KR20140112888A

KR20140112888A - 재조합 단백질의 과발현을 위한 번역속도 조절용 램프 태그 및 이용

Info

Publication number: KR20140112888A
Application number: KR1020130027549A
Authority: KR
Inventors: 김근중; 박원지
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2014-09-24
Also published as: WO2014142453A1; US10227595B2; CN105143464B; KR101446054B1; US20160017341A1; CN105143464A

Abstract

본 발명은 대장균(E.coli)에서 재조합 단백질을 발현시킬 때, 외래 유전자 내의 코돈(codon)과 숙주의 호환성이 좋지 않아 발생하는 번역속도의 불안정성을 해결할 수 있는 램프 태그(ramp tag)에 관한 것이다. 본 발명은 희귀 코돈(rare codon)의 문제를 해결하는 기존의 코돈 최적화(codon optimization) 또는 코돈 탈최적화(codon deoptimization) 방법과 달리 원래의 코돈 서열을 바꾸지 않고 단지 램프 태그를 목적 유전자와 융합하거나 독립적으로 발현하도록 하여 tRNA를 재사용하게 함으로써 목적 단백질의 발현 효율을 증가시킨다. 따라서 본 발명은 DNA 서열을 인공으로 합성하는 코돈 최적화 방법에 비해 비용과 시간을 절감할 수 있는, 재조합 단백질 발현을 증가시키는 새로운 방법으로 부가가치가 높은 의약품이나 산업용 효소의 생산에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

재조합 단백질의 과발현을 위한 번역속도 조절용 램프 태그 및 이용 {Translational rate-regulating ramp tag for recombinant protein over- expression and use thereof}

본 발명은 대장균(E.coli)에서 재조합 단백질을 발현시킬 때, 외래 유전자 내의 코돈(codon)과 숙주의 호환성이 좋지 않아 발생하는 번역속도의 불안정성을 해결할 수 있는 합성태그에 대한 것이다. 희귀 코돈(Rare codon)의 문제를 해결하는 기존의 코돈 최적화(codon optimization) 방법과 달리 원래의 코돈 서열을 바꾸지 않고 단지 태그(tag)가 전사나 번역 단계에서 목적유전자의 내/외부에서 함께 거동(tRNA의 채택 유도와 재사용 제공)하게 함으로써 단백질의 발현 양을 조절하는 원리를 이용한 것이다.

재조합 단백질이란 동물, 식물, 효모, 박테리아에서 유래한 고부가가치의 유전산물을 암호화하고 있는 유전자를 발현이 용이한 숙주인 효모나 대장균에 이식하여 대량의 산물이 생산될 수 있도록 유전자 조작을 거친 단백질을 지칭한다. 최초 재조합 단백질은 1983년 당뇨병 치료목적으로 사람의 인슐린 유전자를 대장균에서 발현시켜 대량 생산하였던 것으로 시작되었다. 그 후 대부분의 생명과학분야에서 다양한 유전자 재조합 발현 연구가 진행되고 있다. 생산성은 비용으로 이어지기 때문에 재조합 단백질의 대량 생산은 다양한 응용에 필수적 요소이다. 따라서 재조합 기술의 등장으로 과거 자연상태로부터 미량으로 얻을 수밖에 없었던 인간에게 유용한 의료용 단백질이나 산업용 효소 등의 대량 생산이 가능하게 되었다. 대장균(E.coli)은 이러한 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이다. 인슐린을 비롯하여 호르몬과 산업용 효소 등이 대장균에 의해 성공적으로 생산되어왔다.

생화학적으로 모든 생물이 동일한 유전자 단위의 구성과 기능을 갖기 때문에 유전자를 재조합하여 이종 숙주에서 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 유전자는 기능적으로 크게 두 부분으로 나뉠 수 있다. DNA에서 mRNA를 합성하는 전사(transcription)과정과 mRNA에서 단백질(protein)을 합성하는 번역(translation)과정을 담당하고 있는 유전자 조절부분(cis-acting element와 UTR)과 전사와 번역조절을 받아 실제로 단백질로 발현되는 부분인 ORF(Open Reading Frame; 개방형 해독틀)로 구성되어 있다. 이 조절부분과 ORF는 상호 모듈성을 지니기 때문에 목적유전자의 ORF 부분만을 조절부분으로 구성된 벡터(vector)에 삽입하여 기능적 유전자 단위를 완성함으로써 발현이 가능하다. 따라서 벡터(vector)에 조절 부위들로 이용할 수 있는 요소들이 개발되어, 목적하는 단백질의 특성에 맞춰 발현 시점과 발현 양을 조절할 수 있다. 그러나 유전자 발현효율은 항상 동일하지 않기 때문에 가장 높은 발현 양을 보이는 최적조건 확립에 많은 시간과 비용이 소비된다. 특히 내재된 단백질의 안정성이나 단백질 접힘 등의 문제로 실험적으로는 감지할 수 없을 정도로 발현이 잘 되지 않는 경우가 재조합 단백질 생산에 가장 큰 어려움이다. 따라서 가장 효율적인 재조합 단백질의 생산은 감지할 수 있는 이상의 양으로 어느 정도 과발현 되면서 가용성(solubility)이 높은 형태를 갖도록 하는 것이다.

일반적으로 발현 효율을 높이기 위해 벡터, 숙주, ORF 수준에서 엔지니어링을 시도한다. 벡터는 전사/번역인자와 복제인자 등으로 구성되어 있으며 각 인자들은 여러 변이체가 만들어져 있다. 최근에는 전형적인 이들 요소 외에 새로운 조절인자들이 발굴되어 발현 효율의 증가를 위한 다양한 조합 조절이 시도되고 있다. 이러한 방식으로 개별 연구실은 물론, New England Biolabs, Promega, Life Technology와 같은 거대 기업들이 상용화된 새로운 발현 모듈을 제공하고 있다. 이러한 과정에 단백질 접힘(protein folding)이나 회수(recovery)를 돕는 기능성 태그(tag)를 장착한 벡터를 이용해 단백질의 가용성(solubility)을 높여 주거나 정제과정의 용이성을 제공한다. 가장 보편적이고 간단한 방식일 뿐만 아니라, 재조합 단백질 기능에 미치는 영향이 적은 비-간섭성도 담보되기 때문에 많이 시도되는 방법이다.

숙주세포는 재조합 단백질의 발현에 영향을 미치는 환경을 충족하는데 매우 중요한 인자 중의 하나이다. 숙주세포 내 chaperon이 단백질의 접힘과 안정성에 영향을 미칠 뿐 아니라 전사/번역을 담당하는 trans-regulatory element를 제공하기 때문에 단백질 생산에서 중요하게 고려되어야 한다. 특히, 번역과정은 뉴클레오타이드 서열을 아미노산 서열로 변환하는 과정이기 때문에 아미노산, tRNA 등의 고에너지 단위체를 많이 소모하므로 경제적인 방식으로 진행되도록 제한된 tRNA와 유전체가 짝을 이루어 발현하도록 진화되었다. 이러한 결과로 숙주의 tRNA pool 내에서 유전체의 ORF가 구성되게 되고, 따라서 ORF의 codon usage는 61개가 균일하게 분포하지 않고 세포마다 제한된 codon으로 각각의 아미노산을 발현시키는 bias를 보인다(Sharp, P.M & Li, W. H., 1987). 이러한 codon bias는 모든 생물체가 갖는 특성이며, 효모와 대장균도 강한 codon bias를 보이는 것으로 알려져 있다.

외래 ORF 코돈이 숙주의 codon usage와 유사하지 않을 경우, tRNA의 부족현상으로 발현율 저하를 초래하기 때문에 ORF와 숙주시스템의 코돈 호환성을 고려하는 것은 재조합 단백질의 생산에 있어서 매우 중요하다. 따라서 호환성의 척도로서 CAI, tAI 등을 개발하여 ORF가 숙주시스템에서 발현 효율이 얼마나 되는지를 평가한다. CAI는 codon adaptation index로 숙주의 과발현 유전자를 구성하는 코돈이 외래 ORF에 많을수록 높은 점수를 매기는 방식이다. 만약 낮은 CAI값의 코돈이 있으면 높은 CAI 값의 코돈으로 치환하여 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 반면 tAI는 tRNA adaptation index, 즉 숙주의 과발현 유전자와 tRNA pool 과의 관련성을 나타낸 것으로 대장균 K-12를 비롯한 여러 박테리아나 파아지 종에서 유의한 패턴을 보이는 것으로 알려져 CAI와 마찬가지로 높은 번역효율 증진에 고려된다.

이러한 codon usage에 의한 단백질 발현문제를 해결하기 위해서 숙주의 코돈에 맞게 재조합 단백질의 코돈을 치환하여 주는 것을 코돈 최적화(codon optimization)라고 한다. 코돈 최적화는 아미노산 서열은 유지하면서 희귀 코돈(rare codon)을 선호 코돈(frequent codon)으로 바꿔주는 간단한 방식이면서, 단백질 발현에 매우 큰 영향을 미치는 인자로서 최근 상용화되어 널리 쓰이고 있다(Gupta, S., 2003; Yadava A. et al., 2003; 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0018799호). 뿐만 아니라 ORF 코돈만을 최적화하던 것을 분비 시그널 코돈 최적화와 접목시켜 목적 단백질의 발현 효율을 향상시키는 방법도 보고되어 있다(대한민국 등록특허공보 제10-0919704호).

코돈 최적화는 번역 단계에 유전자 발현을 최대로 끌어올려 야생형 유전자의 발현율을 높이는 방법으로 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 방법이다. 식물유래 유전자의 코돈이 대장균에 맞춰지거나 동물유래 유전자의 코돈이 식물 시스템에서 용이하게 발현될 수 있도록 호환성을 맞춰주는 것이다. 이 과정은 아미노산의 서열은 전혀 변하지 않고, 단지 희귀 코돈을 선호 코돈으로 치환하여 희귀 코돈에 의해 문제가 되는 번역 효율을 개선한다. 예를 들어, 대장균에서 류신(Leucine)의 희귀 코돈인 UUA(7.5)를 CUG(39.8)로 치환한다.

또한, 제1 이종 폴리뉴클레오타이드 서열과 선택성 표식 단백질을 인코드하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함함으로써 숙수세포에서 이종 단백질 발현을 증가시키는 방법이 보고되었다. 여기서 선택성 표식 단백질을 인코드하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열은 탈최적화된(deoptimized) 것으로 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴틀레오타이드에 의해 인코드된 단백질의 번역이 폴리뉴클레오타이드가 도입된 숙주세포에 있어서 최적이라고 할 수 없도록 변형된 것을 의미한다(Westwood, A. D. et al., 2010; 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0041245호)

전체 게놈 시퀀스(whole genome sequencing) 데이터베이스가 마련되어 있기 때문에 생물체의 각 종에 대한 codon usage를 바탕으로 컴퓨터상에서 코돈 최적화가 손쉽게 이루어진다. 목적 유전자의 서열을 입력하고 맞추고자 하는 숙주의 코돈표(codon table)를 입력하면 가장 높은 빈도(frequency)를 보이는 코돈으로 치환되어 점수(score)가 높은 것부터 차례대로 결과가 생성된다. 그러나 본래 ORF의 DNA 서열을 다른 것으로 바꾸는 것이기에 변경된 서열로 DNA를 인공적으로 합성해야 하므로 비용적인 부담이 있는 단점이 있다. 또한 항상 코돈 최적화된 유전자(codon optimized gene)의 발현이 향상되어 나오는 것이 아니라는 문제점이 흔히 존재한다.

이수정 외 3인(2006)은 Aspergillus niger의epoxide hydrolase(EH) 유전자를 외래 단백질 재조합 발현용 숙주로 널리 사용되는 E. coli를이용하여발현하는경우 EH 단백질 발현 효율이 매우 낮고, 그 원인은 A. niger와E. coli 의코돈사용(codon usage) 차이와 해당 코돈에 대한 tRNA의 양이 부족하다는 것에 있음을 확인하였다. A.nigerEH유전자 전체를 E. coli 선호도가 높은 코돈으로 치환하는 코돈 최적화 방법은 시간과 비용이 많이 들어 비효율적이기 때문에, 이를 극복하고자 특정 tRNA를 코딩하고 있는 플라스미드를 숙주세포에 추가로 넣어주는 방법을 시도하였다. 그러나 이 방법도 목적으로 하는 유전자를 포함하는 벡터와 특정 tRNA를 코딩하는 플라스미드를 함께 제공하여야 하는 불편함이 있고, 듀얼 벡터 발현(dual vector-expression) 의 일반적인 문제점인 세포 내 안정적인 두 벡터의 유지와 재연성있는 발현이 어려운 점은 해결되어야 할 과제로 남아있다.

본 발명에서는 번역 효율을 높일 수 있는 새로운 방법으로 램프 태그(ramp tag)를 제시한다(도1 참조). 태그(tag)을 이용하여 번역 효율을 증가시키면 코돈 최적화와 달리 본래의 ORF 서열을 바꾸지 않아도 되므로 코돈 치환에 따른 DNA 인공 합성을 필요로 하지 않아 비용이 크게 줄어든다. 또한 태그(tag)란 개념은 서열의 유동성을 최대한 확보할 수 있을 뿐만 아니라 다른 기능성 태그와 접목해 쓸 수 있는 응용 효용성이 크다. 따라서 저비용으로 신속하게 번역 효율을 증가시킬 수 있는 태그(tag)를 설계하는 기술은 매우 중요한 경제/산업적 의미를 지닌다.

대한민국 공개특허공보 제10-2009-0018799호, 2009. 2. 23. 공개 대한민국 등록특허공보 제10-0919704호, 2009. 10. 6. 공고 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0041245호, 2012. 4. 30. 공개

Chen, D. & Texada, D. E., Low-usage codons and rare codons of Escherichiacoli,GeneTher.Mol.Biol.Vol.10,pp.1-12(2006) Gupta S., Codon Optimization, Project Report in Arizona State University (2003. 5.) Westwood, A. D. et al., Improved recombinant protein yield using a codon deoptimized DHFR selectable marker in a CHEF1 expression plasmid, Biotechnol. Progress Vol. 26, No. 6, pp. 1558-1566 (2010) 이수정 외 2인, Aspergillusniger의 epoxide hydrolase 고효율 발현 및 라세믹 에폭사이드의 입체선택적 가수분해, J. Korean Ind. Eng. Chem. Vol. 17, No. 5, pp. 557-560 (2006. 10.)

본 발명은 유전자의 서열변경을 필요로 하는 기존의 코돈 최적화와 달리, 번역속도를 조절할 수 있는 코돈 1-20개로 구성된 태그(tag)를 개발하여 원하는 유전자의 내/외부에 융합하는 방식으로 유전자 합성에 소요되는 비용 절감과 신속하고 다양한 응용이 가능한 새로운 방식의 재조합 단백질의 과발현 방법을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 코돈표(codon table)가 구축된 생물체에서 태그를 구성하는 희귀 코돈의 선별기준을 제공하고 그 코돈의 배열 방식을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 각 숙주시스템에서 몇 가지 재조합단백질에 맞춤형 램프 태그(ramp tag)를 제작하는 방법과 서열을 제공하고, 나아가 다양한 재조합 단백질에 적용할 수 있는 유니버설 램프 태그(universal ramp tag)를 제작하여 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 숙주와 재조합 단백질에 맞는 태그의 제작방법을 이용하여 응용할 수 있는 유전자 발현 조절방법을 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 각 숙주세포에서 희귀 코돈(rare codon)을 수집하는 방식과 목적 유전자에 대한 램프 태그(ramp tag)를 구성하는 방법, 그리고 번역 효율 증가에 있어서 태그가 기여하는 작동원리를 제공한다.

따라서, 본 발명은 숙주세포에 따른 희귀 코돈표(rare codon table)를 작성하는 단계; 목적 유전자의 DNA 서열을 코돈으로 변환하는 단계; 상기 작성된 희귀 코돈표 내의 희귀 코돈이 목적 유전자 ORF(open reading frame)에 출현하는 빈도와 위치를 분석하는 단계; 및 희귀 코돈을 수집하여 배치하는 단계를 포함하는 번역속도 조절용 램프 태그(ramp tag)의 제조방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 희귀코돈의 수집은 코돈의 빈도수가 0.5~3%이고 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수가 0~2인 것을 분석하여 램프 태그를 제조한다. 상기 희귀코돈의 배치는 ORF에서 출현하는 순서로 배치되는 것이 바람직하다. 숙주세포는 대장균, 효모, 차이니스 햄스터 난소세포(chinese hamster ovary cell, Cho cell) 및 인간세포(human cell line)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, 더 바람직하게는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 램프 태그(ramp tag)는 1-20개의 코돈으로 구성되어 질 수 있다. 목적 유전자는 난-발현 단백질을 코딩하는 유전자인 것이며, 더 바람직하게는 유전자는 에스테라제(esterase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 사이토리신A(Cytolysin A, ClyA), 재조합항체(single chain Fv, scFv), 아스파라기나제B(asparaginaseB), 테트라-세포접합분자(T-CAM) 또는 B3(Fv)PE38 를 코딩하는 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 번역속도 조절용 램프 태그(ramp tag)에 관한 것이다. 바람직하게는 램프 태그는 서열번호 1 내지 서열번호 7 및 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

또한, 본 발명은 숙주세포에서 난-발현 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법에 있어서, 숙주세포에서 희귀 코돈(rare codon)을 수집하는 단계; 목적 유전자에 대한 램프 태그(ramp tag)를 구성하는 단계; 램프 태그와 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 숙주세포를 발현 벡터로 형질전환 시키는 단계; 단백질을 발현시키기에 적당한 배양 배지에서 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 희귀코돈의 수집은 코돈의 빈도수가 0.5~3%이고 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수는 0~2개인 유전자 수를 분석하는 이루어질 수 있다. 상기 램프 태그(ramp tag) 구성은 희귀코돈이 목적유전자에서 출현하는 순서로 이루어질 수 있다. 숙주세포는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, 더 바람직하게는 숙주세포는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 램프 태그(ramp tag)는 1-20개의 코돈으로 구성되어 질 수 있다.

바람직하게는 목적 유전자는 난-발현 단백질을 코딩하는 유전자인 것이며, 더 바람직하게는 유전자는 에스테라제(esterase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 사이토리신A(Cytolysin A, ClyA), 재조합항체(single chain Fv, scFv), 아스파라기나제B(asparaginaseB), 테트라-세포접합분자(T-CAM) 또는 B3(Fv)PE38를 코딩하는 것이다. 램프 태그는 목적 유전자의 5' 또는 3'에 융합되거나, 목적 유전자의 내부에 도입되거나, 또는 독립적으로 번역되도록 위치할 수 있다. 램프 태그는 추가적으로 다른 태그 또는 융합 단백질과 함께 사용될 수 있으며, 다른 태그는 His tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB 및 Xpress epitope로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 융합 단백질은 GST, MBP, NusA, CBP, GFP, Thioredoxin, Mistic, Sumo 및 DSB로 구성된 군으로부터 선택되어 질 수 있다.

상기 발명은 도 2에 기재된 코돈 서열로 이루어지는 번역속도 개선용 램프 태그(ramp tag)가 목적 유전자에 융합하여 기능하는 전략과 독립적으로 발현하는 전략을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 램프 태그는 목적 유전자의 5' 또는 3'에 융합되거나, 목적 유전자의 내부에 도입되거나, 또는 독립적으로 번역되도록 위치하여도 목적 단백질의 발현 효율을 증가시켰으며, 대조군에 비해 총 단백질 양이 약 2.5~2.7배 이상 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

본 발명은 상기 친화성 태그를 이용하여 난-발현 된다고 알려진 유전자에 맞춤형 램프 태그(ramp tag)를 제작하고 유전자 발현 양 증가를 측정하는 방법으로 태그의 기능성을 증명하는 것을 포함한다.

본 발명에서 부가가치가 크지만 난-발현되는 약물 단백질은 ClyA와 scFv, AsparaginaseB(ansB) 와 T-CAM, B3(Fv)PE38 를 대상으로 맞춤형 램프 태그를 제작하고 대장균과 진핵세포를 숙주로 이용하여 이들 단백질의 발현 양을 조사하였을 때, 대조군에 비해 뚜렷한 단백질 양의 증가와 활성 증가를 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 램프 태그(ramp tag)와 상용화되어 있는 다른 태그 또는 융합fusion 파트너와 융합하여 사용하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 램프 태그를 His-tag, T7-tag, HA-tag과 같은 태그와 GST, GFP, MBP 등과 같은 융합 단백질과 함께 사용한 경우에도 이들의 기능을 방해하지 않으면서도 목적하는 단백질의 발현 양의 증가를 확인할 수 있었다.

본 발명은 희귀 코돈을 분석 수집하고 램프 태그(ramp tag)를 제작하여 재조합 단백질 제조과정에서 번역 효율을 높일 수 있는 새로운 방법으로 코돈 최적화 또는 코돈 탈최적화 방법과는 달리 본래의 ORF 서열을 바꾸지 않아도 번역 효율을 증가시킬 수 있는 장점이 있다.

따라서 코돈을 치환하기 위한 유전자 수준의 DNA 인공합성을 필요로 하지 않아 비용을 절감할 수 있으며, 유니버설 램프 태그(universal ramp tag)의 설계가 가능하여 다양한 생물체와 단백질에 대해서도 신속한 번역 효율의 증가를 가져올 수 있다.

게다가 본 발명은 목적 단백질에 대한 램프 태그의 다양한 융합 위치(N-말단, C-말단, 또는 유전자 내부 도입)뿐 아니라 램프 태그가 독립된 펩타이드로 번역되도록 위치시켜도 목적 단백질의 발현 양을 증가시킬 수 있었으며, 다양한 태그 또는 융합 단백질과 함께 사용하여도 태그나 융합 단백질의 역할을 유지하며 목적 단백질의 발현 양을 증가시키는 효과를 보였다.

또한, 약물 단백질인 ClyA와 scFv, asparaginaseB(ansB) 와 T-CAM, B3(Fv)PE38 에 따라 맞춤형으로 램프 태그의 설계가 가능하므로 의약품이나 산업용 효소의 대량 생산에 직접 이용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 번역 과정에서 희귀 코돈(rare codon)의 영향과 램프 태그(ramp tag)으로 해결하는 원리를 설명하는 모식도이다.
도 1(a)는 희귀 코돈에 상응하는 aa-tRNA가 세포 내에 적은 양으로 존재하여 리보솜(ribosome)이 코돈을 해독할 때 필요한 aa-tRNA의 공급이 지연되어 번역속도를 저하시킨다. 도 1(b)는 램프 태그(Ramp tag)을 지나는 리보솜은 ORF 번역시 필요한 희귀 코돈 tRNA가 주변에 모여 있어 번역속도가 높게 유지된다.
도 2는 설계된 재조합 유전자 발현 모듈에서의 램프 태그의 위치와 목적 유전자와의 관계를 나타낸 모식도이다.
도 2(a) 숙주에서 희귀 코돈표를 만들고 재조합 단백질 내에 각 희귀 코돈에 대한 출연 빈도수를 계산한 다음, cut-off에 맞춰 코돈을 수집하고 배열하여 램프 태그(ramp tag)를 구성한다. 도 2(b) 목적 유전자에 따라 램프 태그가 설계되면 벡터에서 태그와 유전자가 융합된 상태로 클로닝하거나, 번역 짝지움 기법을 이용하여 독립된 폴리펩타이드가 되도록 중간에 시작코돈, 종결코돈, 리보솜 결합 부위(RBS)를 삽입하여 사용한다.
도 3은 유도 발현벡터에서 램프 태그의 효과로 발현 양이 증가한 결과를 확인한 SDS-PAGE 사진이다. 그림에서 SDS-PAGE와 효소활성 측정 결과를 따로 도시하였다. 대조군(without tag)에 비해 램프 태그를 지닌 단백질의 발현 양이 뚜렷하게 증가하였음을 볼 수 있다.
도 3(a)는 재조합 단백질 1767에 대한 램프 태그의 효과를 나타낸다. 도 3(b)는 재조합 단백질 SmPE에 대한 램프 태그의 단백질 양 비교 효과를 나타낸다. 도 3(c)는 재조합 단백질 SmPE에 대한 램프 태그의 활성 비교 효과를 나타낸다.
Ramp tag:1767은 태그와 유전자가 융합된 상태이며, Ramp tag-1767은 번역 짝지움 기법에 의하여 발현된 것이다. Ramp tag:SmPE은 태그와 유전자가 융합된 상태이며, Ramp tag-SmPE는 번역 짝지움 기법에 의하여 발현된 것이다.
도 4는 항시 발현벡터에서 램프 태그의 효과로 재조합 단백질 1767의 발현 양이 증가한 것을 확인한 결과이다.
도 4(a)는 SDS-PAGE를 통한 단백질 양의 비교 결과를 나타낸다. 도 4(b)는 활성 염색(Activity staining)을 통한 활성 비교 결과를 나타낸다.
Ramp tag:1767은 태그와 유전자가 융합된 상태이며, Ramp tag-1767은 번역 짝지움 기법에 의하여 발현된 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 기술분야의 숙련자에게 자명한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 각 숙주에서 희귀 코돈을 수집하는 방식을 구성한다. 여기서 말하는 희귀 코돈은 일반적으로 알려진 희귀 코돈의 개념에 더해 하위에서 설명하는 과정에서 수집되는 코돈들을 지칭한다. 번역의 속도는 코돈을 해독할 때, 아미노산이 결합된 상태인 aa-tRNA가 얼마나 신속하게 공급되느냐에 따라 가장 크게 영향을 받는다. 따라서 해당 aa-tRNA의 양이 세포 내에 충분히 존재하는 코돈에서 번역속도는 빠르고 반대로 aa-tRNA의 부족은 번역효율을 떨어뜨린다. 따라서 tRNA의 유전자 카피(gene copy)는 세포 내 해당 tRNA의 농도를 유추할 수 있는 첫 번째 척도로 쓸 수 있다. 그러나 실제 코돈 최적화는 코돈 빈도수(codon frequency)를 반영하는데 이는 코돈 빈도수와 해당 tRNA 수가 비례한다고 받아들여졌기 때문이다. 다음 표 1(대장균 K-12 균주의 codon usage의 구성)은 대장균 K-12 균주에서 각 아미노산(AA)에 해당하는 코돈 빈도수(100% 기준)와 tRNA 유전자 카피를 나타낸다(http://gtrnadb.ucsc.edu/).

상기 표의 코돈 빈도수를 보면 tRNA 유전자와 비례하지 않는 부분이 많은 것을 알 수 있다. 뿐만 아니라 코돈 빈도수가 높은데도 불구하고 tRNA 유전자가 없는 것을 볼 수 있는데 이는 한 tRNA의 안티코돈(anticodon)이 wobble 현상(세 번째 자리에서 non-Watson-Crick 상보결합)으로 다른 코돈을 인식할 수 있기 때문에 가능한 현상으로 설명될 수 있다 (표 2,안티코돈의 wobble 현상에 의한 해독가능 코돈). 이렇게 두 개 이상의 codon을 읽을 수 있는 tRNA를 이소수용체(isoacceptor) tRNA라고 한다. 예를 들어 페닐알라닌(phenylalanine)의 UUC를 읽는 tRNA(anticodon GAA)는 UUU도 읽는다. 대장균 K-12는 anticodon G와 U 의 tRNA가 대부분의 U, C, A G codon들을 해독하고 있다.

5' Base in Anticodon	3' Base in codon
G	U or C
C	G
A	U
U	A or G
I	A,U or C

tRNA의 부족을 고려한 희귀 코돈을 선정할 때는 isoacceptor tRNA를 고려하여 ORF에서 tRNA를 재사용(reuse) 해야 할 코돈을 선정해야 한다. 예를 들면, ORF에서 세린(serine)을 암호화할 수 있는 코돈 중 낮은 코돈 빈도수를 보이는 UCU 코돈이 번역속도를 저해할 수 있지만, 만약 UCU 코돈의 앞에 UCC가 나온다면, UCC에 쓰인 tRNA가 UCU를 해독하는데 재사용될 수 있으므로 UCU는 번역속도를 저해한다고 할 수 없게 된다. 따라서 codon frequency는 isoacceptor tRNA가 읽는 두 개 codon frequency 를 합쳐 하기 분석과정에서는 하나로 계산한다. Phe 의 codon frequency는 두 codon의 합인 3.87 %가 되며, Ser 의 경우 표1에서 표시한 것처럼 두 코돈씩 나누어 총 3 가지의 codon frequency 1.66 %, 1.60 %, 2.47 % 로 하고 이에 상응하는 tRNA 유전자 카피도 두 코돈의 것을 합쳐서 2, 2, 1 개로 본다. Codon usage에 있어서 또 한가지 특징을 설명하면 codon bias가 3개 이상의 동의 코돈(synonymous codon)을 갖는 아미노산에서 더욱 강하게 나타난다(표 1). 예를 들어 글리신은 5.45 % 와 1.90 % 빈도수를 보여 격차를 보인다. 마찬가지로 아르기닌의 코돈 빈도수는 4.29 %, 0.89 %, 0.31 %의 큰 격차를 보인다. 반면 대장균에서 2개 코돈으로 암호화된 티로신(tyrosine), 히스티딘(histidine), 글루타민(glutamine), 아스파테이트(aspartate), 라이신(lysine), 아스파라진(asparagine)이 한 isoacceptor tRNA로 해독되어 코돈표에서 한 종류의 tRNA 유전자 만을 갖고 있으며, 대부분의 경우에서 두 코돈 모두 2-5% 대의 높은 빈도수를 보여 codon bias가 약함을 볼 수 있다.

대장균에서 희귀 코돈(rare codon)의 새로운 정의와 수집 기준

3개 이상의 코돈 (3 box, 4 box, 6 box 라고 표현)으로 암호화된 아미노산 세린,류신(luecine), 발린(valine), 프롤린(proline), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 글라이신(glycine)은 두 개 이상의 isoacceptor tRNA 가 관여하며, 이를 고려한 코돈쌍(isoacceptor tRNA를 하나로 간주)도 2개 이상인 경우가 많아 빈도수 격차가 클 가능성이 높다. 코돈 희귀성은 ORF에서 코돈들을 여러 개 갖고 있지 않으면 tRNA를 충분히 확보하기 어려운 이 3-6 box 에서 크게 나타날 수 있기 때문이다. 따라서 tRNA를 재사용하여 충분한 번역 효율을 확보하는 전략은 isoacceptor tRNA가 부족한 3-6 box 코돈에서 반드시 필요하다는 것을 알 수 있다. 이러한 효과를 얻기 위해 활용빈도가 낮은 codon 서열을 수집하여 태그를 구성한 후, 목적 유전자 앞에 위치시켜 유전자의 발현 효율에 심각한 문제를 유발하는 희귀 코돈 tRNA를 미리 모아 재사용하게 하는 것이 본 발명의 전략이다 (도 1 참조). 구성된 태그에 의해 채택된 tRNA의 재사용에 목적을 두고 있기 때문에 태그에 의한 tRNA의 절대 사용 횟수 증가(아미노산 사용)는 본 발명에서 고려하지 않았다.

다음은 상기 codon usage를 고려하여 희귀 코돈을 수집하는 조건을 제시한다. 크게 두 가지 방식으로 각 codon 빈도수만을 고려한 방법과 isoacceptor tRNA의 유전자 카피 수를 고려한 방법이 있다. Codon 빈도수 기준으로 희귀코돈 수집 조건은 다음과 같다: 1. 각 아미노산에서 코돈쌍 빈도수가 1.0 % 이하 인 것(이 역치값은 총 코돈 개수의 하위 34.4 %(21개)를 수집 가능한 수준임); 2. 한 아미노산에 대해 최대 3개 코돈까지만 수집하기.

위 조건의 cut-off 값은 대장균의 전체 코돈이 어떻게 분포하는지를 참고해야 함으로 코돈 빈도수와 tRNA 유전자 수의 분포 특성을 참고하였다(표 3, 코돈 빈도수와 tRNA 유전자 수의 분포).

codon fre. tRNA	0~0.5	0.5~1	1~1.5	1.5~2	2~3	3~(%)	합
inefficient wobble	1	0	1	1	1	1	5
0	2	4	2	4	3	2	17
1~2	3	10	5	5	4	0	27
3~4	0	1	1	1	4	2	9
5~8(개)	0	0	1	0	1	1	3
합	6	15	10	11	13	6	61

대부분의 아미노산을 암호하는 코돈들은 0-2개의 tRNA 유전자와 0.5-3 % 이하코돈 빈도수에 분포하는 패턴을 보인다. 여기서 희귀 코돈을 수집하기 위해 위의 괄호와 같은 기준을 적용했고 여기에는 실험 결과로서 희귀코돈이라고 결정된 9개의 코돈들이 포함되어 있다. 이런 식으로 codon 빈도수나 isoacceptor tRNA를 고려하는 방식을 선택하였다. 표 4는 최종 수집된 대장균 K-12 균주의 희귀 코돈표이다.

이를 근거로 본 발명은 램프 태그(ramp tag)를 구성하는 방법을 제공하고 기능하는 원리를 설명한다. 램프 태그는 약 1-20개의 코돈의 배열이다. 이러한 구성과 배열방식은 램프 태그에 융합할 유전자에 따라 달라진다. 또한 목적하는 유전자의 길이나 유전자 내부의 희귀 코돈의 분포 정도에 따라 태그의 길이를 20개 이상으로 구성 할 수 있으나, 번역 짝지움 기법을 이용하는 경우 목적 유전자와 별개로 발현되는 태그에 의해 아미노산이 고갈(depletion)될 가능성이 있어 길이를 제한하는 것이 필요하다.

각 유전자에 융합할 램프 태그의 서열과 구조체(construct) 구성

도 2(a)를 참고로 다음 과정을 통해 램프 태그(ramp tag)를 구성한다: 1. 숙주에 따른 희귀 코돈표 작성; 2. 목적 유전자의 DNA 서열을 코돈으로 바꾸어 준비; 3. 작성된 희귀 코돈표 내의 코돈이 목적유전자 ORF에 출현하는 빈도와 위치를 분석; 4. 희귀 코돈들을 수집하여 ORF에서 출현하는 순서대로 배치; 5. 목적 유전자의 5' 혹은 3', 또는 N-말단(태그 길이에 해당되는 1-20개 코돈)을 태그 치환시켜 발현유도.

이러한 태그의 구성은 ORF에서 필요로 하는 tRNA를 리보솜이 태그를 해독할 때 먼저 끌어들인 다음 ORF에서 재사용할 수 있도록 되어 있다. 그림 1(b)는 이러한 번역과정을 묘사하며 램프 태그(ramp tag)의 작동원리와 전략을 설명한다. 램프 태그가 제대로 작동하기 위해서는 단백질 번역에 이용된 tRNA가 리보솜에서 재사용되기 전까지 aminoacyl-tRNA 합성효소에 의해 반드시 아미노산과 결합(recharging) 되어야 한다. 따라서 본 발명의 구동조건은 한 번 사용된 tRNA는 번역과정이 진행되는 동안 재사용되기 용이하도록 멀리 확산되지 않고, 아미노산과 결합되는 것이다.

본 발명은 하기 난-발현 단백질에 대한 램프 태그 코돈을 제공하기 위해, 목적유전자와 융합한 형태로 기능성을 증명하였다. 난-발현 단백질의 특성인 발현 양과 가용성이 낮은 에스터라제(esterase)인 1767과 SmPE, β-glucosidase인 SmGlu를 대상으로 맞춤형 태그와 태그가 융합된 유전자 구조체를 설계하였다. 그림 2(b)를 보면 태그는 유전자의 5'-말단에 위치하도록 융합시키거나 독립된 형태로 발현되게 한다. 하지만 이에 한정되는 아니며, 유전자 5'-말단 내부에 야생형 단백질의 아미노산이 변화되지 않도록 ramp 서열을 구성해 치환을 유도할 수도 있다. 또한 유전자의 3'-말단이나 내부로도 ramp 서열이 프라이머에 위치하도록 설계해 PCR 로 간단하게 도입할 수 있다. 다음 실시 예에 각 유전자에 대한 태그의 DNA 서열을 표기하였다. 먼저 전술한 3개의 난-발현 유전자에 맞춤형 태그를 융합하여 tRNA의 부족 현상을 유발할 수 있는 유도 발현벡터(induction vector)에서 발현을 유도하였다. 대조군으로 유도체를 필요로 하지 않는 항시 (과)발현 벡터를 이용하였다.

에스터라제 1767과 SmPE, β-glucosidase SmGlu에서 램프 태그 융합에 의한 발현 양 분석

다음 표 5는 각 유전자에 대한 램프 태그의 코돈 서열을 나열한 것이다. 램프 태그는 도 2와 같은 과정에서 수집되었고 유전자의 앞부분에 위치시켜 단백질과 융합해 발현을 유도하였다. 램프 태그에 의한 과발현 효과 확인은 항시 발현벡터인 pBEM3, pRCEMT와 유도 발현벡터인 pET22b(+)를 이용하였다. 1767유전자의 경우 희귀 코돈이 많이 존재하는 관계로 2개의 램프 태그를 제작하였다. 각 벡터에 유전자를 먼저 클로닝한 후, 표 5(유전자 특이적인 램프 태그(ramp tag) 서열)의 태그 서열은 ATG를 첨가한 정방향 프라이머(forward primer) 형태로 합성하여 각 유전자를 주형(template)으로 PCR을 수행해 램프 태그가 연결된 유전자 절편을 얻었다. 이 후 멀티 클로닝 사이트(multi-cloning site)의 제한효소 인식부위를 절단해 클로닝하였다. 이 때 클로닝 효율과 발현양 확인이 용이한 GFPuv 를 대조군으로 활용하였다.

유전자	tag 달린 유전자의 표시	Ramp tag 서열
SmGlu	R-SmGlu	CCC TCC GGA CAC TGC TGT CCT AGG TCA ACA CCA (서열 1)
SmPE	R-SmPE	AGG CAC AGA TCA CCA TCC CCC TGC ACT CCT (서열 2)
1767	R1-1767	GGG TGC CAC CCA GGA CTA ACA (서열 3)
1767	R2-1767	CCC TCT CGA ACT ATA TGT CCT AGT (서열 4)
GFPuv	GFPuv	GGA ACT CCA CAC TCT ACA TGC CCT TCC CCC ATA TCA (서열 5)

결과적으로, 유도 발현벡터에서 IPTG 첨가 후 단백질 발현 양을 SDS-PAGE를 이용해 대조군(1767)과 비교하면 태그가 융합된 1767(Ramp tag:1767)에서 총 단백질 양이 2.7배 이상 증가하였음을 관찰하였다(도 3(a)). 태그의 융합으로 tRNA의 채택과 재사용 기능 부여로 인해 단백질 발현 양이 증가 함을 보여주는 결과이다. 마찬가지로 도3(b)는 에스터라제(esterase) SmPE에 대한 램프 태그(ramp tag)의 효과 분석 결과, 대조군(SmPE)에 비해 램프 태그가 융합된 SmPE(ramp tag:SmPE)의 총 단백질 양도 2.5 배 이상 증가함을 확인할 수 있었다. 도 3(c)의 활성도 테스트 결과에서 확인할 수 있듯이 esterase SmPE(ramp tag:SmPE)의 기질 α-naphthylacetate에 대한 효소활성 결과물(갈색화 반응)이 램프 태그가 있는 경우에 높게 나와 활성을 지닌 단백질 양이 늘어났음을 알 수 있었다. 또한 도 4(a)를 보면 유도체를 첨가하지 않는 항시 발현시스템에서도 태그가 융합된 경우(ramp tag:1767)에 대조군에 비해 단백질 양이 증가함을 확인하였다. 단백질 양의 증가는 도 4(b)의 활성 테스트에서도 확인할 수 있었다. 따라서 두 개의 램프 태그 모두에서 단백질 과발현이 확인됨으로써, 본 발명은 목적 단백질에 대한 램프 태그의 다양한 융합 방법을 제공하며, 따라서 램프 태그 서열을 여러 순서로 조합해 이용할 수 있음을 보여준다.

하지만 유니버설 태그(universal tag)로의 기능 부여에는 태그 서열의 위치나 길이 조절이 필요하며, 보다 효과적인 결과를 얻기 위해서는 번역 짝지움 기법(translational coupling), 즉 한 전사체에서 태그와 유전자가 융합되지 않고 독립적으로 번역되도록 할 필요가 있다고 판단되었다. 따라서 램프 태그와 유전자 사이에 종결 코돈(stop codon) 혹은 종결 코돈(stop codon)과 리보솜 결합 부위(RBS)를 삽입하여 다음과 같은 번역 짝지움 기법을 시도하였다.

번역 짝지움(translational coupling) 시킨 태그의 기능성 분석

램프 태그(ramp tag)와 재조합 단백질이 융합된 형태가 아닌, 태그 만이 독립된 펩타이드로 번역되게 하기 위하여 램프 태그 말단에 종결 코돈과 리보솜 결합 부위(RBS)를 연결하여 프라이머를 제작하였다. 도 2(b)에 묘사된 대로 구조체를 제작하고 유도 발현벡터에서 발현 양을 분석하였다. 그 결과, 도 3(a)에서의 결과와 유사하게 태그를 접목한 1767(Ramp tag-1767)의 경우, translational coupling을 유도했음에도 불구하고 단백질 양이 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 도3(b)의 ramp tag-SmPE의 경우, 상대적으로 단백질 발현양은 소량 감소하였지만 충분히 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 문제점은 태그를 번역한 리보솜이 목적 유전자의 발현에 직접 참여하는 효율이 낮거나 상호충돌 (태그를 번역하는 리보솜과 유전자를 번역하는 리보솜 간의 간섭)하는 문제로 태그의 효능성의 문제는 아닌 것으로 대조군 실험에서 확인되었다.

ClyA, scFv 에 대한 램프 태그의 효과

전술한 램프 태그의 효능을 부가가치가 큰 난-발현 약물 단백질에 적용해 보았다. 약물 단백질 ClyA 와 scFv(single chain antibody)는 암치료 후보 물질로서 응용가능성이 매우 크지만 대량생산이 어려운 단점이 있다. 이러한 단백질도 하기의 램프 태그를 제작하여 대장균을 숙주로 발현 양을 조사하였을 때, 대조군에 비해 뚜렷한 단백질 양의 증가와 활성을 확인할 수 있었다. 정량적으로는 ClyA 가 램프 태그를 융합하지 않은 대조군에 비해 2.2 배, scFv 의 경우에는 1.7-2.1 배 정도 발현 양이 증가하였다. 상대적으로 일반적인 단백질에 비해 낮은 단백질 밴드의 약물 단백질 여부는 웨스톤 블롯(western blot)을 통해 검증하였다. 이들 단백질의 발현 유도에 이용한 램프 태그의 서열은 다음 표 6(약물 단백질 유전자 발현용 램프 태그 서열)과 같다.

유전자	Ramp tag 서열
ClyA	ACT GGA CCC ATA TCA TCC ACA TGT CTA AGG CCA TCT AGA CAC (서열 6)
scFv	ACT CCT ACA TCT GGA TCA TCC TGC CAC TGT AGA AGG CCA CGA ATA CTA (서열 7)

위의 결과로, 본 발명은 목적 유전자에 따라 맞춤형으로 설계된 램프 태그를 이용할 경우, 의약품이나 산업용 효소 생산에 직접 이용할 수 있음을 보여준다.

램프 태그의 C-말단 융합

상기 실시예에서 램프 태그는 목적 단백질의 5'-말단에 위치하였다. 박테리아는 한번 mRNA를 해독한 리보솜이 다시 그 mRNA를 해독하기 쉬운 원형 고리형태를 형성하여 리보솜을 리사이클(recycling)한다. 따라서 램프 태그는 목적 단백질의 뒷부분인 3'-말단에 위치하여도 리보솜의 recycling에 의해 tRNA의 재사용 효과를 지닐 수 있을 것으로 기대되었다. 이러한 사실을 근거로 램프 태그를 3'-말단에 융합 형태로 발현하거나 번역 짝지움 기법(translational coupling)을 시도하여 단백질 양의 증가 여부를 확인하였다. 이때 사용한 목적 단백질은 난 발현 에스터레이즈 유전자 1767이며, 실시 예 3에서 이용한 램프 태그를 목적 유전자의 3'-말단에 위치시켜 효과를 검증하였다. 발현 양은 태그를 융합하지 않은 대조군에 비해 2.2-3.7 배 증가하였다. 결과적으로 대조군에 비해 발현 양의 뚜렷한 증가를 관찰함으로써 번역 효율이 증가하는 효과가 유지된다는 것을 확인하였다.

유전자 안쪽에 위치시킨 램프태그(ramp tag)의 제작과 효과

본 실시예에서는 목적 유전자 내(N-말단)의 코돈 치환으로 램프 태그의 기능을 유전자 내부로 도입하여 효과를 얻을 수 있는 방법을 설계하고 실험하였다. 지금까지 기술한 램프 태그는 목적 유전자의 앞 또는 뒤에 위치하여 tRNA의 재사용을 통한 번역 효율을 증진하는 방식이다. 그러나 리보솜의 tRNA는 따로 태그의 도움 없이 목적유전자 앞 또는 뒤쪽에 코돈의 치환을 통해 재사용될 수 있다고 예상이 된다. 특히 희귀 코돈이 유전자 ORF의 중간이나 뒤쪽에 모여 있을 경우 앞에 출현하는 코돈을 뒤에 나오는 코돈으로 치환하면 N-말단에 융합된 램프 태그와 같은 효과를 기대할 수 있을 것이다. 이러한 가설을 근거로 처음 출현하는 동의 코돈(synonymous codon)을 나중에 출현하는 희귀 코돈으로 치환하여 준다. 예를 들어 에스터라제 1767의 경우, 시작 코돈 ATG 다음부터 유전자의 희귀 코돈의 동의 코돈(synonymous codon)이(아래 밑줄로 표시, 표7) 간헐적으로 출현하는 것을 볼 수 있다. 이러한 코돈 ATT, GGT, CTT, CGT를 각각 ATA, GGA, CTA, CGA로 치환하면 아미노산의 변화가 없으면서도 자체적으로 램프 태그로 기능할 것이다.

유전자	Ramp tag를 포함한 서열
에스터라제 1767	ATG GTG CAG ATT CAG GGT CAT TAC GAA CTT CAG TTC GAA GCG GTA CGT (서열 8)

실험 결과 램프 태그의 기능은 ORF 앞 또는 뒤에 위치시키는 방법뿐만 아니라, 유전자 내부 앞뒤의 8-12개 서열을 유전자 중하단부에서 나타나는 희귀 코돈의 동의 코돈(synonymous codon)으로 바꾸어 사용하여도 효과가 있음이 분석되었다. SDS-PAGE 와 활성 비교를 통한 정량 결과로써, 대략 2.8-3.2 배 정도의 발현 양이 증가하였음을 확인하였다.

His-tag과 램프 태그(ramp tag)의 동시 적용 효과

본 발명에서는 램프 태그가 다른 목적의 다양한 태그나 융합 단백질들과 함께 사용하는 방법을 제공한다. 태그로 His tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB, Xpress epitope과 함께 램프 태그(ramp tag)를 동시에 융합하여 단백질을 발현시켜 보았다. 또한 자주 사용되는 융합 단백질들 GST, MBP, NusA, CBP, GFP, Thioredoxin, Mistic, Sumo, DSB와 함께 램프 태그(ramp tag)를 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과 가용성(solubility), 검출(detection), 위치파악(localization)에 특별한 기능을 수행하는 융합 단백질(fusion protein)의 역할을 침해하지 않으면서 램프 태그(ramp tag)에 의한 발현 양의 증가를 확인할 수 있었다. 기능 평가는 난발현 단백질 smPE 에 his tag 과 PelB 를 각각 장착한 후, 램프 태그를 융합시켜 진행하였다. 분석 결과 모든 경우에서 발현 양이 1.5-2.4 배 이상 증가함이 확인되었다. 이 때 사용한 램프 태그는 실시 예 3과 같다.

효모에서 T-CAM 유전자에 대한 램프태그(ramp tag)의 효과

본 발명에서는 램프 태그가 원핵생물에서 뿐만 아니라 진핵생물에서도 목적유전자 과발현에 활용할 수 있음을 제시한다. 이를 하기 실험을 통해 증명하였다. 숙주세포로서 Saccharomyces cerecisiae 를이용하였고목적유전자로는신생혈관억제효과를지닌후보약물유전자로알려진 T-CAM(tetra-cell adhesion molecule)를 선택하였다. S.cerevisae의 codon usage 에서 희귀코돈을 수집하는 방법은 실시예 1과 동일하다. 그 결과 표 8(효모 S. cerevisae 의 수집된 희귀 코돈) 과 같은 결과를 얻었다. T-CAM에 대한 램프태그는 실시예 2에서 서술한 방식으로 구성하여 표9(효모 숙주에서 T-CAM 유전자 발현용 램프 태그 서열)와 같은 서열을 생성하였다. ATG를 포함하여 정방향으로 램프태그가 포함되도록 primer를 제작하여 T-CAM 유전자의 5'-말단에 위치시켜 PCR로 증폭한 다음 적절한 제한효소를 처리하고 GAL2 프로모터가 있는 셔틀벡터 pYES2에 삽입하였다. Electroporation으로 형질전환한 후 uracil 결핍 배지에서 배양하였다. 목적유전자의 발현양을 확인하기 위해 2%(v/v)의 galactose 로 발현을 유도한 후 western blot을 실시하였다. Band peak analysis를 통해 램프태그에 의한 T-CAM의 발현양이 약 1.85 배 증가하였음을 확인하였다. 이는 램프태그의 과발현 유도 효과가 진핵생물을 숙주로 이용하는 경우에도 유지되는 것을 보여주는 결과이다.

유전자	Ramp tag 서열
C-CAM	CCA ACT TCT CAC CCT AGG AGA CCC ACA TCA CTA GGA TCG (서열9)

차이니스 햄스터 난소세포(chinese hamster ovary cell, CHO cell)

에서 B3(Fv)PE38 유전자에 대한 램프태그(ramp tag)의 효과

본 발명은 램프태그가 동물세포에서 목적유전자의 과발현 유도에 사용될 수 있음을 제시하고 있고 하기 실험을 통해 이를 증명하였다. 희귀 코돈의 분석을 위해 Cricetulus griseus 을 대상으로 코돈 usage 을 검색하였고 tRNA 유전자 분석에는 Cricetulus griseus cell line CHO-K1를 이용하였다. 희귀코돈을 수집하는 방법은실시예 1에서와 동일하다. 그 결과 표 10(동물세포 Cricetulus griseus 의 수집된 희귀 코돈) 와 같은 결과를 얻었다. B3(Fv)PE38 에 대한 램프태그는 실시예 2에서 서술한 방식으로 구성하여 표 11과 같은 서열을 생성하였다 (표 11, C.griseus숙주에서 B3(Fv)PE38 유전자 발현용 램프 태그 서열). 발현벡터로 p3xFlag-CMV-7.1를 이용하였으며 상기 실시 예에서와 같이 시작 코돈 ATG 가 첨가된 램프태그 primer를 이용하여 CMV 프로모터 뒤에 위치하도록 유전자를 클로닝하였다. 숙주세포 CHO-K1에 플라스미드를 형질전환하기 위해 calcium phosphate mediated transfection을 실시하였고 배지는 Gibcoㄾ 사의 CD CHO medium을 사용하였다. 현탁(suspension) 배양조건으로 5 x 105cells/ml까지 세포의 성장을 유도한 후, 회수하여 FLAG에 특이적인 항체를 이용하여 western blot을 실시하였다. 그 결과 5'-말단 부위에 램프태그가 도입된 B3(Fv)PE38의 단백질 양이 대조군에 비해 약 1.5-2.5 배 이상 증가하였음을 확인하였다.

유전자	Ramp tag 서열
B3(Fv)PE38	TTA TGT CGC GTA CGT ATA CGA ACG TCG GCG CCG (서열10)

인간세포(human cell) 에서 아사파라기나제 B(asparaginaseB, ansB)유전자에 대한 램프태그의 효과

본 발명은 램프태그가 인간세포에서 목적유전자의 과발현 유도에 사용되는 방법을 제공한다. 희귀 코돈의 분석을 위해 Homo sapiens (hg18 - NCBI Build 36.1 Mar 2006)을 대상으로 코돈 usage 와 tRNA 유전자 분석을 실시하였다. 희귀코돈을 수집하는 방법은 실시예 1에서와 동일하다. 그 결과 표 12(인간세포 H. sapiens 의 수집된 희귀 코돈) 과 같은 결과를 얻었다. ansB 에 대한 램프태그는 실시예 2에서 서술한 방식으로 구성하여 표 13과 같은 서열을 생성하였다 (표 13, H.sapiens숙주에서 ansB 유전자 발현용 램프 태그 서열). 발현벡터로 p3xFlag-CMV-7.1를 이용하였으며 실시예 9에서와 마찬가지로 ATG 가 첨가된 램프태그 primer를 이용하여 CMV 프로모터 뒤에 위치하도록 유전자를 클로닝하였다. 인간 세포 주로서 HEK 293t를 이용하였으며 Gibcoㄾ 사의 CD CHO medium을 사용하였다. Suspension 배양조건으로 5 x 105cells/ml까지 세포를 키운 다음 회수하여 FLAG에 특이적인 항체를 이용하여 western blot을 실하였다. 그 결과 램프태그가 5'-말단에 도입된 ansB 의 단백질 양이 약 2배 이상 증가하였음을 확인하였다.

유전자	Ramp tag 서열
ansB	ACG TTA GCG CCG CTA GTA CGT CGA TCG ATA (서열11)

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Translational Rate-Regulating Ramp Tag for Recombinant Protein Over-expression and Use Thereof <130> P130011170117 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of SmGlu <400> 1 ccctccggac actgctgtcc taggtcaaca cca 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of R-SmPE <400> 2 aggcacagat caccatcccc ctgcactcct 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of R1-1767 <400> 3 gggtgccacc caggactaac a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of R2-1767 <400> 4 ccctctcgaa ctatatgtcc tagt 24 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of R-GFPuv <400> 5 ggaactccac actctacatg cccttccccc atatca 36 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of ClyA <400> 6 actggaccca tatcatccac atgtctaagg ccatctagac ac 42 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of scFv <400> 7 actcctacat ctggatcatc ctgccactgt agaaggccac gaatacta 48 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of esterase 1767 <400> 8 atggtgcaga ttcagggtca ttacgaactt cagttcgaag cggtacgt 48 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of C-CAM <400> 9 ccaacttctc accctaggag acccacatca ctaggatcg 39 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of B3(Fv)PE38 <400> 10 ttatgtcgcg tacgtatacg aacgtcggcg ccg 33 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp tag of ansB <400> 11 acgttagcgc cgctagtacg tcgatcgata 30

Claims

숙주세포에 따른 희귀 코돈표(rare codon table)를 작성하는 단계; 목적 유전자의 DNA 서열을 코돈으로 변환하는 단계; 상기 작성된 희귀 코돈표 내의 희귀 코돈이 목적 유전자 ORF(open reading frame)에 출현하는 빈도와 위치를 분석하는 단계; 및 희귀 코돈을 수집하여 배치하는 단계를 포함하는 번역속도 조절용 램프 태그(ramp tag)의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 희귀코돈의 수집은 코돈의 빈도수와 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수를 분석하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 램프태그의 제조방법.
제2항에 있어서, 코돈의 빈도수는 0.5~3%이고 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수는 0~2개인 것을 특징으로 하는 램프태그의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 희귀코돈의 배치는 ORF에서 출현하는 순서로 배치되는 것을 특징으로 하는 램프태그의 제조방법.
제1항에 있어서, 숙주세포는 대장균, 효모, 차이니스 햄스터 난소세포(chinese hamster ovary cell, Cho cell) 및 인간세포(human cell line)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 램프 태그의 제조방법.
제5항에 있어서, 숙주세포는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 램프 태그의 제조방법.
제1항에 있어서, 램프 태그(ramp tag)는 1-20개의 코돈으로 구성된 것을 특징으로 하는 램프 태그의 제조방법.
제1항에 있어서, 목적 유전자는 난-발현 단백질을 하는 유전자인 것을 특징으로 하는 램프 태그의 제조방법.
제8항에 있어서, 유전자는 에스테라제(esterase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 사이토리신A(Cytolysin A, ClyA), 재조합항체(single chain Fv, scFv), 아스파라기나제B(asparaginaseB), 테트라-세포접합분자(T-CAM) 또는 B3(Fv)PE38 를 코딩하는 것을 특징으로 하는 램프 태그의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 번역속도 조절용 램프 태그(ramp tag).
제10항에 있어서, 램프 태그는 서열번호 1 내지 서열번호 7 및 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 램프 태그.
숙주세포에서 난-발현 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법에 있어서, 숙주세포에서 희귀 코돈(rare codon)을 수집하는 단계; 목적 유전자에 대한 램프 태그(ramp tag)를 구성하는 단계; 램프 태그와 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; 숙주세포를 발현 벡터로 형질전환 시키는 단계; 단백질을 발현시키기에 적당한 배양 배지에서 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 희귀코돈의 수집은 코돈의 빈도수와 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수를 분석하는 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제13항에 있어서, 코돈의 빈도수는 0.5~3%이고 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수는 0~2개인 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 램프 태그(ramp tag) 구성은 희귀코돈이 목적유전자에서 출현하는 순서로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 숙주세포는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제16항에 있어서, 숙주세포는 대장균(E. coli) K-12, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerecisiae), CHO-K1 및 HEK 293t로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 램프 태그(ramp tag)는 1-20개의 코돈으로 구성된 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 목적 유전자는 난-발현 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제19항에 있어서, 유전자는 에스테라제(esterase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 사이토리신A(Cytolysin A, ClyA), 재조합항체(single chain Fv, scFv),아스파라기나제B(asparaginaseB), 테트라-세포접합분자(T-CAM) 또는 B3(Fv)PE38 를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 램프 태그는 목적 유전자의 5' 또는 3'에 융합되거나, 목적 유전자의 내부에 도입되거나, 또는 독립적으로 번역되도록 위치하는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 램프 태그는 추가적으로 다른 태그 또는 융합 단백질과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제22항에 있어서, 다른 태그는 His tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB 및 Xpress epitope로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 방법.
제22항에 있어서, 융합 단백질은 GST, MBP, NusA, CBP, GFP, Thioredoxin, Mistic, Sumo 및 DSB로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.