JP5322195B2 - 光反応性官能基を有する非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の合成方法 - Google Patents

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本発明は、光反応性官能基を有する非天然型アミノ酸組み込みタンパク質（アロタンパク質）の合成方法に関し、さらに詳細には、光反応性のフェニルジアジリン基を有するアミノ酸を、動物細胞内でタンパク質に部位特異的に導入する方法、及び当該方法を用いて前記動物細胞内で発現するタンパク質と相互作用するタンパク質をクロスリンクさせ、タンパク質間相互作用を解析する方法等に関する。

タンパク質は何れも他の生体構成分子との相互作用を介してその機能を発揮する。特にタンパク質−タンパク質相互作用は多彩な生命現象の中で中心的な役割を果たしている。従来このようなタンパク質間相互作用を調べる方法としては、細胞内で形成されるタンパク質複合体を免疫沈降法によって共沈させて単離し、その構成成分を質量分析法やウェスタンブロッティング法により調べることが一般的である。しかし、免疫沈降法には次のような問題点がある：（１）タンパク質間相互作用が弱い結合力に基づくものである場合、何れかのタンパク質に対して抗体を作用させるとタンパク質間の相互作用が切れて解離してしまう場合がある。（２）細胞からタンパク質を抽出する必要があるため、タンパク質が細胞内の異なったコンパートメント内に存在していて、相互作用が実際には生じていない場合であっても、抽出操作をすることによって細胞外で相互作用が生じ誤って検出してしまう場合がある。

このような問題点を解消する手段として、タンパク質に光反応性基を部位特異的に導入し、細胞内で相互作用をしているタンパク質同士を光照射によりクロスリンクする方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。タンパク質間相互作用が弱い結合力に基づくものであっても、この方法では共有結合でクロスリンクするため、何れかのタンパク質に対して抗体を作用させたときにタンパク質が解離してしまうことがない。また、細胞内で共有結合させるため、細胞からの抽出操作を行った後でも、細胞内で相互作用しているタンパク質のみを検出することができる。

化学生物学領域で用いられている主な光反応性官能基としては、アジド基、ジアジリン基及びカルボニル基等が挙げられる。フェニルアジド基は合成が容易で市販されているため最も広く用いられている光親和性標識である。アジド基の光分解により反応性の高いニトレン(nitrene)中間体が生成する。しかしながら、寿命の短いフェニルニトレン遊離基は寿命の長い求電子性のケテンイミン基に転移し、望ましくない非特異的反応を起こす。一方、フェニルジアジリン基では、より反応性の高いカルベン(carbene)中間体が生成する。ニトレンを用いたクロスリンクでは、窒素−炭素又は窒素−ヘテロ原子結合が生ずるが、カルベンによるクロスリンクではより安定な炭素同士の結合が生ずる。フェニルジアジリン基の光分解においても求電子性のジアゾ異性体が生成するが、電子吸引性のトリフルオロメチル基を導入することによりジアゾ基を安定化し、生じたジアゾ異性体による副反応を抑制している。ジアジリン基の光分解に必要な波長（約３６０ｎｍ）は、アジド基のそれ（約３００ｎｍ）より長く、光照射による生体高分子の受けるダメージはより少ないと考えられる。これらの比較によれば、カルベン中間体の方がニトレン中間体よりもクロスリンク剤として優れていることが分かる（例えば、非特許文献１参照）。

一方、カルボニル基を生成するベンゾフェノンは、生物学的な分野にて幅広く用いられる光反応性試薬である。ベンゾフェノンはおよそ３６０ｎｍの波長の光によって活性化され、近接するＣ−Ｈ結合と反応するが、水素原子を引き抜くために特定の幾何学的配置を必要とし、このため反応選択性が大きいという問題点が指摘されている（例えば、非特許文献２参照）。また、タンパク質表面に導入されたベンゾフェノン基は、近傍のメチオニン残基と特に反応しやすいことから、精密なタンパク質間相互作用の解析方法としては課題が残る。

タンパク質に光反応性基を導入する方法としては、主に３つの方法が用いられる。最初は、タンパク質を化学選択的に修飾する方法である。光反応性基を臭素化又はチオスルホン酸化した試薬を用い、タンパク質中のシステイン残基に導入する方法がある。第二の方法は、無細胞翻訳系を用いて、光反応性アミノ酸を部位特異的に導入する方法である。この方法では、光反応性アミノ酸に化学的に結合させたアンバーサプレッサーｔＲＮＡを用い、無細胞翻訳系でｍＲＮＡのアンバーコドンへ導入する（例えば、非特許文献３参照）。

第三の方法は、大腸菌や動物細胞内において光反応性アミノ酸をタンパク質に取り込ませるインビボ合成方法である。シュルツ(Schultz et al)らは、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（以下「ｐＢｐａ」という。）及びｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（以下「ｐＡｐａ」という。）を含む５種類のチロシンアナログのそれぞれを特異的に認識する大腸菌のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（以下「ＴｙｒＲＳ」という。）の変異体を作製した。これらの酵素を、大腸菌由来のサプレッサーチロシンｔＲＮＡと共に真核生物である酵母で発現させ、ｐＢｐａやｐＡｐａの光反応性アミノ酸を組み込んだタンパク質を合成している（例えば、非特許文献４参照）。

国際公開第２００６／０５７３９１号パンフレット Sadakane, Y. and Hatanaka, Y., Analytical Sciences, 2006, Vol.22, pp.209-218 Tate, J.J. et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol.26, pp.1421-1426 High, S. et al., The Journal of Biological Chemistry, 1993, Vol.266, pp.26745-26751 Chin, J.W. et al., Science, 2003, Vol.301, pp.964-967

パラベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）を導入したタンパク質は、タンパク質間の相互作用を解析するために有用であるが、ｐＢｐａのタンパク質への導入効率や、反応選択性の点で必ずしも満足できるものではない。ｐＢｐａよりも導入効率が高く、かつ反応選択性の低いタンパク質相互作用解析に適したクロスリンク法が求められている。しかしながら、クロスリンク剤として優れたフェニルジアジリン基を動物細胞内で部位特異的にタンパク質に導入する方法は未だ報告されていない。

本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、大腸菌のＴｙｒＲＳの種々の変異体の中に、フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸に特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成活性を有する変異体酵素を発見し、これを用いて動物細胞内で当該アミノ酸組み込みタンパク質の合成に成功することによって完成したものである。

すなわち、本発明の光反応性官能基を有する非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の合成方法は、（ａ）原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体と、原核生物由来のチロシンｔＲＮＡの変異体であるサプレッサーｔＲＮＡと、を動物細胞内で発現させ、（ｂ）前記動物細胞内に、所望の位置にナンセンス変異を受けたタンパク質遺伝子を導入し、そして（ｃ）フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸の存在下において、前記遺伝子にコードされたタンパク質を発現させることを特徴とする。前記フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸としては、Ｌ−４’−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）フェニルアラニン（以下、「ＴｍｄＰｈｅ」と称する。）であることが好ましい。また、前記原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体が、大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の３７位のチロシン、１８２位のアスパラギン酸、１８３位のフェニルアラニン及び１８６位のロイシンの何れか１又は２以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体酵素であることが好ましい。更に好ましい実施形態において、前記変異体酵素は、大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素について、Ｙ３７Ｉ、Ｄ１８２Ｇ、Ｆ１８３Ｍ、及びＬ１８６Ａからなるアミノ酸置換を有する変異体酵素である。前記サプレッサーｔＲＮＡが由来する原核生物としては、バチルス・ステアロサーモフィラスが好ましい。

本発明の別の観点において、上記方法により合成したタンパク質を含む動物細胞に、特定波長の光を照射することを特徴とするタンパク質のクロスリンク方法を提供する。当該特定波長としては、動物細胞へのダメージが比較的少ない３６０ｎｍ付近の波長の光であることが好ましい。この方法によりクロスリンクさせたタンパク質を解析することにより、タンパク質相互作用を精密に検出することができる。

さらに異なる観点において、本発明は、動物細胞内で発現するタンパク質に、部位特異的に光反応性官能基を導入する方法を提供するものであって、その方法は、（ａ）原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体と、原核生物由来のチロシンｔＲＮＡの変異体であるサプレッサーｔＲＮＡと、を発現する動物細胞を用意し、（ｂ）前記細胞内に、所望の位置にナンセンス変異を受けたタンパク質遺伝子を導入し、そして（ｃ）フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸の存在下において、前記遺伝子にコードされたタンパク質を発現させることを特徴とする。

本発明の方法によれば、光反応性官能基としてｐＢｐａよりもサイズの小さいＴｍｄＰｈｅを用いることができるため、動物細胞内においてタンパク質への導入効率が高く、また導入されたタンパク質の細胞内でのフォールディング効率も高いと考えられる。タンパク質間のクロスリンクについても、他のタンパク質との相互作用を阻害することなく、かつ光反応効率がよいため短時間でクロスリンクが生じるという利点がある。本発明の方法は、動物細胞内でタンパク質同士を効率的にクロスリンクさせることができるので、動物細胞内におけるタンパク質の相互作用を容易かつより正確に検出することが可能となる。

（光反応性官能基を有するアミノ酸）
本発明の方法に用いられる光反応性官能基を有するアミノ酸は、中間体としてカルベンを生成するフェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸であれば特に制限されないが、好ましくはＬ−４’−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）フェニルアラニン（ＴｍｄＰｈｅ）である。ＴｍｄＰｈｅの化学構造式を図２に示す。タンパク質表面における光反応性の効率を上げるため、ジアジリン基がフェニルアラニンの４位に存在することが好ましい。また、フェニルアラニンの２位にメトキシ基又はポリエーテル基を介してアミノ基やビオチニルアミノ基を導入した誘導体化合物が報告されており(Hashimoto, M. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter, 2002, Vol.12, pp.2507-2510)、これらの化合物を用いることも可能である。

ＴｍｄＰｈｅの製造方法としては、３−［ｐ−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］フェニル］アラニンを、ｐ−ブロモベンジルアルコールから１０段階で合成する方法が報告されている(Shih LB, Bayley H., Anal Biochem, 1985, Vol.144, pp.132-141、FIG.1参照)。この方法によれば、ｐ−ブロモベンジルアルコールは、３−（α−ヨード−ｐ−トリル）−３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリンに転換され、さらにこれを用いて、Ｎ−（ジフェニルメチレン）グリシンエチルエステルをアルキル化する。得られたラセミ体は、誘導体化した後、酵素的に分解して光学分割することができる。

（ＴｙｒＲＳ変異体）
本発明で用いられるＴｙｒＲＳ変異体は、アミノ酸として上記光反応性を有する非天然型アミノ酸を特異的に認識し、かつｔＲＮＡとして、併用するサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して上記非天然型アミノ酸が結合したアミノアシルサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができる原核生物由来のＴｙｒＲＳ変異体である。原核生物としては大腸菌やバチルス属、等を挙げることができる。その中でも大腸菌Ｋ１２株、及びＢ株が好ましい。大腸菌等の原核生物由来のＴｙｒＲＳ（野生型）は、動物細胞のチロシンｔＲＮＡと反応せず、同様に原核生物由来のチロシンｔＲＮＡは動物細胞のＴｙｒＲＳと反応しない（直交性）。

大腸菌のＴｙｒＲＳ（野生型）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、図１は、そのＴｙｒＲＳの活性部位と、そこに結合したチロシンの立体構造を示した模式図である。これらの分子モデルを参照した上で、配列番号１の配列の中で、基質となるフェニルジアジリン基を認識する酵素側の残基、すなわち、変異を導入すべき位置を推定して、周知の部位特異的変異導入方法により本発明に用いうるＴｙｒＲＳ変異体を取得することができる。光反応性官能基を有するアミノ酸がＴｍｄＰｈｅである場合には、野生型ＴｙｒＲＳの３７位のチロシン、１８２位のアスパラギン酸、１８３位のフェニルアラニン及び１８６位のロイシンの何れか１又は２以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体酵素であることが好ましい。例えば、野生型ＴｙｒＲＳの３７位のチロシンがバリンに置換され、かつ１８２位のアスパラギン酸がセリンに置換された変異体等である。

さらに好ましくは、前記変異体酵素がＹ３７Ｉ、Ｄ１８２Ｇ、Ｆ１８３Ｍ、及びＬ１８６Ａなるアミノ酸置換を有することによりＴｍｄＰｈｅに対する特異性を高めることができる。ここで、Ｙ３７Ｉとは、３７位のチロシン（Ｙ）がイソロイシン（Ｉ）に変異していることを、Ｄ１８２Ｇとは、１８２位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異していることを、Ｆ１８３Ｍとは、１８３位のフェニルアラニン（Ｆ）がメチオニン（Ｍ）に変異していることを、及びＬ１８６Ａとは、１８６位のロイシン（Ｌ）がアラニン（Ａ）に変異していることを意味する。アミノ酸を一文字の略号で表示する方法は当業者において周知の技術常識である。

次に、これらの変異体酵素を調製する方法としては、公知の遺伝子組換え技術により行うことができる。例えば、目的のアミノ酸をコードする塩基配列を、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、ＴｙｒＲＳ遺伝子を鋳型にＰＣＲを行ってＤＮＡを増幅し、増幅させたＤＮＡ断片を結合して全長のＴｙｒＲＳ変異体をコードするＤＮＡを取得する。これを大腸菌や酵母、又は動物細胞等の宿主細胞に導入して発現させることにより容易に調製することができる。この方法において使用するプライマーとしては、２０〜７０塩基、好ましくは２０〜５０塩基程度である。鋳型ＤＮＡとのミスマッチの塩基数に応じてプライマーの長さを適宜調整することは当業者であれば容易に実施しうるであろう。

これらのＴｙｒＲＳ変異体は、公知の発現系を用いて動物細胞内で発現させることができる。例えば、市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology,3,133(1990)）、及びｐＡＧＥ１０３[J.Biochem.101,1307(1987)]など発現プラスミドの所定の位置に上記ＴｙｒＲＳ変異体遺伝子を導入して構築したプラスミドを、哺乳動物細胞に導入すればよい。必要に応じて、誘導可能なベクターを用いることができ、例えば、クロンテック社、インビトロジェン社等から市販されているテトラサイクリン応答プロモーター等を用いることができる。

（サプレッサーｔＲＮＡ）
上記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、通常２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記非天然型アミノ酸特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素にのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない(直交性：orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真核細胞内で発現しなければならない。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が大腸菌のＴｙｒＲＳである場合、対応するｔＲＮＡは、原核生物由来で、かつ動物細胞中で発現するサプレッサーｔＲＮＡである。

ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。また、ナンセンスコドンに代えて、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（以下「フレームシフトコドン」という。）を用いることもできる。

一般に、真核細胞でｔＲＮＡを転写するタイプＩＩプロモーターは、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの領域から成り立つ内部プロモーターであり、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。ボックスＡのコンセンサス配列は、８位〜１９位のＴＲＧＣＮＮＡＧＹＮＧＧ（配列番号２）であり、ボックスＢのコンセンサス配列は、５２位〜６２位のＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ（配列番号３）である。このため、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のサプレッサーチロシンｔＲＮＡは、原核生物由来であるものの、そのサプレッサーチロシンｔＲＮＡコーディング配列内には、ボックスＡとボックスＢが存在しているため（例えば、M.Sprinzl et al., Nucleic Acids Research 17, 1-172(1989)参照）、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができる。

一方、大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡは配列内にボックスＢコンセンサス配列は有しているがボックスＡコンセンサス配列を含まない。これらの内部プロモーターを持たないサプレッサーｔＲＮＡの場合は、外部プロモーターを用いて真核細胞内で発現させることもできる。例えば、大腸菌のサプレッサーチロシンｔＲＮＡ遺伝子の５’末端に、真核生物のｔＲＮＡ核酸配列やＵ１及びＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子のプロモーター配列を結合させることによって動物細胞内で効果的に発現させうることができる。さらに、異なる実施形態として、Ｔ７ファージ由来のＴ７プロモーターを連結し、動物細胞内でＴ７ＲＮＡポリメラーゼと同時に発現させてもよい。

（相互作用解析の対象となるタンパク質）
本発明で非天然型アミノ酸を組み込ませるタンパク質の種類は、限定されるものではなく、発現可能な如何なるタンパク質でもよく、異種の組換えタンパク質でもよい。例えば、タンパク質の種類として、いわゆるシグナル伝達関連タンパク質、受容体、増殖因子、細胞周期関連因子、転写因子、翻訳因子、輸送関連タンパク質、分泌タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、酵素、シャペロン又は癌、糖尿病若しくは遺伝病等を含む疾患関連タンパク質などが挙げられる。これらのタンパク質は、相互作用によってその機能を果たすものであり、本発明の方法を用いてその相互作用を解析することができる。

本発明において、光反応性非天然アミノ酸を組み込ませる所望の位置にナンセンスコドンを導入する。これにより、部位特異的に光反応性非天然アミノ酸を組み込ませることができる。タンパク質の所望の位置に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Gene 152,271-275(1995)、Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。

本発明は動物細胞内で発現させることができるので、これまで、大腸菌や無細胞タンパク質系では、発現しない、あるいは発現量が低い、または活性型となるための翻訳後の修飾を受けることができないようなタンパク質へ、光反応性非天然型アミノ酸を取りこませることができる。このようなタンパク質としては、当業者には種々のものが知られているが、例えば、ヒトＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ型レセプター（Cell,110,775-787(2002)）、ヒトGroucho/TLE1タンパク質（Structure 10,751-761(2002)）、ラット筋肉特異的キナーゼ（Structure 10.1187-1196(2002)）などについて、アロタンパク質を合成することができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の方法においては、動物細胞内でアロタンパク質を発現させるので、糖鎖と結合した糖タンパク質に光反応性非天然型アミノ酸を組みこませることもできる。特に、無細胞タンパク質系における糖鎖付加のパターンが、本来のパターンと異なるようなタイプの糖タンパク質の場合には、本発明の動物細胞内での系は、目的の（本来の）パターンの糖鎖が付加されたアロタンパク質を得るための有効な手段と考えられる。

（宿主）
本発明に用いられる、宿主の動物細胞としては、遺伝子組換え系が確立されている、哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。これらの宿主は、各々発現系が確立されており、適切な宿主細胞の選択は、当業者の技術範囲内である。

上記宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。これらは、例えば、Molecular Cloning 第３版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)などに記載された方法に準じて行なうことができる。従って、本発明の１つの実施形態として、上記ＴｙｒＲＳ変異体及びサプレッサーｔＲＮＡを発現し、かつ相互作用解析の対象となるタンパク質遺伝子を導入した組換え動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞が提供される。

次に、本発明に係るアロタンパク質の合成方法について説明する。最初に、（ａ）動物細胞内において、原核生物由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体と、原核生物由来のチロシンｔＲＮＡの変異体であるサプレッサーｔＲＮＡとを発現させる。例えば、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞内に上記遺伝子をコードする発現ベクターを導入し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ギブコ）等の増殖に適した培地中、３７℃程度の温度で適当な時間インキュベートする。続いて、或いはこれと同時に、（ｂ）前記細胞内に、所望の位置にナンセンス変異を受けたタンパク質遺伝子を導入し、そして（ｃ）フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸の存在下において、前記遺伝子にコードされたタンパク質を発現させる。前記非天然型アミノ酸は、培地中に０．１〜１ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ程度添加することにより、動物細胞自身の働きで細胞内に取り込まれる。細胞内で当該非天然型アミノ酸はＴｙｒＲＳ変異体の働きによってサプレッサーｔＲＮＡに結合する。その後、当該アミノアシルｔＲＮＡがリボソーム上にて、目的タンパク質の所望の位置に存在するナンセンスコドンの翻訳に用いられる。

上記動物細胞内で発現したアロタンパク質が、その動物細胞内で他のタンパク質と相互作用している場合、その動物細胞に特定波長の光を照射することにより該アロタンパク質に取り込まれた非天然型アミノ酸が、該他のタンパク質と共有結合を形成する。当該非天然型アミノ酸はフェニルジアジリン基を有するため、凡そ３５０〜３８０ｎｍ付近、好ましくは３６０〜３７０ｎｍの波長の光の照射により、ジアジリン環が開裂して反応性のカルベン中間体が生成する。これが相互作用する他のタンパク質と炭素−炭素共有結合によるクロスリンクを生成する。照射時間に特に制限はないが、例えば、１０秒〜１時間であり、好ましくは３０分以内である。照射は、例えば、細胞を適当な緩衝液で洗浄した後、水浴上で行なうことが好ましい。

タンパク質相互作用を検出する工程は、ウェスタンブロット法等公知の検出方法を用いることができる。例えば、細胞を緩衝液で溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜等に移した後、適当な一次抗体、二次抗体を用いて検出することができる。

本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］動物細胞内で発現するβ−ガラクトシダーゼへの部位特異的ＴｍｄＰｈｅ導入
β−ガラクトシダーゼに部位特異的にＴｍｄＰｈｅを導入し、その導入効率をβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を指標にして調べた。ＴｍｄＰｈｅを特異的に認識する大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体の遺伝子は、大腸菌由来の野生型ＴｙｒＲＳ遺伝子を鋳型として、種々の変異プライマーを用いたＰＣＲにより部位特異的変異を導入して調製した。本実施例で用いた種々のＴｙｒＲＳ変異体は、Hino et al. Nature Methods (2005) Vol.2, pp.201-0206、国際公開第２００４／０９４５９３号パンフレット、及びChin et al.（上掲の非特許文献４）によりすでに報告されており、その内容は参照により本願明細書に組み込まれる。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の９１位のチロシンコドンを、Quik Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いてアンバーコドンに変換し、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｚｅｏ耐性）のマルチクローニング部位にクローン化した（ｌａｃＺ（９１ａｍｂｅｒ））。バチルス・ステアロサーモフィラス由来のサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子の発現プラスミドｐＢｓｔＲＮＡは本発明者らによりすでに報告されている（Sakamoto, K. et al., Nucleic Acids Research 30, 4692-4699(2002)及び国際公開第２００４／０３９９８９号パンフレット参照）。これらのプラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ−ＴＲｅｘ細胞)に同時に形質導入した。形質導入は、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用い、そのマニュアルに沿って行った。培養液中に０．１〜０．５ｍＭのＴｍｄＰｈｅを添加し、１６時間培養した。細胞からタンパク質を回収し、レポーターアッセイキットβ−Ｇａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｌａｃＺ酵素活性を調べた。その結果を図３及び図４に示す。なお、これらの図の縦軸は、発光基質であるＬｕｍｉ−Ｇａｌ５３０の化学発光強度をパーキネルマー社の測定装置ＦＵＳＩＯＮにて測定した結果である。

図３は、以下の表１に示した試料（９種類の変異体ＴｙｒＲＳ酵素と野生型ＴｙｒＲＳとを含む。）を用い、０．５ｍＭのＴｍｄＰｈｅ（有限会社新成化学社製）を添加又は無添加のときのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。

図３に示したように、大腸菌ＴｙｒＲＳの３７位のチロシンがバリンに、及び１８２位のアスパラギン酸がセリンに変異したＴｙｒＲＳ変異体（試料番号１、３及び４、表１の変異導入部位に下線を示した。）がＴｍｄＰｈｅ存在下においてサプレッション活性を有することが分かった。続いて、サプレッション活性を示した上記３種類の変異体を含む以下の表２の変異体ＴｙｒＲＳを用いて、０．１ｍＭ及び０．５ｍＭのＴｍｄＰｈｅを添加又は無添加のときのβ−ガラクトシダーゼ活性を図４に示した。

図４に示したように、大腸菌ＴｙｒＲＳの３７位のチロシンがイソロイシンに、１８２位のアスパラギン酸がグリシンに、１８３位のフェニルアラニンがメチオニンに、そして１８６位のロイシンがアラニンに変異したＴｙｒＲＳ変異体（試料番号４）が最も高いサプレッション活性を示すことが分かった。意外なことに、この変異体酵素は、Chin et al.によりアセチルフェニルアラニンに対する特異性を有するＴｙｒＲＳ変異体（ＡｃＰｈｅＲＳ−１）として報告されていたものである。また、この変異体酵素は、野生型ＴｙｒＲＳを用いた場合（この場合は、アンバーコドンにチロシンが導入される。）と比べて５０％以上の導入効率を示すことも分かった。一般的に、同様の方法を用いてｐＢｐａを導入したときの導入効率は、野生型ＴｙｒＲＳを用いてチロシンを導入した場合の約５０％以下である（比較例参照）ことから、ｐＢｐａよりもＴｍｄＰｈｅの方が導入効率において優れていることが示唆される。

［実施例２］動物細胞内で発現するグルタチオンＳトランスフェラーゼへの部位特異的ＴｍｄＰｈｅ導入とクロスリンク
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のダイマー表面領域に部位特異的にＴｍｄＰｈｅ、又はｐＢｐａを導入した。さらに、細胞内でクロスリンクが生じるのに必要な光照射の時間を比較した（図５）。

ＧＳＴ遺伝子の５２番目のフェニルアラニンコドンをアンバーコドンに置換した遺伝子と、アンバーサプレッサーであるＢｓｔ−ｔＲＮＡの遺伝子と、大腸菌由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の遺伝子（ＴｍｄＰｈｅ導入のためにはｉｏｄｏＰｈｅＲＳ−３、ｐＢｐａ導入のためにはｐＢｐａＲＳ）をＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ細胞に同時に導入した。培養液中に０．５ｍＭのＴｍｄＰｈｅもしくは１ｍＭのｐＢｐａを添加した後１６時間培養することで細胞中にＴｍｄＰｈｅを含むＧＳＴもしくはｐＢｐａを含むＧＳＴを発現させた。これらの細胞に３６５ｎｍの波長を持つ光を１０分ないし３０分照射したところ、ＧＳＴにＴｍｄＰｈｅを導入した群では１０分間の光照射でクロスリンク体が有意に生成するのに対し、ｐＢｐａを導入した群では３０分間の光照射が必要であった。

ＧＳＴには，Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されるように設計してある。細胞抽出液から、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降法によってＧＳＴモノマーおよびクロスリンクダイマーを精製し、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開した。さらにＰＶＤＦ膜に転写し，抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったところ、図５に示したように、３０ｋＤａ付近にＧＳＴモノマーが、ＴｍｄＰｈｅの場合は６０ｋＤａ付近にクロスリンクダイマーが、ｐＢｐａの場合は５０ｋＤａ及び７０ｋＤａ付近にクロスリンクダイマーが検出された。この結果より、導入する光反応基の違い（ｐＢｐａ又はＴｍｄＰｈｅ）によって、クロスリンク反応が起こる部位に違いがあることが示唆される。

［比較例１］動物細胞内で発現するβ−ガラクトシダーゼへの部位特異的ｐＢｐａ導入
β−ガラクトシダーゼに部位特異的にｐＢｐａを導入し，その効率をβガラクトシダーゼの酵素活性を指標に調べた（図６）。ｌａｃＺ遺伝子の９１番目のチロシンコドンをアンバーコドンに置換した遺伝子と、大腸菌由来チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の遺伝子（ｐＢｐａＲＳ）と、アンバーサプレッサーであるＢｓｔ−ｔＲＮＡの遺伝子とをＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ細胞に同時に導入した。培養液中に０．１−１．０ｍＭのｐＢｐａを添加し、１６時間培養した。細胞からタンパク質を回収し、レポーターアッセイキットβ−Ｇａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｌａｃＺ酵素活性を調べた。その結果を図６に示した。サプレッション効率はｐＢｐａを０．５ｍＭ加えた時に最大となり，野生型チロシルｔＲＮＡ合成酵素を用いてアンバーコドンにチロシンを導入した時の約５０％の活性があった。

本発明の方法は、動物細胞内におけるタンパク質相互作用の解析を行うための分析用、研究用試薬のみならず、生命科学分野における研究の促進を通じて、医薬、健康産業において有用である。

大腸菌ＴｙｒＲＳ（野生型）の活性部位と、そこに結合した基質チロシンの立体構造を表した模式図である。 Ｌ−４’−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）フェニルアラニン（ＴｍｄＰｈｅ）の構造式である。 種々の変異体ＴｙｒＲＳを用いて、動物細胞内における部位特異的ＴｍｄＰｈｅの導入効率をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた結果である。 培養液に添加するＴｍｄＰｈｅの濃度を変えて、図３と同様の実験を行った結果である。 動物細胞内で発現するグルタチオンＳトランスフェラーゼへ部位特異的にＴｍｄＰｈｅ又はｐＢｐａを導入し、光照射によるクロスリンクを行った結果である。 動物細胞内で発現するβ−ガラクトシダーゼへの部位特異的ｐＢｐａ導入効率を調べた結果である。

Claims (5)

1. （ａ）Ｙ３７Ｉ、Ｄ１８２Ｇ、Ｆ１８３Ｍ、及びＬ１８６Ａからなるアミノ酸置換を有する大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、Ｙ３７Ｖ、Ｄ１８２Ｓ、及びＦ１８３Ｙ若しくはＦ１８３Ｍからなるアミノ酸置換を有する大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、又は、Ｙ３７Ｖ、Ｄ１８２Ｓ、Ｆ１８３Ｍ、及びＬ１８６Ａからなるアミノ酸置換を有する大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体と、原核生物由来のチロシンｔＲＮＡの変異体であるサプレッサーｔＲＮＡと、を動物細胞内で発現させ、
   （ｂ）前記動物細胞内に、所望の位置にナンセンス変異を受けたタンパク質遺伝子を導入し、そして
   （ｃ）フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸の存在下において、前記遺伝子にコードされたタンパク質を発現させることを特徴とする、光反応性非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の合成方法。
2. 前記フェニルジアジリン基を有する非天然型アミノ酸が、Ｌ−４’−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）フェニルアラニン（ＴｍｄＰｈｅ）である請求項１に記載の方法。
3. 前記サプレッサーｔＲＮＡが由来する原核生物が、バチルス・ステアロサーモフィラスである請求項１又は２に記載の方法。
4. 請求項１〜３の何れか一項に記載の方法により合成したタンパク質を含む動物細胞に、特定波長の光を照射することを特徴とするタンパク質のクロスリンク方法。
5. 請求項４に記載の方法によりクロスリンクさせたタンパク質を解析することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法。