JP4936290B2 - 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法、当該製造方法に使用する宿主細胞及び当該製造方法に使用する無細胞タンパク質合成系試薬キットに関する。

天然のタンパク質は、天然に存在する２０種類のアミノ酸（以下、天然型アミノ酸と称する）から構成される。タンパク質の構造や機能を解析したり、その化学的性質を拡張する場合、アミノ酸配列における所望の位置に、天然に存在しないアミノ酸（以下、非天然型アミノ酸と称する）を組み込む手法が知られている。なお、非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質をアロプロテインと称する。
ところで、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（以下、ａａＲＳと称する）は、特定のアミノ酸と特定のｔＲＮＡとを特異的に結合させる酵素であり、生物種ごとに、一部の例外を除き２０種類の天然型アミノ酸それぞれに対応して２０種類存在する。アロプロテインを合成する場合、非天然型アミノ酸に対応する新たなａａＲＳ（以下、ａａＲＳ＊と称する）及び天然型アミノ酸をコードしないコドンと対合するｔＲＮＡ（以下、ｔＲＮＡ＊と称する）を宿主細胞に組み込み、正確に機能させる必要がある。すなわち、宿主細胞において、本来は天然型アミノ酸をコードしないコドンに、ａａＲＳ＊によって非天然型アミノ酸を結合したｔＲＮＡ＊を対合させ、非天然型アミノ酸を組み込んだアロプロテインを合成することができる。
このとき、ａａＲＳ＊は、特定の天然型アミノ酸に特異的な既存のａａＲＳをベースとして、この特定の天然型アミノ酸と類似する非天然型アミノ酸を基質とする活性を持たせるように機能改変することによって作出される。例えば、チロシン（天然型アミノ酸）に類似するＯ−メチルチロシン（非天然型アミノ酸）に特異的なａａＲＳ＊を作出する際には、既存のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）をベースとして、Ｏ−メチルチロシンに対する特異性が高められたＴｙｒＲＳ変異体を作出する。このように作出したａａＲＳ＊を使用してアロプロテインを合成する場合、宿主細胞が本来的に備える２０種類の天然型アミノ酸及びこれらに対応するｔＲＮＡと反応せず、所定の非天然型アミノ酸及びｔＲＮＡ＊と特異的に反応するａａＲＳ＊を使用しなければならない。
したがって、ａａＲＳ＊は、所定の非天然型アミノ酸に対する特異性が、既存の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて十分に高められたａａＲＳ＊を用いる。そうでなければ、所定の非天然型アミノ酸が導入されるべき位置に天然型アミノ酸が導入されたタンパク質が合成されてしまうからである。また、ａａＲＳ＊が、ｔＲＮＡ＊以外に宿主細胞に本来的に備わっているｔＲＮＡとも反応するならば、非天然型アミノ酸を導入すべき位置以外にも、天然型アミノ酸であるべき位置に非天然型アミノ酸が導入されることになる。この問題が起こらないためには、宿主細胞として原核細胞を使用する場合、ａａＲＳ＊は真核生物タイプのａａＲＳをベースに構築したａａＲＳ＊を使用する。なぜなら、真核生物タイプのａａＲＳは原核生物のｔＲＮＡとは反応しにくいからである。なお、ここで“真核生物タイプのａａＲＳ”とは、真核生物由来のａａＲＳまたは古細菌由来のａａＲＳを意味している。仮に、宿主細胞として原核細胞を使用し、原核生物由来のａａＲＳ＊を導入した場合、当該ａａＲＳ＊は、ｔＲＮＡ＊のみならず、宿主に本来備わった天然型アミノ酸に対応するｔＲＮＡを基質として複数種のアミノアシルｔＲＮＡを合成してしまう虞があり、この場合には上記の理由から、遺伝子の一意的なタンパク質への翻訳が困難となる。よって、宿主細胞として原核細胞を使用する場合、真核生物タイプのａａＲＳ＊を使用する。逆に、宿主細胞として真核生物タイプの細胞を使用する場合、ａａＲＳ＊は原核生物由来のａａＲＳをベースに構築するものを使用する。
以上のように、アロプロテインを合成する場合、使用する宿主細胞が真核細胞であるか原核細胞であるかによって、適切なａａＲＳ＊を作出しなければならない。宿主細胞が真核生物タイプであるか原核細胞であるかに拘わらず、いずれの場合において使用可能なａａＲＳ＊はまれである。したがって、特定の非天然型アミノ酸を組み込んだアロプロテインを真核生物タイプの細胞及び原核細胞で合成しようとすると、原核生物由来のａａＲＳ＊及び真核生物タイプのａａＲＳ＊を作出する必要がある。ところが、ａａＲＳ＊の作出には、非天然型アミノ酸を基質とする活性を持たせるように既存のａａＲＳの機能改変を成功させなければならず、多大な労力を要するといった問題がある。
ＷＯ２００３／０１４３５４ ＷＯ２００４／０３９９８９

そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、原核生物由来のａａＲＳ＊及び真核生物タイプのａａＲＳ＊のいずれか一方を用い、原核細胞及び真核生物タイプの細胞のいずれも宿主細胞として使用することができるアロプロテインの製造方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成した本発明に係るアロプロテインの製造方法は以下の工程を含む。
（ａ） 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子とを、上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子とを発現する原核細胞に導入する工程
（ｂ） 上記原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のｔＲＮＡ遺伝子とをノックアウトする工程
（ｃ） 上記非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子のアンチコドンに対合するコドンを有する目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、上記原核細胞中で発現させる工程
以上の本発明に係るアロプロテインの製造方法では、上記アンチコドンに対合するコドンの位置に上記非天然型アミノ酸を取り込ませ、原核細胞において所望のアロプロテインを製造することができる。なお、本発明において使用する原核生物由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、原核細胞においてアロプロテインを合成する系に限定されず、真核細胞でアロプロテインを合成する系にも適用することができる。
また、本発明に係るアロプロテインの製造方法は、以上のような原核細胞を宿主細胞として使用する系に限定されず、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を使用して真核生物タイプの細胞を宿主細胞として使用する系にも適用することができる。
また、本発明に係る原核細胞は、以下の特徴を有している。
（ａ） 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子とが導入されている
（ｂ） 原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のｔＲＮＡ遺伝子とがノックアウトされている。
以上のような特徴を有する本発明に係る原核細胞は、非天然型アミノ酸と類似する天然型アミノ酸を組み込む際には、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びこれに対応する真核生物タイプのｔＲＮＡを使用することとなる。
さらに、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、少なくとも以下の要素を含む。
（ａ） 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体
（ｂ） 上記原核生物由来アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の存在下で上記非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ
（ｃ） 上記非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液
（ｄ） 上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子とが導入されるとともに、原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のｔＲＮＡ遺伝子とがノックアウトされた原核細胞の抽出液
以上のような無細胞タンパク質合成系試薬キットを使用した場合、非天然型アミノ酸と類似する天然型アミノ酸を組み込む際には、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びこれに対応する真核生物タイプのｔＲＮＡを使用することとなる。なお、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、以上のような原核細胞の抽出液を使用する系に限定されず、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を使用して真核細胞の抽出液を使用する系にも適用することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３３８４０２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及びＴＯＰ１０株をそれぞれプラスミド２５４１ｓｕｐＦで形質転換した後、クロラムフェニコール含有培地及びクロラムフェニコール非含有培地で培養した結果を示す写真である。
図２は、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及びＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株にそれぞれ大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株をブロモチロシン含有培地及びブロモチロシン非含有培地において生育したときの増殖曲線を示す特性図である。
図３は、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及びＴＯＰ１０株について、それぞれ染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動によって確認した結果を示す写真である。

以下、本発明をより詳細に説明する。
アロプロテインは、非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質として定義される。本発明に係る非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法（以下、アロプロテインの製造方法と称する）は、原核生物由来又は真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（以下、ａａＲＳ＊と称する）を使用するが、宿主細胞の種類、すなわち原核細胞、真核生物タイプの細胞、原核細胞由来の無細胞タンパク質合成系或いは真核生物タイプの細胞由来の無細胞タンパク質合成系であるかを問わず、広く如何なる宿主細胞に対してもａａＲＳ＊を使用することができる。
なお、本発明において、「真核生物タイプ」とは、真核生物及び古細菌を含む意味である。従って、「真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素」と表現した場合、真核生物由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及び古細菌由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含む意味である。
非天然型アミノ酸
本発明において、非天然型アミノ酸とは、２０種類の天然型アミノ酸とは異なる構造を有するアミノ酸である。非天然型アミノ酸は、天然型アミノ酸に類似する構造を有するため、特定の天然型アミノ酸の誘導体又は類似体として分類される。例えば、非天然型アミノ酸としては、天然型アミノ酸であるチロシンの誘導体である３位置換チロシン、４位置換チロシンを挙げることができる。３位置換チロシンとしては、３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン等の３−ハロゲン化チロシンが挙げられる。４位置換チロシンとしては、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−チロシン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン等を挙げることができる。
また、非天然型アミノ酸としては、チロシン誘導体に限定されず、例えば、アジドアラニン、アジドホモアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、４−アミノトリプトファン、７−アザトリプトファン、６−メチルトリプトファン、アセチルリジン、ε−ボクリジン、ε−メチルリジン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、スチリルアラニン、ジフェニルアラニン、チアゾリルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、アントリルアラニン、２−アミノ−５−ヘキシノイン酸、フリルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、チエニルアラニン、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ホスホリルセリン、ホスホリルトレオニン、２，３−ジアミノプロピオン酸等を挙げることができる。
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体
本発明において、ａａＲＳ＊とは、所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた変異型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を意味する。特異性が高められたとは、非天然型アミノ酸に対する活性値（反応速度Ｋ_ｃａｔをミカエリス定数Ｋ_ｍで割った値）が、天然型アミノ酸に対する活性値よりも有意に大となっていることを意味する。活性値は、インビトロのアッセイによって測定することができるが、遺伝学的なデータから活性値の相対的な大きさを判定することもできる。
このように定義されるａａＲＳ＊は、天然型アミノ酸に対応する既知のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の所定の位置に変異を導入することによって取得することができる。天然型アミノ酸に対応する既知のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、アミノアシルｔＲＮＡを合成するに際して、先ず、アミノ酸を特異的に認識してＡＭＰを付加することで活性化する。既知のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素については、アミノ酸の特異的な認識に寄与する部位が知られており、当該部位に変異を導入することによってその特異性を変化させることができる。このような知見に基づけば、天然型アミノ酸に対する特異性を低減して、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性を高めるような変異を導入することができる。このように、既知のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素における所定の部位に変異を導入することによって、所望の特異性を有するａａＲＳ＊を作製することができる。
このようなａａＲＳ＊は、原核生物及び真核生物タイプのいずれを由来としてもよいが、原核生物に由来するａａＲＳ＊の一例としては、３−ヨード−Ｌ−チロシン（非天然型アミノ酸）に対する特異性がチロシン（天然型アミノ酸）に対する特異性に比べて高められたａａＲＳ＊（変異ＴｙｒＲＳと称する）を挙げることができる。変異ＴｙｒＲＳは、下記の文献に記載されている。Ｋｉｇａ，Ｄ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｋ．，Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．，Ｙａｂｕｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｒｏｕｚｕ，Ｍ．，Ｈａｒａｄａ，Ｙ．，Ｎａｋｌａｙａｍａ，Ｈ．，Ｔａｋｉｏ，Ｋ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｙ．，Ｅｎｄｏ，Ｙ．，Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ａｎｄ Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００２）Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，９７１５−９７２３．
この文献によれば、大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素における３７位のチロシン（Ｙ）及び１９５位のグルタミン（Ｑ）に相当する位置を他のアミノ酸に置換することで、３−ハロゲン化チロシン（非天然型アミノ酸）への特異性が高められた変異体を得ることができる。さらに好ましくは、３７位チロシン（Ｙ）に相当する位置がバリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）又はアラニン（Ａ）で置換され、且つ、１９５位グルタミン（Ｑ）に相当する位置がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換された変異体を使用できる。これらの変異体は、特に３−ヨード−Ｌ−チロシンに対する特異性が高められている。
なお、このような変異体をコードする遺伝子を製造する方法は、公知の遺伝子操作技術により容易に行うことができる。例えば、部位特異的変異導入法と呼ばれる手法により、或いは、部位特異的変異導入法を実施するための市販のキットを使用して変異体をコードする遺伝子を製造することができる。
また、その他の原核生物に由来するａａＲＳ＊としては、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｒｏｐｐ，Ｔ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｓｃｈｌｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７に記載されたもの、及びＤｅｉｔｅｒｓ，Ａ．，Ｃｒｏｐｐ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｍ．，Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．．（２００３）Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１１７８２−１１７８３に記載されたものを挙げることができる。
一方、真核生物タイプに由来するａａＲＳ＊の一例としては、Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，１０４４−１０４８（２００２）に記載されたもの、及びＷａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．：Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，４９８−５００（２００１）に記載されたものを挙げることができる。
非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子
非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子とは、上述したａａＲＳ＊により認識されるとともに、活性化された非天然型アミノ酸が転移する３’末端を有するｔＲＮＡをコードする遺伝子である。すなわち、上述したａａＲＳ＊は、特定の非天然型アミノ酸を認識して、非天然型アミノ酸−ＡＭＰを合成するとともに、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡの３’末端に非天然型アミノ酸を転移させる活性を有している。
ここで、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡは、２０種類の天然型アミノ酸に対応するコドン以外の遺伝暗号に対して特異的に対合するアンチコドンを有している。非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンは、ＵＡＧアンバーコドン、ＵＡＡオーカーコドン及びＵＧＡオパールコドンからなるナンセンスコドンに対合する配列であることが好ましい。言い換えると、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡは、ナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡであることが好ましい。なかでも、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡのうちＵＡＧ（アンバーコドン）に対合するアンチコドンを有するものであることが好ましい。その理由の１つは、オパールコドンは低い効率でトリプトファンに翻訳されることがあり、このコドンを用いたとき非天然型アミノ酸とトリプトファンの２種類のアミノ酸に翻訳される虞があるために、オパールコドンは用いることが適当でないからである。もう１つの理由は、アンバーコドンは３字目にＧを持つからである。コドン３字目とアンチコドン１字目の塩基対形成は比較的不安的であり、この位置に安定なＧＣ塩基対を形成することは、サプレッサーｔＲＮＡがＵＡＧコドンを非天然型アミノ酸に効率よく翻訳する上で有利になるからである。
上述したａａＲＳ＊として原核生物由来のａａＲＳの変異体を使用する場合、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子としては、同じ原核生物由来のｔＲＮＡ遺伝子を使用することができる。特に、上述した大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳを使用する場合、大腸菌由来のサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を使用することが好ましい。
また、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンとしては、終止コドンに対応する配列に限定されず、４塩基以上のコドンと特異的に対合する配列からなるものであっても良い。その他にも、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンとしては、非天然の塩基を含むものであってもよい。この場合には、その非天然塩基と特異的に塩基対を形成することができる別種の非天然塩基をコドンの対応する位置に導入する。このような非天然塩基のペアとしては、イソグアニンとイソイチジン、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリンとピリジン−２−オンが挙げられる。
宿主細胞
上述したａａＲＳ＊遺伝子及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子が原核生物由来であるか真核生物タイプであるかに拘わらず、宿主細胞としては真核生物タイプの細胞及び原核細胞のいずれであっても良い。
原核生物由来のａａＲＳ＊遺伝子及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子を使用し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には、当該原核細胞において、ａａＲＳ＊の基質となる非天然型アミノ酸と類似する天然型アミノ酸に対する特異性を有するａａＲＳをコードする遺伝子（以下、「対応する原核細胞内在ａａＲＳ遺伝子」と称する）と、当該対応する原核細胞内在ａａＲＳ遺伝子の存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子（以下、「対応する原核細胞内在ｔＲＮＡ遺伝子」と称する）とを、真核生物タイプのａａＲＳ遺伝子（以下、「対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子」と称する）とｔＲＮＡ遺伝子（以下、「対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子」と称する）とに置き換えるようにする。
より具体的には、宿主細胞が原核細胞である場合、当該原核細胞において、対応する原核細胞内在ａａＲＳ遺伝子及び対応する原核細胞内在ｔＲＮＡ遺伝子をノックアウトするとともに、当該原核細胞に、対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子及び対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子を導入する。原核生物由来のａａＲＳ＊は、対応する真核生物タイプｔＲＮＡをアミノアシル化することなく、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのみをアミノアシル化することとなる。また、対応する真核生物タイプａａＲＳは、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡをアミノアシル化することなく、対応する真核生物タイプｔＲＮＡのみをアミノアシル化することとなる。
ここで、原核細胞に、対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子及び対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子を導入する場合、これら対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子及び対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子を発現可能な形で導入した発現ベクターを使用する方法、及びこれら対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子及び対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子を発現可能な形で原核細胞のゲノムに導入する方法のいずれを用いても良い。導入した遺伝子を高発現させることができ、アロプロテインを効率よく合成できるといった理由から発現ベクターを用いる方法が好ましい。
このように調製した原核細胞では、導入対象の非天然型アミノ酸に類似する天然型アミノ酸については、真核生物タイプａａＲＳ及びｔＲＮＡによってタンパク質に組み込まれることとなり、目的とするアミノ酸配列を有するアロプロテインを正確に合成する際の宿主細胞として利用することができる。
ここで宿主細胞として使用できる原核細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌等を挙げることができる。
また、上述した大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳを使用する場合、真核生物タイプａａＲＳとしてはメタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を使用することができる。メタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれるいずれか一のタンパク質から構成されている。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンを活性化するとともにチロシルｔＲＮＡを合成する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、チロシンを活性化するとともにチロシルｔＲＮＡを合成する活性を有するタンパク質
さらに、上述した大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳを使用する場合、真核生物タイプｔＲＮＡとしてはメタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシンｔＲＮＡ遺伝子を使用することができる。メタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシンｔＲＮＡは、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれるいずれか一のポリヌクレオチドから構成される。
（ａ）配列番号１における４３３４〜４４１０番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１における４３３４〜４４１０番目に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、活性化されたチロシンをメタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１における４３３４〜４４１０番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダイズし、活性化されたチロシンをメタノコッカス・ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
なお、ここでストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイズが形成されるが非特異的なハイブリダイズは形成されない条件を意味する。例えば、緩衝液として６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム）、温度５５℃といった条件を挙げることができる。
ところで、原核生物由来のａａＲＳ＊遺伝子及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子を使用し、宿主細胞として真核生物タイプの細胞を使用する場合には、当該真核生物タイプの細胞が本来的に有している、天然型アミノ酸に特異的なａａＲＳ及び当該ａａＲＳの存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子を何ら置換すること無く使用することができる。言い換えれば、この場合、宿主細胞となる真核生物タイプの細胞はそのまま使用することができる。
ここで宿主細胞として使用できる真核生物タイプの細胞は、特に限定されないが、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞等の真核細胞並びに古細菌を挙げることができる。なかでも遺伝子組換え系が確立されている哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的には、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胚腎臓系（２９３細胞）、チャイニーズハムスター卵巣／−ＤＨＦＲ系、マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）及びマウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２）を挙げることができる。
一方、真核生物タイプのａａＲＳ＊遺伝子及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子を使用し、宿主細胞として真核生物タイプの細胞を使用する場合には、当該真核生物タイプの細胞において、ａａＲＳ＊の基質となる非天然型アミノ酸と類似する天然型アミノ酸に対する特異性を有するａａＲＳをコードする遺伝子（以下、「対応する真核生物内在ａａＲＳ遺伝子」と称する）と、当該対応する真核生物内在ａａＲＳ遺伝子の存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子（以下、「対応する真核生物内在ｔＲＮＡ遺伝子」と称する）とを、原核生物由来のａａＲＳ遺伝子（以下、「対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子」と称する）とｔＲＮＡ遺伝子（以下、「対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子」と称する）とに置き換えるようにする。
より具体的には、宿主細胞が真核生物タイプの細胞である場合、当該真核生物タイプの細胞において、対応する真核生物内在ａａＲＳ遺伝子及び対応する真核生物内在ｔＲＮＡ遺伝子をノックアウトするとともに、当該真核生物タイプの細胞に、対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子及び対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子を導入する。真核生物タイプのａａＲＳ＊は、対応する原核細胞由来ｔＲＮＡをアミノアシル化することなく、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのみをアミノアシル化することとなる。また、対応する原核生物由来のａａＲＳは、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡをアミノアシル化することなく、対応する原核生物由来ｔＲＮＡのみをアミノアシル化することとなる。
ここで、真核生物タイプの細胞に、対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子及び対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子を導入する場合、これら対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子及び対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子を発現可能な形で導入した発現ベクターを使用する方法、及びこれら対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子及び対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子を発現可能な形で真核生物タイプの細胞のゲノムに導入する方法のいずれを用いても良い。導入した遺伝子を高発現させることができ、アロプロテインを効率よく合成できるといった理由から発現ベクターを用いる方法が好ましい。
このように調製した真核生物タイプの細胞では、導入対象の非天然型アミノ酸に類似する天然型アミノ酸については、原核生物由来のａａＲＳ及びｔＲＮＡによってタンパク質に組み込まれることとなり、目的とするアミノ酸配列を有するアロプロテインを正確に合成する際の宿主細胞として利用することができる。
また、真核生物タイプのａａＲＳ＊遺伝子及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子を使用し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には、当該原核細胞が本来的に有している、天然型アミノ酸に特異的なａａＲＳ及び当該ａａＲＳの存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子を何ら置換すること無く使用することができる。言い換えれば、この場合、宿主細胞となる原核細胞はそのまま使用することができる。
目的タンパク質及びその製造方法
上述したａａＲＳ＊遺伝子、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子及び宿主細胞を用いて、非天然型アミノ酸を組み込んだ目的タンパク質（アロプロテイン）を製造することができる。目的タンパク質の種類としては、何ら限定されるものではない。但し、目的タンパク質をコードする遺伝子において、所望の位置のコドンを上述した非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンと対合する配列としておく。これにより、所望の位置に非天然型アミノ酸を有するアロプロテインを製造することができる。具体的には、いわゆる部位特異的変異導入法によって野生型の遺伝子における所望の位置を、非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンと対合する配列に変異させることで、アロプロテインをコードする遺伝子を作製することができる。
作製した目的タンパク質をコードする遺伝子は、通常の方法によって宿主細胞に導入され、当該宿主細胞内で発現することとなる。宿主細胞においては、当該遺伝子における非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのアンチコドンに対合するコドンの位置に非天然型アミノ酸を組み込んだアロプロテインを合成することができる。
目的タンパク質（アロプロテイン）としては、何ら限定されないが、例えば、細胞情報伝達に関わる一群のタンパク質（上皮成長因子受容体、神経成長因子受容体、Ｇｒａｂ２タンパク質、Ｓｒｃキナーゼ、Ｒａｓタンパク質など）、翻訳に関わる一群のタンパク質（ポリペプチド伸長因子、開始因子、転写終結因子、リボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素など）や転写因子、膜タンパク質などが挙げられる。
得られたアロプロテインは、（ｉ）Ｘ線結晶解析による構造決定に用いたり、（ｉｉ）細胞情報伝達経路の解明のために光クロスリンクや部位特異的蛍光標識を施したり、（ｉｉｉ）薬効を高めるためのポリエチレングリコール化を部位特異的に施した上でタンパク質性薬剤として用いるなどの用途がある。さらに、部位特異的なアミノ酸置換によるタンパク質の機能解析において、置換に用いることのできるアミノ酸の種類は従来、天然の２０種類に限られていたが、非天然型アミノ酸を用いればこれに制限されることなく様々なアミノ酸残基に置換することができる。このようにして、一連の変異体を作成して解析することで、タンパク質中の特定部位のアミノ酸残基の役割を詳細に明らかにすることも可能である。
無細胞タンパク質合成系試薬キット
また、上述したａａＲＳ＊及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡは、いわゆる無細胞タンパク質合成系試薬キットの一部として使用することができる。一般に無細胞タンパク質合成系試薬キットは、各種細胞の抽出液をタンパク質合成能を欠損しない形で含んでいる。無細胞タンパク質合成系においては翻訳系、転写・翻訳系が知られており、それぞれ目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを反応液に加えることによって、抽出液に含まれる各種酵素の働きによりタンパク質を合成している。
本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、少なくとも、所定の天然型アミノ酸と類似する非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、上述したａａＲＳ＊及び非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡのセットと、宿主細胞の抽出液とを含むものである。また、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、一般に市販されている公知の無細胞タンパク質合成系試薬キットに含まれる、目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことができるベクターＤＮＡ溶液、目的タンパク質をコードする遺伝子の転写を行うためのＲＮＡポリメラーゼを含む試薬セット等を含んでいても良い。
特に、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、上述した宿主細胞の抽出液は、真核生物タイプの細胞及び原核細胞いずれの抽出液であっても良い。但し、原核生物由来ａａＲＳ＊を使用し、原核細胞の抽出液を使用する場合には、上述した「対応する原核細胞内在ａａＲＳ遺伝子」及び「対応する原核細胞内在ｔＲＮＡ遺伝子」をノックアウトし、「対応する真核生物タイプａａＲＳ遺伝子」及び「対応する真核生物タイプｔＲＮＡ遺伝子」を導入した原核細胞の抽出的を使用する。このとき、「ａａＲＳ＊遺伝子」及び「非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ遺伝子」を原核細胞にさらに導入するか、または、「ａａＲＳ＊」及び「非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ」をそのまま原核細胞の培養液に添加することにより、当該原核細胞の抽出液内に「ａａＲＳ＊」及び「非天然型アミノ酸用ｔＲＮＡ」を含ませることができる。
また、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、原核生物由来のａａＲＳ＊を使用し、真核生物タイプの細胞抽出液を使用する場合には、当該真核生物タイプの細胞が本来的に有している、天然型アミノ酸に特異的なａａＲＳ及び当該ａａＲＳの存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子を何ら置換すること無く使用することができる。言い換えれば、この場合、野生型の真核生物タイプの抽出液をそのまま使用することができる。
一方、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、真核生物タイプａａＲＳ＊を使用し、真核生物タイプの細胞抽出液を使用する場合には、上述した「対応する真核生物内在ａａＲＳ遺伝子」及び「対応する真核生物内在ｔＲＮＡ遺伝子」をノックアウトした真核生物タイプの細胞抽出液を使用する。このとき、「対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子」及び「対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子」を真核生物タイプの細胞に導入しておき、当該真核生物タイプの細胞抽出液内に「対応する原核生物由来ａａＲＳ」及び「対応する原核生物由来ｔＲＮＡ」を含ませることができる。また、「対応する原核生物由来ａａＲＳ遺伝子」及び「対応する原核生物由来ｔＲＮＡ遺伝子」の各産物は、抽出液に別途、添加しても良い。
また、本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、真核生物タイプのａａＲＳ＊を使用し、原核細胞の抽出液を使用する場合には、当該原核細胞が本来的に有している、天然型アミノ酸に特異的なａａＲＳ及び当該ａａＲＳの存在下で天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡ遺伝子を何ら置換すること無く使用することができる。言い換えれば、この場合、野生型の原核細胞の抽出液をそのまま使用することができる。
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

本実施例では、大腸菌由来のａａＲＳ＊（３−ヨード−Ｌ−チロシンに対する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異ＴｙｒＲＳ）を使用し、宿主細胞として大腸菌を用いたアロプロテインの製造方法を実証した。
先ず、以下のようにして変異ＴｙｒＲＳ遺伝子及びサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を準備した。
変異ＴｙｒＲＳ
大腸菌ＴｙｒＲＳ遺伝子を、大腸菌染色体から単離してクローニングする。このクローニングされた遺伝子に、チロシン→バリン（３７位）、アスパラギン→システイン（１９５位）というアミノ酸置換を施すことで、３−ヨード−Ｌ−チロシンに対する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異ＴｙｒＲＳ遺伝子を作製した。大腸菌染色体の調製、染色体から遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によって望みの遺伝子を単離すること、そして、単離された遺伝子を適当なベクターにクローニングすることは、公知の遺伝子操作技術によって容易に行うことができる。変異ＴｙｒＲＳ遺伝子の発現のためには、ＴｙｒＲＳ遺伝子本来のプロモータをＴｙｒＲＳ構造遺伝子とともに単離・クローニングすればよい。ベクターとしては、具体的にはプラスミドｐＢＲ３２２に由来するベクターが使用できる。
サプレッサーｔＲＮＡ ^Ｔｙｒ
ｔＲＮＡのように小さなサイズのＲＮＡの遺伝子は、全長を化学的な方法によって製造することができる。サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子の塩基配列は、ＧＧＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡである。この遺伝子の前に、ｌｐｐ遺伝子由来の転写プロモータを大腸菌染色体から単離して連結し、遺伝子の後ろには、化学合成法によって製造したｒｒｎＣ遺伝子由来の転写終結配列を連結した。連結後の全長の塩基配列は、ＧＣＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＣＡＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣである。この塩基配列を変異ＴｙｒＲＳ遺伝子とともにｐＢＲ３２２由来のベクターにクローニングした。
プラスミドｐＥｃＩＹＲＳ
上述の作製した変異ＴｙｒＲＳ遺伝子及びサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を有するプラスミドをｐＥｃＩＹＲＳと名づける。このプラスミドを導入した大腸菌において、変異ＴｙｒＲＳ遺伝子はそれ自身の転写プロモータから、サプレッサーｔＲＮＡはｌｐｐプロモータから恒常的に発現する。
「対応する真核生物タイプａａＲＳ」及び「対応する真核生物タイプｔＲＮＡ」発現プラスミドの構築
本実施例では、「対応する真核生物タイプａａＲＳ」及び「対応する真核生物タイプｔＲＮＡ」として古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳ及びチロシンｔＲＮＡを宿主細胞内で発現させることとした。これらＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＴｙｒＲＳ遺伝子及びチロシンｔＲＮＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＴＫ３は以下のように構築した。なお、プラスミドｐＴＫ３の全塩基配列を配列番号１に示す。なお、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳ遺伝子は、配列番号１における３２８４〜４２０４番目の塩基配列からなる。古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのチロシンｔＲＮＡ遺伝子は、配列番号１における４４１０〜４３３４番目の塩基配列からなる。さらに、プラスミドｐＴＫ３に含まれるカナマイシン耐性遺伝子は、配列番号１における４８４７〜５６６２番目の塩基配列からなる。カナマイシン耐性遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
プラスミドｐＴＫ３の構築の概要は次の通りである。大腸菌染色体からＴｒｐＲＳ遺伝子のプロモータ領域をＰＣＲ法によって単離してｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングした。このプラスミドをｐＰＴＲＰとする。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳ遺伝子は、同菌の染色体からＰＣＲ法によって単離し、プラスミドｐＰＴＲＰ上のＴｒｐＲＳプロモータ部位の直後にクローニングし、プラスミドｐＭｊＹＳを作製した。大腸菌染色体の調製、染色体から遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によって望みの遺伝子を単離すること、そして、単離された遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングすることは、公知の遺伝子操作技術によって容易に行うことができる。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのチロシンｔＲＮＡ遺伝子は、全長を化学的な方法によって製造をおこなった。この遺伝子の前に、ｌｐｐ遺伝子由来の転写プロモータを大腸菌染色体から単離して連結し、遺伝子の後ろには、化学合成法によって製造したｒｒｎＣ遺伝子由来の転写終結配列を連結した後、プラスミドｐＭｊＹＳ上にクローニングしてプラスミドｐＭｊＹＲＳを作製した。カナマイシン耐性遺伝子は、市販されているプラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）上にクローニングされている同遺伝子をＰＣＲ法によってとりだしてプラスミドｐＭｊＹＲＳにクローニングして、プラスミドｐＴＫ３を作製した。
以上のようにして得られたプラスミドｐＴＫ３を用いて、大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換した。エレクトロポレーション法を用いた形質転換に適した処理を施されたＴＯＰ１０株が市販されている（インビトロジェン社）ので、これを使用した。
「対応する原核生物由来ａａＲＳ」及び「対応する原核生物由来ｔＲＮＡ」のノックアウト
本実施例では、宿主細胞の大腸菌ＴＯＰ１０株における、チロシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子（ｔｙｒＳ遺伝子）及びチロシンｔＲＮＡ遺伝子（ｔｙｒＴ遺伝子及びｔｙｒＵ遺伝子）をノックアウトした。
本実施例では、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ社製のＱｕｉｃｋ ａｎｄ ｅａｓｙ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（以下，ＱＢＭキット）を使用して、プラスミドｐＴＫ３によって形質転換されたＴＯＰ１０株において、ｔｙｒＳ遺伝子、ｔｙｒＴ遺伝子及びｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトした。なお、各遺伝子をノックアウトする順番は実施例に示す順に限定されるものではなく、各遺伝子が最終的にノックアウトされていれば良い。ＱＢＭキットは、人工バクテリア染色体（ＢＡＣ）を操作するためのものだが、大腸菌染色体上の遺伝子をノックアウトする目的でも用いることができる。実験操作はキットに添付の説明書に準じた。すなわち、染色体上から除去したい遺伝子ｘ（ｔｙｒＳ遺伝子、ｔｙｒＴ遺伝子又はｔｙｒＵ遺伝子）に、染色体上で隣接する２つの塩基配列（いずれも５０塩基程度）をそれぞれ配列ｘ−Ｌ、ｘ−Ｒとする。ｘ−Ｌ、ｘ−Ｒを持つ一対のプライマーを用いてマーカーとなる遺伝子をＰＣＲで増幅すると，マーカー遺伝子の両側にｘ−Ｌ及びｘ−Ｒが連結したＤＮＡが得られる．このＤＮＡを、ＱＢＭキットを用いて染色体上にノックインすると、遺伝子ｘがマーカー遺伝子に置換した大腸菌を得ことができる。
染色体上にノックインされたマーカー遺伝子を除去する場合を考慮すると、マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子ではなく，クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を用いるのが望ましい。本実施例ではマーカー遺伝子としてＣＡＴ遺伝子を使用した。
（１）ｔｙｒＳ遺伝子のノックアウト
ｔｙｒＳ遺伝子をノックアウトするため、上記ｘ−ＬとしてｔｙｒＳ−Ｌ及び上記ｘ−ＲとしてｔｙｒＳ−Ｒを決定した。
ｔｙｒＳ−Ｌ：ＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧ（配列番号４）
ｔｙｒＳ−Ｒ：ＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＣＧＣＴＡＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＴＧＴＴＴＡ（配列番号５）
ｔｙｒＳ−Ｌを有するプライマーとしてｔｙｒＳＬ−ＣｍＦ、ｔｙｒＳ−Ｒを有するプライマーとしてｔｙｒＳＲ−ＣｍＲ１を設計し、化学合成によってこれらプライマーを作製した。
ｔｙｒＳＬ−ＣｍＦ（７０塩基）：
ＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＣＣＧ（配列番号６）
ｔｙｒＳＲ−ＣｍＲ１（７１塩基）：
ＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＣＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号７）
これらｔｙｒＳＬ−ＣｍＦ及びｔｙｒＳＲ−ＣｍＲ１を用い、鋳型としてベクターｐＡＣＹＣ１８４を用いたＰＣＲを行うことによって、両端にｔｙｒＳ−Ｌ及びｔｙｒＳ−Ｒを連結したＣＡＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ここで、ＣＡＴ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。本例においてＣＡＴ遺伝子は、転写プロモータ配列とシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ配列）を含み、転写終結配列は含まないものとした。転写プロモータとＳＤ配列によって、ＣＡＴ遺伝子自身の発現が可能となる。ｔｙｒＳ遺伝子の下流に存在するｐｄｘＹ遺伝子の転写プロモータはｔｙｒＳ遺伝子の内部に存在するため、ｔｙｒＳ遺伝子をノックアウトすることによってｐｄｘＹ遺伝子の発現が消失してしまう。したがって、導入するＣＡＴ遺伝子に転写終結配列を含ませないことによって、ｐｄｘＹ遺伝子の発現とＣＡＴ遺伝子の発現とを共役させることができる。
次に、このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、ＱＢＭキットを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株の染色体にノックインした。染色体上にノックインされたＣＡＴ遺伝子は、その両端にｔｙｒＳ−Ｌ及びｔｙｒＳ−Ｒを有することとなる。したがって、ｔｙｒＳ−Ｌ及びｔｙｒＳ−Ｒを直接連結したＤＮＡ断片を、ＱＢＭキットを用いて染色体上にノックインすることによってＣＡＴ遺伝子を染色体から除去することができる。すなわち、ｔｙｒＳ−Ｌ及びｔｙｒＳ−Ｒを直接連結したＤＮＡ断片が染色体に正確にノックインされると、大腸菌ＴＯＰ１０株はクロラムフェニコール（Ｃｍ）感受性になる。
ＱＢＭキットを用いても正しくノックインされる効率は１００００分の１以下であるので、以下の手順に従ってＣｍ感受性大腸菌を選び出した。先ず、増幅されたＤＮＡ断片を導入する処理を行った後、１〜１０万個の大腸菌を液性ＬＢ培地で培養する。次に、培養によって１０万〜１００万個／ｍＬになったところで１０μｇ／ｍＬ濃度のＣｍを培地に添加し、培養を続ける。３０分後、２００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを培地に加え、大腸菌が溶解するまで３０分〜１時間程度培養を続ける。次に、溶解した培養液を遠心にかけ、沈殿してきた大腸菌をＬＢプレートに播いて一晩培養する。得られたコロニーを１００〜２００個選んで、レプリカ法によってＣｍ感受性菌を選択する。
以上の処理を行うことによって、大腸菌ＴＯＰ１０株の染色体からｔｙｒＳ遺伝子がノックアウトされることとなる。
（２）ｔｙｒＴ遺伝子のノックアウト
上記「（１）ｔｙｒＳ遺伝子のノックアウト」と同様にして、大腸菌ＴＯＰ１０株におけるチロシンｔＲＮＡ遺伝子の１つであるｔｙｒＴ遺伝子をノックアウトした。このとき、上記ｘ−ＬとしてｔｙｒＴ−Ｌ及び上記ｘ−ＲとしてｔｙｒＴ−Ｒを決定した。
ｔｙｒＴ−Ｌ：ＡＡＡＡＴＡＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＣＡＧ（配列番号８）
ｔｙｒＴ−Ｒ：ＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＧＧ（配列番号９）
また、ベクターｐＡＣＹＣ１８４上のＣＡＴ遺伝子を鋳型としたＰＣＲに使用する一対のプライマーとしてｔｙｒＴＬ−ＣｍＦ及びｔｙｒＴＲ−ＣｍＲ１を設計し、化学合成した。
ｔｙｒＴＬ−ＣｍＦ（７０塩基）：
ＡＡＡＡＴＡＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＣＣＧ（配列番号１０）
ｔｙｒＴＲ−ＣｍＲ１（７１塩基）：
ＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号１１）
本例においてもＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片に含まれるＣＡＴ遺伝子は、転写プロモータ配列とシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ配列）を含み、転写終結配列は含まないものとした。ｔｙｒＴ遺伝子の下流に存在するｔｐｒ遺伝子の発現とＣＡＴ遺伝子の発現とを共役させることができる。また、増幅されたＤＮＡ断片を、ＱＢＭキットを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株の染色体にノックインした後、同様にＣＡＴ遺伝子を除去することによってｔｙｒＴ遺伝子をノックアウトすることができた。
（３）ｔｙｒＵ遺伝子のノックアウト
上記「（１）ｔｙｒＳ遺伝子のノックアウト」と同様にして、大腸菌ＴＯＰ１０株におけるチロシンｔＲＮＡ遺伝子の１つであるｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトした。このとき、上記ｘ−ＬとしてｔｙｒＵ−Ｌ及び上記ｘ−ＲとしてｔｙｒＵ−Ｒを決定した。
ｔｙｒＵ−Ｌ：ＧＴＡＡＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＡＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣ（配列番号１２）
ｔｙｒＵ−Ｒ：ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＣＣＣＧＡＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＡ（配列番号１３）
また、ベクターｐＡＣＹＣ１８４上のＣＡＴ遺伝子を鋳型としたＰＣＲに使用する一対のプライマーとしてｔｙｒＵＬ−ＣｍＦ及びｔｙｒＵＲ−ＣｍＲ１を設計し、化学合成した。
ｔｙｒＵＬ−ＣｍＦ１（７２塩基）：
ＧＴＡＡＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＡＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号１４）
ｔｙｒＵＲ−ＣｍＲ１（７１塩基）：
ＴＴＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＧＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号１５）
本例においては、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片に含まれるＣＡＴ遺伝子は、ＳＤ配列を含み、転写プロモータ配列と転写終結配列は含まないものとした。ｔｙｒＵ遺伝子は上流のｔｈｒＵ遺伝子と下流のｇｌｙＴ遺伝子の両方に転写共役しており、ＣＡＴ遺伝子の上流に転写プロモータは必要なく、翻訳のためのＳＤ配列があればＣＡＴ遺伝子自身の発現が可能となる。また、導入するＣＡＴ遺伝子に転写終結配列を含ませないことによって、ｇｌｙＴ遺伝子の発現とＣＡＴ遺伝子の発現とを共役させることができる。また、増幅されたＤＮＡ断片を、ＱＢＭキットを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株の染色体にノックインした後、同様にＣＡＴ遺伝子を除去することによって、ｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトすることができた。
なお、ｔｙｒＳ遺伝子及びｔｙｒＴ遺伝子をノックアウトする際に使用した、転写プロモータ配列及びＳＤ配列を含み、転写終結配列は含まないＣＡＴ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示した。また、ｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトする際に使用した、ＳＤ配列を含み、転写プロモータ配列も転写終結配列も含まないＣＡＴ遺伝子の塩基配列を配列番号１７に示した。
アロプロテインの製造
プラスミドｐＴＫ３を導入した後、以上のようにしてｔｙｒＳ、ｔｙｒＴ及びｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトして得られた大腸菌ＴＯＰ１０株（以下、「ＴＯＰ１０＊」または「ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株」）は、この株で発現するすべての遺伝子のチロシンをコードする位置に、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳ及びチロシンｔＲＮＡによりチロシンを組み込むこととなる。そこで、３−ヨード−Ｌ−チロシンに対する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異ＴｙｒＲＳとサプレッサーチロシンｔＲＮＡを発現するプラスミドｐＥｃＩＹＲＳをＴＯＰ１０＊株に導入すれば、サプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒにおけるアンチコドンに対合するアンバーコドンの位置に３−ヨードチロシンを組み込んだアロプロテインを合成することとなる。導入された目的タンパク質をコードする遺伝子におけるチロシンをコードするコドンの位置にも、他の遺伝子と同様に古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳ及びチロシンｔＲＮＡによりチロシンが組み込まれる。
このとき、原核生物由来のａａＲＳ＊である変異ＴｙｒＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｔＲＮＡをアミノアシル化することがなく、また、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＴｙｒＲＳはサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒをアミノアシル化することがない。したがって、プラスミドｐＥｃＩＹＲＳが導入された大腸菌ＴＯＰ１０株によれば、所望の位置のみに非天然型アミノ酸である３−ヨードチロシンを組み込んだアロプロテインを合成することができる。これは、以下のような実験によって確認することができる。
この実験のために、アンバーコドンをコード配列中に導入したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴ）のアンバー変異遺伝子（配列番号１８）を用いる。このＧＳＴアンバー変異遺伝子では、Ｎ末端から２５番目のコドンがアンバーコドンに置換されている。ＧＳＴタンパク質をトリプシン処理して得られるペプチドで、この部位を含むペプチドは質量分析によって容易に検出することができるため、この位置のアミノ酸がヨードチロシンであるかどうかの判定が可能である。ＧＳＴアンバー変異遺伝子は、適当な発現プロモータと連結させて、ｐＥｃＩＹＲＳ上にクローニングすることで、大腸菌内で発現させることができる。適当なプロモータとは、例えば、ｌａｃＺ−ＵＶ５プロモータである。ＧＳＴアンバー変異遺伝子をクローニングしたプラスミドｐＥｃＩＹＲＳを、プラスミドｐＥｃＩＹＲＳ−ＧＳＴ（Ａｍ）とする。
ＴＯＰ１０＊株に、プラスミドｐＥｃＩＹＲＳ−ＧＳＴ（Ａｍ）を導入する方法は次の通りである。液性ＬＢ培地１．５ｍＬにＴＯＰ１０＊を植菌して培養し、１００万個／ｍＬ程度の濃度まで菌が増殖したところで培養液を回収し、４度で１１０００ｒｐｍで３０秒間遠心して菌体を沈殿させる。上澄みを捨てたのち、氷冷した滅菌水１ｍＬに沈殿を懸濁する。再び４度、１１０００ｒｐｍで３０秒間遠心して菌体を沈殿させ、上澄みを捨てたのち、再度、氷冷した滅菌水１ｍＬに懸濁する。最後に、４度で１１０００ｒｐｍ、３０秒間遠心して菌体を沈殿させ、２０−３０μＬの滅菌水に懸濁する。これで、エレクトロポレーション法に適したＴＯＰ１０＊が調製できた。同法によって、同菌株にプラスミドｐＥｃＩＹＲＳ−ＧＳＴ（Ａｍ）を導入し、ＴＯＰ１０＊［ｐＥｃＩＹＲＳ−ＧＳＴ（Ａｍ）］を作製する。
３−Ｌ−ヨードチロシンを２５番目の位置に導入したＧＳＴを作製するためには、ＴＯＰ１０＊［ｐＥｃＩＹＲＳ−ＧＳＴ（Ａｍ）］を、０．１ｍｇ／ｍＬの３−Ｌ−ヨードチロシン、および０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液性ＬＢ培地で培養する。ＧＳＴ（Ａｍ）遺伝子の発現を誘導するために、最終濃度で１ｍＭになるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加する。ＩＰＴＧ添加後数時間で菌を回収し、公知の方法によって大腸菌抽出液を調製したのち、ＧＳＴアフィニティーカラム（アマシャム社）を用いてＧＳＴを精製する。得られたＧＳＴを、質量分析法によって解析することで所定の２５位にヨードチロシンが導入されていること、および、他のチロシン・コドンはチロシンに翻訳されていることが確認できる。
実験方法及び結果−１
上述した説明に準じて、大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳ遺伝子及びサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を用いたアロプロテインの製造に、宿主細胞として使用できる置換型大腸菌を作製した。
具体的には、上述した方法により、先ず、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＴｙｒＲＳ遺伝子及びチロシンｔＲＮＡ遺伝子を発現するプラスミドｐＴＫ３を大腸菌ＴＯＰ１０株に形質転換した。その後、上述した方法により、ｐＴＫ３を有する大腸菌ＴＯＰ１０株（ＴＯＰ１０［ｐＴＫ３］株）におけるｔｙｒＳ遺伝子をノックアウトした変異株（ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株）を作製した。その後、上述した方法により、変異株（ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株）におけるｔｙｒＵ遺伝子をノックアウトした変異株（ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株）を作製した。
得られたＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株において、ｔｙｒＳ遺伝子がノックアウトされていることを、アンバー・サプレッション実験によって検証した。この検証実験のためにプラスミド２５４１ｓｕｐＦを作製した。プラスミド２５４１ｓｕｐＦには、アンバー変異型のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、大腸菌チロシンｔＲＮＡ由来のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子がクローニングされている。プラスミド２５４１ｓｕｐＦの全長塩基配列を配列番号１９に示した。
プラスミド２５４１ｓｕｐＦを導入した大腸菌において、大腸菌ＴｙｒＲＳ（ｔｙｒＳ遺伝子産物）が発現していれば、プラスミド２５４１ｓｕｐＦに存在するサプレッサーｔＲＮＡが働くのでアンバー変異が抑制されることなり、クロラムフェニコール耐性が発現する。一方、プラスミド２５４１ｓｕｐＦを導入した大腸菌において、大腸菌ＴｙｒＲＳ（ｔｙｒＳ遺伝子産物）がノックアウトされていれば、クロラムフェニコール耐性が発現しないと予想される。なお、プラスミド２５４１ｓｕｐＦに存在するサプレッサーｔＲＮＡは、古細菌由来ＴｙｒＲＳからは認識されないので、プラスミド２５４１ｓｕｐＦを導入した大腸菌において古細菌由来ＴｙｒＲＳが発現していたとしてもクロラムフェニコール耐性は発現しない。
ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及び野生株であるＴＯＰ１０株をそれぞれプラスミド２５４１ｓｕｐＦで形質転換した後、クロラムフェニコール含有培地で培養した結果を図１に示す。図１に示すように、プラスミド２５４１ｓｕｐＦで形質転換したＴＯＰ１０株（ＷＴと表示）は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）含有の培地上で生育することができた。一方、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株（ｔｙｒＳ ＫＯと表示）は、Ｃｍ培地上で生育することができなかった。この結果から、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株には大腸菌ＴｙｒＲＳが発現していないことが確認できた。
実験方法及び結果−２
大腸菌に内在するＴｙｒＲＳが完全にノックアウトされていることが確認されたＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株におけるｔｙｒＴ遺伝子のノックアウトを上述した方法により行い、変異株（ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株）を構築した。
作製された変異株において、大腸菌に内在するチロシンｔＲＮＡが全てノックアウトされていることを検証した。検証実験は、以下のようにして行った。
すなわち、先ず、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株において、大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を発現させた。この変異体としては、文献（Ｋｉｇａ，Ｄら，２００２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，９７１５−９７２３．）に記載されているものを使用した。この大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体は、３−ヨードチロシン（又は３−ブロモチロシン）を認識して大腸菌チロシンｔＲＮＡに結合させる機能を有している。したがって、ブロモチロシンを含む培地にこの変異体を発現させた大腸菌を植菌すると、この大腸菌内ではチロシンのかわりにブロモチロシンがあらゆるタンパク質に取り込まれる。このため、大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体が機能し、且つ大腸菌チロシンｔＲＮＡが存在する場合には、あらゆるタンパク質が機能しなくなり、大腸菌が生育することができない。これに対して、大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体が機能するが大腸菌内に大腸菌チロシンｔＲＮＡが存在しない場合には、大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体が機能したとしても、ブロモチロシン含有培地上でも大腸菌が生育することができる。
ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及びＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株にそれぞれ大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株をブロモチロシン含有培地及びブロモチロシン非含有培地において生育したときの増殖曲線を図２に示す。
図２において、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株を「ΔｔｙｒＳ」と表記し、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株を「ｔｙｒ−Ｍｊ」と表記した。なお、図２において、横軸は、培養時間を示している。
図２から判るように、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株においては、ブロモチロシンを添加すると増殖速度が低下し始め、２時間後に増殖が停止していた。これは、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株は、ｔｙｒＴ遺伝子が存在するので大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体が機能するためである。一方、図２から判るように、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株においては、ブロモチロシンの添加が増殖に影響しなかった。これは、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株に大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体を導入した株は、大腸菌チロシンｔＲＮＡが全てノックアウトされており、大腸菌ＴｙｒＲＳ変異体が機能しなかったことを意味する。
実験方法及び結果−３
次に、作製されたＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株において、ｔｙｒＴ遺伝子、ｔｙｒＵ遺伝子及びｔｙｒＳ遺伝子が全てゲノム上から除去されているか否かを確認した。具体的には、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株から染色体ＤＮＡを抽出し、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって確認した。
染色体ＤＮＡは、市販のキットＧｅｎとるくん^ＴＭ（酵母用）（タカラバイオ株式会社）を用いて抽出した。ｔｙｒＴ遺伝子、ｔｙｒＵ遺伝子及びｔｙｒＳ遺伝子の各遺伝子について以下の塩基配列からなる一対のプライマーを設計して化学合成によって作製した。
ｔｙｒＴ遺伝子増幅用
・ＧＣＡＧＧＡＣＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧ（配列番号２０）
・ＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＧ（配列番号２１）
ｔｙｒＵ遺伝子増幅用
・ＧＴＡＡＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＴ（配列番号２２）
・ＴＴＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＡＡＣＴ（配列番号２３）
ｔｙｒＳ遺伝子増幅用
・ＡＡＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧ（配列番号２４）
・ＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧ（配列番号２５）
すなわち、ｔｙｒＴ遺伝子増幅用プライマーはｔｙｒＴ遺伝子及びｔｙｒＶ遺伝子の前後の配列に設定し、ｔｙｒＵ遺伝子増幅用プライマーはｔｙｒＵ遺伝子の前後の配列に設定し、ｔｙｒＳ遺伝子増幅用プライマーはｔｙｒＳ遺伝子の前後の配列に設定した。
ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株及び野生株であるＴＯＰ１０株について、それぞれ染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動によって確認した結果を図３に示す。図３において、ＴＯＰ１０株を用いたときの結果を「ＷＴ」と表記し、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株を用いたときの結果を「ΔｔｙｒＵ」、「ΔｔｙｒＳ」及び「ΔｔｙｒＴ」と表記した。また、図３において、ＴＯＰ１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いてｔｙｒＴ遺伝子、ｔｙｒＵ遺伝子及びｔｙｒＳ遺伝子を増幅したときに現れる増幅断片の位置を三角印で指示した。
図３から判るように、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株の染色体ＤＮＡを用いた場合には、ＴＯＰ１０株の染色体ＤＮＡを用いたときに増幅した各断片と比較して、増幅される断片の長さがより短くなっていた。この結果から、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株においては、ｔｙｒＴ遺伝子、ｔｙｒＵ遺伝子及びｔｙｒＳ遺伝子が全てゲノム上から除去されていることが実証された。
以上のことから、ＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株においては、内在していたＴｙｒＲＳとチロシンｔＲＮＡは全てノックアウトされ、代わりに古細菌ＴｙｒＲＳとチロシンｔＲＮＡによってチロシン・コドンの翻訳を行って生きていることが示された。このＴＯＰ１０［ΔｔｙｒＴ，ΔｔｙｒＵ，ΔｔｙｒＳ，ｐＴＫ３］株は、大腸菌由来の変異ＴｙｒＲＳ遺伝子及びサプレッサーｔＲＮＡ^Ｔｙｒ遺伝子を用いたアロプロテインの製造に使用することができる。

本発明に係る非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法によれば、原核生物由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を用いるとともに原核細胞を宿主細胞として用いて、所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質を製造することができる。また、この原核生物由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、真核生物タイプの細胞を宿主とする非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法にも使用することができる。このように、本発明によれば、原核細胞由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を、原核細胞及び真核生物タイプの細胞のいずれを宿主細胞とする系にも使用することができる。
また、非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法によれば、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を用いるとともに真核生物タイプの細胞を宿主細胞として用いて、所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質を製造することができる。また、この真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、原核細胞を宿主とする非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法にも使用することができる。このように、本発明によれば、真核生物タイプのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を、原核細胞及び真核生物タイプの細胞のいずれを宿主細胞とする系にも使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (29)

1. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子とを、
   上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とを発現する原核細胞に導入する工程と、
   上記原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とをノックアウトする工程と、
   上記非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子のアンチコドンに対合するコドンを有する目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、上記原核細胞中で発現させる工程とを備え、
   上記アンチコドンに対合するコドンの位置に上記非天然型アミノ酸を取り込ませることを特徴とする、非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法。
2. 上記原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体は、大腸菌由来のチロシルtRNA合成酵素変異体であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 上記非天然型アミノ酸は、チロシン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
4. 上記非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子は、大腸菌由来のサプレッサーチロシンtRNA遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
5. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素は、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
6. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれるいずれか一のタンパク質からなることを特徴とする請求項５記載の製造方法。
   （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
   （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
7. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子は、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNA遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
8. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNAは、配列番号１における4334〜4410番目に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
9. 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とが導入され、
    原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とがノックアウトされた、原核細胞。
11. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素は、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素であることを特徴とする請求項１０記載の原核細胞。
12. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれるいずれか一のタンパク質からなることを特徴とする請求項１１記載の原核細胞。
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
13. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子は、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNA遺伝子であることを特徴とする請求項１０記載の原核細胞。
14. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNAは、配列番号１における4334〜4410番目に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１３記載の原核細胞。
15. 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の原核細胞。
16. 請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の原核細胞の抽出液。
17. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素変異体をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子とを、
    上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とを発現する真核生物タイプの細胞に導入する工程と、
    上記真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とをノックアウトする工程と、
    上記非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子のアンチコドンに対合するコドンを有する目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、上記真核生物タイプの細胞中で発現させる工程とを備え、
    上記アンチコドンに対合するコドンの位置に上記非天然型アミノ酸を取り込ませることを特徴とする、非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法。
18. 上記真核生物タイプの細胞は酵母であることを特徴とする請求項１７記載の製造方法。
19. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とが導入され、
    真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とがノックアウトされた、真核生物タイプの細胞。
20. 上記真核生物タイプの細胞は酵母であることを特徴とする請求項１９記載の真核生物タイプの細胞。
21. 請求項１９または２０記載の真核生物タイプの細胞の抽出液。
22. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体と、
    上記原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体の存在下で上記非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用tRNAと、
    上記非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、
    上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とが導入されるとともに、原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とがノックアウトされた原核細胞の抽出液と、
    を含む無細胞タンパク質合成系試薬キット。
23. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素は、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素であることを特徴とする請求項２２記載の試薬キット。
24. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシルtRNA合成酵素は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれるいずれか一のタンパク質からなることを特徴とする請求項２３記載の試薬キット。
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、チロシンを活性化するとともにチロシルtRNAを合成する活性を有するタンパク質
25. 上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNAは、メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNAであることを特徴とする請求項２２記載の試薬キット。
26. 上記メタノコッカス・ジャナシー（Methanococcus jannaschii）由来のチロシンtRNAは、配列番号１における4334〜4410番目に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２５記載の試薬キット。
27. 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の試薬キット。
28. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素変異体と、
    上記真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用tRNAと、
    上記非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、
    上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とが導入されるとともに、真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とがノックアウトされた真核生物タイプの細胞の抽出液と、
    を含む無細胞タンパク質合成系試薬キット。
29. 上記真核生物タイプの細胞は、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項２８記載の試薬キット。

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