合可能な、バチルス属、マイコプラズマ属、又はスタフィロコッカス属真性細菌由来のサプレッサーｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、
   （Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質遺伝子を上記動物細胞内で発現させる発現ベクター
   とを含有し、上記タンパク質のナンセンス変異の位置に上記チロシン誘導体を取りこませることができる動物細胞。
9. 上記チロシン誘導体が、３位置換チロシンまたは４位置換チロシンである、請求の範囲第８項に記載の動物細胞。
10. 上記（Ｂ）サプレッサーｔＲＮＡがバチルス・ステアロサーモフィラス由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡである請求の範囲第８項または第９項に記載の動物細胞。
11. 上記（Ａ）変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位チロシン及び１９５位グルタミンに相当する位置に改変を受けた変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素である請求の範囲第８項乃至第１０項のいずれか一項に記載の動物細胞。
12. 上記（Ａ）変異チロシルｔＲＮＡ合成酵素が、チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置が、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）により置換され、かつチロシルｔＲＮＡ合成酵素の１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、またはアスパラギン（Ｎ）で置換された変異ＴｙｒＲＳである請求の範囲第１１項に記載の動物細胞。
13. 哺乳類細胞である請求の範囲第８項乃至第１２項のいずれか一項に記載の動物細胞。
14. 配列番号１、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選ばれる一の配列を有するＤＮＡ。
15. 動物細胞内で認識される制御配列から発現可能に、配列番号１、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選ばれる一の配列を含有してなる発現ベクター。
16. 配列番号１の配列を有するＤＮＡが同方向に９個配列されてクローン化された、請求の範囲第１５項に記載の発現ベクター。

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