JP6117563B2 - タンパク質の発現を制御する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質の発現を制御する方法に関し、より詳しくは、細胞においてタンパク質の発現を抑制又は誘導するための方法、並びにこれら方法に用いられるためのキットに関する。
組換えタンパク質の生産は、分子生物学や生化学の分野における基礎研究においては勿論のこと、食品、医薬品、化粧品及び機能材料の分野における研究開発や大量生産においても大きく貢献するものである。また、組換えタンパク質を効率良く大量に生産するためには、タンパク質の発現を厳密に制御する方法、すなわち、発現の非誘導時には目的のタンパク質の発現を完全に抑制するが、誘導した際には当該タンパク質を高レベルにて発現させることのできる方法が必要とされている。特に、毒性の強いタンパク質を細胞に産生させる場合には、非誘導時のわずかな発現（ｌｅａｋｙな発現）により当該細胞が死んでしまうため、このｌｅａｋｙな発現を完全に抑えることが必須となる。
かかる点を考慮し、タンパク質の発現を転写レベルにて制御するための様々な方法が開発されている。例えば、ラクトースオペロンに由来するｌａｃリプレッサー及びラクトースオペレーターにＴ７等のプロモーターを組み合わせて利用した系、ａｒａオペロンのａｒａＢＡＤプロモーター及びａｒａＣレギュレーターを利用した系、テトラサイクリン耐性オペロンに関するＴｅｔリプレッサー及びＴｅｔオペレーターＤＮＡ配列を利用した系、合成エクジソン誘導レセプター及び合成レセプター認識エレメントを利用した系が、既に実用化され、研究分野を中心に広く利用されている。しかしながら、かかる既存の方法においても、非誘導時の発現の漏れ（ｌｅａｋａｇｅ）が確認されている。
また、近年、医薬品や機能材料の分野等において、非天然アミノ酸が導入されたタンパク質が利用されている。そして、このようなタンパク質の作製方法の一つとして、タンパク質合成（翻訳）の過程にて、人為的に改変したｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを用いて非天然アミノ酸とｍＲＮＡ内の終止コドンとを対応させ、該非天然アミノ酸をタンパク質に導入する方法が開発されている（特許文献１、非特許文献１及び２）。
Ｗａｎｇ Ｌ.ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、２９２巻、４９８〜５００ページ
Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、非誘導時には目的タンパク質の発現を殆ど抑制することを可能とする、タンパク質の発現制御方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、タンパク質の発現を厳密に制御するために、図１に示すように、非天然アミノ酸と、これと終止コドンとを対応づけるように人工的に改変されたｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ
ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｎａａＲＳ）とを用いるタンパク質発現制御系を構想した。すなわち、前記非天然アミノ酸の存在下、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳが細胞内に発現している場合には、目的とするタンパク質をコードする遺伝子内に挿入された終止コドン（図中、ＵＡＧ）に対応する前記非天然アミノ酸が組み込まれ、目的タンパク質の翻訳を進めることができる。一方、前記非天然アミノ酸、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳの３要素のうちの少なくとも１の要素が欠落すると、前記終止コドンに対応する前記非天然アミノ酸を組み込むことができず、目的タンパク質の翻訳が抑制又は停止することが想定される。
ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｎａａＲＳ）とを用いるタンパク質発現制御系を構想した。すなわち、前記非天然アミノ酸の存在下、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳが細胞内に発現している場合には、目的とするタンパク質をコードする遺伝子内に挿入された終止コドン（図中、ＵＡＧ）に対応する前記非天然アミノ酸が組み込まれ、目的タンパク質の翻訳を進めることができる。一方、前記非天然アミノ酸、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳの３要素のうちの少なくとも１の要素が欠落すると、前記終止コドンに対応する前記非天然アミノ酸を組み込むことができず、目的タンパク質の翻訳が抑制又は停止することが想定される。
そして、実際に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ)を目的とするタンパク質として、このタンパク質発現制御系を評価したところ、前記非天然アミノ酸、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳのいずれか１の要素が欠落すると、翻訳が進行せず、ＧＦＰを合成できなくなることが明らかになった。また、かかるタンパク質発現の抑制は、前記非天然アミノ酸、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳのうち２つ以上の要素が欠落する、又は目的とするタンパク質をコードする遺伝子内に挿入する終止コドン数によってより強まることも明らかになった。
さらに、ｃｏｌＥ３の酵素ドメイン（ｃｏｌＥ３ｅ）を目的とするタンパク質として、前記タンパク質発現制御系を評価した。なお、ｃｏｌＥ３ｅは強毒性のタンパク質であることが知られており、既存の転写レベルにてタンパク質の発現を制御する方法（例えば、ｌａｃリプレッサー等を利用する方法）を利用しても、ｃｏｌＥ３ｅをコードする核酸が導入された細胞は、非誘導時においてもｃｏｌＥ３ｅのｌｅａｋｙな発現によって死滅してしまう。しかし、前記評価の結果、かかる翻訳レベルでのタンパク質の発現を制御する系を利用することによって、ｃｏｌＥ３ｅをコードする核酸を導入した細胞の非誘導時における生存率は各段に向上し、無毒性タンパク質をコードする核酸を導入した細胞のそれと比較し、同程度又はそれ以上となることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下＜１＞〜＜４＞を提供するものである。
＜１＞ 細胞においてタンパク質の発現を抑制するための方法であって、
前記細胞が、開始コドンの直後に２又は３個の天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質を、コードする核酸を含有する細胞であり、
前記核酸がコードするｍＲＮＡの発現は、刺激に応答して誘導されるものであり、
前記ｍＲＮＡに基づく前記タンパク質の合成は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであり、
前記細胞を、前記刺激の非存在下にて、更に下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養する方法
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
＜２＞ 細胞においてタンパク質の発現を誘導するための方法であって、
＜１＞に記載の方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を、
前記刺激の存在下、前記非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する方法。
＜３＞ 前記コドンがアンバー終止コドンである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 下記（ａ）〜（ｅ）に記載の物質を含む、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｂ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｄ）前記非天然アミノ酸
（ｅ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードする核酸、前記ｔＲＮＡをコードする核酸及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸からなる群から選択される少なくとも１の核酸が導入される又は導入された細胞。
＜１＞ 細胞においてタンパク質の発現を抑制するための方法であって、
前記細胞が、開始コドンの直後に２又は３個の天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質を、コードする核酸を含有する細胞であり、
前記核酸がコードするｍＲＮＡの発現は、刺激に応答して誘導されるものであり、
前記ｍＲＮＡに基づく前記タンパク質の合成は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであり、
前記細胞を、前記刺激の非存在下にて、更に下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養する方法
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
＜２＞ 細胞においてタンパク質の発現を誘導するための方法であって、
＜１＞に記載の方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を、
前記刺激の存在下、前記非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する方法。
＜３＞ 前記コドンがアンバー終止コドンである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 下記（ａ）〜（ｅ）に記載の物質を含む、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｂ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｄ）前記非天然アミノ酸
（ｅ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードする核酸、前記ｔＲＮＡをコードする核酸及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸からなる群から選択される少なくとも１の核酸が導入される又は導入された細胞。
本発明によれば、タンパク質の発現を制御する際に、非誘導時において目的タンパク質の発現を殆ど抑制することが可能となる。
本発明の、細胞においてタンパク質の発現を抑制するための方法は、
前記細胞が、天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードする核酸を含有する細胞であり、
前記タンパク質の発現は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであり、
前記細胞を下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養する方法である
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
前記細胞が、天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードする核酸を含有する細胞であり、
前記タンパク質の発現は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであり、
前記細胞を下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養する方法である
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
本発明において「細胞」とは特に制限はなく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞が挙げられる。また、当該細胞において発現抑制の対象となる「タンパク質」としても特に制限はないが、極めて少量の発現であっても細胞が死滅してしまうため、かかるタンパク質をコードする核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）を維持することができない等の観点から、毒性タンパク質の発現を抑制するのに、本発明の方法は好適である。
本発明にかかる毒性タンパク質は、該タンパク質を発現する細胞の形成、発達、維持若しくは増殖を抑制し、又は破壊するタンパク質、すなわちそれ自体が毒性を発揮するタンパク質のみならず、毒性を発揮するのを補助するタンパク質（例えば、アロステリック因子）や、毒性を発揮するタンパク質の発現を制御するためのタンパク質等も含む。かかる毒性タンパク質としては、例えば、該タンパク質をコードする核酸を含有する細胞が大腸菌である場合には、制限酵素等のＤＮＡ分解酵素、コリシンＥ３等のＲＮＡ分解酵素、毒性酵素ピエリシン等のＡＤＰリボシル化酵素、抗微生物ペプチドが挙げられる。
また、本発明にかかるタンパク質は、他のタンパク質が融合されているものであってもよい。この場合、他のタンパク質は、本発明にかかるタンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、直接的に又は間接的に融合させることができる。他のタンパク質としては特に制限はなく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質等の所謂タグタンパク質が挙げられる。
さらに、かかるタンパク質をコードする核酸は、前記細胞に１種のみ含まれていてもよく、複数種含まれていてもよい。
前述の本発明にかかるタンパク質をコードする核酸にインフレームにて挿入されている「天然アミノ酸に対応しないコドン」とは、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、グリシン、トリプトファン、スレオニン、セリン、システイン、プロリン、フェニルアラニン、アルギニン、リジン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる２０種のＬ型アミノ酸のいずれにも対応しないコドンを意味する。具体的には、ウラシル（Ｕ）若しくはチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）とから選択される３塩基の組み合わせ（６４種）からアミノ酸をコードしないコドン（終止コドン３種）を除いた、６１種のコドンが天然アミノ酸に対応するコドンであり、「天然アミノ酸に対応しないコドン」とはその６１種のコドン以外のコドンのことを意味する。
本発明にかかる「天然アミノ酸に対応しないコドン」としては、例えば、終止コドン、４つ以上の塩基からなるコドン及び非天然コドンが挙げられる。
本発明にかかる「終止コドン」は、オーカー（ｏｃｈｒｅ）終止コドン（ＵＡＡ又はＴＡＡからなる３塩基の組み合わせ）、アンバー（ａｍｂｅｒ）終止コドン（ＵＡＧ又はＴＡＧからなる３塩基の組み合わせ）、オパール（ｏｐａｌ）終止コドン（ＵＧＡ又はＴＧＡからなる３塩基の組み合わせ）である。これら終止コドンのうち、本発明にかかるタンパク質をコードする核酸を含有する細胞が大腸菌である場合には、大腸菌における使用頻度が低いという観点から、アンバー終止コドンが好ましい。なお、本発明の方法において、「天然アミノ酸に対応しないコドン」として「終止コドン」を用い、後述の「非天然アミノ酸」の非存在下、後述の「前記終止コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」又は「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」が前記細胞内に存在していない場合には、本発明にかかるタンパク質の翻訳が、その終止コドンが挿入されている部位にて止まることになるため、当該タンパク質を完全長にて得ることができなくなる（図１ 参照）。
本発明にかかる「４つ以上の塩基からなるコドン」は、例えば４、５、６又は７つ以上の塩基からなるコドンである。４塩基からなるコドン（以下「４塩基コドン」とも称する）としてより具体的には、ＣＧＧＧ、ＣＵＣＵ（ＣＴＣＴ）、ＣＵＣＡ（ＣＴＣＡ）、ＣＣＣＵ（ＣＣＣＴ）、ＣＧＧＵ（ＣＧＧＴ）、ＣＵＡＧ（ＣＴＡＧ）、ＡＧＧＡ、ＡＧＧＵ（ＡＧＧＴ）、ＧＧＧＵ（ＧＧＧＴ）及びＵＡＧＡ（ＴＡＧＡ）が挙げられる。５塩基からなるコドン（以下「５塩基コドン」とも称する）としてより具体的には、例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ（ＣＣＣＣＴ）、ＣＣＣＵＣ（ＣＣＣＴＣ）が挙げられる。なお、本発明の方法において、「天然アミノ酸に対応しないコドン」として「４塩基コドン等」を用い、後述の「非天然アミノ酸」の非存在下、後述の「前記４塩基コドン等を認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」又は「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」が前記細胞内に存在していない場合には、天然アミノ酸に対応するコドンを認識する内在性のｔＲＮＡ等によって翻訳が進行するため、その４塩基コドン等が挿入されている部位以降のコドンの読み枠（リーディングフレーム）がシフトし、当該タンパク質を完全長にて得ることができなくなる。
本発明にかかる「非天然コドン」は、非天然型塩基が少なくとも１塩基含まれているコドンを意味する。かかる非天然型塩基としては、例えば、７−（２−チエニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン、ピロール−２−カルボアルデヒドが挙げられる（Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００２年、２０巻、１７７〜１８２ページ、Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、２００６年、１０巻、６号、６２２〜６２７ページ 参照）。なお、本発明の方法において、「天然アミノ酸に対応しないコドン」として「非天然コドン」を用い、後述の「非天然アミノ酸」の非存在下、後述の「前記非天然コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」又は「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」が前記細胞内に存在していない場合には、本発明にかかるタンパク質の翻訳が、その非天然コドンが挿入されている部位にて止まることになるため、当該タンパク質を完全長にて得ることができなくなる。
本発明において「インフレームにて挿入」とは、後述の「非天然アミノ酸」の存在下、後述の「前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」及び「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」が前記細胞内に存在している場合に、読み枠がずれず、本発明にかかるタンパク質を完全長にて得られるよう、前記コドンが挿入されている状態を意味する。
また、本発明における「コドンの挿入」には、前記タンパク質をコードする核酸に天然アミノ酸に対応しないコドンを新たに付加することのみならず、前記タンパク質をコードする核酸中のコドンを天然アミノ酸に対応しないコドンに置換することも含まれる。
本発明にかかるタンパク質をコードする核酸に挿入されている天然アミノ酸に対応しないコドンの「数」としては特に制限はないが、後述の実施例において示す通り、挿入されるコドンの数が多い程、本発明にかかるタンパク質の発現を完全に抑制することができるが、当該タンパク質の発現量は低くなる傾向にあるため、好ましくは１〜３個である。
天然アミノ酸に対応しないコドンが本発明にかかるタンパク質をコードする核酸に挿入されている「位置」としては特に制限はないが、後述の「非天然アミノ酸」の非存在下、後述の「前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」又は「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」が前記細胞内に存在していない場合に得られるタンパク質が、完全長のものではないとはいえ、本発明にかかるタンパク質に相当する機能を発揮する可能性があるという観点から、天然アミノ酸に対応しないコドンが挿入されている位置は、本発明にかかるタンパク質をコードする核酸の前半（５’側の１／２）、好ましくは５’側の１／３、より好ましくは５’側の１／４、特に好ましくは開始コドンの直後である。
また、複数の前記コドンが前記核酸に挿入されている場合には、複数の前記コドン全てが１箇所に連続して挿入されていてもよく、また１以上の前記コドンが間隔をおいて複数箇所に挿入されていてもよいが、本発明にかかるタンパク質を完全に抑制し易くなるという観点から、複数の前記コドン全てが１箇所に連続して挿入されていることが好ましい。
天然アミノ酸に対応しないコドンの、本発明にかかるタンパク質をコードする核酸への挿入は、当業者に公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９８７年、１５４巻、３５０〜３６７ページ 参照）を利用して行うことができる。
また、「天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて挿入されているタンパク質をコードする核酸を含有する細胞」は、当業者であれば公知の手法を適宜選択して調製することができる。
かかる公知の手法としては、例えば、前記細胞が大腸菌の場合、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−３、ｐＧＥＸ−１、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＤＥＳＴ４２等）を、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、Ｉｎｏｕｅ法、塩化ルビジウム法）又は電気穿孔法により、大腸菌に導入することによって調製することができる。
前記細胞が酵母の場合には、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているプラスミドＤＮＡを、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法又は電気穿孔法により、酵母に導入することによって調製することができる。
前記細胞が昆虫細胞の場合には、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているバキュロウイルスを、昆虫細胞に感染させることにより、調製することができる。また、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているプラスミドＤＮＡを、リポフェクション法により、昆虫細胞に導入することによって調製することができる。
前記細胞が植物細胞の場合には、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているプラスミドＤＮＡを、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法又は電気穿孔法により、植物細胞に導入することによって調製することができる。
前記細胞が哺乳動物細胞（例えば、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）の場合、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているプラスミドＤＮＡを、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は電気穿孔法により、哺乳動物細胞に導入することによって調製することができる。また、前記核酸がプロモーターに作動可能に連結しているアデノウィルス、レンチウィルス、センダイウィルス等を、哺乳動物細胞に感染させることによっても調製することができる。
また、前記核酸に作動可能に連結されている「プロモーター」によって誘導される、当該核酸がコードするｍＲＮＡの発現（転写レベルでの発現）は恒常的なものであってもよく、一過性のものであってよい。さらに一過性の発現は、刺激に応答して誘導されるものであってもよい。かかる刺激としては、例えば、特定の化合物の存在下又は非存在下における培養、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射が挙げられる。また、刺激に応答して発現を誘導する系としては特に制限はなく、公知の系を用いることができる。かかる発現制御系としては、ｌａｃリプレッサー及びラクトースオペレーターとＴ７等のプロモーターとを組み合わせて利用した系、ａｒａオペロンのａｒａＢＡＤプロモーター及びａｒａＣレギュレーターを利用した系、Ｔｅｔリプレッサー及びＴｅｔオペレーターＤＮＡ配列を利用した系、合成エクジソン誘導レセプター及び合成レセプター認識エレメントを利用した系が挙げられる。本発明にかかるタンパク質の発現を完全に抑制し易くなるという観点から、本発明の翻訳レベルでの発現を抑制する方法は、かかる転写レベルでの発現制御系と組み合わせて利用することが好ましい。
本発明においては、後述の実施例に示す通り又図１に示す通り、前記タンパク質の発現は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであって、
前記細胞を下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養することによって、前記タンパク質の発現を抑制することができる
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
前記細胞を下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養することによって、前記タンパク質の発現を抑制することができる
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
本発明にかかる「非天然アミノ酸」は、前記２０種の天然アミノ酸にＬ−ピロリジン及びＬ−セレノシステインを加えた２２種のアミノ酸以外のアミノ酸を意味し、前記天然アミノ酸の修飾体、置換体、前記天然アミノ酸に標識化合物が付加されたもの含まれる。本発明にかかる「非天然アミノ酸」としては、例えば、３−ハロゲン置換チロシン（例えば、３−ヨードチロシン）、３−ヒドロキシチロシン、３−アジドチロシン等のチロシン置換体、パラベンゾイルフェニルアラニン、４−ヨードフェニルアラニン、４−アジドフェニルアラニン等のフェニルアラニン置換体、Ｂｏｃ−リジン、アジド−Ｚ−リジン、アセチルリジン等のリジン置換体が挙げられる。また、かかる非天然アミノ酸を含有しない「培地」としては、本発明の方法に用いられる細胞の種類によって適宜選択、調製される公知の培地が好適に用いられる。
本発明にかかる「前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ」において、「前記コドンを認識する」とは、本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列への翻訳過程において、ｍＲＮＡ中の前記コドンと、当該ｔＲＮＡ中のアンチコドンとが、塩基対を形成することを意味する。また「前記非天然アミノ酸に結合し得る」とは、当該ｔＲＮＡ中の末端と前記非天然アミノ酸とが、後述のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってエステル結合し得ることを意味する。また、本発明にかかるｔＲＮＡは、前記細胞の内在性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとは反応しない性質、すなわち高い「直交性」（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）を有していることが好ましい。
本発明にかかる「前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」は、前述の通り、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡ中の末端とのエステル結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ
ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｎａａＲＳ)を意味する。
ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｎａａＲＳ)を意味する。
本発明にかかる前記「ｔＲＮＡ」及び「ｎａａＲＳ」としては、例えば、前記細胞が大腸菌であり、前記非天然アミノ酸がヨードチロシン、パラベンゾイルフェニルアラニンである場合には、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡＴｙｒ変異体（ＭｊＲ１）及びＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ変異体が各々挙げられる（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ 参照）。
本発明にかかる前記「ｔＲＮＡ」及び「ｎａａＲＳ」としては、例えば、前記細胞が哺乳類細胞であり、前記非天然アミノ酸がヨードチロシン、アジドフェニルアラニン、パラベンゾイルフェニルアラニンである場合には、例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔＲＮＡＴｙｒ変異体（ＢＹＲ）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴｙｒＲＳ変異体（Ｖ３７Ｃ１９５）が各々挙げられる（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００２年、３０巻、２１号、４６９２〜４６９９ページ 参照）。
本発明にかかる前記「ｔＲＮＡ」及び「ｎａａＲＳ」としては、例えば、前記細胞が昆虫細胞（ショウジョウバエＳ２細胞）であり、前記非天然アミノ酸がヨードチロシン、アジドチロシン、アジドフェニルアラニンである場合には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔＲＮＡＴｙｒ変異体（ＥＹＲ）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴｙｒＲＳ変異体（Ｖ３７Ｃ１９５）とＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ＰｈｅＲＳ校正ドメインとの融合タンパク質（ｉｏｄｏＴｙｒＲＳ−ｅｄ）が各々挙げられる（Ｍｕｋａｉ Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２０１０年、１９巻、３号、４４０〜４４８ページ 参照）。
本発明にかかる前記「ｔＲＮＡ」及び「ｎａａＲＳ」としては、例えば、前記細胞が大腸菌、酵母、哺乳動物細胞であり、前記非天然アミノ酸がＢｏｃ−リジン、アジド−Ｚ−リジン、アセチルリジンである場合には、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌ及びＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ野生型又は変異体（Ａ３０６Ｆ３８４）が各々挙げられる（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｔ.ら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、２００８年、１５巻、１１号、１１８７〜１１９７ページ 参照）。
本発明の方法において、「前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養」及び「前記細胞内にて、前記ｎａａＲＳを存在させることなく培養」は、前述の通り、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳは、前記細胞内において本来内在されていないものであるから、通常、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳを強制的に前記細胞に導入又は発現させなければ、かかる培養を行うことができる。また、前記ｔＲＮＡ又は前記ｎａａＲＳを刺激に応答して誘導的に発現し得る前記細胞を用いる場合には、かかる刺激の非存在下で培養することによって行うことができる。なお、かかる刺激及びそれに応答して誘導的に発現し得る系については、前述の通りである。
本発明の方法において、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養することによって、本発明にかかるタンパク質の発現を抑制することができるが、後述の実施例８及び９において示す通り、これら培養条件を組み合わせることにより、相乗的にタンパク質の発現をより強く抑制できるという観点から、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも２の培養条件で培養することが好ましい。また、後述の実施例６及び７に示す通り、（Ｉ）及び（ＩＩ）の培養条件を組み合わせて培養することがより好ましい（後述の図７の「４」及び図８の「８」及び「９」参照）。さらに、本発明にかかるタンパク質の発現を完全に抑制するという観点から、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）、全ての培養条件を組み合わせて培養することが特に好ましい。
なお、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）以外の培養条件（培地の組成、培地のｐＨ、培養の際の温度、培養の際の湿度、培養の際のガス（酸素、二酸化炭素等）の濃度）は、当業者であれば、公知の培養条件から選択することができる。また、当業者であれば、必要に応じて、公知の培養条件に適宜、修飾ないし改変を加えることによって、前記細胞の培養を実施することができる。
以上の通り、本発明の方法において、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養することによって、本発明にかかるタンパク質の発現を抑制することができるが、後述の実施例に示す通り又図１に示す通り、非天然アミノ酸の存在下、前記ｔＲＮＡと前記ｎａａＲＳとを、前記細胞内に存在させて培養することにより、かかる抑制は解除され、本発明のタンパク質の発現は誘導されることになる。従って、本発明は、以下に示す細胞においてタンパク質の発現を誘導するための方法も提供する。
前述の本発明の方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を、
非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する方法。
非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する方法。
かかるタンパク質の発現を誘導するための方法における、本発明にかかる「タンパク質」、該タンパク質の発現が抑制されている「細胞」、「非天然アミノ酸」、「ｔＲＮＡ」及び「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」等については、前述の通りである。
本発明にかかる培地が含有する非天然アミノ酸の量（濃度）としては、本発明にかかるタンパク質の合成に十分な量であればよく、当業者であれば、本発明の方法に用いられる細胞の種類、前記タンパク質の発現を転写レベルにて制御する系（プロモーター等）の種類、前記ｔＲＮＡ及びｎａａＲＳの種類及び翻訳の効率等を考慮して、適宜調整し得るが、通常、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の方法における「前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳを、前記細胞内に存在させて培養する」ということは、前述の通り、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳは、前記細胞内において本来内在されていないものであるから、通常、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳを強制的に前記細胞に導入又は発現させることによって達成し得る。かかる強制的な導入又は発現は、当業者であれば公知の手法（例えば、前述の「天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて挿入されているタンパク質をコードする核酸を含有する細胞」の調製方法）を適宜選択して行うことができる。また、前記ｔＲＮＡ又は前記ｎａａＲＳを刺激に応答して誘導的に発現し得る前記細胞を用いる場合には、かかる刺激の存在下で培養することによって行うことができる。なお、かかる刺激及びそれに応答して誘導的に発現し得る系については、前述の通りである。
以上、本発明のタンパク質の発現を誘導するための方法について説明したが、かかる方法によって、発現の非誘導時には目的のタンパク質の発現を完全に抑制するが、誘導した際には当該タンパク質を高レベルにて発現させることができる。従って、かかるタンパク質の発現を誘導するための方法は、タンパク質の製造方法に利用し得る。すなわち、細胞においてタンパク質の発現を誘導するための方法であって、
本発明のタンパク質の発現を抑制するための方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を培養し、増殖させる工程と、前記工程にて増殖させた細胞を、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する工程と、該細胞から産生されるタンパク質を回収する工程とを含む、タンパク質の製造方法も、本発明は提供し得る。特に、かかるタンパク質の製造方法は前述の通り、毒性タンパク質の製造方法に特に好適に利用することができる。また、かかるタンパク質の製造方法における「タンパク質の回収」は、前記細胞に発現させたタンパク質の性状、発現させている細胞の種類等を考慮し、当業者であれば、公知の手法を適宜選択し、組み合わせることによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、界面活性剤等を含有する緩衝液による細胞の溶解、超音波破砕機等を用いた細胞の破砕、フィルターによる分画、カラム（例えば、陰イオン交換カラムや疎水性カラム）による精製、ゲルろ過、膜分画法、塩析、電気透析、減圧濃縮が挙げられる。
本発明のタンパク質の発現を抑制するための方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を培養し、増殖させる工程と、前記工程にて増殖させた細胞を、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する工程と、該細胞から産生されるタンパク質を回収する工程とを含む、タンパク質の製造方法も、本発明は提供し得る。特に、かかるタンパク質の製造方法は前述の通り、毒性タンパク質の製造方法に特に好適に利用することができる。また、かかるタンパク質の製造方法における「タンパク質の回収」は、前記細胞に発現させたタンパク質の性状、発現させている細胞の種類等を考慮し、当業者であれば、公知の手法を適宜選択し、組み合わせることによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、界面活性剤等を含有する緩衝液による細胞の溶解、超音波破砕機等を用いた細胞の破砕、フィルターによる分画、カラム（例えば、陰イオン交換カラムや疎水性カラム）による精製、ゲルろ過、膜分画法、塩析、電気透析、減圧濃縮が挙げられる。
また、本発明は、以下に示す、前述の本発明の方法に用いられるためのキットを提供する。
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも一の物質を含むキット
（ａ）前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｂ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｄ）前記非天然アミノ酸
（ｅ）前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードする核酸、前記ｔＲＮＡをコードする核酸及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸からなる群から選択される１の核酸を含有する細胞。
（ａ）前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｂ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｄ）前記非天然アミノ酸
（ｅ）前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードする核酸、前記ｔＲＮＡをコードする核酸及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸からなる群から選択される１の核酸を含有する細胞。
なお、本発明のキットにおいても、「前記コドン」、該コドンがインフレームにて挿入されている「タンパク質」、「非天然アミノ酸」、「ｔＲＮＡ」及び「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」等については、前述の通りである。
前記（ａ）〜（ｃ）に記載のベクターは、前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ又は前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡがプロモーターに作動可能に連結しているベクターである。本発明にかかるベクターは、前記ＤＮＡを前記細胞内にて発現（転写及び翻訳）するのに寄与する他の制御配列、例えば、複製開始点、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、ポリリンカー、エンハンサー、サイレンサー、リボゾーム結合部位等を適宜含むことができる。一般に、前記プロモーターの下流に、前記タンパク質等をコードするＤＮＡが位置し、さらに該遺伝子の下流にターミネーターが位置する。また、本発明にかかるベクターは、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等）を含んでいてもよい。また、このような本発明にかかるベクターの態様としては、例えば、プラスミドＤＮＡ、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
前記（ａ）に記載のベクターは、前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを下記ベクターに挿入することによって調製することもできる。
前記コドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位を含むベクター。
本発明において、「ＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
また、前記（ａ）に記載のベクターは、前記タンパク質をコードするＤＮＡを下記ベクターに挿入することによって調製することもできる。
タグタンパク質をコードするＤＮＡと、該タグタンパク質のＣ末側に融合して発現されるように、前記タンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含有するベクターであって、前記コドンがインフレームにて前記グタンパク質をコードするＤＮＡに挿入されているベクター。
このようなベクターを利用することにより、クローニング部位への挿入前又は挿入後に、前記タンパク質をコードするＤＮＡに前記コドンを挿入する必要はなくなる。さらに、前記タンパク質をコードするＤＮＡとして、特定の組織、細胞等からｍＲＮＡを抽出し、合成したｃＤＮＡをかかるベクターに挿入することによって、本発明の方法に供するｃＤＮＡライブラリーを構築することも可能となる。
なお、「タグタンパク質」及び「ＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」は前述の通りである。また、タグタンパク質のＣ末側と前記タンパク質との融合は直接的なものであってもよく、スぺーサー配列を介した間接的な融合であってもよい。
本発明にかかるベクターの標品においては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
前記（e）に記載の細胞は、本発明にかかるベクターを、前述の公知の手法により細胞に導入することによって調製することができる。また、本発明にかかる細胞の標品には、当該細胞の保存、培養に必要な培地、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加又は付属してあってもよい。
また、本発明のキットは使用説明書を含むものであってもよい。例えば、前述の本発明の方法に用いられるための前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含むキットの態様も本発明はとり得る。
本発明にかかる「使用説明書」は、前記ベクターや細胞を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明の標品に関する情報（例えば、ベクターの塩基配列やクローニングサイト等が示されているベクターマップ等の情報、細胞の由来、性質、当該細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
先ず、本発明者らは、タンパク質の発現を厳密に制御する（発現誘導時にはタンパク質を高レベルで発現させ、発現非誘導時にはタンパク質の発現を完全に抑制する）ために、図１に示すように、非天然アミノ酸と、これと終止コドンとを対応づけるように人工的に改変されたｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｎａａＲＳ）とを用いるタンパク質発現制御系を構想した。
すなわち、非天然アミノ酸の存在下、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳが細胞内に発現している場合には、目的とするタンパク質をコードする遺伝子内に挿入された終止コドン（図中、ＵＡＧ）に対応する前記非天然アミノ酸が組み込まれ、目的タンパク質の合成（翻訳）を進めることができる。一方、前記非天然アミノ酸、前記ｔＲＮＡ及び前記ｎａａＲＳの３要素のうちの少なくとも１の要素が欠落すると、前記終止コドンに対応する前記非天然アミノ酸を組み込むことができず、目的タンパク質の合成は停止することが想定される。そこで、以下に示す方法にて、図１に示すモデルの有効性について評価した。
なお、以下に示す実施例において特に断りのない限り、大腸菌の培養は、３５℃、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地にて行った。また、この培地には特に断りのない限り、抗生物質（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン及び５０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール）を添加して培養に供した。
（実施例１）
図１に示すモデルにおける非天然アミノ酸の重要性を検証すべく、人工的に改変したｎａａＲＳ及びｔＲＮＡを恒常的に発現させた大腸菌を、非天然アミノ酸の存在下又は非存在下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。なお、実施例１〜９においては、非天然アミノ酸として「３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ）」を用い、前記ｎａａＲＳとして、前記アンバー終止コドンに対応して非天然アミノ酸（３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ））を導入するＩＹＲＳを用い、前記ｔＲＮＡとしてＭＪＲ１を用いた。
図１に示すモデルにおける非天然アミノ酸の重要性を検証すべく、人工的に改変したｎａａＲＳ及びｔＲＮＡを恒常的に発現させた大腸菌を、非天然アミノ酸の存在下又は非存在下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。なお、実施例１〜９においては、非天然アミノ酸として「３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ）」を用い、前記ｎａａＲＳとして、前記アンバー終止コドンに対応して非天然アミノ酸（３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ））を導入するＩＹＲＳを用い、前記ｔＲＮＡとしてＭＪＲ１を用いた。
先ず、開始コドンの直後にアンバー終止コドンを１個挿入したＥＧＦＰ遺伝子と、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターとを含む発現調節領域とを、フュージョンＰＣＲ法により融合させた。そして、この融合遺伝子をｐＵＣ由来のプラスミド:ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、発現コンストラクトを作製した。なお、ＥＧＦＰ遺伝子の開始コドンの直後へのアンバー終止コドンの挿入は、ＥＧＦＰ遺伝子の開始コドンの直後にアンバー終止コドンが挿入された配列を有するプライマーを設計し、このプライマーを用いた高信頼性ＰＣＲによって行った。また、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターはｐＵＣ１９よりサブクローニングすることにより調製した。この発現コンストラクトにおいて、ＥＧＦＰ遺伝子は、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下では、その転写が誘導される。一方、ブドウ糖（Ｇｌｃ）の存在下では、その転写は抑制される。
次に、前記アンバー終止コドンに対応して非天然アミノ酸（３−ヨード−Ｌ−チロシン（ＩＹ）)を導入する、ｎａａＲＳ（ＩＹＲＳ）及びｔＲＮＡ（ＭＪＲ１）はｐ１５ａ由来のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４に挿入した。なお、このプラスミドを大腸菌に導入することにより、大腸菌チロシルｔＲＮＡシンテターゼプロモーター及びｌｐｐプロモーターの制御下、ＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を各々大腸菌内にて恒常的に発現させることができる。また、ＩＹは、渡辺化学工業より購入したもの（コード番号：Ｈ００１０３）を使用した。ＩＹＲＳ及びＭＪＲ１は、理化学研究所より分譲されたもの（ｐＴＹＲ
ＭｊＩＹＲＳ２−１（Ｄ２８６）ＭＪＲ１Ｘ３）を使用した。すなわち、ＩＹＲＳは配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるものを使用した。ＭＪＲ１は配列番号：２に記載の塩基配列からなるものを使用した（Ｓａｋａｍｏｔｏ
Ｋ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ 参照）。
ＭｊＩＹＲＳ２−１（Ｄ２８６）ＭＪＲ１Ｘ３）を使用した。すなわち、ＩＹＲＳは配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるものを使用した。ＭＪＲ１は配列番号：２に記載の塩基配列からなるものを使用した（Ｓａｋａｍｏｔｏ
Ｋ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ 参照）。
上記の通り調製した２種のプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１−ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。そして、形質転換した大腸菌を、１ｍＭ
ＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ）Ｇｌｃを含有する培地にて１６時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図２に示す。
ＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ）Ｇｌｃを含有する培地にて１６時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図２に示す。
図２に示す通り、非天然アミノ酸非添加時における目的タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現量は、非天然アミノ酸添加時におけるそれの約０．０７となり、目的タンパク質の翻訳レベルは大幅に低減することが明らかになった。従って、非天然アミノ酸の培地への添加、非添加によって、該非天然アミノ酸に対応する終止コドンが挿入された遺伝子によってコードされる目的タンパク質の翻訳を、スイッチングできることが明らかになった。
（実施例２）
図１に示すモデルにおける、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるｎａａＲＳの重要性を検証すべく、前記ｔＲＮＡを恒常的に発現させ且つ前記ｎａａＲＳは誘導的に発現させる大腸菌を、前記ｎａａＲＳ発現の誘導条件下又は非誘導条件下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。
図１に示すモデルにおける、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるｎａａＲＳの重要性を検証すべく、前記ｔＲＮＡを恒常的に発現させ且つ前記ｎａａＲＳは誘導的に発現させる大腸菌を、前記ｎａａＲＳ発現の誘導条件下又は非誘導条件下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。
先ず、開始コドンの直後にアンバー終止コドンを１個挿入したＥＧＦＰ遺伝子と、ｂｌａプロモーターとを、フュージョンＰＣＲ法により融合させた。そして、この融合遺伝子をｐＵＣ由来のプラスミドｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、発現コンストラクトを作製した。なお、ｂｌａプロモーターはｐＢＲ３２２よりサブクローニングすることにより調製した。また、この発現コンストラクトにおいて、ＥＧＦＰは転写レベルでは恒常的に発現される。
次に、実施例１にて調製したＩＹＲＳ及びＭＪＲ１をコードするプラスミドにおいて、前記大腸菌チロシルｔＲＮＡシンテターゼプロモーター（ＩＹＲＳのプロモーター）を、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターを含む発現調節領域に、フュージョンＰＣＲ法により置換する改変を施した。その結果、ＩＹＲＳの発現は、ＩＰＴＧにより誘導され、一方Ｇｌｃによって抑制されることになる。なお、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターは、ｐＵＣ１９よりサブクローニングすることにより調製した。また、当該発現調節領域については、Ｓａｋａｍｏｔｏ
Ｋ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ 参照のこと。
Ｋ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００９年、１７巻、３３５〜３４４ページ 参照のこと。
上記の通り調製した２種のプラスミドを、大腸菌ＭＶ１１８４に導入した。形質転換した大腸菌を、グルコース単独添加した培地で１夜培養し、その後、１ｍＭ
ＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地、０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃを含有する培地に、培養した大腸菌を１／２００容になるよう播種した。そして、２４時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図３に示す。
ＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地、０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃ及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃを含有する培地に、培養した大腸菌を１／２００容になるよう播種した。そして、２４時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図３に示す。
図３に示した結果から明らかなように、非天然アミノ酸（ＩＹ）存在下、ＩＹＲＳが発現している場合（ＩＰＴＧ＋ＩＹ）には、目的タンパク質の強い発現が認められた。一方、ＩＹＲＳの発現が抑制されている条件下では、非天然アミノ酸存在下でも、目的タンパク質の発現を殆ど検出することができなかった。従って、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるｎａａＲＳの発現誘導、発現非誘導によって、目的タンパク質の翻訳をスイッチングできることが明らかになった。
（実施例３）
図１に示すモデルにおける、非天然アミノ酸と終止コドンとを対応づけるｔＲＮＡ（ＭＪＲ１）の重要性を検証すべく、ＩＹＲＳを恒常的に発現させ且つＭＪＲ１は誘導的に発現させる大腸菌を、ＭＪＲ１発現の誘導条件下又は非誘導条件下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。
図１に示すモデルにおける、非天然アミノ酸と終止コドンとを対応づけるｔＲＮＡ（ＭＪＲ１）の重要性を検証すべく、ＩＹＲＳを恒常的に発現させ且つＭＪＲ１は誘導的に発現させる大腸菌を、ＭＪＲ１発現の誘導条件下又は非誘導条件下にて培養し、目的タンパク質の発現量を分析した。
次に、実施例１にて調製したＩＹＲＳ及びＭＪＲ１をコードするプラスミドにおいて、前記ｌｐｐプロモーター（ＭＪＲ１のプロモーター）を、Ｔ７プロモーター及びラクトースオペレーターを含む発現調節領域に、フュージョンＰＣＲ法により置換する改変を施した。なお、当該発現調節領域は、ｐＤＥＳＴ４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）よりサブクローニングすることにより調製した。
また、実施例３において目的タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現させるためのプラスミドとして、実施例２に記載の、ＥＧＦＰを転写レベルにて恒常的に発現させるプラスミドを用いた。
上記の通り調製した２種のプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１−ＡＩに導入した。ＢＬ２１−ＡＩは、Ｌ−アラビノースによりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを誘導的に発現し、Ｇｌｃによって抑制される。その結果、ＭＪＲ１の発現は、Ｌ−アラビノース及びＩＰＴＧにより誘導され、一方Ｇｌｃによって抑制されることになる。
形質転換した大腸菌を、０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃ単独添加した培地でプラスミドにて１夜培養し、その後、１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノース及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＩＹを含有する培地、０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃ及び０．１ｍｇ／ｍｌ
ＩＹを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃを含有する培地に、培養した大腸菌を１／２００容になるよう播種した。そして、２４時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ、Ｌ−アラビノース及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図４に示す。
ＩＹを含有する培地又は０．５％（ｗ／ｖ） Ｇｌｃを含有する培地に、培養した大腸菌を１／２００容になるよう播種した。そして、２４時間培養し、波長５９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。さらに、ＩＰＴＧ、Ｌ−アラビノース及びＩＹを含有する培地における測定値を１とし、他の培地における測定値を換算した。得られた結果を図４に示す。
図４に示した結果から明らかなように、非天然アミノ酸（ＩＹ）の存在下、ＭＪＲ１が発現している場合（ＩＰＴＧａｒａ＋ＩＹ）には、目的タンパク質の強い発現が認められた。一方、ＭＪＲ１の発現が抑制されている条件下では、非天然アミノ酸の存在下でも、目的タンパク質の発現を検出することができなかった。従って、アンバー終止コドン等を認識し且つ非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡの発現誘導、発現非誘導によって、目的タンパク質の翻訳をスイッチングできることが明らかになった。
（実施例４）
開始コドンの直後にアンバー終止コドンを、０個、１個、２個又は３個挿入したＥＧＦＰ遺伝子と、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターを含む発現調節領域とを融合させ、ｐＤＯＮＲ２２１に導入し、発現コンストラクトを作製した。この発現コンストラクトにおいて、ＥＧＦＰは、ＩＰＴＧの存在下では、その発現が誘導される。一方、Ｇｌｃの存在下では、その発現は抑制される。
開始コドンの直後にアンバー終止コドンを、０個、１個、２個又は３個挿入したＥＧＦＰ遺伝子と、ｌａｃＩ遺伝子、ラクトースプロモーター及びラクトースオペレーターを含む発現調節領域とを融合させ、ｐＤＯＮＲ２２１に導入し、発現コンストラクトを作製した。この発現コンストラクトにおいて、ＥＧＦＰは、ＩＰＴＧの存在下では、その発現が誘導される。一方、Ｇｌｃの存在下では、その発現は抑制される。
また、実施例４においてＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を発現させるためのプラスミドとして、実施例１に記載の、ＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を恒常的に発現させるプラスミドを用いた。
上記の通り調製した２種のプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１−ＡＩに導入した。形質転換した大腸菌を、ＥＧＦＰの発現を転写レベル及び翻訳レベルにて誘導する条件（１ｍＭ
ＩＰＴＧ及び０．１ ｍｇ／ｍｌ ＩＹ）又はＩＹ非添加によってＥＧＦＰの発現を翻訳レベルにて抑制する条件（１ｍＭ ＩＰＴＧのみ）にて、１６時間培養し、ＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。ＥＧＦＰの発現を転写レベル及び翻訳レベルにて誘導する条件における結果を図５に示す。また、翻訳レベルにて抑制する条件下における測定値については、それぞれの転写レベル及び翻訳レベルにて誘導する条件における測定値を１として相対値に換算した。この換算した結果をを図６に示す。
ＩＰＴＧ及び０．１ ｍｇ／ｍｌ ＩＹ）又はＩＹ非添加によってＥＧＦＰの発現を翻訳レベルにて抑制する条件（１ｍＭ ＩＰＴＧのみ）にて、１６時間培養し、ＥＧＦＰ由来の蛍光強度を測定した。ＥＧＦＰの発現を転写レベル及び翻訳レベルにて誘導する条件における結果を図５に示す。また、翻訳レベルにて抑制する条件下における測定値については、それぞれの転写レベル及び翻訳レベルにて誘導する条件における測定値を１として相対値に換算した。この換算した結果をを図６に示す。
図５に示す通り、目的タンパク質の発現を転写レベルにて誘導する条件下では、目的タンパク質の発現量はアンバー終止コドンの重ね数が多くなるほど減少することが明らかになった。また、図には示さないが、翻訳レベルにて抑制する条件下においても、目的タンパク質の発現量はアンバー終止コドンの重ね数が多くなるほど減少した。そして、その減少の度合いは、転写レベルにて誘導する条件下における減少より大きかった。さらに、図６に示した結果から明らかなように、転写レベルにて誘導する条件下に対する、翻訳レベルにて抑制する条件下における目的タンパク質発現量の相対値は、アンバー終止コドンの重ね数に伴って減少した。従って、アンバー終止コドンの多重化によって、目的タンパク質の発現をより厳密に制御できることが明らかになった。
以上の通り、実施例１〜４の結果から、図１に示したタンパク質の発現制御系は有効であることが明らかになった。すなわち、天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて挿入されている前記タンパク質をコードする核酸を含有する細胞を、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養することによって、当該細胞においてタンパク質の発現を抑制できることが明らかになった
（Ｉ） 非天然アミノ酸を含有しない培地における、前記細胞の培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
（Ｉ） 非天然アミノ酸を含有しない培地における、前記細胞の培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
また、前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の培養条件を解除することにより、かかる培養条件によって抑制されていたタンパク質の発現は誘導されることも明らかになった。
（実施例５）
本発明の方法が、強毒性タンパク質を保持するプラスミドを構築することに適しているかどうか、以下に示す方法にて評価した。
本発明の方法が、強毒性タンパク質を保持するプラスミドを構築することに適しているかどうか、以下に示す方法にて評価した。
無毒のタンパク質ｌａｃＺα又は強毒性タンパク質ｃｏｌＥ３の酵素ドメイン（ｃｏｌＥ３ｅ）をコードする遺伝子の開始コドン直後に、アンバー終止コドンを０〜３個挿入した発現コンストラクトの構築を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙシステムを用いて行った。
すなわち、Ｇａｔｅｗａｙの基本手順に従い、先ずプロモーターのないエントリーベクター（ｐＤＯＮＲ２２１）に、目的遺伝子（アンバー終止コドンが開始コドン直後に０〜３個挿入されたｌａｃＺα遺伝子又はｃｏｌＥ３ｅ遺伝子）をクローニングした。また、これらプラスミドのインサートを、ｌａｃＩ遺伝子、Ｔ７プロモーター及びラクトースオペレーターを含む発現調節領域をもつ発現ベクター（ｐＤＥＳＴ４２）に各々導入し、発現コンストラクトを調製した。
そして、かかる発現コンストラクト（前記目的遺伝子が挿入された、ｐＤＯＮＲ２２１及びｐＤＥＳＴ４２）の調製において、目的の発現コンストラクトを保持する大腸菌が得られるかどうかを解析した。発現コンストラクトの調製には、アンバー抑制能がなく、かつＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを持たない大腸菌（ＭＶ１１８４株）を用いた。なお、「アンバー抑制能」とは、ｔＲＮＡの変異により、アンバー終止コドンにチロシンやグルタミン酸等のアミノ酸を導入して翻訳を続行させる能力を意味する。また、大腸菌の培養は２０％寒天を添加して調製した固形培地にて行った。さらに、ｐＤＥＳＴ４２を導入した大腸菌を培養する際には、培地にはカナマイシンの代わりにカルベニシリンを１００μｇ／ｍｌにて添加した（ｐＤＥＳＴ４２を導入した大腸菌の培養については、後述の実施例６及び７においても同じ）。得られた結果を表１に示す。表１に記載の「Ｓ」は発現コンストラクトを得ることができたことを意味し、「Ｆ」は発現コンストラクトを得ることができなかったことを意味し、「Ｎ．Ｔ．」は発現コンストラクトの調製を行っていないことを示す。
表１に示す通り、無毒のタンパク質であるｌａｃＺαは、アンバー終止コドンの挿入の有無にかかわらず、発現コンストラクトを得ることが出来た。一方、強毒性タンパク質であるｃｏｌＥ３ｅは、アンバー終止コドンが挿入されていない場合には、プロモーターのないｐＤＯＮＲ２２１でさえ、かかる発現コンストラクトを得ることが出来なかった。プラスミドの組換え部位の塩基配列に微弱なプロモーター活性があり、それに起因するｃｏｌＥ３ｅのわずかな発現によって宿主である大腸菌が死滅したことが推測される。しかし、アンバー終止コドンを１〜３個挿入した場合には、ｃｏｌＥ３ｅをコードするプラスミドを得ることが出来た。
従って、本発明の方法において、アンバー終止コドンを毒性タンパク質をコードする遺伝子内に挿入することにより、当該タンパク質をコードする発現コンストラクトの構築が可能となることが明らかになった。
（実施例６）
本発明の方法によって、強毒性タンパク質をコードする発現コンストラクトを導入した宿主細胞を作製できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。
本発明の方法によって、強毒性タンパク質をコードする発現コンストラクトを導入した宿主細胞を作製できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。
開始コドンの直後にアンバー終止コドン１個が挿入されたｃｏｌＥ３ｅ遺伝子を有するｐＤＥＳＴ４２を調製した。また、対照として、開始コドンの直後にアンバー終止コドン１個が挿入されたｌａｃＺαを有するｐＤＥＳＴ４２も調製した。
また、実施例６においてＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を発現させるためのプラスミドとして、実施例１に記載のＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を恒常的に発現させるプラスミド、実施例２に記載のＭＪＲ１を恒常的に発現させ且つＩＹＲＳを誘導的に発現させるためのプラスミド、又は、実施例３に記載のＩＹＲＳを恒常的に発現させ且つＭＪＲ１を誘導的に発現させるためのプラスミドを用いた。
上記の通り調製した、ｃｏｌＥ３ｅ又はｌａｃＺαをコードするプラスミドと、ＩＹＲＳ及びＭＪＲ１をコードするプラスミドとを、エレクトロポレーション法でＢＬ２１−ＡＩに導入した。そして、これらプラスミドを導入した大腸菌を表２に示す条件にて培養した。なお、いずれの条件においても、Ｌ−アラビノース及びＩＰＴＧを添加せず、Ｇｌｃを添加することによって、ｃｏｌＥ３ｅの転写レベルでの発現は強く抑制されている。
そして、ｃｏｌＥ３ｅが導入された大腸菌のコロニー数を、ＬａｃＺαが導入された大腸菌のコロニー数を１として標準化した、得られた結果を図７に示す。
図７に示す通り、アンバー終止コドンにＩＹを導入するＩＹＲＳ及びＭＪＲ１を恒常的に発現させ、かつＩＹを培地に加えることにより、ｃｏｌＥ３ｅの翻訳に必要な要素を全て揃えた場合、ｃｏｌＥ３ｅの転写レベルでの発現は強く抑制されているにも関わらず、コロニーはほとんど生じなかった（図中「１」の結果を参照）。また、ＩＹを培地から除いても、コロニーはほとんど生じなかった（図中「２」の結果を参照）。しかし、ＩＹＲＳの発現を誘導しなかった場合にはコロニーの形成が認められ（図中「３」の結果を参照）、また、ＭＪＲ１の発現を誘導しなかった場合には、無毒性タンパク質を導入した大腸菌同様に、顕著なコロニーの形成、すなわち大腸菌の顕著に高い生存率が認められた（図中「４」の結果を参照）。
（実施例７）
本発明の方法によって、強毒性タンパク質をコードする発現コンストラクトを保持する宿主細胞を維持できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。
本発明の方法によって、強毒性タンパク質をコードする発現コンストラクトを保持する宿主細胞を維持できるかどうかを、以下に示す方法にて評価した。
実施例６において得られた、ｃｏｌＥ３ｅ発現コンストラクトを保持する組換え大腸菌を、滅菌生理食塩水で波長５９０nmにおける光学密度が０．３になるよう調製し、さらに６０００倍に希釈した。また、実施例６に記載の方法と同様の方法にて、開始コドンの直後にアンバー終止コドン２個又は３個が挿入されたｃｏｌＥ３ｅ遺伝子又はアンバー終止コドンが１個挿入されたｌａｃＺα遺伝子を保持する組換え大腸菌を作製し、これら大腸菌について前記同様に希釈液を調製した。
そして、これら希釈液を新たな固形培地上に播種し、表３及び４に示す条件にて培養し、生じたコロニーを数えた。コロニー数は、同アンバー終止コドン挿入数かつ同組成培地におけるＬａｃＺαコロニー数に対して標準化した値を算出した。得られた結果を図８〜１０に示す。
なお、表３及び４において「転写レベルの発現」とはｃｏｌＥ３ｅの発現が転写レベルにて誘導されているか否かを示すものである。
図８〜１０に示した結果から明らかなように、転写レベルで翻訳レベルでもｃｏｌＥ３ｅの発現が抑制されていない場合には、大腸菌は全て死滅し、コロニーは生じなかった（図中「１」〜「３」参照）。また、転写レベルにて発現が抑制され、翻訳レベルでは発現が抑制されていない際には、アンバー終止コドンを３重に挿入した場合のみ少数のコロニーが生じたが、それ以下のアンバー挿入数では全て死滅した（図中「４」参照）。さらに、転写レベルでの発現抑制に加え、ＩＹ、ＩＹＲＳ及びＭＪＲ１の中の少なくとも１つの要素を欠落させることにより、翻訳レベルでの発現を抑制した際には、アンバー終止コドンを２重又は３重に挿入した場合において、ｌａｃＺα遺伝子を保持する大腸菌と同等又はそれ以上のコロニー数が得ることができた（図９及び１０の「５」〜「９」参照）。また、アンバー終止コドンを１個挿入した場合においては、ＭＪＲ１を発現させないことによって、ｌａｃＺα遺伝子を保持する大腸菌と同等又はそれ以上のコロニー数が得ることができた（図８の「８」及び「９」参照）。
従って、実施例６に記載の結果も考慮するに、本発明の方法においては、下記３条件の内、特に（Ｉ）及び（ＩＩ）の培養条件を組み合わせることによって、タンパク質の発現をより強く抑制できることが明らかになった（図７の「４」及び図８の「８」及び「９」参照）。
（Ｉ） 非天然アミノ酸を含有しない培地における細胞の培養
（ＩＩ） 細胞内にて、アンバー終止コドン等を認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 細胞内にて、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
（Ｉ） 非天然アミノ酸を含有しない培地における細胞の培養
（ＩＩ） 細胞内にて、アンバー終止コドン等を認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 細胞内にて、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。
（実施例８）
実施例２に記載の発現コンストラクトを保持する大腸菌を
１ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．１％（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％（ｗ/ｖ）ＩＹ及び０．５％Ｇｌｃを添加した培地、
１ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．５％（ｗ/ｖ）Ｇｌｃを添加した培地又は
０．５％（ｗ/ｖ）Ｇｌｃを添加した培地にて培養し、実施例２に記載と同様の方法にて評価した。得られた結果を図１１に示す。
実施例２に記載の発現コンストラクトを保持する大腸菌を
１ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．１％（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．１％（ｗ/ｖ）ＩＹ及び０．５％Ｇｌｃを添加した培地、
１ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．５％（ｗ/ｖ）Ｇｌｃを添加した培地又は
０．５％（ｗ/ｖ）Ｇｌｃを添加した培地にて培養し、実施例２に記載と同様の方法にて評価した。得られた結果を図１１に示す。
図１１に示した結果から明らかなように、ＩＹ存在下で、ＩＹＲＳの発現誘導時（ＩＰＴＧ添加）に０．５％（ｗ/ｖ）Ｇｌｃを加えることにより、カタボライト抑制を生じさせ、ＩＹＲＳの発現を弱く抑制した結果（ＧｌｃＩＰＴＧ＋ＩＹ）、ＩＹＲＳの発現を最大に誘導した時（ＩＰＴＧ＋ＩＹ）に比べて、ＥＧＦＰの発現量は約２５％に低減した。さらに、ＩＹＲＳの低発現による弱い翻訳抑制状態において、ＩＹを除くと、翻訳効率は約３％に減少した（ＧｌｃＩＰＴＧ）。
従って、非天然アミノ酸とｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するｎａａＲＳ（ＩＹＲＳ）の誘導、非誘導による翻訳のスイッチングは、非天然アミノ酸の添加、非添加による翻訳のスイッチングと併用することにより、目的タンパク質の発現制御の厳密性を相乗的に高めることができることが明らかになった。
（実施例９）
実施例３に記載の発現コンストラクトを保持する大腸菌を
１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノース及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭＩＰＴＧを添加した培地、
０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノース及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノースを添加した培地又は
０．５％Ｇｌｃを添加した培地にて培養し、実施例３に記載と同様の方法にて評価した。得られた結果を図１２に示す。
実施例３に記載の発現コンストラクトを保持する大腸菌を
１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノース及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭＩＰＴＧ及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
１ｍＭＩＰＴＧを添加した培地、
０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノース及び０．１ｍｇ/ｍｌ（ｗ/ｖ）ＩＹを添加した培地、
０．２％（ｗ/ｖ）Ｌ−アラビノースを添加した培地又は
０．５％Ｇｌｃを添加した培地にて培養し、実施例３に記載と同様の方法にて評価した。得られた結果を図１２に示す。
図１２に示した結果から明らかなように、ＩＹ存在下で、ＭＪＲ１の最大誘導に必要なＩＰＴＧ及びＬ−アラビノースのうちの一方を除くことにより、ＭＪＲ１の発現を弱くした結果、最大誘導した時（ＩＰＴＧａｒａ＋ＩＹ）に比べて、ＩＰＴＧのみ（ＩＰＴＧ＋ＩＹ）では約３９％、Ｌ−アラビノースのみ（ａｒａ＋ＩＹ）では約６９％に、ＥＧＦＰの翻訳効率が低減した。さらに、ＭＪＲ１の低発現による弱い翻訳抑制状態において、ＩＹを除くと、翻訳効率は、各々約１６％（ＩＰＴＧ）及び３２％（ａｒａ）に減少した。
従って、非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡ（ＭＪＲ１）の誘導、非誘導による翻訳のスイッチングは、非天然アミノ酸の添加、非添加による翻訳のスイッチングと併用することにより、目的タンパク質の発現制御の厳密性を相乗的に高めることができることが明らかになった。
以上説明したように、本発明によれば、タンパク質の発現を制御する際に、非誘導時において目的タンパク質の発現を殆ど抑制することが可能となる。
従って、本発明のタンパク質の発現を抑制又は誘導するための方法、並びにこれらの方法に用いられるためのキットは、分子生物学や生化学分野等における研究開発や、食品、医薬品、化粧品及び機能材料の分野における、組換えタンパク質の効率性の良い大量生産等において有用である。特に、本発明によれば、非誘導時において目的タンパク質の発現を完全に抑制することができるため、本発明の方法並びにキットは、強い細胞毒性をもつタンパク質の研究、大量生産に有用である。
配列番号：１
＜２２３＞ 人工的に改変されたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列
配列番号：２
＜２２３＞ 人工的に改変されたｔＲＮＡの配列
＜２２３＞ 人工的に改変されたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列
配列番号：２
＜２２３＞ 人工的に改変されたｔＲＮＡの配列
Claims (4)
- 細胞においてタンパク質の発現を抑制するための方法であって、
前記細胞が、開始コドンの直後に２又は３個の天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質を、コードする核酸を含有する細胞であり、
前記核酸がコードするｍＲＮＡの発現は、刺激に応答して誘導されるものであり、
前記ｍＲＮＡに基づく前記タンパク質の合成は、非天然アミノ酸を含有する培地において、前記コドンを認識し且つ前記非天然アミノ酸に結合し得るｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と前記ｔＲＮＡとの結合を特異的に触媒するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとを、前記細胞内に存在させて培養した場合に、誘導されるものであり、
前記細胞を、前記刺激の非存在下にて、更に下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群から選択される少なくとも一の培養条件で培養する方法
（Ｉ） 前記非天然アミノ酸を含有しない培地において培養
（ＩＩ） 前記細胞内にて、前記ｔＲＮＡを存在させることなく培養
（ＩＩＩ） 前記細胞内にて、前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを存在させることなく培養。 - 細胞においてタンパク質の発現を誘導するための方法であって、
請求項１に記載の方法により前記タンパク質の発現が抑制されている細胞を、
前記刺激の存在下、前記非天然アミノ酸を含有する培地において、前記ｔＲＮＡ及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを、前記細胞内に存在させて培養する方法。 - 前記コドンがアンバー終止コドンである、請求項１又は２に記載の方法。
- 下記（ａ）〜（ｅ）に記載の物質を含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｂ）前記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｃ）前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするＤＮＡを含有するベクター
（ｄ）前記非天然アミノ酸
（ｅ）開始コドンの直後に２又は３個の前記天然アミノ酸に対応しないコドンがインフレームにて連続して挿入されている前記タンパク質をコードする核酸、前記ｔＲＮＡをコードする核酸及び前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸からなる群から選択される少なくとも１の核酸が導入される又は導入された細胞。
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